DE69937450T2 - Methoden zur gestaltung von proteingebundenen lipidischen mikropartikeln und verbindungen damit - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet von lipidischen Mikropartikeln, wie Liposomen, Lipid:DNA-Komplexen, Lipid:Medikamentkomplexen und Mikroemulsionströpfchen, welche an Proteinen befestigt sind. Insbesondere betrifft die Erfindung lipidische Mikropartikel mit befestigten Proteinen, welche zuerst an Linkermoleküle mit einer hydrophilen Polymerdomäne und einer hydrophoben Domäne, die fähig zur stabilen Assoziation mit dem Mikropartikel ist, konjugiert worden sind, oder Proteine, welche konstruiert worden sind, um eine hydrophile Domäne und eine Lipidhälfte zu enthalten, welche die stabile Verbindung mit einem lipidischen Mikropartikel ermöglicht.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Liposomen, welche aus amphiphilen kationischen Molekülen bestehen, sind nützliche nichtvirale Vektoren für die Genzuführung in vitro und in vivo (übersichtsmäßig zusammengefasst in Crystal, Science 270: 404–410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2: 291–297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5: 382–389 (1994), Remy et al., Bioconjugate Chem. 5: 647–654 (1994); und Gao et al., Gene Therapy 2: 710–722 (1995)). In der Theorie komplexieren die positiv geladenen Liposomen an negativ geladenen Nukleinsäuren mittels elektrostatischer Wechselwirkungen unter Bildung von Lipid:Nukleinsäurekomplexen. Die Lipid:Nukleinsäurekomplexe weisen mehrere Vorteile als Gentransfervektoren auf. Anders als virale Vektoren können die Lipid:Nukleinsäurekomplexe verwendet werden, um Expressionskassetten von im Wesentlichen unbeschränkter Größe zu übertragen. Da den Komplexen Proteine fehlen, können sie weniger immunogene und entzündliche Antwortreaktionen hervorrufen. Darüber hinaus können sie nicht replizieren oder unter Bildung eines infektiöses Agens rekombinieren und sie besitzen eine niedrige Integrationshäufigkeit.
  • Es gibt eine Reihe von Veröffentlichungen, welche überzeugend aufzeigen, dass amphiphile kationische Lipide eine Genzuführung in vivo und in vitro vermitteln können, indem die nachweisbare Expression eines Reportergens in kultivierten Zellen in vitro gezeigt wird (Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413–17 (1987); Loeffler et al., Methods in Enzymology 217: 599–618 (1993); Feigner et al., J. Biol. Chem. 269: 2550–2561 (1994)). Weil Lipid:Nukleinsäurekomplexe gelegentlich nicht so effizient wie virale Vektoren zum Erzielen eines erfolg reichen Gentransfers sind, sind große Anstrengungen in die Ermittlung von kationischen Lipiden mit erhöhter Transfektionseffizienz gerichtet worden (Gehr, Bioconjugate Chem. 5: 382–389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5: 647–654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2: 710–722 (1995)). Lipid:Nukleinsäurekomplexe werden mit Enthusiasmus als ein potenziell nützliches Werkzeug für die Gentherapie angesehen.
  • Mehrere Gruppen haben die Verwendung von amphiphilen kationischen Lipid:Nukleinsäurekomplexen zur in-vivo-Transfektion sowohl in Tieren als auch in Menschen berichtet (übersichtsmäßig zusammengefasst in Gao et al., Gene Therapy 2: 710–722 (1995); Zhu et al., Science 261: 209–211 (1993); und Thierry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 9742–9746 (1995)). Allerdings wurden die technischen Probleme bei der Herstellung von Komplexen, welche stabile Haltbarkeitsdauern besitzen, nicht behandelt. Anders als virale Vektorpräparationen sind Lipid:Nukleinsäurekomplexe zum Beispiel hinsichtlich der Partikelgröße instabil (Gehr, Bioconjugate Chem. 5: 382–389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5: 647–654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2: 710–722 (1995)). Es ist deshalb schwierig, homogene Lipid:Nukleinsäurekomplexe mit einer für systemische Injektion geeigneten Größenverteilung zu erhalten. Die meisten Präparationen von Lipid:Nukleinsäurekomplexen sind metastabil. Folglich müssen diese Komplexe typischerweise innerhalb einer kurzen Zeitdauer verwendet werden, welche im Bereich von 30 Minuten bis zu wenigen Stunden liegt. In jüngeren klinischen Versuchen unter Verwendung von kationischen Lipiden als Träger für DNA-Zuführung wurden die zwei Komponenten direkt am Bett des Patienten vermischt und unverzüglich verwendet (Gao et al., Gene Therapy 2: 710–722 (1995)). Die strukturelle Instabilität, zusammen mit dem Verlust an Transfektionsaktivität des Lipid:Nukleinsäurekomplexes mit der Zeit, sind Herausforderungen für die zukünftige Entwicklung einer lipidvermittelten Gentherapie gewesen.
  • Liposomen, welche aus amphiphilen kationischen Molekülen bestehen, sind selbstverständlich nicht die einzige Form von lipidischen Mikropartikeln, und Gentherapie ist nicht die einzige Anwendung für solche Partikel. Lipidische Mikropartikel sind auch für die Zuführung von Medikamenten und anderen Mitteln an Zielstellen eingesetzt worden. Die Ziellenkung bzw. das Targeting der Mikropartikel wird typischerweise durch die Verwendung eines an der Oberfläche des Mikropartikels befestigten Proteins erzielt, welches zum Beispiel ein Ligand für einen Zelloberflächenrezeptor auf einem Zelltyp von Interesse sein kann. Umgekehrt kann das Protein ein Antikörper sein, der ein Antigen auf einem Zelltyp von Interesse, wie erkrankten Zellen, welche spezifische Marker tragen, spezifisch erkennt. Zusätzlich dazu können Proteine für andere Zwecke als dem Targeting befestigt werden. Zum Beispiel können Liposomen Proarzneistoffe enthalten, welche langsam aus dem Liposom in den Kreislauf einsickern. Ein an dem Liposom befestigtes Enzym kann dann den Proarzneistoff in seine aktive Form umwandeln.
  • Derzeitige Verfahren zur Bewirkung der Befestigung von Proteinen an lipidischen Mikropartikeln lassen sich in zwei Typen einteilen. Der erste Typ erfordert das Einbringen eines Linkermo leküls, welches eine "aktive" Gruppe trägt (eine solche, welche mit einer funktionellen Gruppe des Proteins reagiert), in die Mikropartikelzusammensetzung vor der Konjugation des "aktivierten" Partikels mit dem Protein von Interesse. Verfahren dieses Typs weisen die folgenden Nachteile auf: häufig unkontrollierbare, unvollständige Reaktion des Proteins mit dem Linker; Vorhandensein von überschüssigem Linker auf dem resultierenden Konjugat, potenziell nachteilige Auswirkung des Linkers auf die Stabilität des Partikels, sowie das Unvermögen, mit dem Linker reaktive Komponenten in die Zusammensetzung des Partikels einzubringen.
  • Die zweite Gruppe von Verfahren verwendet die Schritte des (a) Befestigens einer hydrophoben Hälfte bzw. Einheit, wie einer Kohlenwasserstoffkette, an dem Proteinmolekül, (b) Lösens der Komponenten des lipidischen Mikropartikels, zusammen mit dem Konjugat von Schritt (a) in Gegenwart eines Detergens, und (c) Entfernens des Detergens, was die Bildung des lipidischen Partikels unter Einbindung des Proteinkonjugats bewirkt (Torchilin, Immunomethods 4: 244–258 (1994); Laukkanen et al., Biochemistry 33: 11664–11670 (1994). Diese Verfahren weisen eine Reihe von Nachteilen auf, einschließlich der Verhängung schwerer Einschränkungen auf den Spielraum an Verfahren, durch welche das Partikel gebildet werden kann (z. B. ist die Detergens-Entfernungstechnik erforderlich) und durch welche das Medikament oder ein anderes Mittel in das Mikropartikel geladen werden kann. Darüber hinaus erfordert der Schritt (b) das Lösen des Mikropartikels. Diese Verfahren sind deshalb nicht in der Lage, ein Protein an ein vorgefertigtes Partikel zu befestigen, ohne es zuerst zu zerstreuen. Das Vorhandensein von Detergens in diesem Verfahren ist unvermeidbar, weil das hydrophob modifizierte Protein ohne ein Detergens in wässrigem Medium unlöslich ist.
  • Über die "Insertion" von hydrophilem Polymer-Lipid, das an ein kleines (5 Aminosäuren) Oligopeptid oder kleines Oligosaccharid gebunden ist, in Liposomen wurde berichtet (Zalipsky et al., Bioconjugate Chem. 8:111–118 (1997)). Das verwendete Peptid und Oligosaccharid waren jedoch von einer Größe (Molekulargewicht, 500–3000 Da), welche kleiner oder vergleichbar zum Linker selbst (Molekulargewicht 2750 Da) war. Diese Untersuchung liefert daher keine Richtlinie für das Inserieren von Proteinen, wie Antikörpern oder Fragmenten davon, welche an signifikant kleinere Linker als das Protein konjugiert sind, in Liposomen oder andere lipidische Mikropartikel. In Hinsicht auf die hydrophile Natur von Antikörpern und anderen Proteinen, wurde im Fachgebiet gelehrt, dass der größere, Proteinanteil eines solchen Konjugats die hydrophobe Verknüpfungs-Einheit an einer stabilen Verbindung mit einem lipidischen Mikropartikel hindert.
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • Die Erfindung sieht ein Verfahren zur Bereitung eines lipidischen Mikropartikels vor, welches an einem Polypeptid von wenigstens 6000 Da mittels einem Linkermolekül befestigt ist, wobei das Verfahren den folgenden Schritt aufweist:
    Inkubieren des lipidischen Mikropartikels mit einem Polypeptid, welches an ein Linkermolekül konjugiert ist, welches aufweist:
    • a) eine hydrophobe Domäne,
    • b) eine hydrophile Polymerkette, welche terminal an der hydrophoben Domäne befestigt ist, und
    • c) eine chemische Gruppe, die zu einer oder mehreren funktionellen Gruppen auf dem Polypeptid reaktiv ist und an der hydrophilen Polymerkette an einem zu der hydrophoben Domäne kontralateralen Ende befestigt ist,
    für eine Zeit, die ausreichend ist um zu ermöglichen, dass sich die hydrophobe Domäne stabil mit dem lipidischen Mikropartikel verbindet.
  • Die Erfindung sieht des Weiteren ein Verfahren zur Bereitung eines lipidischen Mikropartikels vor, welches an einem Polypeptid von wenigstens 6000 Da befestigt ist, wobei das Verfahren den folgenden Schritt aufweist:
    Inkubieren des Polypeptids, welches eine terminal angehängte Aminosäuresequenz aufweist, die hauptsächlich Aminosäuren mit hydrophilen Seitenketten aufweist, wobei der Sequenz eine Lipid-Modifikationsstelle mit einer synthetisch angehängten Lipidhälfte folgt, mit dem lipidischen Mikropartikel für eine Zeit, die ausreichend ist um zu ermöglichen, dass sich die Lipidhälfte stabil mit dem lipidischen Mikropartikel verbindet.
  • Darüber hinaus stellt die Erfindung ein lipidisches Mikropartikel bereit, welches mit zwei oder mehr unterschiedlichen Polypeptiden von wenigstens 6000 Da konjugiert ist, wobei die Polypeptide jeweils mit dem lipidischen Mikropartikel durch ein Linker-Molekül konjugiert sind, wobei jedes Linker-Molekül aufweist:
    • a) eine hydrophobe Domäne,
    • b) eine hydrophile Polymerkette, welche terminal an der hydrophoben Domäne befestigt ist, und
    • c) eine chemische Gruppe, die zu einer oder mehreren funktionellen Gruppen auf dem Polypeptid, das mit dem Linker konjugiert ist, reaktiv ist, wobei die chemische Gruppe an der hydrophilen Polymerkette an einem zu der hydrophoben Domäne kontralateralen Ende befestigt ist, wobei die funktionellen Gruppen für jedes Polypeptid gleich sind.
  • Darüber hinaus sieht die Erfindung außerdem ein Kit zum Bereiten eines an einem Polypeptid von wenigstens 6000 Da befestigten lipidischen Mikropartikel vor, wobei das Kit umfasst:
    • (i) einen Behälter mit dem lipidischen Mikorpartikel; und
    • (ii) einen Behälter mit dem Polypeptid, welches mit einem hydrophilen Polymer verknüpft ist, das an einer hydrophoben Domäne befestigt ist;
    wobei sich das lipidische Mikropartikel und das Polypeptid stabil miteinander verbinden, wenn sie zusammen inkubiert werden.
  • Das lipidische Mikropartikel kann ein Lipid:Nukleinsäurekomplex sein. Die vorliegende Offenbarung stellt ein neues Verfahren zum Bereiten von kationischen Lipid:Nukleinsäurekomplexen, welche eine erhöhte Haltbarkeitsdauer aufweisen, bereit. In einer Ausführungsform werden diese Komplexe hergestellt durch In-Kontakt-Bringen einer Nukleinsäure mit einem organischen Polykation, um eine kondensierte oder partiell kondensierte Nukleinsäure herzustellen. Die kondensierte Nukleinsäure wird dann mit einem amphiphilen kationischen Lipid sowie einem neutralen Helfer-Lipid, wie Cholesterol, in einem Molverhältnis von etwa 2:1 bis etwa 1:2 kombiniert, wodurch der Lipid:Nukleinsäurekomplex hergestellt wird. Gegebenenfalls wird anschließend ein hydrophiles Polymer zu dem Lipid:Nukleinsäurekomplex zugesetzt. Alternativ dazu wird das hydrophile Polymer zu einem Lipid:Nukleinsäurekomplex zugesetzt, welcher Nukleinsäure umfasst, die nicht [nicht] kondensiert worden ist. Diese Lipid:Nukleinsäurekomplexe besitzen eine erhöhte Haltbarkeitsdauer, z. B. bei Aufbewahrung bei 22°C oder darunter, im Vergleich zu einem identischen Lipid:Nukleinsäurekomplex, in welchem die Nukleinsäurekomponente nicht mit dem organischen Polykation kontaktiert worden ist, und/oder in welchem der Lipid:Nukleinsäurekomplex nicht mit einem hydrophilen Polymer kontaktiert worden ist.
  • Vorzugsweise ist das Polykation ein Polyamin, weiter bevorzugt ein Polyamin wie Spermidin oder Sperrain.
  • Ebenfalls bevorzugt werden die Lipid:Nukleinsäurekomplexe hergestellt durch Kombinieren einer Nukleinsäure mit einem amphiphilen kationischen Lipid und danach Kombinieren des so gebildeten Komplexes mit einem hydrophilen Polymer. Dieser Lipid:Nukleinsäurekomplex besitzt eine erhöhte Haltbarkeitsdauer, z. B. bei Aufbewahrung bei 22°C oder darunter, im Vergleich zu einem identischen Komplex, welcher nicht mit dem hydrophilen Polymer kombiniert worden ist.
  • Das hydrophile Polymer wird zum Beispiel aus der Gruppe gewählt, die aus Polyethylenglykol (PEG), mit Phosphatidylethanolamin derivatisiertem Polyethylenglykol (PEG-PE), mit Tween derivatisiertem Polyethylenglykol, mit Distearoylphosphatidylethanolamin derivatisiertem Polyethylenglykol (PEG-DSPE), Gangliosid GM1 und synthetischen Polymeren besteht.
  • Der Lipid:Nukleinsäurekomplex kann lyophilisiert werden.
  • In jedwedem der Verfahren und Zusammensetzungen dieser Erfindung kann die Nukleinsäure praktisch eine beliebige Nukleinsäure sein, z. B. eine Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder eine Ribonukleinsäure (RNA) und Peptid-Nukleinsäure (PNA) etc., und ist am stärksten bevorzugt eine DNA. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die DNA eine Expressionskassette, die zum Exprimieren eines Polypeptids in einer Zelle fähig ist, welche mit dem Lipid:Nukleinsäurekomplex transfiziert wurde.
  • Die Lipid:Nukleinsäurekomplexe werden zum Beispiel gebildet, indem zuerst ein Liposom gebildet wird und dann das gebildete Liposom mit kondensierter oder partiell kondensierter Nukleinsäure unter Bildung eines Lipid:Nukleinsäurekomplexes kombiniert wird. Gegebenenfalls wird der Lipid:Nukleinsäurekomplex anschließend mit einem hydrophilen Polymer in Kontakt gebracht. Die Liposomen können alternativ dazu mit einer unkondensierten Nukleinsäure vereinigt werden, um einen Lipid:Nukleinsäurekomplex zu bilden, zu welchem später ein hydrophiles Polymer (z. B. PEG-PE) zugegeben wird. Ein durch die Kombination von Nukleinsäure und einem mit einem hydrophilen Polymer kontaktierten Liposom hergestellter Lipid:Nukleinsäurekomplex kann anschließend mit weiterem hydrophilen Polymer kombiniert werden. Vorzugsweise werden das Lipid und die Nukleinsäure in einem Verhältnis im Bereich von etwa 1 bis etwa 20, weiter bevorzugt von etwa 4 bis etwa 16 und am stärksten bevorzugt von etwa 8 bis etwa 12 nmol Lipid:μg Nukleinsäure kombiniert. Das Lipid und das hydrophile Polymer werden in einem Molverhältnis im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 10%, weiter bevorzugt von etwa 0,3 bis etwa 5% und am stärksten bevorzugt von etwa 0,5 bis etwa 2,0% kombiniert (Molverhältnis von hydrophilem Polymer zu kationischem Lipid des Komplexes).
  • Diese Beschreibung sieht ebenfalls ein Verfahren zum Transfizieren einer Nukleinsäure in eine Säugerzelle vor, wobei das Verfahren das Kontaktieren der Zelle mit einem beliebigen der, wie oben beschrieben hergestellten, Lipid:Nukleinsäurekomplexe umfasst. Das Verfahren kann eine systemische Verabreichung eines Lipid:Nukleinsäurekomplexes in ein Säugetier verwenden. Vorzugsweise verwendet das Verfahren zum Transfizieren die intravenöse Verabreichung des Lipid:Nukleinsäurekomplexes in einen Säuger. In einem besonders bevorzugten Verfahren umfasst das Verfahren das Kontaktieren einer spezifischen Zelle, welche einen Ligand exprimiert, der ein Fab'-Fragment erkennt, das im Komplex vorhanden ist.
  • Diese Beschreibung sieht auch eine pharmazeutische Zusammensetzung vor, welche den oben beschriebenen Lipid:kondensierte-Nukleinsäure-Komplex umfasst. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Dosis des Lipid:Nukleinsäurekomplexes und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Exzipienten.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die 1A und 1B veranschaulichen die Rolle von neutralem Lipid in der Genzuführung. Drei Liposomenformulierungen wurden hinsichtlich Genzuführung an sowohl Kulturzellen (SKBR-3, humane Brustkrebszelle) als auch Mäuse (CD1, weiblich, 20–25 g) getestet. Die Proben waren: (1) DDAB/Chol (1:1); (2) DDAB/Chol/DOPE (1:0,5:0,5); (3) DDAB/DOPE (1:1); und (4) DDAB allein. 1A veranschaulicht die Zelltransfektion. SKBR-3-Zellen wurden bei 50000 Zellen je Vertiefung in Zwölf-Vertiefungs-Platten ausplattiert und über Nacht inkubiert. Jede Vertiefung erhielt 1 μg des Plasmids P-CMWIVSLuc+, welches mit Liposomen bei 5 nmol DDAB komplexiert war. Die Zellen wurden nach 24 Stunden Inkubation mit den Komplexen bei 37°C geerntet. Die dargestellten Werte sind der Mittelwert aus 2 Vertiefungen. Die Werte lagen im Bereich innerhalb von 10–30% vom Mittelwert. Die 1B veranschaulicht die in-vivo-Transfektion in Mäusen. Mäuse erhielten mittels Schwanzveneninjektion 40 μg des Plasmids P-CMVIVS-Luc+, welches mit Liposomen bei einem Verhältnis von 8 nmol DDAB pro μg DNA komplexiert worden war. Die dargestellten Werte sind der Mittelwert aus 2 Mäusen. Die Werte lagen im Bereich innerhalb 20–25% des Mittelwerts.
  • Die 2 veranschaulicht die Reportergenexpression in Mausgewebeextrakten. Mäuse erhielten (durch Schwanzveneninjektion) 60 μg des Plasmids P-CMVIVS-Luc+, welches mit DDAB/Chol(1:1)-Liposomen bei einem Verhältnis von 8 nmol DDAB je μg DNA (ohne Spermidin) komplexiert war. Die dargestellten Werte sind der Mittelwert aus 3 Mäusen.
  • Die 3 veranschaulicht die Dauer der Reportergenexpression in Maus-Lunge [Luna]. Jedes Tier erhielt 40 μg des Plasmids P-CMVIVS-Luc+, welches mit DDAB/Chol(1:1)-Liposomen bei einem Verhältnis von 8 nmol DDAB je μg DNA komplexiert war.
  • Die 4 veranschaulicht die Genzuführung in Maus-Lunge durch verschiedene stabilisierte Komplexe. Jede Maus erhielt 60 μg P-CMVIVS-Luc+, welches mit DDAB/Chol(1:1)-Liposomen bei einem Verhältnis von 8 nmol DDAB/μg DNA komplexiert war. Die dargestellten Werte sind der Mittelwert aus 3 Mäusen. Punktierte Balken: frisch hergestellte Komplexe; ausgefüllte Balken: Proben mit einem Alter von einem Monat. Die Proben waren wie folgend: (1) Keine Zugabe von stabilisierendem Mittel; (2) Zugabe von PEG-PE bei 1% Gesamtlipid zu den gebildeten Komplexen; und (3) Zugabe von Spermidin (0,5 nmol pro μg DNA) zu dem Plasmid vor der Komplexbildung.
