DE69931377T2

DE69931377T2 - Verfahren zur behandlung von ig-e assozierten krankheiten und zusammensetzungen zur verwendung in diesen verfahren

Info

Publication number: DE69931377T2
Application number: DE69931377T
Authority: DE
Inventors: Dino Oakland Dina
Original assignee: Dynavax Technologies Corp
Current assignee: Dynavax Technologies Corp
Priority date: 1998-09-18
Filing date: 1999-09-17
Publication date: 2007-05-10
Anticipated expiration: 2019-09-18
Also published as: US20060013811A1; ES2259478T3; AU766492B2; ATE326239T1; CA2343052A1; WO2000016804A1; DE69931377D1; EP1113818A1; US20030064064A1; JP2003524602A; AU6153799A; EP1113818B1

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Behandlung IgE-assoziierter Störungen und Zusammensetzungen zur Verwendung bei diesen Verfahren bereit. Die Verfahren sind in der Behandlung von Allergien und Allergie-bezogenen Störungen besonders zweckdienlich.
Fachlicher Hintergrund
Allergische Reaktionen, einschließlich derjenigen des allergischen Asthmas und der allergischen Rhinitis, sind durch eine frühe Reaktionsphase, die in Sekunden bis Minuten nach der Allergenexposition erfolgt und durch eine zelluläre Degranulation gekennzeichnet ist, und eine späte Reaktionsphase gekennzeichnet, die 4 bis 24 Stunden später erfolgt und durch eine Infiltration Eosinophiler in die Antigenexpositionsstelle gekennzeichnet ist. Spezifischer stimuliert während der frühen Phase der allergischen Reaktion die Aktivierung der Lymphozyten vom Typ Th2 die Produktion Antigen-spezifischer IgE-Antikörper, die wiederum die Freisetzung von Histamin und anderen Entzündungsmediatoren aus Mastzellen und Basophilen auslösen. Während der späten Reaktionsphase ist die IL-4- und IL-5-Produktion von CD4⁺-Th2-Zellen erhöht. Diese Zytokine scheinen eine wichtige Rolle bei der Rekrutierung Eosinophiler in die Allergenexpositionsstelle zu spielen, woraus eine Gewebeschädigung und Dysfunktion resultiert.
Zurzeit umfasst eine Antigen-Immuntherapie für allergische Störungen die subkutane Injektion kleiner, aber stufenweise zunehmender Mengen an Antigen in einem als Desensibilisierungstherapie bezeichneten Prozess. Eine derartige Immuntherapie besteht im Allgemeinen aus vielen Injektionen über Monate hinweg und einer anschließenden „Aufrechterhaltungstherapie" mit im Allgemeinen monatlichen Injektionen im Verlauf von bis zu 5 Jahren, ohne Laborindikatoren, die Hinweise für eine Beendigung der Therapie geben könnten. Eine Antigen-Immuntherapie ist lediglich palliativ und zurzeit nicht heilend. Weber (1997) JAMA 278:1881-1887; Stevens (1998) Acta Clinica Belgica 53:66-72; und Canadian Society of Allergy and Clinical Immunology (1995) Can. Med. Assoc. J. 152:1413-1419. Viele Patienten, die die Therapie beginnen, vollenden nicht das Dosierungsschema, wobei, falls Injektionen über eine Woche ausgelassen werden, der Patient das ganze Behandlungsschema erneut beginnen muss. Eine Reihe an Antigenen sind identifiziert und mit rekombinanten Mitteln produziert worden. Für eine Übersicht siehe Baldo et al. Allergy (1989), 44:81-97; Baldo Curr. Opin. Immunol. (1991), 3:841-50; Blaser Ther. Umsch. (1994), 51:19-23; Bousquet Arb. Paul Ehrlich Inst. Bundesamt Sera Impfstoffe Frankf A M 1994:257-62; Bousquet et al. Adv. Exp. Med. Biol. (1996), 409:463-9; Breiteneder et al. Arb Paul Ehrlich Inst. Bundesamt Sera Impfstoffe Frankf A M, 1997:80-6; Crameri et al. Pneumologie (1996), 50 (6):387-93; Donovan et al. Monogr. Allergy (1990) 28:52-83; Kraft, Adv. Exp. Med. Biol. (1996), 409:471-4; Nakagawa et al. Int. Arch. Allergy Immunol. (1993), 102:117-20; Schou, Adv. Exp. Med. Biol. (1996), 409:13 7-40; Thomas, Adv. Exp. Med. Biol. (1996), 409:85-93; Valenta et al. Exp. Med. Biol. (1996), 409:185-96; Valenta et al. Arb. Paul Ehrlich Inst. Bundesamt Sera Impfstoffe Frankf A M, 1997:222-9.
Immuntherapeutische Behandlungen mit Antigen weisen das Risiko der Induktion einer potenziell letalen IgE-vermittelten Anaphylaxie auf und wirken sich nicht auf die Zytokin-vermittelten Ereignisse der allergischen Reaktion aus. Tatsächlich hat ein behandelnder Arzt diese Therapie als „potenzielles Missgeschick" bezeichnet. Weber (1997). Ein weiteres signifikantes Problem der Antigen-Immuntherapie ist, dass aufgrund des Risikos von Gegenreaktionen, insbesondere der Anaphylaxie, die Dosierung des Antigens sowohl bezüglich der pro Verabreichung gegebenen Menge wie auch der über einen Zeitraum gegebenen Menge zu verringern ist. Folglich zieht sich die herkömmliche Allergie-Immuntherapie in die Länge und ist zeitaufwändig, unbequem und teuer.
Ein alternativer Versuchsansatz für die Behandlung IgE-assoziierter Störungen, wie Allergien, umfasst die Verabreichung von Verbindungen, welche eine Histamin-Freisetzung hemmen. Viele derartige Medikamente sind als rezeptfreie Arzneimittel im Handel erhältlich. Andere Medikamente umfassen einen anti-IgE-bindenden Antikörper. Allerdings ist ein Nachteil dieses Versuchsansatzes, dass er nur die Symptome behebt, während er in keiner Weise für eine dauerhafte Heilung oder einen dauerhaften Schutz sorgt.
Es besteht ein Bedarf an verbesserten Verfahren zur Behandlung IgE-assoziierter Krankheiten wie Allergien.
OFFENLEGUNG DER ERFINDUNG
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine erste Zusammensetzung, welche die Aktivität von IgE ausreichend hemmt, um die Aktivität von IgE in einem Individuum zu vermindern, wobei die erste Zusammensetzung einen anti-IgE-Antikörper umfasst, und eine zweite Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend eine ausreichende Menge eines Antigens, um die Immunantwort auf das Antigen zu modulieren, wobei das Antigen an ein Polynukleotid geknüpft ist, das ein immunstimulatorisches Oligonukleotid umfasst, zur Verwendung in Kombination in der Behandlung einer allergischen Reaktion auf das Antigen oder einer Allergie-bezogenen Störung während einer Antigen-spezifischen Immuntherapie des Individuums.
Folglich beschreiben wir Verfahren zur Behandlung einer allergischen Reaktion auf ein Antigen oder einer Allergie-bezogenen Störung während einer Antigenspezifischen Immuntherapie eines Individuums mittels Verabreichen an das Individuum einer Menge einer ersten Zusammensetzung, welche die Aktivität von IgE ausreichend hemmt, um die Aktivität von IgE in dem Individuum zu vermindern, und Verabreichen an das Individuum einer ausreichenden Menge des Antigens (oder einer zweiten Zusammensetzung, die das Antigen umfasst), um die Reaktion oder Störung zu lindern, wobei das Antigen an ein Polynukleotid geknüpft ist, das ein immunstimulatorisches Oligonukleotid umfasst.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine erste Zusammensetzung, welche die Aktivität von IgE ausreichend hemmt, um die IgE-assoziierte Störung zu lindern, wobei die erste Zusammensetzung einen anti-IgE-Antikörper umfasst, und eine zweite Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend ein ausreichend immunstimulatorisches Oligonukleotid, um die Aktivität der ersten Zusammensetzung zu erhöhen, zur Verwendung in Kombination in der Behandlung eines Individuums mit der IgE-assoziierten Störung.
Folglich beschreiben wir Verfahren zur Behandlung eines Individuums mit einer IgE-assoziierten Störung mittels Verabreichen an das Individuum einer Menge einer ersten Zusammensetzung, welche die Aktivität von IgE ausreichend hemmt, um die Störung zu lindern, und Verabreichen an das Individuum einer ausreichenden Menge einer zweiten Zusammensetzung, die das immunstimulatorische Oligonukleotid umfasst, um die Aktivität der ersten Zusammensetzung zu erhöhen. Bei der praktischen Umsetzung der Erfindung können die erste und zweite Zusammensetzung in einer beliebigen Reihenfolge oder gleichzeitig an das Individuum verabreicht werden. Außerdem können, wie es vom Fachmann ohne weiteres einzusehen ist, die aktiven Bestandteile (d.h. IgE und/oder Anaphylaxie-Hemmer, ISS und/oder Antigen), die hier in jeder Anwendungsform beschrieben sind, in einer einzigen Zusammensetzung für eine gleichzeitige Verabreichung von einem oder mehreren aktiven Bestandteilen kombiniert sein.
