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Technisches Gebiet
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Diese
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten
Enzyms, das eine hohe Aktivität
mit einem geringen Verlust der Enzymaktivität aufweist, für Hydrolyse
von Fetten und Ölen, den
Esteraustausch von Fetten und Ölen
und Veresterung von aliphatischen Säuren und Alkoholen verwendet
wird. Der Ausdruck "Fette
und Öle" bedeutet Fett, Öl, Schmalz,
Fett usw.
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Stand der Technik
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Bei
der Hydrolyse von Fetten und Ölen
durch ein lipolytisches (oder fett- oder ölzersetzendes) Enzym wird ein
immobilisiertes Enzym, hergestellt durch Immobilisieren eines lipolytischen
Enzyms auf einem anorganischen oder organischen Träger zur effizienten
Verwendung des Enzyms verwendet. Zur Erhöhung des Absorptionsvermögens des
Enzyms an einen Träger
und zur Verbesserung der Enzymaktivität wurden verschiedene Untersuchungen
durchgeführt,
und beispielsweise offenbart
JP-A-9-257 ein Verfahren
zur Erzeugung eines immobilisierten Enzymträgers, hergestellt durch Immobilisieren
einer Lipase auf einem anorganischen Träger, der mit einem Silan-Kupplungsmittel mit
einer speziellen funktionellen Gruppe behandelt ist, Waschen und
Trocknen und durch Imprägnieren
mit einer aliphatischen Säure.
Selbst durch dieses Verfahren bleibt jedoch die Menge des adsorbierten
Enzyms und die Enzymaktivität
noch unzureichend.
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Ein
immobilisiertes Enzym, hergestellt durch Immobilisieren eines lipolytischen
Enzyms, Lipase genannt, auf einem Träger wird als Enzym hauptsächlich zur
Verwendung in Reaktionen für
einen Esteraustausch (Esteraustausch oder Umesterung) von Fetten
und Ölen
und zur Veresterung von aliphatischen Säuren und Alkoholen verwendet.
Diese Reaktionen werden vorteilhaft bei möglichst niedrigen Wasserkonzentrationen
(1000 ppm oder weniger) durchgeführt,
um die Hydrolyse zu inhibieren, und somit wird das immobilisierte
Enzym stark getrocknet, so daß nur
mehrere Prozent Wassergehalt im Träger vorhanden sind, weil das
immobilisierte Enzym hergestellt wird.
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Das
adsorbierte Enzym neigt beim Trocknen des immobilisierten Enzyms
zur Inaktivierung, und es gibt viele Fälle, bei denen das Enzym nicht
die maximale Aktivität
bei der Adsorption entfaltet, wenn das Enzym tatsächlich die
Aktivität
davon entfaltet.
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JP-A-62-134090 beschreibt,
daß nach
der Immobilisierung das immobilisierte Enzym durch Kontakt mit aliphatischen
Säurederivaten
getrocknet wird, um hierdurch die Aktivität zu erhöhen, aber dieses Verfahren
ist weder praktisch noch effizient, weil teure Anlagen zum Trocknen
des immobilisierten Enzyms erforderlich sind und es weiterhin kompliziert ist,
die Bedingungen für
das langsame Trocknen, etc. einzustellen.
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Unter
diesen Umständen
ist es gewünscht, daß ein lipolytisches
Enzym hergestellt wird, so daß es
seine Aktivität
ausreichend entfaltet, und zu verhindern, daß das Enzym zurückbleibt
(oder entfernt wird) oder inaktiviert wird, wodurch die Menge des
für die
Lipolyse verwendeten Enzyms reduziert und die Veresterungsreaktion
gefördert
wird.
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Offenbarung der Erfindung
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Zur
Lösung
dieses Problems ist es gewünscht,
daß eine
größere Menge
eines lipolytischen Enzyms bei einem Adsorptionsschritt adsorbiert
wird, um so seine hohe Aktivität
zu entfalten und daß die Atmosphäre zur Förderung
der Reaktion um das immobilisierte Enzym herum kreiert wird. Diese
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten
Enzyms für
eine Lipolyse (oder Zersetzung von Fetten und ölen), umfassend die Adsorption und
Immobilisierung des Enzyms auf einem porösen Anionenaustauschharz als
immobilisierender Träger, das
mit Fetten und ölen
behandelt wird, und das oben beschriebene Problem wurde hierdurch
gelöst.
