DK157245B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af e.coli varmestabile enterotoxinderivater - Google Patents

Description

DK 157245 B

Den foreliggende opfindelse angâr fremstilling af hidtil ukendte immunogène E.coli varmestabile enterotoxinderiva-ter, ·'· _ 5

Det er kendt, at Escherichia coli-stammer kan være ansvar-lige for diarrêsygdomme hos mennesker og dyr, og ved for-skellige unders0gelser (f.eks. Gyles & Barnum,J.Infect.Dis 120, 419-426, 1969) er det blevet pâvist, at enteropathoge-nicitet af E.coli-stamme stâr i relation til produktionen af enterotoxiner.

To enterotoxiner er blevet beskrevet: Et varmelabilt (LT) enterotoxin og et varmestabilt (ST) enterotoxin, og Smith & Gyles (J.Med.Microbiol. 3, 387-401, 1970) har klassifice-ret enrække enteropathogene E.coli-stammer af forskellige dyriske oprindelser som producenter af enten LT-og ST-enter-otoxiner eller af kun ST-enterotoxin. ST-producerende E.coli-stammer af human oprindelse er ogsâ blevet beskrevet 2Q eller omtalt af forskellige forfattere (f.eks. R.A.Gianella,

Infect.Immun. 14, 95-99, 1976). Det varmelabile enterotoxin er under genetisk kontrol af et overf0rbart plasmid; det ser ud til at bestâ af en gruppe bundne peptider med en molekyl-vægt pâ ca. 24.000. LT-enterotoxinet adsorberes til ganglio= 25 sider ved b0rsteranden i epithel-celler i tyndtarmen, hvor det gennem formidling af en enzymatisk procès forârsager hypersekretion af vand og chlorider i tarmhulrummet og hin-drer reabsorption af natrium, sâledes at tarmhulrummet bliver udspilet med væske, der indebærer hypermotilitet og diarrê. LT-enterotoxinet er antigent og stimulerer neutraliserende

<3 U

antistoffer i serumet hos personer eller dyr, der tidligere er blevet inficeret med toxinproducerende stammer af E.coli.

Det varmestabile enterotoxin er under genetisk kontrol af en heterogen gruppe af plasmider; det forârsager ogsâ diarrê, mâske ved at stimulere guanidincyklase (J.M.Hughes m.fl., 3 5

2 DK 157245 B

Nature 271, 766-767, 1978). I betragtning af, at antiserum fremstillet mod organismer, der producerer LT og ST, blev pâvist at neutralisere LT, men ikke ST, og at antisera fremstillet pâ lignende mâde mod ST ikke havde nogen 5 neutraliserende virkning pâ ST eller pâ LT, konkluderede Smith & Gyles (loc.cit.), at ST ikke er antigent. I en artikel med titlen "Purification and Chemical Characteriza-tion of the Heat-Stable Enterotoxin Produced by Porcine Strains of Enterotoxy génie. Escherichia coli" (Infect.Immun 10 19, 1021 - 1030, 1978) beskrev J.F.Alderete & D.C.Robertson, at renset ST "udviste en molekylvægt pâ 4.400, bestemt ved bâde natriumdodecylsulfat-gelelektroforese og -gelfiltrering", og at "en molekylvægt pâ 5.100, repræsenterende 47 rester, blev beregnet af aminosyreanalyse-data"? de viser ogsâ, at 15 "antiserum fremkommet af kaniner immuniseret med ST eller ST koblet til okseserumalbumin neutraliserede virkningen af enterotoxinet hos museunger pâ pattestadiet, men passiv hæmagglutination og hæmolysetiter-bestemmelser antydede, at ST er et dârligt antigen". ST-molekylvægtsbestemmelse af 20 andre forfattere f0rte til andre og lavere værdier (f.eks.

