DK161105B - Bakteriophag samt fremgangsmaade til fremstilling deraf - Google Patents
Bakteriophag samt fremgangsmaade til fremstilling deraf Download PDFInfo
- Publication number
- DK161105B DK161105B DK179078A DK179078A DK161105B DK 161105 B DK161105 B DK 161105B DK 179078 A DK179078 A DK 179078A DK 179078 A DK179078 A DK 179078A DK 161105 B DK161105 B DK 161105B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- phage
- bacteriophage
- dna
- endonuclease
- ifo
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
DK 161105 B
Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt bakteriophag med den egenskab, at dens phag-DNA, når den inficerer en værtscelle, kan integreres i værtscellens DNA ved lysogeni samt en fremgangsmåde til fremstilling deraf.
5 Den genetiske manipulation er et nyt forskningsområde, som er fremkommet som følge af på den ene side det hurtige fremskridt inden for forskningen vedrørende genetiske og kemiske egenskaber af repliconer såsom plasmider og bak-teriophager og på den anden side fremskridtet inden for 10 forskningen vedrørende enzymer med virkning på DNA (desoxy-ribonucleinsyre), især endonucleaser, som erkender en specifik nucleotidsekvens i DNA og forårsager spaltning af poly-nucleotidkæder (restriktionsenzym), og DNA-ligaser.
Forskningen inden for området genetisk manipulation 15 antages at føre biologien ind i et nyt og meget omfattende område, der ikke tidligere har været tilgængeligt med den konventionelle tekniske viden. Først og fremmest er den forventede frigørelse af gensystemet fra dets afhængighed af naturlig rekombination et problem, som har vakt stor 20 interesse. Endvidere antages det, at genmanipulation i fuldt udviklet form vil kunne føre til dannelsen af mikroorganismer med såkaldte "ønskelige egenskaber", og i løbet af nogen tid vil kunne udnytte højere organismer i menneskehedens tjeneste.
25 Der kendes forskellige fremgangsmåder til gennemfø relse af genrekombination. Eksempelvis kan nævnes den kendte fremgangsmåde for in vitro rekombinationen af Drosophila melanogaster-DNA med λ-phag-DNA. Da imidlertid rekombinationsstedet er det DNA-område, som bærer den genetiske infor-30 mation, der er nødvendig for lysogeniseringen af phagen, er det umuligt at integrere den dannede hybrid-DNA i værtscellens DNA. I praksis er det derfor altid nødvendigt at konservere værtscellen og phagen klar til anvendelse, men konserveringen af phagen udgør et problem. Når endvidere et plasmid 35 med en rekombineret genetisk information for et specifikt enzymprotein inficerer værten, vil dannelsen af det speci- 2
DK 161105 B
fikke enzym foregå kontinuert (som følge af gendoseringsvirk-ningen), selv når værtscellerne findes i konserveret tilstand, og således bevirke væsentlig forstyrrelse i værtsorganismens stofskifte og fremkalde forskellige sekundære 5 variationer for at kompensere for forstyrrelsen. Nogle af plasmiderne undergår f.eks. variation for at formindske antallet af kopier af plasmidet, medens andre gennem variation får en sådan opførsel, at enzymets funktion eller syntetiske aktivitet aftager, eller andre stofskiftesystemer 10 påvirkes med henblik på at korrigere den forstyrrede karakter. Som følge af sådanne sekundære variationer, der i udstrakt grad påvirker resultaterne, er den praktiske genetiske rekombinationsprocedure langt fra tilfredsstillende.
Under disse omstændigheder er der i forbindelse med 15 den foreliggende opfindelse gennemført udstrakt forskning under anvendelse af bakteriophag for at eliminere ovennævnte vanskeligheder.
Phagpartiklen består sædvanligvis af protein og nucle-insyre (DNA eller RNA), som danner en struktur, hvori nucle-20 insyren er omgivet af proteinet, de såkaldte hylsterproteiner (coat proteins). Nucleinsyren bærer alle de genetiske informationer, som er nødvendig for bakteriophagens formering ved inficering af en værtscelle. I tilfældet med bakteriophag λ bærer f.eks. den ene halvdel af DNA-kæden gener, som er 25 nødvendige for selvkopieringen, og den anden halvdel bærer den genetiske information for syntesen af hylsterproteineme, jf. A.D. Hershey, "The Bacteriophage Lambda", Cold Spring Harbor Lab., side 45, 1971. Hvis derfor et phag-DNA-segment, som bærer den genetiske information, som koder for syntesen 30 af hylsterproteiner, erstattes med et andet DNA-segment, som bærer den genetiske information for kodning af f.eks. syntesen af et nyttigt enzym ved hjælp af endonuclease og DNA-ligase, synes det muligt at tilskynde phagen til ved infektion af en værtscelle at syntetisere en stor mængde af 35 det nyttige enzym i stedet for hylsterproteinet.
3
DK 161105 B
Da imidlertid bakteriophagen sædvanligvis har endo-nuclease-sensitivitet selv i dens DNA-område, som deltager i selvkopieringen, undergår den spaltning i nævnte område ved indvirkning af endonuclease, og selvkopieringen bliver 5 umulig.
I forbindelse med den foreliggende opfindelse har man derfor koncentreret bestræbelserne på at eliminere endo-nucleasesensitiviteten i det DNA-område, som deltager i selvkopieringen, uden at forstyrre selvkopieringsevnen, og 10 at bevare endonucleasesensitiviteten i det DNA-område, som deltager i syntesen af hylsterproteiner. Det har vist sig, at det ved hybridisering mellem en phag, som ikke indeholder nogen af de steder, som kan spaltes af endonuclease, og en phag af samme eller en beslægtet art med spaltningssteder i 15 det tilsigtede DNA-område eller beslægtet område, er muligt let og effektivt at fremstille et selvreproducerbart hybrid--DNA-molekyle, som bevarer endonucleasesensitiviteten i det tilsigtede DNA-område.
