DK168530B1 - Antitumor-farmaceutiske præparater, fremgangsmåde til deres fremstilling samt anvendelse af polyaminerivater til fremstilling af sådanne præparater - Google Patents
Antitumor-farmaceutiske præparater, fremgangsmåde til deres fremstilling samt anvendelse af polyaminerivater til fremstilling af sådanne præparater Download PDFInfo
- Publication number
- DK168530B1 DK168530B1 DK329985A DK329985A DK168530B1 DK 168530 B1 DK168530 B1 DK 168530B1 DK 329985 A DK329985 A DK 329985A DK 329985 A DK329985 A DK 329985A DK 168530 B1 DK168530 B1 DK 168530B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- cells
- compounds
- cdm
- cell
- hydrogen
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
- A61K31/415—1,2-Diazoles
Description
DK 168530 B1
Den foreliggende opfindelse angår antitumor-farmaceutiske præparater og en fremgangsmåde til deres fremstilling. Desuden angår opfindelsen anvendelse af forbindelserne med formlen I ifølge krav 1 til fremstilling af farmaceutiske præparater til 5 brug i terapien af tumorsygdomme, der står i forbindelse med celleformering.
Forbindelser med den almene formel
X Y
II I ,
10 R-C-N-fCqH2g'NHi'zE'L (U
ifølge krav 1 er kendt i litteraturen og anvendt inden for mange industrielle områder. Således er f.eks. N-[2-[2-(heptadecenyl)-2-imida-zolin-1-yl]ethyl]-oleamid kendt fra GB-patent nr. 929.397 som 15 additiv til polyepoxybitumener. J. Chem. Res. Synop. 1981(3) 84-5, og DE-OS nr. 2.546.180 beskriver reaktionerne af forskellige steriske isomerer af N-[2-[2-(8-heptadecenyl)-4,5-dihydro-lH-imidazol-l-yl]ethyl]-9-octadecenamid og brugen deraf ved flotation af Nb/Ta-mineraler. En artikel i Przem.
20 Chem. 46 (8), 479-81, beskriver (1:1)-blandingen af N,N'-[eth-ylenbis-(iminoethylen)]bis(9,ll-octadecadienamid) og -(9,11-octadecadienoat) og brugen deraf som kationiske overfladeaktive midler. Ifølge US-patent nr. 3.337.459 anvendes N,N'-[iminobis-(ethyleniminoethylen)]bis(10-octadecenamid) som 25 smøremiddel. US-patent nr. 3.193.454 beskriver 1,1'-(iminodi-ethylen)bis-[2-(8-heptadecenyl)-2-imidazolin] som additiv til malinger.
Der er imidlertid ikke i den ovennævnte kendte teknik nogen henvisning til en terapeutisk virkning af de nævnte forbindel-30 ser.
GB-A-905.186 omhandler farmaceutiske midler, som kan anvendes til remission af tumorer, omfattende forbindelser med formlen 2 DK 168530 B1
O O
II I
R^C-NH- (CH2) n-NH-CR2 hvor R-j^ er CH2=CH-, R2 er 5 -C=CH2, hvori R er et hydrogenatom
R
eller alkyl, og n er et helt tal fra 1 til 8, eller hvor n er l, R]_ og R2 begge kan være allyl- eller 2-halogenethyl-10 radikaler.
De endestillede grupper R-^ og R2 er således lavere alifatiske grupper i modsætning til forbindelserne med formlen I, som er indeholdt i de farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen, hvor de endestillede grupper indeholder henholdsvis 12-20 og 15 17-19 carbonatomer.
De sidste 100 år har medført grundlæggende ændringer i menneskets omgivelser, især som følge af den ekstraordinære udvikling af kemien. Denne udvikling igangsatte naturligvis også ugunstige fænomener, og et af disse er den hurtige stigning i 2 0 tumorsygdomme.
For tiden er cancerforskning et af de hurtigst udviklende forskningsområder, og den kræver ekstraordinær økonomisk og åndelig støtte. Foruden grundforskning er der store bestræbelser inden for terapien af visse specifikke typer tumorsygdom-25 me. I mange tilfælde er kirurgisk indgreb ofte ledsaget af anden slags terapi, f.eks. stråling, kemoterapi etc. De kendte fremgangsmåder og især de kemoterapeutiske metoder har den fælles egenskab, at de er begrænsede til områder af specielle typer tumorer. Hidtil er der ikke fundet nogen almen metode, 30 der resulterer i en generel regeneration af tumorceller.
Ifølge videnskabens nuværende standpunkt kan tumorsygdomme helbredes, når de påvises på et meget tidligt stadium. Da den tidlige fase er meget svær at erkende, hører tumorsygdomme til dem, der er vanskeligst at helbrede. I almindelighed udføres 35 symptomatisk behandling, men helbredelsesgraden er meget dår- 3 DK 168530 B1 lig. Der er derfor et stort behov for terapeutiske midler, som forhindrer forekomst af tumor sygdomme, og som giver en almen og passende terapeutisk virkning i tilfælde med en udviklet sygdom.
5 Målet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe et farmaceutisk præparat, der tilfredsstiller ovennævnte betingelser. Der angives også en fremgangsmåde til fremstilling af de farmaceutiske præparater.
Opfindelsen er baseret på den erkendelse, at årsagen til be-10 gyndelsen af cancerprocesser er svigt i den korrekte information og/eller cirkulationskæde mellem celler. I et sundt organ sker der permanent kommunikation mellem cellerne. Forekomsten af maligne processer i organet er et resultat af mangel på "kommunikationskanaler" mellem celler, da cellerne ikke 15 kan genkende hinanden, taber deres forbindelser og begynder at formere sig ifølge deres egen indre information. Formeringen er af malign grad og fører til hastig formering.
