DE69935828T2

DE69935828T2 - Alkalische Ceramidase (E.C. 3.5.1.23) kodierendes Gen aus Pseudomonas aeruginosa

Info

Publication number: DE69935828T2
Application number: DE69935828T
Authority: DE
Inventors: Nozomu Fukuoka-shi Okino; Makoto Fukuoka-shi ITO
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1998-08-20
Filing date: 1999-08-20
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2019-08-21
Also published as: US20020058305A1; DE69935828D1; EP0980912B1; US6258581B1; USRE38689E1; EP0980912A1; KR20000017393A; KR100632767B1; US6489117B2; ATE360076T1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität und auf ein Gen, welches das Polypeptid codiert. Spezieller bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Aminosäuresequenz der Ceramidase sowie auf eine Nucleotidsequenz, welche die Aminosäuresequenz codiert, die als Reagenz für Lipid-Konstruktion zum Analysieren der Struktur und Wirkung von Ceramid und als ein Anzeiger zur Diagnose der atopischen Dermatitis brauchbar sind. Zusätzlich bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids mit Ceramidase-Aktivität durch Gentechnologie. Weiter bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Nachweisen des Polypeptids und ein Verfahren zum Nachweisen eines Gens, welches das Polypeptid codiert. Weiter bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Nachweisen der atopischen Dermatitis durch Anwenden des voranstehenden Verfahrens zum Nachweisen des Polypeptids und des voranstehenden Verfahrens zum Nachweisen des Gens.
Ceramidase ist ein Enzym, das Ceramid, welches eines der Sphingolipide ist, zu Sphingosin und einer Fettsäure hydrolysiert. Das durch Hydrolyse von Ceramid durch Ceramidase gebildete Sphingosin hat verschiedene physiologische Aktivitäten, wie die Hemmung von Proteinkinase C, die Aktivierung von Phospholipase D, die Hemmung eines Calmodulin-abhängigen Enzyms und desgleichen und ist eine wichtige Substanz, von der man annimmt, dass sie eine Rolle in der Regulierung zellulärer Funktionen durch ihre Beteiligung bei der Zellproliferation und intrazellulären Signaltransduktion hat. Die Regulierung des Niveaus von solchem Sphingosin ist eine wichtige Funktion von Ceramidase.
Ceramidasen werden auf Grundlage ihres pH-Optimums in eine saure Ceramidase und eine neutrale/alkalische Ceramidase klassifiziert. Es gibt Berichte, dass Ceramidasen mit einem pH-Optimum in einem sauren Bereich in Säugetiergeweben wie Rattenhirn [Biochemistry, 8, 1692–1698 (1969)], Epithelzelle des Meerschweinchens [J. Biol. Chem., 270, 12677–12684 (1995)], menschlicher Niere [Biochim. Biophys. Acta, 398, 125–131 (1975)], Milz (Biochim. Biophys. Acta, 1004, 245–251 (1989)], Fibroblast [Biochem. J., 205, 419–425 (1982)] und Epithel [FEBS Lett., 268, 110–112 (1990)]; menschlichem Urin [J. Biol. Chem., 270, 11098–11102 (1995)] und desgleichen anwesend sind.
Unter diesen Ceramidasen wurden die Aminosäuresequenzen und die Nucleotidsequenzen der aus menschlichem Urin aufgereinigten Ceramidase bestimmt [J. Biol. Chem., 271, 33110–33115 (1996)]. Unter Nutzung der Homologie mit diesem Gen wurde auch ein Ceramidase-Gen einer Maus erhalten [Genomics, 50, 267–274 (1998)]. Jedoch sind alle diese saure Ceramidasen, die von Säugetieren stammen, und Aminosäuresequenzen oder Nucleotidsequenzen von neutraler/alkalischer Ceramidase oder von Ceramidasen, die von Mikroorganismen stammen, wurden noch nicht bestimmt. Zum Beispiel beschreibt JP 10 014563 einen Mikroorganismus, der Ceramidase herstellt, und ein Verfahren zum Isolieren der Ceramidase.
Andererseits ist es von einem Ceramidase-herstellenden Mikroorganismus bekannt, dass er auf der Epidermis der Läsion von atopischer Dermatitis anwesend ist, und es wird vorgeschlagen, dass dieses Enzym bei der Verschlimmerung der atopischen Dermatitis ursächlich ist oder beteiligt ist. Jedoch ist dieses Enzym eine Ceramidase, deren pH-Optimum innerhalb eines alkalischen Bereichs ist (nachstehend als alkalische Ceramidase bezeichnet) [J. Biol. Chem., 273, 14368–14373 (1998)].
Wenn eine natürlich vorkommende Ceramidase von einem Ceramidaseherstellenden Mikroorganismus hergestellt wird, ist es notwendig, ein teures Sphingolipid zu einem Kulturmedium hinzuzufügen, um die Herstellung eines Enzyms zu induzieren, und beim Aufreinigungsschritt ist es notwendig, das restliche Sphingolipid oder ein Abbauprodukt davon von einer Fraktion, die Ceramidase enthält, abzutrennen und zu entfernen. Da Enzyme außer Ceramidasen, wie Sphingomyelinase, gleichzeitig während der Züchtung hergestellt werden, ist es zusätzlich schwierig, nur eine gewünschte Ceramidase von diesen Enzymen zu isolieren und aufzureinigen. Außerdem sind die Aminosäuresequenzen und die Genstrukturen der von Mikroorganismen stammenden alkalischen Ceramidase vollständig unbekannt, so dass das Verfahren zur Herstellung von Ceramidase durch Gentechnologie nicht angewandt werden kann.
Obwohl erwartet wird, dass die Anwesenheit des Ceramidase-herstellenden Mikroorganismus als ein Anzeiger zur Diagnose der atopischen Dermatitis und als ein Verfahren zum Bestätigen einer therapeutischen Wirkung verwendet werden kann, waren darüber hinaus bisher keine Mittel zum einfachen Nachweisen oder Identifizieren solch eines Mikroorganismus bekannt. Konventionelle Verfahren machten extrem komplizierte Prozesse notwendig, um den Mikroorganismus zu isolieren und dann zu züchten, und danach seine Ceramidase-Aktivität zu testen.
Demnach war das technische Problem, das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, ein kostengünstiges Verfahren zur Herstellung einer Ceramidase von hoher Reinheit, die aus Mikroorganismen stammt, sowie ein einfaches und nicht zeitaufwendiges Verfahren zum Nachweisen eines Ceramidase-herstellenden Mikroorganismus bereitzustellen.
Die Lösung dieses technischen Problems wird durch Bereitstellen der Ausführungsformen, die in den Patentansprüchen charakterisiert sind, erreicht.
Demgemäß ist ein erstes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität bereitzustellen. Ein zweites Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Gen, welches das vorstehende Polypeptid codiert, bereitzustellen. Ein drittes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine Transformante, die mit dem vorstehenden Gen transformiert ist, bereitzustellen. Ein viertes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Herstellungsverfahren bereitzustellen, das leicht und in großer Menge Ceramidase von hoher Reinheit unter Verwendung der vorstehenden Transformante herstellen kann. Ein fünftes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine Oligonucleotid-Sonde oder einen -Primer bereitzustellen, die/der spezifisch mit dem Gen der vorliegenden Erfindung hybridisieren kann. Ein sechstes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, einen Antikörper oder ein Fragment davon bereitzustellen, der/das spezifisch an ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung binden kann. Ein siebtes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Nachweisen eines Ceramidase-Gens durch Verwendung der Oligonucleotid-Sonde oder des -Primers der vorliegenden Erfindung bereitzustellen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde ein Gen, das ein Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität codiert, isoliert und die Nucleotidsequenz des Gens wurde aufgeklärt. Zusätzlich wurde auf Grundlage solcher Befunde ein Verfahren etabliert, dass leicht und in großer Menge Ceramidase von hoher Reinheit herstellen kann; ein Verfahren zum Nachweisen eines Polypeptids mit Ceramidase-Aktivität; und ein Verfahren zum Nachweisen des Ceramidase-Gens. Zusätzlich wurde die Korrelation zwischen solcher Ceramidase und atopischer Dermatitis gefunden, wodurch ein Verfahren zum einfachen Nachweisen der atopischen Dermatitis etabliert werden konnte.
Speziell folgt nun das Wesentliche der vorliegenden Erfindung:
ein Gen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einem Gen, das ein Polypeptid codiert, das die in SEQ ID NO:1 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst;
(b) einem Gen, das die in SEQ ID NO:2 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst;
(c) einem Gen, das ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz des Polypeptids umfasst, das von dem Gen codiert wird, das von dem in FERM BP-6728 enthaltenen Vektor getragen wird;
(d) einem Gen, das die Nucleotidsequenz des Gens umfasst, das von dem in FERM BP-6728 enthaltenen Vektor getragen wird;
(e) einem Gen, das mit dem komplementären Strang des Gens gemäß (a) bis (d) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann und ein Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität codiert;
(f) einem Gen, das ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz des Polypeptids umfasst, das von dem Gen gemäß (e) codiert wird; oder der komplementäre Strang davon; ein Vektor, umfassend ein beliebiges der vorgenannten Gene; der vorgenannte Vektor, in dem das Gen funktionell mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden ist; eine Transformante, die mit einem beliebigen der vorgenannten Gene oder dem vorgenannten Vektor transformiert ist; ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit Ceramidase-Aktivität, umfassend das Züchten der vorstehend beschriebenen Transformante und das Ernten eines Polypeptids mit Ceramidase-Aktivität aus der entstandenen Kultur; ein(e) Oligonucleotid-Sonde oder -Primer, die/der unter stringenten Bedingungen mit den hierin beschriebenen Genen oder mit einem Gen mit einer dazu komplementären Nucleotidsequenz hybridisieren kann; ein Verfahren zum Nachweis eines Gens, das ein Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität codiert, umfassend das Verwenden der/des vorstehend beschriebenen Oligonucleotid-Sonde und/oder -Primers; ein Kit zum Nachweis eines Gens, das ein Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität codiert, umfassend die/den Oligonucleotid-Sonde und/oder -Primer des vorstehenden Punktes; die Verwendung der/des hierin beschriebenen Oligonucleotid-Sonde oder- Primers zum Nachweis eines Gens, das ein Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität codiert.

Die Figur zeigt:
1 zeigt die Karte einer Restriktionsendonuclease für die Insert-DNA der Plasmide pSCA59 und pGCB38.
(1) Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität
In der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff „Ceramidase" ein Enzym mit Aktivität zur Hydrolyse von Ceramid in Sphingosin und eine Fettsäure, wie vorstehend erwähnt.
Ceramidase-Aktivität kann gemäß einem in zum Beispiel Journal of Biological Chemistry, 273, 14368–14373 (1998) beschriebenen Verfahren bestimmt werden.
In der vorliegenden Erfindung beinhaltet eine Quelle von Ceramidase, aber ist nicht besonders beschränkt auf, zum Beispiel Ceramidasen, die aus Mikroorganismen wie Bakterien, Actinomyceten, Hefen, Fadenpilze, Ascomyceten und Basidiomyceten stammen; oder Ceramidasen, die aus Organismen wie Pflanzen, Tiere und Insekten stammen. Konkret wird zum Beispiel der Pseudomonas aeruginosa-Stamm AN-17, isoliert von der Haut von Patienten mit atopischer Dermatitis, als Quelle zum Erhalten der Ceramidase der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Eine Aminosäuresequenz der Ceramidase, die von dem vorstehenden Stamm stammt, wird in SEQ ID NO:1 im Sequenzprotokoll gezeigt.