In Übereinstimmung mit einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine erste Zusammensetzung, umfassend ein Agens, das eine Anaphylaxie hemmt, in einer ausreichenden Menge, um eine Anaphylaxie zu hemmen, wobei die erste Zusammensetzung einen IgE-Antikörper umfasst, und eine zweite Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend ein Polynukleotid, das ein immunstimulatorisches Oligonukleotid in einer ausreichenden Menge umfasst, um die Aktivität der ersten Zusammensetzung zu erhöhen, zur Verwendung in Kombination in der Behandlung einer IgE-assoziierten Störung in einem Individuum.
Wir beschreiben ebenfalls Verfahren zur Behandlung einer allergischen Reaktion oder Allergie-bezogenen Störung gegen ein Allergen während einer Antigenspezifischen Immuntherapie durch Verabreichen an das Individuum einer Menge einer ersten Zusammensetzung, welche die Aktivität von IgE ausreichend hemmt, um die Störung abzumildern; Verabreichen an das Individuum einer Menge einer zweiten Zusammensetzung, umfassend ein ausreichend immunstimulatorisches Antigen, um die Aktivität der ersten Zusammensetzung zu erhöhen und; Verabreichen an das Individuum einer dritten Zusammensetzung, umfassend eine ausreichende Menge Antigen, um eine Desensibilisierung gegen das Allergen herbeizuführen. Vorzugsweise wird die dritte Zusammensetzung nach der ersten Zusammensetzung verabreicht, so dass ein anaphylaktischer Schock vermieden wird. Andererseits kann die zweite und dritte Zusammensetzung in beliebiger Reihenfolge oder gleichzeitig verabreicht werden. Die hier beschriebenen ISS-Antigen-Konjugate sind besonders für eine gleichzeitige Verabreichung dieser Zusammensetzungen zweckdienlich.
Die hierin bereitgestellten Verfahren sind für eine Behandlung einer beliebigen IgE-assoziierten Störung geeignet, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Allergien, Allergie-bezogene Störungen und Parasiteninfektionen. Eine nicht-erschöpfende Liste von Substanzen, gegen die Individuen allergisch sein können, ist in Tabelle 1 angeführt. Eine Reihe Allergie-bezogener Störungen ist bekannt, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Asthma, Urtikaria und weitere hierin beschriebene. Parasiteninfektionen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, mit Helminthen assoziierte Infektionen.
Wie hierin beschrieben, ist die Zusammensetzung, welche die IgE-Aktivität hemmt, ein IgE-Antikörper.
Die Erfindung stellt außerdem Zusammensetzungen bereit, die wenigstens ein Antigen für eine Verwendung in einer Immuntherapie gemäß den hierin beschriebenen Verfahren enthalten. Entscheidend ist, dass diese Zusammensetzungen für eine Verabreichung an ein Individuum in einer höheren Konzentration geeignet sind, als es für eine Verwendung in einer Allergie-Desensibilisierungstherapie verträglich ist. Die Zusammensetzung kann folglich in einer konzentrierteren Form zugeführt werden, verglichen mit Zusammensetzungen, die in einer Desensibilisierungstherapie üblicherweise genutzt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Zusammensetzungen bereit, die sowohl eine Zusammensetzung, welche die Aktivität von IgE hemmt und einen anti-IgE- Antikörper umfasst, als auch ein immunstimulatorisches Oligonukleotid enthalten, für die Verwendung in den hierin beschriebenen Verfahren.
AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Diese Erfindung stellt eine Kombination aus (a) einem Agens (oder mehreren Agentien) in einer oder mehreren Zusammensetzungen, das die IgE-Aktivität in einem Individuum hemmt und vorzugsweise ausreichend ist, um Gegenreaktionen, einschließlich Anaphylaxie (nach einer Verabreichung und/oder Antigenexposition) zu vermindern oder zu blockieren, und (b) einer Immuntherapie bereit, die ein immunstimulatorisches Polynukleotid oder Antigen und immunstimulatorische Polynukleotid-Sequenzen (ISS) im Kontext mit IgE-assoziierten Störungen, wie allergischen Zuständen, verwendet. Eine derartige Kombination erlaubt signifikante Vorteile gegenüber heutigen, herkömmlichen Therapien. Mit der Kombinationstherapie der Erfindung ist eine aggressivere und deshalb wirksamere Immuntherapie möglich (aufgrund höherer Antigenmengen, die verabreicht werden können) mit einem signifikant verminderten Risiko unerwünschter Nebenwirkungen, wie die Anaphylaxie. Außerdem kann die Behandlung rascher, zeitsparender und weniger lästig verlaufen. Dies sind wesentliche Gründe, da insbesondere bei der herkömmlichen Allergie-Immuntherapie, bei der ein Patient viele Male über einen langen Zeitraum eine Klinik aufsuchen muss, häufig nur zweifelhafte Ergebnisse erzielt werden. Die verkürzte Therapiedauer ist ebenfalls von Vorteil, weil der Behandlungserfolg einfacher und genauer bestimmt werden kann.
Im Gegensatz zu einer konventionellen Desensibilisierungstherapie, die eine relativ niedrige Dosierung beibehält, die langsam mit der Zeit ansteigt, erlaubt die vorliegende Erfindung die Verabreichung von Antigen in signifikant höheren Dosen (d.h. man kann eine Menge an Antigen verabreichen, die normalerweise ein hohes Anaphylaxie-Risiko bilden würde (ohne die Verabreichung eines IgE-Hemmers).
Allgemeine Techniken
Bei der praktischen Umsetzung der Erfindung werden herkömmliche Techniken der Molekularbiologie (einschließlich rekombinanter Techniken), Mikrobiologie, Zellbiolo gie, Biochemie und Immunologie angewandt, sofern nicht anders angegeben, die im Rahmen der Fachkenntnisse liegen. Derartige Techniken sind in der Literatur umfassend erklärt, wie etwa in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Ausgabe (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Multis et al., 1994); und Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan eds., 1991); The Immunoassay Handbook (David Wild, ed., Stockton Press NY, 1994); und Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W.H. Albert und N.A. Staines, eds., Weinheim: VCH Verlagsgesellschaft mbH, 1993).
Definitionen
Wie hierin verwendet, ist „Behandlung" ein Versuchsansatz, um vorteilhafte oder erwünschte klinische Resultate zu erhalten. Im Sinne der Erfindung umfassen vorteilhafte oder erwünschte klinische Resultate, ohne darauf beschränkt zu sein, die Linderung eines oder mehrerer Symptome, die Verminderung des Umfangs einer Störung oder Erkrankung, eine Stabilisierung (d.h. keine Verschlechterung) des Stadiums einer Störung oder Erkrankung, eine Verzögerung oder Verlangsamung des Voranschreitens einer Störung oder Erkrankung, die Verbesserung oder Linderung des Störungs- oder Krankheitsstadiums und die Remission (ob partiell oder total), ob detektierbar oder nicht detektierbar. „Behandlung" kann ebenfalls die Verlängerung des Überlebens im Vergleich zu dem erwarteten Überleben, falls keine Behandlung erfolgt, bedeuten.
„Linderung" einer Erkrankung oder Störung bedeutet, dass das Ausmaß und/oder die unerwünschten klinischen Manifestationen eines Stadiums einer Störung oder Erkrankung verringert und/oder der zeitliche Verlauf der Progression verlangsamt oder verzögert wird im Vergleich zu einer Nichtbehandlung der Störung. Insbesondere im Zusammenhang mit einer Allergie, wie es vom Fachmann einzusehen ist, kann eine Linderung nach einer Modulation der Immunantwort auf ein Allergen oder Allergene erfolgen. Außerdem erfolgt eine Linderung nicht notwendigerweise nach Verabrei chung einer Dosis, sondern erfolgt oftmals nach der Verabreichung einer Reihe von Dosen. Folglich kann eine ausreichende Menge mit einer oder mehreren Verabreichungen verabreicht werden, um eine Reaktion oder Störung zu lindern.
Ein „Individuum" ist ein Vertebrat, bevorzugt ein Säuger, bevorzugter ein Mensch. Säuger umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, landwirtschaftliche Nutztiere, im Sport eingesetzte Tiere, Nager und Haustiere.
Eine „IgE-assoziierte Störung" ist ein physiologischer Zustand, der teilweise durch dauerhaft oder nicht-dauerhaft erhöhte IgE-Levels gekennzeichnet ist. IgE-assoziierte Störungen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Allergien und allergische Reaktionen, Allergie-bezogene Störungen (unten beschrieben), Asthma, Rhinitis, Konjunktivitis, Urtikaria, Schock, Hymenopterenstichallergien und Medikamentenallergien, und Parasiteninfektionen. Der Ausdruck umfasst verwandte Manifestationen dieser Störungen. Generell ist das IgE bei derartigen Störungen Antigenspezifisch.
Eine „allergische Reaktion gegen ein Antigen" bedeutet eine Immunreaktion, die im Allgemeinen durch die Bildung von Antigen-spezifischem IgE und die daraus resultierenden Wirkungen der IgE-Antikörper gekennzeichnet ist. Es ist in der Wissenschaft bekannt, dass IgE an IgE-Rezeptoren auf Mastzellen und Basophilen bindet. Nach einer späteren Exposition an das von IgE erkannte Antigen, vernetzt das Antigen das IgE auf den Mastzellen und Basophilen, was eine Degranulation dieser Zellen verursacht. Es ist einzusehen und beabsichtigt, dass die Ausdrücke „allergische Reaktion gegen ein Antigen", „Allergie" und „allergischer Zustand" für eine Anwendung der Verfahren der Erfindung gleichermaßen geeignet sind. Außerdem ist es einzusehen und beabsichtigt, dass die Verfahren der Erfindung für eine Prävention einer allergischen Reaktion wie auch die Behandlung eines bereits vorhandenen allergischen Zustands gleichermaßen geeignet sind.
