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Verfahren zur Trennung von Penicillinsalzen 1)ie Erfindung bezieht
sich auf die Trennung von Penicillinsalzen und hat ein neues und verbessertes Verfahren
für diesen Zweck zum Gegenstand. Es ist ferner Gegenstand der Erfindung, hochaktive
Penicillinzubereitungen zu erzeugen, die reich an Penicillin G sind. Weiterhin ist
es Gegenstand der Erfindung, das Penicillin G vom Penicillin F und K zu trennen.
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Der weitere Inhalt der Erfindung und deren Vorteile gehen aus der
folgenden Beschreibung hervor, in welcher im einzelnen erklärt ist, worin die neuen
und erfinderischen Merkmale des Verfahrens bestehen und wie dieses Verfahren in
die Praxis umgesetzt werden kann.
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Es ist bekannt, -daß Kulturen gewisser Schimmelpilze von der Art des
Penicillium notattim und Penicillium chrysogenum einen Wirkstoff enthalten, der
das Wachstum pathogener Organismen unterdrückt. Dieser Wirkstoff ist im allgemeinen
als Penicillin bekannt, und seine Abtrennung aus dem Kulturmittel mit der nachfolgenden
Reinigung sowie chemische Untersuchungen haben ergeben, daß das Penicillin kein
einheitlicher chemischer Stoff ist. Zur Zeit sind vier verschiedene chemische Substanzen
festgestellt worden, nämlich Penicillin F, G, R und K.
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Bei der Gewinnung dieser Penicilline aus dem Kulturmittel, in dem
sie gebildet werden, und bei der Reinigung der so gewonnenen rohen Penicilline wird
von ihren gewöhnlichen chemischen und physikalischen Eigenschaften Gebrauch gemacht.
Die freien Penicilline sind organische Säuren, die in Wasser unlöslich, jedoch in
einer Anzahl von organischen Lösungsmitteln löslich sind. Sie haben
die
Fähigkeit, Salze zu bilden, die wasserlöslich, aber unlöslich in organischen Lösungsmitteln
sind. Dementsprechend können die Penicilline, die als Salze in den Kulturmitteln
enthalten sind, durch Ansäuern und Extraktion mit organischen Lösungsmitteln und
nachfolgender Neutralisation -gewonnen werden. Dieses Verfahren kann wiederholt
werden, um die Reinheit der Penicillinzubereitungen zu verbessern. In einigen Fällen
wird die Reinigung auch durch ein Behandeln der wässerigen Penicillinsalzlösungen
oder organischen Lösungen der freien Säuren mit Holzkohle o. dgl. unterstützt. Die
erhaltene wässerige Lösung der Penicillinsalze, im allgemeinen der Natriumsalze,
wird dann einer Gefriertrocknung unterworfen. Derartige Produkte weisen im allgemeinen
eine Stärke von 5oo bis iooo Einheiten pro Milligramm auf, aber sie enthalten noch
eine Anzahl von Verunreinigungen, die ;ich beim therapeutischen Gebrauch der Produkte
störend bemerkbar machen.
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Diese Verunreinigungen können teilweise dadurch beseitigt werden,
(laß man die Penicillinsalze in Form von kristallinen Ammoniumsalzen niederschlägt.
Die Ammoniumsalze können dadurch gebildet werden, daß ein Strom von trockenem Amnioniakgas
durch eine Lösung der freien Penicilliiisäui-eti'in einer Mischung von Chloroform
und Benzol hindurchgeleitet wird.
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Das Ergebnis der obenerwähnten Reinigungsprozesse ist ein Gemisch
der Salze der verschiedenen Penicilline. Werden organische Lösungsmittel, wie z.
B. Chloroform, für die Extraktion der freien Penicilline verwendet, so enthält das
Gemisch der kristallisierten Salze nicht das Salz des Penicillin \, weil das letztere
nicht in Lösungsinitteln, wieChloroforin, löslich ist. Deshalb besteht (las Gemisch
gewöhnlich aus den Salzen des Penicillin F. G und K.
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In letzter Zeit haben alle Untersucher danach getrachtet, eine Penicillinzubereitung
zu gewinnen, @lie reich an Penicillin G ist, weil dieses spezifische Penicillin
eines der wirksamsten für viele Zwecke ist. Obgleich der Gehalt an Penicillin G
(fier Salzmischung durch gewisse Kulturmittel, durch spezifische Schimmelpilzrassen
und durch günstige Wachstumsbedingungen angereichert werden kann, enthält die kristallische
Salzmischung immer beinerkenswerte Anteile von Penicillin F und K, die für viele
Zwecke unerwünscht sind.