Formålet med opfindelsen opnås med den her omhandlede, 20 hidtil ukendte bakteriophag af den ovenfor angivne type, som er ejendommelig ved, at dens DNA-molekyle kun er endo-nucleasesensitivt i det DNA-område, som bærer den genetiske information for dannelsen af hylsterproteiner. Derfor kan den genetiske information i nævnte område erstattes med en 25 anden tilsigtet genetisk information til dannelse af et selvreproducerbart hybrid-DNA-molekyle.
Den her omhandlede bakteriophag er således ejendommelig ved at have et DNA-molekyle, som kun er endonuclea-sesensitivt i det DNA-område, som bærer den genetiske infor-30 mation for dannelsen af hylsterproteiner.
Opfindelsen angår desuden en fremgangsmåde til fremstilling af den her omhandlede bakteriophag, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en lambdoid bakteriophag gøres endonucleaseresistent, og den fremkomne bakteriophag 35 parres med en lambdoid phag, som har endonucleasesensitivitet i det DNA-område, som bærer genetisk information for dannel- 4
DK 161105 B
sen af hylsterproteiner, til dannelse af en bakteriophag, som kun har endonucleasesensitivitet i det DNA-område, som bærer genetisk information for dannelsen af hylsterproteiner.
Opfindelsen beskrives mere detaljeret i det følgende.
5 Selv om en bakteriophag sædvanligvis formerer sig mere eller mindre afhængigt af funktionen hos dens vært, er det en replicon, som kan formere sig selvstændigt uden for værtschromosomet, nemlig i dens autonome tilstand. Den ved den foreliggende opfindelse anvendte bakteriophag er som 10 ovenfor nævnt en phag med den egenskab, at dens phag-DNA, når phagen inficerer en værtscelle, kan integreres i værtscellens DNA under passende betingelser (lysogeni). Foretrukne phager er tempererede phager, især lambdoide phager, f.eks. λ (IFO 20016), 434 (IFO 20018) , 82 (IFO 20019), Φ80 (IFO 15 20020), Φ170 (IFO 20021). Endvidere kan der anvendes phager lysogeniseret i en passende værtscelle, f.eks. Φ80 lysogeni-seret i E. coli W 3110 [E. coli K12 stamme W 3110 (Φ80) (ATCC 31277)], λ cl 857 lysogeniseret i E. coli W 3350 [E. coli K12 stamme W 3350 (λ cl 857) (ATCC 31278)], osv. Oven-20 nævnte to stammer er deponeret i American Type Culture Collection (ATCC) under henholdsvis ATCC nr. 31277 og ATCC 31278.
Hvad angår fremstillingen af en endonucleaseresistent phag er en foretrukken endonuclease en højspecifik endonu-25 clease, som kan genkende specifikke steder i DNA-kæden og spalte DNA-dobbeltspiralen inden for de genkendte steder, således at der dannes såkaldte "forskudte" (staggered) sammenhængende ender. En særdeles velegnet endonuclease er et restriktionsenzym såsom Eco RI, Bam HI eller Hind III. Re-30 striktionsenzymerne kan fås fra firmaerne Seikagaku Kogyo Co. eller Boehringer Mannheim Yamanouchi.
Den endonuclease-resistente phag som f.eks. en mutant-phag, der er absolut resistent mod spaltning ved hjælp af et restriktionsenzym, kan eksempelvis dannes på følgende 35 måde; Vekselvis dyrkning af en lambdoid phag i en vært indeholdende restriktionsenzym og i en anden vært uden indhold
DK 161105B
5 af restriktionsenzym resulterer i tilintetgørelse af en phag, som er følsom over for indvirkningen af restriktionsenzymet, og kontinuert forøgelse i populationen af en mutant, som kun i ringe grad er følsom over for nævnte indvirkning.
5 Ved hjælp af en sådan mikrobiel koncentrering er det muligt til sidst at få en phag (restriktionsenzym-resistent phag) indeholdende DNA, som er absolut ufølsom over for indvirkningen af restriktionsenzymet, dvs. DNA, hvis kæde overhovedet ikke kan spalte ved indvirkning af restriktionsen-10 zymet.
Den resistente phag kan også fås hurtigere ved lokalt at deletere området, som kan spaltes ved hjælp af restriktionsenzymet, og derpå anvende den mikrobielle koncentreringsteknik. Fremgangsmåden til lokal eliminering af området 15 med DNA, som kan spaltes ved hjælp af restriktionsenzymet, består i at isolere en deleteringsmutant, hvori phag-DNA--området indeholdende de spaltelige steder, er blevet dele-teret. Når stederne eller områderne, som kan spaltes ved hjælp af restriktionsenzymet, er placeret i et DNA-område, 20 som ikke er nødvendigt, for at phagen kan overleve, kan phagens resistens mod restriktionsenzymet forøges ved at isolere mutanten, i hvilken nævnte område er blevet delete-ret. Som følge af deleteringen af DNA-området omfattende de spaltelige steder, har deleteringsmutanten en mindre vægt-25 fylde og en bedre termisk stabilitet. Ved at udnytte disse egenskaber kan mutanten isoleres fra et almindeligt phag-dyrkningsmedium, f.eks. ved hjælp af caesiumchlorid (CsCl) vægtfyldegradientcentrifugering, ved hvilken adskillelsen foretages ved centrifugering af kulturen blandet med caesium-30 chlorid, eller ved at opvarme phagkulturen til 60°C og isolere den overlevende phag. Den isolerede mutant underkastes mikrobiel koncentrering ved alternativ dyrkning af mutanten i en vært med et restriktionsenzym og en vært uden restriktionsenzym. På denne måde kan der hurtigere fås en phag 35 indeholdende DNA, som er fuldstændig ufølsom over for indvirkning af restriktionsenzymet.