Eine „Allergie-bezogene Störung" bedeutet eine Störung, die aus den Wirkungen einer Antigen-spezifischen IgE-Immunantwort resultiert. Derartige Wirkungen können umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Hypotonie und Schock. Die Anaphylaxie ist ein Beispiel für eine Allergie-bezogene Störung, während welcher in den Blutkreislauf freigesetztes Histamin eine Vasodilatation wie auch eine erhöhte Permeabilität der Kapillaren mit einem daraus resultierenden deutlichen Plasmaverlust aus dem Blutkreislauf verursacht. Eine Anaphylaxie kann systemisch auftreten, wobei die verbundenen Wirkungen den gesamten Körper betreffen, oder sie kann lokal auftreten, wobei die Reaktion auf ein spezifisches Zielgewebe oder Organ beschränkt bleibt.
Eine „Parasiteninfektion" bedeutet eine Infektion mit metazoischen Parasiten, einschließlich Helminthen, zum Beispiel Schistosoma mansoni. Im Sinne der Erfindung ist eine parasitische Infektion von erhöhten IgE-Levels begleitet (und ist folglich eine IgE-assoziierte Störung).
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck „Antigen" eine Substanz, die von einem Antikörper oder von einem T-Zell-Antigenrezeptor erkannt und spezifisch gebunden wird. Antigene können Peptide, Proteine, Glycoproteine, Polysaccharide, Ganglioside und Lipide, Teile davon und Kombinationen davon umfassen. Die Antigene können in der Natur vorkommende oder können synthetische Antigene sein. Haptene liegen innerhalb des Definitionsbereichs von „Antigen". Ein Hapten ist eine niedermolekulare Verbindung, die nicht selbst immunogen ist, aber immunogen wird, wenn sie mit einem immunogenen Molekül konjugiert ist, das antigene Determinanten enthält.
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck „Allergen" ein Antigen oder einen antigenen Teil eines Moleküls, normalerweise eines Proteins, das eine allergische Reaktion nach Exposition in einem Individuum hervorruft. Üblicherweise ist das Individuum gegen das Allergen allergisch, wie es zum Beispiel mit dem Quaddel- und Hautrötungstest oder einem beliebigen in der Wissenschaft bekannten Verfahren angezeigt wird. Ein Molekül wird als ein Allergen bezeichnet, wenn nur ein kleiner Teil von Individuen eine Immunreaktion nach einer Molekülexposition zeigt. Zahlreiche isolierte Antigene sind in der Wissenschaft bekannt. Diese umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, die in der Tabelle 1 (unten) angeführten Allergene.
Der Ausdruck „Desensibilisierung" bezeichnet das Verfahren der Verabreichung zunehmender Dosen eines Allergens, auf welches das Individuum eine Sensibilität ge zeigt hat. Beispiele für Allergendosierungen, die für Desensibilisierungen eingesetzt wurden, sind in der Wissenschaft bekannt. Siehe zum Beispiel Fornadley (1988) Otolaryngol. Clin. North Am. 31:111-127.
Eine „wirksame Menge" einer Substanz ist diejenige ausreichende Menge, mit der vorteilhafte oder erwünschte klinische Resultate bewirkt werden, wobei eine „wirksame Menge" als solche von dem Zusammenhang abhängt, in dem sie appliziert wird. Im Zusammenhang mit der Behandlung oder Therapie ist eine „wirksame Menge" eine ausreichende Menge, um eine Verbesserung oder Linderung der zu behandelnden Störung mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung zu erreichen. Im Zusammenhang mit einer Verabreichung einer Substanz, welche die IgE-Aktivität hemmt (d.h. eine Zusammensetzung, die ein IgE hemmendes Agens umfasst), ist eine wirksame Menge eine ausreichend Menge, um eine derartige Hemmung zu erreichen (wobei die Hemmung nicht vollständig oder absolut sein muss). Am bevorzugtesten ist insbesondere im Zusammenhang mit einer Allergie eine wirksame Menge eine Menge, die für eine Verminderung und/oder Suppression einer Anaphylaxie (oder anderer unerwünschter Nebenwirkungen) nach einer Verabreichung und/oder Antigenexposition ausreichend ist. Eine wirksame Menge kann mit einer oder mehreren Verabreichungen verabreicht sein, und es versteht sich von selbst, dass besonders im Rahmen einer Desensibilisierungstherapie einer Allergie eine wirksame Menge über eine Reihe von Verabreichungen, üblicherweise mit zunehmenden Dosierungen, erreicht wird.
Der hierin verwendete Ausdruck „ISS" bezeichnet Oligonukleotidsequenzen, die eine messbare Immunreaktion bewirken, wie sie in vitro, in vivo und/oder ex vivo gemessen sein kann. Wie es in der Wissenschaft verstanden ist, umfasst der Ausdruck „Oligonukleotid" variierende Sequenzlängen, und wie es hierin beschrieben und dem Fachmann ohne weiteres offensichtlich ist, umfasst der Ausdruck „ISS" Polynukleotide, die eine ISS enthalten (oder alternativ aus einer ISS bestehen). Beispiele für messbare Immunreaktionen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Produktion Antigen-spezifischer Antikörper, Sekretion von Zytokinen, Aktivierung oder Expansion von Lymphozyten-Populationen, wie NK-Zellen, CD4⁺-T-Lymphozyten, CD8⁺-T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und ähnlichen. Bevorzugt aktivieren die ISS- Sequenzen vorzugsweise eine Reaktion vom Typ Th1. Eine nähere Beschreibung der ISS, die für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, ist weiter unten erörtert.
Ein „ISS-Antigen-Konjugat" bezeichnet ein ISS-Oligonukleotid oder Polynukleotid, das eine ISS umfasst, die über kovalente und/oder nicht-kovalente Wechselwirkungen an ein Antigen gebunden ist.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck „Agens" eine biologische oder chemische Verbindung, wie ein einfaches oder komplexes organisches oder anorganisches Molekül, ein Peptid, ein Protein oder ein Oligonukleotid. Ein weites Spektrum an Verbindungen kann synthetisiert sein, zum Beispiel Proteine, Peptide und Polynukleotide und synthetische organische Verbindungen, die auf verschiedenen Kernstrukturen basieren, wobei diese Verbindungen ebenfalls von dem Ausdruck „Agens" umfasst sind. Zusätzlich können Verbindungen aus verschiedenen natürlichen Quellen stammen, wie pflanzlichen oder tierischen Extrakten und ähnlichen. Agentien können allein oder in verschiedenen Kombinationen verabreicht sein.
Eine Zusammensetzung oder ein Agens, welches) die „IgE-Aktivität hemmt", ist eine Zusammensetzung, die ein Agens oder Agentien enthält, das die IgE-Aktivität vermindert, wenn es unter ansonsten gleichen Bedingungen, mit Ausnahme des Fehlens der Zusammensetzung, verglichen wird. Wie in der Wissenschaft bekannt, wird die IgE-Aktivität im Allgemeinen durch die zirkulierenden IgE-Levels angezeigt und gemessen, kann aber ebenfalls mit Hilfe von Aktivitäten, die mit der IgE-Funktion assoziiert sind, wie Binden an Basophile, Anaphylaxie und Binden an Rezeptoren, wie Fc-Rezeptoren (einschließlich Fc-Hochaffinitätsrezeptoren und CD23-low-affinity-Rezeptor), angezeigt und gemessen werden. Irgendein Quantum einer Verminderung ist ausreichend. Bevorzugt ist der IgE-Level wenigstens um etwa 10% vermindert, bevorzugt wenigstens um etwa 20%, bevorzugt wenigstens um etwa 40%, bevorzugter wenigstens um etwa 50%, bevorzugter wenigstens um etwa 60%, bevorzugter wenigstens um etwa 75%, bevorzugter wenigstens um etwa 80%, bevorzugter wenigstens um etwa 90%, bevorzugter wenigstens um etwa 95%, falls er auf zirkulierendes IgE bezogen ist. Ein anderes Maß für die Verminderung der IgE-Aktivität, das besonders für die vorliegende Erfindung geeignet ist, ist die Hemmung der Anaphylaxie (oder Verminderung bis Beseitigung eines Anaphylaxie-Risikos). Agentien, welche die IgE-Aktivität hemmen, sind hierin beschrieben und umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, anti-IgE-Antikörper, IgE-Rezeptoren, anti-IgE-Rezeptorantikörper, Liganden für IgE-Rezeptoren.