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Als
Ergebnis von intensiven Untersuchungen durch diese Erfinder zur
Lösung
dieses Problems wurde festgestellt, daß es notwendig ist, einen stabilen
Zustand des Enzyms zu halten, das auf dem Träger adsorbiert ist, wofür es effektiv
ist, ein Reaktionssubstrat (oder Reaktionsmittel) mit dem Enzym schnell
nach der Immobilisierung in Kontakt zu bringen.
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Das
heißt,
diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Immobilisieren eines
lipolytischen Enzyms auf einem Träger zur Immobilisierung durch
Adsorption und, ohne Trocknen, direktes Kontaktieren des immobilisierten
Enzyms mit seinem Substrat.
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Das
heißt
erfindungsgemäß wird das
lipolytische Enzym in einem nicht-getrockneten Zustand nach der
Immobilisierung mit seinem Substrat kontaktiert unter Erhalt des
immobilisierten Enzyms mit einem höheren Adsorptionsgrad und höherer Aktivität.
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Diese
Erfindung gibt ein Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten
Enzym an, umfassend folgende Schritte:
Immobilisieren eines
lipolytischen Enzyms auf ein poröses
Anionenaustauschharz für
einen Träger durch
Adsorption und, ohne Trocknen, direktes Kontaktieren des immobilisierten
Enzyms mit Fetten und Ölen
oder einem Derivat von Fetten und Ölen, worin der Wassergehalt
des immobilisierten Enzyms 20 Gew.% oder mehr ist.
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Das
Verfahren kann weiterhin bevorzugt die Behandlung des Trägerharzes
mit einer lipophilen (oder fett- und/oder öllösenden) aliphatischen Säure oder
einem Derivat einer lipophilen aliphatischen Säure vor dem Immobilisierungsschritt
umfassen.
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Das
immobilisierte Enzym kann mit Fetten und Ölen behandelt werden, und das
erhaltene immobilisierte Enzym ist zur Hydrolyse verwendbar.
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Alternativ
kann das immobilisierte Enzym mit dem Derivat von Fetten und Ölen behandelt
werden, und das erhaltene immobilisierte Enzym ist zur Veresterung
verwendbar.
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Das
verwendete Enzym ist bevorzugt Lipase. Dieses immobilisierte Enzym,
wie oben definiert, kann zur Hydrolyse oder Veresterung von Fetten
und Ölen
oder einem Derivat von Fetten und Ölen, zum Beispiel Hydrolyse
von Fetten und Ölen,
Veresterung von Derivaten von Fetten und Ölen wie Teilglyceriden, Glycerin
und einer aliphatischen Säure
verwendet werden.
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Bei
der Veresterung und Hydrolyse können die
Reaktionssubstrate Fette und Öle
wie Triglyceride oder ein Derivat von Fetten und Ölen sein.
Das Derivat von Fetten und Ölen
kann eine aliphatische Säure,
Glycerin oder Teilglycerid wie Monoglycerid und Diglycerid sein.
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Gemäß dieser
Erfindung kann das immobilisierte Enzym mit dem Reaktionssubstrat
für die
Hydrolyse oder Veresterung behandelt werden, mit dem unmittelbar
die Reaktion durchgeführt
wird. Alternativ kann das immobilisierte Enzym nach der Behandlung mit
Fetten und ölen
oder einem Derivat von Fetten und ölen gelagert werden.
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Beste Art zur Durchführung der
Erfindung
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Der
erfindungsgemäß verwendete
Träger
ist ein poröser
Anionenaustauschträger.
Der Teilchendurchmesser des Harzes ist wünschenswert 400 bis 1000 μm, und der
Porendurchmesser ist wünschenswert
100 bis 1500 Å.