Det har vist sig, at de formerede celler, der er forekommet som følge af maligne processer, ikke skal ødelægges, men den 20 mulige kontakt mellem disse og/eller sunde celler skal genetableres. Den eneste måde til genetablering af vævs strukturen af tumorceller til sundt væv er at forny den intercellulære kommunikation.
Formodentlig danner proteinskallen, som forekommer på celle-25 væggen, et skjold på membranen og gør derved intercellulære kommunikationskanaler ude af stand til at virke. Gående ud fra denne teori blev undersøgelserne rettet mod at finde materialer, som desintegrerer proteinskallen, således at intercellulære kommunikationskanaler kan komme sig, og tumorcellen kan 30 tabe sin isolation.
Det har vist sig, at ovennævnte virkning kan opnås med forbindelserne med den almene formel I ovenfor, hvori 4 DK 168530 B1 R er et længere alifatisk hydrocarbonradikal med 12 til 20 carbonatomer, der kan indeholde en eller flere umætninger, R1 er hydrogen eller C17_19 mættet eller umættet alifatisk acyl, 5 X er oxygen, og Y er hydrogen, eller X og Y tilsammen danner et radikal med formlen =N-CH2-CH2-, z er et tal fra 1 til 5, og g er et tal fra 1 til 4.
Opfindelsen angår således et farmaceutisk præparat indehol-10 dende en eller flere forbindelser med formlen I.
Det vil ses, at de ovennævnte forbindelser er ligekædede polymere aminoforbindelser samt tautomerer deraf, når X og Y tilsammen danner en gruppe =N-CH2-CH2-, dvs. at der dannes en intermolekylær dihydroimidazoring.
15 Opfindelsen angår desuden en fremgangsmåde til fremstilling af det farmaceutiske præparat samt en anvendelse af forbindelserne med formlen I til fremstilling af et farmaceutisk præparat til behandling af de ovennævnte sygdomme.
Den ovennævnte længere alifatiske hydrocarbongruppe indeholder 20 12 - 20 carbonatomer og eventuelt mindst én dobbeltbinding. I
de åbenkædede forbindelser, dvs. hvori X er oxygen, er den længere alifatiske acylgruppe fortrinsvis afledt af stearinsyre, oliesyre og linoliesyre.
Som allerede nævnt er forbindelserne med den almene formel I 25 kendte, eller, hvis de er hidtil ukendte, kan de fremstilles på kendte måder, f.eks. ved følgende reaktioner: 5 DK 168530 B1 I. R-COOH + H2N-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH2 -> (fedtsyre) (polyamin) -> R-CO-NH-CH2“CH2“NH-CH2~CH2-NH2 + H20 (amidopolyamin) N-CH0 ii j2 II. R-CT + H„-N-CH_ R-C dH, + 2 Η,,Ο \0H 2 ' 2 2 2 H - N-CEL· , » 2 CH,,-CH -NEL· CH2-CH2-NH2 222 (fedtsyre) (polyamin) (imidaøolinderivat)
Forbindelserne med den almene formel I, der har en anden struktur end de ovennævnte slutprodukter, kan naturligvis fremstilles på i hovedsagen samme måde som ovenfor beskrevet.
I de farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen kan enhver af 5 forbindelserne med den almene formel I samt en blanding af enhver af dem anvendes som aktiv bestanddel. Ved "aktiv bestanddel" skal også forstås alle mulige stereoisomerer af de nævnte forbindelser.
Det skal nævnes, at i vandigt medium er der ligevægt mellem 10 den åbenkædede og den tautomere ringform.
De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen kan fremstilles ved velkendte metoder til sammensætning af midler af denne type, f.eks. ved blanding af en eller flere forbindelser med den almene formel I med mindst én fysiologisk acceptabel 15 bærer.
De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen kan administreres oralt eller fortrinsvis intravenøst, og en anden fore-trukken administrationsform er inhalation. Til dette formål bliver dampen af den aktive forbindelse eller en blanding af 20 flere af disse eller forbindelserne sammensat til et inhalationsmiddel inhaleret af patienten. I tilfælde af inhalation kan dampfasen indeholde ikke blot dampen af den aktive forbindelse eller de aktive forbindelser med formlen I, men også nogle dekomponeringsprodukter. Disse har den almene formel 6 DK 168530 B1 NRR'R" og H2N-[(CRR')y-NH]x-H, hvori R er hydrogen, lavere alkyl eller R' og R" er hydrogen og lavere alkyl, og n, x og y er hele tal.
5 Som et muligt dekomponeringsprodukt skal også nævnes formaldehyd.
De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen omfatter derfor også præparaterne indeholdende forbindelserne med formlen I og dekomponeringsprodukter deraf som aktiv bestanddel.
10 De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen inducerer tumorcellerne og de normale celler til at kommunikere, og tumorcellerne genkender derfor igen deres omgivelser, og yderligere formering afsluttes, og immunsystemet går i aktion ved at eliminere de overflødige, men ikke mere tumorøse celler ved 15 hjælp af forskellige beskyttelsesmekanismer i organismen. Ifølge de biologiske prøver viste en blanding af de aktive forbindelser med den almene formel I sig at være særligt aktive til genetablering af den intercellulære kommunikation og/eller cirkulationskanaleme.
20 Regeneration eller skabelse af intercellulær kommunikation og/eller cirkulationskanaler, kan opnås både in vivo og in vitro. Til disse formål bliver de farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen, fortrinsvis ovennævnte blanding, administreret via blodstrømmen, lymfesystemet, oralt og/eller ved 25 inhalationsteknik.