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Die vorliegende Erfindung beruht auf der Beobachtung, daß die Löslichkeit
der Alkalimetallsalze der Penicilline, insbesondere der Natriumsalze, wesentlich
in organischen Lösungsmitteln differiert, die finit Wasser mischbar sind. Während
die Natrium- und Kaliumsalze der Penicilline alle löslich in den genannten Lösungsmitteln
in Gegenwart einer gewissen Menge Wasser sind, nimmt die Löslichkeit der genannten
Salze des Penicillin G stark ab, wenn der Wassergehalt unter einen bestimmten Wert
sinkt.
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Das Verfahren entsprechend der Erfindung besteht in der Zufügung eines
mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels zu einer Lösung der Gemische der
Alkalisalze der Penicillinsäuren. Dieser Zusatz erfolgt in einem Betrag, der genügt,
um einen Niederschlag von Kristallen zu bewirken, die vorzugsweise aus den Alkalimetallsalzen
des Penicillin G bestehen, während der Hauptanteil der _1lkalimetallsalze der anderen
1'enicillinsäuren dabei in Lösung bleibt.
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Das Verfahren sei im Hinblick auf die Verwendung von Aceton als eines
mit Wasser mischbaren Lösungsmittels beschrieben. Die \N atriumsalze von Penicillin
F, G und K sind alle in Aceton löslich, das über io°/o Wasser enthält. Wenn das
Aceton 9% Wasser enthält, werden wenig Kristalle nach 24 Stunden gebildet und mit
dem Abnehmen des Gehalts an Wasser wächst der Betrag des kristallischen \ iederschlages.
Unter .31/o Wasser ergibt sich eine sehr gute Ausbeute an Kristallen, und es wurde
gefunden, daß die niedergeschlagenen Kristalle vorzugsweise aus den \ atriunisalzen
von Penicillin G bestehen. Ähnliche, jedoch nicht ganz. so günstige Resultate werden
mit den Kalitinisalzen der Penicilline erzielt.
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Naturgemäß hängt die Löslichkeit von der Reinheit der Alkalimetallsalze
a1), und die besten Ergebnisse werden mit den reinsten Salzen erhalten. Wird die
Wirksamkeit der Alkalisalzpräparate als 'Maß für die Reinheit genommen, so ergeben
Präparate, die eine Aktivität unter ungefähr 5oo Einheiten pro Milligrainin aufweisen,
normalerweise keine Resultate, die für praktische Zwecke geeignet sind. In der Weise
jedoch, in der die Resultate mit einem Anwachsen der Reinheit der Salzmischung verbessert
werden, wie es vorzugsweise durch eine intensivere Reinigung der Salzmischung erzielt
wird, werden Aktivitäten weit über 5oo Einheiten pro Milligramm erzielt, wenn (las
Gemisch einer fraktionierten Kristallisation gemäß der Erfindung unterworfen wird.
In der vorzugsweisen Anwendung der Erfindung bei Verwendung einer Mischung von .\Ikalimetallsalzen
der Penicilline ergibt sich eine. Aktivität über iooo Einheiten pro Milligramm,
vorzugsweise über i6oo bis 1700 Einheiten pro 'Milligramm.
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Bei Verwendung einer einzigen fraktionierten Kristallisation in organischen
Lösungsmitteln, die mit Wasser mischbar sind, ergibt sich gewöhnlich, daß in den
Kristalleu der Alkalisalze des Penicillin G eine bestimmte Menge von Alkalisalzen
der anderen Penicilline enthalten ist, die während der Kristallisation eingeschlossen
wurden. Diese letzteren Salze können jedoch durch wiederholte Fraktionierung entfernt
werden. Werden die Natriumsalze verwendet, so, genügt häufig für praktische Zwecke
eine einzige Fraktionierung, wenn eine Salzmischung verwendet wird, die eine Aktivität
von ungefähr i joo Einheiten pro Milligramm, auf die Trockensubstanz berechnet,
verwendet wird, und wenn Aceton als Fraktionierungsmittel Anwendung findet. Werden
Kaliumsalze verwendet, so sind normalerweise zwei oller mehrere Fraktionierungen
erforderlich und selbst dann sind die Ergebnisse nicht so erfolgversprechend.
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11s ein geeignetes organisches Lösungsmittel,
das
mit Wasser mischbar ist, sei für den Zweck der Fraktioilierung gemäß der Erfindung
Aceton erwähnt, aber Versuche haben ergeben, dal auch andere aliphatische Ketone,
wie z. B. Butanon, ge-Ilraticht werden können. Obgleich aliphatische Ketone und
vorzugsweise Aceton gemäß der Erfindung verwendet werden, so ist diese jedoch nicht
auf den Gebrauch dieser Ketone beschränkt. Alle Ketone, die mit Wasser mischbar
sind, die als Lösungsmittel für die Alkalisalze der Penicilline in Gegenwart des
bestimmten Betrages von Wasser wirken, fällen das :\lkalisalz des Penicillin G bei
einer entsprechenden Verminderung des Wassergehaltes aus und bewirken so die Fraktionierung.