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Die
Harzmaterialien umfassen solche auf Phenolformaldehyd-, Polystyrol-,
Acrylamid- und Divinylbenzol-Basis. Insbesondere ist ein Harz auf Phenolformaldehyd-Basis
gewünscht
(z.B. Warenname: Duolite A-568). Seine Poren geben eine große Oberfläche für die Adsorption
des Enzyms, unter Erhalt einer größeren Adsorptionsmenge.
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Erfindungsgemäß wird der
Träger
bevorzugt mit einer lipophilen aliphatischen Säure oder einem lipophilen aliphatischen
Säurederivat
für die
Vorbehandlung vor der Immobilisierung behandelt, wodurch ein Zustand
der Adsorption kreiert wird, unter Entfaltung einer hohen Aktivität. Die lipophile
aromatische Säure
oder das lipophile aliphatische Säurederivat hat bevorzugt 8
bis 18 Kohlenstoffatome. Beispielsweise umfaßt die aliphatische Säure lineare und
gesättigte
aliphatische Säuren
wie Caprinsäure, Laurinsäure und
Myristinsäure,
ungesättigte
aliphatischen Säuren
wie Ölsäure und
Linolsäure,
aliphatische Hydroxysäuren
wie Ricinolsäure
oder verzweigte aliphatische Säuren
wie Isostearinsäure.
Das aliphatische Säurederivat
umfaßt
Ester zwischen C8-18-aliphatischen Säuren und
Verbindungen mit einer Hydroxyl-Gruppe, und Beispiele davon umfassen Monoalkohol-
(einwertige oder monovalente Alkohol)-Ester, mehrwertige Alkoholester
(Polyol oder polyvalente Alkohole), Phospholipide oder Derivate
dieser Ester, an die Ethylenoxid addiert ist. Die Monoalkoholester
umfassen Methylester, Ethylester und die polyvalenten Alkoholester
umfassen Monoglycerid, Diglycerid und Derivate davon oder Polyglycerinfettsäureester,
Sorbitanfettsäureester,
Sucrosefettsäureester.
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Bei
dem Verfahren ist es gewünscht,
daß jede
dieser aliphatischen Säuren
und Derivate davon bei normaler Temperatur im flüssigen Zustand vorliegt. Sie
können
alleine oder kombiniert verwendet werden, um weitere Wirkungen zu
verursachen. Es wird berücksichtigt,
daß diese
Derivate in einem wäßrigen Katalysator
chemisch zersetzt sind oder mit einem lipolytischen Enzym hydrolysiert
werden, unter Bildung von aliphatischen Säuren.
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Um
diese lipophilen aliphatischen Säuren und
Derivate davon mit dem porösen
Anionenaustauschharz in Kontakt zu bringen, können sie direkt als solches
zu Wasser oder einem organischen Lösungsmittel gegeben werden,
oder zur Verbesserung des Dispersionsvermögens werden die lipophilen
aliphatischen Säuren
oder Derivate davon in einem Lösungsmittel
dispergiert und aufgelöst,
und dann können
sie zum porösen
Anionaustauschharz, das in Wasser dispergiert ist, gegeben werden.
Das bei diesem Schritt verwendete organische Lösungsmittel umfaßt Chloroform,
Hexan, Ethanol. Das Verhältnis der
lipophilen aliphatischen Säure
oder des Derivates davon zum porösen
Anionenaustauschharz ist bevorzugt 0,01 bis 1 Gew.% und insbesondere
bevorzugt 0,05 bis 0,5 Gew.-Teile der lipophilen aliphatischen Säure oder
des Derivats davon im Vergleich zu 1 Gew.-Teil (Trockengewichtbasis)
des porösen Anionaustauschharzes.
Die Temperatur für
den Kontakt ist 0 bis 100°C,
bevorzugt 20 bis 60°C.
Die Zeit für
den Kontakt kann etwa 5 Minuten bis etwa 5 Stunden sein. Nach dieser
Behandlung wird das Harz durch Filtration wiedergewonnen und kann
zu diesem Zeitpunkt getrocknet werden. Die Temperatur zum Trocknen
ist bevorzugt Raumtemperatur bis 100°C, und das Trocknen kann unter
vermindertem Druck durchgeführt
werden.
