DK165391B - Fremgangsmaade til chromatografisk separation af biologiske makromolekyler - Google Patents

Description

i

DK 165391 B

o

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til separation ved chromatografi, dvs. ved en adsorptionsproces, hvis væsentlige karakter ligger i dens selektivitet, af biologiske makromolekyler, såsom proteiner, enzymer, toksiner, 5 antistoffer etc., med henblik på tilvejebringelse af opløsninger, der er beriget på et eller flere Ønskede makromolekyler.

Visse biologiske molekyler, de såkaldte biologiske makromolekyler, er karakteriseret ved meget høje molekyl-10 vægte (over 5000) og en tilbøjelighed til denaturering, der medfører tab af deres biologiske aktivitet eller deres funktionelle kapacitet (f.eks. denaturering af proteiner til peptider), og disse egenskaber begrænser de typer af fremgangsmåder, der er anvendelige til rensning af dem i 15 industriel målestok (udfældning, ultrafiltrering og chromatografi) . Metoderne til chromatografi (selektiv adsorption) er i øjeblikket de præparative metoder, der er mest specifikke og bedst tilpasset til produktion i industriel . målestok af biologiske makromolekyler med høj renhed.

20 Disse metoder gennemføres ved at lade en opløsning indeholdende de biologiske makromolekyler passere gennem et fast lag af specifikke chromatografiske harpikser, som er i stand til at bevirke en selektiv adsorption af disse. Hvis det eller de ønskede makromolekyler bindes til har-25 piksen, gennemføres der en eluering af harpiksen med en opløsning med en passende pH-værdi eller ionstyrke, hvorved makromolekylerne separeres og fås i renset og koncentreret form. Hvis det ønskede makromolekyle forbliver i behandlingsopløsningen (idet de andre makromolekyler bindes til 30 harpiksen) får man direkte den ønskede separation.

Denne chromatografiske teknik i fast lag og dens ydeevne er velkendt inden for den bioteknologiske sektor, og der kan især henvises til følgende litteratursteder, som giver eksempler derpå: 35 - "Method of Plasma Protein fractionnation", J.M.

O

2

DK 165391 B

Curling, Academic Press, 1980, s. 149-160, - "Protein recovery by ion exchange, D.T. Jones Bsc, Food Processing Industry, April 1975, s. 21, 23, - "Nouveau procédé de valorisation du lactosérum", 5 B. Mirabel, Rhone-Poulenc Industries, "Informations chi- mie", nr. 175, marts 1978, s. 105-109.

- FR patentskrift nr. 2.321.932 og 2.359.634, hvori der beskrives hidtil ukendte ionbytterharpikser til separation af proteiner.

to Imidlertid har disse metoder til chromatografisk separation i fast lag ulemper, hvoraf den mest alvorlige ligger i den gradvise tilstopning af laget. Denne tilstopning fremkaldes i det væsentlige af faste urenheder suspenderet i opløsningen og også af udfældning af visse kom-15 ponenter af denne. Konsekvenserne er yderst alvorlige, når der er tale om en industriel proces. For at opretholde en tidsmæssigt konstant gennemløbsstrøm, skal indløbstrykket af opløsningen forøges til værdier af størrelsesordenen 3-4 gange den nominelle værdi, hvilket medfører bety-20 delige tekniske vanskeligheder eller endog kan være uacceptabelt ved visse anvendelser. Endvidere er en cyclisk rensning af chromatografiske harpikser i praksis en yderst følsom proces, hvilket medfører, at harpikserne i almindelighed skal vaskes i særskilte beholdere, og dette udgør 25 en hindring for en kontinuerlig funktion af anlægget og medfører vanskelige og kostbare håndteringer. Det skal bemærkes, at' visse chromatografiske harpikser, sædvanligvis af uorganisk natur, har skrøbelige bærere, der knuses under rensningen og danner et fint materiale, der derefter 30 kan tilstoppe visse zoner af laget, og at andre chromatografiske harpikser, sædvanligvis af organisk natur, ikke kan renses, når deres indre netværk er tilstoppet, og derfor må kasseres. I visse tilfælde medfører tilstopningen, at laget bliver fast i sin helhed, og en rensning er 35 derefter ikke mere mulig. En anden yderst uheldig konse-

DK 165391 B

3 o kvens af tilstopningen ligger i, at harpikslagets bindingskapacitet forandres efter flere rensninger. Uafhængigt af de trufne foranstaltninger forbliver en vis andel af urenhederne bundet til den chromatografiske har-5 piks, og lidt efter lidt falder dennes bindingskapacitet, indtil det er nødvendigt at kassere den.

Disse vanskeligheder er velkendte af specialister i biologisk chromatografi og gør det i de fleste tilfælde nødvendigt at gennemføre en grundig rensning af opløs-10 ningerne, før de behandles. Denne rensning medfører en betydelig forøgelse af omkostningerne ved processen og begrænser processens anvendelse til fremstilling af produkter med høj værdi (lægemidler etc.), hvilket udeluk-. ker anvendelsen til et stort antal formål, hvor de pro-15 ducerede makromolekyler har en lavere værdi (behandling af visse naturlige produkter af biologisk oprindelse eller af biprodukter fra især landbrugs- og næringsmiddel--industrien).

En anden ulempe ved metoderne til chromatografi 20 i fast lag ligger i den korte levetid af harpikserne, som temmelig hurtigt ødelægges af de påvirkninger, som de udsættes for, når de sammenpresses, og de forskellige mellemliggende behandlinger med vaskning og rensning, som de underkastes.

