DK153334B - Diagnostiske praeparater - Google Patents

Description

DK 153334 B

Ddn foreliggehde opfindelse angår et diagnostisk præparat af den i krav l's indledning omhandlede art.

Undersøgelse af legemsvæsker eller affaldsstoffer fra dyr eller mennesker, såsom blod, urin eller faste affaldsstoffer spiller en vigtig rolle i diagnosen af sygdomme eller undersøgelsen og vurderingen af virkningerne af behandling af sygdomme med lægemidler.

Til identifikation af en blodprøves komponenter er det imidlertid nødvendigt at adskille erythrocyterne fra blodprøven inden undersøgelsen, og forbehandlingen till adskillelse af plasma- og serumkompo- 2

DK 153334 B

nenter fra blodprøven kræver fagmæssig kunnen og erfaring samt kostbart apparatur. Det er derfor ønskeligt, at man til sin rådighed har diagnostiske præparater, som kan anvendes og håndteres på en simpel og hensigtsmæssig måde samt endvidere give 05 pålidelige semikvantitative diagnostiske test-resultater.

Forskellige forsøg har været gjort på at udvikle et simpelt og bekvemt middel til diagnostisk brug. I den senere tid har man ofte til dette formål anvendt et middel, såsom en prøvestrimmel, der omfatter et lag af prøvepapir. F.eks. er der i USA-patent-10 skrift nr. 3.092.465, britisk patentskrift nr. 922.665, japansk patentskrift nr. 14.673/1969 og japansk patentskrift nr. 15.669/1970 omhandlet et sådant middel, som kan anvendes til identifikation og bestemmelse af glucose, galactose, phenylalanin eller urinstof i en blodprøve. Visse midler af denne type har 15 været markedsført, f.eks. under det registrerede varmemærke "Dextrostix".

De diagnostiske midler, såsom en prøvestrimmel, der konventionelt har været anvendt til identifikation af saccharider i urin eller blod kan f.eks. fremstilles ved imprægnering af et 20 sugende, porøst underlag, såsom filtrerpapir med et enzymatisk system eller en kromogen og påfølgende tørring af det imprægnerede underlag. Det er bekvemt at anvende en sådan prøvestrimmel, fordi den ved dypning i en flydende prøve, som skal undersøges, giver mulighed for at identificere et stof ved påvisning 25 af en farvefremkomst eller forandring i det enzymatiske system eller kromogenen, som induceres af et reaktionsprodukt, som dannes, når det enzymatiske system bringes i kontakt med stoffet i nærværelse af oxygen. Det er dog uundgåeligt, at stabiliteten af farveudviklingen og tonen, som fremkaldes af kromogenen, på-30 virkes af pH-værdien i den flydende prøve eller af mængden af inhiberende materiale, som er til stede i prøven, hvorved det er vanskeligt at få et pålideligt test-resultat. Som følge heraf har konventionelle diagnostiske præparater og midler indeholdende benzidin eller en homolog deraf, såsom ortho-tolidin kun begræn-35 set anvendelighed til diagnostiske formål.

3 DK 153334 B

Por at et diagnostisk middel kan tillade en glat enzymatisk reaktion, hvorved der tilvejebringes en klar og stabil farveudvik-ling eller farveforandring af en kromogen deri, er det nødvendigt at bevare kromogenens stabilitet i et system, hvor kromogenen om-5 dannes til frembringelse af en farve og at holde en flydende prøves pH-værdi inden for et bestemt interval. Til dette formål skal kromogenen tjene som en hydrogendonor for et oxidations-reduktionssystem, dvs. et system, hvori kromogenen omdannes til et produkt, der let kan virke med saccharider i urin eller katalase i faste affalds-10 stoffer til frembringelse af en farve. Samtidig skal kromogenen også virke til bestemmelse,! det mindste semi-kvantitativt,af et stof, som skal identificeres i en flydende prøve ved udvikling af eller omdannelse til en farve ved autooxidation.

De nævnte konventionelle diagnostiske midler fremstilles 15 på en sådan måde, at en gennemskinnelig, tynd filmbelægning eller et vandfrastødende eller hydrofobt materiale belægges på overfladen af den diagnostiske prøvestrimmel, således at hæmoglobinet eller erythrocyterne i en blodprøve ikke kommer ind i det porøse underlag, medens den dyppes i en prøve, således at det på overfladen tilbage-20 bievne hæmoglobin let kan afvaskes med rindende vand i et nærmere bestemt tidsrum, efter at prøvestrimmelen er blevet dyppet i prøven, som skal undersøges. Disse konventionelle diagnostiske’ midler er bekvemme i den henseende. Det er imidlertid vanskeligt at frembringe en ensartet belægning ved hjælp af et vandfrastødende mate-25 riale. Endvidere kan uensartethed af en sådan belægning på overfladen af prøvestrimmelen bevirke uregelmæssigheder i bestemmelsen af et stof, som skal identificeres,eller vanskeligheder ved at udføre en semi-kvantitativ analyse med pålidelige resultater, fordi belægningens tilstand kan indvirke på pålideligheden af bestemmelsen og iden-30 tifikationen.