Antitumor-virkningen af forbindelserne med den almene formel I og blandingen deraf blev afprøvet i dyreforsøg og kliniske forsøg samt in vitro på vævskulturer, indbefattende leukæmi-virusproducerende omdannede cellelinier. Det har vist sig, at 30 omdannede og maligne formeringscellelinier kan bringes i kontakthæmning med en 10“^ - 10"6 fortynding af forbindelserne 7 DK 168530 B1 indeholdt i midlerne ifølge opfindelsen, medens ikke-maligne linier ikke hæmmes i deres formering. Under forsøg udført på mus viste den tumorhæmmende dosis af forbindelserne sig at være mindre end 100 /ig pr. kg legemsvægt. På det første stadi-5 um af kliniske prøver blev det konstateret, at ifølge den specielle diagnostiske metode, der er beskrevet i ungarsk patentansøgning nr. 78/84 (svarende til HU patentskrift nr. 191.105), skete der betydelig regeneration fra den tumorøse tilstand.
10 I de førnævnte fortyndinger er forbindelserne indeholdt i præparaterne ifølge opfindelsen ikke-toksiske, idet LD^q ved dyreforsøg er 15 mg/kg p.o. og 17 mg/kg ved administration i tumoren. I vævskulturer er toksiciteten mindre end eller lig med 5 x 10^ fortynding.
15 De biologiske prøver viste, at præparaterne ifølge opfindelsen har antitumor-virkning. Disse præparater er derfor værdifulde til terapi af tumor sygdomme og til regenerering af tumorøse celler og væv. Disse farmaceutiske præparater er ikke blot nyttige i sig selv i terapien, men kan også anvendes til kom-20 plettering af anden teknik såsom kirurgiske indgreb. Endvidere kan de komplettere eller forberede betingelserne for andre behandlinger.
EKSEMPEL.
Ifølge den almene fremstillingsmåde, der er beskrevet i den beskrivende del, blev der fremstillet følgende forbindelser, som blev identificeret ved massespektroskopi og NMR-spektroskopi (i de nedenstående formler er linolylgruppen betegnet L og oleylgruppen betegnet 0): C17H3l"CO”NH”*CH2“CH2“NH^4CO~C17H31 M+: m/z = 713
L L
8 DK 168530 B1 C17H3l“CO“NH^CH2“CH2“NH^4CO"C17H33 M+i m/z = 715
L O
5 ^17^33”^-^^^2""^2""^^"4^~^17^33 ^ * m/z = 717
O O
C17H3l“CO‘"NH'iCH2“CH2“’NH^3CO"C17H31 M+: m//z = 670
L L
10 C17H31"CO“NH-{CH2-CH2-NH>3CO-C17H33 M+: m/z = 672 L 0 C17H33"CO_NH'iCH2"CH2“NH^3CO"C17H33 M+: m^Z = 674 15 O 0 H2j' y M+: m/z (W, Z) H9C 'c - W 695 (L, L) 697 (L, 0) 20 (CH2-CH2-NHf3CO-Z . 699 (Q/ Q) H2?-.V · M+: m/z (W, Z) H C c - W 652 ^L/ 25 ? 654 (L, O) (ch2-ch2-nh^2co-z 656 (0/ 0) H2C-N M+: m/z (W, Z) 30 I I 609 (L, L)
H0C JZ - W
2 611 (L, O) 'CH2-CH2-NH-CO-Z 613 (0, 0) 35 9 DK 168530 B1 C17H3l”CO“NH^CH2“CH2“NH^3H M+! m/z = 408
L
C17H33“CO_NH'iCH2“CH2"NH)'3H M+: m/Z “ 410 0
M+: m/z W
5 H-jC C - W 390 L
1 x I 392 0
(CH 2“CH 2“NHf 2H
1 13 15 NMR ( H, C og N) - spektroskop! bekræftede de ovenstående strukturer.
Ovennævnte forbindelser samt blandingen deraf (i det følgende; CDM) blev afprøvet ved følgende biologiske arrangementer: 10 In vitro prøver blev udført for at besvare følgende problemer;
Hvad er virkningen af CDM på formeringen af celler med eller uden malign omdannelse in vitro. Undersøgelser blev først udført på cellelinier i den logaritmiske fase (logaritmisk vækstfase, forsøgstype A), derefter på celler i den stationære fase 15 (næppe formerende celler, forsøgstype B).
Bestemmelse af det biologisk effektive fortyndingsinterval.
De anvendte doser blev ikke udtrykt i koncentration, men i fortyndingsenheder.
Undersøgelser af in vitro cytotoksicitet af CDM og reversibili-20 teten af denne virkning.
Følgende materialer og metoder blev anvendt til disse forsøg: 10 DK 168530 B1
Cellelinier:
Cellelinier af normal vævsoprindelse: McCoy's humane monolags cellelinie af synovial oprindelse.
BHK-fibroblasttype-monolagscellelinie af nyfødt hamsternyre-5 oprindelse i BHK-B og i BHK-Tubingen-varieteterne.
HAK-monolagscellelinie af voksen hamsternyreoprindelse.
MRC-5-monolagscellelinie af human embryonal lungeoprindelse.
Cellelinier af tumoroprindelse: LLC-monolagscellelinie af human bronkial carcinomoprindelse (der også kan vedligeholdes 10 in vivo i mus) indeholdende 70 - 80% epitelioid type celle.
HeLa-S3, en klon af en cellelinie af human cervikal carcinomoprindelse .
K 562, en cellelinie af erytroid leukæmi-oprindelse, voksende i suspension.
15 SP 2, en supensionsklon af muse-myeloid leukæmi-oprindelse.
P-388, en suspensionscellelinie af muse-lymfoid leukæmioprindelse .
L-1210, en cellelinie af muse-lymfoid leukæmi-oprindelse (den kan også opretholdes i ascitis-form).