25 De ovenfor anførte problemer er endnu ikke løst eller er løst på bekostning af en betydelig forøgelse af omkostningerne ved behandling af biologiske makromolekyler. På grund af den økonomiske betydning af denne type af behandlinger, som vedrører f.eks. både nærings-30 middelsektoren, den farmaceutiske sektor og den veterinære sektor, er der gennemført talrige undersøgelser med det formål at minimere de ovenfor anførte ulemper med henblik på en fuld udnyttelse af chroma tograf iske processers ydeevne til separation af biologiske makromolekyler.

35 Visse forfattere har således foreslået anvendelse af et

O

4

DK 165391 B

mobilt sammenpresset lag, som udgøres af et lag, der forskydes stykke for stykke ved udtagelse af harpiksen ved én ende og indføring af harpiksen ved den anden ende efter vaskning og rensning (D.T. Jones BSc, "Protein reco-5 very by ion exchange") . Der er imidlertid hidtil ikke fundet nogen løsning, som er tilfredsstillende til en generel anvendelse, og visse alvorlige ulemper består stadig, f.eks. nødvendigheden af at foretage en rensning, faldet af bindingskapaciteten og sliddet på de chromato-10 grafiske harpikser.

Herudover har man inden for andre tekniske sektorer og især ved uorganiske separationer, i lang tid gennemført chromatografier i fluidiseret lag, hvorved tilstopning undgås, og sliddet på harpikserne nedsættes: 15 - separation af metalioner: "A continuous ion exchange column, Turner og Church, Trans. Instn Chem. Engrs, bind 41, 1963, s. 283-288", - udvinding af uran: "Assessment of Fluidised Bed Ion Exchange Equipment, Michael J. Slater, J. Appl. Chem.

20 Biotechnol., 1975, bind 25, s. 367-378".

Disse metoder til chromatografi i fluidiseret lag har været kendt i over 20 år til separation af molekyler med lille størrelse (der har en god stabilitet) . Dog har bioteknologer aldrig forsøgt at anvende disse metoder til 25 chromatografi af biologiske makromolekyler, idet det altså har syntes at være umuligt at tilpasse denne teknik til nævnte behandlingstype, af mere eller mindre objektive grunde. Visse af disse beror efter specialisternes opfattelse på typen af chromatografiske harpikser, som er 30 specifikke for biologiske makromolekyler (for ringe kornstørrelse, vægtfylde for nær vægtfylden af vand, uegnet fysisk natur) , som det vil være umuligt at fluidisere uden at partikler medslæbes af strømmen. Andre grunde beror på de kinetiske forhold ved binding af biologiske ma-35 kromolekyler, der især på grund af de for store mellem-

O

5

DK 165391 B

rumsvolumener vil medføre et effektivitetstab i fluidi-seret lag, der vil gøre processen uanvendelig. Andre grunde beror på de infinitisemale hastigheder, hvormed det vil være nødvendigt at føre opløsningen gennem et 5 fluidiseret lag (uegnethed til industriel anvendelse).

Den eksisterende fordom er således allerede i 1980 blevet forankret tilstrækkeligt hos fagfolk til, at en fremragende bioteknolog i det ovennævnte litteratursted, "Methods of Plasma Protein Fractionation", 10 J.M. Curling, side 152, skriver: "Vi har valgt en søjle med fast lag snarere end en søjle med fluidiseret lag. Fluidiseringen kræver en opadstigende filtreringsstrøm og store, forholdsvis tunge partikler, for at disse kan holde sig i ligevægt 15 under disse opadrettede kræfter. 'Imidlertid er de ge ler, der står til rådighed til fraktionering af proteiner, .sjældent tungere end vand og giver suspensioner, der er yderst fortyndede, selv ved ringe strømningshastighed. Desuden skal størrelsen af kornene og 20 mellemrumsvolumenerne på grund af makromolekylernes langsomme diffusion være så lille som muligt for at forøge sandsynligheden for indtrængning af det flydende element i det indre porevolumen. Det faste lag fører til et minimalt søjlevolumen og medfører en vand-25 besparelse. Alle disse faktorer har økonomiske konse kvenser, som ikke må overses, når man vælger den generelle metode. Med alle disse krav er det klart, at anvendelsen af chromatografiske metoder i den biologiske industri kræver særlige bærere med helt specielle me-30 kaniske egenskaber. De bør være steriliserbare, når de anvendes i en søjle i den mest kompakte form, og de bør tillade meget høje strømningshastigheder, når der skal behandles flere hundrede eller flere tusinde liter væske pr. dag." 35 Det skal bemærkes, at der i to betydelig ældre pa-

O

6

DK 165391 B

tentskrifter (GB patentskrift nr. 1.148.661 (9. maj 1966) og FR patentskrift nr. 2.105.032 (17. september 1970)) i det ene beskrives en chromatografi af biologiske molekyler i fast lag, fluidiseret lag eller åben søjle, og i 5 det andet en ionbytning i fluidiseret lag til rensning af hårdt vand eller et uransalt, idet der som mulig anvendelse nævnes rensning af biologiske stoffer. Det vil imidlertid forstås, at teknikken ifølge disse patentskrifter ikke har kunnet forhindre opståelsen af den ovenfor omtalte 10 fordom. Det første patentskrift, som angår en behandling under turbulente betingelser, uafhængigt af om laget er fast, fludiseret eller åbent, beskriver således kun to eksempler på chromatografi af biologiske molekyler, som begge vedrører molekyler med lille størrelse, nemlig codein 15 og atropin. Desuden henvises der i dette patentskrift i den almindelige del til en række mulige anvendelser: hormoner, vitaminer, alkaloider og antibiotika, der alle er små molekyler, bortset fra visse hormoner. I det andet patentskrift gives der som eksempler kun rensning af hårdt 20 vand til fjernelse af dets salte og rensning af et uransalt. I dette patentskrift omtales der i den generelle indledning anvendelse af ionbytningsprocessen på biologiske stoffer, og det vides, at simple ionbytningsprocesser kun er anvendelige på molekyler med lille størrelse (i mod-25 sætning til chromatografiske processer, hvor der anvendes selektive chromatografiske harpikser af specifik type).