  • Die 5A und 5B veranschaulichen die in-vitro-Transfektion von Zelllinien mit Immunlipid:DNA-Komplexen. Die Proben sind wie folgend: (1) DDAB/DOPE (1:1) unter Erzeugung von kationischen Liposomen, die lediglich mit DNA komplexiert sind; (2) DDAB/DOPE (1:1) mit 1% PEG-PE, welches mit Maleimid an der äußersten Position von PEG derivatisiert ist, unter Erzeugung von Liposomen mit Hinzufügung der sterischen Stabilisierungskomponente nach Komplexierung mit der DNA; und (3) DDAB/DOPE (1:1) mit 1% PEG-PE, welches mit dem Fab'-Fragment von einem humanisierten Anti-Her-2-Antikörper derivatisiert ist, der an der äußersten Position von PEG über die freie Thiolgruppe an den Maleimidrest befestigt ist.
  • DEFINITIONEN
  • Es werden hierin die folgenden Abkürzungen verwendet: Chol, Cholesterol; PA, Phosphatidinsäure; PC, Phosphatidylcholin; PI, Phosphatidylinositol; SM, Sphingomyelin; M-DPE, Maleimid-derivatisiertes Dipalmitoylethanolamin; PBS, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung; LUV, gro ße unilamellare Vesikel; MLV, multilamellare Vesikel; PE, Phosphatidylethanolamin; PEG, Polyethylenglykol; PEG-PE, Polyethylenglykol, welches mit Phosphatidylethanolamin derivatisiert ist, DC-Chol, 3β[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)carbanoyl]-cholesterol; DDAB, Dimethyldioctadecylammoniumbromid; DMEPC, Dimyristoylglycero-3-ethylphosphocholin; DODAP, Dioleoyl-3-dimethylammoniumpropan; DOEPC, Dioleoylglycero-3-ethylphosphocholin; DOGS, N,N-Dioctadecylamidoglycylspermin; DOPE, Dioleoylphosphatidylethanolamin; DOTAP, Dioleoyl-3-trimethylammoniumpropan; DOTMA, N-[2,3-(Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumbromid; DSPE, Distearoylphosphatidylethanolamin; PEG-PE, N-[ω-Methoxypoly(oxyethylen)-α-oxycarbonyl]-DSPE; POEPC, Palmitoyloleoylglycero-3-ethylphosphocholin.
  • Der Begriff "amphiphiles kationisches Lipid" schließt beabsichtigtermaßen jedwedes amphiphile Lipid, einschließlich synthetischer Lipide und Lipidanaloge, ein, aufweisend hydrophobe und polare Kopfgruppen-Hälften, eine positive Nettoladung, und welches sich von selbst spontan zu Doppelschicht-Vesikeln oder Mizellen in Wasser formieren kann, wie durch Phospholipide beispielhaft veranschaulicht. Der Begriff schließt auch jedwedes amphiphiles Lipid ein, welches stabil in Lipid-Doppelschichten in Kombination mit Phospholipiden eingebaut wird, wobei seine hydrophobe Hälfte in Kontakt mit der inneren, hydrophoben Region der Doppelschichtmembran steht, und seine polare Kopfgruppen-Hälfte zur äußeren, polaren Oberfläche der Membran hin orientiert ist.
  • Der Ausdruck "spezifische Bindung" bezieht sich auf diejenige Bindung, welche zwischen derartigen gepaarten Spezies wie Enzym/Substrat, Rezeptor/Agonist, Antikörper/Antigen und Lektin/Kohlenhydrat stattfindet, welche durch kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen oder eine Kombination aus kovalenten und nicht-kovalenten Wechselwirkungen vermittelt werden kann. Wenn die Wechselwirkung der zwei Spezies einen nicht-kovalent gebundenen Komplex erzeugt, ist die Bindung, welche auftritt, typischerweise elektrostatisch, eine Wasserstoffbrückenbindung oder das Ergebnis von lipophilen Wechselwirkungen. Folglich tritt eine "spezifische Bindung" zwischen einer gepaarten Spezies auf, wenn es eine Wechselwirkung zwischen den beiden gibt, die einen gebundenen Komplex erzeugt, der die Merkmale einer Antikörper/Antigen- oder Enzym/Substrat-Wechselwirkung aufweist. Insbesondere ist die spezifische Bindung durch die Bindung eines Mitglieds eines Paars an eine besondere Spezies und an keine andere Spezies innerhalb der Familie von Verbindungen, welcher das entsprechende Mitglied des bindenden Mitglieds angehört, gekennzeichnet. Somit bindet zum Beispiel ein Antikörper an ein einziges Epitop und an kein anderes Epitop innerhalb der Familie von Proteinen.
  • Die Ausdrücke "Ligand" oder "Targeting-Einheit", wie hierin verwendet, beziehen sich im Allgemeinen auf alle Moleküle, welche zum spezifischen Binden an ein jeweiliges Zielmolekül und zur Bildung eines gebundenen Komplexes, wie oben beschrieben, in der Lage sind. Somit bilden der Ligand und sein entsprechendes Zielmolekül ein spezifisches Bindungspaar. Beispiele schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Antikörper, Lymphokine, Cytokine, Rezeptorproteine, wie CD4 und CD8, solubilisierte Rezeptorproteine, wie lösliches CD4, Hormone, Wachstumsfakto ren und dergleichen, welche spezifisch an gewünschte Zielzellen binden, sowie Nukleinsäuren, welche entsprechende Nukleinsäuren über Basenpaarkomplementarität binden, ein. Besonders bevorzugte Targeting-Einheiten schließen Antikörper und Antikörperfragmente (z. B. das Fab'-Fragment) ein.
  • Der Ausdruck "Lipid:Nukleinsäurekomplex" bezieht sich auf das Produkt, welches durch Mischen von amphiphilen kationischen Lipiden oder Liposomen mit einer Nukleinsäure hergestellt wird. Der Ausdruck "CLDC", der, wie hierin verwendet, für "kationisches-Lipid:DNA-Komplex" steht, ist nicht auf DNA beschränkt und ist eine zweckmäßige Abkürzung für Lipid:Nukleinsäurekomplex. Der Lipid:Nukleinsäurekomplex kann auch ein Helfer-Lipid einschließen. Das Helfer-Lipid ist häufig ein neutrales Lipid, wie DOPE oder Cholesterol, wobei Cholesterol am stärksten bevorzugt wird. Der Lipid:Nukleinsäurekomplex kann auch andere Verbindungen, wie ein Polykation, welche in Kontakt mit der Nukleinsäure des Komplexes sind, kondensierte Nukleinsäure erzeugen, sowie hydrophile Polymere, wie PEG und derivatisiertes PEG, enthalten.
  • Die Ausdrücke "Immunoliposom" und "Immunolipid:Nukleinsäurekomplex" beziehen sich auf ein Liposom oder einen Lipid:Nukleinsäurekomplex, der einen Antikörper oder ein Antikörperfragment trägt, welches als eine Targeting-Einheit wirkt, welche ermöglicht, dass der Lipid-Nukleinsäurekomplex spezifisch an ein besonderes "Ziel"-Molekül bindet, welches in Lösung existieren kann oder an die Oberfläche einer Zelle gebunden sein kann. Falls das Zielmolekül ein solches ist, welches typischerweise in verhältnismäßigem Überschuss (z. B. ungefähr 10-fach) und in Assoziation mit einem jeweiligen Zelltyp oder alternativ dazu in einer Vielzahl von Zelltypen, welche alle einen jeweiligen physiologischen Zustand exprimieren, gefunden wird, spricht man von dem Zielmolekül als einem "charakteristischen Marker" dieses Zelltyps oder dieses physiologischen Zustands. So kann zum Beispiel ein Krebs durch die Überexpression eines besonderen Markers gekennzeichnet sein, wie dem HER2 (c-erbB-2/neu)-Protoonkogen im Fall von Brustkrebs.
  • Ein "hydrophiles Polymer", wie hierin verwendet, bezieht sich auf hoch-hydratisierte flexible neutrale Polymere, welche an Lipidmolekülen befestigt sind. Beispiele schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Polyethylenglykol (PEG), mit Phosphatidylethanolamin derivatisiertes Polyethylenglykol (PEG-PE), mit Tween derivatisiertes Polyethylenglykol, mit Distearoylphosphatidylethanolamin derivatisiertes Polyethylenglykol (PEG-DSPE), Gangliosid GM1 und synthetische Polymere ein. Solche Polymere weisen typischerweise ein Molekulargewicht im Bereich von 1000–10000 auf. Vorzugsweise beläuft sich das Molekulargewicht für PEG ungefähr auf 2000.
  • "Transfektion" bezieht sich auf das Kontaktieren einer lebenden Zelle mit einer Nukleinsäure, zum Beispiel als Teil eines Lipid:Nukleinsäurekomplexes.
  • "Transfektionsaktivität" bezieht sich auf die Effizienz der Einbringung einer Nukleinsäure in eine lebende Zelle. Die Transfektionseffizienz kann gemessen werden durch Bestimmen des Betrags der Expression eines Reportergens, welches als Teil eines Lipid:Nukleinsäurekomplexes in die Zelle transfiziert worden ist, zum Beispiel durch fluoreszente oder funktionale Assays.
  • Die Begriffe "kondensierte Nukleinsäure" und "partiell kondensierte Nukleinsäure" werden verwendet, um Bezug auf eine Nukleinsäure zu nehmen, welche mit einem organischen Kation, zum Beispiel Polyaminen, einschließlich Spermin und Spermidin, Polyammoniummolekülen, wie Polybrene (Hexadimethrinbromid), basischen Polyaminosäuren und basischen Proteinen, kontaktiert worden ist. Kondensierte Nukleinsäuren nehmen typischerweise ein signifikant kleineres Volumen ein als nicht-kondensierte Nukleinsäuren. Es wird jedoch erkannt, dass das Ausmaß der Kondensation mit der lokalen Umgebung (z. B. Lipid im Gegensatz zu wässriger Umgebung) variieren kann.
  • Der Begriff "Haltbarkeitsdauer", bei Verwendung zur Bezugnahme auf die hierin offenbarten Lipid:Nukleinsäuren, bezieht sich auf die Zeitdauer, über welche der Lipid:Nukleinsäurekomplex aufbewahrt werden kann (unter definierten Bedingungen, z. B. bei 4°C), bevor er seine biologische Aktivität verliert. Die zur Bestimmung der Haltbarkeitsdauer in der vorliegenden Erfindung geassayte biologische Aktivität ist die Fähigkeit des Lipid:Nukleinsäurekomplexes, Säugerzellen in vivo nach einer intravenösen Verabreichung zu transfizieren. Die "Haltbarkeitsdauer" eines Lipid:Nukleinsäurekomplexes wird zweckmäßigerweise durch Assay mittels Genexpression von Reporternukleinsäuren in dem Lipid:Nukleinsäurekomplex ermittelt, wie es hierin beschrieben wird.
  • Eine "Expressionskassette" bezieht sich auf einen Promotor, der funktionsfähig an ein DNA-Molekül verknüpft ist, welches alle Elemente enthält, die für die Expression dieses DNA-Moleküls in einer lebenden Zelle erfordert werden. Die Expressionskassette kann zusätzliche Elemente, wie Enhancer, Replikationsursprünge und dergleichen enthalten, wodurch ein Expressionsvektor gebildet wird.
  • "Organisches Polykation" oder "Polykation" beziehen sich auf eine organische polymere Struktur, worin mehr als eine Einheit des Polymers eine negative Ladung trägt, und die Nettoladung des Polymers positiv ist. Beispiele für ein solches organisches Kation sind Polyamine, einschließlich Spermin und Spermidin, Polyammoniummoleküle, wie Polybrene (Hexadimethrinbromid), basische Polyaminosäuren oder basische Proteine.
  • Ein "pharmazeutisch annehmbarer Träger" ist ein Material, welches nicht biologisch oder anderweitig unerwünscht ist, d. h. das Material kann einem Individuum zusammen mit dem Lipid:Nukleinsäurekomplex verabreicht werden, ohne unannehmbare biologische Effekte zu verur sachen oder in einer nachteiligen Weise mit irgendeiner der anderen Komponenten der pharmazeutischen Zusammensetzung, in welchem er enthalten ist, wechselzuwirken.
  • Der Begriff "Nukleinsäure" bezieht sich auf ein Polymer oder Oligomer, welches aus Nukleotideinheiten (Ribonukleotide, Desoxyribonukleotide oder verwandte strukturelle Varianten oder synthetische Analoge davon) aufgebaut ist, die durch Phosphodiesterbindungen (oder verwandte strukturelle Varianten oder synthetische Analoge davon) verknüpft sind. Somit bezieht sich der Begriff auf ein Nukleotidpolymer, in welchem die Nukleotide und die Bindungen zwischen ihnen natürlich vorkommend sind (DNA oder RNA), sowie auf verschiedene Analoge, zum Beispiel, und ohne Einschränkung, Peptidnukleinsäuren (PNAs), Phosphoramidate, Phosphorthioate, Methylphosphonate, 2-O-Methyl-Ribonnukleinsäuren und dergleichen.
  • Der Begriff "Molprozent", bei Bezugnahme auf den Prozentgehalt an hydrophilem Polymer in einem Liposom, wird relativ zu dem kationischen Lipid im Liposom ausgedrückt, es sei denn es ist anders lautend angegeben. So werden beispielsweise in einem Liposom, welches ein Verhältnis von DDAB zu Cholesterol (Chol) von 100:100 aufweist, 4 Molprozent hydrophiles Polymer (z. B. PEG) ein Verhältnis von DDAB:Chol:PEG von etwa 100:100:4 repräsentieren.
  • Der Ausdruck "identisch" bezieht sich auf eine Zusammensetzung, welche unter Verwendung derselben Verbindungen wie in einer anderen Zusammensetzung gebildet wird, wobei sich die Zusammensetzungen nicht in einer statistisch signifikanten Weise unterscheiden.
  • Der Begriff "systemische Verabreichung" bezieht sich auf ein Verfahren zur Verabreichung einer Verbindung oder Zusammensetzung an einen Säuger, sodass die Verbindung oder Zusammensetzung an viele Stellen im Körper über das Kreislaufsystem zugeführt wird.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet "Linkermolekül" ein Molekül, umfassend (a) eine hydrophobe Domäne, (b) eine hydrophile Polymerkette, welche terminal an der hydrophoben Domäne befestigt ist, und (c) eine chemische Gruppe, die zu einer oder mehreren funktionellen Gruppen auf einem Proteinmolekül reaktiv ist und an der Polymerkette an, oder nahe, dem zu der hydrophoben Domäne kontralateralen Ende befestigt ist.
  • Der Begriff "hydrophobe Domäne" von, zum Beispiel, einem Linkermolekül, bedeutet eine Fettsäure, einen Fettalkohol, ein Sterol oder ein anderes hydrophobes Molekül, das aus einem wässrigen Medium heraus zur Verteilung in eine Lipidphase fähig ist. Zum Beispiel kann eine hydrophobe Domäne ein Diacylglycerol, ein Phospholipid, ein Sterol, wie Cholesterol, oder ein Diacylamidderivat, wie N,N-Distearoylglycinamid sein.
  • Der Begriff "Lipidhälfte" bzw. "Lipideinheit" in Bezug auf ein Proteinmolekül bedeutet eine Anordnung, zusammengesetzt aus einer oder mehreren hydrophoben Domänen, welche direkt an das Proteinmolekül kovalent gebunden ist.
  • Die Ausdrücke "Protein" und "Peptid" werden auf dem Fachgebiet allgemein nach dem Molekulargewicht unterschieden, wobei Polypeptide unter 6000 Dalton als Peptide angesehen werden, und diejenigen mit oder über 6000 Dalton als Proteine angesehen werden; Siehe z. B. McMurray, Organic Chemistry (Brooks/Cole Publishing Co., Belmont, CA)(1988), auf S. 971. Die Verwendung dieser Begriffe hierin folgt dieser Unterscheidung.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
  • Diese Offenbarung liefert Verfahren zur Erhöhung der Haltbarkeitsdauer von kationischen Lipid:Nukleinsäurekomplexen und der in-vivo- und/oder in-vitro-Transfektionseffizienz dieser Komplexe. Derartige Komplexe haben ein beträchtliches Interesse als Mittel zur Zuführung von Nukleinsäuren, welche verschiedene therapeutische Polypeptide exprimieren, sowie als Mittel zur Zuführung von therapeutischen (z. B. Antisense-)Nukleinsäuren selbst auf sich gezogen. Unglücklicherweise ist es schwierig gewesen, homogene Lipid:Nukleinsäurekomplexe, welche für eine Verabreichung in vivo geeignet sind, aufrechtzuerhalten und aufzubewahren. Die Komplexe neigen dazu, rasch zu aggregieren oder sich innerhalb von relativ kurzer Zeit zu zersetzen. Diese Instabilität hat eine Anwendung dieser Komplexe innerhalb einer kurzen Zeitspanne nach der Zubereitung, häufig in nicht mehr als 30 Minuten bis einigen Stunden, erforderlich gemacht. So wurden zum Beispiel in jüngeren klinischen Versuchen, unter Verwendung von kationischen Lipiden als Träger für eine DNA-Zuführung, die DNA und Lipidkomponenten direkt am Patientenbett vermischt und unverzüglich verwendet (Gao et al., Gene Therapy 2: 710–722 (1995)).
  • Diese Lipid:Nukleinsäurekomplex-Instabilität stellt ein bedeutendes Hindernis für die allgemein verbreitete Akzeptanz von kationischen Lipid:Nukleinsäurekomplexen als Therapeutika dar. Die Notwendigkeit der Bereitung des Komplexes kurz vor der Anwendung erfordert, dass eine pharmazeutische Anlage in verhältnismäßig enger Nachbarschaft zur Örtlichkeit der Anwendung vorhanden ist. Alternativ dazu stellt die Vereinigung des Lipids und der Nukleinsäure am Patientenbett eine wesentliche Arbeitslast dar, bringt Probleme bei der Qualitätskontrolle zur Gewährleistung einer angemessenen Komplexierung mit sich und führt eine potenzielle Fehlerquelle ein.
  • Die vorliegende Offenbarung löst diese Probleme durch Bereitstellen von Verfahren zur signifikanten Erhöhung der Haltbarkeits(Lagerungs)dauer von Lipid:Nukleinsäurekomplexen. Die Verfahren beinhalten im Allgemeinen: (1) Kondensieren der Nukleinsäure vor Einbringung in den Lipid:Nukleinsäurekomplex; (2) Kombinieren eines Lipid:Nukleinsäurekomplexes mit einem hydrophilen Polymer (z. B. PEG); und (3) sowohl Kondensieren der Nukleinsäure vor der Komplexbildung als auch Kombinieren des Komplexes mit einem hydrophilen Polymer.
  • Während die Kondensation von Nukleinsäuren zu einer Stabilität der Nukleinsäure bei der Isolierung führen kann (z. B. in einem wässrigen Puffer), war es eine überraschende Feststellung, dass die Verwendung eines Kondensierungsmittels (z. B. eines organischen Polykations) einen Lipid:Nukleinsäurekomplex vorsieht, welcher zum Transfizieren einer Zelle in vivo sogar nach einer Periode von verlängerter Aufbewahrung fähig bleibt (z. B. Kalt-Lagerung bei einer Temperatur von etwa 22°C oder darunter, weiter bevorzugt im Bereich von etwa 0°C bis etwa 22°C, und am stärksten bevorzugt bei etwa 4°C).
  • Es war ebenfalls eine überraschende Feststellung, dass Lipid:Nukleinsäurekomplexe, kombiniert mit einem hydrophilen Polymer, das an einem amphipathischen Lipid befestigt ist (z. B. PEG-PE), ebenfalls eine erhöhte Haltbarkeitsdauer zeigen. Ohne durch eine besondere Theorie gebunden zu sein, nimmt man an, dass wenn der kationisches-Lipid:DNA-Komplex ("CLDC") mit dem hydrophilen Polymer in Kontrakt gebracht wird, das hydrophile Polymer sich lokalisiert und über seine hydrophoben Seitenketten in hydrophobe Taschen im Komplex eingebunden wird, während der hydrophile Teil an der Außenoberfläche bleibt, wodurch der gesamte Komplex stabilisiert wird.
  • In Hinsicht auf diese Feststellungen stellt diese Offenbarung Verfahren zur Erhöhung der Haltbarkeitsdauer von kationisches-Lipid:Nukleinsäure-Komplexen bereit. Die Verfahren beinhalten im Allgemeinen entweder das Kondensieren der Nukleinsäure unter Anwendung eines Polykations und/oder das Kontaktieren, z. B. Beschichten, des Lipid:Nukleinsäurekomplexes mit einem hydrophilen Polymer.
