DE69014644T2

DE69014644T2 - Somatische embryogenese von kürbissen.

Info

Publication number: DE69014644T2
Application number: DE69014644T
Authority: DE
Inventors: Paula Chee
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1989-09-20
Filing date: 1990-08-22
Publication date: 1995-05-04
Anticipated expiration: 2010-08-23
Also published as: DK0491733T3; AU6284090A; EP0491733A1; JPH05500308A; EP0491733B1; WO1991004332A1; ES2065545T3; US5677157A; DE69014644D1; ATE114720T1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Regenerierverfahren für Kürbisse (Cucurbita pepo L.) und die Verwendung der Quellen von regenerierbarem Gewebe zum Transfer von genetischem Material. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Kürbisgeweben, zum Gewinnen somatischer Embryos und zum Regenerieren dieser Embryos in normale Kürbispflanzen. Die vorliegende Erfindung sorgt ferner für die Übertragung von genetischem Material in Kürbisembryos zur Herstellung transformierter Pflanzenzellen und transformierter Kürbispflanzen, die gegen Pflanzenviren, -insekten, -unkräuter, pathogene Pflanzenmikroben resistent sind, und zur Erreichung weiterer günstiger Merkmale als Ergebnis der Übertragung genetischer Information.

Hintergrund der Erfindung

Rürbis (Cucurbita pepo L.) ist in vielen Bereichen der gemäßigten Zonen beider Hemisphären eine wichtige Feldfrucht, so daß Verbesserungen der Fähigkeit dieser Feldfrucht, Viren, Insekten und Unkräutern zu widerstehen und ihre Wachstumskraft zu verbessern, von beachtlichem kommerziellem Wert wäre. Gegenwärtige Pflanzenzuchtprogramme haben bei dieser Spezies hinsichtlich ihrer Eigenschaften beachtliche Verbesserungen erzielt. Es wird jedoch angenommen, daß mit der Entwicklung zellulärer Vorgänge, beispielsweise einer Gewebekulturregeneration, und molekularer Vorgänge, beispielsweise der Übertragung von genetischem Material, diese Eigenschaften schneller entfaltet werden könnten.
Über die Regeneration der Kürbisspezies aus Gewebekulturen wurde für die Gurke (Cucumis sativas L.) (Nadolska-Orczyk und Malepszy, 1984) und die Melone (Cucumis melo L.) (Moreno et al., 1985) berichtet. Schroder (1968) berichtete über die Produktion von embryogenetischem Gewebe aus Pericarpgeweben des Kürbis. Jelaska (1972, 1973) berichtete über eine somatische Embryogenese von aus dem Hypokotyl und Kotyledon stammendem Kallus von Kürbissen und zeigte, daß sich Embryos in normale Pflanzen entwickeln konnten. Pink und Walkey (1984) berichteten über ein schnelles Vermehrungsverfahren für Kürbisse durch eine apikale Meristemkultur. Die Literatur enthält jedoch keine Berichte über eine Ganzpflanzenregeneration von Kürbissen, obwohl wir hier zwei Verfahren zur effizienten Regeneration von Kürbissen beschreiben. Diese Regenerationsverfahren liefern ferner das Material, das zur Übertragung von genetischem Material in das Kürbisgenom verwendet werden kann.
Ein Verfahren zur Übertragung genetischer Information in die Genome zweikeimblättriger Pflanzen umfaßt die Verwendung von zwei pathogenen Spezies Gram-negativer Bodenbakterien Agrobacterium tumefaciens und Agrobacterium rhizogenes (vgl. Übersichtsartikel von Bevan und Chilton, 1982), was zu den als Crown Gall bzw. Hairy Root bekannten Erkrankungen führt. Die Ursache dieser beiden Erkrankungen liegt, wie festgestellt wurde, in der Übertragung und Integration eines Segments des großen pTi- oder pRi-DNA-Plasmids, die als die T-DNA-Bereiche bekannt sind (Chilton et al., 1977; Chilton et al., 1982). Die Identifizierung mehrerer gemeinsamer Schritte beim pTi- und pRi-T-DNA-Übertragungsmechanismus und der in diesen T-DNA-Bereichen, die für die Erkrankung verantwortlich sind, enthaltenen Gene führte zu der Konstruktion avirulenter Agrobacterium-Stämme (Hepburn et al., 1985; Hood et al., 1986; Vilaine und Casse-Delbart, 1987). Diese Information führte ferner zur Konstruktion kleinerer, einen großen Wirtstamm aufweisender Plasmide mit der Fähigkeit zur Replikation sowohl in E. coli-, als auch in Agrobacterien-Stämmen. Derartige Plasmide enthalten die zur Übertragung eines konstruierten T-DNA-Bereichs aus dem Bakterium in Pflanzenzellen notwendigen, aus dem Agrobacterium stammenden pTi- oder pRi-DNA-Signale. Diese Plasmide werden als binäre Plasmide bezeichnet (Bevan, 1984; An et al., 1985).
Von vielen zur Familie Cucurbitaceae gehörenden Spezies ist bekannt, daß sie für eine Infektion durch diese Agrobacterium-Pathogene empfänglich sind (vgl. Übersichtsartikel von Anderson und Moore, 1979; Smarrelli et al., 1986). Eine Regeneration von Kürbissen (Cucurbita pepo L.) wird im folgenden beschrieben. Die Kombination dieser beiden Tatsachen legt die Vermutung nahe, daß eine Agrobacterium vermittelte Übertragung genetischer Information in das Genom einer Kürbisspezies (beispielsweise Cucurbita pepo L.) ohne Schwierigkeiten erreichbar sein sollte.
Neben der Verwendung einer Agrobacterium vermittelten Übertragung regenerierbarer Pflanzengewebe wurde jüngst ein zweites Verfahren zur Übertragung von Genen entwickelt: Die Verwendung von Mikroprojektilen zur Übertragung von DNA-Molekülen in Pflanzenzellen (Klein et al., 1987). Das im folgenden beschriebene Verfahren zur Regenerierung von Kürbissen liefert Gewebe, die bereitwillig durch das Mikroprojektilvorgehen übertragen werden können. Die Entwicklung von Regenerations und Transformationssystemen zur Übertragung und stabilen Integration genetischen Materials in das Genom der Kürbisspezies (Gurke, Melone und Kürbis) eignet sich zur Übertragung genetischer Merkmale, die (nur schwierig) oder überhaupt nicht über herkömmliche Pflanzenzuchttechniken übertragen werden können.
Die Entwicklung einer Genübertragungstechnologie für die Kürbisspezies (beispielsweise Kürbis) wird zur Übertragung konstruierter Gene, die Resistenz gegenüber einer Virusinfektion (Powell-Able et al., 1986; Cuozzo et al., 1988), Herbizidresistenz (Comai et al., 1985; della- Cioppa et al., 1987; Lee et al., 1988; Stalker et al., 1985) oder beliebige weitere geeignete genetische Merkmale, beispielsweise Gene für eine Resistenz gegen Insektenschädlinge, Mikroben und weitere Schädlinge (vgl. die im folgenden aufgeführten Beispiele), verleihen, verwendet.