Ifølge den foreliggende opfindelse foreslås en forbedring af den kendte teknik til chromatografisk separation af biologiske makromolekyler inden for den biotekno-30 logiske sektor. Opfindelsen angår chromatografi af molekyler med høj molekylvægt (over 5000), såsom proteiner, enzymer, toksiner og antistoffer.

Et væsentligt formål med den foreliggende opfindelse er især for biologiske makromolekyler at muliggøre oc chromatografiske separationer, hvorved man undgår den al-

O

7

DK 165391 B

yorligste ulempe ved disse separationer, nemlig tilstopningen af lagene.

Et andet formål, der er knyttet til det foregående, er at opnå en væsentlig formindskelse af sliddet på 5 harpikspartiklerne, der udgør lagene.

Et andet formål er at muliggøre en kontinuerlig gennemførelse af separationerne.

Et andet formål er at gøre den chromatografiske separation af biologiske makromolekyler økonomisk anvende-10 lig i industriel målestok til et stort antal stoffer med høj molekylvægt, især med henblik på at forbedre værdien af f.eks. proteinholdige biprodukter fra landbrugs- og næringsmiddelindustrien, naturlige produkter, såsom mælk, blod, plasma eller serum, eller syntetiske produkter.

15 Til opfyldelse af disse formål angår opfindelsen en fremgangsmåde til chromatografisk separation af biologiske makromolekyler med en molekylvægt over 5.000, der findes i en opløsning, af den type, hvorved opløsningen bringes i kontakt med et lag af harpikser, der er chroma-20 tografisk selektive og specifikke for makromolekylerne, der skal separeres, med henblik på gennemførelse af en selektiv adsorption, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at: - der anvendes en chromatografisk harpiks med en 25 gennemsnitlig kornstørrelse Gm og en rumvægt Mv, hvis værdier ligger i området Z (ikke skraveret) i diagrammet i fig. 1, - den nævnte chromatografiske harpiks placeres i en søjle omfattende mindst én etage, der ved sin basis 30 er forsynet med et perforeret fordelingssystem med følgende karakteristika: - en åben tværsnitsandel på mellem 0,1 og 10%, - en gennemsnitlig diameter af de åbne tværsnit på over ca. 300 μπι, 35

O

8

DK 165391 B

* - en gennemsnitlig diameter af de åbne tværsnit på mellem 2 G og 20 G , - og at hver etage i søjlen via sit fordelingssystem fødes med opløsningen således, at laget af chroma- 5 tografisk harpiks fluidiseres, idet strømmen af opløsning indstilles således, at der i søjlen fås en lineær hastighed af væsken (henført til det totale tværsnit) på mellem 1,5 og 12 V hvor V f er den minimale hastighed for fluidisering af harpiksen.

10 Den gennemsnitlige kornstørrelse af harpiksen de fineres på sædvanlig måde ved formlen G _ ^xi Gi m .

15 hvor xi er massen af partikelfraktionen med kornstørrelsen Gi.

Det har således på uventet måde i forhold til den kendte tekniks oplysninger kunnet konstateres, at det er muligt at gennemføre en chromatografisk separation af bio-20 logiske makromolekyler ved selektiv adsorption i fluidise-ret lag, når man kombinerer de ovenfor anførte betingelser med hensyn til den chromatografiske harpiks og fordelingen af opløsningen (fordelernes struktur, fødestrøm). Som det fremgår af eksemplerne nedenfor, medfører anvendelsen af 25 et fluidiseret lag overraskende ikke en nedsættelse af den chromatografiske harpiks' udvekslingskapacitet, og den selektive materialeoverføring forbliver alt i alt omtrent den samme som den, der opnås i fast lag.

Der vælges fortrinsvis en chromatografisk harpiks 30 med en gennemsnitlig kornstørrelse Gm mellem 75 og 300 ^im, hvilket på diagrammet i figur 1 svarer til det vandrette bånd mellem grænsekurven C og de to rette linier og D2·

Det har vist sig at være af interesse, at spredningen af kornstørrelsen ikke er for stor, og der foretages fortrins-vis en forudgående sigtning af harpikserne for at begrænse

DK 165391 B

O

9 spredningen til højest 50% omkring gennemsnitsværdien G^.

Ifølge en foretrukken udførelsesform anbringes den chromatografiske harpiks desuden i en i det væsentlige lodret søjle omfattende mellem 2 og 5 over hinan-5 den liggende etager, som gennemløbes successivt af opløsningen, idet fraførsien af opløsningen sker ved overløb i den øvre del af den øverste etage, og idet hver etage (med undtagelse af denne sidste) er afgrænset af to perforerede fordelingssystemer, hvor det ene fordeler op-10 løsningen ved basis af den pågældende etage, og den anden fordeler opløsningen mod etagen, der befinder sig umiddelbart derover.

Det er blevet konstateret, at fraktioneringen i fluidiseret lag i flere etager ved anvendelse af en be-15 stemt samlet mængde chromatografisk harpiks giver en betydelig forbedring af separationens ydeevne i et givet tidsrum og gør det muligt at nærme sig den ydeevne, der opnås i fast lag. Dette fænomen kan forklares ved, at den omhandlede udformning virker i retning af at genska-20 be en koncentrationsgradient (som fremmer separationen) , der naturligvis foreligger i et fast lag, men ikke i et fluidiseret lag i en enkelt etage.