Ein Agens (oder eine Zusammensetzung), das die Anaphylaxie „hemmt", ist ein Agens, welches das Ausmaß der Anaphylaxie verringert, das unter ansonsten gleichen Bedingungen, mit Ausnahme des Fehlens des Agens, vorgelegen hätte. Dementsprechend ist ein Agens oder eine Zusammensetzung, welches) die Anaphylaxie hemmt, eine) solche/s), die/das das Anaphylaxierisiko vermindert (oder sogar ausschließt). Die üblichste Hemmung der Anaphylaxie umfasst eine Verminderung der IgE-Aktivität (einschließlich Verminderung zirkulierender IgE-Levels durch, zum Beispiel, Binden an IgE); Binden an IgE auf IgE-sezernierenden B-Zellen; Antagonisten; Beeinträchtigung von Ereignissen vor der IgE-Produktion, Blockieren der Fähigkeit von IgE, an Rezeptoren auf Mastzellen zu binden (zum Beispiel Binden an den Rezeptor auf der Mastzelle, ohne eine Histamin-Freisetzung auszulösen). Im Sinne der Erfindung ist jedes beliebige Agens geeignet, das vor der Histamin-Freisetzung wirkt. Ein Agens, das als Hemmer der IgE-Produktion und/oder der Aktivität wirkt, ist bevorzugt, solange der/die Hemmer nicht eine systemische Anaphylaxie induziert. Folglich führen vorzugsweise die in dieser Erfindung verwendeten Hemmer der IgE-Aktivität zu keiner Histamin-Freisetzung von Basophilen oder Mastzellen.
Verfahren der Erfindung
Die Erfindung stellt Verfahren zur Behandlung von Allergien wie auch anderen IgE-assoziierten Störungen bereit. Dementsprechend stellt die Erfindung in einer Anwendungsform Verfahren zur Behandlung einer allergischen Reaktion gegen ein Antigen oder einer Allergie-bezogenen Störung während einer Antigen-spezifischen Immuntherapie (d.h. Verfahren für eine Antigen-spezifische Immuntherapie oder Desensibilisierungstherapie) eines Individuums bereit, umfassend (a) Verabreichen einer ersten Zusammensetzung, welche die IgE-Aktivität hemmt (vorzugsweise die Anaphylaxie hemmt oder supprimiert); und (b) Verabreichen einer zweiten Zusammensetzung, umfassend eine ausreichende Menge eines Antigens, um die Immunantwort gegen ein Antigen zu modulieren, wobei das Antigen an ein Polynukleotid geknüpft ist, das ein immunstimulatorisches Oligonukleotid umfasst. Diese Modulation der Immunantwort soll die Reaktion oder Störung lindern. Wie hierin beschrieben, ist einzusehen, dass in diesen Anwendungsformen die Menge an verabreichtem Antigen höher ist als diejenige Menge, die ohne einen IgE-Hemmer verabreicht würde (d.h. die Menge an verabreichtem Antigen ist höher als diejenige, die normalerweise in einer herkömmlichen Desensibilisierungstherapie eingesetzt ist). In einer bevorzugten Anwendungsform umfasst die erste Zusammensetzung einen anti-IgE-Antikörper, vorzugsweise einen humanisierten anti-IgE-Antikörper, wie unten beschrieben. Außer mit einem anti-IgE-Antikörper ist das Antigen der zweiten Zusammensetzung mit einem Polynukleotid verknüpt, das ein immunstimulatorisches Oligonukleotid (d.h. eine ISS) umfasst. Dies kann eine kovalente oder nicht-kovalente Verknüpfung sein oder über andere Mechanismen erfolgen, wie Verkapselung oder Verknüpfung mit einem Plattform-Molekül. In anderen Anwendungsformen umfasst die erste Zusammensetzung einen anti-IgE-Antikörper, und die zweite Zusammensetzung umfasst ein Antigen, das an ein Polynukleotid bevorzugt durch Konjugation geknüpft ist, das eine ISS umfasst oder aus dieser besteht.
In einer anderen Anwendungsform werden Verfahren zur Behandlung einer IgE-assoziierten Störung in einem Individuum bereitgestellt, umfassend das Verabreichen an das Individuum einer Menge einer ersten Zusammensetzung, welche die Aktivität von IgE ausreichend hemmt, um die Störung zu lindern; und Verabreichen an das Individuum einer ausreichenden Menge einer zweiten Zusammensetzung, umfassend ein immunstimulatorisches Oligonukleotid, um die Aktivität der ersten Zusammensetzung zu erhöhen. In anderen Anwendungsformen werden auch ein Antigen oder Antigene verabreicht. Im Allgemeinen wird die erste Zusammensetzung in einer ausreichenden Menge verabreicht, um die Aktivität von IgE zu vermindern. Diese Anwendungsformen sind besonders zweckdienlich, da eine Verabreichung einer ISS hilft, den IgE-Level zu verringern und die Verringerung des IgE-Levels aufrecht zu halten, während eine Th1-Antwort verstärkt wird. Die IgE-assoziierte Störung, wie sie unten diskutiert ist, umfasst, ohne darauf beschränkt zu sein, Allergien (jeden beliebigen Allergietyp); Allergie-verwandte Störungen und Asthma.
Bei den Verfahren der Erfindung wird eine Zusammensetzung verabreicht, welche die Aktivität von IgE hemmt (d.h. die Zusammensetzung enthält ein Agens oder Agentien, welche die IgE-Aktivität hemmen). Vorzugsweise ist diese Hemmung ausreichend, um eine Anaphylaxie nach einer Verabreichung und/oder Antigenexposition zu vermeiden oder das Ausmaß der Anaphylaxie zu supprimieren.
In einer anderen Anwendungsform stellt die Erfindung Verfahren zur Behandlung einer IgE-assoziierten Störung in einem Individuum bereit, umfassend Verabreichen an das Individuum einer ersten Zusammensetzung, umfassend ein Agens, das eine Anaphylaxie hemmt oder das Risiko einer Anaphylaxie vermindert, vorzugsweise ein Agens, welches die IgE-Aktivität hemmt, wobei eine wirksame Menge der ersten Zusammensetzung eine wirksame Menge ist, um eine Anaphylaxie zu hemmen (oder das Risiko einer Anaphylaxie zu verringern), und einer zweiten Zusammensetzung, umfassend eine ISS (oder ein Polynukleotid, das ein immunstimulatorisches Oligonukleotid umfasst), wobei eine wirksame Menge eine ausreichende Menge ist, um die Aktivität der ersten Zusammensetzung zu verstärken oder zu erhöhen. Vorzugsweise wird auch ein Antigen an das Individuum verabreicht (entweder in der zweiten Zusammensetzung oder in einer dritten Zusammensetzung).
In einer bevorzugten Anwendungsform ist das Agens oder sind die Agentien in der ersten Zusammensetzung ein anti-IgE-Antikörper, vorzugsweise ein humanisierter Antikörper, wie unten beschrieben. In einigen Anwendungsformen wird außer dem IgE-Antikörper ein Antigen, das an ein Polynukleotid geknüpft ist, umfassend ein immunstimulatorisches Oligonukleotid (d.h. ISS), verabreicht. Dies kann eine kovalente oder nicht-kovalente Verknüpfung sein oder über andere Mechanismen erfolgen, wie Verkapselung oder Verknüpfung mit einem Plattform-Molekül. In anderen Anwendungsformen umfasst die erste Zusammensetzung einen anti-IgE-Antikörper, und die zweite Zusammensetzung umfasst ein Antigen, das an ISS (oder an ein Polynukleotid, umfassend eine ISS) vorzugsweise durch Konjugation geknüpft ist.
Zusammensetzungen zur Hemmung der IgE-Aktivität
Bei den Verfahren der Erfindung wird eine erste Zusammensetzung verabreicht, welche die IgE-Aktivität hemmt (d.h. ein Agens enthält, das die IgE-Aktivität hemmt) und am bevorzugtesten die Anaphylaxie hemmt (oder das Anaphylaxierisiko senkt oder ausschließt), insbesondere die systemische Anaphylaxie hemmt. Bevorzugt wird, wie unten diskutiert, ein anti-IgE-Antikörper, bevorzugter ein humanisierter Antikörper, verwendet.
Hemmer der IgE-Aktivität sind in der Wissenschaft bekannt und umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, anti-IgE-Antikörper, IgE-bindende Fragmente (einschließlich Antikörper-Fragmente), Rezeptoren oder Fragmente davon. Zum Beispiel wirken einige Hemmer der IgE-Aktivität der Erfindung durch die Blockierung der Bindung von IgE an seine Rezeptoren auf B-Zellen, Mastzellen oder Basophilen, entweder durch Blockieren der Rezeptorbindestelle auf dem IgE-Molekül oder durch Blockieren der IgE-Bindestelle auf dem Rezeptor. Durch das Binden an IgE auf der Oberfläche von B-Zellen kann ein anti-IgE-Antikörper zu einer klonalen Eliminierung der IgE-produzierenden B-Zellen führen und auf diese Weise zu einer Verringerung der IgE-Produktion führen. Ebenfalls können Hemmer der IgE-Aktivität durch Binden von löslichem IgE wirken und dadurch dieses aus dem Kreislauf entfernen.
Hemmer der IgE-Aktivität sind in der Wissenschaft bekannt und umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, anti-IgE-Antikörper, Antigen-bindende Fragmente, Rezeptoren oder Fragmente davon. U.S. Patent 5.614.611 legt humanisierte monoklonale anti-IgE-Antikörper offen, die für IgE-tragende B-Zellen spezifisch sind. Durch ein spezifisches Binden an B-Zellen und nicht an Basophile oder Mastzellen induzieren diese anti-IgE-Antikörper keine Histamin-Freisetzung von Basophilen oder Mastzellen.