:\ndere Ketone, wie sie dem Fachmann bekannt sind, können gemäß der Erfindung ebenfalls
Verwendung finden, wenn das verwendete Keton die erforderlichen Eigenschaften besitzt.
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I?s sei erwähnt, daß sich für den Zweck der Ertindung andere organische
Lösungsmittel, die mit Wasser misclil>ar sind, verwenden lassen. Von diesen sei
beispielsweise auf die aliphatischen :1lkoluile verwiesen. Propatiol und Butanol
sind l@eispic-le für geeignete aliphatische Alkohole, welche dieselbe fraktionierende
Wirkung wie die Ketone zeigen.
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.\tidererseits ist gefunden worden, das Äthylalkohol unter normalen
Verhältnissen keine zufriedenstellen(leit Resultate ergibt.
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Die genaue Konzentration des mit Wasser mischl)aren organischen Lösungsmittels,
welche die Fraktionierung bewirkt, hängt von der Natur des gew@ililten L<isungsmittels
ab und kann durch I?xileritilettte bestimmt werden. In der vorausgehenden Beschreibung
sind die Verhältnisse in bezug auf Aceton angegeben. Wenn Aceton zu einer \@-ässerigen
Lösung der Natriumsalze der Penicilline zugegeben wird, um eine Konzentration derselben
voll ungefähr 97% zu erzielen, so enthalten die niedergeschlagenen Kristalle 98%
Penicillili (3, was eine genügende Fraktionierung für die Praxis darstellt. Durch
wiederholte Fraktionierungen können jedoch Kristalle erzielt werden, die annähernd
ioo% Penicillin G enthalten.
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Gemäß der Erfindung wird vorzugsweise eine gesättigte Lösung der _\lkalimetallsalze
für die Fraktionierung verwendet. Es werden auch dann gute Resultate erzielt, wenn
in einer solchen gesättigten Lösung Salze verschiedener Herkunft verwendet werden,
wenn die Lösung aus den entsprechenden :\mmoniumsalzen hergestellt ist.
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Die folgenden Beispiele zeigen die Gewinnung von gesättigten l.ösiiiigen
Gier Natrium:alze der 1'eilicillinsätlren au: den entsprechenden .\mmonittnisalzeii.
lieisi) iel t j4.fi g kristallisierte .\innloniumllenicillinsalze, die eine Aktivität
von 1700 internationalen Einheiten pro llilligramin zeigen. werden in iio
ml Wasser gelöst und auf .3'C gekühlt. Die resultierende Lösung wird mit i to ml
i>eroxydfreiem .'Wier unter Zufiigull<- voll 90 ml 2n-Schwefelsäure geschüttelt.
Die Ätherfraktion wird abgetrennt und das emulgierte Wasser mit 25 g wasserfreiem
Natriumsulfat entfernt. Nach dem Filtrieren wird die klare Lösung mit einer Lösung
von 13,6 g Natriumbikarbonat in 1614 ml Wasser gemischt. Der Äther wird durch leichtes
Erwärmen und Schütteln verdampft. Während des Erwärmens entweicht auch der Hauptanteil
des frei werdenden Kohlendioxyds. Der Rest des Kohlendioxyds wird im Vakuum entfernt.
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Auf diese Weise wird eine gesättigte Lösung der Natriumsalze der Penicilline
erhalten. In dieser Lösung beträgt der Gehalt an Penicillin G ungefähr 840/0 'der
aktiven Wirkstoffe, während die verbleibenden 16% durch die Penicilline F und K
gebildet werden. Beispiel e io g kristallisierte Ammoniumpenicillinsalze, die eine
Aktivität von 1700 internationalen Einheiten pro Milligramm haben, werden
in 20 ml Wasser gelöst. Nach dem Zufügen von 20 m1 peroxydfreietn Äther wird die
Lösung auf 5° abgekühlt und unter Schütteln ;7 ml 2 n-Schwefelsäure zugefügt. Die
Ätherfraktion wird abgetrennt und das emulgierte Wasser durch wasserfreies Natriumsulfat
entzogen. Nach dem Filtrieren und Waschen mit io ml Äther wird die klare Lösung
mit einer Lösung von 2,52 g Natriumbicarbonat in 3 ml Wasser gemischt. Der Äther
wird durch leichtes Erhitzen und Schütteln verdampft. Das verbleibende Kohlendioxyd
wird im Vakuum entfernt.