6
DK 161105 B
For at indsætte stederne, som kan spaltes ved hjælp af restriktionsenzymet, i et tilsigtet område i den dannede phag-DNA, som er helt fri for steder, som kan spaltes af restriktionsenzymet, parres phagen med en lambdoid phag med 5 endonucleasesensitivitet i DNA-området, som bærer den genetiske information for dannelsen af hylsterproteiner. Parringen gennemføres ved at sætte to phagsuspensioner, den ene indeholdende en resistent phag og den anden indeholdende den sensitive phag, til restriktionsenzymet (109 - 1010/ml 10 hvert), efter hinanden eller samtidig efter at de er blandet med en suspension af Escherichia coli (108 - 109/ml), som er sensitiv over for begge phager. Parringen kan også gennemføres ved at inducere formering af en endonucleaseresi-stent eller sensitiv phag lysogeniseret i Escherichia coli-15 stamme K 12 og derpå inficere det inducerede lysogen med en anden endonucleasesensitiv eller endonucleaseresistent phag. Escherichia coli-cellerne inficeret med disse phager som anført overfor rystes ved 37°C i 1-2 timer i et medium som f.eks. tryptonmedium. Ethvert medium kan frit anvendes, når 20 blot det muliggør væksten af værtscellerne.
Som den sensitive Escherichia coli-organisme kan anvendes enhver af K12 stammerne, incl. f.eks. W 3110 (ATCC 27325), W 3350 (ATCC 27020) og 1100 (Max Planck instituttet, Vesttyskland). Escherichia coli-bakterien kan anvendes i 25 form af en flydende kultur eller i form af en suspension fremstillet ved at centrifugere kulturen til fjernelse af den ovenstående væske, hvorpå sedimentet suspenderes i en 10 mM MgCl2-opløsning og rystes i 1 time ved 37°C. Sidstnævnte form er bedst med henblik på adsorptionen og infek-30 tionen af phagen.
På den ovenfor beskrevne måde er det muligt at fremstille ca. 105/ml af en phag, som kun har endonucleasesensitivitet i DNA-området, som bærer genetisk information for fremstillingen af hylsterproteiner.
35 Isoleringen af de ønskede phager fra den således fremstillede kultur gennemføres på følgende måde.
7
DK 161105 B
Eksempelvis vælges en phag A og en phag B tilfældigt blandt gruppen lambdoide phager. Hvis den endonuclease-resi-stente phag A parres med phagen B med endonucleasesensiti-vitet i DNA-området, som bærer genetisk information for 5 dannelsen af hylsterproteiner, dannes der en ny phag, hvori DNA-området for dannelsen af hylsterproteiner kommer fra den sensitive phag B, og DNA-området, som deltager i selvkopieringen, kommer fra den resistente phag A. Den således dannede ny phag kan formeres i Escherichia coli-celler, som 10 er A-resistente og B-immune (Escherichia coli-celler, som ikke kan adsorbere phag A, og hvori phag B lysogeniseres), medens andre phager ikke kan vokse. På denne måde er det muligt at isolere den ny phag.
Den A-resistente og B-immune Escherichia coli-bakterie 15 fås på følgende måde.
Først inficeres Escherichia coli-cellerne med phagen A, fortrinsvis under betingelser, som er ugunstige for lyso-genisering. Når f.eks. Escherichia coli-celler inficeres med phag A-mutantpartikler uden lysogeni i forholdet 1:100, 20 er de overlevende celler sådanne, som er resistente over for phagen A. Den tempererede phag lysogeniseres sædvanligvis i Escherichia coli-celler med en vis sandsynlighed og danner en uklar plaque eller belægning, hvorimod mutanten uden lysogeni danner en transparent plaque eller belægning. Føl-25 gelig kan phagen uden lysogeni fås ved at opsamle phagpar-tikler i transparente plaques eller belægninger. Det er ønskeligt at anvende den således indsamlede phag med henblik på simplificering af arbejdet med at udvælge en phag-resi-stent Escherichia coli-bakterie.
30 Den således udvalgte Escherichia coli er resistent over for phagen A og adsorberer ikke phagen A som følge af dens natur. Adsorptionsspecificiteten afhænger helt af proteinet, som findes i phagens hale. Da den genetiske information for adsorptionen af den ovennævnte phag findes i DNA-35 -området, som deltager i dannelsen af hylsterproteiner, kan en phag indeholdende den genetiske information for dannelsen
DK 161105B
8 af hylsterproteiner i phagen A ikke adsorberes på Escherichia coli-celler, som er resistente over for phagen A, og derfor heller ikke trænge ind i disse celler. Hvorvidt værtscellerne er phagresistente mutanter eller ej, kan afgøres på følgende 5 måde. Da f.eks. en Escherichia coli-celle, som er resistent over for λ phag, ikke kan udnytte maltose, kan den erkendes ved hjælp af fraværelsen af rød farve på cellen, når den dyrkes i et medium indeholdende maltose og indikatorer omfattende methylenblåt og eosingult.
10 Derpå bibringes den A-resistente vært B-immunitet.
Dette kan udføres ved at inficere den A-resistente værtscelle med en phag, såsom phag B, hvori den genetiske information, som kontrollerer immuniteten, bæres af DNA-området, som deltager i selvkopieringen, til dannelse af en værtscelle, 15 hvori DNA fra phagen B er integreret i værtscellens DNA.
Hvis en phag med samme immunitet som den phag B-DNA, som er blevet integreret i værtscellen, trænger ind i denne værtscelle, kan den ikke formere sig deri. For at afgøre, hvorvidt DNA fra phagen B er blevet integreret i DNA hos værten, 20 udsættes værtscellerne f.eks. for ultraviolet bestråling for at inducere phagformeringen. Hvis phagen B frigøres ved rystebordsdyrkning af de bestrålede værtsceller, har der fundet integrering sted af phag B-DNA i DNA hos værtscellen.