På denne måde gør fremgangsmåden ifølge opfindelsen det muligt at opnå i det væsentlige samme ydeevne 25 som ved anvendelse af et fast lag, samtidig med at man undgår de alvorlige ulemper ved anvendelsen af denne lagtype, nemlig tilstopning og nødvendighed af rensning, og nedbrydning af harpikserne på grund af sammenpresning og rensning. Således muliggør det fluidiserede lag fri pas-30 sage af urenheder i opløsningen uden risiko for tilstopning, og det er ikke nødvendigt at foretage nogen rensning, hvilket forlænger harpiksernes levetid betydeligt.

Endvidere kan fremgangsmåden gennemføres kontinuerligt på grund af fraværelsen af de begrænsninger, som rensningerne skaber. Den chromatografiske harpiks kan 35

DK 165391 B

10 o bringes til at cirkulere kontinuerligt fra søjlens top til bund, idet der sker en kontinuerlig tilførsel af harpiks ved den øvre del og en kontinuerlig fjernelse ved den nedre del, og separationen i fluidiseret lag gennem-5 føres kontinuerligt i søjlen, idet der sideløbende hermed gennemføres vasknings-, eluerings- og vaskningsproces-ser uden for søjlen.

Man må ikke forveksle de klassiske vaskningsproces-ser, der består i en simpel skylning med destilleret, valid 10 eller en anden opløsning, eller elueringsprocesser, der består i en passage af en regenereringsopløsning, med de rensningsprocesser, der ved de kendte fremgangsmåder kræver en mekanisk og energisk behandling af harpikserne og medfører en nedbrydning af disse og vanskeligheder med at 15 gennemføre processen kontinuerligt.

Cirkulationen af harpiksen mellem de over hinanden anbragte etager kan ske via et passagerør, der er anord-net således, at det tillader harpiksen at cirkulere ved overløb gennem røret fra etagen ovenover til etagen ne-20 denunder.

Desuden er der fortrinsvis anordnet en eller flere ledeplader i hver etage, således at der sikres en fuldstændig fornyelse af harpiksen i etagen uden fremkomst af "døde" zoner.

25 Naturligvis kan fremgangsmåden ifølge opfindelsen i påkommende tilfælde gennemføres diskontinuerligt. Den chromatograflske harpiks indesluttes da i hver etage i kolonnen uden cirkulation fra én etage til en anden, og separationen i fluidiseret lag gennemføres i cycler med 30 selektiv binding, vaskning, eluering og vaskning i søjlen. Denne udførelsesform er fordelagtig i forhold til separationer i fast lag af de allerede anførte grunde, idet det især ikke er nødvendigt at demontere søjlen, når der skal foretages en rensning.

35 Ved de to udførelsesformer (kontinuerligt, diskon-

DK 165391 B

11 o tinuerligt) fødes søjlen fordelagtigt således, at strømmen af opløsning i det indre af denne i det væsentlige er konstant, i det mindste i stadierne med selektiv binding, idet variationen af denne strøm i forhold til den 5 nominelle værdi er mindre end - 5%.

Denne foranstaltning sikrer en stabil fluidise-ring af den chromatografiske harpiks uden risiko for tilfældig medslæbning af korn.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er generelt an-10 vendelig til separation af alle biologiske makromoleky-ler. Fagmanden kan til enhver anvendelse vælge en selektiv chromatografisk harpiks (betingelserne med hensyn til rumvægt og kornstørrelse er anført i diagrammet i figur 1) og tilvejebringe et perforeret fordelingssystem, 15 der passer til harpiksens kornstørrelse (jf. de ovenfor anførte betingelser vedrørende diametre af åbne sektioner) .

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan især anvendes til chromatografisk separation af proteiner i valle.

20 Den anvendte harpiks kan især være en harpiks af typen "Spherosil", der forhandles af firmaet Rhone-Poulenc og beskrives i FR patentskrift nr. 2.321.932. Denne harpiks opfylder de specifikationer, der er angivet i diagrammet i figur 1.

25 I det følgende gives der eksempler på gennemførelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hvor denne dels gennemføres i et diskontinuerligt apparat (eksempel 1 og 2) og dels i et kontinuerligt apparat (eksempel 3). Disse apparater er vist i figurerne på tegningen.

30

Fig. 1, som allerede er omtalt, giver specifikationerne for egnede harpikser, fig. 2 viser skematisk et diskontinuerligt apparat til gennemførelse af den omhandlede fremgangsmåde, 35 fig. 3 viser et lodret tværsnit af en detalje af

DK 165391 B

12

O

søjlen i det nævnte apparat, fig. 4 viser skematisk et kontinuerligt apparat, fig. 5 viser et lodret tværsnit af en detalje af søjlen i det nævnte apparat, 5 fig. 6 viser et tværsnit i det vandrette plan AA', og fig. 7, 8 og 9 er diagrammer, der som funktion af tiden viser forløbet af opløsningens udløbskoncentration for hvert af eksemplerne 1-3.

10 Apparatet, der er vist eksempelvis i fig. 2 og 3, er beregnet til at sikre en chromatografisk separation af biologiske makromolekyler ved en proces med cyclisk funktion, der skifter mellem en bindingsfase, en vask-ningsfase, en elueringsfase og en ny vaskningsfase.

15 Under disse forskellige faser er den specifikke chromatografiske harpiks indesluttet i en lodret søjle 1 med flere etager, såsom 3 eller 4. Der kan i praksis være anordnet tre eller fire etager.

Søjlen 1 omfatter et bundstykke 2, der gør det mu-20 ligt at fordele opløsningerne mod den nedre etage 3 gennem et perforeret fordelingssystem. Dette system er identisk for alle etagerne og er betegnet 5 og vist i forstørret skala i fig. 3.

Det omfatter to perforerede cylindriske plader 6 25 og 7 (eller eventuelt et større antal plader), som er placeret ovenpå hinanden, idet der ved hjælp af mellemstykker 8 opretholdes et mellemrum mellem pladerne.