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Das
lipolytische Enzym, das erfindungsgemäß verwendet wird, umfaßt Lipasen,
die von Mikroorganismen (Mikroben oder Stämmen) der Art Rizopus, Aspergillus,
Chromobacterium, Mucor, Pseudomonas, Geotrichum, Penicillium und
Candida abgeleitet sind (oder stammen) ebenso wie tierische Lipasen
wie pankreatische Lipase. Für
den Erhalt von aliphatischen Säuren
mit einem hohen Zersetzungsgrad oder für den Erhalt von Triglyceriden
bei einem hohen Veresterungsgrad ist eine Lipase (statistischer Typ)
ohne Positionsselektivität
bevorzugt, und das Enzym, das von den Mikroorganismen stammt, wird bevorzugt
aus dem Genus Pseudomonas und Candida ausgewählt.
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Für den Erhalt
eines teilweisen Glycerides wie Monoglycerid und Diglycerid mit
einem hohen Veresterungsgrad ist eine Lipase mit einer Positionsselektivität bevorzugt.
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Die
Temperatur zum Durchführen
einer Immobilisierung ist 0 bis 60°C, bevorzugt 5 bis 40°C, weil keine
Inaktivierung eines Enzyms auftritt, aber die Temperatur kann in
Abhängigkeit
von den Eigenschaften des verwendeten Enzyms ausgewählt werden.
Der pH der Enzymlösung
liegt gut in dem Bereich, solange das Enzym nicht denaturiert wird.
Der pH von 3 bis 9 ist gewünscht.
Der pH kann ebenfalls gleichermaßen wie die Temperatur in Abhängigkeit von
den Enzymeigenschaften bestimmt werden. Der Puffer zum Aufrechterhalten
des pHs umfaßt
Essigsäurepuffer,
Phosphorsäurepuffer
und Tris-HCl-Puffer,
ist aber nicht hierauf beschränkt.
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In
dem Verfahren zur Immobilisierung gemäß dieser Erfindung ist die
Konzentration des Enzyms in einer Enzymlösung wünschenswert die Löslichkeit
des Enzym oder weniger und ist eine ausreichende Konzentration angesichts
der Immobilisierungseffizienz. Falls erforderlich werden unlösliche Enzyme
durch Zentrifugation entfernt und dann kann ein Überstand verwendet werden.
Das Verhältnis
des Enzyms zum Träger
für die
Immobilisierung ist 0,05 bis 10 Gew.-Teile und besonders bevorzugt
0,1 bis 5 Gew.-Teile des Enzyms im Vergleich zu 1 Gew.-Teile des
Trägers
für die
Immobilisierung.
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Um
das Enzym mit dem Träger,
der wie oben beschrieben behandelt ist, zu kontaktieren, ist es möglich, ein
Verfahren zum Dispergieren und Rühren eines
Trägers
in einer Enzymlösung
oder ein Verfahren zum Einführen
eines Trägers
in einen Packturm (oder eine Packsäule) wie eine Säle, etc.
einzuführen und
eine Enzymlösung
durch Gießen
unter Verwendung einer Pumpe usw. zu zirkulieren. Irgendein Verfahren
kann verwendet werden.
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Das
Verfahren für
diesen Schritt bei der Herstellung des immobilisierten Enzyms zur
Hydrolyse von Fetten und ölen
kann das gleiche sein wie bei der Herstellung des immobilisierten
Enzyms für
die Veresterungsreaktion.
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Nachfolgend
werden bevorzugte Ausführungsbeispiele
zur Herstellung des immobilisierten Enzyms für die Hydrolyse von Fetten
und ölen
beschrieben.
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Das
Reaktionssubstrat, das erfindungsgemäß verwendet wird und mit dem
das immobilisierte Enzym nach der Immobilisierung behandelt wird,
umfaßt
die Fette und öle
wie Rapssamenöl,
Sojabohnenöl,
Maisöl,
Olivenöl,
Talg, Fischöl.