I dansk patentskrift nr. 92.277 nævnes følgende eksempler på farvedannende substrater (kromogener): o-phenylendiamin

^ NHL

35

DK 153334B

Ν,Ν' -dimethyl-p-phényLendiamin CH3NH —^ NHCH3 5 N, N1-diethyl-p-phenylendiamin C2H5NH^_ NHC2H5 Benzidin 10 H2N-^ NH2

Dianisidin H^N Jf NH0 15 \ / 2 CH30 \ OCH3 20 Disse kromgener er velkendte i diagnostiske præparater af den foreliggende type, og er generelt diskuteret ovenfor, hvor det konkluderes, at konventionelle diagnostiske præparater indeholdende benzidin eller en homolog deraf såsom ortho-tolidin kun har begrænset anvendelighed til diagnostiske formål. Dette er yderligere 25 undefbygget nedenfor i eksemplerne, især eksempel 4, hvoraf det fremgår, at benzidin og ortho-tolidin giver en uklar og ustabil farvereaktion.

De i det diagnostiske præparat ifølge den foreliggende opfindelse anvendte kromogener er alkyleringsprodukter af o-tolidin, der 30 kan betegnes med den almene formel: 4 35 hvori R til R betegner hydrogen, methyl ellér ethyl, hvoraf en til tre er methyl eller ethyl. Det har uventet vist sig, at disse alkylerede o-tolidiner giver en klarere og mere stabil farvereaktion end de ikke-alkylerede produkter, som er omhandlet i bl.a.- dansk patentskrift nr. 92.277.

5 DK 153334B

Det diagnostiske præparat ifølge opfindelsen til påvisning eller måling af okkult blod eller saccharid i en prøve, opnået fra legemsvæsker eller eskrementer fra mennesker eller dyr, er af den art, der indeholder et kromogen, der ved kontakt med prøven i nær-5 værelse af et enzym, som sammen med prøven danner aktivt oxygen, oxideres til dannelse af en farve og er ejendommeligt ved, at kro-mogenet i det mindste er en af forbindelserne N-monomethyl-, N-monoethyl-, N,N'-dimethyl-, Ν,Ν-diethyl-, Ν,Ν,Ν1-trimethyl- eller NyN, N' -triethy l-o-toli din.

10 Det alkylerede diamino-diphenylderivat kan fremstilles ved be handling af diamino-diphenylderivatet uden alkylsubstitution i amino-grupperne med et alkyleringsmiddel. Omsætningen kan udføres ved omgivelsernes eller forhøjet temperatur. Diamino-diphenylderivatet, der anvendes som udgangsmateriale, er ortho-tolidin. Alkyleringsmidlet, 15 som kan anvendes til dette fomål, kan være et hvilket som helst middel, der sædvanligvis kan anvendes til alkylering af en amino-gruppe, og som også kan give et diamino-diphenylderivat, hvori i det mindste et af hydrogenatomerne i aminogrupperne er substitueret med en lavere alkylgruppe med 1 til 2 carbonatomer. Eksempler 20 på alkyleringsmidlerne er et dialkylsulfat, som f.eks. dimethyl-sulfat og diethylsulfat, et alkylhalogenid som f.eks. methyl-chlorid, methylbromid, methyliodid, ethylchlorid, ethylbromid og ethyliodid,samt et dialkylsulfoxid som f.eks. dimethylsulfoxid, diethylsulfoxid og methylethylsulfoxid.

25 Alkyleringen af diamino-diphenylderivatet ved behandling med alkyleringsmidlet kan sædvanligvis føre til et reaktionsprodukt, hvori i det mindste et af hydrogenatomerne i aminogrupperne er substitueret med en lavere alkylgruppe. Endvidere kan denne alkylering give en blanding af de alkylerede diamino-diphenylderivater, hvori de to 30 aminogrupper hver er alkylerede med indtil to alkylgrupper. Endvidere giver alkyleringsreaktionen sædvanligvis disse reaktionsprodukter med forskellig grad af alkylsubstitution i blanding med udgangsmaterialet. Anvendelsen af en sådan blanding indvirker dog ikke ugunstigt på den diagnostiske virkning, således at det ikke er nød-35 vendigt at adskille det alkylerede reaktionsprodukt fra produkter med andre alkylsubstitutioner eller at adskille en blanding af alkylerede reaktionsprodukter fra udgangsmaterialet, som bliver uomsat tilbage i reaktionsblandingen. Som følge af de tekniske vanskeligheder ved at adskille det uomsatte udgangsmateriale fra en blanding af de alkylerede produkter er det i øvrigt ud fra et prak-

DK 153334B

6 .

tisk synspunkt tilrådeligt at anvende en totalblanding indeholdende udgangsmaterialet og de forskelligt alkylerede produkter.

Det alkylerede o-tolidin, som anvendes, kan give sin egen særlige farvetdne i henhold til antallet og/eller positionen 05 af alkylsubstitutionen i aminogrupperne. I overensstemmelse hermed kan et bestemt, ønsket diagnostisk middel omfattende o-tolidinet med en passende mæhgde alkylsubstitution i en passende position på aminogrupperne udvælges i overensstemmelse med arten og naturen af et stof, som skal identificeres og en væske, som skal 10 undersøges.