Informationshinweise

Über die Transformation und Regeneration von transformierten Gurkenpflanzen, die das NPT II-Gen exprimieren, wurde vormals von Trulson et al. (1986) berichtet. Diese Übertragung bzw. Transformation wurde mit Hilfe von Agrobacterium rhizogenes erreicht. Die EP-A-O 223 452 beschreibt Pflanzen mit einer Resistenz gegen virale Erkrankungen und Verfahren zur Herstellung derselben. Die internationale PCT-Patentanmeldung PCT/US86/00614 betrifft im allgemeinen ein Verfahren, um einem Wirt für einen Parasiten eine Resistenz gegen den Parasiten zu verleihen. Ferner gibt es weitere Patentschriften über Herbizide und die Verwendung von Proteinen zur Herstellung einer Mikrobenresistenz.
G. An (1986): "Developement of plant promoter expression vectors and their use for analysis of differential activity of nopaline synthase promoter in transformed tobacco cells" in Plant Physiol. 81:86-91;
G. An, B.D. Watson, S. Stachel, M.P. Gordon und E.W. Nester (1985): "New cloning vehicles for transformation of higher plants" in EMBO J. 4:277-284;
A. R. Anderson und L.W. Moore (1979): "Host specificity in the genus Agrobacterium" in Phytopath. 69:320- 323;
M. W. Bevan (1984): "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation" in Nucl. acids Res. 12:8711- 8721;
M. W. Bevan und M.-D. Chilton (1982): "T-DNA of the Agrobacterium Ti and Ri plasmids" in Ann. Rev. Genet. 16:357-384;
M.-D. Chilton, M.H. Drummond, D.J. Merlo, D. Sciaky, A.L. Montoya, M.P. Gordon und E. W. Nester (1977): "Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: the molecular basis of crown gall tumorigenesis" in Cell 11:263-271;
M.-D. Chilton, D.A. Tepfer, A. Petit, C. David, F. Casse-Delbart, J. Tempe (1982): "Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells" in Nature 295:432-434;
A. Depicker, M. Dewilde, G. DeVos, M. Van Montagu und J. Schell (1980): "Molecular cloning of overlapping segments of the nopaline Ti-plasmid pT1C58 as a means to restriction endonuclease mapping" in Plasmid 3:193-211;
A.G. Hepburn, J. White, L. Pearson, M.J. Maunders, L. E. Clarke, A.G. Prescott und K.S. Blundy (1985): "The use of pNJ5000 as an intermediate vector for genetic manipulation of Agrobacterium Ti-plasmids" in J. Gen. Microbio. 131:2961-2969;
E.E. Hood, G.L. Helmer, R.T. Fraley und M.-D. Chilton (1986): "The hypervirulence of Agrobacterium tumefaciens A281 is encoded in a region of pTiBo542 outside of the T-DNA" in J. Bacteriology 168:1291-1301;
R.B. Horsch, J.E. Fry, H.L. Hoffmann, D. Eichholtz, S.G. Rogers und R.T. Fraley (1985): "A simple and general method for transferring genes into plants" in Science 227:1229-1231;
S. Jelaska (1972) in Planta 103:278-280;
S. Jelaska (1973) in Acta Bot. Croat. 32:81-94;
S. Jelaska (1986), Cucurbits in Biotechnology in Agriculture and Forestry (Herausgeber Y.P.S. Bajai) 2:371-386;
T. M. Klein, E. D. Wolf und J. C. Sandford (1987): "High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells" in Nature 327:70-73;
S. Malepepsy und A. Nadolska-Orczyk (1983): "In vitro Culture of Cucumis staivus I. Regeneration of plantlets from callus formed by leaf explants" in Z. Pflanzenphysio. Bd. 111 S. 273-276;
V. Moreno, M. Garcia-Sogo, I. Granell, B. Garcia- Sogo und L. A. Rorg (1985) in Plant Cell Tissue Organ Culture 5:139-146;
T. Murashige und S. Skoog (1962): "A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures" in Physiol. Plant 15:473-497;
A. Nadolska-Orczyk und S. Malepszy (1984): "Cucumber plant regeneration from leaf explants-selected characteristics" in Bulletin Pol. Acad. Sci.
D. A. C. Pink und D. G. A. Walkey (1984), Sci. Hortic. (AMST) 24:107-114;
C. A. Schroder (1986), Bot. Gaz 129:374-376;
J. Smarelli Jr., M.T. Watters und L. Diba (1986): "Reponse of various cucurbits to infection by plasmidharboring strains of Agrobacterium" in Plant. Physiol. 82:622-624;
A. J. Trulson, R. B. Simpson und E. A. Shahin (1986), "Transformation of cucumber (Cucumis sativus L.) plants with Agrobacterium rhizogenes" in Theor. Appl. Genet.
F. Vilaine und F. Casse-Delbart (1987): "Independent induction of transformed roots by the TL and TR regions of the Ri plasmid of agropine type Agrobacterium rhizogenes" in Mol. Gen. Genet. 206:17-23.
Die folgenden wissenschaftlichen Publikationen sind von Interesse, jedoch nicht relevant:
H. Bohlmann, S. Clausen, S. Behnke, H. Giese, C. Hiller, U. Reinmann-Philipp, G. Schrader, V. Barkholt und K. Apel (1988): "Leaf-specific thionins of barley-a novel class of cell wall proteins toxic to plant-pathogenic fungi and possibly involved in the defense mechanism of plants" in EMBO J. 7:1559-1565;