Den bakteriophag-DNA, som kun har endonucleasefølsom-25 hed i det DNA-område, som bærer genetisk information for dannelsen af hylsterproteiner, er kun følsom over for spaltning i dette område ved indvirkning af endonucleasen, hvilket således gør det muligt at erstatte informationen for dannelse af hylsterproteiner med den tilsigtede genetiske information 30 på let og enkel måde.
En rekombinant-bakteriophag dannes ved at erstatte DNA-sekvenserne, som bærer genetisk information for dannelsen af hylsterproteiner, fra den ny phag-DNA dannet ovenfor med de tilsigtede DNA-sekvenser. Den resulterende rekombinant-35 bakteriophag får lov til at inficere værten og således blive integreret i vært-DNA'en. De således behandlede værtsceller 9
DK 161105 B
(lysogeniserede) kan opbevares med henblik på fremtidig anvendelse. Det er således unødvendigt altid at konservere værtscellen og rekombinantphagen, og konserveringen af sidstnævnte er temmelig vanskelig. Når der er behov derfor, indu-5 ceres formeringen af rekombinantphagen til "forstærkning" af den genetiske information, og de inducerede celler dyrkes i et medium som f.eks. tryptonmedium. På denne måde kan der fremstilles en stor mængde specifikt protein (så meget som 50% af det opløselige protein i værtscellen, jf. N.E. Murray 10 og K. Murray, Nature, 251 (1974) , side 476-481) som følge af den forstærkede genetiske information, som muliggør, at rensningen af det specifikke protein gennemføres meget let og effektivt. Af disse årsager repræsenterer den ovenfor fremstillede ny bakteriophag et stort industrielt fremskridt.
15 Fra ovennævnte litteratursted kendes ganske vist λ- -phager med unikt restriktionssted, hvor DNA kan indsættes og klones; men det fragment (betegnet A i dette litteratursted) , som bærer den genetiske information for dannelsen af hylsterproteiner, indeholder ikke et sådant restriktionssted, 20 ligesom der ikke angives noget om, at en konservering kan udelades.
Tilsvarende gælder for de fra Molec. gen Genet. 149 (1976), side 87-99, kendte derivater af ATpp-phager, som dels behøver konservering, og som dels er endonucleasesensi-25 tive uden for det DNA-område, som er essentielt for den her omhandlede bakteriophag.
Det har vist sig, at når Escherichia col i trp“-vært lysogeniseret med rekombinantphagen dannet ved indføring af Escherichia coli-trp-gen i den ny phag fremstillet som be-30 skrevet ovenfor dyrkes efter inducering af phagformering, dannes der en stor mængde enzym for tryptophanbiosyntese.
Opfindelsen illustreres nærmere i det følgende eksempel.
10
DK 161105 B
Eksempel
Fremstilling af en ny phag, XcI857RIrh80, som kun er følsom over for spaltning ved indvirkning af et restriktionsenzym, Eco RI fra Escherichia col i, i det DNA-område, som 5 bærer den genetiske information for dannelsen af hylsterproteiner.
1. Isolering af en deleteringsmutantphag XcI857b6042 fra phag XcI857.
1-1. Med øjet på en platinpodenål udtages én portion 10 Escherichia coli K12, stamme W 3350 (XcI857) (ATCC 31278), som inokuleres i 3 ml tryptonmedium og dyrkes under rystning i 16 timer ved 30°C. Den fremkomne 3 ml forkultur blandes med 30 ml tryptonmedium, blandingen dyrkes under rystning i 3 timer ved 30° C og derpå i 20 minutter ved 43°C for at 15 inducere formering af XcI857. Dyrkningen fortsættes i yderligere 3-6 timer ved 30°C, indtil bakteriolyse har fundet sted, og kulturen er blevet næsten gennemsigtig, hvorefter dyrkningen afbrydes. Dyrkningsvæsken centrifugeres til fjernelse af cellebestanddele, og den ovenstående væske er en 20 phag XcI857-suspension indeholdende ca. 10-^/^1 phagpartik-ler.
1-2. 0,1 ml af den ovenfor fremstillede suspension af XcI857 suspenderes i 5 ml trispufferopløsning (pH-værdi 8.2) indeholdende 0,02 M ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 25 hvorefter blandingen henstilles ved 40°C i 10 minutter og derpå fortyndes med 0,01 M trispufferopløsning (pH-værdi 7.2) indeholdende 0,01 M MgCl2 (i det følgende betegnes denne opløsning en tris-Mg-pufferopløsning) til en endelig partikelkoncentration på 107/ml. 0,1 ml af den fortyndede 30 phagopløsning og 0,25 ml af en kultur af Escherichia coli W 3110 (ATCC 27325) dyrket natten over og fremstillet ved inkubering ved 37°C i 16 timer i tryptonmedium udspredes på en trypton-agarplade (se note (1) nedenfor) sammen med 3 ml smeltet B^-blød agar (se note (2) nedenfor), som holdes ved 35 46°C, og der dyrkes ved 37°C i 4-5 timer. Phagen på pladen udvaskes med 4 ml tris-Mg-pufferopløsning og konserveres i 11
DK 161105 B
et lille sterilt reagensglas forsynet med gummiprop. Under anvendelse af en portion af denne phagsuspension gentages den ovenfor beskrevne fremgangsmåde fem gange.