  • Diese Erfindung sieht Verfahren zur Bildung von lipidischen Mikropartikeln mit befestigten Proteinen vor, die beispielsweise für das Targeting der Mikropartikel zu ausgewählten Zellen oder Geweben geeignet sind. Die Verfahren sehen eine Anzahl von Vorteilen gegenüber Verfahren des Stands der Technik vor:
    • (1) wegen der quantitativen Natur der Insertion ist die Anzahl von Proteinen je Partikel in hohem Maße reproduzierbar und kann exakt definiert werden;
    • (2) mehr als eine Art von Protein kann an die Oberfläche desselben Partikels, in einem exakten Anteil, befestigt werden;
    • (3) wenn das Protein-Linker-Konjugat vor der Insertion in eine Partikeloberfläche gereinigt wird, wird das Partikel keine unkonjugierten Linker tragen;
    • (4) das Partikel kann, in seiner Zusammensetzung, mit der aktiven Linker-Gruppe reaktive Moleküle enthalten. Zum Beispiel kann das Partikel Thiole enthalten, sogar wenn die aktive Gruppe Maleimid ist;
    • (5) wenn das Partikel ein Vesikel ist, werden die Linker/Protein-Moleküle nur auf der Außenoberfläche vorhanden sein; und
    • (6) das Verfahren erhöht die Anwendbarkeit von im Voraus hergestellten, bekannten Partikeln, wie kommerziell hergestellten pharmazeutischen Liposomen, durch Ermöglichen der Hinzufügung von an der Oberfläche befestigten Konjugaten, die Proteine von Interesse tragen.
  • I. Kationisches-Lipid:Nukleinsäure-Komplexe
  • Wie oben erläutert, liefert diese Offenbarung Verfahren zum Erhöhen der Lagerungsdauer (Haltbarkeitsdauer) von Lipid:Nukleinsäurekomplexen. Vorzugsweise werden die Komplexe durch Kombination einer Nukleinsäure mit einem Liposom gebildet. Es wird jedoch erkannt, dass die Lipide nicht als ein Liposom bereitgestellt werden müssen. Es wird ebenfalls erkannt, dass nach der Komplexierung der Lipid:Nukleinsäurekomplex nicht länger als ein echtes Vesikel vorliegen kann, und deshalb nicht allgemein als ein Liposom angesehen wird. Die Herstellung von Lipid:Nukleinsäurekomplexen ist dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt (siehe z. B. Rezension in Crystal, Science 270: 404–410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2: 291–297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5: 382–389 (1994), Remy et al., Bioconjugate Chem. 5: 647–654 (1994); und Gao et al., Gene Therapy 2: 710–722 (1995)). Die verschiedenen Komponenten und die Konstruktion der stabilisierten Lipid:Nukleinsäurekomplexe der Erfindung werden nachstehend ausführlich beschrieben.
  • A. Amphiphile kationische Lipide
  • Wie oben angegeben, beinhalten die hierin offenbarten Verfahren das Komplexieren eines kationischen Lipids mit einer Nukleinsäure. Der Begriff "kationisches Lipid" bezieht sich auf ein beliebiges von einer Reihe von Lipidspezies, welche eine positive Nettoladung bei physiologischem pH-Wert tragen. Solche Lipide schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, DODAC, DOTMA, DDAB, DOTAP, DC-Chol und DMRIE ein. Darüber hinaus ist eine Reihe von kommerziellen Präparaten kationischer Lipide verfügbar, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Diese schließen zum Beispiel LIPOFECTIN® (kommerziell erhältliche kationische Liposomen, umfassend DOTMA und DOPE, von GIBCO/BRL, Grand Island, New York, USA); LIPOFECTAMINE® (kommerziell erhältliche kationische Liposomen, umfassend DOSPA und DOPE, von GIBCO/BRL); und TRANSFECTAM® (kommerziell verfügbare kationische Lipide, welche DOGS in Ethanol umfassen, von Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA) ein.
  • Das kationische Lipid kann allein oder in Kombination mit einem "Helfer"-Lipid verwendet werden. Bevorzugte Helfer-Lipide sind bei physiologischem pH-Wert nicht-ionisch oder ungela den. Besonders bevorzugte nicht-ionische Lipide schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Cholesterol und DOPE ein, wobei Cholesterol am stärksten bevorzugt ist.
  • Das Molverhältnis von kationischem Lipid zu Helfer kann im Bereich von 2:1 bis etwa 1:2, weiter bevorzugt von etwa 1,5:1 bis etwa 1:1,5 liegen und beträgt am stärksten bevorzugt etwa 1:1. Zusätzliche kationische und nicht-ionische Lipide, die zur Verwendung in den Lipid:Nukleinsäurekomplexen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt und werden in einer Vielzahl von allgemein bekannten Quellen zitiert, z. B. McCutcheon's Detergents and Emulsifiers und McCutcheon's Functional Materials, Allured Publishing Co., Ridgewood, N. J. Bevorzugte Lipide schließen DDAB:Cholesterol oder DOTAP:Cholesterol bei einem Molverhältnis von 1:1 ein.
  • B. Nukleinsäure
  • Die Lipid:Nukleinsäurekomplexe enthalten eine Nukleinsäure, typischerweise eine Expressionskassette, welche unter Anwendung rekombinater Techniken konstruiert wird. Eine rekombinante Nukleinsäure wird hergestellt, indem zuerst die Nukleinsäure von Interesse isoliert wird. Die isolierte Nukleinsäure wird dann in eine Kassette oder einen Vektor ligiert, welche(r) zur Expression des Gens geeignet ist. Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Nukleinsäure sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt (siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratom Manual (2. Ausgabe 1989)).
  • Das Gen von Interesse, zum Beispiel ein Gen, codierend ein therapeutisches Polypeptid, oder ein Reportergen, kann in einen "Expressionsvektor", "Klonierungsvektor" oder "Vektor" inseriert werden – Begriffe, welche üblicherweise Plasmide oder andere Nukleinsäuremoleküle bezeichnen, die zum Replizieren in einer gewählten Wirtszelle und zum Exprimieren des Gens von Interesse in der Lage sind. Expressionsvektoren können autonom replizieren oder sie können replizieren, indem sie in das Genom der Wirtszelle inseriert werden. Häufig ist es für ein Vektor wünschenswert, in mehr als einer Wirtszelle anwendbar zu sein, z. B. in E. coli zur Klonierung und Konstruktion, und in einer Sängerzelle zur Expression. Zusätzliche Elemente des Vektors können zum Beispiel selektierbare Marker und Enhancer einschließen. Selektierbare Marker, z. B. Tetracyclinresistenz oder Hygromycinresistenz, gestatten die Detektion und/oder Selektion derjenigen Zellen, welche mit den gewünschten DNA-Sequenzen transformiert wurden (siehe z. B. U.S.-Patent 4 704 362 ). Der jeweilige Vektor, der zum Transportieren der genetischen Information in die Zelle hinein verwendet wird, ist also nicht besonders kritisch. Beliebige der herkömmlichen Vektoren, welche für die Expression von rekombinanten Proteinen in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen verwendet werden, können eingesetzt werden.
  • Die Expressionsvektoren weisen typischerweise eine Transkriptionseinheit oder Expressionskassette auf, welche alle die Elemente enthält, die für die Expression der Nukleinsäure in den Wirts zellen erfordert werden. Eine typische Expressionskassette enthält einen Promotor in funktionsfähiger Verknüpfung an die DNA-Sequenz, welche ein Protein codiert. Der Promotor ist vorzugsweise etwa im gleichen Abstand von der heterologen Transkriptionsstartstelle positioniert, wie von der Transkriptionsstartstelle in ihrer natürlichen Situation. Wie es im Fachgebiet bekannt ist, kann jedoch eine gewisse Variation hinsichtlich dieses Abstands ohne Verlust der Promotorfunktion aufgenommen werden.
  • In der Expressionskassette kann die Nukleinsäuresequenz von Interesse so an eine Sequenz verknüpft sein, welche eine spaltbare Signalpeptid-Sequenz codiert, dass die Sekretion des codierten Proteins durch die transformierte Zelle gefördert wird. Die Expressionskassette sollte auch eine Transkriptionsterminationsregion stromabwärts des Strukturgens enthalten, um für eine effiziente Terminierung zu sorgen. Die Terminationsregion kann aus dem gleichen Gen wie die Promotorsequenz erhalten werden oder kann aus einem anderen Gen erhalten werden.
  • Für eine effizientere Translation der von dem Strukturgen codierten mRNA in Säugerzellen werden üblicherweise auch Polyadenylierungssequenzen an die Expressionskassette angefügt. Terminations- und Polyadenylierungssignale, welche für die vorliegende Erfindung geeignet sind, schließen diejenigen ein, welche aus SV40 abgeleitet sind, oder eine partielle genomische Kopie eines Gens, welches bereits auf dem Expressionsvektor vorhanden ist.
  • Zusätzlich zu der Expressionskassette schließen viele Expressionsvektoren in optimaler Weise Enhancer-Elemente ein, welche die Transkription von damit verknüpften homologen oder heterologen Promotoren aus bis zum 1000-fachen stimulieren können. Viele Enhancer-Elemente, welche aus Viren abgeleitet sind, weisen einen breiten Wirtsbereich auf und sind in einer Vielzahl von Geweben aktiv. Zum Beispiel ist der SV40-"Eearly"-Gen-Enhancer für viele Zelltypen geeignet. Andere Enhancer/Promotor-Kombinationen, welche für die vorliegende Erfindung geeignet sind, schließen diejenigen ein, welche aus Polyoma-Virus, humanem oder Maus-Cytomegalovirus, dem "Long Terminal Repeat" aus verschiedenen Retroviren, wie murinem Leukämievirus, murinem oder Rous-Sarkom-Virus und HIV abgeleitet sind (siehe Enhancers and Eukaryotic Expression (1983)).
  • Zusätzlich zu den oben erörterten rekombinanten Nukleinsäuren können auch synthetische Nukleinsäuren oder Oligonukleotide in der Erfindung verwendet werden. Als ein allgemeiner Punkt im Hinblick auf die in der Erfindung verwendeten Nukleinsäuren erkennt der Fachmann auf dem Gebiet, dass die in der Erfindung verwendeten Nukleinsäuren sowohl DNA- als auch RNA-Moleküle einschließen, sowie synthetische, nicht-natürlich vorkommende Analoge derselbigen, und Heteropolymere aus Desoxyribonukleotiden, Ribonukleotiden und/oder Analogen von jedem. Die besondere Zusammensetzung einer Nukleinsäure oder eines Nukleinsäureanalogs wird von dem Zweck, für den das Material verwendet werden wird, sowie von der Umgebung, in welcher das Material eingebracht werden wird, abhängen. Modifizierte oder synthetische, nicht- natürlich vorkommende Nukleotide sind entworfen worden, um einer Vielzahl von Zwecken zu dienen und um in einer Vielzahl von Umgebungen stabil zu bleiben, wie denjenigen, in welchen Nukleasen vorhanden sind, wie es im Fachgebiet allgemein bekannt ist. Modifizierte oder synthetische, nicht-natürlich vorkommende Nukleotide können, im Vergleich zu natürlich vorkommenden Ribo- oder Desoxyribonukleotiden, in Hinsicht auf das Kohlenhydrat (Zucker), die Phosphatbindung oder die Basenanteile der Nukleotide abweichen, oder können in einigen Fällen sogar eine Nicht-Nukleotidbase (oder überhaupt keine Base) enthalten (siehe z. B. Arnold et al., PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 89/02439 ). Zum Beispiel können die modifizierten oder nicht-natürlich vorkommenden Nukleinsäuren der Erfindung biotinylierte Nukleinsäuren, Omethylierte Nukleinsäuren, Methylphosphonat-Grundgerüst-Nukleinsäuren, Phosphorthioat-Grundgerüst-Nukleinsäuren oder Polyamid-Nukleinsäuren einschließen.
  • Oligonukleotide, wie nachstehend beschriebene Antisense-RNA, werden vorzugsweise auf einem Applied BioSystems- oder einem sonstigen kommerziell verfügbaren Oligonukleotidsynthesizer gemäß den vom Hersteller bereitgestellten Anweisungen synthetisiert. Oligonukleotide können unter Anwendung jedes geeigneten Verfahrens hergestellt werden, wie den Phosphotriester- und Phosphodiesterverfahren oder automatisierten Ausführungsformen davon. In einer solchen automatisierten Ausführungsform werden Diethylphosphoramidite als Ausgangsmaterialien verwendet und können synthetisiert werden, wie es von Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22: 1859 (1981), und U.S.-Patent Nr. 4 458 066 , beschrieben wurde.
  • C. Kondensierte Nukleinsäure
  • Es ist bekannt, dass kleine polykationische Moleküle Nukleinsäuren durch elektrostatische Ladung-Ladung-Wechselwirkungen kondensieren (Plum et al., Biopolymers 30: 631–643 (1990)). Die Vorbehandlung von Nukleinsäure mit Polyaminen kann daher die Anzahl von Ladungsstellen zum Komplexieren mit kationischen Liposomen verringern. Allerdings erzeugte die Kondensierung von Nukleinsäure vor der Lipidkomplexbildung das überraschende Ergebnis einer erhöhten Haltbarkeitsdauer für Lipid:Nukleinsäurekomplexe, wie gemessen durch die Transfektionseffizienz. Die mit einer solchen Vorbehandlung gebildeten Lipid:Nukleinsäurekomplexe waren bei einem geringeren Verhältnis von Lipid zu DNA, ohne Aggregation, stabil. Organische Polykationen, wie Polyamine, Polyamonium-Moleküle und basische Polyaminosäuren und ihre Derivate werden verwendet, um die Nukleinsäure vor der Lipidkomplexbildung zu kondensieren. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet Polyamine, wie Spermidin und Spermin, um die Nukleinsäure zu kondensieren (siehe z. B. Beispiel 1).
  • D. Hydrophiles Polymer
  • Es ist jüngst belegt worden, dass eine PEG-PE-Einbringung in Liposomen eine sterische Stabilisierung erzeugt, welche zu längeren Kreislaufzeiten im Blut führt (Allen et al., Biochim. Bi ophys. Acta 1066: 29–36 (1991); Papahadjopoulos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 11460–11464 (1991)). In der vorliegenden Erfindung verhindert das Inserieren von PEG-PE (z. B. 1% des Gesamt-Lipids) in die frisch gebildeten Lipid:Nukleinsäurekomplexe, dass die Komplexe während der Aufbewahrung aggregieren. Es war jedoch eine überraschende Feststellung, dass die Einbindung von PEG-PE die Transfektionsaktivität in vivo nicht inhibierte, und auch, dass die in-vitro-Transfektionsaktivität, welche inhibiert wurde, durch die Einbringung von Fab'-Fragment, welches am Ende des PEG-PE konjugiert war, zurückgewonnen wurde. Das Vorhandensein von hydrophilen Polymeren in dem Lipid:Nukleinsäurekomplex sieht eine erhöhte Haltbarkeitsdauer vor, wie durch Transfektionseffizienz nach einer Aufbewahrung gemessen wird. Daher ist es wünschenswert, ein hydrophiles Polymer, wie Polyethylenglykol(PEG)-modifizierte Lipide oder Gangliosid GM1, an die Liposomen hinzuzufügen. PEG kann auch mit anderen amphipathischen Molekülen derivatisiert werden, wie Fettsäuren, Sphingolipiden, Glykolipiden und Cholesterol. Die Zugabe solcher Komponenten verhindert eine Liposomen-Aggregation während der Kopplung der Targeting-Einheit an das Liposom. Diese Komponenten stellen auch eine Methode zum Erhöhen der Kreislauf-Lebensdauer der Lipid:Nukleinsäurekomplexe bereit.
  • Eine Anzahl verschiedener Verfahren kann für die Herstellung von PEG zum Einbringen in Liposomen angewandt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird PEG als PEG-derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) oder PEG-derivatisiertes Distearoylphosphatidylethanolamin (PEG-DSPE) eingebracht. Verfahren zur Herstellung von PEG-PE sind allgemein bekannt und beinhalten typischerweise die Verwendung von aktiviertem Methoxy-PEG (mit nur einem reaktiven Ende) und von PE. Somit kann PEG-Succinimidylsuccinat in einem basischen organischen Lösungsmittel umgesetzt werden (Klibanov et al., FEBS Lett. 268: 235–237 (1990)). Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur PEG-PE-Herstellung basiert auf der Reaktion des PEG mit Carbonyldiimidazol, gefolgt von der Zugabe von PE (siehe Woodle et al., Proc. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 17: 77–78 (1990); Papahadjopoulos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 11460–11464 (1991); Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1066: 29–36 (1991); Woodle et al., Biochim. Biophys. Acta 1105: 193–200 (1992); und Woodle et al., Period. Biol. 93: 349–352 (1991)). In ähnlicher Weise wird Cyanurchlorid-aktiviertes PEG in einem basischen organischen Lösungsmittel von Blume et. al., Biochim. Biophys. Acta 1029: 91–97 (1990), und U.S.-Patent Nr. 5 213 804 , beschrieben. Ein völlig anderes Vorgehen basiert auf der Kopplung des PEG mit im Voraus hergestellten Liposomen unter Verwendung von Tresylchloridaktiviertem PEG, welches dann Liposomen, die PE enthalten, bei hohem pH-Wert hinzugefügt wird (Senior et al., Biochim. Biophys. Acta 1062: 77–82 (1991)). Derivatisiertes PEG ist ebenfalls im Handel erhältlich. So ist beispielsweise PEG-PE von Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama) erhältlich. Der Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass viele andere Verknüpfungen verfügbar sind, z. B. PEG-verknüpfte Detergentien, wie Tweens, und die Insertion von PEG-derivatisiertem Lipid in gebildete Lipid:Nukleinsäurekomplexe.
  • E. Fab'-Antikörperfragment
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Lipid:Nukleinsäurekomplexe an das Fab'-Fragment eines Antikörpers konjugiert, welches als eine Targeting-Einheit wirkt, die ermöglicht, dass der Lipid:Nukleinsäurekomplex spezifisch an eine Zielzelle bindet, welche das Ziel-Molekül (z. B. charakteristischer Marker) trägt, gegen welches das Fab'-Antikörperfragment gerichtet ist. Kleinere Peptide aus der hypervariablen Region oder aus einem anderen Peptid, welches mit einem spezifischen Zelloberflächenligand wechselwirkt, können ebenfalls an die Komplexe konjugiert werden. Im Allgemeinen repräsentiert das Fab'-Fragment eines Antikörpers ein Monomer, umfassend die variablen Regionen und die CH1-Region eines Arms eines Antikörpers. Eine solche bevorzugte Ausführungsform wird im Beispiel 2 beschrieben.
  • Ein "Antikörper" bezieht sich auf ein Protein, bestehend aus einem oder mehreren Polypeptiden, welche im Wesentlichen von Immunglobulingenen oder Fragmenten von Immunglobulingenen codiert werden. Die erkannten Immunglobulingene schließen die Kappa-, Lambda-, Alpha-, Gamma-, Delta-, Epsilon- und Mu-Konstante-Region-Gene sowie die Myriaden von Genen der variablen Immunglobulin-Region ein. Leichtketten werden entweder als Kappa oder Lambda klassifiziert. Schwerketten werden als Gamma, Mu, Alpha, Delta oder Epsilon klassifiziert, welche ihrerseits die Immunglobulinklassen IgG, IgM, IgA, IgD bzw. IgE definieren.
  • Es ist bekannt, dass die grundlegende Immunglobulin(Antikörper)-Struktureinheit ein Tetramer umfasst. Jedes Tetramer ist aus zwei identischen Paaren von Polypeptidketten aufgebaut, wobei jedes Paar eine "leichte" (etwa 25 kD) und eine "schwere" Kette (etwa 50–70 kD) aufweist. Der N-Terminus jeder Kette definiert eine variable Region von etwa 100 bis 110 oder mehr Aminosäuren, welche hauptsächlich für die Antigenerkennung verantwortlich ist. Die Begriffe variable Leichtkette (VL) und variable Schwerkette (VH) beziehen sich auf diese leichten bzw. schweren Ketten.
  • Antikörper können als intakte Immunglobuline oder als eine Anzahl von gut charakterisierten Fragmenten existieren, welche durch Verdau mit verschiedenen Peptidasen hergestellt werden. Insbesondere verdaut Pepsin einen Antikörper unterhalb der Disulfidbindungen in der Gelenkregion unter Erzeugung von F(ab)'2, einem Dimer von Fab', welches selbst eine leichte Kette ist, verknüpft an VH-CH1 durch eine Disulfidbindung. Das F(ab)'2 kann unter milden Bedingungen reduziert werden, um die Disulfidbindung in der Gelenkregion zu zerbrechen, wodurch das F(ab)'2-Dimer in ein Fab'-Monomer umgewandelt wird. Das Fab'-Monomer ist im Wesentlichen ein Fab mit einem Teil der Gelenkregion (siehe Fundamental Immunology, Hrsg.: W. E. Paul, Rauen Press, N. Y. (1993), für weitere Antikörperfragment-Terminologie). Während das Fab'-Fragment in Hinsicht auf den Verdau eines intakten Antikörpers definiert ist, wird es der Fachmann richtig einschätzen, dass solche Fab'-Fragmente entweder chemisch oder durch Anwendung rekombinanter DNA-Methodik de novo synthetisiert werden können.
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Fab'-Fragmente können aus Antikörpern von tierischem (speziell Maus oder Ratte) oder menschlichem Ursprung abgeleitet werden oder können chimär (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851–6855 (1984)) oder humanisiert sein (Jones et al., Nature 321: 522–525 (1986), sowie veröffentlichte GB-Patentanmeldung Nr. 8707252 ).