1.000 - 1.200, 1.500 - 2.000 og 2.500 dalton, som vist af E.V.Lee m.fl., R.Lallier m.fl. og G.L.Madsen m.fl. i American Society of Microbiology Meeting, 1973 abstract M168, 1979 abstract B34 og 1979 abstract P29, og disse uoverens-25 stemmelser skyldes muligvis forskelle i ST-produktionen, iso-lerings- eller rensningstrinet samt forskellige enzymatiske forarbejdninger, nâr enterotoxinet forlader cellen.

Nylige unders0gelser (R.A.Kapitany m.fl., Infect.Immun. 26, 173-177, 1979) ber0rer sp0rgsmâlet om heterogeniciteten af 30 ST, men fundet af forskellige typer ST, baseret pâ aminosyre-sammensætning - som vist af R.A.Kapitany m.fl. (loc.cit.) -varmestabilitetsegenskaber og biologisk aktivitet er uden virkning for den foreliggende opfindelse, som er ubestemt anvendelig pâ hver aminosyre-sammensætning af de forskellige 35 ST-enterotoxiner.

, DK 157245 B

•J

Forskellige medier og inkubationsmetoder er blevet anvendt af forskellige forskere ved dyrkning af forskellige E.coli ST-producerende stammer. Eksempler pâ sâdanne medier er det komplekse medium if0lge F.G.Evans m.fl. (Infect.Immun.

^ 8, 731-735, 1973) og det minimale definerede medium if01ge J.F.Alderete m.fl. (Infect.Immun. 15, 781-788, 1977) og modifikationer heraf.

I de f0lgende eksempler fremstilles ST-enterotoxinet af en svine-E.coli-stamme K12, som er deponeret d,13.marts ^-0 1980 i American Type Culture Collection (Rockville, Mary land, USA) under deponeringsnummeret ATCC 31621.

E.coli-stammen ATCC 31621 er en mutantstamme afledt af den velkendte E.coli Kl2-stamme, isoleret af aff0ringen fra en rekonvalescent difteripatient i 1922 og universelt anvendt til grundlæggende forskning inden for bakteriel genetik og molekular biologi (B.J.Bachmann, Bacteriol.Rev.36,4, 525, 1972). E.coli K12 er en stavformet gramnegativ bak-terie, ca. 2 mikron i længden og 1 mikron i diameter. Vækst sker bedst ved 37°C, men stammen vokser ogsâ og deler sig ^ ved temperaturer sâ lave som 20°C. E.coli Kl2 er en ikke-indkapslet motil bakterie med O :K (J):H48 serotype? den udviser en meget specifik f0lsomhed over for lambda-fagen.

E.coli-stammen ATCC 31621 udviser ovennævnte typiske egen- skaber af E.coli K12, og den har desuden auksotrofe behov

P S

for phenylalanin, tryptophan, histidin og prolin og for-gærer ikke lactose, sandsynligvis pâ grund af en lac y mutation (den danner hvide kolonier pâ McConkey's lactose-medium) . E.coli-stammen ATCC 31621 huser et rekombinerende plasmid med et 2,1 x 10 dalton DNA-fragment, fremkommet ved restriktions-endonuklease - ford0jelse af et plasmid DNA, der oprindeligt er afledt af en pathogen svinestamme af E.coli, og som bærer et gen, der koder for syntese af varme-stabilt enterotoxin. Stammen er chloramphenicol-resistent (25 pg pr. ml) .

DK 157245 B

4

Ifelge opfindelsen angives en analogifremgangsmâde til frem-stilling af E.coli varmestabilt enterotoxin-derivat, hvilken fremgangsmâde omfatter reaktion af E.coli varmestabilt entero-5 toxin med et ugiftigt bifunktionelt tværbindingsmiddel for proteiner og udvinding af det derved fremkomne E.coli varme-stabile enterotoxi nde'ri vat. Enterotoxi nder i vatet er sâledes inter- eller intramolekulært tværbundet ST enterotoxin, der udviser væsentlig hejere molekylvægt end ST enterotoxin selv.