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In der sich ergebenden gesättigten wässerigen Lösung der Natriumsalze
der Penicilline beträgt der _ltiteil an Penicillin G ungefähr 72% der wirksamen
Bestandteile, während die verbleihenden 28% durch die Penicilline I# und K gebildet
werden.
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Die folgenden Beispiele zeigen die Fraktionierung gemäß der Erfindung,
wenn gesättigte Lösungen von Natriumpenicillinsalzen verwendet werden. die entsprechend
den Beispielen i und 2 dargestellt sind. Beispiel 3 Zu der gesättigten Lösung der
Natriumsalze der Penicilline, die nach dem Beispiel i dargestellt sind, werden ioo
ml wasserfreien Acetons zugefügt, und die Lösung wird durch Filtrieren in einem
Seitz-Filter sterilisiert. Unter fortlaufenden aseptischen Bedienungen werden 2170
ml vom wasserfreien Aceton zugegeben, und die Mischung wird 24 Stunden stehengelassen.
Die ausgefallenen Kristalle werden auf einem Saugfilter abgeschieden, mit wasserfreiem
Aceton gewaschen und getrocknet. Die Ausbeute beläuft sich auf 449, elltsprechend
1;0.50/0, und die Kristalle zeigen eine Wirksamkeit von ungefähr 165o Einheiten
pro Milligramm und enthalten ungefähr 98% Penicillin G. , Die Mutterlauge wird in
eine gesättigte wässerige 1'enicillinlösung verwandelt und 300 ml Aceton
und
1200 1111 Amylacetat werden zugefügt, wodurch
Kristallisation erfolgt. Die Kristalle werden durch Filtration abgetrennt und zunächst
mit einer Mischung von Aceton und Amclacetat und dann mit Äther gewaschen und schließlich
getrocknet. 1)1e Ausbeute beträgt 8,3 g mit einem Gehalt von ungefähr 85% der Penicilline
F und K, w;iltren(l die restlichen t 5 % Penicillin G sind.
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t)tirch Wiederholung der Fraktionierung können liristalle erhalten
werden. welche die Penicilline F und K und keinen bemerkenswerten :\ttteil ain Penicillin
G mehr enthalten. Beispiel Zur gesättigten Lösung der Natriumsalze der Penicilline,
die entsprechend dem Beispiel 2 hergestellt sind, «-erden 25 ml Butanon unter Schütteln
zugefügt. Nach der Filtration werden weitere 275 ml Butanon zugesetzt und die Mischung
24 Stunden stehengelassen, die abgeschiedenen Kristalle durch Saugfiltration abgetrennt
und mit ßutanon gewaschen und getrocknet.
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Die Ausbeute beläuft sich auf 4,o g. Die Kristalle zeigen eine Wirksamkeit
von ungefähr 165o Einheiten pro Milligramm und enthalten 93% Penicillin G.
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Die N atriumsalze der Penicilline F und K können aus der Z-lutterlauge
in der gleichen Weise gewonnen werden, wie es im Beispiel 3 beschrieben ist. Bei
spiel5 Zur gesättigten Lösung der Natriumsalze der Penicilline, die entsprechend
dem Beispiel e hergestellt ist, werden 25 tnl von n-Butanol unter Schütteln zugesetzt.
Naclh dem Filtrieren werden weitere 275 ml von n-Butanol zugefügt und die Mischung
24 Stunden stehengelassen. Die gebildeten Kristalle werden auf einem Saugfilter
abgetrennt und mit n-Butanol gewaschen und getrocknet.
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Die Ausbeute beläuft sich auf 4,4 g. Die Kristalle zeigen eine Aktivität
von ungefähr 165o Einheiten pro Milligramm und enthalten go% Penicillin G.
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Die Natriumsalze der Penicilline F und K können aus der Mutterlauge
in der gleichen Weise gewonnen werden, wie es im Beispiel 3 beschrieben ist.
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1)i1: gesättigte wässerige .Lösung der entsprechenden Kaliumsalzc
ist ebenfalls der Fraktionierung unter .\nwettdung von Aceton als Fraktionierungsinittel
unterworfen worden, aber die Ergebnisse sind nicht so gut wie diejenigen, die mit
den \atriumsalzen erhalten werden. Wenn Ammoniumsalzkristalle für die Herstellung
der gesättigten wässerigen Lösung der Kaliumsalze Verwendung finden, ergibt sich
ein Gehalt von Penicillin G von ungefähr 34%. Eine Fraktionierung läßt den Gehalt
an Penicillin G auf 6201n anwachsen. und eine zweite Fraktionierung bringt ihn auf
770/0.
Es werden jedoch ähnliche Resultate wie mit den ,Natriumsalzen erhalten,
wenn die Fraktionierung mehrmals wiederholt wird.