  • Das Fab'-Fragment wird ausgewählt, um spezifisch an ein Molekül oder einen Marker zu binden, das/der für die Oberfläche der Zellen charakteristisch ist, an welche der Inhalt des kationischen Lipid:Nukleinsäurekomplexes gewünschtermaßen zugeführt werden soll. Ein Molekül ist charakteristisch für eine Zelle, ein Gewebe oder einen physiologischen Zustand, wenn dieses Molekül typischerweise in Assoziation mit diesem Zelltyp gefunden wird, oder alternativ dazu in einer Vielzahl von Zelltypen, welche alle einen besonderen physiologischen Zustand (z. B. Transformation) exprimieren. Ein spezifischer charakteristischer Marker wird vorzugsweise auf den Oberflächen von Zellen eines besonderen Gewebes oder Zelltyps oder auf den Oberflächen von Geweben oder Zellen, welche einen besonderen physiologischen Zustand exprimieren, und auf keinem anderen Gewebe oder Zelltyp in dem Organismus gefunden. Der Fachmann auf dem Gebiet wird jedoch erkennen, dass ein solcher Spiegel an Spezifität des Markers häufig nicht erforderlich ist. Zum Beispiel wird ein charakteristischer Zelloberflächenmarker ausreichende Gewebespezifität zeigen, wenn die einzigen bzw. nur die Nicht-Ziel-Gewebe für den Lipid:Nukleinsäurekomplex nicht zugänglich sind. Alternativ dazu kann eine effektive Spezifität durch Überexpression des Markers im Zielgewebe, im Vergleich zu anderen Geweben, erzielt werden. Dies wird zur einer präferenziellen Aufnahme durch das Zielgewebe führen, was zu einer effektiven Gewebespezifität führt. Somit sind beispielsweise viele Krebsarten durch die Überexpression von Zelloberflächenmarkern, wie dem HER2(c-erbB-2, neu)-Protoonkogencodierten Rezeptor, im Falle von Brustkrebs, gekennzeichnet.
  • Der Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass es zahlreiche Zelloberflächenmarker gibt, welche gute charakteristische Marker in Abhängigkeit von dem jeweiligen Gewebe bereitstellen, welches wunschgemäß angezielt werden soll. Diese Zelloberflächenmarker schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Kohlenhydrate, Proteine, Glykoproteine, MHC-Komplexe, Interleukine und Rezeptorproteine, wie HER-, CD4- und CD8-Rezeptorproteine, sowie andere Wachstumsfaktor- und Hormon-Rezeptorproteine ein.
  • Wachstumsfaktorrezeptoren sind besonders bevorzugte charakteristische Zelloberflächenmarker. Wachstumsfaktorrezeptoren sind Zelloberflächenrezeptoren, welche spezifisch Wachstumsfaktoren binden und dadurch eine zelluläre Antwort vermitteln, die charakteristisch für den jeweiligen Wachstumsfaktor ist. Der Begriff "Wachstumsfaktor", wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Protein- oder Polypeptidligand, welcher Zellteilung oder -differenzierung aktiviert oder stimuliert oder eine biologische Antwort stimuliert, wie Motilität oder Sekretion von Proteinen. Wachstumsfaktoren sind dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt und schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, (Blut)Plättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF), epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor (IGF), transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF-β), Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGF), Interleukin 2 (IL2), Nervenwachstumsfaktor (NGF), Interleukin 3 (IL3), Interleukin 4 (IL4), Interleukin 1 (IL1), Interleukin 6 (IL6), Interleukin 7 (IL7), Granulozyten/Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF), Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF), Makrophagen-Koloniestimulierenden Faktor (M-CSF), Erythropoietin, Interleukin13-Rezeptor (IL13R) und dergleichen ein. Der Fachmann auf dem Gebiet erkennt, dass der Begriff Wachstumsfaktor, wie hierin verwendet, im allgemeinen Cytokine und Kolonie-stimulierende Faktoren einschließt.
  • Besonders bevorzugte Marker werden in der HER-Familie von Wachstumsfaktorrezeptoren gefunden. Genauer gesagt werden HER1, HER2, HER3 und HER4 stärker bevorzugt, wobei HER2 am stärksten bevorzugt ist. Die HER-Rezeptoren umfassen Protein-Tyrosinkinasen, welche selbst hochspezifische Antikörperziele bereitstellen. Somit liefert, in einer Ausführungsform, die P185-Tyrosinkinase von HER2 ein am stärksten bevorzugtes Ziel für das Fab'-Fragment, das in den Immunolipid:Nukleinsäurekomplexen der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
  • Es ist davon auszugehen, dass der charakteristische Marker kein natürlich vorkommender Marker sein muss, sondern vielmehr in die jeweilige Zielzelle eingebracht werden kann. Dies kann bewerkstelligt werden durch direktes Markieren bzw. Tagging einer Zelle oder eines Gewebes mit einem jeweiligen Marker (z. B. durch direktes Injektionsbehandeln des jeweiligen Zielgewebes mit einem Marker, oder alternativ dazu durch Verabreichen eines Markers, welcher selektiv von dem Zielgewebe aufgenommen wird, an den gesamten Organismus. In einer Ausführungsform kann der Marker ein Genprodukt sein, welches von einer Nukleinsäure in einer Expressionskassette codiert wird. Das Markergen kann unter der Steuerung eines Promotors stehen, welcher nur in den besonderen Zielzellen aktiv ist. Daher wird die Einführung eines Vektors, der die Expressionskassette enthält, zur Expression des Markers lediglich in den jeweiligen Zielzellen führen. Der Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass es zahlreiche Vorgehen unter Anwendung von rekombinanter DNA-Methodik gibt, um charakteristische Marker in Zielzellen einzubringen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Targeting-Einheit spezifisch Produkte oder Komponenten eines Wachstumsfaktorrezeptors binden, insbesondere Produkte des HER2(c-erbB-2, neu)-Protoonkogens. Es wird besonders bevorzugt, dass die Targeting-Einheit die von HER2 codierte Wachstumsfaktor-Rezeptortyrosinkinase, Protein p185HER2, bindet, welche üblicherweise in Brustkrebs-Arten überexprimiert wird (Slamon et al., Science 235: 177–182 (1987)). Andere geeignete Ziele für die Targeting-Einheit schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, EGFR (HER1), HER3 und HER4, Kombinationen dieser Rezeptoren und andere mit Krebsarten assoziierte Marker ein. Andere Antikörper von Interesse schließen, ohne je doch darauf eingeschränkt zu sein, BR96 (Friedman et al., Cancer Res. 53: 334–339 (1993), e23 bis erbB2 (Batra et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA 89: 5867–5871 (1992)), PR1 in Prostatakrebs (Brinkmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 547–551 (1993)) und K1 in Eierstockkrebs (Chang et al., Int. J. Cancer 50: 373–381 (1992)) ein.
  • II. Herstellung von Liposomen
  • Eine Vielzahl von Verfahren ist für die Herstellung von Liposomen verfügbar, wie z. B. beschrieben in Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980); U.S.-Patente Nr. 4 186 183 , 4 217 344 , 4 235 871 , 4 261 975 , 4 485 054 , 4 501 728 , 4 774 085 , 4 837 028 , 4 946 787 ; PCT-Veröffentlichungen Nr. WO 91/17424 ; Szoka & Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sd. USA 75: 4194–4198 (1978); Deamer & Bangham, Biochim. Biophys. Acta 443: 629–634 (1976); Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 3348–3352 (1979); Hope et al., Biochim. Biophys. Acta 812: 55–65 (1985); Mayer et al., Biochim. Biophys. Acta 858: 161–168 (1986); Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 242–246 (1988), Liposomes, Kap. 1 (Hrsg.: Ostro, 1983); und Hope et al., Chem. Phys. Lip. 40: 89 (1986). Geeignete Verfahren schließen z. B. Schallbehandlung, Extrusion, Hochdruck/Homogenisierung, Mikrofluidisierung, Detergens-Dialyse, Calciuminduzierte Fusion von kleinen Liposomenvesikeln und Ether-Infusionsverfahren ein, welche alle im Fachgebiet allgemein bekannt sind. Ein Verfahren erzeugt multilamellare Vesikel von heterogenen Größen. In diesem Verfahren werden die Vesikel-bildenden Lipide in einem geeigneten organischen Lösungsmittel oder Lösungsmittelsystem gelöst und unter Vakuum oder einem Inertgas getrocknet, wodurch ein dünner Lipidfilm gebildet wird. Falls gewünscht, kann der Film in einem geeigneten Lösemittel, wie tertiärem Butanol, erneut gelöst werden und dann lyophilisiert werden, um ein homogeneres Lipidgemisch zu bilden, welches in einer einfacher hydratisierten, pulverartigen Form vorliegt. Dieser Film wird mit einer wässrigen gepufferten Lösung bedeckt und hydratisieren gelassen, und zwar typischerweise über eine Dauer von 15–60 Minuten unter Bewegung. Die Größenverteilung der resultierenden multilamellaren Vesikel kann in Richtung zu kleineren Größen verschoben werden durch Hydratisieren der Lipide unter heftigeren Bewegungsbedingungen oder durch Hinzufügen von solubilisierenden Detergentien, wie Desoxycholat.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden zumeist unilamellare Liposomen durch das Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren von Szoka & Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 4194–4198 (1978) hergestellt.
  • Unilamellare Vesikel werden im Allgemeinen durch Schallbehandlung oder Extrusion hergestellt. Schallbehandlung wird im Allgemeinen mit einem Sonifikator vom Bad-Typ, wie einem "Branson Tip"-Sonifikator, bei einer regulierten Temperatur durchgeführt, wie bestimmt durch den Schmelzpunkt des Lipids. Die Extrusion kann durch Biomembran-Extruder durchgeführt werden, wie dem "Lipex Biomembrane Extruder". Die definierte Porengröße in den Extrusionsfiltern kann unilamellare liposomale Vesikel von spezifischen Größen erzeugen. Die Liposomen können auch durch Extrusion durch einen asymmetrischen Keramikfilter gebildet werden, wie einen Ceraflow Microfilter, welcher von der Norton Company, Worcester MA, im Handel erhältlich ist.
  • Im Anschluss an die Liposomenherstellung, können die Liposomen, welche während der Bildung nicht größenklassiert bzw. gesiebt worden sind, durch Extrusion größenklassiert werden, um einen gewünschten Größenbereich und eine relativ schmale Verteilung von Liposomengrößen zu erzielen. Ein Größenbereich von etwa 0,2–0,4 Mikrometer ermöglicht, dass die Liposomensuspension durch Filtration durch einen herkömmlichen Filter sterilisiert werden kann, typischerweise einen 0,22-Mikrometer-Filter. Das Filtersterilisations-Verfahren kann auf einer Hochdurchsatz-Basis ausgeführt werden, wenn die Liposomen auf etwa 0,2–0,4 Mikrometer herunter klassiert worden sind.
  • Mehrere Techniken zum Klassieren von Liposomen zu einer gewünschten Größe sind verfügbar. Ein Klassierungsverfahren ist in den U.S.-Patenten Nr. 4 529 561 oder 4 737 323 beschrieben. Die Schallbehandlung einer Liposomensuspension entweder durch Bad- oder Sonden-Schallbehandlungsvorgehen erzeugt eine progressive Größenverringerung hinunter bis zu kleinen unilamellaren Vesikeln mit einer Größe von weniger als etwa 0,05 Mikrometern. Homogenisierung ist ein anderes Verfahren, welches auf Scherenergie beruht, um große Liposomen zu kleineren zu fragmentieren. In einem typischen Homogenisierungsvorgehen werden multilamellare Vesikel durch einen Standard-Emulsions-Homogenisator rezirkuliert, bis ausgewählte Liposomengrößen, typischerweise zwischen etwa 0,1 und 0,5 Mikrometer, beobachtet werden. Die Größe der liposomalen Vesikel kann durch Quasi-Elektrische-Lichtstreuung (QELS) ermittelt werden, wie beschrieben in Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10: 421–450 (17981). Der durchschnittliche Liposomendurchmesser kann durch Schallbehandlung von gebildeten Liposomen verringert werden. Unterbrochene Schallbehandlungs-Zyklen können mit QELS-Überprüfung abgewechselt werden, um eine effiziente Liposomensynthese zu leiten.
  • Die Extrusion von Liposomen durch eine kleinporige Polycarbonatmembran oder eine asymmetrische Keramikmembran ist ebenfalls ein effektives Verfahren zur Verringerung von Liposomengrößen zu einer relativ gut definierten Größenverteilung. Typischerweise wird die Suspension ein- oder mehrmals durch die Membran zirkuliert, bis die gewünschte Liposomengrößenverteilung erreicht ist. Die Liposomen können durch sukzessiv kleinporigere Membranen extrudiert werden, um eine allmähliche Verringerung der Liposomengröße zu erzielen. Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung weisen Liposomen eine Größe von etwa 0,05 Mikrometer bis etwa 0,5 Mikrometer auf. Stärker bevorzugt werden Liposomen, welche eine Größe von etwa 0,05 bis 0,2 Mikrometer aufweisen.
  • III. Bildung von Lipid:Nukleinsäurekomplexen
  • Es wurde festgestellt, dass stabilisierte Lipid:Nukleinsäurekomplexe (z. B. aufweisend kondensierte Nukleinsäure und/hydrophiles Polymer) dazu neigen, keine sichtbaren großen Aggregate zu bilden, und eine erhöhte Transfektionseffizienz und Haltbarkeitsdauer aufweisen. Nukleinsäure/Liposom-Verhältnisse zur Herstellung von Lipid:Nukleinsäurekomplexen, welche keine sichtbaren großen Aggregate bilden, können vom Fachmann auf dem Gebiet bestimmt werden. Typischerweise wird das Verhältnis bestimmt durch Mischen festgelegter Mengen einer Nukleinsäure, z. B. eines Plasmids, mit verschiedenen Mengen an Liposomen (siehe Beispiel 1). Im Allgemeinen werden Lipid:Nukleinsäurekomplexe gebildet, indem man die Nukleinsäure (z. B. Plasmid-DNA) in eine Liposomensuspension mit gleichem Volumen pipettiert und rasch vermischt. Routinemäßig bilden Liposomen, welche 5–15 nmol eines Lipids wie DDAB oder DOPE (wie oben beschrieben) enthalten, einen Komplex mit 1 μg Plasmid ohne Bildung von sichtbaren großen Aggregaten. Die Untersuchung hinsichtlich sichtbarer großer Aggregate wird typischerweise ohne Hilfe eines Mikroskops durchgeführt. Der Endpunkt der Titration der Mengen an Lipid und Nukleinsäure wird auch durch Assay hinsichtlich erhöhter Transfektionseffizienz, entweder in vitro oder in vivo, im Vergleich zu einer nicht-stabilisierten Kontrolle (wie nachstehend beschrieben), erreicht.
  • Um die Lipid:Nukleinsäurekomplexe von der Bildung großer Aggregate und vom Verlust an transfizierender Aktivität über die Zeit abzuhalten, werden zwei Vorgehensweisen eingeschlagen: (1) Einbinden einer kleinen Menge eines hydrophilen Polymers, wie PEG-PE (ungefähr 1% Molverhältnis) in Lipid:Nukleinsäurekomplexe innerhalb weniger Minuten nach ihrer Herstellung; und/oder (2) Kondensieren der Nukleinsäure mit einem Polykation, wie einem Polyamin (z. B. ungefähr 0,05 bis 5,0 nmol Spermidin pro μg DNA) vor dem Mischen mit den Liposomen. Die optimale Menge der Polyamine und des hydrophilen Polymers kann vom Fachmann auf dem Gebiet bestimmt werden durch Titrieren des Polyamins oder hydrophilen Polymers mit der Nukleinsäure, sodass die gebildeten Komplexe keine großen, z. B. sichtbaren, Aggregate bilden. Die Größe dieser Lipid:Nukleinsäurekomplexe kann durch dynamische Lichtstreuung als im Bereich von 410 ± 150 nm eingeschätzt werden. Der Endpunkt der Titration wird auch erreicht durch Assay hinsichtlich erhöhter Transfektionseffizienz entweder in vitro oder in vivo, im Vergleich zu einer nicht-stabilisierten Kontrolle (wie nachstehend beschrieben).
  • IV. Transfektion und Gentherapie mit Lipid:Nukleinsäurekomplexen
  • Die vorliegende Offenbarung sieht Lipid:Nukleinsäurekomplexe, welche eine erhöhte Haltbarkeitsdauer haben, zur Transfektion von Säugerzellen in vitro, in vivo und ex vivo, sowie Verfahren zur Herstellung und Transfektion solcher Komplexe vor. Dies beruht zum Teil auf der unerwarteten Feststellung, dass ein Lipid:Nukleinsäurekomplex, welcher Nukleinsäure umfasst, die durch Kontakt mit einem organischen Polykation kondensiert worden ist, eine erhöhte Haltbar keitsdauer aufzeigt. Darüber hinaus beruht dies auf der unerwarteten Feststellung, dass ein Lipid:Nukleinsäurekomplex, welcher nach der Lipid:Nukleinsäurekomplex-Bildung mit einem hydrophilen Polymer gemischt wird, eine hohe Transfektionsaktivität und erhöhte Haltbarkeitsdauer, wie gemessen durch die Transfektionsaktivität nach der Aufbewahrung, aufzeigt. Derartige Lipid:Nukleinsäurekomplexe mit einer erhöhten Haltbarkeitsdauer sind z. B. nützlich für in-vitro- und ex-vivo-Transfektion von Zellen und für die Zuführung von Nukleinsäuren in Zellen für Säuger-Gentherapie in vivo und im Anschluss an intravenöse Verabreichung.
  • Die Verwendung von Lipid:Nukleinsäurekomplexen zum Zuführen von Nukleinsäuren in verschiedene Säugerzelltypen führt zu einem sicheren Transferverfahren und einer hohen Effizienz des Gentransfers. Die Transfektion von Zellen in vivo mit Lipid:Nukleinsäurekomplexen ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und kann unter Anwendung von Standardtechniken durchgeführt werden, wie sie im Beispiel 1 erörtert sind (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausgabe 1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995)).
  • Jedwede heterologe Nukleinsäure, welche zur Einführung in eine Wirtszelle geeignet ist, kann vom Fachmann auf dem Gebiet verwendet werden. Für Gentherapie nützliche Gene können unter Anwendung der Verfahren und Vektoren dieser Erfindung in Säuger eingeführt werden. Gene, welche Blutproteine, Enzyme, Hormone, Ribozyme, Antisense-RNA, virale Inhibitoren und Ionenkanalproteine codieren, sind Beispiele für heterologe Nukleinsäuren, die in der Gentherapie nützlich sind. Ein funktionales heterologes Gen kann verwendet werden, um ein mutiertes Gen in einem Säuger unter Anwendung von Gentherapie zu ersetzen. Zum Beispiel kann das β-Globin codierende Gen verwendet werden, um β-Thalassämie zu behandeln; und das CFTR codierende Gen kann verwendet werden, um cystische Fibrose zu behandeln. Gene, welche selektierbare Marker codieren, wie diejenigen, welche Antibiotikumresistenz vermitteln, können verwendet werden, um mit dem Lipid:Nukleinsäurekomplex transfizierte Zellen nachzuweisen und zu isolieren. Reportergene, wie Luciferase, β-Galactosidase, Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT), humanes Wachstumshormon (hGH) und das Grün-fluoreszente Protein (GFP), sind bevorzugte Beispiele von Genen, welche in Assays zum Bestimmen der Transfektionseffizienz verwendet werden können. Luciferase kann als ein Reportergen verwendet werden, um die Transfektionseffizienz zu bestimmen.
  • Die Transfektionseffizienz eines Reportergens kann mit einem Assay bestimmt werden, welcher für das verwendete Reportergen geeignet ist. Solche Assays sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Zum Beispiel ist der HGH-Reporter-Assay immunologisch basiert und verwendet im Handel erhältliche Radioimmunassay-Kits. Vorzugsweise wird der Luciferase-Assay angewandt, um die Transfektion und Expression des Luciferase-Reportergens nachzuweisen. Der Luciferase-Assay wird bevorzugt, weil er hochempfindlich ist und keine Radioaktivität anwendet. Ein Lu minometer kann verwendet werden, um die Luciferase-Enzymaktivität zu messen, wie es im Beispiel 1 beschrieben wird.
  • Gentherapie stellt Verfahren zur Bekämpfung von chronischen Infektionskrankheiten, wie HIV-Infektion, sowie nicht-infektiösen Krankheiten, wie Krebs und Geburtsfehlern bereit (siehe im allgemeinen, Anderson, Science 256: 808–-813 (1992); Yu et al., Gene Ther. 1: 13–26 (1994)). Gentherapie kann angewandt werden, um Zellen entweder mit einem Ex-vivo- oder einem In-vivo-Vorgehen zu transduzieren. Ex-vivo-Verfahren für die Gentherapie beinhalten das Transduzieren der Zellen außerhalb des Säugers mit einem Lipid:Nukleinsäurekomplex dieser Erfindung und das Wiedereinbringen der Zellen in den Organismus. Die Zellen können hämatopoietische Stammzellen sein, welche aus dem Knochenmark isoliert wurden, oder andere Zellen, welche mittels Lipid:Nukleinsäurekomplexen transfiziert werden können.
  • Im Menschen können hämatopoietische Stammzellen aus einer Vielzahl von Quellen erhalten werden, einschließlich Nabelschnurblut, Knochenmark und mobilisierten peripherem Blut. Die Reinigung von CD34+-Zellen kann durch Antikörper-Affinitätsverfahrensweisen bewerkstelligt werden (siehe Ho et al., Stem Cells 13 (Suppl. 3): 100–105 (1995); siehe auch Brenner, J., Hematotherapy 2: 7–17 (1993)). Zellen können auch aus Patienten isoliert und kultiviert werden. Alternativ dazu können die für ex-vivo-Verfabrensweisen verwendeten Zellen diejenigen sein, welche in einer Zellbank gelagert sind (z. B. einer Blutbank). Der Vorteil bei der Verwendung von Stammzellen besteht darin, dass sie in vitro zu anderen Zelltypen differenziert werden können oder in einen Säuger (wie den Spender der Zellen) eingebracht werden können, wo sie sich im Knochenmark einnisten werden. Verfahren zur Differenzierung von Knochenmarkzellen in vitro zu klinisch bedeutsamen Immunzelltypen unter Verwendung von Cytokinen, wie GM-CSF, IFN-γ und TNF-28, sind bekannt (siehe z. B. Inaba et al., J. Exp. Med. 176: 1693–1702 (1992)).