Pladerne 6 og 7 er forsynet med perforeringer 6a og 7a, således at disse perforeringer er forskudt i for-30 hold til hinanden.

Pladerne har en sådan fordelingstæthed, at andelen af åbne sektioner er mellem 0,1 og 10%, især 5% i de nedenfor beskrevne eksempler. Ved andelen af åbne sektioner forstås der, som det er sædvane, forholdet i et 35 tværsnit mellem summen af åbne overflader og pladens nyt-

O

13

DK 165391 B

tige overflade.

Desuden er perforeringerne i hver plade anordnet med en diameter hver især på over 300 ^im. Over denne tærskelværdi er diameteren af perforeringerne tilpasset 5 til den gennemsnitlige kornstørrelse Gm af den anvendte harpiks. En værdi af størrelsesordenen 4 til 6 Gm synes at give de bedste resultater. For eksempel anvendes der til de i eksemplerne anvendte "Spherosil"-harpkser plader med perforeringer med en diameter på 1 mm. Pladerne 10 6 og 7 holdes på plads af ringformede flanger 9 med bol te. De cylindriske dele 3 eller 4 eller fodstykket 2 er ved deres periferi fastgjort til de indre ringformede overflader af disse flanger 9. Desuden sikrer ringformede pakninger, såsom 10, tætheden udadtil, dels mellem 15 pladerne og dels mellem pladerne og flangerne.

Opløsningen (opløsningen, der skal behandles under bindingsfasen, opløsning af destilleret vand under vaskningerne eller regenereringsopløsning under elue-ringsfasen) løber ind i fodstykket 2 via en ledning 11.

20 Til sikring af en strengt konstant strøm er disse opløsninger placeret i reservoirer 12 (opløsning, der skal behandles, eller regenereringsopløsning) og 13 (opløsning af destilleret vand), der er anordnet i en passende højde over søjlen 1 til at kunne give den ønskede strøm. En 25 . strømningsmåler 14 og en skydeventil 15 gør det muligt at foretage en fin regulering af denne strøm.

Opløsningen, der skal behandles, opbevares i en beholder 16, hvor den omrøres og holdes ved en bestemt temperatur. Regenereringsopløsningen opbevares under de 30 samme betingelser i en beholder 17. Det destillerede vand opbevares i en beholder 18. Opløsningen, der løber ud fra søjlen, kan opbevares i en beholder 19. En pumpe 20 og et system af rørledninger og ventiler gør det muligt i hver fase at forsyne reservoirerne 12 eller 13 med 35 passende opløsninger fra beholderne 16-18, således at re-

O

14

DK 165391 B

servoirernes niveau i det væsentlige er konstant.

Det ovenfor beskrevne system sikrer fødning af søjlen 1 med en strøm, hvis variationer i praksis er under - 5 %.

5 Ved udløbet fra søjlen 1 opsamles væsken ved over løb i den øvre del af den øverste etage og kan eventuelt oplagres i beholderen 19.

I fig. 4 er der skematisk vist et apparat, der er modificeret til at muliggøre en kontinuerlig funktion.

10 Søjlen, dens perforerede fordelingssystemer og anordningerne til tilførsel af væske med konstant strøm ligner de ovenfor beskrevne.

I dette apparat bringes den chromatografiske harpiks dog til at cirkulere kontinuerligt fra en etage til 15 etagen nedenunder, og vasknings- og elueringstrinnene gennemføres uden for søjlen, idet den chromatografiske fiksering sker kontinuerligt i sidstnævnte.

Foranstaltningerne, der foretages i apparatet, er følgende: 20 Som vist i fig. 5 er der mellem to oven på hinan den anordnede etager i søjlen placeret et rør 21 til passage af harpiks, der går gennem det perforerede fordelingssystem. Dette rør strækker sig mellem den øvre del 21a af laget i etagen ovenover og den nedre del 21b af 25 laget i etagen nedenunder. På denne måde kan harpiksen cirkulere ved overløb gennem de forskellige rør 21 og gradvis komme fra én etage til etagen nedenunder denne.

For at muliggøre dette overløb går hvert passagerør 21 et stykke Ηβ ind i hver etage under stykket Hg 30 af den ikke-optagne del af hver etage.

På denne måde løber laget af fluidiseret harpiks, der dannes i det indre af hvert rør 21, ikke ud af røret i etagen ovenfor, hvilket er betingelsen for cirkulation af harpiksen fra én etage til etagen nedenunder 35 under tyngdekraftens virkning.

O

15

DK 165391 B

Endvidere er der i hver etage placeret en chikane 22 mellem de to åbninger af de to rør 21, der udmunder i den pågældende etage (den nedre åbning 21'b af røret, der står i forbindelse med etagen ovenover, og den øvre åbning 5 21a i røret, der står i forbindelse med etagen nedenunder).

* Hver chikane 22 kan udgøres af et rørstykke 22, der omgi ver røret 21. Dette rørstykke går ved den øvre del længere op end niveauet af åbningen 21a og opretholder ved sin nedre del en passage 22a for harpiksen.

10 Harpiksen, der kommer fra etagen ovenover og løber ud gennem åbningen 21'b, er mindre ladet og derfor generelt lettere og er tilbøjelig til at stige opad i laget. Chikanen forhindrer, at der dannes en "kortslutning" af harpiksen mellem de to åbninger 21'b og 21a. Den under-15 trykker døde områder i laget, hvor harpiksen ikke fornyes, og sikrer således en fuldstændig fornyelse af denne (det skal bemærkes, at for visse harpikser og visse makromole-kyler, der skal fikseres, ændres harpiksens rumvægt ikke under udvekslingen; i dette tilfælde er chikanen mindre 20 væsentlig, men forbedrer den samlede ensartethed af fikseringen) .