10 Det udviser immunogen virkning og er et værdifuldt profylak-tisk middel til at beskytte mennesker og dyr mod diarrésyg-domme fremkaldt af E.coli enterotoxin.

15

Ved fremgangsmâden if01ge opfindelsen fâr ST enterotoxin lov til at reagere med et ugiftigt bifunktionelt tværbin-dingsmiddel for proteiner, der virker enten som et homofunk-tionelt eller som et heterofunktionelt reagens til dannelse 20 af et tværbundet ST enterotoxin, og eksempler pâ bifunktio- nelle protein-tværbindende midler, der virker som homofunk-tionelle reagenser, er dialdehyder, diketoner, carbodiimider, diisocyanater, diisothiocyanater, aryldiazider, acyldiazider, aryl (aktiveret)-difluorider, aryldisulfonyl(aktiveret)-chlo= 25 rider eller -bromider, dicarboxylsyre(aktiveret)-azider, chlo= rider eller estere, dialphahalogenketoner, polymethylen (n=3-12)-diimidsyreestere, bis-(maleidomethyl)-ethere, gem-bis-diazoacetylalkaner, bis-diazoaren og N,N'-arylen-dimalein= syreimider, og eksempler pâ beterofunktionelle reagenser er 30 dem, der har to forskellige, men forenelige funktionelle grupper af de ovennævnte tværbindende midler, specielt iso= cyanato- og isothiocyanatoarener, (aktiveret) fluor- og azidoarener, (aktiveret) azido- og fluorarener, (aktiveret) azido-aryl-alpha-halogenalkylketoner, chlor- eller brom= 35 acetimidsyre lavere alkylestere, chlormyresyre lavere alkyl= estere og epihalogenhydriner.

DK 157245 B

5

De bifunktionelle tværbindingsraidler til proteiner, der er omtalt i den foreliggende beskrivelse/ er velkendte. For eksempel er en oversigt over kunstige tværbindinger i pro-5 teiner blevet offentliggjort af Rosa üy & Finn Wold i ka- pitel 9 i Advances in Experimental Medicine and Biology med titlen "Protein 'Crosslinking (Biochemical and Molecu-lar Aspects)",redigeret af Mendel Friedman, Plénum Press,

New York.

10

Blandt disse forskellige tværbindingsmidler er de, der mest almindeligt anvendes af praktiske grunde, homofunktionelle reagenser sâsom glutaraldehyd, difluordinitrobenzen, isocy= anat-og isothiocyanat-forbindelserne, carbodiimiderne og *5 diimidsyreesterne.

E.coli ST enterotoxinet, der anvendes som udgangsmateriale til fremgangsmâden if01ge opfindelsen, kan fâs af enhver 20 E.coli ST enterotoxin-producerende stamme.

Det fremkomne ST enterotoxin, der findes i kulturens over- liggende væske, bliver sâ i reglen ekstraheret og renset ved at fjerne nogle af forureningerne, f.eks. ved ultra-25 filtrering, gelfiltreringskromatografi, ionbytningskromato- grafi, ekstraktion med éthanol eller polyacrylamidgel- pladeelektroforese. En beskrivelse af nogle af disse frem- gangsmâder kan findes i en artikel, der er offentliggjort af Y.Takeda m.fl. i Infect.Immun. 25, 978-985, 1979.

30

Da ST enterotoxinet er ret résistent over for temperatur, kan fremgangsmâden if0lge opfindelsen finde sted inden for et bredt temperaturinterval, omend det i praksis foretrækkes at arbejde ved en temperatur under 37°C og specielt ved 35 o stuetemperatur, d.v.s. 20 - 25 C.