Im übrigen bezeichnet in der vorliegenden Erfindung der Begriff „Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität" (das Polypeptid kann hierin einfach als Ceramidase bezeichnet werden) ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO:1 im Sequenzprotokoll gezeigt. Der Begriff „Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität" kann weiter nicht nur ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Ceramidase umfassen, sondern auch ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die eine Mutation wie Substitution, Deletion, Addition oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren in der Aminosäuresequenz hat, wie in SEQ ID NO:1 gezeigt, solange das Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die eine Mutation hat, ein Polypeptid mit dem gleichen Niveau von Ceramidase-Aktivität ist, wie durch das Verfahren für die Aktivitätsbestimmung bestimmt, wie vorstehend beschrieben. Zusätzlich kann das Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz zwei oder mehr Mutationen haben, solange die vorstehende Mutation eine Mutation ist, bei der das erhaltene Polypeptid Ceramidase-Aktivität hat. Wie hierin beschrieben, beinhaltet „eine Aminosäuresequenz mit einer Mutation" Aminosäuresequenzen, bei denen eine natürlich vorkommende Mutation eingebracht wird sowie jene, bei denen eine künstliche Mutation eingebracht wird.
(2) Ceramidase-Gen
Das Ceramidase-Gen der vorliegenden Erfindung bezeichnet ein Gen, welches das vorstehende Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität codiert, d.h. eine Nucleinsäure mit einer Nucleotidsequenz, die eine Aminosäuresequenz eines Polypeptids mit Ceramidase-Aktivität codiert. Das Ceramidase-Gen der vorliegenden Erfindung beinhaltet zum Beispiel ein Gen, das Ceramidase codiert, die aus dem vorstehenden Pseudomonas aeruginosa-Stamm AN-17 stammt, von dem die Nucleotidsequenz in SEQ ID NO:2 im Sequenzprotokoll gezeigt wird. Das Ceramidase-Gen der vorliegenden Erfindung kann auch ein Gen umfassen, das eine Aminosäuresequenz eines Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz codiert, die Substitution, Deletion, Addition oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren in der vorstehenden Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Ceramidase hat, und das Ceramidase-Aktivität hat.
Das Gen der vorliegenden Erfindung kann auch ein Gen mit Nucleotidsequenz umfassen, die Substitution, Deletion, Addition oder Insertion von einer oder mehreren Basen in der Nucleotidsequenz hat, wie in SEQ ID NO:2 im Sequenzprotokoll gezeigt, und ein Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität codiert.
Wie hierin beschrieben, beinhaltet die „Nucleotidsequenz, die Substitution, Deletion, Addition oder Insertion hat" eine Nucleinsäuresequenz, in die eine natürlich vorkommende Mutation eingebracht wird oder eine künstliche Mutation eingebracht wird.
Weiter umfasst das Gen der vorliegenden Erfindung ein Gen, das mit den vorstehend erwähnten Ceramidase-Genen unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann, und das ein Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität codiert. Die Hybridisierung kann durch ein in z.B. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. Aufl., publiziert von Cold Spring Harbor Laboratory in 1989, herausgegeben von T. Maniatis et al., beschriebenes Verfahren durchgeführt werden. Die Bedingungen zur Hybridisierung beinhalten zum Beispiel die Bedingungen der Inkubation mit einer Sonde bei 60°C über Nacht in einer Lösung, die 6 × SSC (Zusammensetzung von 1 × SSC: 0.15 M NaCl, 0.015 M Natriumcitrat, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 × Denhardt-Reagenz und 100 mg/ml Heringssperma-DNA enthält.
Da die Primärstruktur und die genetische Struktur von Ceramidase durch die vorliegende Erfindung aufgeklärt werden, kann ein Gen, das ein Polypeptid mit zumindest einer Deletion, Addition, Insertion oder Substitution von einem oder mehreren Aminosäureresten in einer Aminosäuresequenz von natürlich vorkommender Ceramidase codiert, mit Hilfe des Einbringens einer Zufallsmutation oder ortspezifische Mutation in das Gen der vorliegenden Erfindung erhalten werden, wodurch es möglich gemacht wird, Gene zu erhalten, die Ceramidasen codieren, die Ceramidase-Aktivität mit geringen Unterschieden in den Eigenschaften wie Temperatur-Optimum, stabile Temperatur, pH-Optimum und stabiler pH-Wert haben. Zusätzlich können diese Ceramidasen durch Gentechnologie hergestellt werden.
Das Verfahren zum Einbringen einer Zufallsmutation beinhaltet zum Beispiel ein Verfahren zum Verursachen einer Transitionsmutation, in der die Cytosin-Base durch eine chemische Behandlung mit Natriumhydrogensulfit in eine Uracil-Base umgewandelt wird [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79, 1408–1412 (1982)]; ein Verfahren zur Senkung der Genauigkeit der Einlagerung von Nucleotiden bei der DNA-Synthese durch Ausführen der PCR in einer Reaktionsmischung, die Mangan enthält [Anal. Biochem., 224, 347–353 (1995)], und desgleichen.
Das Verfahren zum Einbringen einer ortsspezifischen Mutation beinhaltet zum Beispiel ein Verfahren, das eine Ambermutation anwendet [Gapped-Duplex-Verfahren; Nucleic Acids Res., 12, 9441–9456 (1984)]; ein Verfahren, das einen Wirt anwendet, in dem die Gene dut (dUTPase) und ung (Uracil-DNA-Glycosilase) deletiert werden [Kunkel-Verfahren; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 488–492 (1985)]; ein Verfahren, welches das Ausführen der PCR durch Anwendung der Ambermutation umfasst (W098/02535) und desgleichen. Verschiedene Kits zum Einbringen der ortsspezifischen Mutation in das gewünschte Gen durch diese Verfahren sind kommerziell erhältlich und durch Anwenden der vorstehenden Kits kann leicht ein Gen erhalten werden, in das eine gewünschte Mutation eingebracht wird.
Ein Verfahren zum Erhalten eines von einem Mikroorganismus stammenden Ceramidase-Gens mit Hilfe des Hybridisierungsverfahrens wird nachstehend beschrieben werden.

1) Zuerst wird eine Teil-Aminosäuresequenz der Ceramidase als Information zum Herstellen einer Sonde zum Clonieren eines Ceramidase-Gens bestimmt. Eine aufgereingte Ceramidase wird der konventionellen Aminosäuresequenzierung durch den Edman-Abbau ohne irgendeine Behandlung unterworfen [J. Biol. Chem., 256, 7990–7997 (1981)], oder ein aufgereinigtes Peptidfragment, isoliert und aufgereinigt aus einer Peptidmischung, die durch begrenzte Hydrolyse durch ein hoch substratspezifisches proteolytisches Enzym wie Lysyl-Endopeptidase und N-Tosyl-L-phenylalanyl-chlormethylketon (TPCK)-Tripsin erhalten wird, wird einer Aminosäuresequenzierung unterworfen. Auf Grundlage der Information der Teil-Aminosäuresequenz, wie vorstehend aufgeklärt, wird ein Oligonucleotid entworfen und chemisch synthetisiert, um als Sonde für die Hybridisierung verwendet zu werden.
2) Genomische DNA aus einem Ceramidase-herstellenden Mikroorganismus wird präpariert, vollständig mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut, durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und dann durch ein übliches Verfahren auf eine Nylonmembran geblottet. Das DNA-Fragment auf der Nylonmembran wird mit der synthetischen Oligonucleotid-Sonde, vorstehend beschrieben, unter allgemein verwendeten Bedingungen hybridisiert. Zum Beispiel wird die Nylonmembran in einer Pre-Hybridisierungslösung, die Lachssperma-DNA enthält, blockiert und dann über Nacht zusammen mit einer ³²P-markierten synthetischen Oligonucleotid-Sonde inkubiert. Nach Waschen der Nylonmembran wird ein Autoradiogramm gemacht, und ein DNA-Fragment, das mit dem synthetischen Oligonucleotid hybridisiert, wird nachgewiesen.
3) Ein DNA-Fragment, das dem Signal auf dem Autoradiogramm entspricht, wird extrahiert und von dem Agarosegel aufgereinigt. Das so erhaltene DNA-Fragment wird in einen Vektor wie einen Plasmidvektor durch ein üblicherweise angewandtes Verfahren eingebaut, um ein rekombinantes DNA-Molekül zu präparieren. Der Vektor kann ein beliebiger von verschiedenen kommerziell erhältlichen Vektoren sein. Anschließend wird das rekombinante DNA-Molekül in einen geeigneten Wirt wie Escherichia coli eingebracht, um eine Transformante zu erhalten. Das Verfahren der Transformation kann ein üblicherweise angewandtes Verfahren sein wie eines, ausgewählt in Abhängigkeit von einem zu verwendenden Vektor aus jenen, die in dem vorstehenden Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl. beschrieben sind und desgleichen.
4) Anschließend wird die Transformante, die ein Fragment eines Ceramidase-Gens beherbergt, durchmustert. Ein Durchmusterungsverfahren kann aus der Koloniehybridisierung, Plaque-Hybridisierung und desgleichen, abhängig von den Arten der Vektoren, ausgewählt werden. Es kann auch das PCR-Verfahren unter Verwendung einer Kolonie oder eines Plaques wie sie/er ist als Probe oder ein Verfahren unter Anwendung einer Expression von Ceramidase-Aktivität als ein Anzeiger verwendet werden.
5) Ein rekombinantes DNA-Molekül, in das ein Fragment eines Ceramidase-Gens eingebaut wird, wird aus einer Transformante, die das Fragment beherbergt, hergestellt, und die Nucleotidsequenz des Fragments wird analysiert. Die Nucleotidsequenz kann durch ein übliches Verfahren wie das Didesoxy-Verfahren bestimmt werden. Durch Vergleichen der so bestimmten Nucleotidsequenz mit der Teil-Aminosäuresequenz der vorher erhaltenen Ceramidase und dem Molekulargewicht der Ceramidase kann dort bestimmt werden, ob das erhaltene DNA-Fragment das gesamte gewünschte Ceramidase-Gen oder eine Teilsequenz davon ist.
6) Wenn das erhaltene DNA-Fragment nicht die gesamte Länge des Ceramidase-Gens enthält, kann die gesamte Länge des gewünschten Ceramidase-Gens durch Verdauen der genomischen DNA mit anderen Restriktionsenzymen unter Verwendung eines Teils des Fragments als Sonde erhalten werden; und durch Durchführen der Hybridisierung auf die gleiche Weise, um die deletierte Region zu erhalten. Auf Grundlage des DNA-Fragments, das ein so erhaltenes Ceramidase-Gen umfasst, werden die Struktur des Ceramidase-Gens und die gesamte Aminosäuresequenz der Ceramidase bestimmt.

Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Hybridisierungsverfahren kann das PCR-Verfahren angewandt werden, um ein Ceramidase-Gen der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Zum Beispiel kann ein PCR-Verfahren unter Verwendung eines Primers, der auf Grundlage der N-terminalen Aminosäuresequenz oder einer inneren Teil-Aminosäuresequenz der Ceramidase entworfen wurde, oder ein PCR-Verfahren unter Verwendung einer Kassetten-DNA und eines Kassettenprimers zusätzlich zu solch einem Primer angewandt werden, um ein Ceramidase-Gen zu erhalten.
Als nächstes wird die aus Pseudomonas aeruginosa AN-17 stammende Ceramidase als ein Beispiel genommen und konkret nachstehend beschrieben. Die vorstehende Ceramidase ist alkalische Ceramidase, deren pH-Optimum im Bereich von pH 8.0 bis 9.0 liegt.