Desuden, i den nedre del af søjlen, går det nedre passagerør 23 gennem tilførselsfodstykket og er kombineret med hydrauliske anordninger til transport af harpik-25 sen 24, f.eks. til et regenereringskar 25. Harpiksen i dette kar regenereres i en ekstern søjle, der ligeledes kan fungere med fluidiseret lag. Transporten mod denne søjle kan foretages kontinuerligt.

Den regenererede chromatografiske harpiks place-30 res i et oplagringsreservoir 26, enten ved kontinuerlig overføring fra regenereringssøjlen eller ved manuel tilførsel. Dette hermetisk lukkede reservoir er fyldt med destilleret vand og kan fødes med destilleret vand via en ledning 27, der omfatter en ventil og en strømnings-35 måler.

O

16

DK 165391 B

Harpiksen kan hydraulisk transporteres gennem et rør 28 til et transportbånd 29, der er kombineret med en vakuumpumpe med henblik på at fjerne vandet, der omgiver harpikskornene.

5 Transportbåndet 29 fører den regenererede harpiks i en regulerbar strøm til et øvre passagerør 21", der foroven er forsynet med en tragt.

Eksempel 1 og 2 er gennemført med et apparat af den type, der er vist i fig. 2, og eksempel 3 er gennem-10 ført i et apparat af den type, der er vist i fig. 4 og 5.

Eksempel 1.

Søjlen i apparatet omfatter i dette eksempel tre etager. Højden af hver etage er 50 cm, og diameteren af 15 søjlen er 5 cm.

Eksemplet omhandler ekstraktion af albuminerne β--lactoglobulin (molekylvægt af dimerformen: 34.000) og a-lactalbumin (14.000) fra sødt laktoserum, der fås som biprodukt ved fremstilling af ost fra "Fromageries Bel".

20 Den anvendte chromatografiske harpiks er en "Spherosil QMA"-harpiks fremstillet af Rhone-Poulenc. Kornstørrelsesfordelingen til at begynde med er 100-300 ^am. Der foretages en tør sigtning til tilbageholdelse af korn på mellem 200 og 250 ^am, dvs. med en gennemsnitlig kornstør-25 relse Gm = 225 ^am. Rumvægten af "Spherosil QMA"-harpik-sen er Mv = 1400 kg/m^. Parret af værdier (G^, Mv) , som karakteriserer den nævnte harpiks, er vist ved punktet R i diagrammet i fig. 1.

Denne harpiks er en chromatografisk harpiks be- 30 stående af sfæriske siliciumdioxidkorn med en specifik 2 overflade på 25 m /g, en gennemsnitlig porediameter på 3 1250 Å og et porevolumen på 1 cm /g, der er overtrukket med en tværbundet styren-vinyltriethoxysilan-polymer, der bærer følgende funktionelle grupper: 35

O

17

DK 165391 B

CH-3 I 3 - / O \ - CH - N + - CH3 Cl

Jh3 5 Den minimale fluidiseringshastighed af en sådan -4 harpiks er V ^ = 1,4 x 10 m/sek.

Den gennemsnitlige diameter af de åbne tværsnit af fordeleren i hver etage i søjlen svarer under disse betingelser til ca. 4 Gm· 10 Den i hver etage anbragte mængde harpiks er 130 cm3.

Søjlen fødes ved sin basis med laktoserum i en strøm på 9 liter/time, der ikke varierer mere end 5% i forhold til denne nominelle værdi takket være naturen 15 af de anvendte fødeanordninger (fyldekar i bestemt højde).

Denne strøm svarer i en søjle med et tværsnit på -3 2 -3 1,96 x 10 m til en væskehastighed på 1,3 x 10 m/sek., dvs. 9 Vmf.

Når strømmen er etableret, konstateres det, at la-20 get i hver etage undergår en udvidelse på 64% og udviser en højde på 20 cm. Der konstateres visuelt en god stabil fluidisering.

Ved indløbet udviser laktoserummet følgende koncentrationer: 3,0 g/liter β-lactoglobulin og 1,2 g/liter 25 a-lactalbumin.

Fremgangsmåden gennemføres i 2 timer. Fig. 7 viser kurver, der som funktion af tiden angiver forholdet mellem koncentrationen ved udløbet fra hver etage C og begyndelseskoncentrationen Co. Kurverne c^, a2 og a3 vi-30 ser variationen af C/Co for α-lactalbumin ved udløbet fra henholdsvis den nedre etage, mellemetagen og den øvre etage. Kurverne β^, β2 °9 ^3 viser variationen af C/Co for β-lactoglobulin ved udløbet fra henholdsvis den nedre etage, mellemetagen og den øvre etage. Målingerne 35 er gennemført på prøver, der er udtaget hvert tredie mi-

O

18

DK 165391 B

nut, ved zoneelektroforese på en celluloseacetatmembran.

Det konstateres, at i 30 minutter fikseres β-lac-toglobulin og a-lactalbumin fuldstændigt til harpiksen (det første vandrette stykke af kurverne og β^), hvor-5 efter kun β-lactoglobulinet, fortsætter med at blive ad-sorberet i ca. 15 minutter, medens a-lactalbuminet findes i udløbsstrømmen fra søjlen.

Når fikseringsprocessen er afsluttet (C/Co = 1), foretages der en vaskning med destilleret vand i ca. 20 to minutter.

Harpiksen elueres derefter ved hjælp af 0,1N saltsyre i 2 timer.

Der foretages derefter en ny vaskning med destilleret vand i ca. 1 time, og søjlen er klar til en ny cy-15 clus.

Under alle disse operationer (vaskning, eluering) fluidiseres harpiksen i søjlen på analog måde.