DK 157245 B

6

Reaktionen finder sted i vandigt og fortrinsvis pufret medium ved en pH-værdi, der afhænger'af karakteren af tvær-bindingsmidlet: For eksempel, hvor det drejer sig om di= aldehyder eller diketoner, er pH-værdien af reaktionen 5 ikke af afg0rende betydning, og en egnet pH-værdi ligger fra ca. 4 til ca. 8, idet en pH-værdi pâ ca. 5 foretrækkes, og meget lave pH-værdier undgâs for at reducere en mulig selvkondensation af aldehydet. En pH-værdi pâ 5 er ogsâ egnet til tværbindingsmidlerne carbodiimid og isocyanat, 10 men til epihalogenhydrinet er en svagt alkalisk pH-værdi (f.eks. ca. 8) egnet.

Nâr et dialdehyd eller en diketon anvendes til tværbinding af ST enterotoxin, der findes i lav koncentration i mediet, kan tværbindingsreaktionen forbedres ved at udfælde ST ved 15 udsaltningsteknik, f.eks. ved tilsætning af natriumsulfat, f0r tværbindingsreagenset tilsættes.

Opl0seiigheden af det fremkomne ST enterotoxinderivat pâ-virkes af de forskellige mulige grader af tværbinding.

ST enterotoxinderivaterne fremstillet if0lge opfindelsen kan 20 forarbejdes til farmaceutiske eller veterinære præparater til intramuskulær eller oral administration ved tilsætning af en anvendelig bærer til sâdan administration. Egnede bærere indbefatter isotoniske saltopl0sninger eller st0dpude-opl0sninger og andre materialer af velkendt art.

25 Afhængende af vandopl0seligheden af ST enterotoxinderivatet kan det administrerede farmaceutiske eller veterinære præ-parat være enten en opl0sning eller en suspension, men allige-vel inkluderes i praksis en adjuvant sâscm Freund's fuld-stændige adjuvant (til veterinært brug), aluminiumhydroxid

DK 157245 B

7 eller lignende, idet præparatet lagres i fryset0rret form, og opl0sningen (eller suspensionen) rekonstitueres pâ be-stilling, f.eks. ved tilsætning af Freund's fuldstændige adjuvant. En enhedsdosis af ST enterotoxinderivat if0lge 5 opfindelsen vil indeholde f.eks. 0,1 mg tværbundet TS pr. kg legemsvægt.

ST enterotoxinderivaterne fremstillet if0lge opfindelsen kan ogsâ tjene andre formâl, f.eks. til let fremstilling af anti ST antisera, der er nyttige til immunbestemmelse.

10 EKSEMPEL 1.

E.coli-stammen ATCC 31621 rehydratiseres med sterilt salt-vand og inkuberes i 18 timer ved 37°C i petri-skâle, der hver indeholder 20 ml selektiv LB agar fastmedium (et pro-dukt fremstillet og forhandlet af Difco Laboratories, Detroit, 15 Michigan, USA) suppleret med 25 mcg chloramphenicol pr. ml og forud opvarmet i 45 minutter til 115°C.

Et flydende kulturmedium (betegnet PP3) fremstilles sâ ved at opl0se proteose-pepton nr. 3 (et produkt fremstillet og forhandlet af Difco Laboratories) (30 g),gærekstrakt 20 (4g) og dextrose (5g) i en liter vand ved 60°C. Efter af- k0ling tilsættes 5 g NaCl, 5,05 g Na2HPO^ og 1,2 g KI^PO^. Mediet, hvis pH-værdi er 6,9 - 7,0, filtreres pâ Seitz EKS filter, og portioner pâ 30 ml fordeles i 250 ml kulturkolber.

Disse kulturkolber podes med de glatte kolonier fremkommet 25 i petri-skâle, idet der anvendes fire kolonier pr. 30 ml PP3 flydende medium, og inkuberes i 7 timer ved 37°C un-der rystning pâ rystehylder (20 - 30 rystninger pr. minut).

Der foretages sâ en anden passage (i en période pâ 16 timer) i 800 ml PP3 medium indeholdt i en 6 1 konisk kolbe under 30 anvendelse af 5% (v/v) podemateriale fra den f0rste passage.

