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Verfahren zur Herstellung oxydierter Steroide Die Erfindung bezieht
sich auf ein neuartiges Verfahren zur Einführung von Sauerstoff in das Steroidmolekül.
Sie bezieht sich insbesondere auf ein aerobes Gärungsverfahren, bei dem die Gärung
und eine Oxydierung von Steroiden mittels Pilzen der Gattung Neurospora mindestens
in fi-Stellung durchgeführt wird.
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Die Einführung von Sauerstoff in das Steroidmolekül, insbesondere
in ii-Stellung, zur Erzeugung von bei der Herstellung therapeutischer Verbindungen
nützlichen Zwischenprodukten oder zur Herstellung solcher Verbindungen selbst ist
bekannt. Bei diesen Zwischenprodukten oder Pharmazeutika, unter denen z. B. Corticosteron,
ii-Dehydrocorticosteron (Kendalls Verbindung E, Cortison) und 17-Oxycorticosteron
(Kendalls Verbindung F) zu nennen sind, handelt es sich um oxydierte, insbesondere
in ii-Stellung sauerstoffhaltige Verbindungen. Derartige Ergebnisse wurden bisher
nur durch sehr verwickelte organische Synthesen mit einer beträchtlichen Anzahl
von Verfahrensstufen erreicht.
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Es wurde nun gefunden, daß Pilze der Gattung Neurospora, z. B. Neurospora
sitophila und Neurospara crassa, bei der Oxydation von Steroiden einschließlich
ii-Desoxysteroiden nützlich sind, obwohl bei ihrer Verwendung nicht notwendigerweise
die gleichen Ergebnisse erzielt werden wie bei Verwendung der Ordnung Mucorales.
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Es wurde gefunden, daß ii-Desöxysteroide leicht in hohen Ausbeuten
in die entsprechenden oxydierten Steroide umgewandelt werden können, wenn man die
Steroidverbindungen der. Einwirkung einer Fungusart
der Gattung
Neurospora unterwirft. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt ein wirksames, wirtschaftliches
und kommerziell zufriedenstellendes Verfahren zur Einführung von Sauerstoff in die
ii-Stellung eines ii-Desoxysteroids dar.
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Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können auch in anderen Stellungen
als in der ii-Stellung des Steroidmoleküls durch die Wirkung des Fungus Umbildungen
auftreten; diese Umbildungen sind jedoch nicht als unerwünscht zu betrachten, da
die Einführung von Sauerstoff in andere Teile des Steroidmoleküls wertvolle therapeutische
Produkte oder Zwischenprodukte, z. B. in i7-Stellung eine Hydroxylgruppe enthaltende
Produkte, ergeben kann. Falls diese weiteren Gruppen nicht erwünscht sind, stehen
Verfahren zur leichten Entfernung dieser Gruppen zur Verfügung: Falls in dem Molekül
eines zu oxydierenden Steroids zu Ketogruppen oxydierbare Hydroxylgruppen anwesend
sind, so können diese nötigenfalls, so z. B. wenn die Gewinnung außerordentlich
hoher Ausbeuten an ii-Oxysteroid angestrebt wird, vor verschiedenartigstem Angriff
einschließlich Angriff durch die oxydierend wirkenden Pilze durch Umwandlung, z.
B. durch Veresterung, Verätherung, Halogenierung u. dgl., in eine Gruppe, die sich
in eine Hydroxylgruppe zurückverwandeln läßt, geschützt werden. Ein derartiges Verfahren
ist jedoch keine Voraussetzung für die Einführung von Sauerstoff, insbesondere von
Sauerstoff in ii-Stellung in ein Oxysteroid nach dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung.
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Erfindungsgemäß wird eine Art des Gattung Neurospora auf einem vorzugsweise
flüssigen Nährboden gezüchtet, der Kohlehydrate, Proteine, mineralische Bestandteile
und, falls erwünscht, Vitamine und Auxine sowie Suspensions- oder Mycelträger enthält.
Einer solchen Pilzkultur oder daraus erhältlichen, oxydierend wirkenden Enzymen
wird das Desoxysteroid zugesetzt, dann wird es unter Belüftung bei den üblichen
Temperaturen des Pilzwachstums i bis 72 Stunden bebrütet. Anschließend wird das
oxydierte Steroid durch txtraktion aus dem Gärungsgemisch gewonnen.
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Im einzelnen kann bei dem erfindungsgemäßen V erfahren nach den im
Patent 936 2o7 angegebenen Verfahrensbedingungen -gearbeitet werden.
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Das folgende Beispiel erläutert das Verfahren der vorliegenden Erfindung.
Beispiel Eine aus 30 g Dextrose, 2o g Getreideweichflüssigkeit, 12 g Natriumnitrat,
12 g Natüumacetat und i g K H2 P 04 bestehende Kulturflüssigkeit, die mit Leitungswasser
auf 11 verdünnt worden war, wurde auf einen pH-Wert von 7 gestellt. Nach der Sterilisation
betrug der p,1-Wert 6,7. 121 dieser Kulturflüssigkeit wurden auf einer Temperatur
von 25° gehalten und mit Neur-)spora* sitophila (ATCC 9278) geimpft. Die Belüftung
wurde auf 11 pro Minute und das Rühren auf Zoo Umdrehungen pro Minute eingestellt.