1-3. Under anvendelse af den ovenfor under 1-2 dannede 5 phag gentages fremgangsmåden som beskrevet under 1-2 fire gange med den undtagelse, at behandlingen gennemføres ved 60*C i 10 minutter og ikke ved 40°C i 10 minutter. Den dannede phagsuspension fortyndes til 103/ml. 0,1 ml af den fortyndede phagsuspension blandes med 0,25 ml af den oven-10 nævnte kultur af Escherichia coli W 3110, hvorpå blandingen udspredes på en trypton-agarplade sammen med B^-blød agar og dyrkes natten over ved 37°C. Phagpartiklerne i en af de ca. 100 plagues eller belægninger på pladen udtages med en spids fra en bambusgren og suspenderes i tris-Mg-pufferopløs-15 ning, hvorved fås phagstamme XcI857b6042.
Den således fremstillede deleteringsmutant har en vægtfylde på 1,465, hvilket er noget mindre end vægtfylden på 1,493 for moderstammen XcI857, og en deletering i DNA på ca. 23% beregnet ud fra vægtfylden. I DNA fra moderphagen 20 XcI857 er antallet af spaltninger forårsaget af restriktionsenzymet Eco RI (fra Seikagaku Kogyo Co.) fem, hvorimod antallet er tre i phagstammen XcI857b6042, beregnet ud fra antallet af overlevende bestemt ved anvendelse af Escherichia coli W 3110 og Escherichia coli W 3110 (RI).
25 Escherichia coli W 3110 (RI) isoleres på følgende måde. En blanding af Escherichia coli RY-13 (fra H.B. Boyer, University of California) med en resistensfaktor RI over for lægemidler (resistent over for penicillin, streptomycin, tetracyclin og sulfamider) og Escherichia coli W 3110 (ATCC 30 27325) dyrkes, og Escherichia coli W 3110 (RI) med en resistensfaktor over for lægemidler isoleres.
2. Isolering af phagstammen XcI857b6042 RIr, som er fuldstændig resistent over for restriktionsenzymet Eco RI, fra phagstammen XcI857b6042.
35 2-1. 0,25 ml af kulturen af Escherichia coli W 3110, som er blevet dyrket natten over, fremstillet som beskrevet
DK 161105B
12 ovenfor under 1-2 og 0,1 ml af suspensionen af phagen XcI857b6042 blandes i 3 ml smeltet B^-blød agar ved en temperatur på 46°C. Den fremkomne blanding udspredes på en tryptonagarplade og dyrkes ved 37°C i 4-4,5 timer. Til pladen 5 sættes derpå 4 ml tris-Mg-pufferopløsning og 3 dråber chloroform. Pladen henstilles ved 37°C i 15 minutter, og den ovenstående væske overføres til et lille reagensglas forsynet med gummiprop. Antallet af phagpartikler i den ovenstående væske er 6 x 1010/ml.
10 2-2. Antallet af partikler af phagen fremstillet under 2-1 måles under anvendelse af Escherichia coli W 3110 (RI) indeholdende restriktionsenzymet Eco RI. (Escherichia coli W 3110 (RI) spalter og inaktiverer den phag-DNA, som trænger ind i dens celler. Følgelig er antallet af phagpar-15 tikler målt under anvendelse af Escherichia coli W 3110 (RI) meget mindre end antallet målt under anvendelse af Escherichia coli W 3110 uden noget restriktionsenzym. Det første tal er 108/ml, hvilket er 1/600 af sidstnævnte tal).
På samme måde som beskrevet under 2-1, fremstilles 20 en phagsuspension under anvendelse af 0,25 ml af kulturen af Escherichia coli W 3110 (RI), som er blevet dyrket natten over, og som er blevet dyrket som beskrevet under 1-2, og 0,1 ml af en phagsuspension fremkommet ved at fortynde den under 2-1 fremstillede phag med tris-Mg-pufferopløsning til 25 en phagpartikelkoncentration på 107/ml, hvilket måles under anvendelse af stammen W 3110 (RI).
2-3. Den under 2-2 fremstillede phag behandles under anvendelse af den under 2-1 beskrevne fremgangsmåde. På denne måde gentages behandlingen ti gange under skiftevis 30 anvendelse af fremgangsmåden ifølge 2-1 og fremgangsmåden ifølge 2-2. Den sidste behandling gennemføres under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet ovenfor under 2-1. En prøve af den færdige phagsuspension udviser praktisk taget samme antal phagpartikler, hvad enten der ved målingen anven-35 des stamme W 3110 (RI) eller stammen W 3110, hvilket indicerer, at phagsuspensionen består af en mutantstamme, som 13
DK 161105 B
er fuldstændig resistent over for Eco RI. Denne phagsuspen-sion fortyndes til 103/ml, og 0,1 ml af den fortyndede suspension blandes med 0,25 ml af kulturen af stammen W 3110.
Den fremkomne blanding udspredes på smeltet B^-blød agar på 5 tryptonagarpladen til dannelse af belægninger, som ikke overlapper hinanden. Fra de således dannede belægninger isoleres en phagstamme XcI857b6042RIr, som er absolut resistent over for Eco RI.
3. Rekombination mellem phag XcI857b6042 RIr og phag 10 Φ 80.
DNA fra phagen XcI857 mangler fra naturens hånd Eco RI-spaltningssteder i området, som bærer den genetiske information for dannelsen af hylsterproteiner. For at frembringe spaltningssteder i dette område krydses den Eco-RI-resistente 15 phag XcI857b6042 RIr med phagen Φ 80, som er analog med phag XcI857, og en ny phag XcI857RIrh80 fås på følgende måde.
Med en platinpodenål udtages en portion Escherichia coli W 3110, som inokuleres i 1 ml tryptonmedium og dyrkes 20 under rystning ved 37°C i 16 timer. 0,1 ml af kulturen sættes til 15 ml tryptonmedium, og kulturen dyrkes under rystning ved 37eC, indtil celleantallet er steget til 3 x 108/ml, hvorpå kulturen centrifugeres ved 10.000 rpm i 10 minutter til isolering af cellerne. Cellerne suspenderes i 5 ml tris-25 -Mg-pufferopløsning og rystes i 1 time ved 37'C. 0,2 ral af suspensionen overføres til et reagensglas.