U.S. Patent 5.449.760 beschreibt anti-IgE-Antikörper, die lösliches IgE, jedoch nicht IgE, auf der Oberfläche von B-Zellen oder Basophilen binden. Antikörper wie diese binden an lösliches IgE und hemmen die IgE-Aktivität, zum Beispiel durch Blockieren der IgE-Rezeptorbindestelle, durch Blockieren der Antigenbindestelle und/oder durch einfaches Entfernen von IgE aus dem Kreislauf. Zusätzliche anti-IgE-Antikörper und IgE-bindende Fragmente, die von den anti-IgE-Antikörpern stammen, sind in U.S. Patent 5.656.273 beschrieben. U.S. Patent 5.543.144 beschreibt anti-IgE-Antikörper, die lösliches IgE und Membran-gebundenes IgE auf IgE-exprimierenden B-Zellen binden, aber nicht an von Basophilen gebundenes IgE binden.
Ein weiteres Verfahren zur Hemmung der IgE-Aktivität ist, zirkulierendes IgE mit Hilfe der Apherese zu entfernen, bei der Plasma oder Serum eine Affinitätssäule passiert, die Antikörper selektiv entfernt. Der Selektivitätsgrad kann durch die Art der Affinitätssäule festgelegt werden. Zum Beispiel kann eine Affinitätssäule konstruiert werden, in der ein anti-IgE-Antikörper (entweder polyklonal oder monoklonal) mit der Säulenmatrix vernetzt ist.
Präparation von anti-IgE-Antikörpern
Wie hierin beschrieben, umfassen die Hemmer der IgE-Aktivität anti-IgE-Antikörper und anti-IgE-Rezeptorantikörper, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
Für die Herstellung von anti-IgE-Antikörpern kann humanes IgE für eine Immunisierung aus humanem Serum aufgereinigt werden. Alternativ kann humanes IgE durch Kultivieren einer IgE-produzierenden Zelllinie, zum Beispiel der Zelllinie U266, ATCC-Nummer CRL8033, produziert werden. Humanes IgE kann mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt werden, wie es in der Technik bekannt ist. Zum Beispiel können für humanes IgE spezifische monoklonale Antikörper der Maus, die an eine geeignete Matrix konjugiert sind, ein IgE-spezifisches Immunoadsorbens bereitstellen. Nachdem das IgE-Präparat mit dem Immunoadsorbens in Kontakt gebracht worden ist, kann das IgE im Wesentlichen in reiner Form von dem Immunadsorbens eluiert werden. Ein derartiges Präparat von humanem IgE kann als ein Immunogen für die Produktion von anti-IgE-Antikörpern verwendet werden.
Polyklonale Antikörper können durch Verabreichung des immunogenen Konjugats, das normalerweise mit einem Adjuvans gemischt ist, an einen Säugerwirt gewonnen werden. Das Immunogen wird der Einfachheit halber durch Rehydratation von lyophilisiertem Immunogen zwecks Herstellung einer Lösung oder Suspension für eine Injektion präpariert. Bevorzugte Adjuvantien sind Wasser-in-Öl Immersionen, insbesondere komplettes Freund-Adjuvans für die erste Verabreichung, und inkomplettes Freund-Adjuvans für Booster-Dosen. Das Präparat wird üblicherweise an verschie denen Stellen verabreicht und üblicherweise in zwei oder mehr Dosen über einen Zeitraum von wenigstens 4 Wochen. Das Serum wird geerntet und auf das Vorhandensein spezifischer Antikörper unter Verwendung eines Hapten-Protein-Konjugats oder einer anderen kompetitiv bindenden Verbindung für das Analyt in einem Standard-Immunoassay oder in einer Präzipitationsreaktion getestet.
Polyklonale Antiseren enthalten üblicherweise Antikörper, die nicht mit dem Analyt reagieren oder unerwünschte Kreuzreaktivitäten zeigen. Verfahren zur Reinigung spezifischer Antikörper von einem polyklonalen Antiserum sind bekannt, insbesondere die Affinitätsreinigung mit Hilfe einer Säule des an einer festen Phase konjugierten Analyts. Das Antiserum wird über die Säule gegeben, die Säule wird gewaschen und der Antikörper wird mit einem leicht denaturierenden Puffer, wie 0,1 M Glycin, 0,2 M NaCl, pH 2,5, eluiert. Falls das Antiserum über die Säule in einem Puffer gegeben wird, der mögliche interferierende Substanzen enthält, dann wird die gebundene und eluierte Fraktion mit Antikörpern angereichert sein, die nicht kreuzreagieren.
Vorzugsweise sind die anti-IgE-Antikörper für die Verwendung in dieser Erfindung monoklonale Antikörper. Monoklonale Antikörper können mit mehreren unterschiedlichen in der Wissenschaft bekannten Verfahren hergestellt werden. Hinsichtlich der Hybridom-Technologie wird der Leser allgemein auf Harrow & Lane (1988), U.S. Patent, Nr. 4.491.632, 4.472.500 und 4.444.887, und Methods in Enzymology, 73B:3 (1981) verwiesen. Der üblichste Weg für die Produktion monoklonaler Antikörper ist die Immortalisierung und Klonierung einer Milzzelle oder einer anderen Antikörperproduzierenden Zelle, die von einem immunisierten Tier gewonnen ist. Der Klon wird mit einem Verfahren, wie Fusion mit einem nicht-produzierenden Myelom, durch Transfektion mit dem Epstein-Barr-Virus oder Transformation mit onkogener DNA, immortalisiert. Die behandelten Zellen werden kloniert und kultiviert und die Klone selektiert, welche den Antikörper der erwünschten Spezifität produzieren. Das Testen der Spezifität erfolgt mit Kulturüberständen mit mehreren Techniken, wie der Verwendung des immunisierenden Antigens als dem Detektionsmittel in einem Immunoassay. Ein Vorrat von monoklonalen Antikörpern von dem selektierten Klon kann dann aus einem großen Volumen Kulturüberstand oder aus der Ascitesflüssigkeit geeignet präparierter Wirtstiere, denen der Klon injiziert wurde, gereinigt werden. Der Antikörper kann auf Aktivität als unbehandelter Überstand oder Ascites getestet werden und wird gegebenenfalls unter Verwendung biochemischer Präparationsstandardtechniken, wie Ammoniumsulfatpräzipitation, Ionenaustausch-Chromatographie und Gelfitrationschromatographie, gereinigt.
Alternative Verfahren zur Gewinnung monoklonaler Antikörper umfassen das Inkontaktbringen einer immunkompetenten Zelle oder eines viralen Partikels mit dem erwünschten Analyt oder einem Analyt-Protein-Komplex in vitro. In diesem Zusammenhang bedeutet „immunkompetent", dass die Zelle oder der Partikel in der Lage ist, einen für das Antigen spezifischen Antikörper ohne eines weiteren genetischen Rearrangements zu exprimieren, und sie/er aus einem Gemisch von Zellen durch die Präsentierung des Antigens selektiert werden kann. Immunkompetente eukaryotische Zellen können aus einem immunisierten Säugerdonor geerntet sein oder können von einem nicht immunisierten Donor geerntet sein und in vitro durch Kultivieren in Gegenwart eines Immunogens und immunstimulatorischen Wachstumsfaktoren prästimuliert werden. Zellen der erwünschten Spezifität können durch Inkontaktbringen mit dem Immunogen unter Kulturbedingungen, die zu einer Proliferation spezifischer Klone, jedoch nicht der unspezifischen Klone, führen, selektiert werden. Immunkompetente Phagen können konstruiert werden, um Abschnitte variabler Immunglobulinregionen auf ihrer Oberfläche zu exprimieren. Siehe Marks et al. (1996) N. Engl. J. Med. 335:730; WO Patentanmeldungen 94/13804, 92/01047, 90/02809 und McGuinnes et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:1149. Phagen der erwünschten Spezifität können zum Beispiel mittels Adhäsion an einen Hapten-Protein-Komplex, der an einer festen Phase gebunden ist, selektiert und dann in E. coli amplifiziert werden.
Antikörper können ebenfalls mit Hilfe biotechnischer Verfahren hergestellt werden. Die Aminosäuresequenz der variablen Regionen der schweren und leichten Kette der erwünschten Spezifität werden von Prototypen-Antikörpermolekülen erhalten und gegebenenfalls, zum Beispiel für Humanisierungszwecke, modifiziert. Polynukleotide, die sie codieren, werden dann synthetisiert oder geklont, funktionsfähig mit Transkriptions- und Translationselementen verknüpft und dann in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert. Siehe zum Beispiel U.S. Patente, Nr. 5.225.539 und 5.693.761.
Noch bevorzugter sind die in der Erfindung verwendeten Antikörper „humanisiert" oder chimär. Humanisierte Antikörper umfassen variable oder Antigen-bindende (hypervariable oder komplementaritätsbestimmende) Regionen, die von einem tierischen (z.B. murinen) Antikörper stammen, und die restlichen Regionen stammen von einem humanen Antikörper. Humanisierte Antikörper sind im Menschen generell weniger immunogen als nichthumane Antikörper. Verfahren zur Produktion humanisierter Antikörper sind in der Wissenschaft beschrieben. Siehe zum Beispiel U.S. Patent Nr. 5.449.760 und Better et al. (1988) Science 240:1041-1043.