20 Dyrkningsbetingelser;
Cellelinierne blev vedligeholdt i minimalt essentielt medium (MEM) indeholdende 10% kalvefosterserum (FCS, Flow Laboratories Ltd.). For at undgå bakterieinfektion blev der tilsat 50 ;ug/ml 3 gentamycin (SERVA). Kulturerne blev vedligeholdt i 25 cm 25 Falcon plastcellekulturbeholdere (NUNC, Greiner eller Costar) i 10 ml rumfang.
Monolagskulturer blev overført med tilsætning af 0,05% trypsin, medens suspensionskulturer blev fortyndet. Til prøver med CDM blev der anvendt cellekultur-multiplader indeholdende 24 fordyb- 3 11 DK 168530 B1 t ninger på 2 cm med tilsætning af 1 ml medium pr. fordybning. Kulturerne blev dyrket i 72 timer ved 37°c i en atmosfære indeholdende 5% CC>2· Den relative fugtighed blev holdt på 75 - 80%. Cellekulturer i logaritmisk fase blev opnået ved 10 ganges for-5 tynding af kulturer i stationær fase, og som udviste kontakthæmning. I monolagskulturer blev betingelsen for kontakthæmning anset for at forekomme på dagen efter mikroskopisk fremkomst af cellesammenflydning. Disse kulturer blev anvendt i B-type forsøg.
10 Fortynding af CDM.
CDM blev fortyndet i MEM (uden serum), gående ud fra 1000 ganges fortynding af stamopløsningen. Den rigtige fine dispersitet af emulsionen blev opnået ved hjælp af en varig intens blanding under anvendelse af en Vortex blander. Før tilsætning til 15 kulturerne blev de givne fortyndinger omhyggeligt genhomogeniseret.
Celletælling blev udført med Burker's homocytometer, eller, hvis der også blev udført cytofluorometrisk måling, blev cytofluoro-grafens værdier automatisk accepteret.
20 Strømnings-mikrofluorometriske målinger.
Efter trypsinisering blev celler centrifugeret og farvet i iskold isotonisk trinatriumcitrat indeholdende 50 /ag propidium-jodid i 30 minutter. Målinger blev udført ved anvendelse af en cytofluorograf (Bio Physic Inc.) ved hjælp af en Ar-ion-25 gaslaser ved 488 nm. Fluorescensen af propidiumjodid-DNA- komplekset blev påvist over 600 nm.
Ved hjælp af en indbygget elektronisk differentialdiskriminator blev celler, der havde mindre end "diploide" DNA-indhold, kasseret, fordi disse celler sandsynligvis døde længe før målingen.
12 DK 168530 B1
Bestemmelse af levedygtighed.
Efter trypsinisering blev celler suspenderet i MEM-medium indeholdende 0,05% w/v trypan-blåt. 5 minutter senere blev antallet af levende celler (der udelukker trypan-blåt) og døde 5 celler (der bliver blå) bestemt ved lysmikroskopi.
Bestemmelse af reversibilitet.
Cellekulturer blev behandlet i 24 timer med CDM. På dette tidspunkt blev halvdelen af de parallelle prøver analyseret, medens resten blev geninkuberet i et frisk medium, der ikke indeholdt 10 nogen CDM. Efter 24 timer blev genkultivering standset, og cellerne blev fjernet til analyse.
RESULTATER.
CDM blev først undersøgt på cellekulturer i logaritmisk fase.
Det optimale dosisinterval til yderligere undersøgelser blev 15 valgt på SP 2-cellelinien, hvor CDM blev anvendt inden for et bredt koncentrationsinterval.
På grundlag af disse erfaringer blev der til det videre arbejde 4 7 anvendt et fortyndings-interval på 5 x 10 - 10 gange.
I overensstemmelse med modifikationen af vækstkurverne kan 20 prøvesystemerne grupperes som følger: 5 x 104 ganges fortynding af CDM dræbte cellerne af kulturen inden 24 timer (K 562, MRC-5, BHK-B, McCoy, HAK, SP 2).
5 x 104 ganges fortynding af CDM dræbte cellerne af kulturen inden for 48 timers forsøg (P-388, L-1210, BHK-Tub.).
13 DK 168530 B1
Ingen påviselig toksisk virkning i det undersøgte fortyndings-interval (HeLa, LLC). Visse koncentrationer af CDM stimulerede endog væksten af celler af de to sidstnævnte linier i logaritmisk fase.
5 Virkningen af CDM på kulturer,der var i kontakthæmningsfasen, blev undersøgt i to rækker. Det viste sig, at virkningerne 5 af CDM var reversible i fortyndinger over 10 gange, medens 4 de i fortyndinger under 10 gange syntes at være irreversible.
En del af kurverne over vækst og reaktion, registreret efter 10 en 72 timers dyrkningsperiode, viste en kontinuerlig ændring (BHK-B, BHK-Tub., HAK, L-1210), medens andre havde et lokalt minimumspunkt (SP 2, McCoy, LLC, HeLa, MRC-5, P-388). De fleste af de lokale minimumspunkter var inden for fortyndings-5 6 intervallet 10 - 10 gange.
15 Levedygtigheds-undersøgelser blev udført på fire cellelinier (LLC, McCoy, HeLa, BHK-Tub.) i et fortyndings-interval på 3 6 4
5x10 -10. 10 ganges eller lavere fortyndinger af CDM
resulterede i 100% toksicitet. In vitro LDC/.-værdierne faldt 4 4 50 mellem 10 og 5 x 10 ganges fortynding.
20 Ved yderligere prøver blev den leukæmivirus-producerende QL- omdannede cellelinie (K.Nagy: Chester Beatty Seminars, London, 1983) valgt til undersøgelse af virkningerne af CDM in vitro.
Materialer og metoder.
På grund af den alkaliske karakter af materialet blev CDM ikke 25 anvendt direkte, men først fortyndet i dimethylsulfoxid (DMSO, Reanal), og dets yderligere fortyndinger blev anvendt.