Escherichia coli W 3110 dyrkes i tryptonmedium under rystning med 37°C i 3 timer, hvorpå kulturen inficeres med XcI857b6042 RIr, og dyrkningen fortsættes i 4 timer. Lysatet 30 fortyndes derpå 30 gange med tris-Mg-pufferopløsning til dannelse af en XcI857b6042 RIr-suspension.
Med en platinpodenål udtages én portion coliforme bakterier (Escherichia coli) K12, stamme W 3110 (Φ 80) (ATCC 31277), som inokuleres i 3 ml tryptonmedium og fordyrkes 35 ved 37*C i 16 timer. De 3 ml forkultur sættes til 30 ml tryptonmedium og dyrkes under rystning ved 37“C i 3 timer.
14
DK 161105 B
15 ml af kulturen anbringes i en petriskål med en diameter på 15 cm og bestråles med en 15W ultraviolet lampe i en afstand på 50 cm i 1-2 minutter, hvorpå der igen dyrkes under rystning ved 37°C i 4 timer. Det fremkomne lysat for-5 tyndes 30 genge med tris-Mg-pufferopløsning, hvorved fås en suspension af Φ 80.
0,2 ml af den ovenfor fremstillede suspension af XcI857b6042RIr (3,4 x 109/ml) og 0,2 ml af ovenstående suspension af Φ 80 (3,2 x 109/ml) sættes til 0,2 ml suspen-10 sion af Escherichia coli W 3110, som er konserveret i et reagensglas, og blandingen inkuberes ved 37°C i 10 minutter. Derefter sættes 0,1 ml af blandingen til 10 ml tryptonmedium, og der rystes i 70 minutter ved 37°C. Derpå sættes 7 dråber chloroform til kulturen, og der rystes kraftigt. 0,1 ml af 15 den fremkomne blanding blandes med Escherichia coli W 3110 (Φ 80)/λ (λ-resistent Escherichia coli lysogeniseret med Φ 80). 3 ml smeltet B^-blød agar holdes ved 46°C og sættes til ovenstående blanding, hvorpå der udspredes på en trypton--agar-plade, som derefter henstilles natten over ved 37°C.
20 Phagpartiklerne opsamles ved hjælp af spidsen af en bam-buskvist fra en af belægningerne og suspenderes i en tris--Mg-pufferopløsning. Rensning ved hjælp af belægningsdannelse på Escherichia coli W 3110 (Φ 80)/λ gentages yderligere to gange, og der fås en ny phag XcI857RIrh80.
25 Ovennævnte Escherichia coli W 3110 (Φ 80)/λ fås på følgende måde.
Med en platinpodenål udtages en portion Escherichia coli K12 stamme W 3110 (Φ 80) (ATCC 31277), som podes på 2 ml tryptonmedium, og der dyrkes ved 37°C i 16 timer. En 30 blanding bestående af 0,1 ml af kulturen og 0,1 ml af λν-phagsuspension (IFO 20017) holdes ved 37°C i 30 minutter.
Efter tilsætning af 3 ml smeltet Βχ-blød agar holdt ved 46“C, udspredes blandingen på en tryptonagarplade og dyrkes ved 37“C i 48 timer. Ved anvendelse af en spids bambuskvist 35 udtages bakterierne fra en af kolonierne på pladen og suspenderes i 5 ml steril 0,9%'s natriumchloridopløsning. 0,05 ml 15
DK 161105 B
af denne suspension fortyndes 10.000 gange med steril 0,9%'s natriumchloridopløsning. 0,1 ml af den fortyndede opløsning udspredes på en trypton-agar-plade og dyrkes ved 3 7° c i 48 timer. Bakterierne udtages fra en af de dannede kolonier på 5 pladen og anvendes som W 3110 (Φ 80)/λ.
Note (1) trypton-agar-plade: 1% trypton (Difco), 0,25% natriumchlorid og 1,2% agar.
Bestanddelene steriliseres ved autoklavering. Substratet overføres til petriskåle med en diameter på 10 9 cm med 30 ml pr. skål.
Note (2) B^-blød agar: 1% trypton (Difco), 0,25% natriumchlorid, 5 mM magne- siumchlorid, 1,5 Mg/ml vitamin B^ og 0,5% agar. 3 ml substrat overføres til et lille reagensglas, og der 15 steriliseres ved autoklavering.
Note (3) tryptonmedium: 1% trypton (Difco) og 0,25% natriumchlorid.
Den ny phag XcI857RIrh80 fremstillet som beskrevet ovenfor har følgende egenskaber: 20 Vært: Den ny phag kan ikke inficere Φ 80-resistent
Escherichia coli, men derimod λ-resistente. Værtsområdet er det samme som for phag Φ 80 og forskelligt fra området for phag λ, hvilket viser, at i det mindste en del af hylsterproteinerne hos den ny phag er de samme som hos phagen Φ 80.
25 Immunitet: Immuniteten er den samme som hos phag λ.
Restriktion ved hjælp af Eco RI. Den ny phag udviser en værdi, som ligger imellem værdierne for de to moderorganismer.
Tempera turf ølsomhed: Den ny phag kan ikke danne aktive 30 phagpartikler ved 43°C. Dette stemmer overens med den kendsgerning, at syntesen af hylsterproteiner hos phag Φ 80 er umulig ved 43°C i modsætning til phag λ.