Mængden af proteiner, som kommer ud i den eluere-de fase, er for β-lactoglobulin 10,5 g, hvilket svarer 20 til en fiksering på 102 mg pr. g tør harpiks, og for a--lactalbumin 1,7 g, hvilket svarer til 16,5 mg pr. g tør harpiks. Eluatet indeholder altså 86,1% β-lactoglobulin og 13,9% α-lactalbumin. Imidlertid er de relative, andele af disse proteiner i udgangsmaterialet 71% β-lacto-25 globulin og 29% α-lactalbumin. Der sker altså en berigelse med hensyn til β-lactoglobulin.

Elueringsproduktet indeholdende disse proteiner er befriet for lactose, fint caseinmateriale og uorganiske salte, som findes i laktoserum, og proteinerne er rene 30 og i deres native (ikke-denaturerede) tilstand.

Bindingskapaciteterne af "Spherosil QMA"-harpik-sen i fluidiseret lag i tre etager er i det væsentlige de samme som dem, der er opnået ved hjælp af et fast lag ifølge ældre arbejder, jf. følgende publikationer: 35 P.J. Skudder, "Recovery and Fractionation of Pro-

O

19

DK 165391 B

teins from Cheese whey using a Porous Silica-Based Ion Exchange Medium", Chemistry and Industry 21, 810-814 (1983.) , C.M. Bourgeois og P. Leroux, "Proteines Animales 5 (Extraits Concentrés et isolats en alimentation humaine)", kapitel 3, Collection Sciences Techniques agro-alimentair-es, Lavoisier (DR).

De ovenfor beskrevne forsøg er blevet gentaget dusinvis af gange, uden at der er blevet konstateret nogen 10 tilstopning af hverken laget eller fordelerne. Der skal bemærkes, at det anvendte laktoserum foreligger i rå tilstand og indeholder faste urenheder i suspension.

Desuden observeres der ingen formindskelse af har-pisens virkningsgrad eller noget slid af denne.

15

Eksempel 2.

Dette eksempel gennemføres under de samme betingelser som i eksempel 1, bortset fra at mængden af harpiks, som anbringes på hver etage, er 110 cm .

20 Når strømmen er etableret, konstateres det, at la get i hver etage undergår en udvidelse på 69% og udviser en højde på 18 cm. Der konstateres visuelt en god stabil fluidisering.

Ved indløbet har laktoserummet de samme koncentra-25 tioner som i eksempel 1 (3,0 g/liter β-lactoglobulin og 1,2 g/liter α-lactalbumin).

Fremgangsmåden gennemføres i 2 timer. Fig. 8 viser kurverne, der som funktion af tiden angiver forholdet mellem koncentrationen ved udløbet fra hver etage C 30 og begyndelseskoncentrationen Co.

Idet mængden af harpiks på hver etage er mindre end i eksempel 1, konstateres det, at de tidsrum, i hvilke dels hele mængden af de to proteiner og dels β-lacto-globulinet alene adsorberes, er kortere end i eksempel 1 35 (hver ca. 15 minutter).

0

DK 165391 B

20

Der foretages derefter vaskning, eluering og vask-ning på samme måde som i eksempel 1.

Den opnåede mængde af proteiner svarer til en fiksering på 110 mg pr. g tør harpiks for β-lactoglobulin og 5 19,5 mg pr. g tør harpiks for α-lactalbumin. Eluatet inde holder altså 84,9% β-lactoglobulin og 15,1% a-lactalbumin. Inden for forsøgs- og analyseusikkerheden er disse andele analoge med dem, der observeres i eksempel 1.

to Eksempel 3.

Dette eksempel gennemføres i apparatet beskrevet ovenfor og vist i fig. 4 og 5. Søjlen har tre etager med en højde på 60,5 cm.

Dette eksempel omhandler ekstraktion af albuminer-ts ne ,β-lactoglobulin og α-lactalbumin fra sødt lactoserum, der fås som biprodukt ved fremstilling af ost fra "Fromageries Bel".

Den anvendte harpiks ("Spherosil QMA") har de samme karakteristika som i eksempel 1.

20 Den gennemsnitlige diameter af de åbne tværsnit i fordeleren i hver etage i søjlen er 4 Gm·

Forbindelsesrørene, der tjener til at føre harpiksen ovenfra og nedad i søjlen, har en indvendig diameter på 1,4 cm og er forlænget til en højde Ηβ på 25 cm i hver 25 etage.

Strømmen af harpiks, der føres til søjlen, holdes på 0,14 liter/time.

Systemet til fjernelse af harpiksen ved søjlens basis omfatter tre elektromagnetiske ventiler, der regu-30 leres af et kontaktur. Partiklerne af fast stof løber gen nem den åbne ventil og opsamle's i et rør af blød plast.

Hvert 20. sekund lukkes den Øvre ventil, medens der via sideventilen, som åbnes samtidig med den nedre ventil, indsprøjtes destilleret vand, som fører partiklerne med 35 nedad.

O

21

DK 165391 B

Søjlen fødes ved sin basis med laktoserum i en strøm på 9 liter/time, idet denne strøm reguleres på samme måde som i eksempel 1.

Når strømmen er etableret, konstateres det, at 5 laget i hver etage udviser en højde på 25 cm svarende til højden HL af forbindelsesrøret på den pågældende Γ) etage.

Hver etage har en højde på 60,5 cm, således at højden af det fluidiserede lag, der tilbageholdes i 10 forbindelsesrøret i etagen, er lavere end højden af det fluidiserede lag i etagen umiddelbart ovenover, hvorved overløb af harpiks i etagen ovenover forhindres.

Der konstateres visuelt en god stabil fluidise-ring og en god cirkulation af de to faste og flydende 15 faser.