Zuerst wird eine Teil-Aminosäuresequenz der von Pseudomonas aeruginosa AN-17 produzierten Ceramidase untersucht. Die N-terminale Aminosäuresequenz der vorstehenden Ceramidase hat eine große Anzahl in den Arten der entsprechenden Codons und die Anzahl der Kombinationen der Primersequenzen wird extrem groß. Wenn PCR unter Verwendung des vorstehenden Primers durchgeführt wird, wird zusätzlich eine große Anzahl der unspezifischen amplifizierten Produkte gebildet, und unter diesen Produkten ist es unmöglich, ein Produkt zu identifizieren, das aus einem gewünschten Gen stammt. Die vorliegenden Erfinder haben unter Verwendung eines proteolytischen Enzyms oder eines Reagenzes für begrenzte Proteolyse, das typischerweise durch Cyanbromid veranschaulicht wird, die Peptidkartierung durchgeführt, um eine Sequenz mit einer geringeren entsprechenden Codon-Entartung als eine Aminosäuresequenz zu erhalten, zur Verwendung beim Entwurf eines Primers, und versuchten dann, einen Primer zu entwerfen. Wie in den nachstehend gegebenen Beispielen beschrieben, wird PCR in Kombination von 4 Arten von Primern versucht, aber keine spezifischen amplifizierten Produkte konnten dadurch erhalten werden. Demgemäß haben die vorliegenden Erfinder jeweils weiter auf Grundlage der erhaltenen Aminosäuresequenz synthetische Oligonucleotidprimer, d.h. einen Oligonucleotidprimer C-89-1 (SEQ ID NO:13), entworfen aus einer Teil-Aminosäuresequenz C-89 (SEQ ID NO:3) der Ceramidase und einen Oligonucleotidprimer C-91-c1 (SEQ ID NO:14), entworfen aus einer Teil-Aminosäuresequenz C-91 (SEQ ID NO:4) synthetisiert. PCR wird unter Verwendung der voranstehenden 2 Arten von Primern zusammen mit genomischer DNA des Pseudomonas aeruginosa-Stamms AN-17 als Matrize ausgeführt, wodurch ein spezifisch amplifiziertes DNA-Fragment erhalten wird. Durch Untersuchen der Nucleotidsequenz dieses Fragments und Vergleichen der Ergebnisse mit der Teil-Aminosäuresequenz der Ceramidase mit Ausnahme von jenen vorstehend beschriebenen wurde gefunden, dass das Fragment einen Teil eines Gens, das die Ceramidase codiert, enthält.
Dieses amplifizierte DNA-Fragment wird als Sonde verwendet, um die Hybridisierung oder dergleichen durchzuführen, wodurch ein Gen cloniert wird, das die gesamte Länge der Ceramidase codiert.
Die so vorstehend erhaltene gesamte Nucleotidsequenz eines Gens, das die aus dem Pseudomonas aeruginosa-Stamm AN-17 stammende Ceramidase codiert, ist wie in SEQ ID NO:16 im Sequenzprotokoll gezeigt. Zusätzlich ist die von der vorstehenden Nucleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz der Ceramidase wie in SEQ ID NO:15 im Sequenzprotokoll gezeigt.
Weiter wird durch Vergleichen dieser Aminosäuresequenz mit der N-terminalen Aminosäuresequenz der Ceramidase, die aus dem Pseudomonas aeruginosa-Stamm AN-17 stammt, wie in SEQ ID NO:8 im Sequenzprotokoll gezeigt, gefunden, dass die von diesem Stamm hergestellte Ceramidase nach Translation zu einem reifen Enzym umgewandelt werden kann, indem ein Polypeptid, das aus N- terminalen 24 Aminosäuren besteht, deletiert wird. Diese reife Ceramidase hat eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO:1 im Sequenzprotokoll gezeigt, und die Nucleotidsequenz der reifen Ceramidase-codierenden Region in der Nucleotidsequenz des vorstehend beschriebenen Ceramidase-Gens ist jeweils wie in SEQ ID NO:2 im Sequenzprotokoll gezeigt. Da die Aminosäuresequenz der vorstehenden Ceramidase, die aus dem Pseudomonas aeruginosa-Stamm AN-17 stammt und die Nucleotidsequenz, die ihn codiert, keine Homologie mit Aminosäuresequenzen und Nucleotidsequenzen von bekannten sauren Ceramidasen zeigen, wird vorgeschlagen, dass dieses aus dem Pseudomonas aeruginosa-Stamm AN-17 stammende Enzym eine Ceramidase ist, die zu einem Mitglied einer neuen Familie gehört.
Durch Verwendung des gesamten oder eines Teils eines Ceramidase-Gens, von dem eine gesamte Nucleotidsequenz, wie vorstehend beschrieben, als eine Sonde zur Hybridisierung identifiziert wird, kann eine DNA mit einer hohen Homologie mit einem Ceramidase-Gen aus genomischen DNA-Bibliotheken oder cDNA-Bibliotheken, die von den Organismen mit Ausnahme des Pseudomonas aeruginosa-Stamms AN-17 erhalten werden, durchmustert werden. Die Hybridisierung kann unter allgemein angewandten Bedingungen durchgeführt werden. Zum Beispiel wird eine Nylonmembran hergestellt, auf der die genomischen DNA-Bibliotheken oder cDNA-Bibliotheken, die aus den Organismen mit Ausnahme des Pseudomonas aeruginosa-Stamms AN-17 erhalten werden, immobilisiert sind. Die Nylonmembran wird bei 65°C in einer Prä-Hybridisierungslösung, die 6 × SSC, 0.5% SDS, 5 × Denhardt-Reagenz, 100 mg/ml Heringssperma-DNA enthält, blockiert und dann bei 65°C über Nacht mit Zugabe der vorstehenden Sonde, die ³²P-markiert ist, inkubiert. Diese Nylonmembran wird zuerst in 6 × SSC bei Raumtemperatur für 10 Minuten gewaschen; anschließend in 2 × SSC, das 0.1% SDS enthält, bei Raumtemperatur für 10 Minuten; und weiter in 0.2 × SSC, das 0.1% SDS enthält, bei 45°C für 30 Minuten. Danach wird ein Autoradiogramm davon gemacht, um die DNA, die mit der Sonde hybridisiert, nachzuweisen. Im Übrigen können Gene mit verschiedenen Homologien durch Verändern der Bedingungen wie Waschen erhalten werden.
Andererseits kann ein PCR-Primer auch auf Grundlage der Nucleotidsequenz des Ceramidase-Gens der vorliegenden Erfindung entworfen werden. Durch Ausführen der PCR unter Verwendung dieses Primers ist es möglich, ein Genfragment, das eine hohe Homologie mit dem Gen der vorliegenden Erfindung hat, nachzuweisen oder solch ein Gen ganz zu erhalten und auch einen Organismus nachzuweisen, der Ceramidase herstellt.
Um zu bestätigen, ob oder nicht ein Gen, erhalten durch Hybridisierung oder PCR, wie vorstehend beschrieben, ein Gen ist, das ein Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität codiert, kann die Folgerung durch Vergleichen der Nucleotidsequenz des erhaltenen Gens mit der Nucleotidsequenz oder der Aminosäuresequenz des Ceramidase-Gens der vorliegenden Erfindung gemacht werden. Alternativ ist es möglich, zu bestätigen, ob oder nicht das erhaltene Gen ein gewünschtes Gen ist durch Herstellen eines Polypeptids, das durch das erhaltene Gen codiert wird, gefolgt vom Testen der Ceramidase-Aktivität mit Hilfe der Verwendung eines Verfahrens, wie nachstehend beschrieben.
Das Gen der vorliegenden Erfindung beinhaltet ein Gen mit einer Nucleotidsequenz, die sich von einer Nucleotidsequenz der vorstehend erwähnten Gene unterscheidet, über den entarteten genetischen Code.
(3) Transformante, die das Ceramidase-Gen beherbergt
Die Transformante der vorliegenden Erfindung ist eine Transformante, die mit den vorstehenden Ceramidase-Genen transformiert ist.
Das Gen der vorliegenden Erfindung kann in verschiedenen Wirten durch Ligieren des Gens mit bekannten Vektoren und desgleichen exprimiert werden. Da die Codon-Anwendung abhängig von einem Wirt für die Expression des Gens der vorliegenden Erfindung unterschiedlich ist, kann das Expressionsniveau im Übrigen in dem Wirt in einigen Fällen unterdrückt werden. In diesem Fall kann ein Codon, das in dem Gen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, verwendet werden, um in ein Codon zu wechseln, das von dem verwendeten Wirt abhängt. Zusätzlich ist der vorstehende Expressionsvektor nicht nur auf einen Plasmidvektor beschränkt, solange der Vektor nicht von der Ausführung eines Ziels der vorliegenden Erfindung abhält, und dort kann ein Phagenvektor, ein Cosmidvektor und desgleichen verwendet werden. Von dem Standpunkt der einfachen und umfangreichen Herstellung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung werden dort ein Vektor, der ein fremdes Gen induzieren und exprimieren kann, ein Vektor, der als ein Fusionsprotein mit einem Reportergenprodukt exprimieren kann, und desgleichen gewünscht.
Die Transformante der vorliegenden Erfindung kann durch Transformieren eines Wirts mit einem Vektor, der ein Ceramidase-Gen trägt, erhalten werden. Als ein Wirt können dort Mikroorganismen wie Escherichia coli; Tierzellen; und Pflanzenzellen und desgleichen verwendet werden. Anschließend wird ein Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität durch Züchten der Transformante unter den Bedingungen, die üblicherweise angewandt werden, hergestellt.
Die Transformante, die das Ceramidase-Gen berherbergt, das aus dem vorstehenden Pseudomonas aeruginosa AN-17 stammt, wird genannt und identifiziert als Escherichia coli JM109/pTCDS7 und bei dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry [Address: 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken Japan (Postleitzahl 305–8566)] am 4. August 1998 (ursprüngliches Hinterlegungsdatum) [Zugangsnummer: FERM BP-6728.] hinterlegt.
Die Bestätigung der Ceramidase-Expression kann durch Bestimmen der Ceramidase-Aktivität ausgeführt werden. Die Bestimmung der Ceramidase-Aktivität kann durch Verwendung von Zellextrakten der Transformante als eine Probe gemäß einem Verfahren, zum Beispiel in Journal of Biological Chemistry, 273, 14368–14373 (1998) beschrieben, ausgeführt werden. Zusätzlich kann ein Antikörper gegen Ceramidase verwendet werden und in dem Fall, wo Ceramidase als eine Fusion mit einer anderen Art eines Polypeptids exprimiert wird, kann ein Antikörper gegen die Polypeptidregion verwendet werden. Wenn der Antikörper verwendet wird, kann die Ceramidase zum Beispiel durch Durchführen einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese mit den Zellextrakten der Transformante übertragen auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran und Nachweisen der entsprechenden Ceramidase auf der vorstehenden Membran mit einem Antikörper nachgewiesen werden.
(4) Verfahren zur Herstellung des Polypeptids mit Ceramidase-Aktivität
Als ein großes Merkmal umfasst das Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit Ceramidase-Aktivität der vorliegenden Erfindung das Züchten der vorstehend beschriebenen Transformante und das Ernten eines Polypeptids mit Ceramidase-Aktivität aus der entstandenen Kultur.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung in dem Fall, wo die Transformante ein Mikroorganismus oder eine gezüchtete Zelle ist, können die optimalen Bedingungen für die Expression von Ceramidase in Bedingungen der Zusammensetzung des Mediums, dem pH-Wert eines Mediums, der Züchtungstemperatur, der Züchtungszeit, der Menge eines verwendeten Induktors und der Zeitdauer der Verwendung gesetzt werden, wodurch die Ceramidase effizient herstellt wird.