DK 157245 B

8

Den fremkomne forkultur anvendes som podemateriale (5% v/v) til produktionstri.net, der udf0res i en forgæringsbeholder indeholdende 80 1 modificeret Alderete medium (8,71 g I^HPO^, 2,35 g NaCl, 1,0 g NH^Cl, 1,8 g tricin, 50 mg MgSO^, 5 711^0,4,95 mg MnC^^f^O og4,9 mg FeCl^ i en liter vand), der er steriliseret i30 minutter ved 121°C og derpâ suppleret med 1,42 g 1-prolin, 0,87 g 1-asparaginsyre, 0,39 g 1-alanin, 0,69 g 1-serin, 0,05 g 1-phenylalanin, 0,05 g 1-histidin, 0,05 g 1-tryptophan og 5 g casaminosyrer (et produkt frem-stillet og forhandlet af Difco Laboratories, Detroit 1, Michigan, USA) til en liter endelig opl0sning, idet amino-syrebestanddelene fremstilles separat som 10 gange koncen-treret opl0sning indstillet til pH 7,5 og steriliseret i 30 minutter ved 121°C, f0r de inkorporeres i den f0rstnævnte opl0sning.

Produktionsmediet inkuberes aerobt under omr0ring ved 36°C i en période pâ 10 - 15 timer, d.v.s. nâr pH-værdien nâr 8,2 - 8,4, og nâr oxygenforbruget nærmer sig 0.

Efter endt produktionstrin bringes suppen op pâ 60°C i 30 mi-20 nutter og centrifugeres ved 6000 g, og den overliggende væ-ske filtreres pâ Seitz EKSl filter.

ST enterotoxin koncentreres sa og renses ved en procès i tre trin som f0lger: I det f0rste trin bliver en portion pâ 40 liter filtreret 25 fermentationsmedium koncentreret op til et rumfang pâ 5 liter ved filtrering pâ Pellicon PTAC-membran, der har en afskæ-ring ved 1.000 (Pellicon PTAC er varemærket for en ultra-membran af blandede celluloseestere, fremstillet og forhandlet af Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts, 30 USA), efterfulgt af dialyse pâ samme Pellicon PTAC-membran, indtil ledningsevnen er faldet til 500 mikrosiemen. Den tilbageholdte fraktion koncentreres sâ yderligere op til en liter og lyofiliseres. Det fryset0rrede produkt kaldes

DK 157245 B

9 I det andet trin bliver en portion pâ 3 g ST-MP opl0st i 150 ml vand, og opl0sningen afk0les til 0 - 4°C. Kold acetone (1,5 liter) tilsættes drâbevis under omr0ring, som opretholdes i 30 minutter efter fuldstændig tilsætning 5 af acetonen. Blandingen centrifugeres ved 3.000 g, og den overliggende væske koncentreres under reduceret tryk til et rumfang pâ 30 ml, hvortil der sættes 180 ml af en blan-ding af methanol og chloroform 2:1 (v/v). Efter kraftig rystning tilsættes 42 ml vand, og det 0vre lag fraskilles, 10 inddampes til t0rhed under reduceret tryk og fryset0rres.

Det fryset0rrede produkt omtales i den foreliggende beskri-velse som ST-ACF-D.

1 det tredie trin bliver en portion pâ 200 ml ST-ACF-D op-l0st i 2 ml vand og pâf0rt foroven pâ en afk0let s0jle (2,5 x 30 cm) indeholdende 50 g Servachrom-8 (Servachrora-8 er varemærket for en kromatografisk kvalitet af polyacryl= methylester, forhandlet af Serva G.m.b.H & Co., Heidelberg, Vesttyskland), der er bragt i ligevægt med vand. Eluering foretages med vand. Efter eluering af en f0rste fraktion 20 fortsættes elueringen med methanol/vand 6:4 (v/v) for at eluere den ST-holdige fraktion. ST isoleres ved afdampning af opl0sningsmidlet, og den fremkomne remanens betegnes ST-PAE.

