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Verfahren zur Herstellung eines Cewebeextraktes und eines durch diesen
Extrakt stimulierten Serums Zusatz zum Patent 862942
Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zur Herstellung eines Gewebeextraktes und eines durch diesen Gewebeextrakt stimulierten
Serums.
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Nach dem Verfahren des Patentes 862 942 werden Extrakte, speziell
Wundextrakte, aus Geweben in der Weise hergestellt, daß vorzugsweise noch nicht
geschlechtsreifen Tieren Wunddef ekte zugefügt werden und nach vorzugsweise 7 bis
15 Tagen das in der Wunde gebildete Granulationsgewebe ausgeschnitten und in bekannter
Weise extrahiert wird, wobei ein durch diesen Wundextrakt stimuliertes Serum dargestellt
werden kann.
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In weiterer Ausbildung dieses Verfahrens wurde nun gefunden, daß
derartige Extrakte auch aus Geweben, die in Gewebekulturen in vitro gezüchtet werden,
hergestellt werden können.
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Es ist bekannt, nach der Methode von Alexis Carrell in sogenannten
Carrell-Flaschen oder Rolltuben Gewebe zu züchten. Umfangreiche Versuche haben jedoch
gezeigt, daß eine Gewebezüchtung zum Zwecke der erfindungsgemäßen Herstellung von
Gewebeextrakten nach den bekannten Methoden absolut unbefriedigende Resultate zeitigte
und damit für das vorliegende Verfahren ungeeignet war. Erfindungsgemäß werden die
noch bestehenden Mängel beseitigt, so daß es nunmehr möglich geworden ist, sämtliche
in vivo entnommenen Gewebekulturen in vitro weiterzuzüchten, daraus die Extrakte
und mit diesen das Serum zu gewinnen.
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Aufgabe der Erfindung ist es, aus möglichst stark sich vermehrenden
vitro-Kulturgeweben verschiedenster Gewebespezifität Extrakte zu gewinnen, die dann
bei
Degenerationen bzw. schlechter Regeneration, z. B. maligne Tumoren, schlechtheilende
Wunden, Leberzirrhose, Schrumpfniere usw., des vorzugsweise gleichartigen Gewebes
von möglichst derselben Spezies direkt therapeutische Verwendung finden, und/oder
durch Injektion hoher Dosen dieser Extrakte bei Spendertieren in der im Patent 862
942 geschilderten Weise stimuliertes Blutserum zu gewinnen.
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Zu diesem Zwecke werden erfindungsgemäß in vivo entnommene Gewebe
in vitro weitergezüchtet und zu größtmöglicher Mitosetätigkeit angeregt. Dies geschieht
derart, daß in einem in bekannter Weise beheizten und temperaturregulierten Brutraum
durch Schleusen und Einblasen von keimfreier Luft im Überdruck in bekannter Weise
völlige Innenraumsterilität gewährleistet wird. In diesem Brutraum sind geeignete
Trägerplatten aufgestellt, die der Aufnahme des Nährplasmas dienen. Über jeder Platte
befindet sich eine Feinstsprayanlage, aus der unter Druck in bestimmten Zeitintervallen
eine Benetzung der implantierten Kulturen mit Nährflüssigkeit erfolgt.
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Das Nährplasma wird aus steril entnommenem Blut, vorzugsweise von
Säugetieren oder Geflügel, gegebenenfalls auch von Menschen, gewonnen indem gerinnungshemmende
Mittel, z. B. Heparin, acidum citricum usw., zugesetzt werden und durch Zentrifugieren
das Plasma vom Serum getrennt wird.
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Dieses Plasma wird auf die zuvor paraffinierten Trägerplatten des
Brutraumes in entsprechender Schichtdicke aufgetragen. Auf diese Plasmanährböden
werden nun in vivo unter sterilen Kautelen gewonnene Gewebe implantiert und anschließend
bei einer Temperatur von vorzugsweise 34 bis 370 bebrütet. Dabei wird die wachsende
Kultur in einem Turnus von etwa 3 Stunden mit Nährflüssigkeit besprayt, die aus
einer durch Traubenzuckerzusatz modifizierten Tyrodelösung unter Zusatz von Embryonalpreßsaft,
Milz- oder Leberpreßsaft und dem bei der Plasmagewinnung zurückbleibenden Serum
besteht. Dabei wird durch Regulierung des Embryonal- bzw. Milz-Leber-Preßsaftzusatzes
im Verhältnis zum Serumzusatz sowie durch Zugabe mitoseanregender Stoffe, vorzugsweise
des nach dem im Hauptpatent angegebenen Verfahrens gewonnenen Wundgranulationsextraktes,
die Nährflüssigkeit so eingestellt, daß optimale Mitosebedingungen für die Gewebekulturen
geschaffen werden.