Det har endvidere vist sig, at man kan undgå ulemperne og vanskelighederne ved de konventionelle diagnostiske midler ved hjælp af et diagnostisk præparat af den i krav l"s kendetegnende del anførte art, hvilket præparat kan omfatte et sugende, 15 porøst underlag og en oxidations-reduktions-indikator, som er i stand til at reagere med et saccharid, som skal identificeres, såsom glucose, idet underlaget er imprægneret i en opløsning indeholdende den alkylerede forbindelse, således at der på underlagets overflade dannes en tynd, gennemskinnelig film eller et 20 lag af et vandfrastødende eller hydrofobt middel. Det omhandlede diagnostiske præparat omfatter det alkylerede diamino-diphenyl-derivat og om ønsket og fortrinsvis sammen med en saccharid--oxidase, peroxidase og guajak, understøttet på et sugende, porøst underlag.

25 Med udtrykket "saccharid-oxidase" menes et hvilket som helst enzym, der besidder evnen til at oxidere et saccharid, som fi.eks. glucose og galactose, og som kan identificere det ønskede saccharid i det mindste semi-kvantitativt i en flydende prøve. Saccharid-oxidasen kan f.eks. være glucose-oxidase og galactose- on oxidase.

En guajak, som er den ene af komponenterne, der kan anvendes i det omhandlede diagnostiske instrument, kan i almiiidelighed være af naturlig oprindelse. Det er vandkeligt at identificere sammensætningen deraf nøjagtigt, men guajakken, som anvendes til 35 det foreliggende formål, kan være i form af et gulbrunt, amorft pulver indeholdende α-guajakonsyre (^22H26°6^ eHer β-guajakon-syre (C2iH26°5^ ’ Den chlorof°ritloPlØseli9e af guajak, som er kommercielt tilgængelig, kan sædvanligvis anvendes til det fore- 7

DK 153334B

liggende formål, alene fordi den er let tilgængelig.

Det sugende, porøse unde±lag, som anvendes i det omhandléde diagnostiske instrument, kan i almindelighed være filtrerpapir, især hærdet filtrerpapir, fortrinsvis Whatman nr. 5(i^, Whatman 05 nr. 5$, Whatman nr. 54®, Whatman nr. 540®' Whatman nr. 54]®, Whatman nr. 542® og Whatman DE-81®, idet Whatman nr. 54® er det mest foretrukne. Et sintret porøst materiale af glas eller formstof materialer, som kan bære en adsorbent i de fine huller eller hulheder, kan også anverides til det foreliggende formål.

10 Det omhandlede diagnostiske prséparat og diagnostiske middel besidder fremragende egenskaber med hensyn til frembringelse eller udvikling af en stabil farve, som ikke forringes af inhiberende materialer, der er til stede i den flydende prøve, som skal undersøges. Homogeniteten af den kromogene reaktion eller farvereak-" 15 tionen, som finder sted på det diagnostiske middel, og kromogenets sensitivitet og nøjagtighed er også forbedret.

Det alkylerede diamino-dipehnylderivat, som anvendes til det foreliggende formål, er på olieform, medens det som udgangsmateriale til ^'fremstilling af de alkylerede forbindelser anvendte ikke-20 alkylerede diamino-diphénylderivat foreligger på krystalform. Såfremt udgangsmateriale forbliver uomsat tilbage i reaktionsblandingen og er til stede sammen med de olieggtige alkylerede produkter, kan en sådan blanding fortsat have form af et olieagtigt materiale. Endvidere afsætter udgangsmaterialet, som forbliver 25 uomsat tilbage i reaktionsblandingen, sig ikke på underlagets overside som faste stoffer, således at de ulemper, dom måtte forventes på grund af flaste stoffer afsat på overfladen deraf, undgås. En sådan blanding er også forenelig med guajakken i det omhandlede diagnostiske præparat og fungerer herved til hindring af 30 det i en legemsvæske- eller faecesprøve tilstedeværende hæmoglobin i at trænge ind i det porøse underlag.

Det omhandlede diagnostiske præparat kan indeholde en hvilken som helst komponent, der konventionelt kan anvendes til dette formål, såsom en puffer, et overfladeaktivt middel, et baggrunds-35 justerende farvestof og/eller et middel til forøgelse af præparatets viskositet. Pufferen kan f.eks. være en vandig opløsning af phthalsyre, et phosphat eller citronsyre. Det overfladeaktive middel kan f.eks. være en kompleks blanding af polyoxyethylen- 8 .

DK 153334B

ethere af blandede estere af fede syrer, f.eks. den, der kendes under det registrerede varemærke "Tween 20". Det baggrunds-justerende farvestof kan f.eks. vire tartrazin. Det viskositets-for øgendemiddel kan f.eks. være et beskyttende kolloid, der i 05 almindelighed anvendes til stabilisation af et enzym, såsom polyalkylenglycol og polyvinylalkohol.