H.G. Boman, I.A. Boman, D. Andreu, Z.-q. Li, R.B. Merrifield, G. Schlenstadt und R. Zimmermann (1989): "Chemical synthesis and enzymatic processing of precursor forms of Cecropins A and B" in J. Bio. Chem. 264:5852- 5860;
H.G. Boman, I. Faye, P. v.Hofstein, K. Kockum, J.-Y. Lee, K.G. Xanthopoulos, H. Bennich, A. Engstrom, R.B. Merrifield und D. Andreu (1985): "On the primary structure of lysozyme, cecropins, and attacins from Hyalophora cecropia" in Dev. Comm. Imm. 9:551-558;
L. Comai, D. Facciotti, W.R. Hiatt, G. Thompson, R.E. Rose und D.M. Stalker (1985): "Expression in plants of a mutant aroA gene from Salmonella typhimurium confers tolerance to glyphosphate" in Nature 317:741-744;
K.A. Daher, R.I. Lehrer, T. Ganz und M. Kronenberg (1988) "Isolation and characterization of human defensin cDNA clones" in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7327-7331;
G. della Cioppa, S.C. Bauer, M.L. Taylor, D.E. Rochester, B.K. Klein, D.M. Shah, R.T. Fraley und G.M. Kishore (1987): "Targeting a herbicide-resistant enzyme from Escherichia-coli to chloroplasts of higher plants" in Bio/Tech. 5:579-584;
M. Cuozzo, K. O'Connell, W. Kaniewski, R.-X. Fang, N.-H. Chua und N.E. Turner (1988): "Viral protection in transgenic tobacco plants expressing the cucumber mosaic virus coat protein or its antisense RNA" in Bio/Tech. 6:549-557;
S.C. Falco, R.S. Chaleff, K.S. Dumas, R.A. LaRossa, K.J. Leto, C.J. Mauvais, B.J. Mazur, T.B. Ray, J.V. Schloss und N.S. Yadav (1985): "Molecular biology of sulfonylurea herbicide activity" in Biotechnology in Plant Sciences (Academic Press, Inc. New York, NY) S. 313-328;
D. Hultmark, A. Engstrom, K. Anderson, H. Steiner, H. Bennich und H.G. Boman (1983): "Insect immunity: attacins, a family of antibacterial proteins from Hyalophora cecropia", in EMBO J. 2:571-567;
R.A. Jefferson, T.A. Kavanagh, M.W. Bevan (1987): "Gus fusions: B-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plant" in EMBO J. 6:3901-3907;
K.Y. Lee, J. Townsend, J. Tepperman, M. Black, C.F. Chui, B. Mazur, P. Dunsmuir und J. Bedbrook (1988) in EMBO J. 7:1241-1248;
B.J. Mazur und C.-F. Chui (1985): "Sequence of a genomic DNA clone for the small subunit of ribulose bisphosphate carboxylase-oxygenase from tobacco" in Nucl. Acid. Res. 13:2373-2386;
M. Pietrzak, R.D. Shillito, T. Hohn und I. Potrykus (1986): "Expression in plants of two bacterial antibiotic resistance genes after protoplast transformation with a new plant expression vector" in Nuc. Acids. Res. 14:5857- 5868;
P. Powell-Abel, R.S. Nelson, B. De, N. Hoffmann, S.G. Rogers, R.T. Fraley und R.N. Beachy (1986): "Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene" in Science 232:738-743;
J.J. Sanchez-Serrano, M. Keil, A. O'Connor, J. Schell und L. Willmitzer (1987): "Wound-induced expression of a potato proteinase inhibitor II gene in transgenic tobacco plants" in EMBO J. 6:303-307;
H.E. Schnepf, H.C. Wong und H.R. Whiteley (1985): "The amino acid sequence of a crystal protein from Bacillus thuringiensis deduced from the DNA base sequence" in J. Biol. Chem. 260:6264-6272;
V. Sekar, D.V. Thompson, M.J. Maroney, R.G. Bookland und M.J. Adang (1987): "Molecular cloning and characterization of the insecticidal crystal protein gene of Bacillus thuringiensis var. tenebrionis." in Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:7036-7040;
D.M. Shah, R.B. Horsch, H.J. Klee, G.M. Kishore, J.A. Winter, N.E. Turner, C.M. Hironaka, P.R. Sanders, C.S. Gasser, S. Aykent, N.R. Siegel, S.G. Rogers und R.T. Fraley (1986): "Engineering herbicide tolerance in transgenic plants" in Science 233:478-481;
D.M. Stalker, W.R. Hiatt und L. Comai (1985): "A single amino acid substitution in the enzyme 5-enolyruvylshikimate-3-phosphate synthase confers resistance to the herbicide glyphosate" in J. Bio. Chem. 260:4724-4728;
M. Vaeck, A. Reynaerts, H. Hofte, S. Jansens, M. De Beuckeleer, C Dean, M. Zabeau, M. Van Montagu und J. Leemans (1987): "Transgenic plants protected from insect attack" in Nature 328:33-37;
C. Waalwijk, A.M. Dullemans, M.E.S. van Workum und B. Visser (1985): "Molecular cloning and the nucleotide sequence of the Mr 28000 crystal protein gene of Bacillus thuringiensis supsp. israelensis" in Nucl. Acids Res. 13:8207-8217;
M. Zasloff (1987) Magainins: "A class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: isolation, characterization of two active forms, and partial cDNA seguence of a precursor" in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5449-5453.