Die Menge an Antikörper (oder einem beliebigen IgE-Hemmer), die verabreicht werden soll, kann empirisch bestimmt werden; außerdem werden empfohlene Dosen in den Veröffentlichungen üblicherweise gefunden, die die Antikörper beschreiben. Beispiele für wirksame Mengen an anti-IgE-Antikörpern können zum Beispiel in U.S. Patenten 5.543.144 und 5.656.273 gefunden werden. Dass eine geeignete Menge verabreicht worden ist, kann zum Beispiel durch Messen der IgE-Levels und/oder Kontrolle von Symptomen erkannt werden.
IgE-bindende Fragmente
Hemmer der IgE-Aktivität umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, IgE-bindende Fragmente. Der Ausdruck „IgE-bindendes Fragment", wie er hier in dieser Offenlegung verwendet wird, umfasst nicht nur intakte Immunglobulin-Moleküle, sondern ebenfalls Fragmente und Derivate (einschließlich rekombinanter Derivate) von Immunglobulin-Molekülen oder T-Zellrezeptoren mit der erwünschten Spezifität. Ein Antigen-bindendes Fragment kann aus einer einzigen Polypeptidkette (wie ein scFv), aus mehreren Polypeptiden, die über Disulfidbindungen verbunden sind (wie ein intaktes Immunglobulin) oder aus mehreren Peptiden bestehen, die nicht-kovalent assoziiert sind (wie Fv-Fragmente). Antigen-bindende Fragmente enthalten üblicherweise zwei gegenüberliegende variable Domänen, jede von einem Immunglobulin oder T-Zellrezeptor, wobei aber einzelne variable Domänen von ausreichender Affinität gefunden werden können, die Antigen unabhängig binden.
Antikörper-Fragmente können mit Standardverfahren der Proteinchemie hergestellt werden, wie beispielsweise Spaltung des Antikörpers mit einem proteolytischen Enzym, wie Pepsin, Papain oder Trypsin; und Reduzieren der Disulfidbindungen mit einem Reagenz wie Dithiothreitol. Beispiele umfassen Fab-Fragmente (umfassend die V_H-C_H1 und V_L-C_L-Domänen), F(ab)₂-Fragmente, Fd-Fragmente (umfassend die V_H-C_H1-C_H2 und V_L-C_L-Domänen), Fv-Fragmente (umfassend V_H und V_L-Domänen) und isolierte Fragmente der schweren und leichten Kette mit Antigen-bindender Aktivität. Gentechnisch veränderte Varianten eines intakten Immunglobulins können durch die Gewinnung eines Polynukleotids, das den Antikörper codiert, und Anwendung der allgemeinen Verfahren der Molekularbiologie, um die codierenden Sequenzen zu spleißen oder Mutationen einzuführen, und Translatieren der Variante hergestellt werden. Hergestellte Varianten von besonderem Interesse umfassen chimäre und humanisierte Antikörper, Fab-ähnliche Fragmente, Fragmente einzelkettiger variabler Regionen (scFv, die Regionen der schweren und leichten Kette umfassen, die über einen Peptid-Linker verknüpft sind) und Diabodies (Peptide, die zwei variable Regionen umfassen, die zur Bildung eines bivalenten Antigen-bindenden Peptids dimerisieren).
Die Antigen-bindende Aktivität kann mit jedem beliebigen Bindungsassay bestimmt werden, bei welchem das Antigen und das Kandidaten-Fragment unter Bedingungen vereint werden, die eine Bildung von Komplexen erlauben – üblicherweise einem isotonischen Puffer bei physiologischem pH. Die Bildung stabiler Komplexe wird zum Beispiel mit physikalisch-chemischen Mitteln (wie einem Biosensor) bestimmt oder unter Verwendung eines geeigneten Markers (wie einem Radioisotop oder Enzymmarker), der an eine der reagierenden Komponenten gebunden ist. Das Vorhandensein stabiler Komplexe korreliert mit der Bindungsaktivität. Die Gesamtavidität zwischen Antigen und Peptid beträgt bevorzugt wenigstens etwa 10⁸ M^–1, bevorzugter wenigstens etwa 10¹⁰ M^–1, und noch bevorzugter wenigstens etwa 10¹² M^–1. Die Antigen-bindende Fragmente sind üblicherweise durch Gewinnung eines Antikörper-Prototyps der erwünschten Spezifität, Herstellen eines Fragments oder anderweitige Anpassung der Struktur und dann erneutes Testen der Bindungsaktivität entwickelt. Eine Subfragmentierung oder Modifizierung kann solange fortgesetzt werden, wie die Antigen-bindende Aktivität beibehalten ist.
Wie der Fachmann weiß, kann die Menge an IgE-bindenden Fragmenten (oder einem beliebigen IgE-Hemmer) empirisch bestimmt werden. Dass eine geeignete Menge verabreicht worden ist, kann zum Beispiel durch Messen der IgE-Levels und/oder Kontrolle von Symptomen gezeigt werden.
Antigen-Immuntherapie
Bei einigen Anwendungsformen der Erfindung wird ein Antigen (d.h. eine Zusammensetzung, umfassend ein Antigen oder Antigene) verabreicht. Weil das/die Antigene) im Zusammenhang mit der Verabreichung einer Zusammensetzung verabreicht wird/werden, welche die IgE-Aktivität hemmt (besonders eine Zusammensetzung, welche die Anaphylaxie nach einer Verabreichung des Antigens und/oder Antigenexposition hemmt), ist es verständlich, dass die Menge an verabreichtem Antigen höher ist als die Menge, die ohne eine Zusammensetzung, welche die IgE-Aktivität hemmt, verabreicht wäre. Dementsprechend sind derartige Mengen größer als die „maximal tolerierte Dosis" (MTD) einer herkömmlichen Immuntherapie einer Allergie, die keine Verwendung eines IgE-Hemmers umfasst oder dies erwägt. Wie in der Wissenschaft bekannt, ist eine MTD die höchste Dosis, die keine systemische anaphylaktische Reaktion induziert. Alternativ ist die Menge an gegebenem Antigen kleiner als die MTD für ein Individuum, das eine Behandlung gemäß der Erfindung erhält.
Dementsprechend wird bei einigen Anwendungsformen das Antigen in wenigstens etwa 1,25, wenigstens etwa 1,5, wenigstens etwa 1,75, wenigstens etwa 2,00fach höheren Mengen verabreicht als die Menge, die während einer herkömmlichen Desensibilisierungstherapie gegeben worden wäre oder gegeben würde (d.h. ohne die Verabreichung einer Zusammensetzung, welche die IgE-Aktivität hemmt). In anderen Anwendungsformen wird das Antigen in wenigstens etwa 5, wenigstens etwa 7, wenigstens etwa 10, wenigstens etwa 12, wenigstens etwa 15, wenigstens etwa 20fach höheren Mengen verabreicht als die Menge, die während einer herkömmlichen Desensibilisierungstherapie gegeben worden wäre oder gegeben würde. Bei einigen Anwendungsformen ist eine anfängliche Antigendosis eine beliebige der folgenden: etwa 0,25, etwa 0,5, etwa 1,0, etwa 2,0, etwa 5,0, etwa 10, etwa 15, etwa 20 μg. Bei einigen Anwendungsformen ist eine Enddosis oder Endpunktdosis eine beliebige der folgenden: etwa 25, etwa 40, etwa 50, etwa 75, etwa 100, etwa 125, etwa 150, etwa 175, etwa 200 μg. Die Menge an verabreichtem Antigen kann in höheren Konzentrationen und/oder höheren Volumina erfolgen. Dementsprechend könnte die „Menge" an Antigen hinsichtlich der Konzentration erhöht sein. Es ist verständlich, dass zusätzlich zum Verabreichen von höheren als den herkömmlichen Dosierungen es ebenfalls möglich (aber nicht erforderlich) ist, die aufeinanderfolgenden Dosierungen schneller zu erhöhen.
Dosierungsprotokolle sind in der Wissenschaft bekannt. Siehe z.B. Weber (1997); Fornadley (1998) Otolaryngology Clinics North America 31:111-127; Remingtons's Pharmaceutical Sciences 19th Ed. Mack Publishing (1995), Kapitel 82. Die Dosierungen für jedes Antigen hängen von dem bestimmten Antigen wie auch von dem die Therapie erhaltenden Individuum ab und liegen des weiteren auch im Ermessen des einzelnen behandelnden Arztes. Im Allgemeinen wird die Allergen-Immuntherapie wöchentlich mit steigenden Dosen verabreicht, wobei die Menge an verabreichtem Antigen im Mikrogramm-Bereich liegt. Die Menge an Antigen wird erhöht, bis eine Abschwächung (bis Verschwinden) von Symptomen beobachtet wird oder nachteilige Symptome beobachtet werden. Alternativ umfasst eine sogenannte „Schnelltherapie" das anfänglich gehäufte Verabreichen (wie mehrere Verabreichungen an einem Tag, einmal pro Woche), gefolgt von anschließenden wöchentlichen Verabreichungen. Die Therapie wird perennierend gegeben, mit einer Aufrechterhaltungsdosis, die in 2 oder 4 Wochenintervallen gegeben wird. Über die Zeit können die Aufrechterhaltungsdosen sogar weniger häufig festgelegt sein, wie alle 6 bis 8 Wochen.
In den Verfahren der Erfindung können variierende Antigen-Mengen verwendet werden, solange die Dosierung keine systemische Anaphylaxie induziert (d.h. MTD). Geringere Dosierungen als die MTD können ebenfalls verwendet werden.