Fremgangsmåden til fremstilling af det omhandlede diagnostiske middel består i, at det sugende, porøse underlag imprægneres i en opløsning indeholdende det omhandlede alkylerede diamino-diphenyl derivat. Fremstillingsmåden for det diagnostiske middel kan TO variere i afhængighed af det formål, hvortil det skal anvendes.

Når det til imprægneringsopløsningen ønskes at sætte- en saccharid-oxidase, peroxidase og en guajak, kan imprægneringen fortrinsvis foretages i to trin, og det diagnostiske middel, som er fremstillet på denne måde kan besidde en god, bred anvendelighed til T5 diagnostiske formål. I det første trin imprægneres det dugende, porøse underlag i en opløsning indeholdende en saccharid-oxidase og peroxidase, og det imprægnerede underlag tørres. I det andet trin imprægneres det tidligere imprægnerede tørre underlag i en anden opløsning, som indeholder det alkylerede diamino-diphenyl-derivat og en guajak, hvorefter det to gange imprægnerede underlag tørres. Denne fremgangsmåde er ikke begrænset til denne specielle udførelsesform, men kan anvendes i andre udførelsesformer, hvor en blariding af disse fire komponenter er til stede samtidig eller i anden kombination dermed. Pufferen, det over- j)p e ( fladéaktive middel, det baggrundsjusterende farvestof og/eller midlet til forøgelse af viskositeten kan også tilsættes imprægneringsvæskerne på et ønsket trin. I visse tilfælde kan det omhandlede diagnostiske middel fremstilles ved, at man imprægnerer det sugende, porøse underlag i en opløsning indeholdende det al-30 kylerede diamino-diphenyIderivat og ;om ønsket, pufferen, det overfladeåktive middel, det baggrundsjusterende fiaoWestof og/eller midlet til forøgelse af viskositeten. De således fremstillede diagnostiske instrumenter kan også besidde fremragende egenskaber med hensyn til styring og forhindring af indtrængning af hæmoglobinet 35 i en flydende prøve, som skal undersøges.

De omhandlede diagnostiske midler kan anvendes på konventionel måde. En dråbe af en blodprøve dryppes på overfladen af

9 DK 153334 B

# bort med vand i et bestemt tidsrum, som afhænger af prøven. De omhandlede diagnostiske midler gør det muligt let at fjerne en af blodprøven forårsaget plet, som kunne virke ugunstigt ind på bestemmelsen, uanset at de konventionelle prøvestrimler er util-05 strækkelige med hensyn til fjernelse af en plet i et sådant omfang, at pletten ikke bare forringer farvereaktionen, ved hvilken test-resultaternes nøjagtighed nås. De omhandlede diagnostiske midlet kan derfor give et nøjagtigt og pålideligt test-resultat uden den uheldige virkning af en plet, som ellers ville forringe 10 prøvens nøjagtighed. Disse fordelagtige egenskaber ved de omhandlede diagnostiske midler i praktisk brug gør det muligt at anvende dem til at identificere og bestemme et ønsket stof på i det mindste semi-kvantitativ måde og cf.ør det muligt, at farvereaktionen på overfladen deraf kan finde sted på en stabil måde.

15 De omhandlede diagnostiske præparater kan semi-kvantitativt identificere et saceharid i legemsvæsker eller affaldsstoffer fra mennesker eller dyr, f.eks. glucose i en mængde på 0 til ca.

500 mg pr. dl. Det skal her bemærkes, at man med andre saccharid-oxidaser, f.eks. galactose-oxidase i stedet for glucose-oxidase 20 med de omhandlede diagnostiske Mdler kan opnå i det væsentlige de samme resultater.

Opfindelsen belyses i det følgende nærmere ved eksempler. Det skal være underforstået, at mængden af de komponenter, hvormed et urideilag er belagt ikke er begrænset til de i eksemplerne beskrev-25 ne mængder, og navnlig mængderne af N-(og/eller Ν'-)methylerede eller ethjrlerededdiamino-diphenyldefivater og guajak, som er hovedkomponenterne i opløsningen, som anvendes til det andet imprægneringstrin, kan ændres og varieres i almindelighed iriden for et toleranceintertøal på plus eller minus ca. 50% i forhold til ΟΛ de i eksemplerne beskrevne mængder ud fra betragtninger over stabiliteten af et bestemt enzym, som skal anvendes, og det interval, inden for hvilket bestemmelsen kan foretages pålideligt. Endvidere kan mængderne af saccharid-oxidasen, som fortrinsvis anvendes til opløsningen for det det første imprægneringstrin, 35 varieres og ændres i forhold til variationen i mængderne af komponenterne i opløsningen for det andet imprægneringstrin.

I de følgende referenceeksempler beskrives fremstillingen af de alkylerede derivater.

DK 153334B

ίο ’

Referenceeksempel 1

Til en opløsning af 0,1 g ortho-tolidin i 2,0 ml benzen sattes 0,6 g dimethylsulfat (1 mol),og blandingen henstod 30 min. ved stuetemperatur. Aminforbindelsen overførtes til benzenlaget ved tilsæt-05 ning af 10 ml af en 10% vandig natriumhydroxid-opløsning til blandingen. Benzenlaget-udvaskedes med vand,og benzen afdestilleredes til dannelse af olieagtige materialer indeholdende udgangsmaterialet og en blanding af fem typer reaktionsprodukter med en forskellig grad af methylsubstitution.