Die Aufreinigung der Ceramidase aus der Kultur der Transformante kann durch ein übliches Verfahren ausgeführt werden. Wenn die Transformante Ceramidase in den Zellen anhäuft wie in dem Fall von Escherichia coli, werden die Transformanten-Zellen durch Zentrifugation nach Beendigung der Kultur geerntet. Die geernteten Zellen werden durch Ultraschallbehandlung oder desgleichen aufgebrochen und danach zentrifugiert, um einen zellfreien Extrakt zu erhalten. Dieser zellfreie Extrakt wird als Startmaterial verwendet, um ein allgemein angewandtes Proteinaufreinigungsverfahren wie das Aussalzen sowie verschiedene Chromatographien wie Ionenaustausch, Gelfiltration, hydrophobe und Affinitätschromatographien durchzuführen. Bei einigen hierein verwendeten Transformanten wird ein Expressionsprodukt extrazellulär sezerniert, und in solch einem Fall kann das Produkt gleichermaßen von dem Kulturüberstand aufgereinigt werden.
Wenn die durch eine Transformante hergestellte Ceramidase in den Zellen hergestellt wird, koexistieren auch verschiedene intrazelluläre Enzyme und Proteine, aber nur in sehr kleinen Mengen wie verglichen mit der exprimierten Ceramidase, was die Aufreinigung extrem einfach macht. Außerdem wird, wenn ein Vektor vom extrazellulären sekretorischen Typ als ein Vektor verwendet wird, Ceramidase extrazellulär sezerniert, und eine Ceramidase-enthaltende Fraktion koexistiert auch mit den Bestandeilen des Mediums und desgleichen. Dennoch, da die Fraktion üblicherweise kaum Proteinkomponenten enthält, die die Ceramidaseaufreinigung nachteilig beeinflussen, wird eine komplizierte Isolierungs- und Aufreinigungsprozedur, die für die Aufreinigung von zum Beispiel Ceramidase aus der Kultur des Stamms Pseudomonas aeruginosa AN-17 erforderlich war, nicht benötigt.
Wenn Escherichia coli als ein Wirt verwendet wird, kann zusätzlich ein exprimiertes Produkt als ein unlöslicher Einschlusskörper entwickelt werden. In diesem Fall werden die Zellen durch Zentrifugation nach Beendigung der Kultur geerntet, und die geernteten Zellen werden durch zum Beispiel Ultraschallbehandlung aufgebrochen. Danach werden die entstandenen aufgebrochenen Zellen zentrifugiert, um eine unlösliche Fraktion, die den Einschlusskörper umfasst, zu sammeln. Der Einschlusskörper wird gewaschen und dann mit einem üblicherweise verwendeten Löslichkeitsvermittler für Protein, wie Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid, löslich gemacht, und, wenn notwendig, wird der löslich gemachte Einschlusskörper durch Ausführen verschiedener Chromatographien wie Ionenaustausch, Gelfiltration, hydrophobe und Affinitätschromatographien aufgereinigt und dann weiter einer Rückfaltungsprozedur durch die Dialyse-Prozedur oder Verdünnungsprozedur unterworfen, wobei man eine Präparation erhält, die ein Polypeptid umfasst, das Ceramidase-Aktivität beibehält. Wenn notwendig, kann die so erhaltene Präparation weiter durch verschiedene Chromatographien aufgereinigt werden, um ein Polypeptid von hoher Reinheit mit Ceramidase-Aktivität zu erhalten.
(5) Oligonucleotid-Sonde oder -Primer
Die Oligonucleotid-Sonde oder der -Primer der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders begrenzt, solange er unter stringenten Bedingungen mit dem vorstehend beschriebenen Ceramidase-Gen oder einem Gen mit einer damit komplementären Nucleotidsequenz hybridisieren kann.
Der Begriff „stringente Bedingungen" ist nicht besonders begrenzt, und bezieht sich auf Bedingungen, wo zum Beispiel ein Gen bei einer Temperatur von [T_m –25°C] über Nacht in einer Lösung, die 6 × SSC, 0.5% SDS, 5 × Denhardt-Reagenz und 100 mg/ml Heringssperma-DNA enthält, inkubiert wird.
Zum Beispiel wird T_m für die Oligonucleotid-Sonde oder den -Primer mit 18 Nucleotiden oder länger durch die nachstehend gezeigte Gleichung berechnet: Tm = 81.5 – 16.6(log10[Na+]) + 0.41(%G + C) – (600/N)wobei „N" die Kettenlänge der Oligonucleotid-Sonde oder des -Primers ist; und „%G + C" die Gehalte von Guanin- und Cytosinresten in der Oligonucleotid-Sonde oder dem -Primer sind. Alternativ kann im Fall der Oligonucleotid-Sonde oder dem- Primer, der/die kürzer als 18 Nucleotide ist T_m durch zum Beispiel Multiplizieren der A + T (Adenin + Thymin)-Reste mit 2°C und die Zahl der G + C-Reste mit 4°C und Erhalten der Summe der vorstehenden zwei Zahlen bestimmt werden.
Die vorstehend beschriebene Oligonucleotid-Sonde kann durch chemisches Synthetisieren mit zum Beispiel einem üblichen Verfahren gemäß einem Entwurf auf Grundlage der Nucleotidsequenz für das Ceramidase-Gen der vorliegenden Erfindung präpariert werden.
Die Länge der voranstehend beschriebenen Oligonucleotid-Sonde ist nicht besonders begrenzt, und die Sonde besteht vorzugsweise aus 15 Basen oder länger, vom Standpunkt des Vermeidens einer nicht spezifischen Hybridisierung, und bevorzugter aus 18 Basen oder länger.
Der Primer der vorliegenden Erfindung beinhaltet auch eine Nucleinsäure mit einer Nucleotidsequenz, ähnlich zu der von der vorstehend beschriebenen Oligonucleotid-Sonde. Zum Beispiel kann der Primer durch chemisches Synthetisieren gemäß einem Entwurf auf Grundlage der Nucleotidsequenz für das Gen der vorliegenden Erfindung hergestellt werden. Die Länge des Primers ist nicht besonders begrenzt, und der Primer kann aus 15 bis 40 Basen, vorzugsweise 17 bis 30 Basen bestehen. Der vorstehend beschriebene Primer kann verschiedenen Genamplifikationsverfahren wie dem Polymerasekettenreaktion (PCR)-Verfahren unterworfen werden, wodurch das Ceramidase-Gen der vorliegenden Erfindung nachgewiesen wird.
Zusätzlich kann als die/der vorstehende beschriebene Oligonucleotid-Sonde oder -Primer eine Nucleinsäure verwendet werden, die aus Fragmentierung einer Nucleinsäure, die eine natürlich vorkommende Ceramidase codiert, mit Hilfe einer enzymatischen Behandlung wie eine Restriktionsenzym-Behandlung oder eine Exonuclease-Behandlung oder eine physikalische Behandlung wie eine Ultraschallbehandlung resultiert; und Unterwerfen des so erhaltenen Fragments dem Isolierungs- und Aufreingungsprozess durch verschiedene Verfahren zum Auftrennen einer Nucleinsäure, wie durch die Agarosegelelektrophorese veranschaulicht. Die so erhaltene Nucleinsäure, wie vorstehend beschrieben, stammt wünschenswerterweise aus einer Region mit einer Ceramidase-eigenen Sequenz.
Die/der vorstehend beschriebene Oligonucleotid-Sonde oder -Primer können mit einer geeigneten Markierung durch ein bekanntes Verfahren markiert werden und verwendet werden, um das Ceramidase-Gen der vorliegenden Erfindung nachzuweisen. Die Markierung ist nicht besonders begrenzt und schließt zusätzlich zu Radioisotopen fluoreszierende Substanzen und Liganden wie Biotin und Digoxigenin ein.
(6) Verfahren zum Nachweisen des Gens
Ein großes Merkmal des Verfahrens zum Nachweisen des Gens der vorliegenden Erfindung liegt in dem Nachweis eines Gens in einer nachzuweisenden Probe durch Verwendung der/des vorstehend beschriebenen Oligonucleotid-Sonde und/oder -Primers.
Bei dem Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung kann der Nachweis eines Gens durch das Hybridisierungsverfahren oder desgleichen mit der vorstehend beschriebenen Oligonucleotid-Sonde ausgeführt werden, oder alternativ kann der Nachweis eines Gens mit Hilfe eines DNA-Amplifikationsverfahren wie das PCR-Verfahren unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Primers ausgeführt werden.
Wenn das Oligonucleotid verwendet wird, kann eine nachzuweisende Probe zum Beispiel Proben einer Mikroorganismenkolonie oder eines Gewebeabschnitts, DNA oder RNA in diesen Proben, die auf einer Membran immobilisiert sind, und DNA oder RNA, die aus diesen Proben extrahiert wurden, sein. Unter diesen Proben wird die auf einer Membran immobilisierte DNA oder extrahierte DNA von dem Standpunkt der Stabilität der Proben her bevorzugt.
Wenn das Oligonucleotid verwendet wird, kann ein Gen durch ein bekanntes Hybridisierungsverfahren wie jene, die in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl. beschrieben sind, und desgleichen nachgewiesen werden.
Die Bedingungen der vorstehend beschriebenen Hybridisierung können in geeigneter Weise in Abhängigkeit von den Faktoren, wie dem Tm-Wert der verwendeten Sonde und dem GC-Gehalt einer Ziel-DNA ausgewählt werden. Zum Beispiel können die in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl. beschriebenen Bedingungen angewandt werden.
Wenn der Primer verwendet wird, kann die nachzuweisende Probe zum Beispiel Mikroorganismenproben wie ein Kulturmedium eines Mikroorganismus, eine Kolonie eines Mikroorganismus und Mikroorganismuszellen sowie eine Körperprobe wie Haut, Gewebe und Gewebeabschnitte sein.
Die nachzuweisende Probe kann während Verwendung des vorstehend beschriebenen Primers ein an sich isolierter Mikroorganismus sein, oder sie kann eine sein, in der der isolierte Mikroorganismus weiter einer geeigneten Behandlung unterworfen wird. Eine feste Probe wie Gewebe kann in einer Form eines Extraktes oder einer Suspension verwendet werden. Zusätzlich kann der Überstand von solchen Proben oder einer, der durch weiteres Unterwerten der Probe der Zelllyse-Behandlung unter Anwendung von zum Beispiel einer Behandlung mit einem oberflächenaktiven Stoff erhalten wird, sowie der Überstand davon verwendet werden. Sofern nicht die nachzuweisende Nucleinsäure nachteilig beeinflusst wird, kann auch ein beliebiger Vorgang zum Entfernen anderer Bestandteile in der Probe ausgeführt werden.
Wenn der Nachweis durch das PCR-Verfahren mit dem vorstehend beschriebenen Primer ausgeführt wird, können die PCR-Bedingungen in geeigneter Weise in Abhängigkeit von den Faktoren wie dem Tm-Wert des verwendeten Primers und der Länge der amplifizierten nachzuweisenden Region ausgewählt werden.
Wenn der vorstehend beschriebene Primer verwendet wird, kann der Nachweis durch Amplifizieren mit einem DNA-Amplifikationsverfahren wie dem PCR-Verfahren, und durch Bestätigen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines PCR-amplifizierten Produkts ausgeführt werden. Das Verfahren zum Bestätigen der Anwesenheit oder Abwesenheit der Amplifikation ist nicht besonders begrenzt. Zum Beispiel kann die Amplifikation durch Durchführen einer Agarosegelelektrophorese mit der Reaktionsmischung der Nucleinsäure-Amplifikation, danach durch Färben des Gels mit einem geeigneten Nucleinsäure färbenden Reagenz wie Ethidiumbromid, SYBER Green I oder desgleichen, und Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit der Banden, die aus der Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen entstehen, bestätigt werden. Die Banden können durch visuelle Beobachtung nachgewiesen werden, oder sie können durch Verwendung zum Beispiel eines Fluorescent-Image-Analyzers oder desgleichen nachgewiesen werden.