Obwohl sie nicht beschränkt
sind, werden Fette und öle,
die tatsächlich
hydrolysiert sind, bevorzugt verwendet.
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Um
die Substrate mit dem immobilisierten Enzym nach der Immobilisierung
zu kontaktieren, wird das immobilisierte Enzym durch Filtration
von der Enzymlösung
nach der Immobilisierung wiedergewonnen, dann wird ein überschüssiger Wassergehalt
entfernt und ohne Trocknen wird das immobilisierte Enzym mit Fetten
und Ölen
als Substrat kontaktiert. Der Wassergehalt im immobilisierten Enzym ist,
obwohl er in Abhängigkeit
von der Art des verwendeten Trägers
variiert, 20 Gew.% oder mehr und bevorzugt im Bereich von 40 bis
60 Gew.%. Das immobilisierte Enzym kann in einen Packbehälter wie eine
Säule eingeführt werden,
zum Zirkulieren von Fetten und Ölen
durch den Packbehälter
mit beispielsweise einer Pumpe, oder das immobilisierte Enzym kann
in Fetten und Ölen
dispergiert sein. Die Temperatur für den Kontakt ist bevorzugt
normale Temperatur bis 60°C,
und diese Temperatur kann in Abhängigkeit
von den Eigenschaften des Enzyms ausgewählt werden. Weiterhin kann
die Kontaktzeit etwa 2 bis etwa 24 Stunden sein. Nach Beendigung dieses
Kontaktes erfolgt eine Filtration zur Wiedergewinnung des immobilisierten
Enzyms. Durch diesen Vorgang wird die Reaktionsstelle des immobilisierten Enzyms
geeignet für
die Hydrolyse. Das immobilisierte Enzym hat nach Durchführung dieser
Behandlung eine gute Lagerungsstabilität. Dies liegt vermutlich in der
Stabilisierung von Lipase durch Fette und Öle.
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Nachfolgend
werden bevorzugte Ausführungsbeispiele
zur Herstellung des immobilisierten Enzyms für die Veresterungsreaktion
beschrieben.
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Das
Substrat umfaßt
aliphatische C2-22-Säuren. Diese können gesättigt oder
ungesättigt
sein oder eine lineare Kette neben einer verzweigten Kette und/oder
einer konjugierten Doppelbindung, etc. enthalten. Weiterhin kann
das Substrat strukturelle Isomere davon enthalten und ist nicht
besonders beschränkt.
Zur Herstellung von Estern mit einer einzelnen aliphatischen Säurekomponente,
Teilglyceriden und/oder Triglyceriden können diese aliphatischen Säuren alleine
oder als Mischung von zwei oder mehreren Typen davon verwendet werden.
Weiterhin können
die aliphatischen Säuren
vollständig
oder teilweise von einem oder mehreren pflanzlichen Ölen und/oder
tierischen Fetten zersetzt sein. Auf der anderen Seite umfassen
die Alkohole ein- und zwei- oder mehrwertige C1-22-Alkohole.
Als Substrat werden die oben beschriebenen aliphatischen Säuren und
Alkohole so kombiniert, daß ein
gewünschtes verestertes
Produkt erzeugt werden kann, und das Substrat ist nicht auf spezifische
Verbindungen beschränkt.
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Das
immobilisierte Enzym nach der Immobilisierung durch Adsorption wird
von Wasser ausreichend durch ein physikalisches Verfahren befreit
und dann mit dem Substrat kontaktiert, zur Bewirkung der Veresterungsreaktion.
Der Wassergehalt im immobilisierten Enzym ist 20 Gew.% oder mehr
und bevorzugt im Bereich von 40 bis 60 Gew.%, obwohl dies je nach
Art des verwendeten Trägers
variiert.