Zusammenfassung der Erfindung

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Regenerierung und Transformation von Cucurbita pepo L. (Kürbis) Pflanzen, die zur Familie Cucurbitaceae gehören, durch
1. Herausschneiden von Kürbisgewebe, ausgewählt aus der Gruppe Sprossenspitzen aus keimenden Kürbissamen und Kürbisgewebe aus reifen Samen,
3. Herstellen embryogener Kalli aus den Geweben, bei denen es sich entweder um nicht transformierte oder transformierte handelt,
4. Selektives Wachsenlassen der transformierten embroygenen Kalli auf Kanamycin enthaltenden Medien und
5. Unterwerfen der transformierten embryogenen Kalli einem embroyogenen Regenerationsverfahren, aus dem ganze transformierte Kürbispflanzen gewonnen werden können.
Wenn das herausgeschnittene Gewebe die Sprossenspitzen aus keimendem Kürbissamen sind, werden die transformierten embryogenen Kalli durch a) Animpfen des herausgeschnittenen Kürbisgewebes mit virulenten oder avirulenten Stämmen von Agrobacterium und b) Züchten der erhaltenen Explantate auf aus MS-Medium, 2,4,5-T, BA, Kn bestehenden Induktionsmedien gebildet.
Wenn das herausgeschnittene Gewebe aus Gewebe reifer Kürbissamen besteht, werden die transformierten embryogenen Kalli durch a) Animpfen des herausgeschnittenen Kürbisgewebes mit virulenten oder avirulenten Stämmen von Agrobacterium und b) Züchten der erhaltenen Explantate auf aus MS-Medium, 2,4-D oder 2,4,5-T, BA, Kn bestehenden Induktionsmedien gebildet.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Im allgemeinen umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren die schematisch in Schema 1 dargestellten Schritte.

Bildung und Regeneration von embryonalen Kürbiskalli

Verfahren 1: Aus Sprossenspitzenexplantaten stammende somatische Embryos

Pflanzenmaterial

Von der Asgrow Seed Company, Kalamazoo, MI wurden Samen von Sommerkürbis (Cucurbita pepo L.) cv. YC 60 bezogen. Sie wurden etwa 15 min lang in Leitungswasser eingeweicht und anschließend ihre Samenhüllen von Hand entfernt. Die von der Hülle befreiten Samen wurden 2 min lang mit 95% Alkohol behandelt und anschließend 25 min lang in eine 25% (v/v) Lösung von im Handel erhältlichem Hypochlorit (Clorox, es enthält 5,25% Natriumhypochlorit) eingetaucht. Danach wurden sie 4 mal mit sterilem destillierten Wasser gespült. Die sterilisierten Samen wurden mit 50 ml Murashige und Skoog (1962) (MS)-Basismedium mit 30 g/l Saccharose, 8 g/l Difco-Agar (Difco Laboratories) in Magnetabehälter eingebracht. Die Samen wurden im Dunklen bei 28ºC in einem Percival-Inkubator keimen gelassen.

Induktion einer somatischen Embryogenese und Pf lanzenregeneration:

Aus den apikalen Kuppeln und etwas Stützgewebe bestehende Sprossenspitzen wurden von 7 Tage alten in vitro gezogenen Sämlingen abgeschnitten. Die Spitzen wurden in Längsrichtung in Hälften geschnitten und horizontal auf MS Plus 1,2 mg/l 2,4,5-Trichlorphenoxyessigsäure (2,4,5- T) plus 0,8 mg/l 6-Benzylaminopurin (BAP) und 0,1 mg/l β- Naphthylenessigsäure (NAA) kultiviert. Alle Gewebekulturmedien wurden mit 3% Saccharose ergänzt und mit 0,8% Phytagar (Gibco) verfestigt. Der pH-Wert der Medien wurde vor einem 20minütigen Autoklavieren bei 121ºC auf 5,8 eingestellt. Alle nachfolgenden Gewebekulturen wurden bei 28ºC im Dunklen gehalten. Nach einem 2wöchigen Züchten auf diesem Medium quollen die Sprossenspitzenexplantate. Das Gewebe verlor seine grüne Farbe und wurde bernsteinfarben. Das embryogene Kallusgewebe wurde durch nachfolgendes jede Woche erfolgendes Subkultivieren des schleimigen lichtdurchlässigen Kallusgewebes auf Platten mit frischem MS-Medium plus 1,2 mg/l 2,4,5-T, 0,8 mg/1 BAP und 0,1 mg/l NAA vermehrt. Nach 6 Wochen war das vermehrte Kallusgewebe glänzend, lichtdurchlässig und schleimig. Nach 8 Wochen Inkubation bei den obigen Bedingungen wurde beobachtet, daß sich vermeintliche somatische Embryos aus Sektoren auf der Oberfläche des schleimigen Kallus organisieren. Zur Förderung einer weiteren Entwicklung der vermeintlichen somatischen Embryos wurden sie auf ein Umkehrmedium, das aus MS- Medium plus 0,05 mg/l NAA und 0,05 mg/l Kinetin bestand, übertragen. Diese Strukturen wurden bei 28ºC bei einer 16stündigen Photoperiode unter diffusen Kaltweiß- Fluoreszenzlampen (4 klx) auf diesem Medium gehalten. In 3 Wochen wurden die Sprossenspitzen der Embryos grün und weitere 3 Wochen später wurden Pflänzchen erhalten. Etwa 75% der somatischen Embryos entwickelten sich zu vollständigen Pflanzen. Eine oberflächliche Bewertung zeigte, daß die regenerierten Pflanzen keine großen phänotypischen Abnormalitäten zeigten. Die regenerierten Pflanzen blühten und brachten Samen hervor.