Bei dem Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung kann die/der vorstehend beschriebene Sonde und Primer in Kombination für den Zweck der Steigerung der Nachweisempfindlichkeit verwendet werden. Zum Beispiel wird der vorstehend beschriebene Primer verwendet, um ein Ceramidase-Gen, das in einer sehr kleinen Menge in einer Probe anwesend ist, mit Hilfe des PCR-Verfahrens zu amplifizieren, und dann wird eine Sonde verwendet, um mit dem Gen zu hybridisieren, wodurch ein hoch empfindlicher und genauer Nachweis erreicht wird.
Wenn ein Ceramidase-Gen durch das Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung nachgewiesen wird und das Expressionsniveau des Gens weiter bestimmt wird, kann die Intensität eines Signals, das einer hybridisierten Sonde zugeschrieben wird, oder eine Fluoreszenzintensität einer Bande, die einem amplifizierten Produkt zugeschrieben wird, unter Verwendung eines Primers oder desgleichen quantifiziert werden.
(7) Kit zum Nachweisen des Gens der vorliegenden Erfindung
Eines der Merkmale des Kits für den Nachweis des Gens der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass der Kit die Oligonucleotid-Sonde und/oder die vorstehend beschriebene Sonde umfasst.
Der Kit der vorliegenden Erfindung kann weiter verschiedene Reagenzien für die Hybridisierung, die typischerweise durch eine Membran zur Immobilisierung einer Nucleinsäure und Hybridisierungspuffer veranschaulicht sind; PCR-Reagenzien wie die hitzebeständige DNA-Polymerase, Mischung von dNTPs und PCR-Puffer; Reagenzien zum Nachweisen einer Sonde oder einer amplifizierten DNA; ein Medium für Mikrobenwachstum; und ein Reagenz zum Extrahieren einer Nucleinsäure aus einer Probe umfassen.
(8) Antikörper oder Fragment davon, das an ein Polypeptid mit Ceramidase- Aktivität spezifisch binden kann
Der Antikörper oder das Fragment davon, der/das spezifisch an das Polypeptid der vorliegenden Erfindung binden kann, ist nicht besonders begrenzt, solange er/es spezifisch an das Polypeptid binden kann, und kann entweder von einem polyclonalen Antikörper oder einem monoclonalen Antikörper sein. Weiter kann ein durch ein bekanntes Verfahren modifizierter Antikörper oder ein Derivat eines Antikörpers, einschließlich zum Beispiel ein humanisierter Antikörper, ein Fab-Fragment, ein Einzelkettenantikörper und desgleichen angewandt werden.
Darüber hinaus kann der Antikörper der vorliegenden Erfindung leicht durch Immunisieren eines Kaninchens oder einer Maus unter Verwendung des gesamten oder eines Teils des Polypeptids der vorliegenden Erfindung, zum Beispiel durch das Verfahren, beschrieben in Current Protocols in Immunology [hrsg. von Joh. E. Coligan, publiziert von John Wiley & Sons, Inc. (1992)] erhalten werden. Der Antikörper kann auch mit Hilfe einer Gentechnologiemethode hergestellt werden. Zusätzlich kann auch der Antikörper oder ein Fragment davon, der/das spezifisch an ein bestimmtes Teilfragment eines Polypeptids binden kann, umfasst werden.
Weiter wird ein Fragment des Antikörpers durch Aufreinigen des so erhaltenen Antikörpers und dann durch Behandeln mit einer Peptidase oder desgleichen erhalten. Der/das so erhaltene Antikörper oder Fragment davon, können zum Nachweis eines Ceramidase-herstellenden Mikroorganismus, Affinitätschromatographie, Durchmustern von verschiedenen Bibliotheken (genomische DNAs oder cDNAs), eines pharmazeutischen, eines diagnostischen Wirkstoffs, eines Reagenzes für Forschung und Entwicklung und desgleichen angewandt werden.
Außerdem kann der Antikörper oder das Fragment davon der vorliegenden Erfindung auch auf verschiedene Weisen für den Zweck des Erleichterns eines Nachweises durch Enzymimmunoassay, Fluoreszenzimmunoassay, Lumineszenzimmunoassay und desgleichen modifiziert werden.
(9) Verfahren zum Nachweisen des Polypeptids
Die vorliegende Anmeldung beschreibt auch ein Verfahren zum Nachweisen des Polypeptids der vorliegenden Erfindung, das in dem Nachweis eines Polypeptids mit Ceramidase-Aktivität unter Verwendung des Antikörpers oder des vorstehend beschriebenen Fragments davon liegt.
In der vorliegenden Erfindung beinhaltet eine nachzuweisende Probe zum Beispiel Proteinproben wie aufgebrochene Mikrobenzellen, einen Extrakt oder ein Produkt, erhalten durch Waschen der Gewebe wie Haut, und eine Membran, auf der ein Protein, das aus Geweben oder Mikroorganismen stammt, immobilisiert wird.
Der Nachweis eines spezifischen Bindens des Antikörpers oder des Fragments davon an das vorstehend beschriebene Polypeptid kann durch ein bekanntes Verfahren wie Enzymimmunoassay, Fluoreszenzimmunoassay, Lumineszenzimmunoassay und desgleichen ausgeführt werden.
(10) Kit für das Verfahren zum Nachweisen des Polypeptids der vorliegenden Erfindung
Ein Merkmal des Kits für das Verfahren zum Nachweisen eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass der Kit den vorstehend beschriebenen Antikörper oder das Fragment davon umfasst.
Der Kit der vorliegenden Erfindung kann weiter den Reaktionspuffer, einen markierten sekundären Antikörper, ein chromogenes Reagenz und desgleichen umfassen.
(11) Verfahren zum Nachweisen der atopischen Dermatitis
Wie vorstehend beschrieben, nimmt man an, dass der Mikroorganismus, der Ceramidase herstellt, ursächlich für oder beteiligt an der Verschlimmerung der atopischen Dermatitis ist.
Gemäß dem Verfahren zum Nachweisen der atopischen Dermatitis der vorliegenden Erfindung kann die atopische Dermatitis durch Nachweisen eines Polypeptids mit Ceramidase-Aktivität oder eines Gens, das solch ein Polypeptid codiert, in einer Probe von der Haut nachgewiesen werden.
Die Probe, die aus der in dem Verfahren zum Nachweisen der atopischen Dermatitis der vorliegenden Erfindung verwendeten Haut stammt, ist nicht besonders begrenzt und kann eine Hautschuppe eines zu testenden Individuums, ein Hautabstrich, erhalten durch Abwischen der Haut mit einem Baumwolltupfer oder einem Verbandmull, ein Produkt, das durch Waschen der Haut erhalten wird, und desgleichen sein. Das Verfahren zum Sammeln solcher Proben ist nicht besonders begrenzt. Beispiele davon beinhalten ein Verfahren des Sammelns einer Schuppe direkt von der Haut eines zu testenden Individuums; ein Verfahren des Abwischens der Haut eines zu testenden Individuums mit einem Baumwolltupfer oder einem Verbandmull; oder ein Verfahren des Sammelns eines Waschprodukts, welches darin besteht, dass man einen Zylinder einer passenden Größe in engen Kontakt mit der Haut eines zu testenden Individuums bringt, den Zylinder mit einer passenden Flüssigkeit zum Waschen, wie physiologische Kochsalzlösung oder Phosphatpuffer füllt und dann die Haut mit der Waschflüssigkeit wäscht.
Diese so erhaltenen Proben können direkt für den Nachweis des voranstehend beschriebenen Polypeptids oder für den Nachweis des Gens, das solch ein Polypeptid codiert, verwendet werden. Weiter kann die Kultur, die aus dem Züchten eines Mikroorganismus, der in der Probe enthalten ist, hergestellt in einem geeigneten Medium gezüchtet werden und als eine nachzuweisende Probe verwendet werden, wobei die Nachweisempfindlichkeit verbessert wird. Das für das Züchten des Mikroorganismus verwendete Medium ist nicht besonders begrenzt, solange der Mikroorganismus in der Probe aus der Haut gezüchtet werden kann, und das Medium effizient Ceramidase herstellen kann. Zum Beispiel wird ein Medium, das als Kohlenstoffquellen und/oder Stickstoffquellen Glycerol, Glucose, Saccharose, Sirupe, Hefeextrakte, Pepton, Maisquellwasser, Fleischextrakte, entfettete Sojabohne, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat und desgleichen geeignet verwendet. Zusätzlich zu dem vorstehend aufgelisteten können auch Mineralien und Metallsalze wie Natriumsalze, Kaliumsalze, Magnesiumsalze, Zinksalze, Phosphate und desgleichen enthalten sein. Zusätzlich kann zu dem Medium dort auch 0.001 bis 1% eines Lipids wie Sphingomyelin und Ceramide oder ein oberflächenaktiver Stoff wie Taurodesoxycholat zugegeben werden, um das Expressionsniveau der Ceramidase zu steigern, wodurch die Nachweisempfindlichkeit verbessert wird. Die Kulturbedingungen für die Mikroorganismen sind nicht besonders begrenzt, vorzugsweise wird der Mikroorganismus bei 25° bis 37°C für 1 bis 7 Tage gezüchtet. Nach Beendigung der Kultur kann die Kultur direkt für eine Nachweisprozedur verwendet werden oder alternativ, wenn ein Polypeptid nachgewiesen wird, kann ein Kulturüberstand, der durch Zentrifugieren der Kultur erhalten wird, als eine Probe verwendet werden.
Das Verfahren zum Nachweisen der atopischen Dermatitis der vorliegenden Erfindung kann durch Nachweisen eines Gens, das ein Polypeptid mit Ceramidase- Aktivität codiert, unter Verwendung der/des vorstehend beschriebenen Oligonucleotid-Sonde oder -Primers ausgeführt werden oder das Verfahren kann auch durch Nachweisen eines Polypeptids mit Ceramidase-Aktivität unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Antikörpers oder des Fragments davon, der/das spezifisch an das Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität binden kann, ausgeführt werden. Zusätzlich kann zu dem Zweck des einfachen Nachweisens der atopischen Dermatitis ein Kit zum Nachweisen des vorstehend beschriebenen Gens, das ein Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität codiert, oder ein Kit zum Nachweisen des vorstehend beschriebenen Polypeptids mit Ceramidase-Aktivität angewandt werden. Die vorstehend beschriebenen Kits können weiter ein Hilfsmittel zum Erhalten einer vorstehend beschriebenen Probe umfassen, einschließlich zum Beispiel einen Kit, der ferner einen Baumwolltupfer und ein Kulturmedium umfasst.
Bei dem Verfahren zum Nachweisen der atopischen Dermatitis der vorliegenden Erfindung, wenn das Gen, das ein Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität codiert, durch Verwendung einer Oligonucleotid-Sonde nachgewiesen wird, wird zum Beispiel eine Nucleinsäure, die durch ein bekanntes Verfahren aus einer Probe von der Haut eines zu testenden Individuums hergestellt wurde, mit einer Oligonucleotid-Sonde hybridisiert, die auf Grundlage eines Nucleotidsequenz des Ceramidase-Gens unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen zum Nachweisen des gebildeten Hybrids entworfen wurde. Zum Beispiel kann das Gen, das ein Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität codiert, durch die Dot-Blot-Hybridisierung nachgewiesen werden, wo eine Nucleinsäure, gewonnen aus einer Probe von der Haut, auf eine Nitrocellulosemembran oder desgleichen immobilisiert wird. Alternativ wird eine Probe direkt auf einer Nitrocellulosemembran immobilisiert, und die Nucleinsäure, die in der Probe enthalten ist, wird der geeigneten Lysebehandlung ausgesetzt und dann hybridisiert, wodurch das gebildete Hybrid nachgewiesen werden kann.