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Bei
der Veresterungsreaktion wird die Reaktion durch Verschiebung unter
Dehydratisierung durchgeführt,
und daher kann, während
die Reaktion durchgeführt
wird, der überschüssige Wassergehalt, der
im immobilisierten Enzym verbleibt, gleichzeitig durch Verwendung
eines Dehydratisierungssystems entfernt werden. Nachdem das lipolytische
Enzym durch Adsorption auf einem Träger für die Immobilisierung immobilisiert
ist, wird die anfängliche
Veresterungsreaktion durch direktes Kontaktieren des immobilisierten
Enzyms ohne Trocknen mit dem Substrat durchgeführt, und die Entfernung dieses überschüssigen Wassergehaltes
in dieser anfänglichen Veresterungsreaktion
erfordert zusätzliche
Reaktionszeit, kann aber in deutlich kürzerer Zeit durchgeführt werden
als sie beim normalen Durchführen
des Trocknen des immobilisierten Enzyms erforderlich ist. Weiterhin
sind die Zusammensetzung und die Qualitäten eines Produktes, das bei
dieser anfänglichen
Reaktion erzeugt wird, keineswegs schlechter als die eines Produktes,
das in der zweiten oder späteren
Reaktion erzeugt wird. Bei dieser anfänglichen Veresterungsreaktion
ist die Zeit, die verstrichen ist bis der Wassergehalt ausreichend
ist, damit das Enzym seine Aktivität entfaltet, obwohl dies eine
Menge des immobilisierten Enzyms und von der Fähigkeit des verwendeten Dehydratisierungssystems
abhängt, üblicherweise
eine Stunde oder ähnlich.
Weil der überschüssige Wassergehalt
in der Anfangsreaktion entfernt wurde, ist die Zeit, die für die Entfernung von
Wasser in der anfänglichen
Reaktion erforderlich ist, in der zweiten oder späteren Reaktion
nicht notwendig, bei der das immobilisierte Enzym für die Veresterungsreaktion
erhalten werden kann.
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Für das Verfahren
für die
Veresterungsreaktion ist es möglich,
irgendwelche Verfahren anzuwenden, die allgemein bekannt sind, wie
die Dehydratisierung unter vermindertem Druck, die Glycerin-Dehydratisierung
und die Dehydratisierung unter Verwendung eines Dehydratisierungsmittels
wie Molekularsiebe. Weiterhin kann das immobilisierte Enzym in einem
Rührreaktor,
einem Reaktor mit einer gepackten Säule und einem Fließbettreaktor
verwendet werden.
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Gemäß dieser
Erfindung wird die maximale Aktivität des adsorbierten Enzyms verursacht
und die Veresterungsreaktion kann effizient stabil für eine lange
Zeitperiode durchgeführt
werden, indem ein stabiler Zustand beim immobilisierten Enzym verursacht
und maximal verhindert wird, daß das
Enzym aufgrund des Trocknens inaktiviert wird.
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Beispiele
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Beispiel 1
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10
Duolite A-568 (Diamond Shamrock Co., Ltd.) wurden 1 Stunde in 100
cm3 1/10 N NaOH gerührt. Nach der Filtration wurde
dies mit 100 cm3 entionisierten Wasser gewaschen
und der pH wurde mit 100 cm3 500 mm-Puffer
auf Essigsäure-Basis
eingestellt (pH 7). Danach wurde der pH zweimal 2 Stunden mit 100
cm3 50 mM-Puffer auf Essigsäure-Basis (pH
7) eingestellt. Danach wurde der Träger durch Filtration wiedergewonnen
und dann 50 cm3 Ethanol 30 Minuten verwendet,
um das Lösungsmittel
durch Ethanol zu ersetzen. Nach der Filtration wurden 50 cm3 Ethanol mit 10 g Ricinolsäure zugegeben,
und die Ricinolsäure
wurde 30 Minuten auf dem Träger adsorbiert.