ST-PAE udviser en rensningsfaktor pâ 1.000 - 4.000 sammen-25 lignet med den oprindelige portionsaktivitet, og den speci-fikke aktivitet af ST-PAE-produktet varierer mellem 5., 5 og 15 nanogram fra parti til parti.

Den biologiske aktivitet af fraktioneme bestemmes ved pr0ven med museunger if0lge den fremgangsmâde, der er beskrevet 2° af A.G.Dean (J.Infect.Dis. 125, 407-411, 1972). 48 - 72 timer garnie babymus podes derfor intragastrisk med 0,025 ml toxinopl0sning, og akkumuleringen af væske i tarmen mâles 2 timer senere. Forholdet ^g^^gvægt' er et ^or ^en logiske aktivitet af toxinet. Værdier h0jere end eller lig ? 10

DK 1 5 7 2 4 5 B

l ofiliseret produkt), som giver en j^^svægt “værdi Pâ 0,100 ved pr0ven med museunger.

EKSEMPEL 2.

10 mg ST-PAE opl0se's i 0,25 ml acetat-st0dpude (pH 5,1) 5 og udfældes deraf ved tilsætning af 0,25 ml af en 36% op-l0sning (w/v) af natriumsulfat i samme st0dpude. Vandig glutaraldehyd (20 mikroliter af en 25% v/v opl0sning) til-sættes, og reaktionen fâr lov at forl0be i 2 timer ved stuetemperatur. Efter denne reaktionstid fraskilles over-skydende reagens ved centrifugering og vask med vand, og bundfaldet fryset0rres.

Det fryset0rrede produkt bestâr af immunogen tværbundet ST med for0get molekylvægt sammenlignet med umodificeret ST anvendt som udgangsmateriale, bestemt ved gelkromatogra-I5 fri pâ Sephadex G-100 (Sephadex er varemærket for en kro-matografi-kvalitet af dextran, fremstillet og forhandlet af Pharmacia, Uppsala, Sverige).

For at demonstrere molekylvægt-for0gelsen opl0seligg0res det fryset0rrede produkt delvis ved tilsætning af en ml 20 vand og omr0ring af blandingen i 2 timer ved stuetemperatur. Den opl0seliggjorte fraktion repræsenterer fra 30 til 50% af den uopl0seUge fraktion og udviser en hovedtop ved 10.000, medens udgangs-ST-PAE-materialet under samme betingelser udviser en hovedtop ved 4.000 (top bag ved Vt 25 pâ Sephadex G-100; Vt er s0jlens leje-rumfang).

EKSEMPEL 3.

20 mg ST-PAE opl0ses i en ml vand, og der tilsættes en op-l0sning af 200 mg l-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)-carbodi= imid hydrochlorid. Blandingen fâr lov at henstâ ved 25°C i 20 12 timer, hvorunder tværbindingsreaktionen forl0ber. Det opl0selige reaktionsprodukt dialyseres pâ PM-10 Amicon mem- 11

DK 1S7245 B

bran (Amicon er varemærket for en ultramembran, fremstillet og forhandlet af Amicon Corporation, Lexington, Massachusetts, USA) for at fjerne ureageret ST, og den tilbagehold-te fraktion (13 mg) fryset0rres. Molekylvægten af denne 5 tværbundne ST er ca. 10.000 (mod 2.000 for udgangsmateri- alet), nâr den bestemmes ved gelkromatografi pâ Sephadex G-100, som vist i eksempel 2. Absorptionsspektret af denne tværbundne ST er ogsâ forskellig fra absorptionsspektret af den ST-PAE fraktion, der blev anvendt som udgangsmateri-10 ale.

EKSEMPEL 4.