Verfahren 2: Somatische Embryos aus reifen Samen Pflanzenmaterial

Von der Asgrow Seed Company, Kalamazoo, MI wurden reife Samen des Sommerkürbis Curcubita pepo L. cv. YC 60 bezogen. Die Samen wurden 10 min lang mit einer 15% (v/v) Lösung von Clorox (im Handel erhältliches Bleichmittel mit 5,25% Natriumhypochlorit) oberflächensterilisiert und 3 x mit sterilem Wasser gewaschen. Die Samenhüllen wurden von Hand entfernt und die Samen abermals 25 min lang mit 25% Clorox sterilisiert, 3 x mit sterilem Wasser und anschließend 1 min lang mit 70% Alkohol und danach abermals 3 x mit sterilem Wasser gewaschen.

Induktion einer somatischen Embryogenese und Pflanzenregeneration:

(A) Sterilisierte Samen wurden in Querrichtung in zwei ungleiche Teile zerschnitten: Ein Teil mit der Embryonalachse und einem Drittel des Kotyledon und der andere Teil mit zwei Dritteln des Kotyledon. Die Explantate mit der Embryonalachse wurden im Dunklen bei 26ºC mit der Schnittoberfläche nach oben gezüchtet. Die Explantate mit lediglich den Kotyledons wurden horizontal auf MS-Basis- Medium mit einer faktoriellen Kombination von acht Konzentrationen 2,4-D (0,5, 1, 2, 3, 5, 10, 25, 50 mg/l) und fünf Konzentrationen kn (0, 0,5, 1, 2, 3 mg/l) gezüchtet. Nach 9 Wochen mit einer Subkultur wurden auf der Oberfläche der Explantate die vermeintliche somatische Embryos enthaltenden embryogenen Kallusgewebe gebildet. Diese somatischen Embryos wurden auf ein Umkehrmedium aus MS Basis-Medium mit 0,05 mg/l NAA und 0,05 mg/l Kinetin überführt. Diese Strukturen wurden bei 28ºC unter diffusen Kaltweiß-Fluoreszenzlampen (4 klx) bei einer 16stündigen Photoperiode auf diesem Medium gehalten. Sobald die apikalen Bereiche eine Entwicklung zeigten, wurden die Pflänzchen in ein halb starkes MS Basis-Medium enthaltende Magnetabehälter überführt. Nachdem die Pflänzchen ein Wurzelsystem entwickelt hatten, wurden sie in ein Eintopfgemisch überführt und zu einer Abhärtung mit einem Ziploc-Vorratsbeutel bedeckt. Danach wurden die abgehärteten Pflanzen in Erde überführt und in einem Gewächshaus zur Reife wachsen gelassen. Die regenerierten Pflanzen zeigten keine großen phänotypischen Abnormalitäten, sie blühten und sie brachten lebensfähige Samen, die nachfolgende Generationen lieferten, hervor.
(B) Explantate wurden auf MS Basis-Medium mit einer faktoriellen Kombination von drei Konzentrationen IAA (0, 1,5 und 3 mg/l) und fünf Konzentrationen kn (0, 1,5, 3,0, 4,5 und 6,0 mg/l) gezüchtet. Nach neun Wochen mit einer Subkultur wurden die Gewebe bezüglich einer embryogenen Kallusbildung bewertet.
(C) Die Explantate wurden auf einem MS Basis-Medium mit 2,4,5-T (1,2 mg/l), BA (0,8 mg/l) und Kinetin (0,1 5mg/l) im Dunklen bei 26ºC gezüchtet. Nach neun Wochen mit einer Subkultur wurden die vermeintliche somatische Embryos enthaltenden embryogenen Kallusgewebe, die sich auf der Oberfläche der Explantate gebildet hatten, auf ein Umkehrmedium überführt und unter diffusen Kaltweiß-Fluoreszenzlampen (4 klx) bei einer 16stündigen Photoperiode inkubiert. Die nachfolgenden Vorgänge entsprachen den in Experiment 1 beschriebenen.

Abkürzungen:

BA = 6-Benzylaminopurin,
2,4-D = 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure,
IAA = Indoylbuttersäure,
NAA = Naphthylessigsäure,
2,4,5-T = 2,4,5-Trichlorphenoxyessigsäure,
Kn = Kinetin
MS = Murashige und Skoog (1962).