Dannelsen af den ny phag fra lysogen: Escherichia coli W 3110 dyrkes i tryptonmedium under rystning ved 37°C 35 i 24 timer. 0,25 ml af kulturen (4 x 109/ml) blandes med 0,1 ml af en XcI857RIrh80-suspension (103/ml) og derpå med
DK 161105 B
ie 3 ml smeltet I^-blød agar med en temperatur på 46°C. Den fremkomne blanding udspredes på en tryptonagarplade og dyrkes natten over ved 30°C. Med en platinpodenål udtages en portion lysogeniserede celler opsamlet fra en af de dannede uklare 5 belægninger, og den udstryges på en anden tryptonagarplade og dyrkes natten over ved 30°C. Cellerne indsamlet fra en af de fremkaldte kolonier er de, som er lysogeniseret med XcI857RIrh80. Efter dyrkning i tryptonmedium under rystning ved 33°C i 2 timer, henstilles denne stamme W 3110 lysogeni-10 seret med XcI857RIrh80 ved 43°C i 20 minutter til inducering af XcI857RIrh80-formering. Derpå fortsættes dyrkningen igen i 5 timer ved 33°C, og der fås 3 x lO11/111! af phagen XcI857RIrh80. Udbyttet svarer til det tredobbelte udbytte opnået på tilsvarende måde ved lysogenisering af XcI857 i 15 Escherichia coli W 3110 med efterfølgende dyrkning af lysogenet og inducering af phagformeringen med efterfølgende dyrkning til dannelse af et lysat.
Transduktion: Den ny phag kan overføre den biosyntetiske virkning af tryptophan, men kan ikke overføre virknin-20 gen af galactoseudnyttelse.
Det fremgår af de ovennævnte egenskaber, at i phagen XcI857RIrh80 stammer det DNA-område, som bærer den genetiske information, der kontrollerer selvkopieringen af DNA, fra phagen X, og det DNA-område, som bærer den genetiske infor-25 mation for dannelsen af hylsterproteiner, stammer fra phagen Φ 80.
Phagen XcI857RIrh80 fremstillet i overensstemmelse med opfindelsen er deponeret i American Type Culture Collection (ATCC) under deponeringsnummeret ATCC nr. 31285.
Claims (16)
1. Bakteriophag med den egenskab, at dens phag-DNA, når den inficerer en værtscelle, kan integreres i værtscellens DNA ved lysogeni, kendetegnet ved, at dens
2. Bakteriophag ifølge krav 1, kendetegnet ved, at bakteriophagen er en tempereret phag.
3. Bakteriophag ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den tempererede phag er en lambdoid phag.
4. Bakteriophag ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den lambdoide phag er λ (IFO 20016), 434 (IFO 20018), 82 (IFO 20019), Φ80 (IFO 20020) eller Φ170 (IFO 20021).
5. Bakteriophag ifølge krav 1-4, kendeteg net ved, at endonucleasen er et restriktionsenzym.
5 DNA-molekyle kun er endonucleasesensitivt i det DNA-område, som bærer den genetiske information for dannelsen af hylsterproteiner.
6. Bakteriophag ifølge krav 5, kendetegnet ved, at restriktionsenzymet er Eco RI, Barn HI eller Hind III.
7. Bakteriophag ifølge krav 1, kendetegnet 20 ved, at den er XcI857RIrh80 (ATCC 31285).
8. Fremgangsmåde til fremstilling af en bakteriophag ifølge krav 1, kendetegnet ved, at en lambdoid bakteriophag gøres endonucleaseresistent, og den fremkomne bakteriophag parres med en lambdoid phag, som har endonuclea- 25 sesensitivitet i det DNA-område, som bærer genetisk information for dannelsen af hylsterproteiner, til dannelse af en bakteriophag, som kun har endonucleasesensitivitet i det DNA-område, som bærer genetisk information for dannelsen af hylsterproteiner.
9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendeteg net ved, at den lambdoide bakteriophag er λ (IFO 20016), 434 (IFO 20018), 82(IFO 20019), Φ80 (IFO 20020) eller Φ170 (IFO 20021).
10. Fremgangsmåde ifølge krav 8 eller 9, kende- 35 tegnet ved, at endonucleasen er et restriktionsenzym. DK 161105 B
11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at restriktionsenzymet er Eco RI, Barn HI, eller Hind III.
12. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendete g-5 net ved, at den endonucleaseresistente, lambdoide bak- teriophag fremstilles med mikrobiel koncentreringsteknik.
13. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at den endonuclease-resistente bakteriophag af den lambdoide phagart fremstilles ved lokal deletering af 10 området med DNÅ, som kan spaltes af restriktionsenzymet, og efterfølgende anvendelse af den mikrobielle koncentreringsteknik.
14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendetegnet ved, at den lokale deletering af området med DNA, 15 som kan spaltes ved hjælp af restriktionsenzymet, består i isolering af en mutant, hvori det phag-DNA-område, som indbefatter spaltningsstederne, er blevet deleteret.
15. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at parringen gennemføres ved at tillade en phag, 20 som er resistent over for restriktionsenzymet, og en phag, som er følsom over for restriktionsenzymet, efter hinanden eller samtidigt at inficere en Escherichia coli-stamme, som er sensitiv over for begge phager.
16. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendete g- 25 net ved, at den fremstillede, ny phag isoleres ved dyrkning af den ny phag i den Escherichia coli-stamme, som ikke kan adsorbere den endonucleaseresistente bakteriophag, og hvori den endonucleasesensitive phag lysogeniseres.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4740977 | 1977-04-26 | ||
JP4740977A JPS53133684A (en) | 1977-04-26 | 1977-04-26 | Novel bacteriophage and fabricating same |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DK179078A DK179078A (da) | 1978-10-27 |
DK161105B true DK161105B (da) | 1991-05-27 |
DK161105C DK161105C (da) | 1991-11-11 |
Family
ID=12774319
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK179078A DK161105C (da) | 1977-04-26 | 1978-04-25 | Bakteriophag samt fremgangsmaade til fremstilling deraf |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4332897A (da) |
JP (1) | JPS53133684A (da) |
DK (1) | DK161105C (da) |
GB (1) | GB1598019A (da) |
NL (1) | NL191440C (da) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4469786A (en) * | 1981-01-30 | 1984-09-04 | The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Detection of chemical mutagens in marker rescue assay |
US4593002A (en) * | 1982-01-11 | 1986-06-03 | Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Viruses with recombinant surface proteins |
JPS58212781A (ja) * | 1982-06-02 | 1983-12-10 | Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho | 新種バクテリオフア−ジ及びその育種法 |
US5559018A (en) * | 1983-09-13 | 1996-09-24 | Mattson; Thomas L. | Inviable phages, their production and DNA thereof |
US4774182A (en) * | 1984-06-29 | 1988-09-27 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Partially defective foreign gene for conferring immunity on a biological host |
US5223409A (en) * | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
US7413537B2 (en) * | 1989-09-01 | 2008-08-19 | Dyax Corp. | Directed evolution of disulfide-bonded micro-proteins |
AU8740491A (en) * | 1990-09-28 | 1992-04-28 | Protein Engineering Corporation | Proteinaceous anti-dental plaque agents |
AU1545692A (en) * | 1991-03-01 | 1992-10-06 | Protein Engineering Corporation | Process for the development of binding mini-proteins |
US20010043924A1 (en) * | 1994-04-05 | 2001-11-22 | Exponential Biotherapies, Inc. | Antibacterial therapy with bacteriophage physico-chemically altered to delay inactivation by the host defense system |
WO1995027043A1 (en) * | 1994-04-05 | 1995-10-12 | Exponential Biotherapies, Inc. | Antibacterial therapy with genotypically modified bacteriophage |
AU702802B2 (en) | 1994-10-18 | 1999-03-04 | Scottish Crop Research Institute | Method of producing a chimeric protein |
US20090053179A1 (en) * | 2005-10-05 | 2009-02-26 | Internalle, Inc. | Method for using liberated dormant bacteriophage and environmental stress to reduce infectious bacteria |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4259444A (en) * | 1972-06-07 | 1981-03-31 | General Electric Company | Microorganisms having multiple compatible degradative energy-generating plasmids and preparation thereof |
-
1977
- 1977-04-26 JP JP4740977A patent/JPS53133684A/ja active Granted
-
1978
- 1978-04-12 US US05/895,602 patent/US4332897A/en not_active Expired - Lifetime
- 1978-04-25 GB GB16242/78A patent/GB1598019A/en not_active Expired
- 1978-04-25 DK DK179078A patent/DK161105C/da not_active IP Right Cessation
- 1978-04-26 NL NL7804483A patent/NL191440C/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6137915B2 (da) | 1986-08-26 |
US4332897A (en) | 1982-06-01 |
JPS53133684A (en) | 1978-11-21 |
NL7804483A (nl) | 1978-10-30 |
GB1598019A (en) | 1981-09-16 |
DK161105C (da) | 1991-11-11 |
NL191440C (nl) | 1995-07-04 |
DK179078A (da) | 1978-10-27 |
NL191440B (nl) | 1995-03-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Old et al. | Selective outgrowth of fimbriate bacteria in static liquid medium | |
US4348477A (en) | Method for preparing a recombinant DNA phage | |
JPS6246152B2 (da) | ||
DK161105B (da) | Bakteriophag samt fremgangsmaade til fremstilling deraf | |
US4348478A (en) | Method for preparation of a recombinant DNA phage | |
KR101725570B1 (ko) | 그람 음성균에 대해 세포 사멸능을 갖는 포도비리대 박테리오파지 | |
Gowland et al. | Transfer and stability of drug resistance plasmids in Escherichia coli K12 | |
Bowden et al. | Escherichia coli deoxyribonucleic acid synthesis mutants: their effect upon bacteriophage P2 and satellite bacteriophage P4 deoxyribonucleic acid synthesis | |
Baron et al. | Behavior of coliphage lambda in hybrids between Escherichia coli and Salmonella | |
Hull et al. | Genetic characterization of Mu-like bacteriophage D108 | |
Mizobuchi et al. | Abortive infection by bacteriophage BF23 due to the colicin Ib factor. I: Genetic studies of nonrestricted and amber mutants of bacteriophage BF23 | |
Lee et al. | The R-type pyocin of Pseudomonas aeruginosa C is a bacteriophage tail-like particle that contains single-stranded DNA | |
Romig | Infectivity of Bacillus subtilis bacteriophage deoxyribonucleic acids extracted from mature particles and from lysogenic hosts | |
JPS6246153B2 (da) | ||
Clarke | The Leeuwenhoek Lecture, 1979 Experiments in microbial evolution: new enzymes, new metabolic activities | |
KR101023995B1 (ko) | 대장균 특이적 박테리오파아지 및 이를 이용한 대장균오염의 예방 또는 통제 방법 | |
JPS58212781A (ja) | 新種バクテリオフア−ジ及びその育種法 | |
Dhundale et al. | Mutations that affect production of branched RNA-linked msDNA in Myxococcus xanthus | |
CN112522214B (zh) | 一株高裂解性铜绿假单胞菌噬菌体rdp-pa-20001及其应用 | |
US6245504B1 (en) | Transducing phages of Actinomycetales | |
KR20180102040A (ko) | 신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Vib-PAP-4 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도 | |
CN112961847B (zh) | 贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶在口腔科室卫生消毒中的应用 | |
Walker et al. | Isolation and characterization of plaque-forming lambdadnaZ+ transducing bacteriophages | |
Varon | The bdellophage three-membered parasitic system | |
Talarmin et al. | Study of Pseudomonas aeruginosa serotype O12 isolates with a common antibiotic susceptibility pattern |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PUP | Patent expired |