  • Die Zuführung einer Nukleinsäure kann ebenfalls unter Verwendung von In-vivo-Gentherapie bewirkt werden. Die Lipid:Nukleinsäurekomplexe der Erfindung können direkt an einen Patienten, vorzugsweise an einen Menschen, verabreicht werden. In-vivo- und Ex-vivo-Verabreichung erfolgt durch eine Beliebige der Routen, welche normalerweise zur Einführung eines Moleküls oder einer Zelle in den letztendlichen Kontakt mit Blut oder Gewebezellen angewandt werden. Lipid:Nukleinsäurekomplexe der Erfindung werden auf eine beliebige geeignete Weise verabreicht, vorzugsweise mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern.
  • Geeignete Verfahren zur Verabreichung solcher nicht-viralen Partikel im Kontext der vorliegenden Erfindung an einen Patienten sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen unter Anwendung von Aerosol-Verabreichung (z. B. unter Verwendung eines Zerstäubers oder einer anderen Aerosolierungs-Vorrichtung) und parenteral, d. h. intra-arteriell, intravenös, intraperitoneal, subkutan oder intramuskulär, verabreicht. Weiter bevorzugt werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen durch Aerosol-Verabreichung oder intravenös oder intraperitoneal durch eine Bolus-Injektion verabreicht. Besondere Formulierungen, welche für diese Verwendung geeignet sind, findet man in Remington's Pharmaceutical Sciences (17. Auflage, 1985). Typischerweise werden die Formulierungen eine Lösung der Lipid:Nukleinsäurekomplexe umfassen, welche in einem annehmbaren Träger, vorzugsweise in einem wässrigen Träger, suspendiert ist.
  • V. Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die Lipid:Nukleinsäurekomplexe umfassen, werden gemäß Standardtechniken hergestellt und umfassen ferner einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Im Allgemeinen wird normale Kochsalzlösung als der pharmazeutisch annehmbare Träger verwendet. Andere geeignete Träger schließen z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, isotonische Lösung (z. B. Dextrose), 0,4% Kochsalzlösung, 0,3% Glycin und dergleichen ein, einschließlich Glykoproteinen für eine gesteigerte Stabilität, wie Albumin, Lipoprotein, Globulin etc. Diese Zusammensetzungen können durch herkömmliche, allgemein bekannte Sterilisierungstechniken sterilisiert werden. Die resultierenden wässrigen Lösungen können zur Verwendung verpackt oder unter aseptischen Bedingungen filtriert und lyophilisiert werden, wobei das lyophilisierte Präparat, vor der Verabreichung, mit einer sterilen wässrigen Lösung vereinigt wird. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen nach Bedarf enthalten, um physiologische Bedingungen anzunähern, wie pH-einstellende und puffernde Mittel, Tonizitäts-einstellende Mittel und dergleichen, zum Beispiel Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid etc. Darüber hinaus kann die Lipid:Nukleinsäurekomplex-Suspension lipidschützende Mittel einschließen, welche Lipide gegen Freiradikal- und Lipid-peroxidative Schäden bei der Aufbewahrung schützen. Lipophile Freiradikal-Abfangmittel, wie Alphatocopherol und wasserlösliche, eisenspezifische Chelatbildner, wie Ferrioxamin, sind geeignet.
  • Die Konzentration von Lipid:Nukleinsäurekomplexen in den pharmazeutischen Formulierungen kann in breitem Maße, d. h. von weniger als etwa 0,05%, üblicherweise bei oder bei mindestens etwa 2–5%, bis so viel wie 10 bis 30 Gew.-%, variieren und wird hauptsächlich nach den Fluidvolumina, Viskositäten etc. gemäß der gewählten besonderen Art der Verabreichung ausgewählt. Zum Beispiel kann die Konzentration erhöht werden, um die mit der Behandlung assoziierte Fluidbelastung zu verringern. Dies kann besonders wünschenswert bei Patienten sein, welche ein mit Atherosklerose assoziiertes kongestives Herzversagen oder schwerere Hypertension aufweisen. Alternativ dazu können aus irritierenden Lipiden zusammengesetzte Immunlipid:Nukleinsäurekomplexe zu geringen Konzentrationen verdünnt werden, um eine Entzündung an der Stelle der Verabreichung zu verringern. Die Menge an verabreichtem Lipid:Nukleinsäurekomplex wird von dem verwendeten jeweiligen Fab', dem behandelten Krankheitszustand und der Beurteilung des Arztes abhängen. Im Allgemeinen wird die Menge an verabreichten Lipid:Nukleinsäurekomplexen ausreichend sein, um eine therapeutisch wirksame Dosis der Nuk leinsäure zuzuführen. Die zur Zuführung einer therapeutisch wirksamen Dosis notwendige Menge an Lipid:Nukleinsäurekomplex kann vom Fachmann auf dem Gebiet bestimmt werden. Typische Lipid:Nukleinsäurekomplex-Dosierungen werden allgemein zwischen etwa 0,01 und etwa 50 mg Nukleinsäure pro Kilogramm Körpergewicht, vorzugsweise zwischen etwa 0,1 und etwa 10 mg Nukleinsäure/kg Körpergewicht und am stärksten bevorzugt zwischen etwa 2,0 und etwa 5,0 mg Nukleinsäure/kg Körpergewicht liegen. Für eine Verabreichung an Mäuse beträgt die Dosis typischerweise 50–100 μg je 20 g Maus.
  • VI. Assay der Blut-Halbwertszeit
  • Eine Hilfe für die Lipid:Nukleinsäurekomplex-Lokalisierung in einem Zielgewebe ist eine verlängerte Lipid:Nukleinsäurekomplex-Lebensdauer im Blutstrom im Anschluss an eine Verabreichung. Ein Maß der Lipid:Nukleinsäurekomplex-Lebensdauer im Blutstrom ist das Blut/RES-Verhältnis, welches an einem ausgewählten Zeitpunkt nach der Komplex-Verabreichung bestimmt wird. Typischerweise werden Lipid:Nukleinsäurekomplexe, welche eine Markierung (z. B. fluoreszenter Marker, elektronendichtes Reagenz oder radioaktiver Marker) entweder intern im Komplex oder gebunden an ein im Komplex beinhaltetes Lipid enthalten, in den Testorganismus injiziiert. Eine festgelegte Zeitspanne später, wird der Organismus getötet, und die Menge an im Blut nachgewiesener Markierung (z. B. durch Messen der Lumineszenz oder durch Szintillationszählung) wird mit derjenigen verglichen, welche in jeweiligen Geweben (z. B. Leber oder Milz) lokalisiert ist.
  • Der Zeitverlauf der Retention von Lipid:Nukleinsäurekomplexen im Blut kann auch einfach bestimmt werden durch Probenentnahme von Blut bei festgelegten Intervallen nach der Verabreichung von Markierung enthaltenden Lipid:Nukleinsäurekomplexen und Ermitteln der Menge an Markierung, welche im Kreislauf bleibt. Das Ergebnis kann als der Bruchteil der ursprünglichen Dosis ausgedrückt werden.
  • VII. Assay der Gewebetransfektion durch die Lipid:Nukleinsäurekomplexe
  • Die Transfektion von Zielzellen durch die Lipid:Nukleinsäurekomplexe dieser Erfindung kann in ähnlicher Weise durch Verabreichen von Lipid:Nukleinsäurekomplexen bestimmt werden, welche eine Nukleinsäure enthalten, die an sich nachweisbar ist oder die ein nachweisbares Produkt codiert. Biologische Proben (z. B. Gewebebiopsien oder Fluidproben) werden dann abgenommen und hinsichtlich Transfektion durch Nachweisen der Gegenwart der transfizierten Nukleinsäure selbst oder durch Nachweisen der Gegenwart des exprimierten Produkts der Nukleinsäure geassayt.
  • Die Nukleinsäure selbst kann gewählt werden, um eine Sequenz aufzuweisen, welche leicht, z. B. durch Nukleinsäure-Amplifikation, nachweisbar ist. In diesem Fall wird die Nukleinsäure selektiert, welche Primerstellen aufweist, die so ausgewählt sind, dass sie eine einzigartige Amplifikation der vorliegenden Nukleinsäure und keiner anderen in der Probe des biologischen Gewebes ermöglichen, welches hinsichtlich der Transfektion zu testen ist.
  • Methoden zum Nachweisen von spezifischen DNA-Sequenzen sind dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt. Zum Beispiel können Oligonukleotidsonden verwendet werden, welche gewählt sind, um komplementär zu einer ausgewählten Teilsequenz innerhalb[mit] der Region zu sein. Alternativ dazu können Sequenzen oder Teilsequenzen durch eine Vielzahl von DNA-Amplifikationstechniken amplifiziert werden, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Polymerasekettenreaktion (PCR) (Inns et al., PCR Protocols: A guide to Methods and Application (1990)), Ligase-Kettenreaktion (LCR) (siehe Wu & Wallace, Genomics 4: 560 (1989); Landegren et al., Science 241: 1077 (1988); Barringer et al., Gene 89: 117 (1990), Transkriptionsamplifikation (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173 (1989)) und selbst-ablaufender Sequenzreplikation (Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874 (1990)).
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird Transfektion durch Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit oder Quantifizieren eines Genprodukts in einem oder mehreren Geweben ausgewertet. Ein beliebiges Gen, welches ein leicht zu testendes Produkt exprimiert, wird einen geeigneten Indikator für den vorliegenden Assay bereitstellen. Geeignete Reportergene sind dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt. Sie schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, bakterielle Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT), beta-Galactosidase oder Luciferase (siehe z. B. Alam et al., Analytical Biochemistry 188: 245–254 (1990)) ein. Ein besonders bevorzugtes Reportergen ist das Fflux-Gen, wie es in den Beispielen veranschaulicht wird.
  • VIII. Assay der Haltbarkeitsdauer
  • Wie oben angegeben, wird der Begriff "Haltbarkeitsdauer" hierin verwendet, um Bezug auf die Zeitdauer zu nehmen, während der der Lipid:Nukleinsäurekomplex aufbewahrt werden kann (unter definierten Bedingungen, z. B. in Puffer bei 4°C), bevor er seine biologische Aktivität verliert. Die biologische Aktivität, welche zur Ermittlung der Haltbarkeitsdauer in der vorliegenden Erfindung getestet wird, ist das Vermögen des Lipid:Nukleinsäurekomplexes, Säugerzellen in vivo nach einer intravenösen Verabreichung zu transfizieren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Haltbarkeitsdauer bestimmt durch Aufbewahren der Lipid:Nukleinsäurekomplexe während variierenden Zeitdauern, Injizieren des Komplexes in ein oder mehrere Versuchstiere und Assay ausgewählter Gewebe in dem Tier hinsichtlich Transfektion (z. B. Expression eines Reportergens), wie oben beschrieben und in den Beispielen veranschaulicht.
  • Es wird davon ausgegangen, dass die Haltbarkeitsdauer als Absolutangabe ausgedrückt werden kann, d. h. die Länge der Zeit, während der die Zusammensetzung vor Verlust von Aktivität aufbewahrt werden kann. Alternativ dazu kann die Haltbarkeitsdauer als Relativangabe unter Bezugnahme auf eine andere Zusammensetzung ausgedrückt werden. Wenn der vorliegende Komplex nach einer festgelegten Aufbewahrungsdauer eine Transfektionsaktivität zeigt und diese Aktivität größer ist als die Aktivität eines unterschiedlichen Komplexes, der während der gleichen Zeitspanne in ähnlicher Weise aufbewahrt wurde, sagt man zum Beispiel, dass der vorliegende Komplex somit eine erhöhte Haltbarkeitsdauer im Vergleich zu dem unterschiedlichen Komplex aufweist.
  • IX. Ziellenken von Lipid:Nukleinsäurekomplexen zu spezifischen Geweben
  • Es können spezifische Targeting-Einheiten mit den Lipid:Nukleinsäurekomplexen der Erfindung verwendet werden, um spezifische Zellen oder Gewebe anzuzielen. So stellt die Verwendung einer Targeting-Einheit in Kombination mit einem generischen bzw. allgemeinen Effektor-Lipid:Nukleinsäurekomplex die Fähigkeit bereit, den Komplex für die Zuführung zu spezifischen Zellen und Geweben zweckmäßig zu gestalten.
  • Beispiele von Effektoren in Lipid:Nukleinsäurekomplexen schließen Nukleinsäuren, welche Cytotoxine (z. B. Diphtherietoxin (DT), Pseudomonas-Exotoxin A (PE), Pertussistoxin (PT) und die Pertussis-Adenylcyclase (CYA)) codieren, Antisense-Nukleinsäure, Ribozyme, markierte Nukleinsauren und Nukleinsäuren, welche Tumorsuppressorgene wie p53, p110RB und p72 codieren, ein. Diese Effektoren können mit einer Targeting-Einheit spezifisch zu Zellen, wie Krebszellen, Immunzellen (z. B. B- und T-Zellen) und anderen gewünschten zellulären Zielen, gelenkt werden. Wie oben beschrieben, sind zum Beispiel viele Krebsarten durch die Überexpression von Zelloberflächenmarkern, wie HER2, welches in Brustkrebszellen exprimiert wird, oder IL17R, welches in Gliomen exprimiert wird, gekennzeichnet. Targeting-Einheiten, wie Anti-HER2- und Anti-IL17R-Antikörper oder -Antikörperfragmente werden verwendet, um den Lipid:Nukleinsäurekomplex an die Zelle der Wahl zuzuführen. Das Effektormolekül wird somit zu dem spezifischen Zelltyp zugeführt, wodurch eine nützliche und spezifische therapeutische Behandlung bereitgestellt wird.
  • X. Lipid:Nukleinsäurekomplex-Kits
  • Die vorliegende Offenbarung sieht auch Kits zur Herstellung der oben beschriebenen Lipid:Nukleinsäurekomplexe vor. Derartige Kits können aus leicht verfügbaren Materialien und Reagenzien, wie oben beschrieben, hergestellt werden. Zum Beispiel können solche Kits ein beliebiges oder mehrere der folgenden Materialien umfassen: Liposomen, Nukleinsäure (kondensiert oder unkondensiert), hydrophile Polymere, hydrophile Polymere, die mit Targeting- Einheiten, wie Fab'-Fragmenten, derivatisiert sind, und Anweisungen. Eine weite Vielzahl von Kits und Komponenten kann gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, abhängig von dem beabsichtigten Anwender des Kits und den jeweiligen Anforderungen des Anwenders. Zum Beispiel kann das Kit eine Beliebige von einer Reihe von Targeting-Einheiten zum Ziellenken des Komplexes zu einem spezifischen Zelltyp enthalten, wie oben beschrieben.
  • Das Kit kann gegebenenfalls Anweisungsmaterialien einschließen, welche Anleitungen (d. h. Protokolle) enthalten, welche die Anwendung des kationischen Lipid:Nukleinsäurekomplexes zum Transfizieren von Zellen in vivo, ex vivo oder in vitro ermöglichen. Typischerweise beschreiben die Anweisungsmaterialen die Verfahrensweise zum Bereiten des Lipid:Nukleinsäurekomplexes aus Liposomen und Nukleinsäure, wie oben beschrieben. Die Anweisungsmaterialien beschreiben ebenfalls, wie das hydrophile Polymer mit dem Lipid:Nukleinsäurekomplex zu vermischen ist. Darüber hinaus können die Anweisungsmaterialien Verfahrensweisen zum Transfizieren von Zellen mit dem Lipid:Nukleinsäurekomplex beschreiben.
  • Obgleich die Anweisungsmaterialien typischerweise geschriebene oder gedruckte Materialien umfassen, sind sie nicht derartig eingeschränkt. Jedwedes Medium, das zum Speichern solcher Anweisungen und zum Mitteilen dieser an einen Endverbraucher in der Lage ist, wird von dieser Erfindung in Betracht gezogen. Solche Medien schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, elektronische Speichermedien (z. B. Magnetscheiben, Bänder, Kassetten, Chips), optische Medien (z. B. CD-ROM) und dergleichen ein. Derartige Medien können Adressen von Internetseiten einschließen, welche solche Anweisungsmaterialien bereitstellen.
  • XI. Herstellung von lipidischen Mikropartikeln mit Oberflächen-befestigten Proteinen
  • A. Allgemeines
  • Die vorliegende Erfindung sieht die Bereitung von lipidischen Mikropartikeln mit an der Oberfläche befestigten Proteinen vor. Wie im oben aufgeführten "Hintergrund"-Abschnitt angemerkt, lehrt das Fachgebiet, dass lösliche Proteine, wie Antikörper, so groß sind, dass ihre Tendenz zur Solubilisierung der Tendenz einer hydrophoben Domäne eines an dem Protein befestigten Linkermoleküls, stabil mit einem lipidischen Mikropartikel verbunden zu werden, überlegen ist. Daher war die Lehrmeinung, dass, während, an ein Linkermolekül von ungefähr gleicher oder höherer Größe konjugierte, kleine Peptide ermöglichen könnten, dass die hydrophobe Domäne eines Linkermoleküls stabil mit einem lipidischen Mikropartikel verbunden wird, Proteine, welche an ein Linkermolekül, das viel kleiner als das Protein ist, konjugiert sind, nicht in der Lage sind, dies zu vollbringen.
  • Wir haben nun festgestellt, dass im Gegensatz zu den Lehren des Stands der Techniks, Proteine, die um ein Vielfaches größer als ein Linkermolekül sind, an ein Linkermolekül konjugiert wer den können und immer noch erfolgreich und stabil an ein lipidisches Mikropartikel befestigt werden können. Die nachstehenden Beispiele zeigen, dass Proteine, die um ein Vielfaches größer als die Linkermoleküle sind, an welchen sie konjugiert sind, erfolgreich an lipidische Mikropartikel befestigt werden können. Diese Feststellung erweitert die Typen von Mitteln, mit denen solche Mikropartikel beladen werden können. Ferner erweitert sie den Bereich an Verfahren, durch welche solche Mikropartikel hergestellt und noch an Proteine befestigt werden können, da die Befestigung nun unter Bedingungen stattfinden kann, bei welchen die Stabilität des Mikropartikels, wie eines Liposoms, nicht gefährdet sein wird.
  • Vorzugsweise besitzen die in diesem Verfahren verwendeten Proteine ein Molekulargewicht zwischen etwa 6000 und etwa 1000000 Dalton. Weiter bevorzugt besitzen die Proteine ein Molekulargewicht zwischen etwa 10000 und etwa 600000 Dalton. Noch weiter bevorzugt weisen die Proteine ein Molekulargewicht zwischen etwa 15000 und etwa 250000 Dalton auf. Am stärksten bevorzugt weisen die Proteine ein Molekulargewicht zwischen etwa 20000 und etwa 75000 Dalton auf.
  • B. Befestigung von Proteinen durch Inkubieren von lipidischen Mikropartikeln mit an Linkermoleküle konjugierten Proteinen
  • Zur Verwendung in dieser Erfindung kann ein Protein zuerst an ein Linkermolekül konjugiert werden, umfassend (a) eine hydrophobe Domäne, (b) eine hydrophile Polymerkette, welche terminal an der hydrophoben Domäne befestigt ist und (c) eine chemische Gruppe, welche zu einer oder mehreren funktionalen Gruppen auf einem Proteinmolekül reaktiv ist und an der hydrophilen Polymerkette am oder nahe dem zur hydrophoben Domäne kontralateralen Ende befestigt ist. Derartige Linkermoleküle sind im Fachgebiet bekannt (Allen & Martin, US 5 527 528 ; Shahinian & Sylvius, Biochim. Biophys. Acta, 1239: 157–167 (1995); Zalipsky et al., J. Controlled Release 39: 153–161, 1996; Kirpotin et al., Biochemistry, 36: 66–75 (1997)).
  • Die hydrophobe Domäne des Linkermoleküls kann zum Beispiel ein Diacylglycerol, ein Phospholipid, ein Sterol, wie Cholesterol, oder ein Diacylamid-Derivat, wie N,N-Distearoyl-Glycinamid, sein. Die hydrophile Polymerkette kann zum Beispiel Poly(ethylenglykol), Polyglycidol, Poly(vinylalkohol), Poly(vinylpyrrolidon), Polyoxazolidinon, Polysaccharid oder ein Copolymer, welches die Blöcke der oben genannten Polymere einschließt, sein. Die chemische reaktive Gruppe kann beispielsweise eine Aminogruppe, Carboxygruppe, Thiolgruppe, Maleimidgruppe, Iodacetamidgruppe, Vinylsulfongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Ketongruppe, Cyanurchloridgruppe oder jedwede andere im Fachgebiet bekannte funktionale Gruppe zur Bildung von Bindungen mit Proteinen sein. Ein Protein kann ein Antikörper, ein Enzym, ein Wachstumsfaktor, ein Hormon, ein Nukleinsäure-bindendes Protein oder ein beliebiges anderes Protein von Nützlichkeit für eine jeweilige beabsichtigte Anwendung sein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Protein ein Fab''-Fragment eines Antikörpers oder ein Single-Chain-Antikörper. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist der Single-Chain-Antikörper ein Fv-Antikörper, der über Selektion aus einer Phagendisplay-Bibliothek produziert wird. Maleimidgruppen, welche mit Cysteinresten im Protein reagieren, werden als die reaktive Gruppe zur Verwendung mit einem Fab'-Antikörperfragment oder Single-Chain-Antikörper bevorzugt.