10 Referenceeksempel 2

Den i referenceeksempel 1 beskrevne fremgangsmåde gentoges, bortset fra at 10 ml methanol og 1,5 g ethyliodid (2 mol) anvendtes i stedet for 2,0 ml benzen og 0,6 g dimethylsulfat, og reaktionen ^udførtes i 1 time. Reaktionsblandingen ekstraheredes med 20 ml benzen og oparbejdedes på samme måde som ovenfor til dannelse af en blanding af udgangsmaterialet og fem typer reaktionsprodukter med en forskel -grad af ethylsubstitution.

Det skal her bemærkes, at forholdet mellem forbindelserne i 20 en blanding af disse afhænger af reaktionsbetingelserne. F.eks. bestemtes forholdet mellem forbindelserne i referenceeksempel· 1 ved måling af de ved gaskromatografi opnåede toppunkter og viste sig at være som følger:

Forbindelser Mængder i % 25

Ortho-tolidin 37,9 N-monomethyleret 43,4 N,N'-dimethyleret 7,5 N,N-dimethyleret 8,6 3Q Ν,Ν,Ν'-trimethyleret 2,6 N,N,N',N'-tetramethyleret spor.

De efterfølgende tabeller viser de farver, som opnåedes ved farvereaktionen af de alkylerede aminderivater. Tabel X viser ek-35 semplet på farvereaktionen af ortho-tolidin og forskellige méthyle-rede derivater heraf opnået i referenceeksempel 1, og tabel II viser farvereaktionen af benzidin og de forskellige methylerede derivater heraf opnået i referenceeksempel 3.

11

DK 153334B

Tabel I

Forbindelser Farver

Ortho-tolidin blå N-monomethyleret let grønblå 05 Ν,Ν-dimethyleret ingen farveudvikling N,N‘-dimethyleret blålig grøn Ν,Ν,Ν'-trimethyleret grøn Ν,Ν,Ν',Ν'-tetramethyleret grøn (farveudviklingen var sen).

10 De følgende eksempler belyser fremstilling af de omhandlede diagnostiske instrumenter.

Eksempel 1

Der fremstilledes to forskellige typer imprægneringsopløsninger 15 med de nedenfor anførte sammensætninger, på konventionel måde.

Sammensætningen af opløsningen til første imprægneringstrin var følgende:

Sammensætning Mængder 20 0,5 M phthalsyre-puffer- opløsning (pH 5,3) 13 ml

Glucose-oxidase 1000 enheder

Peroxidase 6 mg

Tartrazin 4,2 mg 25 Polyvinylalkohol 200 mg

Opløsningen til det andet imprægneringstrin havde følgende sammensætning :

Sammensætning Mængder 30

Blanding af methylerede ortho-tolidiner (produkt fra referenceeksempel 1) 80 mg

Guajak (chloroform-opløselig del) 100 mg

Ethanol 13 ml 35 En prøvestrimmel fremstilledes ved at dyppe et stykke Whatman nr. 54 filtrerpapir i opløsningen til det første imprægneringstrin,

12 DK 153334B

tørring af det imprægnerede papir, påfølgende dypning af det tørre papir i opløsningen til det andet imprægneringstrin og tørring af det to gange imprægnerede papir. Emnet af det tørre filtrerpapir blev skåret til stykker af en bredde på 5 mm og opbevaredes et sted, hvor der ikke var direkte lys, og hvor fugtigheden holdtes lav.

5 Ved anvendelse af den således fremstillede prøvestrimmel til identifikation og bestemmelse af glucose i f.eks. en blodprøve dryppes en dråbe af blodprøven på overfladen af prøvestrimmelen, og hæmoglobinet, som bliver tilbage, afvaskes med rindende vand på overfladen af prøvestrimmelen i 1 minut. Prøvestrimmelen gav farvereak-10 tion i forhold til koncentrationen af glucose i blodprøverne. Farve-udviklingen bragtes dernæst til at finde sted og sammenlignedes med et standard farvetoneindeks for udførelse af den semi-kvantitative sammenlignende analyse. Standard farvetoneindekset fremstilledes ved udvikling og bestemmelse af en farve i forhold til en specifik 15 mængde glucose i en blodprøve. For de omhandlede prøvestrimler iagt-toges ingen farveforringelse 5 minutter efter udvaskning med forskellige mængder vand, hvilket ellers hyppigt ses ved konventionelle kommercielt tilgængelige prøvestrimler.

20 Eksempel 2

En prøvestrimmel fremstilledes i det væsentlige på samme måde som i eksempel 1, bortset fra at der anvendtes den ethylerede ortho-tolidinblanding fremstillet i referenceeksempel 2 i stedet for de methylerede ortho-tolidinderivater i den anden opløsning. Prøve-25 strimmelen viste sig at give næsten de samme resultater som den i eksempel 1 fremstillede prøvestrimmel.