Cellekultur.
Den omdannede vagtel-fibroblastcellelinie (QL) producerer kontinuerligt MC 29/L virus-underlinie med forøget onkogenicitet.
14 DK 168530 B1
Celler blev vedligeholdt og propageret i plastkulturflasker af Falcon-typen. Der blev anvendt Parker 199 vævskulturmedium suppleret med 10% tryptose-phosphat, 5% kalvefosterserum og 1% hønseserum. Cellekulturer blev inkuberet ved 37°C i en at-5 mosfære indeholdende 5% CO 2 i luft. Cellekulturer blev over ført ved trypsinisering, i reglen hveranden dag.
Celletælling.
Cellekulturer blev dispergeret ved trypsinisering, og celletallene blev bestemt ved en Laborscal (Labor MIM) elektronisk 10 celletæller eller, i nogle få tilfælde, under anvendelse af den sædvanlige Buerker's metode.
Levedygtighed.
Celletallene blev korrigeret i overensstemmelse med mængden af levende celler. Denne blev bestemt under anvendelse af trypan-15 blåt-udelukkelsesteknikken.
3
Bestemmelse af H-thymidin-inkorporering.
Hastigheden af DNA-syntese blev, efter CDM-behandling, bestemt 3 ved huælp af tilsætning af 50 /UCi (0,2 ml) radioaktiv H-thymidin- 3 nukleosid (Thymidin-6- H, Chemopol, Tjekkoslovakiet) til kul- g 20 turerne (10 celler pr. beholder).
På udvalgte tidspunkter blev cellesuspensionen vasket med kulturmedium, og efter centrifugering (2000 omdrejninger pr. minut, 5 minutter, +4°C) blev celler udfældet med 5 ml 5% iskold tri-chloreddikesyre og opsamlet på Millipore-filter. Radioaktiv!te-25 ten af prøverne blev bestemt ved anvendelse af en Packard Tricarb scintillationstæller.
Bestemmelse af omvendt transskriptase (RT).
I kulturmediet af QL-celler blev tilstedeværelsen og titeren 15 DK 168530 B1 af MC 29/L-virus bestemt af RT-enzymaktiviteten/ der kun er karakteristisk for RNA-tumorvirus. Kulturmedium blev først klaret for celleaffald ved centrifugering (10.000 g, 30 minutter, +4°C). Virusfraktionen blev så koncentreret ved 5 ultracentrifugering (100.000 g, 90 minutter, +4°C) (MSE 65 Super Speed, U.K.).
Sediment blev gensuspenderet i følgende stødpudeopløsning: 0,01 M tris-HCl, pH 7,5, 0,1 M NaCl og 0,001 M EDTA. Reaktionen blev udført som beskrevet tidligere i Acta Microbiol. 25, 10 142 (1978). I korthed blev reaktionsblandingen indeholdende TKD-stødpude, MnCl2"Triton-X,'100 og thymidin-triphosphat inkuberet med poly(rA) (dT) 12-skabelonstarter i nærværelse af virusen. Det syntetiserede DNA blev udfældet med TCA på filterplader, og aktiviteten blev bestemt med en scintillationstæller.
15 Immunofluorescens.
Tilstanden eller ændringerne af aktive filamenter, som opbygger cellens skelet - cytoskelettet - blev undersøgt ved indirekte immunofluorescens i normale, omdannede og CDM-behandlede celler. Celler blev dyrket på tynde, runde dækglas og inkuberet med 20 anti-actin-kaninserum ved 37°C i 40 minutter. Efter rigelig vask fortsatte inkubationer med andre antistoffer, enten med fluorescein eller med rhodamin-konjugeret anti-kanin/gedeserum. Efter den anden antistofkonjugation blev prøver undersøgt ved fluorescensmikroskopi i ultraviolet lys.
25 Toksicitetsprøve.
C
2 dage gamle QL-fibroblastkulturer indeholdende 10 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af CDM, fortyndet i DMSO. Det fortyndede materiale blev sat til beholderne i rumfang på 1 ml. 48 timer senere blev celletal og levedygtighed 30 bestemt. Toksicitetsprøve afslørede, at 10 , 10 og 10 ganges fortyndinger af CDM var meget cytotoksiske, da de kendeligt ned- DK 168530 B1 16 satte antallet og levedygtigheden af levende QL-celler. Selv g den 10 dobbelte fortynding resulterede i fald i celletal, omend den ikke var signifikant. Der var praktisk taget intet 7 fald i celletal eller levedygtighed ved 10 eller større for-5 tyndinger, hvorfor disse fortyndinger kan betragtes som ugiftige for QL-celler.
Hæmning af celleformering.
Virkningen af CDM blev undersøgt på kinetikken af hurtigt formerende omdannede QL-celler. Ubehandlede celler fordoblede 10 deres antal hveranden dag.
Celleformering var meget påvirket af de forskellige koncentrationer af CDM.
7
Den 10 dobbelte fortynding ændrede ikke egenskaberne af formeringen, men der krævedes længere tid til at frembringe samme g 15 antal som kontrollerne. Virkningen af den 10 dobbelte fortynding er interessant. Celledeling startede langsommere, men intensiteten deraf var konstant indtil den 6.dag. Fra dette tidspunkt voksede mængden afdelinger, og på den 8.dag var den tæt ved værdien af den tidligere fortynding. Virk-5 20 ningen af den 10 dobbelte fortynding var modsat. Først begyndte en langsom formering, men den standsede på dag 4, og 4 fra denne dag faldt celletallet gradvis. 10 fortyndingen re sulterede i denne virkning allerede den anden behandlingsdag.
Intensitet af DNA-syntese.