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Das zur Kulturzüchtung verwendete Gewebe ist spezifisches Gewebe,
z. B. Muskel, Schleimhaut, Leber, Epithel, Bindegewebe usw., das entweder direkt
in Reinkultur und/oder als in vivo gewonnenes spezifisches Wundgranulationsgewebe
weitergezüchtet wird.
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Dabei ist dieses Gewebe weitmöglichst von der Spezies zu gewinnen,
für die dann der Extrakt zur therapeutischen Anwendung kommen soll.
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Nachdem etwa am zweiten bis fünften Tage die Kultur sichtbar angegangen
ist, wird diese an einigen Stellen vorsichtig verletzt.
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Nach einer bestimmten optimalen Wachstumszeit, vorzugsweise von etwa
5 bis 15 Tagen, wird die Kultur abgesetzt und vom Plasmanährboden gereinigt. Aus
dieser Kultur wird dann ein Gewebeextrakt gewonnen, mit dem nunmehr nach den allgemein
bekannten und im Hauptpatent dargestellten Methoden verfahren wird.
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Es wird also zunächst ein wäßriger Gesamtextrakt oder ein getrennter
Aceton-Äther- und wäßriger Extrakt hergestellt.
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Die so gewonnenen Extrakte können unmittelbar therapeutische Verwendung
finden; sie können aber auch zur Herstellung eines stimulierten Serums verwendet
werden, indem sie unbehandelten Tieren in hoher Dosis eingespritzt werden und diesen
Tieren nach einer gewissen Zeit, vorzugsweise nach etwa 6 bis 7 Tagen, Blut entnommen
und in bekannter Weise durch Zentrifugieren das stimulierte Serum gewonnen wird,
das man dann noch zur Keimfreimachung durch Bakterienfilter schickt.
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Im folgenden soll die vorliegende Erfindung an Hand von einigen Beispielen
erläutert werden, ohne daß damit eine Beschränkung auf die in den Beispielen enthaltenen
Mengen-, Zeit-, Temperaturangaben u. dgl. beabsichtigt ist, vielmehr können Abänderungen,
wie sie jedem Fachmann geläufig sind, getroffen werden.
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Beispiel I Bei einem jungen, kräftigen, gesunden Tier wird unter
aseptischen Kautelen eine scharfrandige Wunde ausgestanzt, wobei sich der Defekt
auf die Haut, das Unterhautbindegewebe sowie eine Schicht der darunterliegenden
Muskulatur zu erstrecken hat.
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Nach Anlegung eines aseptischen Verbandes wird die Regeneration des
Gewebedefektes durch die Wundgranulation und Epithelisation abgewartet und dann
das Granulationsgewebe getrennt von Muskulatur, Bindegewebe und Epithel unter Wahrung
der Asepsis entnommen.
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Dieses Gewebe wird in möglichst dünnpräparierten Schichten auf das
bereits beschriebene Nährplasma im Brutraum implantiert. Die periodische Besprayung
erfolgt mit einer Nährlösung, der auf I000 ccm Tyrodelösung 12 g Traubenzucker,
5 ccm Embryonalpreßsaft, 20 ccm Wündgranulailönsextrakt und 1 ccm des bei der Plasmagewinnung
zurückgebliebenen Serums zugesetzt sind. Die Besprayung erfolgt in einem bestimmten
Intervall, vorzugsweise von etwa 3 Stunden. Nachdem etwa am zweiten bis dritten
Tage die Kultur sichtbar angegangen ist, wird sie an einigen Stellen vorsichtig
verletzt.
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Nach einer Wachstumszeit, vorzugsweise von etwa 6 bis I8 Tagen (je
nach der Art des Gewebes, z. B, Epithel- länger als Bindegewebe oder Mesenchym),
wird die Gewebekultur weitmöglichst vom Plasma mechanisch und durch Abspülen mit
Ringerlösung gereinigt.