Danach wurde der Träger
durch Filtration wiedergewonnen und 4-mal 30 Minuten mit 50 cm3 mM-Puffer auf Essigsäure-Basis (pH 7) gewaschen, zur
Entfernung des Ethanols, und der Träger wurde durch Filtration
wiedergewonnen. Danach wurde der Träger 5 Stunden mit einer Enzymlösung mit
10 g kommerzieller Lipase (Lipase OF, Meito Sangyo Co., Ltd.), aufgelöst in 90
cm3 50 mM-Puffer auf Essigsäure-Basis
(pH 7) kontaktiert, wodurch das Enzym auf dem Träger immobilisiert wurde. Das
immobilisierte Enzym wurde durch Filtration wiedergewonnen und mit
100 cm3 50 mM-Puffer auf Essigsäure-Basis
(pH 7) gewaschen, zum Waschen des Enzyms und Proteins, die nicht
immobilisiert sind. Danach wurden 40 g Sojabohnenöl, das tatsächlich zersetzt
werden sollte, zugegeben und 12 Stunden gerührt. All diese Vorgänge wurden
bei 20°C
durchgeführt.
Danach wurde das immobilisierte Enzym durch Filtration vom Öl getrennt.
Der Immobilisierungsgrad, gemessen durch den Unterschied zwischen
der Restaktivität
der Enzymlösung
nach der Immobilisierung und der Aktivität der Enzymlösung vor
der Immobilisierung war 82 %. Dies ist etwa 20 % höher als
der Immobilisierungsgrad durch das konventionelle Verfahren.
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2,8
g (1 g auf Trockengewichtsbasis) des immobilisierten Enzyms, das
somit erhalten wurde, wurden genau in einem 50 cm3 Erlenmeyer-Kolben
gewogen, der mit einer Schraube ausgerüstet war. 10 g Sojabohnenöl und 6
g destilliertes Wasser wurden zugegeben und konnten unter Schütteln bei
200 Upm bei 40°C
reagieren. 30 Minuten nach Initiierung der Reaktion war der Zersetzungsgrad
83 %. In der zweistündigen
Reaktion erreichte der Zersetzungsgrad 97 %. Als Zersetzungsgrad
wird ein Wert als Prozentsatz ausgedrückt, erhalten durch Dividieren
des Säurewertes
(AV) durch den Verseifungswert (SV). Diese Zersetzungsrate ist der
höchste
Wert unter denen des immobilisierten Enzyms, hergestellt in den
oben angegebenen Verfahren.
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Beispiel 2
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Nach
Beendigung der Reaktion entsprechend dem in Beispiel 1 gezeigten
Verfahren wurde die Gesamtmenge des immobilisierten Enzyms wiedergewonnen,
und die Reaktion wurde mit den anfänglich zugegebenen Zusammensetzungen
gemäß Beispiel
1 wiederholt. Die Reaktion wurde 5-mal wiederholt, und 2 Stunden
nach Initiierung der Reaktion wurden Zersetzungsgrade von 97,0 %.
97,2 %, 96,5 %, 96,8 % und 96,5 % erhalten.
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Beispiel 3
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10
g Duolite A-568 (Diamond Shamrock Co., Ltd.) wurden 1 Stunde in
100 cm3 1/10 N NaOH gerührt. Nach der Filtration wurde
dies mit 100 cm3 entionisiertem Wasser gewaschen
und der pH wurde mit 100 cm3 500 mM-Puffer
auf Essigsäure-Basis
(pH 7) eingestellt. Danach wurde der pH zweimal 2 Stunden mit 100
cm3 50 mM Acetatpuffer (pH 7) eingestellt.