Viele Antigene sind bekannt und sind häufig mit rekombinanten Techniken isoliert worden. Die Tabelle 1 zeigt eine Liste von Allergenen, die eingesetzt werden können. TABELLE 1 Rekombinante Allergene
Verabreichung von ISS
Bei einigen Anwendungsformen umfassen die Verfahren der Erfindung eine Verabreichung von ISS (d.h. eine ISS umfassendes Polynukleotid) zusätzlich zu einer Verabreichung eines IgE-Hemmers (oder eines Anaphylaxie-Hemmers) im Allgemeinen in einer ausreichenden Menge, um die Aktivität des IgE-Hemmers zu erhöhen. Wie es für den Fachmann einzusehen ist, gibt es zahlreiche Möglichkeiten, diese Verstärkung aufzuzeigen, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, solcher, die eine gesteigerte Persistenz einer IgE-Suppression und/oder eine deutliche Verminderung der IgE-Aktivität im Vergleich zur Verabreichung des IgE-Hemmers allein erlauben.
ISS sind bekannt und können ohne weiteres auf eine immunstimulatorische Aktivität mit Hilfe von Standardverfahren in der Wissenschaft identifiziert werden, wie Messung von Zytokin- und/oder Antikörper-Produktion. Im Allgemeinen umfassen ISS die Sequenz 5'-C, G-3'. Ganz besonders umfassen ISS die hexamere Sequenz 5', Purin, Purin, C, G, Pyrimidin, Pyrimidin-3'.
Bevorzugte ISS umfassen die allgemeine oktamere Sequenz 5'-Purin, Purin, Cytosin, Guanin, Pyrimidin, Pyrimidin, Cytosin, (Cytosin oder Guanin)-3'. Am bevorzugtesten umfasst die ISS eine Oktamer, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: AACGTTCC, AACGTTCG, GACGTTCC und GACGTTCG. Bei einigen Anwendungsformen umfasst die ISS die Sequenz TGACTGTGAACGTTCGAGATGA.
Bei einigen Anwendungsformen wird ein ISS-Antigen-Konjugat verabreicht. Die Herstellung kovalenter und/oder nicht-kovalenter Bindungen zwischen Polynukleotid und anderen Molekül-Resten, wie Peptiden, nutzt Standardtechniken der Wissenschaft.
Die ISS oder das eine ISS umfassende Polynukleotid kann an den immunmodulatorischen Molekülteil eines Konjugats auf verschiedene Art und Weise gekoppelt sein, einschließlich kovalenter und/oder nicht-kovalenter Wechselwirkungen.
Die Verknüpfung zwischen den Teilen kann am 3' oder 5'-Ende des ISS-enthaltenden Polynukleotids oder an einer geeignet modifizierten Base an einer internen Position in der ISS hergestellt sein. Falls das immunmodulatorische Molekül ein Peptid ist und eine geeignete reaktive Gruppe (z.B. ein N-Hydroxysuccinimidester) besitzt, kann es direkt mit der N⁴-Aminogruppe von Cytosin-Resten umgesetzt werden. In Abhängigkeit von Anzahl und Position der Cytosin-Reste in der ISS kann ein spezifisches Markieren an einem oder mehreren Resten erreicht werden.
Alternativ können modifizierte Oligonukleotide, wie sie in der Wissenschaft bekannt sind, an jedem Terminus oder an internen Positionen in dem ISS-enthaltenden Polynukleotid eingebaut sein. Diese können blockierte funktionelle Gruppen enthalten, die, wenn sie entblockiert sind, mit verschiedenen funktionellen Gruppen reagieren können, die auf dem immunmodulatorischen Molekül von Interesse vorhanden sein können oder an dieses gebunden sein können.
Wo das immunmodulatorische Molekül ein Peptid ist, kann dieser Teil des Konjugats an das 3'-Ende der ISS mit Hilfe der Festphasen-Chemie angeheftet sein. Zum Beispiel kann der ISS-Teil zu einem Polypeptid-Teil hinzugefügt werden, der auf einem festen Träger präsynthetisiert worden ist. Haralambidis et al. (1990a) Nucleic Acids Res. 18:493-499; und Haralambidis et al. (1990b) Nucleic Acids Res. 18:501-505. Alternativ kann die ISS so synthetisiert werden, dass sie mit einem festen Träger über einen spaltbaren Linker verbunden ist, der am 3'-Ende sitzt. Nach einer chemischen Spaltung der ISS von dem Träger, bleibt eine terminale Thiolgruppe am 3'-Ende des Oligonukleotids (Zuckermann et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:5305-5321; und Corey et al. (1987) Science 238:1401-1403) oder eine Amingruppe an dem 3'-Ende des Oligonukleotids zurück (Nelson et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:1781-1794). Eine Konjugation der Amino-modifizierten ISS an Aminogruppen des Peptids kann, wie in Benoit et al. (1987) Neuromethods 6:43-72 beschrieben, durchgeführt sein. Eine Konjugation der Thiol-modifizierten ISS an Carboxylgruppen des Peptids kann, wie in Sinah et al. (1991) Oligonucleotide Analogues: A Practical Approach, IRL Press, beschrieben, durchgeführt sein. Eine Kopplung eines Oligonukleotids, das ein angehängtes Maleimid trägt, an die Thiolseitenkette eines Cystein-Rests eines Peptids, ist ebenfalls beschrieben worden. Tung et al. (1991) Bioconjug. Chem. 2:464-465.
Der Peptidteil des Konjugats kann an das 5'-Ende des ISS-enthaltenden Polynukleotids über eine Amin-, Thiol- oder Carboxylgruppe angeheftet sein, die in das Oligonukleotid während seiner Synthese eingebaut worden ist. Vorzugsweise wird eine verknüpfende Gruppe, die ein geschütztes Amin, Thiol oder Carboxyl an einem Ende und ein Phosphoramidit am anderen Ende umfasst, an das 5'-Hydroxyl kovalent gebunden, während das Oligonukleotid an dem festen Träger gebunden ist. Agrawal et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14:6227-6245; Conolly (1985) Nucleic Acids Res. 13:4485-4502; Kremsky et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:2891-2909; Conolly et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:3131-3139; Bischoff et al. (1987) Anal. Biochem. 164:336-344; Blanks et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10283-10299; und U.S. Patent, Nr. 4.849.513, 5.015.733, 5.118.800 und 5.118.802. Nach einer anschließenden Entschützung können die latenten Amin-, Thiol- und Carboxylfunktionalitäten für eine kovalente Bindung des Oligonukleotids an ein Peptid genutzt sein. Benoit et al. (1987); und Sinah et al. (1991).
Der Peptidteil kann an ein modifiziertes Cytosin oder Uracil an einer beliebigen Position in dem ISS-enthaltenden Polynukleotid angeheftet sein. Der Einbau eines „Linker-Arms", der eine latente reaktive Funktionalität besitzt, wie eine Amin- oder Carboxylgruppe am C-5 der modifizierten Base liefert eine Ansatzstelle für die Peptidbindung. Ruth 4th Annual Congress for Recombinant DNA Research, Seite 123.
Ein Konjugat aus ISS/immunmodulatorisches Molekül kann ebenfalls über nicht-kovalente Wechselwirkungen gebildet sein, wie Ionenbindungen, hydrophobe Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen und/oder van der Waals Kräfte.
Nicht-kovalent verbundene Konjugate können eine nicht-kovalente Wechselwirkung, wie einen Biotin-Streptavidin-Komplex, umfassen. Eine Biotinylgruppe kann zum Beispiel an einer modifizierten Base eines ISS gebunden sein. Roget et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7643-7651. Der Einbau eines Streptavidin-Rests in einen Peptidteil erlaubt eine Bildung eines nicht-kovalent gebundenen Komplexes aus dem Streptavidin-konjugierten Peptid und dem biotinylierten Oligonukleotid.
Nicht-kovalente Verbindungen können ebenfalls über Ionenwechselwirkungen erfolgen, die einer ISS und Reste innerhalb des immunmodulatorischen Moleküls umfassen, wie geladene Aminosäuren, oder über den Einsatz eines Linkers, der geladene Reste umfasst, die sowohl mit dem Oligonukleotid als auch mit dem immunmodulatorischen Molekül wechselwirken können. Zum Beispiel kann eine nicht-kovalente Konjugation zwischen einer generell negativ geladenen ISS und positiv geladenen Aminosäure-Resten eines Peptids, z.B. Polylysin- und Polyarginin-Resten, erfolgen.
Eine nicht-kovalente Konjugation zwischen ISS und immunmodulatorischen Molekülen kann über DNA-bindende Motive von Molekülen erfolgen, die mit DNA als ihre natürliche Liganden wechselwirken. Zum Beispiel können derartige DNA-bindende Motive in Transkriptionsfaktoren und anti-DNA-Antikörpern gefunden werden.
Die Kopplung der ISS an ein Lipid kann mit Hilfe von Standardverfahren erfolgen. Diese Verfahren umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Synthese von Oligonukleotid-Phospholipid-Konjugaten (Yanagawa et al. (1988) Nucleic Acids Symp. Ser. 19:189-192), von Oligonukleotid-Fettsäure-Konjugaten (Grabarek et al. (1990) Anal. Biochem. 185:131-135; und Staros et al. (1986) Anal. Biochem. 156:220-222) und von Oligonukleotid-Sterol-Konjugaten. Boujrad et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5728-5731.