Sammenlignende eksempel

En prøvestrimmel fremstilledes i det væsentlige på samme måde 30 som i eksempel 1, bortset fra at der anvendtes u-reagéret ortho- tolidin i stedet for den methylerede ortho-tolidinblanding. Ved anvendelse til diagnostiske formål var prøvestrimmelen ikke ensartet med hensyn til farvereaktionen, og den var også utilstrækkelig med hensyn til fjernelse af hæmoglobin, som hæftede til prøvestrimmelens 35 overflade, således at prøveresultaterne var utilfredsstillende sammenlignet med resultaterne med de i eksempel 1 og 2 fremstillede prøvestrimler.

13 DK 153334 B

Eksempel 3

Prøvestrimler fremstilledes på samme måde som i eksempel 1, bortset fra at chloroform, methylenchlorid, tetrachlorcarbon og dichlorethan hver anvendtes i stedet for ethanol i opløsningen 5 til det andet imprægneringstrin. Disse prøvestrimler viste sig også at give næsten samme resultater som den i eksempel 1 opnåede prøvestrimmel.

De følgende eksempler belyser fremstillingen af prøvestrimler, som er nyttige til identifikation og bestemmelse af henholdsvis 10 saccharider og okkult blødning i urin.

Eksempel 4

Forskellige imprægneringsvæsker fremstilledes under anvendelse af følgende sammensætning: 15 Sammensætning Mængder

Blanding af reaktionsprodukterne fra ortho-tolidin eller benzidin (som fremstillet i reference- 20 eksempler) 20 - 100 mg 95% ethanol 4 - 6 ml 0,1 M - 0,5 M citronsyre- puffer-opiøsning (pH 4-8) 2 - 3 ml

Glucose-oxidase 500 - 2000 enheder 25 Tartrazin 0,5 - 15 mg "Tween 20"(10%) 0 - 0,1 ml

Peroxidase 1 - 10 mg

Opløsninger af denne sammensætning fremstilledes f.eks. ved at opløse 60 mg af en blanding af reaktionsprodukterne i 6 ml ethanol, 30 tilsætning hertil af 3 ml af puffer-opløsningen, opløsning af en blanding af 1000 enheder glucose-oxidase, 1 mg peroxidase og 10 mg tartrazin i 4 ml af pufferen, blanding af de to opløsninger med hinanden og tilsætning hertil af 0,1 ml "Tween 20".

Til sammenligningsformål fremstilledes opløsninger indeholdende 35 u-reageret ortho-tolidin eller benzidin på samme måde som ovenfor.

Dernæst fremstilledes en prøvestrimmel ved at dyppe et underlag såsom filtrerpapir i opløsningen og tørring af det imprægnerede papir ved hjælp af en luftstrøm med en temperatur på 70°C i 3 minutter Γ)Ρ cil δΑ pc frcmcf -ill δΑ δ Γ»ν/Ατ?Λ c? 4- ν» i ml Δ·ν wa v· ^1<νΛν\^Λ«

14 DK 153334 B

Prøvestrimmel A; Denne prøvestrimmel indeholder reaktionsprodukter fremstillet i referenceeksempel 1 eller en blanding af reaktionsprodukterne fremstillet i referenceeksempel 2.

Prøvestrimmel B: Denne prøvestrimmel indeholder ortho-tolidin, 5 som ikke er reageret med noget alkyleringsmiddel, og som anvendes til kontrol.

Prøvestrimmel C: Denne indeholder en blanding af methylerede benzidinderivater fremstillet i referenceeksempel 3 eller i referenceeksempel 4.

10 Prøvestrimmel D; Denne prøvestrimmel indeholder ubehandlet ben- zidin og anvendtes som kontrol.

Disse prøvestrimler undersøgtes ved dypning af hver i en opløsning, som var således indstillet, at en bestemt mængde urin fra en 15 voksen person indeholdt glucose i de i nedenstående tabel angivne mængder, hvorefter de straks fjernedes fra væskeprøven. Farvetonen af prøvestrimlerne, som skulle undersøges, sammenlignedes dernæst i 60 til 120 sekunder ved henvisning til standard farvetoneindekset og bestemtes. Resultaterne var følgende: 20

Tabel III

Glucose-koncentration, %_

Prøvestrimler 0,1_0,25 0,5_2,0 25 A gullig grøn grøn grønlig blå mørkeblå B gullig grøn grønlig grøn-blålig blålig brun brun brun C gullig grøn grøn grønlig blå blå 30 D gullig brun grønlig mørk grønlig brunlig blå brun brun

Note: Prøvestrimlerne B og D blev brune,straks efter at de blev fjernet fra prøven, som skulle undersøges.

35 Med samme prøvestrimler som ovenfor foretoges en test under an vendelse af en serumprøve indeholdende glucose i en mængde fra 0 til 120 mg pr. dl. Prøveresultaterne var næsten de samme som ovenfor.