Danach wurde der Träger
durch Filtration wiedergewonnen und dann wurden 50 cm3 Ethanol
30 Minuten verwendet, um das Lösungsmittel
durch Ethanol zu ersetzen. Nach der Filtration wurden 50 cm3 Ethanol mit 10 g Ricinolsäure zugegeben
und die Ricinolsäure
wurde auf dem Träger
30 Minuten lang adsorbiert. Danach wurde der Träger durch Filtration wiedergewonnen
und 4-mal 30 Minuten mit 50 cm3 50 mM-Puffer
auf Essigsäurebasis
(pH 5) gewaschen, zur Entfernung des Ethanols, und der Träger wurde
durch Filtration wiedergewonnen. Danach wurde der Träger 5 Stunden
mit einer Enzymlösung mit
10 g kommerzieller Lipase (Li Lipase, Nagase Sangyo Co., Ltd.),
aufgelöst
in 90 cm3 50 mM-Puffer auf Essigsäure-Basis
(pH 7), kontaktiert, wodurch das Enzym auf dem Träger immobilisiert
wurde. Das immobilisierte Enzym wurde durch Filtration wiedergewonnen
und mit 100 cm3 50 mm-Puffer auf Essigsäure-Basis
(pH 7) gewaschen, zum Waschen des Enzyms und des Proteins, das nicht
immobilisiert war. Alle Vorgänge
wurden bei 20°C
durchgeführt. Der
Immobilisierungsgrad, gemessen durch den Unterschied zwischen der
Restaktivität
der Enzymlösung
nach der Immobilisierung und der Aktivität der Enzymlösung vor
der Immobilisierung war 98 %.
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Dann
wurden 100 g aliphatische Säure,
gebildet durch Zersetzung von Sojabohnenöl zugegeben und gut gerührt, und
16 g Glycerin wurden zugegeben und die Veresterungsreaktion wurde
unter vermindertem Druck (13 Pa oder weniger) bei 40°C durchgeführt.
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Die
DG (Diglycerid)-Ausbeute (Diglycerid-Gehalt + Triglycerid-Gehalt)
im Reaktionsöl
erreichte in 4 Stunden der Reaktion 63 %. Nach dieser Reaktion wurde
das Öl
nach der Reaktion durch Filtration getrennt, zur Wiedergewinnung
der gesamten immobilisierten Enzyms, und 100 g der Sojabohnenzersetzten
aliphatischen Säure
und 16 g Glycerin wurden zugegeben, und die gleiche Reaktion wurde noch
zweimal durchgeführt.
Als Ergebnis war die DG-Ausbeute im Öl nach der Reaktion 62 % innerhalb
von 2 Stunden bei jeder zweimal durchgeführten Reaktion. Bei der oben
beschriebenen wiederholten Reaktion ist die Zusammensetzung der
Komponenten im Reaktionsöl
bei der Reaktion bei einer DG-Ausbeute von etwa 62 % in Tabelle
1 gezeigt.
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Vergleichsbeispiel 1
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Das
immobilisierte Enzym, hergestellt in Beispiel 3, wurde bei 40°C unter vermindertem
Druck (133 Pa oder weniger) einen gesamten Tag und Nacht in der
Abwesenheit einer Sojabohnenölzersetzten
aliphatischen Säure,
gezeigt in Beispiel 3, getrocknet. Der Wassergehalt des immobilisierten
Enzyms nach dem Trocknen war etwa 2 %. Unter Verwendung von 10 g
dieses immobilisierten Enzyms wurde die Veresterungsreaktion dreimal
auf gleiche Weise wie bei Beispiel 3 wiederholt. Als Ergebnis war die
DG-Ausbeute bei jeder Reaktion 62 bis 63 % in 3-stündiger
Reaktion. Bei der oben beschriebenen wiederholten Reaktion ist die
Zusammensetzung der Komponenten im Reaktionsöl aufgrund der Reaktion bei
einer DG-Ausbeute von 62 % in Tabelle 1 gezeigt.
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Der
Anteil der Komponenten im Öl
nach der Reaktion in den obigen Beispielen ist ein Ergebnis, erhalten
durch Analyse der Probe mit Gaschromatographie nach Trimethylsilylierung.
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Der
Vergleich zwischen Beispiel 3 und Vergleichsbeispiel 1 ergab, daß dann,
wenn die Reaktion ohne Trocknen des immobilisierten Enzyms gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
durchgeführt wurde,
die Reaktionszeit vermindert werden kann, während die Qualitäten des
Produktes nicht beeinträchtigt
werden. Ein Vergleich zwischen den Veresterungsaktivitäten der
jeweiligen Enzyme zeigt, daß das
mit dem Reaktionssubstrat behandelte Enzym eine 150%ige Aktivität (verglichen
mit dem getrockneten Enzym) entfaltet.