Ved indløbet har laktoserummet følgende koncentrationer: 3,0 g/liter β-lactoglobulin og 1,2 g/liter a-lactalbumin.

Fremgangsmåden fungerer kontinuerligt, men i det 20 foreliggende eksempel gennemføres den i tre timer. Fig.

9 viser kurverne, der som funktion af tiden angiver forholdet mellem koncentrationerne ved udløbet fra hver etage C og begyndelseskoncentrationen Co.

Det konstateres, at processen har en overgangsfa-25 se, før den når en stationær funktionstilstand.

Det bemærkes, at α-lactalbumin (alf α2, a^) tilbageholdes i mindre mængde på harpiksen end β-lactoglo-bulin (β-^ β2, β3) .

Ved udløbet fra søjlen (tredie etage) indeholder 30 væsken ca. 50% α-lactalbumin i forhold til begyndelsesværdien, medens den kun indeholder 25% β-lactoglobulin, idet resten er fikseret til harpiksen.

35

Claims (11)

1. Fremgangsmåde til chromatografisk separation af biologiske makromolekyler med en molekylvægt over 5.000, som er indeholdt i en opløsning, af den type, hvorved op-5 løsningen bringes i kontakt med et lag af harpikser, der er chromatografisk selektive og specifikke for makromolekylerne, der skal separeres, med henblik på gennemførelse af en selektiv adsorption, kendetegnet ved, at - der anvendes en chromatografisk harpiks med en 10 gennemsnitlig kornstørrelse G^ og en rumvægt Mv, hvis værdier ligger i området Z (ikke skraveret) i diagrammet i fig. 1, - den chromatografiske harpiks placeres i en søjle omfattende mindst én etage, der ved sin basis er for- 15 synet med et perforeret fordelingssystem med følgende karakteristika: - en åben tværsnitsandel på mellem 0,1 og 10%, - en gennemsnitlig diameter af de åbne tværsnit på over ca. 300 μιη, 20. en gennemsnitlig diameter af de åbne tværsnit på mellem 2 G og 20 G , m r m - og at hver etage i søjlen via sit fordelingssystem fødes med opløsningen således, at laget af chromatografisk harpiks fluidiseres, idet strømmen af opløsning 25 indstilles således, at der i søjlen fås en lineær hastighed af væsken (henført til det -totale tværsnit) på mellem 1,5 og 12 V hvor V ^ er den minimale hastighed for fluidisering af harpiksen.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den chromatografiske harpiks placeres i en i det væsentlige lodret søjle omfattende mellem 2 og 5 over hinanden anbragte etager, der successivt gennemløbes af opløsningen, og fjernelsen af opløsning sker ved overløb fra 35 den øvre del af den øverste etage, og hver etage (med und- 0 23 uiv loojy i a tagelse af denne sidstnævnte) er afgrænset af to perforerede fordelingssystemer, hvor det ene fordeler opløsningen ved basis af den pågældende etage, og det andet fordeler opløsningen nær den etage, der er anbragt umiddelbart oven-5 over.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at søjlen fødes således, at strømmen af opløsning i det indre af denne i det væsentlige er kon- 10 stant under i det mindste stadierne med selektiv fiksering, idet variationen af denne strøm i forhold til den nominelle værdi er mindre end - 5%.

4. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 1-3, k e n- 15 detegnet ved, at hvert perforeret fordelingssy stem dannes af mindst to perforerede plader, der er an» bragt over hinanden med en vis afstand mellem pladerne, og pladerne er forsynet med perforeringer og er placeret således, at perforeringerne i én plade er forskudt i for- 20 hold til perforeringerne i den eller de tilstødende plader.

5. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 1-4, k e n-detegnet ved, at den chromatografiske harpiks er 25 indesluttet i hver etage i søjlen uden cirkulation fra en etage til en anden, og separationen i fluidiseret lag gennemføres ved cycler med selektiv fiksering, vaskning, eluering og vaskning i søjlen.

6. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 1-4, k e n- detegnet ved, at den chromatografiske harpiks bringes til at cirkulere kontinuerligt ovenfra og nedad i søjlen med kontinuerlig tilførsel af harpiks ved den øvre del og kontinuerlig fjernelse ved den nedre del, og 35 O 24 DK 165391 B separationen i fluidiseret lag gennemføres kontinuerligt i søjlen med samtidig gennemførelse af vasknings-, elue-rings- og vaskningsprocesser uden for søjlen.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 2og6, kende- tegnet ved/ at der mellem to over hinanden anbragte etager i søjlen placeres et rør til passage af harpiksen, der går gennem fordelingssystemet og strækker sig mellem den nedre del af laget i etagen ovenover og den øvre del 10 af laget i etagen nedenunder, og harpiksen ved overløb cirkulerer i røret fra etagen ovenover til etagen nedenunder .

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendete g-15 net ved, at der i hver etage i laget af harpiks anord- nes mindst én chikane mellem åbningen af røret, der står i forbindelse med etagen nedenunder, og åbningen af røret, der står i forbindelse med etagen ovenover, således at der sikres en fuldstændig udskiftning af harpiksen i eta-20 gen.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7 eller 8, kendetegnet ved, at passagerørene er anordnet således i søjlen, at laget af fluidiseret harpiks, der dannes i et 25 rør i en given etage, ikke ved overløb fra røret løber ud i etagen overover.

10. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 1-9, kendetegnet ved, at der separeres proteiner i 30 et laktoserum.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at der til ekstraktion af albuminerne β-lacto-globulin og a-lactalbumin i et laktoserum anvendes en 35 chromatografisk harpiks med en rumvægt på 1400 kg/m og en kornstørrelse på 225 μπι, der i forvejen er blevet sigtet, således at spredningen af kornstørrelser omkring denne gennemsnitsværdi højest er 50%.