  • Die Konjugation des Proteins an den Linker kann durch ein Beliebiges von einer Anzahl von Verfahren, welche auf dem Fachgebiet für Proteinkonjugation bekannt sind, bewirkt werden. In einem bevorzugten Verfahren kann der Linker einfach in wässrigem Puffer gelöst werden (was auf Grund der Gegenwart der hydrophilen Polymerdomäne möglich ist) und mit dem Protein der Wahl inkubiert werden, um die Bildung einer stabilen Bindung zwischen der chemischen reaktiven Gruppe des Linkers und der passenden funktionellen Gruppe des Proteins zu gewähren. Das Konjugat kann ferner von dem überschüssigen Linker und jedwedem nicht-konjugierten Protein durch Aussalzen, Dialyse, Chromatographie und andere Verfahren, welche auf dem Fachgebiet der Proteinreinigung bekannt sind, gereinigt werden. Alternativ dazu kann das Konjugat ohne weitere Reinigung verwendet werden.
  • Konjugiertes Protein wird dann mit den lipidischen Mikropartikeln in einem wässrigen Medium während einer ausreichenden Zeit inkubiert, damit die hydrophobe Domäne des Konjugats in die Oberflächen-Lipidschicht des Partikels hinein verschmilzt. Die erforderliche Zeit wird von der Lipidzusammensetzung des Mikropartikels, der Natur der hydrophoben Domäne und der Temperatur der Inkubation abhängen. Typischerweise wird die Inkubationszeit im Bereich von etwa 1 Minute bis etwa 50 Stunden liegen. Die zur Inkubation notwendige Zeit wird sinken, wenn die Temperatur, bei der die Inkubation durchgeführt wird, erhöht wird. Somit wird die Inkubation bei 37°C im Allgemeinen über Nacht stattfinden, während die Inkubation bei 55–60°C im Allgemeinen 5–60 Minuten dauern wird, wobei 15–30 Minuten bevorzugt sind. Für jedwede besondere Kombination von Mikropartikel, hydrophober Domäne und Temperatur angemessene Inkubationszeiten können unter Anwendung der nachstehend in den Beispielen aufgeführten Assays bestimmt werden.
  • C. Herstellung von Proteinen, welche hydrophobe Domänen enthalten, welche sich selbst in ein lipidisches Mikropartikel inserieren
  • In einer alternativen Ausführungsform werden ein hydrophober Anker und eine hydrophile Polymerkette durch rekombinante DNA- und Proteintechnik-Verfahren in ein Proteinmolekül eingeführt. In diesem Fall wird eine hydrophile polymere Domäne, wie oben beschrieben, in das Protein von Interesse eingeführt durch eine terminal angehängte Polyaminosäuresequenz, welche hauptsächlich Aminosäuren mit hydrophilen Seitenketten enthält. Ein hydrophober Anker wird in das Konstrukt während seiner Biosynthese vermittels einer Lipidmodifikationsstelle eingeführt, die am distalen Ende der terminal angehängten Polyaminosäuresequenz positioniert ist.
  • BEISPIELE
  • Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht. Diese Beispiele werden zur Veranschaulichung, aber nicht nur Einschränkung der vorliegenden Erfindung angeboten.
  • Beispiel 1: Herstellung von stabilen Lipid:Plasmid-DNA-Komplexen für in-vivo-Genzuführung
  • A. Materialien und Methoden
  • 1. Lipide & andere Reagenzien
  • DOPE wurde von Avanti (Alabaster, AL) erworben. Hochgereinigtes Cholesterol wurde von Calbiochem (San Diego, CA) erhalten. DDAB und Dextran (M. G. 40000) wurden von Sigma (St. Louis, MO) erworben. DDAB wurde einmal aus Aceton-Methanol-Lösung umkristallisiert. D-Luciferin wurde von Boehringer Mannheim erhalten. PEG-PE war ein Geschenk von Sequus Pharmaceuticals (Menlo Park, CA). DC-Chol, MMCE und DOGS wurden vom "UCSF Gene Transfer Vehicle Core of Gene Therapy Center" erhalten. ESPM, DOTAP, POEPC, DOEPC, DMEPC und DODAP waren Geschenke von Avanti (Alabaster, AL). Die Chloroformlösung von jedem Lipid wurde unter Argon in versiegelten Ampullen bei –40°C aufbewahrt. Andere Reagenzien von höchstmöglicher Güteklasse wurden erworben und ohne weitere Reinigung verwendet.
  • 2. Herstellung von Liposomen
  • Kleine kationische Liposomen wurden in 5% (w/v) Dextroselösung auf die folgende Weise hergestellt. DDAB oder andere kationische Lipide in Chloroform wurden mit DOPE und/oder Cholesterol in einem gewünschten Molverhältnis vermischt, und das Lösungsmittel wurde langsam unter verringertem Druck bei 50°C auf einem Rotationsverdampfer entfernt. Der trockene Lipidfilm wurde mit 5% Dextroselösung, welche auf 50°C vorgewärmt war, hydratisiert, und der Behälter wurde unter Argon verschlossen. Die hydratisierte Lipidsuspension wurde in einem Bad-Sonifikator (Lab Supplies, Hicksville, N. Y.) während 5–10 Minuten bei 50°C schallbehandelt. Die Endkonzentration an Liposomen war 5 mM kationisches Lipid, und die Größe von Liposomen wurde durch dynamische Lichtstreuung als 195 ± 65 nm gemessen. Schallbehandelte Liposomen wurden unter Argon bei 4°C bis zur Verwendung aufbewahrt.
  • 3. Luciferase-Reportersystem
  • Das Plasmid pCMV/IVS-luc+ wurde wie folgend konstruiert. Ein Fragment, welches den CMV-Promotor und ein synthetisches IgE-Intron enthielt, wurde aus pBGt2.CAT unter Verwendung von SpeI und HindIII herausgeschnitten und in pBSIIKS+ kloniert. Die cDNA, welche die modifizierte Glühwürmchen-Luciferase (luc+) einschließlich SV40-Late-Poly(A)-Signal codiert, wurde aus dem pGL3-Basic-Vector (Promega) mit HindIII und SalI herausgeschnitten und in den pBS-CMV-IVS-Klon stromabwärts der Splice-Stelle eingebracht. Plasmide wurden unter Anwendung von Alkalische-Lyse-Verfahrensweisen gereinigt, welche von Qiagen Corp. (Chatsworth, CA) angenommen und ersonnen wurden. Die Plasmidreinheit wurde durch das Verhältnis der Extinktion bei 260 nm gegenüber 280 nm gemessen, und eine Aufbewahrung erfolgte im Puffer, der 10 mM Tris-Cl und 1 mM EDTA bei pH 8,0 enthielt, bei Konzentrationen von 1–2 mg/ml.
  • 4. Herstellung von Transfektionskomplexen
  • Vor den Transfektionsexperimenten wurde das optimale DNA/Liposomen-Verhältnis zur Bildung von Komplexen, welche keine großen Aggregate waren, durch Mischen von festgelegten Mengen an Plasmid mit veränderlichen Mengen an Liposomen bestimmt. Im Allgemeinen wurden die Transfektionskomplexe durch Pipettieren von Plasmid in eine Liposomensuspension von gleichem Volumen und rasches Vermischen gebildet. Routinemäßig konnten Liposomen, welche 8–12 nmol DDAB enthielten, mit 1 μg Plasmid ohne Bildung von sichtbaren großen Aggregaten komplexieren. Solche Komplexe besitzen eine überschüssige positive Ladung, aber neigen noch dazu, mit der Zeit während der Aufbewahrung bei 4°C zu aggregieren und Transfektionsaktivität in 4 Tagen zu verlieren. Für in-vitro-Experimente, welche nach viel verdünnteren Komplexen verlangen, wurden kationische Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe ("CLDC") bei 5 nmol DDAB pro μ [μg] DNA verwendet. Um die Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe davon abzuhalten, große Aggregate zu bilden und mit der Zeit die transfizierende Aktivität zu verlieren, wurden zwei Vorgehensweisen angewandt: (1) Einbinden einer kleinen Menge von PEG-PE (ungefähr 1% Molverhältnis) in Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe innerhalb einiger weniger Minuten nach ihrer Herstellung; und/oder (2) Kondensieren von Plasmid mit Polyaminen (z. B. 0,05–5,0 nmol Spermidin pro μg DNA) vor dem Vermischen mit Liposomen. Die optimale Menge der Polyamine wurde bestimmt durch Titrieren von Polyaminen zu DNA vor der Bildung großer Aggregate. Die Größe dieser Komplexe wurde durch dynamische Lichtstreuung als im Bereich von 410 ± 150 nm eingeschätzt.
  • 5. Assay der Reportergen-Expression
  • Gereinigte Luciferase wurde von Boehringer Mannheim als Standard zum Kalibrieren des Luminometers und zum Konstruieren eines Kontrollstandards für die relative spezifische Aktivität von Luciferase erworben. Die Reportergen-Expression in einem Gewebeextrakt wurde durch Umwandeln der von einem Luminometer gemessenen relativen Lichteinheiten in Gewichtseinheiten gemäß einer Eichkurve in Nanogramm-Mengen dargestellt. In Zellen oder Geweben exprimierte Luciferase wurde mit chemischer Zelllyse extrahiert. Ein effektiver Lysepuffer bestand aus 0,1 M Kaliumphosphat-Puffer bei pH 7,8, 1% Triton X-100, 1 mM DTT und 2 mM EDTA.
  • Weibliche CD1-Mäuse (4–6 Wochen alt, Gewicht ungefähr 25 g) wurden vom Charles River Laborstory erhalten. Mäuse erhielten Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe durch Schwanzveneninjektion und wurden 24 Stunden später geopfert. Die betäubten Tiere erhielten eine Perfusion mit kalter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch Herzpunktur. Jedes Gewebe wurde präpariert und in PBS gewaschen und dann in 6 ml großen Rundboden-Kulturröhrchen, enthaltend 500 μl Lysepuffer, homogenisiert. Die Proben wurden 20 Minuten lang bei gelegentlichem Mischen bei Raumtemperatur gehalten. Die homogenisierten Proben wurden 10 Minuten lang bei 3000 U/min in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Die Luciferase-Aktivität jedes Gewebes wurde durch Mischen von 100 μl des rekonstituierten Luciferase-Substrats (Promega, Madison, WI) mit 20 μl des Überstands des Gewebehomogenats im Injektionssystem eines Luminometers gemessen. Die Spitzen-Lichtemmission wurde 10 Sekunden lang bei 20°C gemessen. Die relativen Lichteinheiten jeder Probe wurden in die Menge an Luciferase im Gewebeextrakt durch Vergleichen mit einer Eichkurve umgewandelt, welche für jeden Satz an Experimenten aufgestellt worden war. Der Proteingehalt des Extrakts wurde unter Anwendung von Protein-Assay-Kits (BioRad, Richmond, CA) bestimmt. Der Hintergrund war die Zählung von Lysepuffer allein.
  • SK-BR-3-Zellen (Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1327–1331 (1995)) wurden in McCoy's 5A-Medium, das mit 10% hitzeinaktiviertem bovinem Kälberserum ergänzt war, und in 5% CO2 kultiviert. SK-BR-3-Zellen in Monoschichtkultur wurden bei 50000 Zellen je Vertiefung in 12-Vertiefungs-Platten ausplattiert und über Nacht inkubiert. Jede Vertiefung erhielt 0,5~1 μg pCMV/IVS-luc+ innerhalb von 20 Minuten der Komplexbildung. Die Zellen wurden nach 24 Stunden Inkubation mit Komplexen bei 37°C geerntet. Die Luciferase-Aktivität in den Zellen wurde wie oben beschrieben bestimmt.
  • B. Ergebnisse
  • 1. Optimieren des "Helfer"-Lipids
  • Die Verwendung von kationischen Liposomen für in-vitro-Gentransfer gelangte zu weiter Verbreitung, seit Feigner et al. ihre Untersuchung veröffentlichten (Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413–17 (1987)). Es wurde später belegt (Feigner et al., J. Biol. Chem. 269: 2550–2561 (1994)), dass DOPE bei Weitem das effizienteste "Helfer"-Lipid für in-vitro-Gentransfektion ist, und dieses Ergebnis ist durch mehrere Laboratorien bestätigt worden (Farhood et al., in Gene Therapy for Neoplastic Diseases, S. 23–55 (Hrsg.: Huber & Lazo, 1994); Zhou et al., Biochim. Biophys. Acta 1189: 195–203 1994)). Auf der Grundlage von in-vitro-Untersuchungen ist es vorgeschlagen worden, dass DOPE die cytoplasmatische Zuführung mittels Membranfusion erleichtern kann, sobald positiv geladene Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe an die Zellmembran gebunden sind (Zhou et al., Biochim. Biophys. Acta 1189: 195–203 (1994)). Selbst obwohl Friend et al. keinerlei morphologischen Beweis erhielten, dass die DOTMA/DOPE-Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe direkt mit der Plasmamembran fusionieren, schließen sie nicht die Möglichkeit von Fusionsereignissen aus (Friend et al., Biochim. Biophys. Acta 1278: 41–50 (1996)). Sie schlugen vor, dass die Komplexe endozytiert werden, und die kationischen Lipide die endosomal/lysosomalen Membranen zerbrechen und danach ein Austreten der DNA-Komplexe in das Cytoplasma und letztendlich in den Zellkern hinein erleichtern.
  • Im Gegensatz zu den meisten Erwartungen ist die "Helfer"-Rolle von DOPE, welche aus in-vitro-Untersuchungen belegt wurde, für eine in-vivo-Genzuführung im Anschluss an eine i.v.-Injektion der Komplexe nicht offensichtlich. Als DOPE in DDAB-kationische Liposomen eingeschlossen wurde, wurde die in-vivo-Gentransfektion inhibiert. Diese DOPE-abhängige Inhibition ist in der 1 gezeigt. Es wurde festgestellt, dass Cholesterol, nicht DOPE, als "Helfer"-Lipid für in-vivo-Genzuführung effektiv ist. Es bestand eine zehnfache Verringerung der Luciferase-Expression in Mauslungen, als die Hälfte des Cholesterols mit DOPE ersetzt wurde. Die in-vivo-Ergebnisse von DDAB- und anderen kationischen Liposomen sind nicht konsistent mit der allgemeinen Annahme, dass DOPE ein geeignetes "Helfer"-Lipid ist. Im Widerspruch hierzu schwächt DOPE in kationisches-Lipid:Plasmid-DNA-Komplexen die in-vivo-Transfektion zu einem so großen Ausmaß ab, dass DOPE als ein inhibitorisches Mittel in Formulierungen für in-vivo-Genzuführung betrachtet wird. Cholesterol ist für in-vivo-Untersuchungen in kürzlich veröffentlichten Berichten gewählt worden (Liu et al., J. Biol. Chem. 270: 24864–70 (1995); Solodin et al., Biochemistry 34: 13537–44 (1995)), in welchen die Autoren nicht darauf eingehen, wie und warum sie verschiedene "Helfer"-Lipide für ihre Experimententwürfe wählten, d. h. DOPE für in vitro erfolgende und Cholesterol für in vivo erfolgende Untersuchungen. Die Stabilisierung von anionischen und neutralen Liposomen im Blut durch Cholesterol ist über lange Zeit hinweg bekannt gewesen (Mayhew et al., Cancer Treat. Rep. 63: 1923–1928 (1979)). Es ist deshalb offensichtlich, dass man für systemische Genzuführung die Stabilität von Lipid:Plasmid-DNA-Komplexen in Blut berücksichtigen muss, von welchem verschiedene Komponenten bekanntermaßen mit makromolekularen Komplexen reagieren. In der Tat hat die vorläufige Untersuchung verschiedener Formulierungen von Lipid:Plasmid-DNA-Komplexen unter Anwendung von Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie gezeigt, dass in Gegenwart von Serum die Cholesterol enthaltenden Komplexe strukturell stabiler sind als die DOPE enthaltenden Komplexe.
  • Unter Verwendung von DDAB/Chol-Lipid:Plasmid-DNA-Komplexen (8 nmol DDAB/μg DNA) für in-vivo-Transfektionsexperimente erforderte eine nachweisbare Luciferase-Expression in der Lunge von 25 g Maus eine DNA-Dosis im Bereich von 30 μg bis 60 μg. Routinemäßig ergaben 40 Ç an 60 μg Plasmid-DNA pro Maus eine konsistente Genexpression. Die Menge an DDAB, welche üblicherweise mit 80 μg DNA (oder mehr) pro Maus assoziiert war, wurde als zu toxisch für das Tier befunden. Die Expression von Luciferase in verschiedenen Geweben ist in der 2 gezeigt. Wie zuvor beobachtet (Zhu et al., Science 261: 209–211 (1993); Liu et al., J. Biol. Chem. 270: 24864–70 (1995); Solodin et al., Biochemistry 34: 13537–44 (1995)), wurde eine maximale Expression im Lungengewebe gefunden. Für 60 μg injiziertes Plasmid wurden routinemäßig 1–2 ng Luciferase pro mg Gewebeprotein erhalten. Die 3 zeigt die Dauer der Reportergen-Expression in Lungengewebe. Die Expression von Luciferase sank rasch und erreichte in 2 Wochen nicht-nachweisbare Spiegel. Zhu et al. berichteten, dass im Anschluss an eine i.v.-Injektion von DOTMA/DOPE(1:1)-Plasmidkomplexen in erwachsene Mäuse die Expression des Reportergens (CAT) unter verschiedenen Geweben weitverbreitet ist, und die Maximum-Expression aus Komplexen mit einem Verhältnis von 1 I μg Plasmid zu 8 nmol Gesamtlipiden erfolgt (Zhu et al., Science 261: 209–211 (1993)). Allerdings neigten, bei diesem Verhältnis (entsprechend 1 μg Plasmid zu 4 nmol kationischem Lipid), die DDAB/Chol-Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe dazu, zu aggregieren, und riefen keine messbare Genexpression in dieser Untersuchung hervor.
  • Da unter verschiedenen Laboratorien unterschiedliche Reportergene verwendet wurden, ist es schwierig, die Variationen in der Effizienz der in-vivo-Genzuführung Änderungen in der Formulierung von Liposomen zuzuschreiben. Für einen direkten Vergleich der Ergebnisse in der Literatur wurden die relativen Lichteinheiten von Luciferase-Aktivität, welche aus einem Luminometer gemessen wurden, in einen Standard von gereinigter Luciferase umgewandelt. Bei derartigem Vorgehen war die Spitzen-Transfektionsaktivität von DDAB/Chol-Formulierungen um 3 Größenordnungen höher als die Werte, welche kürzlich in vergleichbaren Experimenten berichtet wurden (Thierry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 9742–9746 (1995)). Unter Vorgabe desselben Reportergens zusammen mit demselben Promotor in den experimentellen Auslegungen, kann der Unterschied in der Expression die Selektion der Liposomen-Formulierung widerspiegeln. Tatsächlich war DDAB/Chol eines der effizientesten Genzuführungsvehikel unter vielen Formulierungen aus 18 verschiedenen kationischen Lipiden, welche kürzlich gescreent wurden. Vorläufige Ergebnisse der Expression in Mauslunge im Anschluss an i.v.-Injektion zeigten, das DOTMA/Chol, DOTAP/Chol, MMCE/Chol und ESPM/Chol ergaben 10–100% der Transfektionsaktivität von DDAB/Chol, [und] DOGS/Chol, POEPC/Chol, LYSPE/DOPE und DC-Chol/DOPE ergaben 1–10% von DDAB/Chol. DOEPC/Chol, DMEPC/Chol, DODAP/Chol und DDAB/DOPE ergaben keinerlei messbare Aktivität.
  • Parallel zu den Transfektionsuntersuchungen wurde die Morphologie dieser Komplexe in Serum und in Zellmedium durch Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie untersucht. Bei Untersuchungen in 50% Mausserum (10 Minuten Inkubationszeit), sind nicht-stabilisierte, einen Tag alte CLDC so klein, wie sie im Puffer bei geringer Innenstärke (100–250 nm) sind, aber sie zeigen sehr wenige Protrusionen. Sechs Tage alte, nicht-stabilisierte CLDC, die in 50% Mausserum inkubiert wurden, erschienen als dicht gepackte Aggregate von sphärischen Partikeln mit einer hohen Anzahl von befestigten Partikeln. Solche Formulierungen haben alle ihre in-vivo-Transfektionsaktivität innerhalb von 4 Tagen verloren. Restliche fibrilläre Protrusionen werden nicht beobachtet.
  • PEG-PE-stabilisierte CLDC, welche in 50% Mausserum inkubiert wurden, waren sogar nach sechs Tagen klein (100–200 nm). In ähnlicher Weise waren mit kondensierter DNA zubereitete CLDC ebenfalls ziemlich klein, sogar nach sechs Tagen Aufbewahrung. Genauer gesagt, waren die CLDC wie "Stecknadeln" geformt, welche in Gegenwart von Serum strukturell stabil waren.
  • Nach Inkubation in Zellmedium (RPMI-1640 mit 10% FCS) waren nicht-stabilisierte, sechs Tage alte CLDC morphologisch ähnlich zu denjenigen, welche wie oben beschrieben, in Mausserum inkubiert wurden. Diese Komplexe waren jedoch loser gepackt und zeigte keine fibrillären Protrusionen. Eine ähnliche Morphologie wurde mit PEG-PE-stabilisierten CLDC und Kondensierte-DNA-CLDC, welche in Zellmedium inkubiert wurden, beobachtet.