15 DK 153334B

Eksempel 5

Forskellige imprægneringsvæsker fremstilledes indeholdende en foretrukken kombination af følgende sammensætning:

Sammensætning Mængder

Blanding af reaktionsprodukterne fra ortho-tolidin (som fremstillet i referenceeksemplerne 1 og 2 20 - 100 mg 95% ethanol 4 - 8 ml 10 0/2 M citronsyre-pufferopløsning (pH 5,5) ' 3 - 7 ml

Tartrazin 0,1 - 0,5 mg 10% "Tween 20" 0,05 - 0,5 ml 15 Til en opløsning af 60 mg af denne blanding af reaktionspro dukterne i 6 ml ethanol og 5 ml af puffer-opløsningen sattes 0,2 g tartrazin og 0,05 ml "Tween 20" i denne rækkefølge. Strimlerne fremstilledes på samme måde som i eksempel 4.

En opløsning, hvori der anvendtes ubehandlet ortho-tolidin i 20 stedet for blandingen af reaktionsprodukterne, fremstilledes på samme måde som ovenfor som en kontrolopløsning.

Dernæst justeredes prøvestrimlerne ved hjælp af samme metode som i eksempel 4. Der anvendtes prøvestrimler på 5 x 40 mm filtrerpapir og indeholdende en blanding af reaktionsprodukterne fremstillet 25 i referenceeksempel 1 (i det følgende kaldet prøvestrimmel E) og en prøvestrimmel af samme opbygning som E,men indeholdende uomsat ortho-tolidin i stedet for blandingen (nedenfor kaldet prøvestrimmel F). Hver af prøvestrimlerne dyppedes i en flydende prøve, som justeredes ved at sætte menneskeblod til urin fra en sund voksen person, såle-30 des at der opnåedes de i nedenstående tabel anførte koncentrationer. Prøvestrimlerne fjernedes fra den flydende prøve straks efter,og en dråbe af en 3% opløsning af hydrogenperoxid dryppedes på overfladen. Prøvestrimlernes farvetone bestemtes 30 sekunder efter tilsætning af hydrogenperoxid-opløsningen. Resultaterne var følgende: 35

16 DK 153334B

Tabel IV

Prøve- Koncentration of okkult blødning strimmel 1/100.000 1/20.000 1/10.000 1/2000 1/1000 E gullig lysegrøn lyseblå mørke- mørkeblå 5 grøn grøn F lys gullig gullig lyseblå blå mørkeblå grøn grøn

Note: Farvetonen for prøvestrimmel E var skarpere og 10 klarere end for prøvestrimmelen F, således at det var lettere at skelne én koncentration fra en anden, selv inden for samme farvekategori.

Eksempel 6 15 En prøvestrimmel bestående af et stykke papir og den omhandlede alkylerede ortho-tolidin fremstilledes til anvendelse ved undersøgelse af den okkulte blødning i faeces.

Der fremstilledes på konventionel måde en imprægneringsopløsning af følgende sammensætning: 20

Sammensætning Mængder

Blanding af reaktionsprodukterne fremstillet i referenceeksempel 1 240 mg

Ethylalkohol 13 ml 25

Gua j ak 40 mg

Kaliumdihydrogenphosphat 180 mg

Natriumhydrogenphosphat 340 mg

Tartrazin 2 mg

Vand 16 ml 30

Alternativt kan også anvendes en blanding af reaktionsprodukterne af alkyleret ortho-tolidin uden adskillelse fra reaktionsblandingen. Der fremstilledes en opløsning indeholdende en blanding, idet 1,0 g ortho-tolidin opløstes ved 50°C i 20 ml methyl-35 alkohol (eller ethylalkohol), 0,6 g dimethylsulfat tilsattes, og den resulterende blanding henstod i 30 til 60 minutter ved stuetemperatur og fortyndedes med ethylalkohol til et samlet volumen på 54 ml. Imprægneringsopløsningen havde følgende sammensætning:

17 DK 153334 B

Sammensætning Mængder

Opløsningen indeholdende de alkylerede ortho- tolidiner 13 ml

Gua j ak 40 ml )

Kaliumdinatriumphosphat 180 mg

Dinatriumhydrogenphosphat 340 mg

Natriumhydroxid 0 - 46 mg

Tartrazin 2 mg

Vand 16 ml

Prøvestrimlerne fremstilledes ved at imprægnere et underlag såsom papir i hver af imprægneringsopløsningerne og påfølgende tørring af det imprægnerede underlag uden udsættelse for lys.

Som kontrol fremstilledes også prøvestrimler på samme måde, 1-5 bortset fra at imprægneringsopløsningen indstilledes således,at den indeholdt ikke-alkylerede derivater i stedet for det alkylerede derivat.

De således fremstillede prøvestrimler undersøgtes for farvereaktion ved anvendelse af en vandig opløsning indeholdende 5 · 20 vægtprocent hydrogenperoxid og 35 vægtprocent alkohol. Prøveresultaterne viser, at den omhandlede prøvestrimmel var følsom over for en frisk human blodprøve, som var fortyndet med vand til en koncentration på 1/100.000, hvorimod kontrolprøvestrimmelen var følsom op til en fortynding på 1/20.000 af blodprøven med vand.