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Das so gewonnene Gewebe wird unter strenger Sterilität mechanisch
homogenisiert und mit der vierfachen Gewichtsmenge Aceton 30 Minuten lang extrahiert.
Das Aceton wird abgenutscht, der Rückstand mit derselben Menge Aceton-Äther I:I
versetzt, nach 10 Minuten erneut abgenutscht und dann weitere 10 Minuten lang mit
reinem Äther extrahiert. Das Extrahieren erfolgt jeweils unter Zuhilfenahme eines
Rührwerks. Das durch Abnutschen im Vakuum
gewonnene Aceton-Äther-Trockenpulver
wird mit der Ioofachen Menge destillierten Wassers, dem die Il/2fache Menge des
Trockenpulvergewichtes Ringerlösung zugesetzt ist, steril unter Toluol im Kühlraum
24 Stunden lang bei einer Temperatur von etwa +2° unter Zuhilfenahme eines Rührwerks
extrahiert. Der so gewonnene wäßrige Extrakt wird nun im Vakuum auf die 11/2fach
Gewichtsmenge des ausgangs verwendeten Trockenpulvergewichtes eingeengt. Dieser
Extrakt wird dann unter sterilen Kautelen in Ampullen zu je 10 ccm abgefüllt oder
im Tiefgefriervakuum bis zur Trockensubstanz entwässert, oder aber direkt verwendet.
Der Aceton-Äther-Extrakt wird im Vakuum weitmöglichst eingeengt und der Lipoidrückstand
mit wenig absolutem Alkohol aufgenommen, um dann gegebenenfalls direkt zur Verwendung
zu kommen.
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Beispiel 2 Bei einem' jungen, gesunden, kräftigen Schwein wird operativ
am vorderen Leberrand eine kleine Keilwunde gesetzt, welche durch Catgutnähte versorgt
wird. Nach einer Zeit von vorzugsweise etwa 6 Tagen wird das Wundgranulationsgebiet
operativ entfernt, wie in Beispiel I beschrieben, in vitro weitergezüchtet und in
der geschilderten Weise aus den so gewonnenen Gewebekulturen die entsprechenden
Extrakte hergestellt.
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Analog wird mit anderen Organen bzw. Knochenbruchkallus verfahren.
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Beispiel 3 Die nach Beispiel 1 und 2 hergestellten Extrakte werden
in einer Menge von etwa I50 ccm und mehr, und zwar entweder der wäßrige Extrakt
oder der Lipoidextrakt, jeweils gesondert oder beide zusammen einem jungen, kräftigen
Rind oder Pferd intramuskulär eingespritzt. Nach einer gewissen Zeit, vorzugsweise
von etwa 6 bis 8 Tagen, wird dem so behandelten Tier Blut entnommen und daraus in
bekannter Weise durch Zentrifugieren das stimulierte Serum gewonnen, das zwecks
Keimfreimachung durch Bakterienfilter geschickt wird.
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Erfindungsgemäß wird es möglich, unter Ausschaltung der kostspieligen
Gewebegewinnung in vivo therapeutisch hochwirksame Gewebeextrakte unter Vermeidung
der Verluste durch infizierteWunden der umfangreichen und kostspieligen Tierhaltung
aus möglichst stark sich vermehrenden vitro-Kulturgeweben verschiedenster Gewebespezifität
zu erhalten, die dann bei Degenerationen bzw. schlechter Regeneration, z. B. maligne
Tumoren, Leberzirrhose, Schrumpfniere, schlechtheilende Wunden usw., entweder direkt
therapeutische Verwendung finden oder zur Gewinnung stimulierten Blutserums benutzt
werden.
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PATEXTAXSPnÜCHE I. Verfahren zur Herstellung eines Gewebeextraktes,
dadurch gekennzeichnet, daß in weiterer Ausbildung des Verfahrens gemäß Patent 862
942 in einem Brutraum auf paraffinierte, mit Nährplasma beschickte Trägerplatten
in vivo entnommene Gewebearten implantiert werden, die periodisch durch über den
Kulturen angeordnete Feinstspraysysteme mit Nährflüssigkeit benetzt, nach Angehen
verletzt und nach einer günstigsten Wachstumszeit, vorzugsweise von 6 bis I8 Tagen,
in bekannter Weise extrahiert werden.