  • 2. Erhöhung der Haltbarkeitsdauer für Transfektionsaktivität
  • Die Beziehung zwischen struktureller Stabilität und Transfektionsaktivität von Lipid:Plasmid-DNA-Komplexen ist bislang in veröffentlichten Berichten nicht ausführlich geschildert worden. Es sind Screening-Vorgehen eingerichtet worden, um große Aggregate von Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe durch Ändern des Verhältnisses von DNA zu Lipid von einer negativen Netto-Ladung zu einer positiven Ladung zu vermeiden. Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe von jedem besonderen kationischen Lipid bei verschiedenen Verhältnissen von DNA/Lipid wurden hergestellt, und die resultierenden stabilen und metastabilen Formulierungen wurden für in-vivo-Transfektion verwendet. Komplexe, welche 8 bis 12 nmol kationisches Lipid pro μg DNA enthielten, wiesen festgestelltermaßen die höchste in-vivo-Transfektionsaktivität auf. Allerdings sank die Transfektionsaktivität dieser Komplexe mit der Zeit. Ohne Modifizieren der Vorgehensweisen zur Herstellung der Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe gab es eine sichtbare Aggregation innerhalb weniger Tage, und die Transfektionsaktivität sank um mehr als das Tausendfache beinahe auf Hintergrundspiegel nach einem Monat Aufbewahrung bei 4°C (4). Deshalb wurde eine Formulierung von stabilisierten Lipid:Plasmid-DNA-Komplexen ausgeführt, welche eine hohe in-vivo-Transfektionsaktivität während der Aufbewahrung beibehalten konnte.
  • i. Erhöhen der Transfektionsstabilität: PEG-PE
  • Das Inserieren von PEG-PE (1% des Gesamtlipids) in die frisch gebildeten Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe konnte nicht nur die Komplexe am Aggregieren während der Aufbewahrung hindern, sondern die PEG-PE-enthaltenden Komplexe zeigten auch eine ziemlich hohe Transfektionsaktivität in vivo, und zwar eine lediglich geringfügig niedrigere Aktivität im Vergleich zu den Komplexen ohne PEG-PE (4). Der Einbau von PEG-PE in die Komplexe ist im Hinblick auf die mit der Dosis zusammenhängende Inhibition der Transfektionsaktivität bei steigendem Prozentgehalt an PEG-PE offensichtlich (Ergebnisse nicht gezeigt). Unerwarteterweise stellte die Aufbewahrung der PEG-PE enthaltenden Komplexe bei 4°C langsam die ursprüngliche Aktivität wieder her, wie es in der 4 gezeigt ist. Die mechanistischen Aspekte des Inhibitionseffekts auf die Transfektion durch PEG-PE sowie die Wiederherstellung der Aktivität im Anschluss an eine Aufbewahrung bei niedriger Temperatur sind zum derzeitigen Zeitpunkt nicht bekannt.
  • ii. Erhöhen der Transfektionsstabilität: Polyamine
  • Zusätzlich zu der Rolle von PEG-PE bei der Erhöhung der Haltbarkeitsdauer von Lipid:Nukleinsäurekomplexen ergab auch das Kondensieren von Nukleinsäure mit Polyaminen eine ähnliche unerwartete Erhöhung der Haltbarkeitsdauer der Komplexe. Die mit kondensierter DNA gebildeten Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe waren bei einem niedrigeren Verhältnis von Lipid zu DNA, ohne Aggregation, stabil. Die 4 zeigt die Spiegel der in-vivo-Transfektionsaktivität einer solchen Präparation und ihr Schicksal während der Aufbewahrung. Erneut wurde eine unerwartete Erhöhung der Transfektionsaktivität in gealterten, Polyamin-behandelten Lipid:Plasmid-DNA-Komplexen im Vergleich zu derjenigen der Proben gefunden, welche nicht mit Polyaminen vorbehandelt und unmittelbar verwendet wurden, nachdem die Komplexe gebildet worden waren. Ein anderes Vorgehen zum Erhalten stabiler kationisches-Lipid/DNA-Komplexe durch Komplexieren von Plasmid mit Lipid in Lipid-Detergens-Mizellen wurde kürzlich veröffentlicht (Hofland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7305–7309 (1996)). Allerdings wurde nur 30% der Transfektionseffizienz von solchen Komplexen in 15% Serum in vitro beibehalten, und in vivo wurden keine Ergebnisse berichtet.
  • iii. Erhöhung der Transfektionsstabilität: Lyophilisieren
  • Schließlich sind Bedingungen für die Stabilisierung von Lipid:Plasmid-DNA-Komplexen durch Lyophilisieren ermittelt worden. Aus DDAB/Chol, suspendiert durch Schallbehandlung in 5% (w/v) Dextran in Wasser, zusammengesetzte Liposomen konnten, bei Vermischen mit DNA in einem Verhältnis von 1:10 (μg DNA pro nmol DDAB), wie in "Methoden" beschrieben, ohne Verlust von Aktivität lyophilisiert werden. Die Endkonzentration an Dextran, in welchem Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe gebildet wurden, betrug 8% (w/v). Die lyophilisierten Präparationen wurden durch Zugeben von destilliertem Wasser rekonstituiert, und ihre Transfektionsaktivität in den Lungen von Mäusen nach i.v.-Injektion wurde durch Luciferase-Reportergen-Expression gemessen. Einfrieren und Auftauen der rekonstituierten Präparation beeinflusste die Aktivität (üblicherweise 1 bis 2 ng Luciferase-Protein pro mg Gewebeprotein) nicht.
  • Mehrere der hierin beschriebenen kationisches-Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe sind stabil und können eine konsistente in-vivo-Transfektionsaktivität (im Bereich von 0,5 bis 2 ng Luciferase pro mg Gewebeprotein) selbst nach langer Aufbewahrung bei 4°C oder Lyophilisierung ergeben. Formulierungen, die Cholesterol als das "Helfer"-Lipid enthalten, erzeugen eine wesentlich höhere in-vivo-Transfektionseffizienz. Die Stabilisierung der Komplexstruktur durch PEG-PE hält die Komplexaktivität bei der Aufbewahrung aufrecht und kann die Kreislaufzeit im Blut für das Targeting zu spezifischen Geweben verlängern. Das Kondensieren der DNA mit Polyaminen vor der Lipid-Komplexierung verbessert die in-vitro-Aufbewahrung und Spiegel der Aktivität in vivo. Die methodische Vorgehensweise zur Herstellung stabiler Formulierungen von Lipid:Plasmid-DNA-Komplexen, welche eine hohe Transfektionsaktivität in vivo aufzeigen, vermittelt Vorteile für die Einrichtung von pharmazeutisch annehmbaren Präparaten und erleichtert daher die Liposomen-basierende Gentherapie.
  • Beispiel 2: In-vitro-Transfektion von Lipid:Plasmid-DNA-Komplexen mit Targeting-Liganden
  • A. Herstellung von Fab'-Fragmenten
  • Klonierte rhuMAbHER2-Sequenzen für Schwer- und Leichtkette wurden in E. coli coexprimiert, wie früher beschrieben (Carter et al., Biotechnology 10: 163–167 (1992)). Das Antikörperfragment, rhuMAbHER2-Fab' wurde aus E. coli-Fermentierungspasten durch Affinitätschromatographie mit Streptokokken-Protein G (Carter et al., Biotechnology 10: 163–167 (1992)) gewonnen, wodurch man typischerweise Fab' erhält, wobei 60–90% reduziertes freies Thiol (Fab'-SH) enthalten.
  • B. Herstellung von Liposomen
  • Kondensierte DNA wurde mit drei verschiedenen Lipidzusammensetzungen komplexiert, wobei die oben im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, mit den folgenden Modifikationen, angewandt wurden. Der erste Komplex wurde mit DDAB/DOPE (1/1) hergestellt, was kationische Liposomen herstellte, die nur mit DNA komplexiert waren, wie oben beschrieben. Der zweite Komplex wurde mit DDAB/DOPE (1/1) mit 1% PEG-PE, derivatisiert mit Maleimid an der äußersten Position von PEG, hergestellt, wodurch CLDC mit Hinzufügung der sterischen Stabilisationskomponente nach Komplexierung mit der DNA produziert wurde. Der dritte Komplex wurde mit DDAB/DOPE (1/1) mit 1% PEG-PE hergestellt, welches mit dem Fab'-Fragment eines humanisierten Anti-Her-2-Antikörpers derivatisiert war, der an der äußersten Position von PEG über die freie Thiolgruppe an den Maleimidrest befestigt war. Dies erzeugte CLDC, bei welchen der Targeting-Ligand, welcher an der sterischen Stabilisationskomponente befestigt ist, nach der Komplexierung mit der DNA zugefügt wird.
  • C. Transfektion und Ergebnisse
  • Zellen wurden wie oben im Beispiel 1 beschrieben transfiziert, jedoch ohne Aufbewahrung des Lipid:Plasmid-DNA-Komplexes. In diesem Beispiel wurden zwei Zelllinien verwendet. Die erste Zelllinie war MCF-7; Zellen dieser Zelllinie überexprimieren den HER-2-Rezeptor nicht. Diese Zellen wurden in DME H-21 mit 10% bovinem Kälberserum und in 5% CO2 kultiviert. Bei der zweiten Zelllinie handelte es sich um SK-BR3-Zellen, deren Zellen den HER-2-Rezeptor übe rexprimieren, kultiviert in McCoy's 5A-Medium mit bovinem Kälberserum in 5% CO2. In beiden Fällen wurden die Zellen (~5 × 104 Zellen pro Vertiefung) transfiziert und inkubiert mit 12 μg Plasmid-DNA, komplexiert mit Lipid, wie oben beschrieben (PCMV/IVS-luc+, Luciferase-Reportergen, oben beschrieben), während 4 Stunden bei 37°C. Der Überstand wurde dann abgesaugt, frisches Medium wurde zugegeben, und die Zellen wurden 24 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden dann durch Waschen mit PBS (Ca/Mg-frei) geerntet und dann für den Luciferase-Assay, wie oben beschrieben, in Lysepuffer suspendiert.
  • Die 5A zeigt, dass die Transfektion von Nicht-Zielzellen, welche den HER-2-Rezeptor nicht überexprimieren, durch die Addition von PEG-PE inhibiert wurde, sogar in Gegenwart des Targeting-Liganden, welcher an die Spitze von PEG über den terminalen Maleimidrest konjugiert war. Die 5B zeigt, dass die Transfektion von Zielzellen, welche den HER-2-Rezeptor überexprimieren, ebenfalls durch die Addition von PEG-PE inhibiert wurde, aber dass die Transfektionsaktivität wiederhergestellt und gesteigert wurde, als das PEG-PE an einen Targeting-Ligand konjugiert wurde, welcher den HER-2-Rezeptor erkennt.
  • Der Vergleich der 5A und 5B zeigt, dass die targetierten Immuno-CLDC viel effizienter bei der Transfektion von Zielzellen als von Nicht-Zielzellen aktiv waren. Dieses Ergebnis tritt wegen der Addition des Liganden-tragenden stabilisierenden Mittels (PEG-PE), konjugiert an Anti-HER-2-Fab', auf, welches die Transfektion von Nicht-Zielzellen inhibiert (5A), aber die Transfektion der Zielzellen steigert (5B).
  • Beispiel 3: Herstellung des Linkers Maleimido-Propionylamido-PEG2000-Distearoylphosphatidylethanolamin (Mal-PEG-DSPE).
  • 100 mg (44 mol) 4-Maleimidopropionylamido-Poly(ethylenglykol)-α-succinimidylcarbonat (Mal-PEG-NHS; Shearwater Polymers, Inc.), hergestellt aus Poly(ethylenglykol) (Molekulargewicht 2000), 33 mg (44 μmol) Distearoylphosphatidylethanolamin (DSPE; Avanti Polar Lipids) und 12 ml (86 μmol) Triethylamin in 1 ml Chloroform wurden 6 Stunden lang bei 45°C inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt zeigte die Dünnschicht-Chromatographie auf Siliziumdioxid (Lösungsmittel: Chloroform/Methanol bei 7:3) die vollständige Umwandlung von DSPE in das schneller wandernde, Ninhydrin-negative Produkt, welches als Mal-PEG-DSPE identifiziert wurde. Dieses Produkt wurde durch Säulenchromatographie auf Siliziumdioxid unter Anwendung eines stufenweisen Gradienten von Methanol in Chloroform (5%, 10%, 15% Methanol, bezogen auf Volumen) gereinigt. Reines Mal-PEG-DSPE wurde bei 15% Methanol eluiert. Ausbeute: 85 mg (67% der Theorie). Rf 0,27–0,29 (Silica 60, CHCl3-MeOH-H2O 65:25:4). Verhältnis von Maleimido-Gruppen zu Phosphat: 0,95–1,02.
  • Alternativ dazu kann dieser Linker hergestellt werden, wie beschrieben in US 5 527 528 oder in Kirpotin et al. (Biochemistry, 36: 66–75 (1997)).
  • Beispiel 4: Konjugation von Mal-PEG-DSPE mit Fab'-Fragment eines Antikörpers, der gegen das HER2-Onkoprotein reaktiv ist.
  • 300 nmol Mal-PEG-DSPE in 0,5 ml Chloroform wurden in ein Glas-Reagenzröhrchen eingebracht, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Der trockene Rückstand wurde in 1 ml MES-20-Puffer (20 mM Morpholinoethansulfonsäure, 144 mM Natriumchlorid, 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure, und NaOH auf pH 6,0) gelöst. 2,5 ml Lösung, enthaltend 0,57 mg/ml Fab'-Fragmente eines rekombinanten humanisierten monoklonalen Antikörpers gegen die extrazelluläre Domäne von HER2-Onkoprotein (rhuMAbHER2, Genentech, Inc.), wurden zu der Mal-PEG-DSPE-Lösung zugegeben, und der pH-Wert wurde sorgfältig mit verdünntem NaOH auf 7,2–7,4 eingestellt. Die Mischung wurde unter Argon bei Raumtemperatur 2,5 Stunden lang inkubiert, und die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,2 M Cysteinhydrochlorid zu einer Endkonzentration von 5 mM gestoppt. 15 Minuten nach der Zugabe des Cysteins wurde die Reaktionsmischung gegen HEPES-gepufferte Kochsalzlösung (20 mM Hydroxyethylpiperazino-Ethansulfonsäure, 144 mM NaCl, NaOH bis pH 7,2) dialysiert, mittels Ultrafiltration durch eine YM-10-Membran (Amicon) unter Druck konzentriert, und durch Filtration durch einen 0,2 μm-Celluloseacetatfilter sterilisiert. Die Reaktionsprodukte wurden durch Polyacrylamidgelelektrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE), mit Coomassie-Blau-Färbung, analysiert. Das Gesamtprotein wurde durch den Farbstoffbindungs-Assay (Bio-Rad) bestimmt. Der Assay zeigte eine 62%ige Umwandlung des Ursprungproteins (M. G. 46000) in ein langsamer wanderndes Produkt (M. G. 49000), was mit dem erwarteten Konjugat übereinstimmt. Die Gesamtproteinausbeute in den Produkten betrug 98%.
  • Beispiel 5: Konjugation von Mal-PEG-DSPE mit Single-Chain-Fv-Antikörper, der gegen HER2-Onkoprotein reaktiv ist.
  • 150 nmol Mal-PEG-DSPE wurden in 0,5 ml MES-20 gelöst und mit 0,5 ml Lösung umgesetzt, enthaltend 0,7 mg/ml Single-Chain-Fv-Antikörper C6.5Cys, welcher gegen die extrazelluläre Domäne von HER2-Onkoprotein reaktiv ist. Der Antikörper wurde hergestellt, wie beschrieben von Schier et al. (Immunotechnology 1: 73–81 (1995)). Die Reaktion und Produkt-Assays wurden durchgeführt, wie im oben stehenden Beispiel beschrieben. Die Gesamtproteinausbeute betrug 86%. Ungefähr 52% des gewonnenen Proteins (M. G. 27000) lag in der Form eines Produkts mit höherem Molekulargewicht (M. G. 29000–30000) vor, was in Übereinstimmung mit dem erwarteten Konjugat steht.
  • Beispiel 6: Herstellung von Immunoliposomen mit konjugierten Anti-HER2-Fab'-Fragmenten und beladen mit einem fluoreszierenden pH-empfindlichen Indikator
  • Kleine (100 nm) unilamellare Liposomen, welche den eingeschlossenen pH-empfindlichen Fluoreszenzindikator 8-Hydroxypyrentrisulfonsäure enthielten, wurden aus einer Mischung von 1-Palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholin (Avanti), Cholesterol (Calbiochem) und Methoxypolyoxyethylenglykol(M. G. 1900)-derivatisiertem Distearoylphosphatidylethanolamin (Sygena) im Molverhältnis von 30:20:3, wie beschrieben von Kirpotin et al. (Biochemistry, 36:66–75 (1997)), hergestellt und durch Filtration durch einen 0,2 μm-Celluloseacetatfilter sterilisiert. 0,26 ml Liposomenpräparation, welche 2 μmol Phospholipide enthielt, wurde mit 0,106 ml einer Lösung gemischt, enthaltend 100 μg des gemäß dem oben stehenden Beispiel 4 hergestellten Anti-HER2-Fab'-PEG-DSPE-Konjugats, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Liposomen von nicht-gebundenem Material durch Gelfiltration auf einer Säule mit Sepharose 4B (Pharmacia) getrennt, wobei HEPES-gepufferte Kochsalzlösung als Elutionsmittel verwendet wurde. Die Liposomen wurden im Hohlraumvolumen der Säule eluiert. Die Menge an Liposomen-gebundenem Protein wurde durch den Bio-Rad-Farbstoffbindungs-Assay bestimmt, und die Liposomenkonzentration wurde durch Gesamt-Phosphor unter Anwendung des Molybdat-Verfahrens gemessen (Morrison, Anal. Biochem., 7: 218–224 (1964)). Eine SDS-PAGE der Liposomen (siehe nachstehendes Beispiel 13) zeigte das Vorhandensein von Anti-HER2-Fab'-PEG-DSPE-Konjugat, aber kein freies Anti-HER2-Fab' in der Liposomenpräparation. Liposomen-assoziiertes Protein wurde durch SDS-PAGE (siehe Beispiel 13) quantifiziert, und die Bindung des zugesetzten Fab'-PEG-DSPE-Konjugats mit den Liposomen wurde als Prozentsatz des Ausgangs-Protein/Phospholipid-Verhältnisses gegenüber dem Eingangs-Protein/Phospholipid-Verhältnis ausgedrückt. Die Bindung von Fab'-PEG-DSPE-Konjugat an die Liposomen betrug 80%. Das Austreten von HPTS aus den Liposomen während der Inkubation mit dem Protein-PEG-DSPE-Konjugat an die Liposomen betrug weniger als 2%.
  • Beispiel 7: Herstellung von Immunoliposomen mit konjugierten Anti-HER2-scFv-Antikörpern, und beladen mit einem fluoreszenten, pH-empfindlichen Indikator
  • Unter Anwendung des Vorgehens von Beispiel 6 wurde das Konjugat von Anti-HER2-Single-Chain-Fv C6.5Cys mit Mal-PEG-DSPE, welches gemäß Beispiel 5 erhalten wurde, mit HPTS-beladenen Liposomen beim Eingangsverhältnis von 15,6 μg Protein pro 1 μmol Liposomen-Phospholipid inkubiert. Nach Trennen von ungebundenem Material durch Gelfiltration auf Sepharose 4B, wurden die Liposomen wie im Beispiel 6 beschrieben geassayt. Das Ausgangs-Protein/Phospholipid-Verhältnis betrug 14,4 μg/μmol, was eine 92,3%ige Bindung des Konjugats an die Liposomen anzeigte.
  • Beispiel 8: Aufnahme der Liposomen durch HER2-überexprimierende Zellen.
  • HER2-überexprimierende humane Brustkrebszellen (SK-BR-3) wurden in McCoy 5A-Medium, welches mit 10% fötalem Kälberserum, 50 U/ml Penicillin und 50 U/ml Streptomycin ergänzt war, bei 37°C und 5% CO2 wachsen gelassen. 24 Stunden vor dem Assay wurden die Zellen durch Behandlung mit 5 mM EDTA in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung geerntet und in 24-Vertiefungs-Zellkulturplatten bei einer Dichte von 200000 Zellen/Vertiefung in 1 ml Zellkulturmedium ausplattiert. Liposomen wurden dem Zellkulturmedium in den Vertiefungen (in dreifacher Ausfertigung) zugesetzt, um eine Endkonzentration von 25 μM Liposomen-Phospholipiden zu erzielen. Die Platten wurden dann 4 Stunden unter vorsichtigem Bewegen bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Medien aus den Vertiefungen abgesaugt, die Zellschichten wurden viermal mit 1 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gespült, in 1 ml 5 mM EDTA in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung abgeerntet, und die Mengen an zellgebundenen und endozytierten Liposomen wurden mittels Fluorometrie bestimmt, wie es in Kirpotin et al., Biochemistry, 36: 66–75 (1997), beschrieben ist. Zum Vergleich wurden Inkubationen auch mit den Liposomen durchgeführt, die an Anti-HER2-Fab' und -scFv über Mal-PEG-DSPE-Linker konjugiert waren, welche im Voraus in die Liposomenzusammensetzung eingeschlossen worden waren (Kirpotin et al., ebenda). Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst:
    Liposomen Proteine pro Liposom Insgesamte Zellassoziierte Liposomen, nmol Phospholipid/106 Zellen Endozytierte Liposomen, % v. Gesamt
    Kein Antikörper 0 0,0059 ± 0,00036 0
    Anti-HER2-Fab', Konjugation an im Voraus eingebauten Linker 34 0,744 ± 0,086 86 ± 7,8
    Anti-HER2-scFv, Konjugation an im Voraus eingebauten Linker 37 0,311 ± 0,025 59,3 ± 4,3
    Anti-HER2-Fab', gemäß Beispiel 4 43 1,304 ± 0,054 95,9 ± 3,2
    Anti-HER2-scFv, gemäß Beispiel 5 39 0,576 ± 0,035 60,4 ± 0,9
  • Wie von diesen Daten bewiesen, war die Zielzellbindung und die Internalisierung der Liposomen, welche gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, wenigstens gleich und häufig höher als diejenige der ähnlichen Liposomen, welche gemäß dem besten Verfahren des Stands der Technik hergestellt worden waren.