25

Eksempel 7

Dette eksempel belyser, hvorledes en prøvestrimmel ifølge opfindelsen kan anvendes til undersøgelse af galactose i urin.

En prøvestrimmel fremstilledes ved at dyppe et stykke diethyl-3 0 aminoethyl-cellulose-filtrerpapir (Whatman DE8^ i en imprægnerings-opløsning og tørring ved 40°C som første trin og ved dypning af det tørre papir i en anden imprægneringsopløsning og tørring ved samme temperatur som andet trin. Den således fremstillede prøvestrimmel opbevaredes ved lav temperatur uden direkte indfaldende lys derpå. 35 Imprægneringsopløsningen til første trin havde følgende sammen sætning :

18 DK 153334 B

Sammensætning Mængder 0,3 M citronsyre-puffer- opløsning (pH 5,0) 6 ml

Metiiylerede orthcrtolidiner 20 mg 5 Éthanol 6 ml

Tartrazin 1 mg Følgende opløsning anvendtes til andet trin: 10 Sammensætning Mængder

Galactose-oxidase 1500 enheder

Peroxidase 6 mg 0,1 M phosphat-pufferopløsning (pH 7,0) 6 ml 15

Prøvestrimmelen viste sig at være i stand til semi-kvantitativt at identificere galactose i urin i en mængde varierende fra 50 til 1000 mg pr. dl.

2o Eksempel 8

Dette eksempel belyser en prøvestrimmel indeholdende de alkyle-rede ortho-tolidiner til anvendelse ved identifikation af galactose i blod.

En prøvestrimmel fremstilledes på samme måde som i eksempel 7, 25 bortset fra at der anvendtes andre imprægneringsopløsninger.

Sammensætningen af imprægneringsopløsningen til det første trin var følgende:

Sammensætning Mængder 0,3 M phthalsyre-puffer- opløsning (pH 6,5) 2,5 ml

Polyvinylalkohol 20 mg

Galactose-oxidase 1500 enheder

Tartrazin 0,4 mg

Peroxidase 1 mg 35

Den i andet trin anvendte imprægneringsopløsning havde følgende sammensætning:

19 DK 153334 B

Sammensætning Mængder

Methylerede ortho-tolidiner 80 mg

Guajak 100 mg

Ethylalkohol 13 ml

Den således fremstillede prøvestrimmel undersøgtes på samme måde som ovenfor, hvor glucose i blod undersøgtes,og viste sig at identificere galactose semi-kvantitativt i blod i en koncentration på 40 til 500 mg pr. dl.

0 Det viste sig endvidere, at en prøvestrimmel, der var fremstil let på samme måde, men hvor ortho-tolidin var anvendt i stedet for blandingen af de alkylerede derivater,var ringere til semi-kvantita-tiv analyse af galactose i blod end den i henhold til opfindelsen fremstillede.-5

Claims (12)

1. Diagnostisk præparat til påvisning eller måling af okkult blod eller saccharid i en prøve opnået fra legemsvæsker eller ekskrenenter fra mennesker eller dyr, hvilket præparat indeholder et kromogen, der ved kontakt med prøven i nærværelse af et enzym, 5 som sammen med prøven danner aktivt oxygen, oxideres til dannelse af en farve, KENDETEGNET ved, AT kromogenet er i det mindste en af forbindelserne N-monomethyl-, N-monoethyl-, N,Ν'-dimethyl-, N,N-diethyl-, Ν,Ν,Ν'-trimethyl- og Ν,Ν,Ν'-triethyl-o-tolidin.

2. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at krorno-10 genen er det ved methylering af o-tolidin opnåede produkt.

3. Præparat ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det yderligere indeholder mindst én saccharid-oxidase, én peroxidase eller én guajak. 15

4. Præparat ifølge krav 3, kendetegnet ved, at saccharid-oxidasen er glucose-oxidase eller galactose-oxidase.

5. Præparat ifølge krav 3,kendetegnet ved, at gua- 20 jakken er α-guajakonsyre eller β-guajakonsyre.

6. Præparat ifølge krav 1-5, kendetegnet ved, at det yderligere indeholder en puffer, et overfladeaktivt middel, et baggrundsjusterende farvestof og/eller et middel til viskosi-25 tetsforøgelse.

21 DK 153334B

7. Præparat ifølge krav 6, kendetegnet ved, at pufferen er en vandig opløsning af phthaisyre, et phosphat eller citronsyre.

8. Præparat ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det baggrundsjusterende farvestof er tartrazin.

9. Præparat ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det viskositetsforøgende middel er et beskyttende kolloid. 10

10. Præparat ifølge krav 9, kendetegnet ved, at det beskyttende kolloid er polyalkylenglycol eller polyvinyl-alkohol.

11. Præparat ifølge krav 1-10, kendetegnet ved, at det er understøttet på et sugende, porøst underlag herfor.

12. Præparat ifølge krav 11, kendetegnet ved, at det sugende, porøse underlag er filtrerpapir, hærdet filtrerpapir, 20 sintret porøst glasmateriale eller sintret porøst formstof- materiale.