Transformationsvorgehen

Beispiel 1

Die Verwendung von Agrobacterien zur Transformation
Eine Transformation von Kürbisgeweben aus entweder den Sprossenspitzen oder frisch geschnittenen reifen Samen erfolgte unter Verwendung von zu den von Horsch et al. (1985) beschriebenen Verfahren ähnlichen Verfahren. Aus den apikalen Kuppeln und etwas Stützgewebe bestehende Sprossenspitzen wurden aseptisch von jungen Kürbissämlingen entfernt und in einer über-Nacht-Kultur von entweder dem avirulenten Agrobacteriumstamm C58Z707 (Hepburn et al, 1985), dem virulenten Stamm C58 (Depicker et al., 1980) oder beliebigen weiteren Stämmen von Agrobacterium tumefaciens oder rhizogenes untergetaucht. Darüber hinaus wurden Kürbisgewebe aus frisch geschnittenen reifen Samen gewonnen und in ähnlicher Weise durch Agrobacterium transformiert. Die Agrobacteriumstämme sollten ein binäres Plasmid, beispielsweise pGA482 (An et al., 1985; An, 1986), das so modifiziert worden ist (vgl. Beispiele), daß es (ein) günstige(s) Gen(e) zur Transformation und Integration in das Kürbisgenom enthält, enthalten. Nach einem vorsichtigen Schütteln zur Gewährleistung, daß alle Kanten infiziert wurden, wurden die Pflanzengewebe trocken geblottet und mit der nicht in der Achse liegenden Seite nach unten in einer sterilen Petrischale mit 10 ml Initiationsmedium (MS Basis-Medium, ergänzt mit 1,2 mg/l 2,4,5-T, 0,8 mg/l BAP; 0,1 mg/l Kinetin) gemäß der obigen Beschreibung, gefolgt von einem Wachstum im Dunklen bei 26ºC gezüchtet. Die von reifen Samen stammenden Gewebe wurden unter Verwendung von MS Medium mit 5 mg/l 2,4-D oder 1,2 mg/l 2,4,5-T und 0,8 mg/l BA und 0,1 mg/l Kinetin behandelt. Nach 4 Tagen wurden die Agrobacterium-infizierten Gewebe in Petrischalen mit demselben, mit 500 ug/ml Carbenicillin und 100 bis 200 ug/ml Kanamycin ergänzten Medium überführt und 6 weitere Wochen lang im Dunklen bei 28ºC gezüchtet. In den Fällen, in denen ein Agrobacterium-Überwachstum ein Problem wurde, wurden die Gewebe mit 500 ug/ml Carbenicillin enthaltendem MS Salz vor einer Übertragung in die nachfolgenden Petrischalen gespült.
Eine Regeneration potentiell transformierter Kürbiskallusgewebe erfolgte entsprechend dem jeweiligen oben in den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Vorgehen. Nach einer 9wöchigen Inkubation (2 bis 3 Subkulturen) bildete sich an der Oberfläche der Kürbisgewebe ein charakteristischer gelartiger Kallus. Embryogene Kalli mit vermeintlichen somatischen Embryos wurden abgeschnitten und auf MS Basis-Medium mit 0,05 mg/1 NAA, 0,05 mg/l Kinetin (dieses Medium ist für beide Kürbisgewebequellen identisch), 100 bis 200 mg/l Kanamycinsulfat, 500 mg/l Carbenicillin aufgebracht und unter Verwendung von 2 klx Kaltweiß-Licht bei einer 16stündigen Photoperiode wachsengelassen. Sobald die apikalen Bereiche eine Entwicklung zeigten, wurden die Pflänzchen in halbstarkes MS Basis-Medium enthaltende Magentaboxen überführt. Nachdem die Pflänzchen ein Wurzelsystem entwickelt hatten, wurden sie in ein Eintopfgemisch überführt. Die auf diese Weise regenerierten Pflanzen zeigten keine großen phänotypischen Abnormalitäten. Sie blühten und brachten Samen hervor, die nachfolgende Generationen lieferten.

Beispiel 2

Die Verwendung von Mikroprojektilen zur Transformation

Gemäß der Beschreibung in der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung (MS Medium mit 1,2 mg/l 2,4,5-T, 0,8 mg/l BAP, 0,1 mg/l Kinetin) wurden somatische Kürbisembryos aus Kürbissprossenspitzen erhalten. Darüber hinaus konnten aus reifen Kürbissamen entsprechend der Beschreibung in der vorliegenden Erfindung (MS Medium mit 5 mg/l 2,4-D oder 1,2 mg/l 2,4,5-T und 0,8 mg/l BA und 0,1 mg/l Kinetin) somatische Kürbisembryos erhalten werden. Diese Embryogewebe wurden mit Microprojektilen, die mit ein Plasmid mit Codierung für (ein) nützliche(s) Gen(e) enthaltender DNA beschichtet waren, entsprechend der Beschreibung des Herstellers bombardiert. Nach einer Bombardierung dieser Gewebe wurden sie 2 Tage lang auf diesen Platten wachsen gelassen und anschließend auf Platten mit den jeweiligen frischen Medien überführt. Wenn das verwendete DNA-Konstrukt das pflanzenexprimierbare NPT II-Gen enthielt, wurde den frischen Platten die Auswahldroge Kanamycin in einer Menge von 100 bis 200 mg/ml zugesetzt. Die mit Mikroprojektilen bombardierten Kürbisgewebe wurden mit Hilfe der in der Ausführungsform vorliegenden Erfindung oben beschriebenen Vorgehensweise (in Abhängigkeit von der ursprünglichen Gewebequelle) regeneriert.