5 mg ST-PAE opl0ses i 0,5 ml 0,1 M borat-st0dpude NaOH), pH 8,0, og der tilsættes 100 mikroliter 0,02 M di= fluordinitrobenzen i éthanol. Tværbindingsreaktionen fâr 15 lov at forl0be under omr0ring i 4 tinter ved stuetemperatur. Efter denne reaktionstid kasseres ureageret ST ved dialyse gennem et Spectrapor dialyser0r, der har en afskæring ved 14.000 (Spectrapor er varemærket for et dialyser0r, der fremstilles og forhandles af Spectrum Medical Industries, 20 New York,USA).

Ved gelkromatografi pâ Sephadex G-100 (som vist I eksempel 2) bestemmes molekylvægten af denne opl0selige tværbundne ST til 50.000 (mod 2.000 for udgangs-ST-PAE). Absorptionsspektret af den tværbundne ST udviser ogsâ en yderligere 25 top ved 350 nanometer til forskel fra absorptionsspektret af udgangs-ST-PAE.

EKSEMPEL 5.

Fryset0rret ST enterotoxinderivat (100 mg), som fremkommet i slutningen af eksempel 2, suspenderes i 0,5 liter fysio-30 logisk saltopl0sning og 0,5 liter Freund's fuldstændige adjuvant, og blandingen fordeles i glasflasker indeholdende hver en effektiv dosis af tværbundet ST enterotoxin til vete-

DK 157245 B

12 rinær administration. Flaskerne tillukkes sâ tæt og hol-des ved 4°C.

EKSEMPEL 6.

Fryset0rret ST enterotoxinderivat (100 mg), som framkommet 5 i slutningen af eksempel 2, suspenderes i en liter fysialo-gisk saltopl0sning og 10 g alhydrogel (et produkt fremstil-let og forhandlet af Superfos Export Company, K0benhavn, Danmark), og blandingen fordeles i glasflasker, der hver indeholder en effektiv tværbundet ST enterotoxin til human 10 administration. Flaskerne tillukkes sâ tæt og holdes ved 4°C.

EKSEMPEL 7.

Et præparat, som fremstillet i eksempel 5, blev administre-ret subkutant til tre kaniner (A, B og C) med en enheds-15 dosis pâ 0,1 mg pr. dyr, og samme subkutane administration blev gentaget 21 dage senere. Blodpr0ver (d.v.s. antiserum) blev taget den 28. dag efter f0rste administration.

Seraene af de immuniserede kaniner blev afpr0vet for deres styrke til at neutralisere (in vitro, 2 timer ved 37°C), 20 en fast mængde ST, som bestemt ved museunge-pr0ven (A.G.Dean, loc.cit.). Til kontrollen blev anvendt enten phosphat-st0dpude med saltopl0sning eller normal sérum i stedet for antiserum.

Resultaterne af seroneutralisations-pr0ven er anf0rt i f01gen-25 de tabel I, hvor PBS betyder en st0dpude-opl0sning bestâende af 8 g NaCl, 0,2 g KC1, 1,15 g Na2HPO^, 0,2 g KH2PO^ i destilleret vand op til 800 ml,blandet med en opl0sning af 100 mg MgCl2,6H20 i 100 ml destilleret vand, og derefter til en 30 opl0sning af 0,1 g CaCl2 i 100 ml destilleret vand.

Værdier af gw/bw mindre end 0,09 er indikation for ST- neutralisation.

13

DK 15 7 2 4 5 B

Hver gw/bw-værdi er gennemsnitsværdien af tre bestemmelser, og hver af dem repræsenterer gw/bw af en gruppe pâ fire 5 museunger.

ST-rumfang refererer til en ST-opl0sning indeholdende 1,4 mcg toxin af ST-ACF-D-kvalitet pr. ml.

TABEL· I.

Antisérum

Skema fortynding gw/bw 10 Kontrol 0,5 ml ST + 0,5 ml PBS - 0,102

Kanin A

0,5 ml ST + 0,5 ml 1/16 0,064 antiserum 1/32 0,087 1/128 0,097

Kanin B

0,5 ml ST + 0,5 ml 1/4 0,059 antiserum 1/8 0,100

15 Kanin C

0,5 ml ST + 0,5 ml 1/8 0,098 antiserum 1/16 0,098

Resultaterne demonstrerer immunogeniciteten af den tværbundne ST. 1 EKSEMPEL 8.