Bei dem Verfahren zum Nachweisen der atopischen Dermatitis der vorliegenden Erfindung, wenn das Gen, das ein Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität codiert, mit Hilfe der Genamplifikation nachgewiesen wird, wird eine Reaktionsmischung aus der Probe von der Haut eines zu testenden Individuums hergestellt oder eine Nucleinsäure aus einer solchen Probe und ein Primer hergestellt, der auf der Grundlage der Nucleotidsequenz eines Ceramidase-Gens entworfen ist, und die Reaktionsmischung wird der Genamplifikationsreaktion unterworfen. Wenn das PCR-Verfahren als Genamplifikationsreaktion angewandt wird, werden die in Abschnitt (6) vorstehend beschriebenen Verfahren durchgeführt, um eine DNA zu amplifizieren, und eine amplifizierte DNA wird dann nachgewiesen. Zum Beispiel wird eine Reaktionsmischung durch Zugeben eines Paars von Primern, die auf Grundlage einer Nucleotidsequenz eines Ceramidase-Gens hergestellt wurden, und einer Probe von der Haut zusammen mit DNA-Polymerase und dNTPs präpariert und die Amplifikationsreaktion wird unter Bedingungen durchgeführt, die für die Primersequenz und die erwartete Länge der Region, amplifiziert zu werden. Nach Beendigung der Reaktion wird die Reaktionsmischung durch Agarosegelelektrophorese oder desgleichen analysiert, um die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Amplifikation des DNA-Fragments, das von einem gewünschten Gen stammt, zu untersuchen.
Wenn ein Gen, das ein Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität codiert, in einer Probe von der Haut mit Hilfe des vorstehend beschriebenen Verfahrens nachgewiesen wird, wird diagnostiziert, dass die Stelle der Haut, wo die Probe gewonnen wird, atopische Dermatitis hat.
Bei dem Verfahren zum Nachweisen der atopischen Dermatitis der vorliegenden Erfindung, wenn das Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität nachgewiesen wird, wird ein Antikörper oder ein Fragment davon, der/das spezifisch an das Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität binden kann, verwendet, um zu untersuchen, ob oder nicht ein Polypeptid, das an den/das vorstehend beschriebene(n) Antikörper oder Fragment davon gebunden ist, in der Probe von der Haut eines zu testenden Individuums anwesend ist. Der Nachweis eines solchen Polypeptids kann durch bekannte immunologische experimentelle Prozeduren wie Immunodiffusion, Latex-Agglutinationsverfahren und Enzymimmunoassay durchgeführt werden. Unter dem Aspekt der Nachweisempfindlichkeit und der Einfachheit des Vorgangs ist der Enzymimmunoassay das praktischste Verfahren.
Wenn das Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität in einer Probe von der Haut durch das vorstehend beschriebene Verfahren nachgewiesen wird, wird diagnostiziert, dass die Stelle der Haut, wo die Probe gewonnen wird, atopische Dermatitis hat.
(12) Kit zum Nachweisen der atopischen Dermatitis
Um den vorstehend beschriebenen Nachweis der atopischen Dermatitis einfacher durchzuführen, kann der Kit zum Nachweisen des vorstehend beschriebenen Gens, das ein Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität codiert, oder der vorstehend beschriebene Kit zum Nachweisen des Polypeptids mit Ceramidase-Aktivität weiter ein Hilfsmittel zum Sammeln einer Probe wie einen Baumwolltupfer und ein Kulturmedium umfassen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden das erste Mal eine Aminosäuresequenz der alkalischen Ceramidase sowie eine Nucleotidsequenz, die sie codiert, bereitgestellt, wobei Gentechnologieverfahren für das Herstellen eines Polypeptids mit Ceramidase-Aktivität unter Verwendung des vorstehenden Gens, ein Verfahren zum Nachweisen der Ceramidase und auch ein Verfahren zum Nachweisen der atopischen Dermatitis bereitgestellt werden. Bei dem Verfahren zum Herstellen der Ceramidase der vorliegenden Erfindung kann, da es keinen Bedarf gibt, ein Sphingolipid zu einem Medium hinzuzugeben, um eine Expression der Ceramidase zu induzieren, und es keine Verunreinigung von zum Beispiel Enzymen gibt, die gleichzeitig die Enzyme, die Sphingomyelinase beinhalten, induzieren oder es keine Beimischung von dem zum Medium zugegebenen Sphingolipid oder seinen Abbauprodukten gibt, die gewünschte Ceramidase leicht aufgereinigt werden. Auch werden eine Sonde oder ein Primer bereitgestellt, die spezifisch mit dem Ceramidase-Gen der vorliegenden Erfindung hybridisieren können, sowie ein Antikörper oder Fragment davon, der/das spezifisch an das Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität der vorliegenden Erfindung binden kann. Durch Verwendung der/des vorstehenden Sonde, Primers und Antikörpers oder Fragments davon kann die Ceramidase einfach und mit einer hohen Empfindlichkeit nachgewiesen werden. Zusätzlich wird durch Verwendung der/des vorstehenden Sonde, Primers und Antikörpers oder Fragments davon eine ausgezeichnete Wirkung gezeigt, dass die atopische Dermatitis einfach nachgewiesen werden kann.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der folgenden Beispiele konkret veranschaulicht, ohne dass es beabsichtigt ist, den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung darauf zu begrenzen.
Beispiel 1 Clonierung des strukturellen Gens der Ceramidase
(1) Extraktion und Aufreinigung der genomischen DNA
Ein Cermidase-produzierender Mikroorganismus Pseudomonas aeruginosa-Stamm AN-17 wurde zu 200 ml eines PY-Mediums (0.5% Polypepton, 0.1 % Hefeextrakt, 0.5% Natriumchlorid, pH 7.2) geimpft und bei 25°C 23 Stunden gezüchtet. Nach Beendigung der Züchtung wurde ein erhaltenes Kulturmedium zentrifugiert, um die Zellen zu ernten. Die geernteten Zellen wurden in 10 ml TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) suspendiert und dann wurden dazu 0.2 ml einer 50 mg/ml Albumin-Lysozym-Lösung gegeben und bei 30°C 15 Minuten reagieren gelassen. Anschließend wurde zu der Lösung, die nach Beendigung der Reaktion erhalten wurde, 2 ml 10% SDS zugegeben, und die Mischung wurde sanft gerührt. Unmittelbar nachdem die Lösung viskos wurde, wurden 10 ml TE-Puffergesättigtes Phenol und 1.5 ml 5M NaCl zu der Lösung zugegeben und sanft bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt. Die nach dem Rühren erhaltene Lösung wurde bei 2500 Upm 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde gesammelt. Zu der so erhaltenen Lösung wurde ein Equivolumen Chloroform zugegeben und 10 Minuten gerührt und dann bei 1500 Upm 10 Minuten zentrifugiert, um den Überstand zu sammeln. Zu dem vorstehend erhaltenen Überstand wurde noch einmal ein Equivolumen von Chloroform zugegeben, gerührt und zentrifugiert, um den Überstand zu sammeln (nachstehend wird eine Reihe dieser Vorgänge als Phenol-Chloroform-Behandlung bezeichnet). Zu dem so gesammelten Überstand wurde ein Equivolumen von Isopropanol langsam zugegeben und eine an der der Grenzfläche präzipitierende DNA wurde durch Umschlingen einer Pasteurpipette geerntet und dann in 10 ml TE-Puffer gelöst. Zu der so erhaltenen Lösung wurden 20 μl RNase A (jene, die durch Lösen von RNase in 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 15 mM NaCl, um eine Konzentration von 10 mg/ml zu haben, und dann durch Hitzebehandlung bei 100°C für 15 Minuten hergestellt wurde) zugegeben und die Mischung wurde bei 50°C 1 Stunde inkubiert. Zu der Lösung wurden nach der Inkubation weiter 10 μl einer 20 mg/ml Protease K-Lösung, 200 μl 5 M NaCl und 400 μl 10% SDS zugegeben, und die Mischung wurde bei 37°C 1 Stunde inkubiert, wodurch eine Reaktion erfolgt. Die Lösung wurde nach der Reaktion auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, und der Phenol-Chloroform-Behandlung unterworfen. Diese Behandlung wurde zweimal wiederholt und zu einer erhaltenen wässrigen Phase wurde ein Equivolumen von Isopropanol und ein 1/10 Volumen von 3M Natriumacetat zugegeben. Die Mischung wurde bei –20°C 1 Stunde gekühlt und dann bei 10,000 Upm 10 Minuten zentrifugiert, um eine Sedimentation zu erhalten. Das erhaltene Sediment wurde mit 70% Ethanol gespült und in TE-Puffer gelöst, um die genomische DNA-Lösung zu erhalten. Durch die vorstehenden Prozeduren wurden 1.1 mg genomische DNA erhalten.
(2) Bestimmung der Teil-Aminosäuresequenz von Ceramidase
Ceramidase, die vom Pseudomonas aeruginosa-Stamm AN-17 produziert wurde, wurde gemäß einem Verfahren, beschrieben in Journal of Biological Chemistry, 273, Nr. 23, 14368–14373 (1998), aufgereinigt. Etwa 5 μg der erhaltenen Ceramidase wurden auf SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgebracht, um elektrophoresiert zu werden. Anschließend wurden die Proteine auf dem Gel mit Hilfe des Elektroblottings auf eine PVDF-Membran („Immobilon-P", hergestellt von Millipore) übertragen. Eine Region, die einer Ceramidase-Bande auf dieser Membran entspricht (etwa 50 pmol), wurde ausgeschnitten und bei 37°C 16 Stunden unter Schütteln in 100 μl eines 20 mM Tris-HCl-Puffer, der 0.2 mg Lysyl-Endopeptidase (0.9 U) und 8% Acetonitril enthielt, Enzym-verdaut. Diese Enzymverdaute Lösung wurde auf eine Umkehrphasen-Chromatographie aufgebracht, um ein Peptidfragment aufzureinigen. Das so erhaltene Peptidfragment wurde durch den Edmanabbau unter Verwendung des Gasphasen-Peptidsequenzer Model 477 (hergestellt von Applied Biosystem) analysiert, um die inneren Teil-Aminosäuresequenzen C-89 (SEQ ID NO:3 im Sequenzprotokoll), C-91 (SEQ ID NO:4 im Sequenzprotokoll), S-90 (SEQ ID NO:5 im Sequenzprotokoll), C-86 (SEQ ID NO:6 im Sequenzprotokoll) und C-121 (SEQ ID NO:7 im Sequenzprotokoll) der Ceramidase zu bestimmen.
Andererseits wurde, abgesehen von dem vorstehenden, die vorstehend beschriebene PVDF-Membran ohne eine Behandlung mit Lysyl-Endopeptidase in einen Peptidsequenzer eingebracht, um eine N-terminale Aminosäuresequenz N-Term (SEQ ID NO:8 im Sequenzprotokoll) zu bestimmen.
(3) Amplifikation des Ceramidase-Gen-enthaltenden DNA-Fragments durch PCR
Auf der Grundlage der N-terminalen Aminosäuresequenz und der inneren Teil-Aminosäuresequenz, bestimmt in Beispiel 1-(2), wurde jeder Primer, wie in jedem von SEQ ID NOS:9 bis 11 im Sequenzprotokoll gezeigt, entworfen und durch einen DNA-Synthesizer synthetisiert.
Speziell wurden jeweils ein Sense-Mischprimer S90-1, wie in SEQ ID NO:9 gezeigt, und ein Sense-Mischprimer S90-2, wie in SEQ ID NO:10 gezeigt, jeder S-90 entsprechend, wie in SEQ ID NO:5 gezeigt; ein Antisense-Mischprimer C89-c1, wie in SEQ ID NO:11 gezeigt, ein Antisense-Mischprimer C89-c2, wie in SEQ ID NO:12 gezeigt, und ein Antisense-Mischprimer C89-1, wie in SEQ ID NO:13 gezeigt, jeder C-89 entsprechend, wie in SEQ ID NO:3 gezeigt; und ein Antisense-Mischprimer C91-c1, wie in SEQ ID NO:14 gezeigt, entsprechend C-91, wie in SEQ ID NO:4 gezeigt, synthetisiert.