Die Übertragung eines nützlichen genetischen Materials

Beispiel 3

Die Übertragung von Virushüllenprotein-Genen

Der Zweck dieses Beispiels ist die Erzeugung eines Konstrukts zur Expression eines Pflanzenvirushüllenprotein-Gens, das bei Expression in einer Pflanze zu verringerten Symptomen oder einer Resistenz gegenüber späteren Infektionen durch den Virus führt. Im allgemeinen können nach der Identifikation eines Hüllenproteingens durch Nucleotidsequenzierung seine Sequenzen unter Verwendung spezifischer Oligomerer und der als Polymerasekettenreak tion (PCR) bezeichneten Technik zur Anheftung spezifischer Restriktionsenzymstellen an einem beliebigen Hüllenproteingen modifiziert werden. Diese Restriktionsenzymstellen können zur Klonierung des Hüllenproteingens in einen Pflanzenexpressionsvektor, der die notwendigen, für eine Steuerung der Expression des Gens nach Übertragung in das Genom verschiedener Pflanzen erforderlichen Genregulatorelemente enthält, verwendet werden. Ein die Verwendung des Pflanzenexpressionsvektors p18UCcpexp beschreibendes Schema zur Klonierung der verschiedensten Hülleproteingene ist in Schema 2 dargestellt. Zur Erleichterung einer Agrobacterium vermittelten Genübertragung wird das pflanzenexprimierbare Hülleprotein in einen binären Vektor kloniert und zur Erleichterung von Mikroprojektil-vermittelten Genübertragungen ein Markergen, beispielsweise das β-Glucuronidasegen (Jefferson et al, 1987) an das Plasmid angeheftet (vgl. Schema 2).
Gegenüber Viruserkrankungen resistente Pflanzen und Verfahren zur Herstellung derselben sind aus der EP-A-223 452, der internationalen Patentanmeldung PCT/US89/03288, veröffentlicht am 8. Mai 1990, mit dem Titel "Cucumber Mosaic Virus Coat Protein Gen" und der internationalen Patentanmeldung PCT/US89/03094, veröffentlicht am 8. Mai 1990, mit dem Titel "Potyvirus Coat Protein Genes and Plants Transformed Therewith" bekannt. Die Verwendung eines viralen Hüllenproteingens zur Erreichung einer Resistenz in transgenen Pflanzen wurde von Powell-Abel et al., (1986) beschrieben. Virale Hülleproteingene werden aus einer beliebigen Zahl von Pflanzenvirusklassen (Tobamo, Cucumo, Poty, Tobra, AMV usw.) isoliert und nach der Anfügung des CaMV-Promotors und der stromab 3' befindlichen Pflanzenpolyadenylierungssignale konstitutiv in Pflanzen exprimiert.
Die Konstruktion von pflanzenexprimierbaren Hülleproteingenen ist in den Beispielen 3 und 4 und den begleitenden Schemata der internationalen Patentanmeldung PCT/US89/03288 und in den Beispielen 8, 11 und 14 und dem begleitenden Schemata der internationalen Patentanmeldung PCT/US89/03094 beschrieben. Auf diese Beispiele und begleitenden Schemata wird hierin Bezug genommen.

Beispiel 11

Übertragung eines Herbizid-Resistenzgens
Dieses Beispiel veranschaulicht, wie pflanzenexprimierbare Gene, die es einer Pflanze ermöglichen, gegenüber spezifischen Klassen von Herbiziden resistent zu sein, erzeugt werden können. Derartige Pflanzen eignen sich aus verschiedenen Gründen: (1) Normalerweise letale Herbizide können verwendet werden und (2) verschiedene Feldfrüchte können in engen Abfolgen auf einem Boden, der Restmengen an einem vormals verwendeten Herbizid, das normalerweise letal für die zweite Feldfrucht ist, enthalten kann, verwendet werden. Zwei interessierende Gene sind Mutantenderivate (abgeleitet von Pflanzen- oder Bakterienquellen) des Acetolactatsynthase (ALS)-Gens, die gegenüber Chlorsulfuron- und Sulfometuronmethylherbiziden nicht empfindlich sind (Falco et al., 1985), sowie Mutanten des Gens mit einer Codierung für Enolpyruvylshikimate-3-phosphatsynthase (EPSPS) (Stalker et al., 1985), die für das Herbizid Glyphosat nicht empfindlich sind.
Ein Gen mit Codierung für ein wichtiges Enzym, das entweder gegenüber einem spezifischen Herbizid resistent ist oder es detoxifiziert, wird stromab eines Pflanzenpromotors, beispielsweise CaMV 355 (Pietrzak et al., 1986), eines eine kleine Untereinheit bildenden Ribulose-1,5-biphosphatcarboxylase-Gens (Mazur und Chui, 1985) oder eines weiteren starken Pflanzengenpromotors und stromauf einer Pflanzengenpoly(A)signalsequenz kloniert (vgl. Schema 3).
Dieses Gen wird anschließend in einen von einem Agrobacterium abgeleiteten Vektor (entweder binär oder cis) kloniert, worauf unter Verwendung der oben beschriebenen Pflanzentransformationsverfahren dieses genetische Material in das Kürbisgenom überführt und integriert werden kann (Schema 3). Dieses Gen kann auch in einen Vektor mit einem pflanzenexprimierbaren Markergen kloniert (Schema 3) und unter Verwendung des microprojektilvermittelten Genübertragungsverfahrens in Kürbispflanzen übertragen werden (vgl. Beispiel 2).

Beispiel 5

Übertragung von Insektenresistenzgenen

In der Natur gibt es zahlreiche Polypeptide, die für Insekten und Nematoden toxisch sind. Die am besten bekannten Proteintoxine sind diejenigen, die mit verschiedenen Bacillus thuringiensis-Stämmen in Verbindung stehen. Beispielsweise ist B. israelenis gegen Diptera (Moskitos und schwarze Blattläuse), B. thuringiensis gegen Lepidoptera und B. san diego gegen Colioptera aktiv. Das in jedem dieser Bakterien gefundene toxische Protein ist gegen Insektenschädlinge hoch spezifisch. Sie sind gegen andere Organismen nicht toxisch. Somit sind die Übertragung und Expression von Genen mit Codierung für derartige toxische Proteine in Pflanzen für eine Verringerung eines Insektenschadens, ohne daß chemische Insektizide verwendet werden günstig. Ferner wird dadurch ein Risiko für andere Organismen vermieden. Diese Gene mit Codierung für zahlreiche dieser toxischen Proteine wurden isoliert und sequenziert (Schmeph et al., 1985; Waalwijk et al., 1985; Sekar et al., 1987). Über die Übertragung des B. thuringiensis Toxingens in die Tabakpflanze und seine Eignung zum Schutz der Pflanze gegen einen Insektenschaden wurde von Vaeck et al. (1987) berichtet. Somit gestattet die Kombination einer Verwendung der hier beschriebenen Regenerations- und Transformationssysteme mit den pflanzenexprimierbaren Bacillustoxingenen (Schema 4) die Übertragung eines geeigneten genetischen Merkmals auf Kürbisse (vgl. Beispiele 1 und 2 hinsichtlich der Genübertragungsverfahren)