25 Intensiteten af DNA-syntese blev målt ved inkorporering af radioaktiv nukleosid-thymidin i formerende behandlede og ubehandlede celler. Dag for dag fandtes stigende inkorporering i ubehandlede celler. Hastigheden af stigning blev formindsket på dag 5 og 6. Ved 10 dobbelt fortynding blev iagttaget en 30 variabel grad af stigning og fald af thymidin-inkorporering, 17 DK 168530 B1 men alligevel udvistes stadig en samlet langsom stigning.
g 10 fortynding nedsatte moderat intensiteten af DNA-syntese 5 af QL-celler, medens 10 fortynding forårsagede meget betydeligt fald.
5 Omvendt transskriptase-bestemmelse.
Foruden at undersøge virkningen af CDM på intensiteten af DNA-syntese og celleformering ønskede man også at undersøge indflydelsen af forbindelsen på propageringen af tumorvirus produceret af QL-celler. På de anførte dage blev der taget prøver 10 af kulturmediet, og omvendt transskriptase-enzymaktivitet, ka- 7 rakteristisk for tumorvirus, blev bestemt. 10 dobbelt fortynding af CDM nedsatte enzymaktiviteten, som er proportional med viruskoncentrationen, sammenlignet med ubehandlede celler, men værdierne udviste en stigende tendens som funktion af tiden.
C
15 Ved 10 dobbelt fortynding var der en vis begyndelsesstigning, men den faldt på dag 6 (tredie måling) og målingerne afslørede 5 en stærkt aftaget viruskoncentration. 10 dobbelt fortynding hæmmede fuldstændigt viruspropagering, og på den 6. og 8.dag kunne der ikke påvises nogen enzymaktivitet.
20 Ændring af cytoskelet-actinfilamenter.
Skelettet i højere celler er cytoskelettet. Det er et kompleks netværk af proteinfilamenter i cytoplasmaen. Hovedbestanddelene er actinfilamenter. Tilstedeværelsen og ændringen af dem blev undersøgt i normale virusomdannede og CDM-behandlede fibroblaster 25 I normale fibroblaster danner de stærke, organiserede knipper, og disse actinknipper kan iagttages over hele cytoplasmaen.
Celler omdannet med ONCORNA-virus viser et totalt anderledes morfologisk udseende. I disse celler bliver actinfilamenter fibrilløse, de kan danne knuder, de er beliggende uregelmæssigt 30 uden nogen orden, og de kan være til stede eller mangle i en- 18 DK 168530 B1 hver del af cytoplasmaen.
Efter CDM-behandling havde celler igen et tydeligt morforlogisk udseende og havde udvækster. De tidligere brudte, udfældede actinpartikler var organiseret i filamenter, omend orienterin-5 gen af filamenterne ikke var så udtalt som i normale celler.
Med henblik på mere fuldstændig påvisning blev actinfilamenter af cytoskelettet farvet med rhodamin i stedet for fluorescein, og der blev påvist i princippet samme proces.
Den farmakologiske virkning af CDM blev afprøvet på svejtsiske 10 hvide mus, der var podet med en 10-dobbelt fortyndingsrække af Németh-Kellner lymphoma (NKL). Musegrupperne blev podet med fortyndingerne af NKL og CDM-materialet samtidig ved begyndelsen af forsøget. Dyrene blev så behandlet med CDM under prøven ved yderligere 5 lejligheder. Dyrene, der tjente som kontrol, 15 fik injiceret fortyndinger af NKL-materialet ved begyndelsen. Disse dyr blev ikke behandlet på anden måde.
Gennemsnits-vægten af CDM-behandlede dyr og kontroldyr blev sammenlignet 6 gange under forsøget. Gennemsnitsvægten af CDM-behandlede dyr på den 16.dag var fra 8 til 27% mindre end 20 af kontrollen.
På den 18.dag blev dyrene dræbt og dissekeret. I tilfældet med mus podet med ufortyndet NKL (50 millioner celler pr. dyr) g hæmmede CDM ikke tumordannelsen. På grupperne podet med 5 x 10 , 5 4 o 5 x 10 og 5 x 10 eller færre celler gav CDM en beskyttelse pa 25 henholdsvis 20%, 80% og 100%.
Claims (7)
1. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det som aktiv bestanddel indeholder en eller flere forbindelser 5 med den almene formel X Y I I , R-C-N-fCgH2g-NH^zR'1' (I) hvor 10. er et længere alifatisk hydrocarbonradikal med 12 til 20 carbonatorner, der kan indeholder en eller flere umætninger, R1 er hydrogen eller mættet eller umættet alifatisk acyl, X er oxygen, og Y er hydrogen, eller 15 X og Y tilsammen danner et radikal med formlen =N-CH2-CH2-, z er 1 - 5, og g er l - 4.
2. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R er et C16_mættet eller umættet hydrocarbonradikal, z er 1 - 4, 20 og q er 2.
3. Præparat ifølge krav 2, kendetegnet ved, at R er det alifatiske hydrocarbonradikal af stearinsyre, oliesyre eller linoliesyre, og R1 er hydrogen eller stearyl, oleyl-eller linoleylgruppen.
4. Præparat ifølge krav 1-3, kendetegnet ved, at den aktive bestanddel er en blanding af forbindelser med den almene formel I.
5. Fremgangsmåde til fremstilling af antitumor-farmaceutiske præparater, kendetegnet ved, at en eller flere af 30 forbindelserne med den almene formel I ifølge krav l blandes med mindst én fysiologisk anvendelig bærer. DK 168530 B1 20
6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at en blanding af mindst to af forbindelserne med den almene formel I, hvori R er hydrocarbonradikalet af oliesyre eller linoliesyre, R1 er hydrogen, oleyl eller linoleyl, z er 1 - 4, 5. er 2, X er oxygen, og Y er hydrogen, eller X og Y tilsammen danner et radikal med formlen =N-CH2-CH2-, blandes med mindst én fysiologisk anvendelig bærer.