Et præparat fremstillet i eksempel 5, men med tværbundet toxin sorti fremstillet i eksempel 3 (opl0selig fraktion med molekyl-vægt over 10.000) blev administreret subkutant til tre ka-niner (K, L og M) med en enhedsdosis pâ 0,1 mg pr. dvr, og

O C “l mVlA A A* « *1a 11·., i* n M A —. ÂI VW J V. · A J. V -«4-4 A VI Vn 1 /—« V V M A —. -I— AM — i. g 7 J3 n> A A AV. A ΊΑ A

DK 157245 B

14

Blodpr0ver (d.v.s. antiserum) blev taget den 28.dag efter f0rste administration, og seroneutralisationspr0verne blev udf0rt som i eksempel 7, men under anvendelse af normal sérum i stedet for PBS.

5 Resultaterne er vist" i tabel II og viser immunogeniciteten af den tværbundne ST i êt dyr ud af tre.

TABEL II.

Antiserum

Skema fortynding gw/bw 10 Kontrol 0,5 ml ST + 0,5 ml sérum - 0,129

Kanin L

0,5 ml ST + 0,5 ml antiserum 1/1 0,060

Kanin K

15 0,5 ml ST + 0,5 ml antiserum 1/1 0,100

Kanin M

0,5 ml ST + 0,5 ml antiserum 1/1 0,111 EKSEMPEL 9.

20 Et præparat fremstillet i eksempel 5, men med tværbundet toxin som fremstillet i eksempel 4 (opl0selig fraktion med molekyl-vægt over 14.000) blev administreret til tre kaniner (H, I og J) med en enhedsdosis pâ 0,5 mg pr. dyr, og samme subkutane administration blev gentaget 21 dage senere. Blodpr0ver 25 (d.v.s. antiserum) blev taget den 28.dag efter f0rste admini stration, og seroneutralisationspr0verne blev udf0rt som i eksempel 7.

Resultaterne er anf0rt i f0lgende tabel III, der viser immunogeniciteten af tværbundet ST.

DK 157245 B

15 TABEL III.

Antiserum

Skema fortynding gw/bw

Kontrol 0,5 ml ST + 0,5 ml PBS - 0,114

Kanin H

5 0,5 ml ST + 0,5 ml antiserum 1/1 0,078

Kanin I

0,5 ml ST + 0,5 ml antiserum 1/1 0,073

Kanin J

0,5 ml ST + 0,5 ml antiserum 1/1 0,061 10 EKSEMPEL 10.

Et præparat fremstillet i eksempel 5 blev administreret sub-kutant til tre pattegrise (20 kg legemsvægt) med en enheds-dosis pâ 0,5 mg (dag 0), 0,5 mg (dag 21) og 5 mg (dag 46) til grisene A og B og 0,1 mg (dag 0), 1 mg (dag 21) og 15 5 mg (dag 46) til gris C. Blodpr0ver (d.v.s. antiserum) blev taget pâ dag 61, og seroneutralisationspr0ver blev udf0rt, som beskrevet i eksempel 7.

Resultaterne er vist i f0lgende tabel IV, der viser immunoge-niciteten af tværbundet ST.

Claims (2)

1. Analogifremgangsmâde til fremsti11ing af varmestabi1t en-terotoxinderivat, kendetegnet ved reaktionen af E.coli varmestabi1t enterotoxin med et ugiftigt bifunktionelt tvarbindende middel for proteiner og udvinding af det derved fremkomne E.coli varmestabilt enterotoxinderivat.

2. Fremgangsmâde ifolge krav 1, kendetegnet ved, at det bifunktionelle tværbindingsmiddel er et dialdehyd, en diketon, et carbodiimid, et isocyanat, et epihalogenhydrid eller et difluorid.