  • Beispiel 9: Herstellung von Anti-HER2-immunoliposomalem Doxorubicin durch Modifikation von im Voraus bereitetem liposomalem Doxorubicin mit Anti-HER2-Fab'-PEG DSPE-Konjugat bei 55°C.
  • 0,38 ml kommerziell erhältliches liposomales Doxorubicin (Doxil®, Sequus Pharmaceuticals, Inc.), enthaltend 2 mg/ml Doxorubicin, wurden mit 0,26 ml der Präparation von Anti-HER2-Fab'-PEG-DSPE-Konjugat gemischt, welches gemäß Beispiel 6 erhalten worden war, bei 55°C während 20 Minuten inkubiert und rasch in Eiswasser abgekühlt. Nicht-gebundenes Material und niedermolekulare Komponenten wurden durch Gelfiltration der Inkubationsprodukte durch eine Säule mit Sepharose 4B (Pharmacia) entfernt. Die Liposomen wurden im Hohlraumvolumen der Säule gesammelt und hinsichtlich Protein unter Anwendung von SDS-PAGE, hinsichtlich Phospholipid unter Anwendung des Molybdatverfahrens und hinsichtlich Doxorubicin durch Spektrophotometrie nach Solubilisierung in angesäuertem Isopropanol (E1% 480 = 208) geassayt. Ermittelt: ungefähr 45 Fab'/Liposom (77% Bindung des zugegebenen Konjugats). Der Austritt von Doxorubicin aus Liposomen wurde nicht beobachtet (Doxorubicin-Gehalt vor der Inkubation: 145,9 μg/μmol Phospholipid; nach Inkubation: 155,8 ^Zg bzw. μg/mol Phospholipid).
  • Beispiel 10: Herstellung von Anti-HER2-immunoliposomalem Doxorubicin durch Modifikation von im Voraus bereitetem liposomalem Doxorubicin mit Anti-HER2-scFv-PEG DSPE-Konjugat bei 55°C
  • Die Modifikation wurde wie im Beispiel 9 beschrieben unter Verwendung von 0,4 ml C6.5Cys-PEG-DSPE-Konjugat-Präparat (Beispiel 5) und 0,31 ml Doxil® durchgeführt. Ermittelt: 48 Proteine/Liposom (quantitative Bindung des Konjugats an Liposomen); Arzneistoffaustritt 3,7% (Doxorubicin-Gehalt vor Modifikation: 145,9 μg/μmol Phospholipid; nach Modifikation: 140,5 μg/μmol Phospholipid).
  • Beispiel 11: Herstellung von Anti-HER2-immunoliposomalem Doxorubicin durch Modifikation von Doxil® mit Anti-HER2-Fab'-PEG-DSPE-Konjugat bei 37°C
  • Die Modifikation wurde wie im obigen Beispiel 9 beschrieben unter Anwendung von 0,31 ml Doxil® und 0,212 ml Anti-HER2-Fab'-PEG-DSPE-Präparat (Beispiel 4) durchgeführt, aber die Inkubation erfolgte bei 37°C über Nacht. Ermittelt: 46 Fab'/Liposom (82% Bindung des hinzugefügten Konjugats an Liposomen); Ein Arzneistoffaustritt wurde nicht beobachtet (Doxorubicin vor Modifikation: 145,9 μg/μmol Phospholipid; nach Modifikation: 146,0 μg/μmol Phospholipid). Die Übergangstemperatur des Lipidbestandteils von Doxil® (hydriertes Soja-Phosphatidylcholin) liegt nahe bei 55°C. Somit ist die Modifikation gleichermaßen wirksam, wenn die Liposomenlipide im Gelzustand sind.
  • Beispiel 12: Herstellung von Anti-HER2-immunoliposomalem Doxorubicin durch Modifikation von Doxil® mit Anti-HER2-scFv-PEG-DSPE-Konjugat bei 37°C
  • Die Modifikation wurde wie im obigen Beispiel 11 beschrieben unter Verwendung von 0,31 ml Doxil® und 0,4 ml C6.5Cys-PEG-DSPE-Konjugat-Präparat (Beispiel 5) durchgeführt. Ermittelt: 49 Proteine/Liposom (quantitative Bindung des Konjugats an Liposomen). Ein Arzneistoffaustritt wurde nicht nachgewiesen (Doxorubicin vor Modifikation: 145,9 μg/μmol Phospholipid; nach Modifikation: 150,3,0 μg/μmol Phospholipid). Somit war die Modifikation der Liposomen mit scFv-PEG-DSPE-Konjugat gleichermaßen wirksam, wenn die Liposomenlipide im Gelzustand waren.
  • Beispiel 13: Quantifizierung von Antikörperkonjugat in den Liposomen und Konjugationsprodukten, welche gemäß den Beispielen 6–12 hergestellt wurden.
  • Die Menge an Protein-PEG-Konjugat im Konjugationsprodukt und in den Liposomen wurde durch Polyacrylamidgelelektrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS-Page) unter nicht-reduzierenden Bedingungen gemäß Laemmli (1974) geassayt. Typischerweise wurden 5–20 μl große Aliquots von analytischer Probe mit 6×-Probenpuffer gemischt, der SDS und Spur-Farbstoff (Bromphenolblau) enthielt, 1 Minute lang bei 60°C inkubiert und auf ein Polyacrylamidgel (Abmessungen 10 × 10 × 0,075 cm) mit einer Konzentration von 10–12% und einem Vernetzungsmittel-Gehalt von 2,6% aufgetragen. Die Trennung wurde in einer vertikalen Flachgelelektrophorese-Vorrichtung bei einem konstanten Strom von 30 mA durchgeführt. Die Proteinbanden wurden durch Coomassie-Blau-Färbung unter Anwendung von herkömmlichen Verfahren entwickelt. Das Konjugat bildete eine getrennte Bande mit geringerer elektrophoretischer Mobilität als das Ursprungsprotein. Für die Quantifizierung von Protein wurden die Banden herausgeschnitten, und der Farbstoff wurde in 50% wässrigem Dimethylformamid bei 100°C während 30 Minuten extrahiert. Die Menge an extrahiertem Farbstoff wurde durch Spektrophotometrie bei 595 nm quantifiziert, und die Proteinmenge pro Bande wurde durch Vergleich mit einer Eichkurve ermittelt, die aus den ähnlich verarbeiteten Banden von einhergehend aufgetragenen Standardmengen an entsprechendem Protein 9 (Fab' oder scFV) erstellt wurde.
  • Beispiel 14: Zuführung von Doxorubicin an HER2-überexprimierende Krebszellen durch gemäß den Beispielen 9–12 hergestellte Anti-HER2-Immunoliposomen.
  • HER2-überexprimierende humane Brustkrebszellen (SK-BR-3) wurden kultiviert und ausplattiert, wie oben im Beispiel 8 beschrieben. Präparationen von Anti-HER2-immunoliposomalem Doxorubicin (obige Beispiele 9–12) wurden dem Zellkulturmedium in den Vertiefungen (in dreifacher Ausfertigung) zugesetzt, um eine Endkonzentration von 200 μM Liposom-Phospholipiden (0,030 ± 0,001 mg/ml Doxorubicin) zu erzielen. Die Platten wurden dann 4 Stunden bei vorsichtigem Bewegen bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Flüssigkeit aus den Vertiefungen abgesaugt, die Zellschichten wurden 3 Mal mit jeweils 1 ml Phosphatgepufferter Kochsalzlösung gespült und die Zellen wurden in 0,5 ml 5 mM EDTA in Phosphatgepufferter Kochsalzlösung abgeerntet, durch Zentrifugation pelletiert und mit 0,3N HCl/50% Ethanol-Mischung extrahiert. Die Mengen an Doxorubicin in den Ethanol-HCl-Extrakten wurden mittels Spektrofluorometrie (Anregungswellenlänge 470 nm; Emissionswellenlänge 590 nm) bestimmt und an die Menge der ausplattierten Zellen normiert. Zum Vergleich wurden Inkubationen auch mit den Liposomen durchgeführt, welche über im Voraus in die Liposom-Lipidmatrix eingebundene Mal-PEG-DSPE-Linker an Anti-HER2-scFv (C6.5Cys) konjugiert waren (Kirpotin et al., 1997). Um die Spezifität der Bindung zu überprüfen, wurden in einigen Vertiefungen die Zellen mit 5 μg des freien, zweiwertigen monoklonalen Anti-HER2-Antikörpers (Anti-HER2MAb) vorinkubiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst:
    Liposomale Doxorubicin-Präparation: Doxorubicin-Aufnahme, pg/Zelle (Mittelwert ± Standardabweichung)
    Beispiel 9 1,652 ± 0,046
    Beispiel 10 1,364 ± 0,016
    Beispiel 11 1,518 ± 0,040
    Beispiel 12 1,118 ± 0,005
    Anti-HER2-scFv, Konjugation an Liposomen-eingebundenen aktiven Linker 0,372 ± 0,015
    Beispiel 9 + Anti-HER2MAb 0,372 ± 0,015
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte Immunliposomen waren sogar effizienter zur Zuführung von Liposomen-verkapseltem Doxorubicin an Zielzellen fähig als Immunliposomen, welche durch frühere Verfahren hergestellt worden waren, d. h. Konjugation des Antikörperfragments an die Liposomen, welche aktivierten Linker enthielten. Die Vorinkubation der Zellen mit freiem Antikörper, welcher gegen das Zielantigen (HER2-Protein) auf der Zelloberfläche reaktiv war, verursachte eine zehnfache Verringerung der Aufnahme von immunoliposomalem Doxorubicin, welches gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt worden war; daher war die Aufnahme zielspezifisch.
  • Beispiel 15: Herstellung von Lipid-DNA-Komplex-Mikropartikeln mit konjugierten Antikörperfragmenten
  • Eine Suspension von Lipid-DNA-Mikropartikeln (mit Größenabmessungen von 410 ± 150 nm bei dynamischer Laserstreuung), welche aus Plasmid-DNA (pCMV/IVS-Luc+; 10 μg/ml), Dimethyldioctadecylammoniumbromid (DDAB, 60 nmol/ml) und Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE, 60 nmol/ml) zusammengesetzt waren, in 5% wässriger Dextrose, wurde wie von Hong et al. (FEBS Lett. 400: 233–237, 1997) beschrieben hergestellt. Fab'-PEG-DSPE-Konjugat wurde durch Coinkubation von Mal-PEG-DSPE und Anti-HER2-Antikörper-Fab'-Fragmenten bei einem Molverhältnis von 4:1, bei einer Konzentration des Proteins von 0,3 mg/ml in wässrigem physiologischen Puffer, bei pH 7,2 während 2 Stunden zubereitet. Lipid-DNA-Mikropartikel mit konjugierten Anti-HER2-Fab'-Fragmenten wurden durch Inkubation der Lipid-DNA-Mikropartikel mit dem Konjugat in der Menge von 0,5 Mol-% relativ zum gesamten Partikellipidgehalt während mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur zubereitet. Kontrollpartikel mit Linker allein (nicht-zielgerichtete Kontrolle) wurden auf gleiche Weise hergestellt, aber nicht-konjugiertes, β-Mercaptoethanol-abgelöschtes Mal-PEG-DSPE wurde für das Fab'-PEG-DSPE-Konjugat substituiert.
  • Beispiel 16: Zielgerichtete DNA-Transfektion der Zellen durch Lipid-DNA-Mikropartikel mit konjugierten Antikörperfragmenten
  • Die Transfektionsaktivität von pCMV/IVS-Luc+-DNA-Lipid-Mikropartikeln, die wie im obigen Beispiel 15 hergestellt worden waren, wurde in den folgenden Kulturen von humanen Brustkrebszellen untersucht: SK-BR-3 (welche das Zielantigen, HER2-Onkoprotein, überexprimieren) und MCF-7 (die Linie mit geringer Expression von HER2). Die Expression des Reportergens (Luciferase) wurde durch Luminometrie nach 24-ständigem Aussetzen der Zellen an Lipid-DNA-Komplexe (1 μg bzw. ^Zg DNA pro 50–100 000 Zellen) in mit 10% Serum ergänztem Wachstumsmedium ermittelt, und diente als das Maß der Transfektionseffizienz. Die ausführliche Beschreibung dieses experimentellen Vorgehens wird in Hong et al., FEBS Lett. 400: 233–237 (1997), angegeben. Gemäß dieser Erfindung zubereitete Anti-HER2-Fab'-konjugierte DNA-Lipid-Mikropartikel waren etwa 25 Mal wirkungsvoller für die Plasmidzuführung an Ziel-positive SK-BR-3-Zellen als entsprechende nicht-zielgerichtete Partikel. In den Ziel-negativen MCF-7-Zellen wiesen zielgerichtete und nicht-zielgerichtete DNA-Lipid-Partikel die gleiche Effizienz auf. Somit sind gemäß der Erfindung hergestellte Antikörper-modifizierte Lipid-DNA-Partikel zur zielspezifischen Zuführung von funktioneller DNA in humane Krebszellen in der Lage.
    Zellen: Mikropartikel Luciferaseexpression, ng/mg Zellprotein (Mittelwert ± Standardabweichung)
    SK-BR-3 DNA/Lipid allein 116,2 ± 35,4
    SK-BR-3 DNA/Lipid + Mal-PEG-DSPE (*Nicht-Ziel-Kontrolle) 40,4 ± 0,1
    SK-BR-3 DNA-Lipid + Fab'-PEG-DSPE (zielgerichtet) 995 ± 197
    MCF-7 DNA/Lipid allein 6,44 ± 0,34
    MCF-7 DNA/Lipid + Mal-PEG-DSPE (Nicht-Ziel-Kontrolle) 0,58 ± 0,30
    MCF-7 DNA-Lipid + Fab'-PEG-DSPE (zielgerichtet) 0,71 ± 13

Claims (34)

  1. Verfahren zur Bereitung eines lipidischen Mikropartikels, welches an einem Polypeptid von wenigstens 6000 Da mittels einem Linkermolekül befestigt ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: Inkubieren des lipidischen Mikropartikels, wobei das Polypeptid an ein Linkermolekül konjugiert ist, welches aufweist: a) eine hydrophobe Domäne, b) eine hydrophile Polymerkette, welche terminal an der hydrophoben Domäne befestigt ist, und c) eine chemische Gruppe, die zu einer oder mehreren funktionellen Gruppen auf dem Polypeptid reaktiv ist und an der hydrophilen Polymerkette an einem zu der hydrophoben Domäne kontralateralen Ende befestigt ist, für eine Zeit, die ausreichend ist um zu ermöglichen, dass sich die hydrophobe Domäne stabil mit dem lipidischen Mikropartikel verbindet.
  2. Verfahren zur Bereitung eines lipidischen Mikropartikels, welches an einem Polypeptid von wenigstens 6000 Da mittels einem Linkermolekül befestigt ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: Inkubieren des Polypeptids, welches eine terminal angehängte Aminosäuresequenz aufweist, die hauptsächlich Aminosäuren mit hydrophilen Seitenketten aufweist, wobei der Sequenz eine Lipid-Modifikationsstelle mit einer synthetisch angehängten Lipidhälfte folgt, mit dem lipidischen Mikropartikel für eine Zeit, die ausreichend ist um zu ermöglichen, dass sich die Lipidhälfte stabil mit dem lipidischen Mikropartikel verbindet.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das lipidische Mikropartikel ein Liposom ist.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das lipidische Mikropartikel ein Lipid:Nukleinsäurekomplex ist.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das lipidische Mikropartikel ein Lipid:Medikamentkomplex ist.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das lipidische Mikropartikel ein Mikroemulsionströpfchen ist.
  7. Verfahren gemäß einem der vorausgegangenen Ansprüche, wobei das Polypeptid ein Antikörper ist.
  8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Polypeptid ein Fab'-Fragment eines Antikörpers ist.
  9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Polypeptid ein Single-chain Fv-Antikörper ist.
  10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Polypeptid ein Enzym ist.
  11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Polypeptid ein Hormon ist.
  12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Polypeptid ein Wachstumsfaktor ist.
  13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Polypeptid ein Nukleinsäure-Bindeprotein ist.
  14. Verfahren gemäß einem der vorausgegangenen Ansprüche, wobei die reaktive Gruppe eine Maleinimidgruppe ist.
  15. Verfahren gemäß einem der vorausgegangenen Ansprüche, wobei die Inkubation in einem wässrigen Medium auftritt.
  16. Verfahren gemäß einem der vorausgegangenen Ansprüche, wobei das konjugierte Polypeptid einem Reinigungsschritt unterzogen wird, um dieses vor Inkubation mit dem Mikropartikel von nicht reagiertem Linker und nicht modifiziertem Polypeptid zu trennen.
  17. Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei der Reinigungsschritt aus der Gruppe gewählt ist, die aus Aussalzen, Dialyse und Chromatographie besteht.
  18. Verfahren gemäß einem der vorausgegangenen Ansprüche, wobei zwei oder mehr Polypeptide an dem lipidischen Mikropartikel befestigt sind.
  19. Verfahren zum Befestigen einer Vielzahl von Polypeptiden an einem lipidischen Mikropartikel, wobei wenigstens eins der Polypeptide durch das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 befestigt ist.
  20. Verfahren gemäß einem der vorausgegangenen Ansprüche, wobei das Mikropartikel in seiner Zusammensetzung Moleküle enthält, die mit der chemischen Gruppe reaktiv sind.
  21. Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die chemische Gruppe aus der Gruppe gewählt ist, die besteht aus: einer Aminogruppe, einer Carboxygruppe, einer Thiolgruppe, einer Maleinimidgruppe, einer Iodacetamidgruppe, einer Vinylsulfongruppe, einer Aldehydgruppe, einer Hydrazingruppe, einer Ketongruppe und einer Cyanurchloridgruppe.
  22. Lipidisches Mikropartikel, welches mit zwei oder mehr unterschiedlichen Polypeptiden von wenigstens 6000 Da konjugiert ist, wobei die Polypeptide jeweils mit dem lipidischen Mikropartikel durch ein Linker-Molekül konjugiert sind, wobei jedes Linker-Molekül aufweist: a) eine hydrophobe Domäne, b) eine hydrophile Polymerkette, welche terminal an der hydrophoben Domäne befestigt ist, und c) eine chemische Gruppe, die zu einer oder mehreren funktionellen Gruppen auf dem Polypeptid, das mit dem Linker konjugiert ist, reaktiv ist, wobei die chemische Gruppe an der hydrophilen Polymerkette an einem zu der hydrophoben Domäne kontralateralen Ende befestigt ist, wobei die funktionellen Gruppen für jedes Polypeptid gleich sind.
  23. Lipidisches Mikropartikel gemäß Anspruch 22, wobei das lipidische Mikropartikel aus der Gruppe gewählt ist, die besteht aus: einem Liposom, einem Lipid:Nukleinsäurekomplex, einem Lipid:Medikamentkomplex und einem Mikroemulsionströpfchen.
  24. Kit zum Bereiten eines an einem Polypeptid von wenigstens 6000 Da befestigten Mikropartikels, wobei das Kit aufweist: (i) einen Behälter mir dem lipidischen Mikorpartikel; und (ii) einen Behälter mit dem Polypeptid, welches mit einem hydrophilen Polymer verknüpft ist, das an einer hydrophoben Domäne befestigt ist; wobei sich das lipidische Mikropartikel und das Polypeptid stabil miteinander verbinden, wenn sie zusammen inkubiert werden.
  25. Kit gemäß Anspruch 24, wobei das Polypeptid mit dem hydrophilen Polymer durch chemische Derivatisierung verknüpft ist.
  26. Kit gemäß Anspruch 24, wobei das Polypeptid das hydrophile Polymer aufweist.
  27. Kit gemäß Anspruch 24, 25 oder 26, wobei das Polypeptid ein Antikörper, Antikörper-Fragment, ein Antikörper-Fab'-Fragment, ein Single-chain FV-Antikörper-Fragment, ein Rezeptorprotein, ein Lymphokin, ein Cytokin, ein Enzym, ein Hormon, ein Wachstumsfaktor oder ein Nukleinsäure-Bindeprotein ist.
  28. Kit gemäß einem der Ansprüche 24 bis 27, wobei sich das Polypeptid spezifisch an einen Zellflächen-Marker bindet.
  29. Kit gemäß einem der Ansprüche 24 bis 28, wobei das hydrophile Polymer ein PEG, PEG-PE, PEG-DSPE, PEG-derivatisiertes Detergens oder ein synthetisches Polymer ist.
  30. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das lipidische Mikropartikel ein PEGy-liertes Liposom ist.
  31. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei sich wenigstens 77% der Polypeptid-Moleküle stabil mit dem lipidischen Mikropartikel verbinden.
  32. Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei sich wenigstens 80% der Polypeptid-Moleküle stabil mit dem lipidischen Mikropartikel verbinden.
  33. Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei sich wenigstens 92,3% der Polypeptid-Moleküle stabil mit dem lipidischen Mikropartikel verbinden.
  34. Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei sich die Polypeptid-Moleküle quantitativ stabil mit dem lipidischen Mikropartikel verbinden.
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