7. Anvendelse af forbindelser med formlen I ifølge krav 1 til fremstilling af et farmaceutisk præparat til brug i terapien 10 af tumor sygdomme.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU434883 | 1983-12-20 | ||
| HU834348A HU200093B (en) | 1983-12-20 | 1983-12-20 | Process for production of medical compositions against tumour |
| HU8400062 | 1984-12-18 | ||
| PCT/HU1984/000062 WO1985002769A1 (en) | 1983-12-20 | 1984-12-18 | Antitumour pharmaceutical compositions and process for preparing the same |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK329985D0 DK329985D0 (da) | 1985-07-19 |
| DK329985A DK329985A (da) | 1985-07-19 |
| DK168530B1 true DK168530B1 (da) | 1994-04-18 |
Family
ID=10967718
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK329985A DK168530B1 (da) | 1983-12-20 | 1985-07-19 | Antitumor-farmaceutiske præparater, fremgangsmåde til deres fremstilling samt anvendelse af polyaminerivater til fremstilling af sådanne præparater |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5068240A (da) |
| EP (1) | EP0165960B1 (da) |
| JP (1) | JPS61500729A (da) |
| KR (1) | KR850700108A (da) |
| AU (1) | AU574754B2 (da) |
| BR (1) | BR8407235A (da) |
| CA (1) | CA1255231A (da) |
| DE (1) | DE3477881D1 (da) |
| DK (1) | DK168530B1 (da) |
| EG (1) | EG17013A (da) |
| ES (1) | ES8604490A1 (da) |
| FI (1) | FI853199A0 (da) |
| GR (1) | GR82477B (da) |
| HU (1) | HU200093B (da) |
| IL (1) | IL73825A0 (da) |
| IN (1) | IN160438B (da) |
| IT (1) | IT1177485B (da) |
| MA (1) | MA20305A1 (da) |
| NO (1) | NO853241L (da) |
| NZ (1) | NZ210558A (da) |
| PT (1) | PT79698B (da) |
| WO (1) | WO1985002769A1 (da) |
| ZA (1) | ZA849897B (da) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6646149B1 (en) | 1997-07-15 | 2003-11-11 | Nicolaas M. J. Vermeulin | Polyamine analogues as therapeutic and diagnostic agents |
| WO1999003823A2 (en) | 1997-07-15 | 1999-01-28 | Oridigm Corporation | Novel polyamine analogues as therapeutic and diagnostic agents |
| US7208528B1 (en) | 1997-07-15 | 2007-04-24 | Mediquest Therapeutics, Inc. | Polyamine analogues as therapeutic and diagnostic agents |
| USRE43327E1 (en) | 2001-01-08 | 2012-04-24 | Aminex Therapeutics, Inc. | Hydrophobic polyamine analogs and methods for their use |
| GB0425556D0 (en) * | 2004-11-19 | 2004-12-22 | Glaxo Group Ltd | Novel compounds |
| HUP0900271A2 (hu) * | 2009-04-30 | 2010-11-29 | Adam Kovacs | Levegõszûrõ betét védõmaszkhoz, illetve légkezelõ berendezésekhez széles hatásspektrumú gyógyászati kezelési és prevenciós eljárásokban történõ alkalmazásra |
| JP5836394B2 (ja) * | 2010-12-30 | 2015-12-24 | サムヤン バイオファーマシューティカルズ コーポレイション | 陽イオン性脂質を含む陰イオン性薬物伝達体およびその製造方法 |
| RU2487122C1 (ru) * | 2012-05-24 | 2013-07-10 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное объединение "НИИПАВ" | Способ получения алкилимидазолина |
| US10632145B2 (en) | 2016-03-25 | 2020-04-28 | Aminex Therapeutics, Inc. | Bioavailable polyamines |
| WO2022072586A1 (en) | 2020-09-30 | 2022-04-07 | Aminex Therapeutics, Inc. | Combination drug substance of polyamine transport inhibitor and dfmo |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR1202M (fr) * | 1960-05-09 | 1962-03-26 | American Cyanamid Co | Compositions d'amides. |
| US3085940A (en) * | 1960-05-09 | 1963-04-16 | American Cyanamid Co | Nu, nu'-methylene-bis-amides for the suppression of tumors |
-
1983
- 1983-12-20 HU HU834348A patent/HU200093B/hu not_active IP Right Cessation
-
1984
- 1984-12-14 NZ NZ210558A patent/NZ210558A/en unknown
- 1984-12-14 IL IL73825A patent/IL73825A0/xx unknown
- 1984-12-17 GR GR82477A patent/GR82477B/el unknown
- 1984-12-18 AU AU37801/85A patent/AU574754B2/en not_active Ceased
- 1984-12-18 WO PCT/HU1984/000062 patent/WO1985002769A1/en active IP Right Grant
- 1984-12-18 PT PT79698A patent/PT79698B/pt not_active IP Right Cessation
- 1984-12-18 US US07/533,943 patent/US5068240A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-12-18 EP EP85900164A patent/EP0165960B1/en not_active Expired
- 1984-12-18 DE DE8585900164T patent/DE3477881D1/de not_active Expired
- 1984-12-18 BR BR8407235A patent/BR8407235A/pt unknown
- 1984-12-18 JP JP60500050A patent/JPS61500729A/ja active Pending
- 1984-12-18 KR KR1019850700171A patent/KR850700108A/ko not_active Application Discontinuation
- 1984-12-19 MA MA20529A patent/MA20305A1/fr unknown
- 1984-12-19 ZA ZA849897A patent/ZA849897B/xx unknown
- 1984-12-19 ES ES538852A patent/ES8604490A1/es not_active Expired