Jeder dieser Primer wurde der PCR-Reaktion unterworfen. Die PCR wurde unter Verwendung des Gene Amp Reagent Kits (hergestellt von Perkin Elmer) durchgeführt. Vierzig Reaktionszyklen der Reaktion wurden ausgeführt, wobei 1 Zyklus aus bei 94°C für 0.5 Minuten, bei 51°C für 0.5 Minuten und bei 72°C 1 Minute besteht.
In einer PCR-Reaktion mit der Kombination des Primers C89-1 mit dem Primer C91-c1 unter Verwendung der genomischen DNA, die in Beispiel 1-(1) erhalten wurde, als eine Matrize wurde die Amplifikation einer spezifischen Bande, die etwa 350 bp entspricht, nachgewiesen. Keine der Kombinationen von S90-1 mit C89-c1, S90-1 mit C89-c2, S90-2 mit C89-c1 und S90-2 mit C89-c2 zeigte irgendeine Amplifikation von spezifischen Banden.
Das vorstehend erhaltene amplifizierte DNA-Fragment von etwa 350 bp wurde von einem Gel nach der Agarosegelelektrophorese gesammelt und das gesammelte DNA-Fragment wurde mit pGEM-T Easy Vector (hergestellt von Promega) ligiert, um ein rekombinantes Plasmid zu präparieren. Unter Verwendung dieses Plasmids als eine Matrize wurde die Nucleotidsequenz des vorstehend erhaltenen amplifizierten DNA-Fragments durch das Didesoxy-Verfahren bestimmt. Als ein Ergebnis wurde gefunden, dass die erhaltene Nucleotidsequenz eine Nucleotidsequenz hat, die jede der Teil-Aminosäuresequenzen der Ceramidase, und zwar C-89, C-86, C-121 und C-91 codiert, was klarstellt, dass dieses amplifizierte DNA-Fragment ein Teil des Gens war, das eine gewünschte Ceramidase codiert.
(4) Nachweis des Ceramidase-Gen-enthaltenden DNA-Fragments
Das PCR-amplifizierte DNA-Fragment, das in Beispiel 1-(3) erhalten wurde, wurde als Sonde verwendet, um ein genomischen DNA-Fragment, das ein Ceramidase-Gen umfasst, zu durchmustern.
Zuerst wurden 5 μg der genomischen DNA, die in Beispiel 1-(1) erhalten wurde, mit 100 U von jedem der Restriktionsenzyme SphI, ApaI, KpnI, XhoI, SalI, HincII, HindIII, EcoRV, EcoRI, PstI, SmaI, BamHI, NotI und SacII bei 37°C für 22 Stunden verdaut und die entstandene Restriktionsenzym-verdaute DNA wurde einer Elektrophorese mit 1% Agarosegel unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde die DNA mit Hilfe des Southern-Blottings auf eine Nylonmembran [Hybond-N+, hergestellt von Amersham] übertragen. Als eine Hybridisierungssonde wurde eine verwendet, die durch Markierung von 0.1 μg des PCR-amplifizierten DNA-Fragments, das in Beispiel 1-(3) erhalten wurde, mit ³²P unter Verwendung des DNA-Markierungskits (Ready To Go, hergestellt von Pharmacia) gemäß dem Protokoll des Kits erhalten wurde.
Die vorstehend beschriebene Nylonmembran wurde bei 65°C 1 Stunde oder länger in einer Hybridisierungslösung, die 0.5 M Church-Verfahren-Phosphatpuffer [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 1991–1995 (1984)], pH 7.0, 7% SDS und 1mM EDTA enthielt, vorhybridisiert, und dann wurde die vorstehend beschriebene markierte Sonde dazu gegeben, so dass sie eine Konzentration von 6 fmol/ml hatte, und die Hybridisierung wurde bei 65°C über Nacht ausgeführt. Anschließend wurde die Nylonmembran dreimal jeweils bei 65°C für 15 Minuten mit einer Waschlösung, die vorher auf 65°C erhitzt worden war (Zusammensetzung: 1% SDS, 40 mM Natriumphosphatpuffer) gewaschen. Nach Entfernung des überschüssigen Wassers von der Nylonmembran wurde die Nylonmembran mit einer Bildplatte (hergestellt von Fuji Photo Film Co., Ltd.) für 20 Minuten in Kontakt gebracht, so dass sie photosensibilisiert wurde. Nach der Photosensibilisierung wurde die Bildplatte durch BAS 1000 Imaging-Analyzer (hergestellt von Fuji Photo Film Co., Ltd.) analysiert, um eine Sonde auf der Nylonmembran nachzuweisen. Als ein Ergebnis wurde gefunden, dass die durch SphI, ApaI, KpnI, XhoI, SalI, HincII, HindIII, EcoRV, EcoRI, PstI, SmaI, BamHI, NotI und SacII verdauten Produkte Signale haben, die den Sonden, die bei den Stellen von jeweils ungefähr 7.1 kb, 2.8 kb, 12.6 kb, 5.8 kb, 1.8 kb, 1.8 kb, 13.7 kb, 12.6 kb, 9 kb, 6 kb, 3.5 kb, 6.7 kb, 11.8 kb und 1.5 kb hybridisiert wurden, zugeschrieben wurden.
(5) Clonierung des Ceramidase-Gens
Auf der Grundlage der Ergebnisse von Beispiel 1-(4) wurde ein etwa 2.8 kb großes ApaI-Fragment cloniert. Zehn Milligramm ApaI-verdauter genomischer DNA wurden durch die Elektrophorese mit 1% Agarosegel aufgetrennt und ein Agarosegel an der Position, die einer Größe von etwa 2.8 kb entspricht, wurde ausgeschnitten. Unter Verwendung von Sephaglas BandPrep Kit (hergestellt von Amersham Pharmacia) wurde ein DNA-Fragment aus dem Gel extrahiert und aufgereinigt, und dieses DNA-Fragment wurde in pBluescript II SK (hergestellt von Toyobo Co., Ltd.) an der ApaI-Stelle eingefügt, um ein rekombinantes Plasmid zu präparieren. Der Escherichia coli-Stamm JM109 wurde mit diesem Plasmid transformiert und über Nacht auf einer L-Platte eines Agarmediums (Zusammensetzung: 1% Trypton, 0.5% Hefeextrakt, 1% NaCl, pH 7.2), das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, gezüchtet, und aus den gebildeten Kolonien wurden 300 Kolonien ausgewählt und auf eine Nylonmembran (Hybond-N, hergestellt von Amersham), die auf dieselbe Agarplatte gesetzt wurde, geimpft. Nach Züchten bei 37°C für 16 Stunden wurde die Nylonmembran 5 Minuten auf einem Filterpapier, das in eine alkalische Denaturierungslösung (Zusammensetzung: 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl) (Denaturierung) getaucht wurde, und 5 Minuten auf einem Filterpapier, das in eine Neutralisationslösung [Zusammensetzung: 0.5 M Tris-HCl (pH 7.5), 3M NaCl] (Neutralisation) getaucht wurde, behandelt und dann mit 2 × SSC (Zusammensetzung von 1 × SSC: 0.15 M NaCl, 0.015 M Natriumcitrat, pH 7.0) gespült
Diese Nylonmembran wurde unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen unter Verwendung des in Beispiel 1-(3) erhaltenen PCR-amplifizierten DNA-Fragments als eine Sonde hybridisiert, und 2 Kolonien wiesen die Signale auf. Eine dieser Kolonien wurde verwendet, um ein Plasmid herzustellen, das pSCA59 genannt und verwendet wurde, um die Nucleotidsequenz des in dieses Plasmid eingefügten DNA-Fragments zu bestimmen. Als ein Ergebnis wurden die Nucleotidsequenzen, die der Aminosäuresequenz, erhalten in Beispiel 1-(2), entsprechen, C-89, C-86, C-121 und C-91 zusammen mit den Stoppcodons in denselben Rastern gefunden, während keine Nucleotidsequenz, die einer N-terminalen Aminosäuresequenz N-Term oder S-90 entspricht, gefunden wurde. Mit anderen Worten, es wurde aufgeklärt, dass dieses Plasmid ein 3'-Endstück (C-terminale Region) enthielt, das ein Stoppcodon eines Ceramidase-Gens enthielt, aber kein 5'-Endstück (N-terminale Region).
Um die gesamte Länge eines Ceramidase-Gens zu erhalten, wurde anschließend ein DNA-Fragment, das die Region bei dem N-Endstück codiert, die in pSCA59 deletiert wurde, durch das Southern-Hybridisierungsverfahren auf die gleiche Weise, wie vorstehend beschrieben, durchmustert. Die hierin verwendete Sonde war ein KpnI/SacII-verdautes Fragment von pSCA59 mit einer Größe von etwa 560 bp, das die Sequenz bei dem 5'-Endstück des Ceramidase-Gens enthielt. Ein KpnI/SacII-Fragment in einer Größe von etwa 560 bp, isoliert durch Agarosegelelektrophorese, wurde mit ³²P auf dieselbe Weise, wie vorstehend beschrieben, markiert und auf dieselbe Weise, wie vorstehend beschrieben, der Southern-Hybridisierung unterworfen. Als ein Ergebnis wurde jede der Sonden jeweils mit einem SphI-verdauten Fragment bei einer Stelle von etwa 7.1 kb, mit einem ApaI-verdauten Fragment bei einer Stelle von etwa 2.8 bp, mit einem XhoI-verdauten Fragment bei einer Stelle von etwa 5.8 kb, mit einem EcoRI-verdauten Fragment bei einer Stelle von etwa 9 kb, mit einem PstI-verdauten Fragment bei einer Stelle von etwa 6 kb, mit einem SmaI-verdauten Fragment bei einer Stelle von etwa 3.5 kb, mit einem BamHI-verdauten Fragment bei einer Stelle von etwa 2.1 kb und mit einem SacII-verdauten Fragment bei einer Stelle von etwa 2.5 kb hybridisiert.
Auf der Grundlage der vorstehenden Ergebnisse wurde ein etwa 2.1 kb großes BamHI-Fragment cloniert. Zehn Milligramm von BamHI-verdauter genomischer DNA wurden durch Elektrophorese mit 1% Agarosegel aufgetrennt, und ein Agarosegel wurde an der Position, die einer Größe von etwa 2.1 kb entspricht, ausgeschnitten und ein DNA-Fragment von dem Gel, extrahiert und aufgereinigt unter Verwendung des Sephaglas BandPrep Kits, wurde an einer BamHI-Stelle in pGEM-3Zf(+) (hergestellt von Promega) eingefügt. Neun positive Kolonien wurden durch Transformieren des Escherichia coli-Stamms JM109 mit diesem Plasmid und durch Durchführen der Koloniehybridisierung auf die gleiche Weise, wie vorstehend beschrieben, erhalten. Ein Plasmid wurde aus einer dieser Kolonien präpariert und pGCB38 genannt. Danach wurde die Nucleotidsequenz des in das vorstehende pGCB38 eingefügte DNA-Fragments bestimmt. Zuerst wurden verschiedene Deletionsmutanten durch Verdau dieses Plasmids mit den Restriktionsenzymen PstI und XbaI und dann durch Behandeln mit Exonuclease III (hergestellt von Nippon Gene) und Mung Bean Nuclease (hergestellt von Nippon Gene) gemäß einem Standardverfahren hergestellt. Die Nucleotidsequenz des in pGCB38 eingefügten Ceramidase-Gens wurde durch Analysieren der Nucleotidsequenzen dieser Mutanten und pGCB38 mit dem Didesoxy-Verfahren bestimmt. Als ein Ergebnis wurden die Nucleotidsequenzen, die der N-terminalen Aminosäuresequenz N-Term einer Ceramidase und S-90 entsprechen, gefunden, wodurch geklärt wurde, dass pGCB38 die Region, die das N-Endstück des Ceramidase-Gens codiert, enthielt.