Nach 24stündigem Wachstum wurden 3 g in 150 ccm Aceton gelösten Progesterons (Verbindung
I) zugesetzt und die Gärung 48 Stunden durchgeführt. Das Mycel wurde aus der Brühe
mittels Abpressen durch Gaze vollständig entfernt. Das abgetrennte Mycel wurde zweimal
mit je einem dem Volumen des Mycels annähernd gleichen Volumen Aceton extrahiert
und abermals zweimal mit je einem dem Volumen des Mycels annähernd gleichen Volumen
Methylenchlorid extrahiert. Die Aceton- und Methylenchloridextrakte einschließlich
Lösungsmittel wurden dem Brühenfiltrat zugesetzt. Das Gemisch aus Extrakten und
Brühenfiltrat wurde dann viermal mit je 31 Methylenchlorid extrahiert. Der vereinigte
Methylenchloridextrakt wurde zweimal mit je einem zehntel Volumen einer 2°[oigen
wäßrigen Lösung von Natriumbicarbonat und danach zweimal mit je einem ze'?ntel Volumen
Wasser gewaschen. Der Methylencbloridextrakt wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet und dann auf einem Dampfbad auf ein kleines Volumen konzentriert.
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Der lösungsmittelfreie, konzentrierte Extrakt wog 4,796 g. Dieser
Rückstand wurde in
300 ccm Benzol gelöst und unter Verwendung von Mengen
von je
300 ccm der in Tafel I aufgeführten entwickelnden Lösungsmittel über
150 g Tonerde (mit Salzsäure sowie mit Wasser gewaschen und 4 Stunden bei
12o° getrocknet) chromatographisch getrennt. Unter Verwendung eines Toluol-Propylenglykol-Systems
und eines Methylcyclohexancarbitolsystems wurde durch papierchromatographische Analyse
die Anwesenheit neuer Steroide nachgewiesen. Fraktion 12 wurde in 3 ccm Methylenchlorid
gelöst, filtriert und auf einem Dampfbad auf
0,5 ccm konzentriert.
| Tabelle I |
| Chromatographische Analyse |
| Fraktion Lösungsmittel Feststoff- |
| eluate in mg |
| 1 Benzol 105 |
| 2 desgl. 64 |
| 3 Benzol-Äther 2o: 1 56 . |
| 4 desgl. 159 |
| 5 Benzol-Äther io : x 83 |
| 6 desgl. 26 |
| 7 . Benzol-Äther i : 1 33 |
| 8 desgl. 129 |
| 9 Äther 381 |
| io desgl. 193 |
| 11 Äther-Chloroform 2o : 1 398 |
| 12 desgl. 517 |
| 13 Äther-Chloroform io : 1 791 |
| 14 desgl. 444 |
| 15 Äther-Chloroform i : 1 169 |
| 16 desgl. 28 |
| 17 desgl. 22 |
| 18 desgl. i9 |
| i9 Chloroform 10 |
| 20 desgl. 48 |
| 21 desgl. 48 |
| 22 -desgl. 32 |
| 23 Chloroform-Aceton 2o: r 50 |
| 24 Aceton 257 |
| 25 Methanol 254 |
| 26 desgl. 14 |
Nach Zusatz von 5 ccm Äther zum Konzentrat wurden Kristalle ausgefällt,
die filtriert und dreimal mit je 2 ccm Äther unter Zurücklassung von
203
mg Kristallen mit einem Schmelzpunkt von 155 bis i73° gewaschen wurden. Durch Umkristallisation
aus Methylenchlorid mit Äther wurde eine Ausbeute an i2o mg Kristallen der Verbindung
II, einem Oxyprogesteron, erzielt, das einen Schmelzpunkt von 165 bis i72° hatte.
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Die Verbindung II läßt sich mit Cr 03 in Eisessig zu einer Verbindung
III oxydieren, aus der durch umkristallisieren aus Äthylacetat-Petroläther eine
kristalline Verbindung IV vom Schmelzpunkt von i68 bis i76° erhalten wurde. Wie
durch Infrarotspektren nachgewiesen wurde, hat diese Verbindung, im Vergleich zu
Progesteron, eine Hydroxylgruppe sowie eine zusätzliche nicht konjugierte Ketogruppe
behalten.
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Durch Acetyherung der Verbindung II erhält man nach dem Umkristallisieren
aus Aceton-Äther eine Verbindung VI vom Schmelzpunkt 188 bis 2o5°. Durch Infrarotspektren
wurde die Veresterung bestätigt.
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Die Verbindungen II, IV und VI wiesen Progesteron-Wirksamkeit auf.
Nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren können z. B. auch 17a, 2i-Dioxyprogesteron,
Pregnan-3, 2o-dion, 4-Pregnen-2i-o1-3, 2o-dion, i6-Dehydroprogesteron und 17a-Oxyprogesteron,
in die entsprechenden oxydierten Steroide übergeführt werden.