- 1984-12-19 CA CA000470495A patent/CA1255231A/en not_active Expired
- 1984-12-20 IT IT24159/84A patent/IT1177485B/it active
- 1984-12-23 EG EG804/84A patent/EG17013A/xx active
- 1984-12-27 IN IN1042/MAS/84A patent/IN160438B/en unknown
-
1985
- 1985-07-19 DK DK329985A patent/DK168530B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-08-16 NO NO853241A patent/NO853241L/no unknown
- 1985-08-20 FI FI853199A patent/FI853199A0/fi not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NZ210558A (en) | 1988-04-29 |
| MA20305A1 (fr) | 1985-07-01 |
| JPS61500729A (ja) | 1986-04-17 |
| US5068240A (en) | 1991-11-26 |
| WO1985002769A1 (en) | 1985-07-04 |
| FI853199L (fi) | 1985-08-20 |
| AU574754B2 (en) | 1988-07-14 |
| DK329985D0 (da) | 1985-07-19 |
| ZA849897B (en) | 1985-08-28 |
| HUT39602A (en) | 1986-10-29 |
| EP0165960A1 (en) | 1986-01-02 |
| ES538852A0 (es) | 1986-02-01 |
| BR8407235A (pt) | 1985-11-26 |
| IT1177485B (it) | 1987-08-26 |
| IN160438B (da) | 1987-07-11 |
| PT79698A (en) | 1985-01-01 |
| GR82477B (en) | 1985-04-11 |
| DE3477881D1 (en) | 1989-06-01 |
| KR850700108A (ko) | 1985-10-25 |
| AU3780185A (en) | 1985-07-12 |
| HU200093B (en) | 1990-04-28 |
| PT79698B (en) | 1987-01-15 |
| ES8604490A1 (es) | 1986-02-01 |
| DK329985A (da) | 1985-07-19 |
| FI853199A0 (fi) | 1985-08-20 |
| EG17013A (en) | 1993-07-30 |
| EP0165960B1 (en) | 1989-04-26 |
| IT8424159A0 (it) | 1984-12-20 |
| NO853241L (no) | 1985-08-16 |
| CA1255231A (en) | 1989-06-06 |
| IL73825A0 (en) | 1985-03-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DiPaolo et al. | Quantitative studies of in vitro transformation by chemical carcinogens | |
| Carchman et al. | The inhibition of DNA synthesis by cannabinoids | |
| DK168530B1 (da) | Antitumor-farmaceutiske præparater, fremgangsmåde til deres fremstilling samt anvendelse af polyaminerivater til fremstilling af sådanne præparater | |
| EP0196415A2 (en) | Trichostatins A and C as antitumour drugs | |
| US5004735A (en) | Pharmaceutical compositions for the inhibition of tumor metastasis | |
| KR950008767B1 (ko) | 에브셀렌(Ebselen)의 새로운 의약적 용도 | |
| JPH07500581A (ja) | ６−〔Ｘ−（２−ヒドロキシエチル）アミノアルキル〕−５，１１−ジオキソ−５，６−ジヒドロ−１１Ｈ−インデノ〔１，２−ｃ〕イソキノリン誘導体、それらの製造方法およびそれらの使用 | |
| EP1140116A1 (en) | Use of adenosine agonists in cancer therapy | |
| Yoshida et al. | Sensitivity to 1‐(4‐amino‐2‐methyl‐5‐pyrimidinyl) methyl‐3‐(2‐chloroethyl)‐3‐nitrosourea hydrochloride (ACNU) of glioma cells in vivo and in vitro | |
| Kumar et al. | The administration of the nerve growth factor to children with widespread neuroblastoma | |
| Sato et al. | Effects of 5-fluorouracil and the combination of 5-fluorouracil and human leukocyte interferon on human salivary gland adenocarcinoma cell line in culture | |
| Hill et al. | B16 melanoma in C57BL/6J mice: Kinetics and effects of heterologous serum | |
| CN107412736B (zh) | 一种抗肿瘤联合用药物及其在制备抗癌药物中的用途 | |
| Fisher et al. | The effect of a growing tumor and its removal on the cytotoxicity of macrophages from cultured bone marrow cells | |
| Lichtner et al. | Direct effects of the pyrimido-pyrimidine derivative RA 233 (Rapenton) on rat 13762NF mammary tumor cell clones in vitro | |
| CN112390854B (zh) | 茶氨酸与rgds共同修饰的5-氟尿嘧啶,其合成,活性和应用 | |
| EP0127389A2 (en) | N,N-diethyl-5-methyl-2H-1-benzothiopyrano-(4,3,2-cd)-indazole-2-ethanamine, compositions comprising the same and uses therefor | |
| SE437931B (sv) | Lekemedelspreparat med antitumorverkan innehallande fosfat av polyhexametylenguanidin med angiven formel | |
| Fagg et al. | Myeloproliferative sarcoma virus: its effects on erythropoiesis in adult DBA/2J mice | |
| Clarris et al. | The effects of homologous and heterologous whole serum upon multiplication of recently‐isolated human synovial cells in culture | |
| Gordon et al. | Effect of medium conditioned by acute myeloid leukaemia cells on normal marrow colony-forming ability and sensitivity to cytosine arabinoside | |
| Nelson | Response of Mice to Reovirus Type 3 in Presence and Absence of Ascites Tumor Cells. | |
| Wilson et al. | Relative cytotoxicity of mithramycin and vinblastine sulfate in cell cultures of human neural tumors | |
| CN105412114A (zh) | 6-{[4-(2-氟苯基)1-哌嗪基]甲基}-n-(萘基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺在制备血管生成抑制剂中的应用 | |
| Boggs et al. | Murine recovery from busulfan‐induced hematopoietic toxicity as assessed by three assays for colony‐forming cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PBP | Patent lapsed |