Eine Restriktionskarte des eingefügten DNA-Fragments der Plasmide pSCA59 und pGBC 28 wird in 1 gezeigt. Auf Grundlage der Ergebnisse der Analyse der Nucleotidsequenzen der beiden Plasmide wurden die gesamte Nucleotidsequenz des Ceramidase-Gens und die Aminosäuresequenz der Ceramidase bestimmt. Die Nucleotidsequenz des offenen Leserasters (ORF), das die vom Pseudomonas aeruginosa-Stamm AN-17 hergestellte Ceramidase codiert, ist, wie in SEQ ID NO:16 im Sequenzprotokoll gezeigt, und die durch dieses ORF codierte Aminosäuresequenz ist, wie in SEQ ID NO:15 im Sequenzprotokoll gezeigt. Eine Nucleotidsequenz, die die reife Ceramidase codiert, die durch eine N-terminale Aminosäuresequenz N-Term der Ceramidase, erhalten in Beispiel 1-(2) (SEQ ID NO:8 im Sequenzprotokoll) aufgeklärt wurde, wird in SEQ ID NO:2 im Sequenzprotokoll gezeigt. Die Aminosäuresequenz der reifen Ceramidase, die durch diese Nucleotidsequenz codiert wird, wird in SEQ ID NO:1 im Sequenzprotokoll gezeigt.
Beispiel 2 Konstruktion des Plasmids, welches das Ceramidase-Polypeptid exprimiert
Ein Plasmid, das Ceramidase exprimiert, wurde durch das Befolgen der nachstehend gezeigten Verfahren konstruiert.
Die Deletionsmutante des Plasmids pGCB38, die in Beispiel 1-(5) hergestellt wurde, pGCB38-D13, hat eine Insertion von bis zu 15 Basen stromaufwärts eines Startcodons des ORF, das die Ceramidase codiert. Ein DNA-Fragment von etwa 1.3 kb, entstanden aus dem Verdau dieses Plasmids mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI, wurde isoliert und durch Elektrophorese mit 1% Agarosegel aufgereinigt, um das DNA-Fragment-1 zu erhalten. Andererseits wurde ein DNA-Fragment von etwa 1.6 kb, entstanden aus dem Verdau des Plasmids pSCA59 mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI, isoliert und durch Elektrophorese mit 1% Agarosegel aufgereinigt, um das DNA-Fragment-2 zu erhalten.
Anschließend wurde ein HindIII-verdautes Plasmid pTV119N (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) mit einer Mischung des vorstehend erhaltenen DNA-Fragments-1 und DNA-Fragments-2 ligiert. Danach wurde ein rekombinantes Plasmid, in dem die Insertionsfragmente genau in der Reihenfolge von DNA-Fragment-1 und DNA-Fragment-2 stromabwärts eines lac-Promotors des pTV119N eingefügt wurden, ausgewählt und pTCD11 genannt. Weiter wurde pTCD11 mit einem Restriktionsenzym SmaI verdaut, um das Plasmid pTCDS7 herzustellen, in dem ein 500 bp SmaI-Fragment deletiert wurde. Der mit diesem Plasmid transformierte Escherichia coli-Stamm JM109 wurde als JM109/pTCDS7 benannt und angegeben und unter der Zugangsnummer FERM BP-6728 bei dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry hinterlegt.
Beispiel 3 Expression der Ceramidase in transformiertem E. coli
Der in Beispiel 2 erhaltene Escherichia coli-Stamm JM109/pTCDS7 wurde in 5 ml L-Medium, das 100 μg/ml von Ampicillin enthielt, geimpft und mit Schütteln bei 37°C über Nacht gezüchtet, und 1 ml Anteil des Kulturmediums wurde zu 200 ml des gleichen L-Mediums geimpft. Nach Züchten bei 37°C, bis die Trübung (Extinktion bei 600 nm) etwa 0.6 erreichte wurde zu der entstandenen Kultur Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) gegeben, um eine Endkonzentration von 0.1 mM zu ergeben, und dann weiter unter Schütteln bei 37°C 8 Stunden gezüchtet. Nach Beendigung der Züchtung wurden die Zellen durch Zentrifugation des Kulturmediums geerntet, in 3 ml eines 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8.0), der 0.5 mM 4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluoridhydrochlorid enthielt, suspendiert und ultraschallbehandelt, um die Zellen aufzubrechen. Die so erhaltene Flüssigkeit der aufgebrochenen Zelle wurde zentrifugiert, um den Überstand zu sammeln, der als eine Rohenzym-Lösung verwendet wurde.
Diese Rohenzym-Lösung wurde auf ihre Ceramidase-Aktivität unter Verwendung von C12-NBD-Ceramid als ein Substrat gemäß dem Verfahren, beschrieben in Journal of Biological Chemistry, 273, 14368–14373 (1998) getestet. Spezifisch wurde eine Reaktionslösung durch Lösen von 550 pmol C12-NBD-Ceramid, 2.5 mM Calciumchlorid, 0.25% (w/v) Triton X-100 und einer geeigneten Menge der Rohenzym-Lösung in 20 μl eines 25 mM Tris-HCl-Puffers (pH 8.5) hergestellt und die Reaktionslösung wurde bei 37°C 20 Minuten inkubiert. Die entstandene Reaktionsmischung wurde in siedendem Wasser 5 Minuten inkubiert, um die Reaktion zu beenden, und die Reaktionsmischung wurde weiter unter reduziertem Druck getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde in der Lösung von Chloroform/Methanol = 2/1 (Gewichtsverhältnis) gelöst und einer Kieselgel-Dünnschichtchromatographie [Eluent: Chloroform/Methanol/25% wässriges Ammoniak = 90/20/0.5 (Volumenverhältnis)] unterworfen. Nach der Entwicklung wurden die Mengen von C12-NBD-Ceramid und sein Abbauprodukt C12-NBD-Fettsäure bei der Anregungswellenlänge von 475 nm und der Fluoreszenzwellenlänge von 525 nm mit einem CS-9300-Chromatoscanner (hergestellt von Shimadzu Corporation) getestet. Eine Einheit dieses Enzyms wurde definiert als eine Enzymmenge, die für die Bildung von 1 μmol C12-NBD-Fettsäure pro Minute unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen benötigt wird. Als Ergebnis wurde gezeigt, dass der Escherichia coli-Stamm JM109/pTCDS7, der das Ceramidase-Gen gemäß der vorliegenden Erfindung beherbergt, etwa 32 Einheiten der Ceramidase pro 1 L des Kulturmediums herstellte.
Beispiel 4 Nachweis der atopischen Dermatitis
Auf der Grundlage der Nucleotidsequenz des vorstehend beschriebenen Ceramidase-Gens wurden Primer 382U, ein Primer für stromaufwärts, und Primer 884L, ein Primer für stromabwärts, entworfen und als Primer zum Nachweisen eines Ceramidase-Gens synthetisiert. Die Nucleotidsequenzen von Primer 382U und Primer 884L sind wie in SEQ ID NOS:17 und 18 im Sequenzprotokoll gezeigt. Wenn eine PCR unter Verwendung dieser zwei Primer und eines Ceramidase-Gens der in SEQ ID NO:2 im Sequenzprotokoll gezeigten Nucleotidsequenz als eine Matrize durchgeführt wurde, wurde ein DNA-Fragment von 523 bp amplifiziert.
Die von Haut-stammenden Proben wurden von der Haut von jedem der 24 Patienten mit atopischer Dermatitis und 8 normalen Individuen in den folgenden Prozeduren gesammelt. Die Haut eines zu testenden Individuums wurde mit einem sterilisierten Baumwolltupfer abgewischt und der Tupfer wurde in 200 μl sterilisiertes destilliertes Wasser getaucht und vor dem Entnehmen einer Probe heftig gerührt. Die entnommene Probe wurde bei 100°C 5 Minuten erhitzt, um eine Probenlösung zu erhalten, die für eine PCR verwendet wird.
Die PCR wurde unter Verwendung von EXTaq (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) durchgeführt. 100 μl einer PCR-Reaktionslösung, die 5 μl der Probenlösung, je 0.2 μM Primer 382U und Primer 884L, je 0.2 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 2.5 U EXTaq enthielt, wurde unter Verwendung eines Reaktionspuffers, angefügt an EXTaq für 40 Zyklen präpariert, wobei ein Zyklus aus 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 60°C und 1 Minute bei 72°C besteht. Ein Teil der entstandenen Reaktionsmischung wurde einer Agarosegelelektrophorese unterworfen und das erhaltene Gel nach der Elektrophorese wurde mit Ethidiumbromid gefärbt, um die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Amplifikation des DNA-Fragments zu untersuchen.
Als ein Ergebnis wurde in den Proben von 15 aus 24 Patienten mit atopischer Dermatitis eine spezifische Amplifikation des DNA-Fragments von etwa 500 bp, ein Anzeiger für die Anwesenheit eines Ceramidase-Gens gefunden. Andererseits wurde keine solche Amplifikation des Fragments in einer beliebigen der 8 Proben, die von den normalen Individuen stammten, bemerkt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Gen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Gen, das ein Polypeptid codiert, das die in SEQ ID NO:1 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst; (b) einem Gen, das die in SEQ ID NO:2 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst; (c) einem Gen, das ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz des Polypeptids umfasst, das von dem Gen codiert wird, das von dem in FERM BP-6728 enthaltenen Vektor getragen wird; (d) einem Gen, das die Nucleotidsequenz des Gens umfasst, das von dem in FERM BP-6728 enthaltenen Vektor getragen wird; (e) einem Gen, das mit dem komplementären Strang des Gens gemäß (a) bis (d) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann und ein Polypeptid mit Ceramidase-Aktivtät codiert; (f) einem Gen, das ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz des Polypeptids umfasst, das von dem Gen gemäß (e) codiert wird; oder der komplementäre Strang davon.
Vektor, umfassend das Gen nach Anspruch 1.
Vektor nach Anspruch 2, in dem das Gen funktionell mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden ist.
Transformante, die mit dem Gen nach Anspruch 1 oder dem Vektor nach Anspruch 2 oder 3 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit Ceramidase-Aktivität, umfassend das Züchten der Transformante nach Anspruch 4 und das Ernten eines Polypeptids mit Ceramidase-Aktivität aus der entstandenen Kultur.
Oligonucleotid-Sonde oder -Primer, bestehend aus einer Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:9 bis 14, 17 und 18.
Verfahren zum Nachweis eines Gens, das ein Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität codiert, umfassend das Verwenden einer/eines Oligonucleotid-Sonde oder- Primers, bestehend aus zumindest 15 Basen, die/der unter stringenten Bedingungen mit dem Gen nach Anspruch 1 oder dem komplementären Strang davon hybridisieren kann.
Verfahren zum Nachweis von atopischer Dermatitis, umfassend das Nachweisen eines Gens, das ein Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität codiert, durch das Verfahren nach Anspruch 7.
Verwendung einer/eines Oligonucleotid-Sonde oder -Primers zum Nachweis eines Gens, das ein Polypeptid mit Ceramidase-Aktivität codiert, wobei die/der Oligonucleotid-Sonde oder -Primer aus zumindest 15 Basen besteht und unter stringenten Bedingungen mit dem Gen nach Anspruch 1 oder dem komplementären Strang davon hybridisieren kann.