Beispiel 6

Übertragung eines antimikrobiellen Gens

Dieses Beispiel soll veranschaulichen, wie pflanzenexprimierbare Gene, die dafür sorgen, daß eine Pflanze gegenüber Infektionen durch Bakterien und Pilze resistent ist, erzeugt werden können. In der Natur wurden die verschiedensten Polypeptidklassen isoliert und dabei festgestellt, daß sie ein breites Spektrum einer antimikrobiellen Aktivität tragen, beispielsweise Magainine (Zasloff, 1987), Defensine (Daher et al., 1988), Lysozyme (Boman et al., 1985), Cercorpine (Boman et al., 1989), Attacine (Haltmark et al., 1983), Thionine (Bohlmann et al., 1988) und dergleichen. Gene mit Codierung für diese antimikrobiellen Peptide oder ihre aktiveren modifizierten Formen können synthetisiert und zur Expression in Pflanzen konstruiert werden. Promotoren zur Expression dieser antimikrobiellen Polypeptidgene können den konstitutiven Typ oder andere Typen, die eine Gewebespezifität aufweisen, umfassen. Die Verwendung von gewebespezifischen Promotoren oder durch Verletzungen induzierbaren Promotoren (Sanchez-Serrano et al., 1987) würden sich zur Herstellung des antimikrobiellen Peptids lediglich bei seinem Bedarf oder in Geweben, die gegenüber einem Angriff durch Bakterien oder Pilze oder beide Schädlinge stärker verwundbar sind, eignen. Somit sorgt die Konstruktion von Genen mit einer Codierung für antimikrobielle Polypeptidgene in Kombination mit den in der Ausführungsform und den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Pflanzentransformations- und Regenerationsschemata für die Übertragung eines geeigneten Merkmals auf Kürbispf lanzen. Schema 5 faßt die Konstruktion von Plasmiden, die bei den Agrobacterium vermittelten und Mikroprojektil vermittelten Genübertragungssystemen verwendet werden können, zusammen.

Schema 1

Entfernen von Samenhüllen, Behandeln mit Clorox und anschließend mit Alkohol
Keimenlassen der Samen während 3 bis 5 Tagen
oder
Gewinnen reifer Kürbissamen und Behandeln mit Clorox
Abschneiden von Sprossenspitzen von keimenden Sämlingen Verwenden des oben beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von somatischen Embryos
oder
Zerschneiden der Samen und Anwenden des oben beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von somatischen Embryos
Eintauchen von Pflanzengeweben in Agrobacterium
oder
Bombardieren von Geweben mit mit DNA beschichteten Microprojektilen
Übertragen auf Kulturplatten und vier Tage langes Züchten
Übertragen auf frisches Medium
9wöchiges Züchten im Dunklen (auf der Seite läßt sich ein Kalluswachstum beobachten)
Herauschschneiden vermeintlicher somatischer Embryos und Einbringen in Regenerationsmedien zur Herstellung von Pflanzen Schema 2 Hülleproteingenvektoren Pflanzenpromotor Bazillus oder anderes toxisches Gen Pflanzenpoly(a) Schema 3 Herbizidgenvektoren Pflanzenpromotor Mutante ALS- oder EPSPS-Gen Pflanzenpoly(A) Schema 4 Insektenresistenzgenvektoren Pflanzenpromotor Bazillus oder anderes toxisches Gen für einen Insektenschädling Pflanzenpoly(A) Schema 5 Antimikrobielle Genvektoren Promotor Antimikrobielles Gen Poly(A)

Claims

1. Verfahren zum Transformieren und Regenerieren von Cucurbita pepo L. (Kürbis)-Pflanzen, die zur Familie Cucurbitaceae gehören, durch

(1) Herausschneiden von Sprossenspitzengewebe aus keimenden Kürbissamen oder Kürbisgewebe aus reifen, nicht-gekeimten Samen,

(2) Herstellen eines transformierten embryogenen Kallus aus dem herausgeschnittenen Gewebe,

(3) Selektives Wachsenlassen des transformierten embryogenen Kallus auf einem Kanamycin enthaltenden Medium und

(4) Unterwerfen des transformierten embryogenen Kallus einem embryogenen Regenerationsvorgehen, aus dem ganze transformierte Kürbispflanzen erhalten werden können.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Stufe 1 ein Herausschneiden von Sprossenspitzengewebe aus keimenden Kürbissamen umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Stufe (2) (a) ein Animpfen des herausgeschnittenen Gewebes mit virulenten oder avirulenten Agrobacterium-Stämmen und (b) ein Züchten des erhaltenen Explantats auf einem aus MS Medium, 2,4,5-T, BA, Kn bestehenden Induktionsmedium umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Stufe 2 (a) ein Züchten des herausgeschnittenen Gewebes auf einem aus MS Medium, 2,4,5-T, BA, Kn bestehenden Induktionsmedium und (b) ein Einführen fremder DNA in das erhaltene Gewebe durch Bombardement mit Mikroprojektilen umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Stufe 1 ein Herausschneiden von Kürbisgewebe aus reifen Samen umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Stufe (2) (a) ein Animpfen des herausgeschnittenen Gewebes mit virulenten oder avirulenten Agrobacterium-Stämmen und (b) ein Züchten des erhaltenen Explantats auf einem auf MS Medium, 2,4-D oder 2,4,5-T, BA, Kn bestehenden Induktionsmedium umfaßt.

7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Stufe (2) (a) ein Züchten des herausgeschnittenen Gewebes auf einem aus MS Medium, 2,4-D oder 2,4,5-T, BA, Kn bestehenden Induktionsmedium und (b) ein Einführen fremder DNA in das erhaltene Gewebe durch Bombardement mit Mikroprojektilen umfaßt.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die transformierten Embryonen durch ihre Expression einer Antibiotikum- oder Herbizidresistenz identifiziert werden.