Die Kopplung des Oligonukleotids an ein Oligosaccharid kann mit Hilfe von bekannten Standardverfahren erfolgen. Diese Verfahren umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Synthese von Oligonukleotid-Oligosaccharid-Konjugaten, worin das Oligosaccharid ein Teil eines Immunglobulins ist. O'Shannessy et al. (1995) J. Applied Biochem. 7:347-355.
Die Kopplung einer ringförmigen ISS an ein Peptid oder Antigen kann auf verschiedene Art und Weise erfolgen. Wo die ringförmige ISS mit Hilfe rekombinanter oder chemischer Verfahren synthetisiert ist, ist ein modifiziertes Nukleosid geeignet. Ruth (1991) in Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press. Standardtechniken für die Verknüpfung können zum Verknüpfen der ringförmigen ISS mit dem Antigen oder anderen Peptid angewandt sein. Goodchild (1990) Biocon jug. Chem. 1:165. Wo die ringförmige ISS unter Anwendung rekombinanter oder chemischer Verfahren isoliert oder synthetisiert ist, kann die Verknüpfung mittels chemischer Aktivierung oder Photoaktivierung einer reaktiven Gruppe (z.B. Carben, Radikal) erfolgen, das in das Antigen oder andere Peptid eingebaut worden ist.
Weitere Verfahren für die Verknüpfung von Peptiden und anderen Molekülen mit Oligonukleotiden können U.S. Patent Nr. 5.391.723; Kessler (1992) „Nonradioactive labeling methods for nucleic acids" in Kricka (ed.) Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press; und Geoghegan et al. (1992) Bioconjug. Chem. 3:138-146 entnommen werden.
Eine ISS kann ebenfalls unmittelbar mit einem Antigen oder Antigenen assoziiert sein durch (a) Verkapselung (wie zum Beispiel ein Liposom); (b) Adsorption auf einer Oberfläche; und (c) über ein Plattform-Molekül (d.h. ein synthetisches oder natürlich vorkommendes Molekül, das Stellen umfasst, die eine Bindung von ISS und Antigen(en) erlauben.
Die ISS kann allein oder in Kombination mit weiteren pharmazeutischen und/oder immunogenen und/oder immunstimulatorischen Agentien verabreicht sein und kann mit einem physiologisch verträglichen Träger davon kombiniert sein. Die wirksame Menge und das Verfahren der Verabreichung der bestimmten ISS-Formulierung kann basierend auf dem einzelnen Patienten und dem Stadium der Erkrankung und weiterer Faktoren, die dem Fachmann offensichtlich sind, variieren. Der/die in einer bestimmten Anwendung zweckdienliche(n) Verabreichungsweg(e) ist/sind dem Fachmann offensichtlich. Verabreichungswege umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, topische, dermale, transdermale, transmukosale, epidermale, parenterale, gastrointestinale und nasopharyngeale und pulmonäre, einschließlich transbronchialer und transalveolärer, Verabreichungen. Ein geeigneter Dosisbereich stellt eine ausreichend ISS-haltige Zusammensetzung bereit, um eine Gewebekonzentration von etwa 1-10 μM zu erreichen, wie mit Blutlevels gemessen. Die an jeden Patienten gegebene absolute Menge hängt von pharmakologischen Eigenschaften, wie Bioverfügbarkeit, Clearance-Rate und Verabreichungsweg, ab.
Die vorliegende Erfindung stellt ISS-haltige Zusammensetzungen bereit, die für eine topische Anwendung geeignet sind, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, physiologisch verträglicher Implantate, Salben, Cremes, Spülungsflüssigkeiten und Gele. Eine topische Verabreichung erfolgt zum Beispiel mit Hilfe eines Verbands oder einer Bandage mit einem darin dispergierten Abgabesystem, oder mit Hilfe einer direkten Verabreichung eines Abgabesystems in Schnitte oder offene Wunden. Cremes, Spülungsflüssigkeiten, Gele oder Salben mit einer darin dispergierten ISS-haltigen Zusammensetzung sind für eine Verwendung als topische Salben oder Wundfüllmaterialien geeignet.
Bevorzugte Wege der dermalen Verabreichung sind die gering invasiven Wege. Bevorzugt von diesen Möglichkeiten sind die transdermale Übertragung, die epidermale Verabreichung und die subkutane Injektion. Von diesen Möglichkeiten ist die epidermale Verabreichung aufgrund der höheren Konzentrationen von APCs, die im intradermalen Gewebe erwartet sind, bevorzugt.
Die transdermale Verabreichung erfolgt durch die Applikation einer Creme, Spülungsflüssigkeit, eines Gel etc., die in der Lage sind, eine Penetration der ISS-haltigen Zusammensetzung in die Haut zu erlauben und in den Blutstrom zu gelangen. Zusammensetzungen, die für eine transdermale Verabreichung geeignet sind, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, pharmazeutisch verträgliche Suspensionen, Öle, Cremes und Salben, die direkt auf die Haut aufgetragen werden oder in einem schützenden Träger, wie einem transdermalen Mittel (sogenanntes „Pflaster"), eingebaut sind. Beispiele für geeignete Cremes, Salben etc. können zum Beispiel in der Physician's Desk Reference vorgefunden werden.
Für eine transdermale Übertragung ist die Iontophorese ein geeignetes Verfahren. Die iontophoretische Übertragung kann mit Hilfe im Handel erhältlicher Pflaster durchgeführt sein, die ihr Produkt durch die unverletzte Haut für einen Zeitraum von mehreren Tagen oder länger kontinuierlich abgeben. Die Anwendung dieses Verfahrens erlaubt die kontrollierte Übertragung pharmazeutischer Zusammensetzungen in relativ hohen Konzentrationen, erlaubt die Zufuhr von Kombinationen von Medikamenten und erlaubt die gleichzeitige Verwendung eines Absorptionsbeschleunigers.
Ein beispielhaftes Pflaster für die Verwendung in diesem Verfahren ist das LECTRO PATCH, ein gesetzlich geschütztes Produkt der General Medical Company aus Los Angeles, CA. Dieses Produkt hält Reservoir-Elektroden elektronisch auf einem neutralen pH und kann angepasst werden, um Dosierungen verschiedener Konzentrationen zu liefern, um kontinuierlich und/oder periodisch zu dosieren. Präparation und Verwendung des Pflasters sollte entsprechend der Herstelleranleitungen erfolgen, die dem LECTRO PATCH Produkt beiliegen; diese Anleitungen sind hier durch Quellenangabe eingefügt.
Für eine transdermale Übertragung ist eine niederfrequente Ultraschall-Abgabe ebenfalls ein geeignetes Verfahren. Mitragotri et al. (1995) Science 269:850-853. Das Anlegen von niederfrequenten Ultraschall-Frequenzen (etwa 1 MHz) erlaubt die allgemeine kontrollierte Abgabe von therapeutischen Zusammensetzungen, einschließlich derjenigen mit einen hohen Molekulargewicht.
Die epidermale Verabreichung umfasst im Wesentlichen eine hinreichende mechanische oder chemische Reizung der äußersten Schicht der Epidermis, um eine Immunantwort gegen das Reizmittel hervorzurufen. Genauer, die Reizung sollte hinreichend sein, um APCs an die gereizte Stelle zu locken.
Ein beispielhaftes mechanisches Reizmittel verwendet eine Vielzahl sehr feiner kurzer Nadeln, die zur Reizung der Haut und zum Anlocken von APCs an die gereizte Stelle verwendet sein können, um ISS-haltige Zusammensetzungen aufzunehmen, die den Nadelenden abgegeben werden. Zum Beispiel enthält der MONO-VACC alte Tuberkulintest, der von Pasteur Merieux in Lyons, Frankreich, hergestellt wird, eine für die Einführung von ISS-haltigen Zusammensetzungen geeignete Vorrichtung.
Die Vorrichtung (die in den USA von Connaught Laboratories, Inc. in Swift in Swiftwater, PA, vertrieben wird) besteht aus einem Kunststoffbehälter mit einem Spritzenkolben an einem Ende und einer Nadelplatte am anderen Ende. Die Nadelplatte trägt eine Vielzahl feiner Nadeln mit einer Länge, so dass gerade nur die äußerste Epidermiszellschicht aufgeritzt wird. Jede Nadel ist in dem MONO-VACC Kit mit altem Tuberkulin beschichtet; in der vorliegenden Erfindung ist jede Nadel mit einer pharmazeutischen Zusammensetzung einer ISS-haltigen Zusammensetzung beschichtet. Die Verwendung der Vorrichtung erfolgt bevorzugt entsprechend den Herstelleranleitungen, die der Vorrichtung beigefügt sind. Ähnliche Vorrichtungen, die ebenfalls in dieser Anwendungsform verwendet sein können, sind solche Vorrichtungen, die gegenwärtig zur Durchführung von Allergietests eingesetzt werden.
Ein anderer geeigneter Versuchsansatz für eine epidermale Verabreichung von ISS ist die Verwendung einer Chemikalie, welche die äußersten Zellen der Epidermis reizt, und folglich eine hinreichende Immunantwort hervorruft, um APCs in diesen Bereich zu locken. Ein Beispiel ist ein keratinolytisches Agens, wie die Salicylsäure, die in topischen Enthaarungscremes Verwendung findet, die im Handel erhältlich sind und von Noxema Corporation unter dem Warenzeichen NAIR verkauft werden. Dieser Versuchsansatz kann auch zur Durchführung einer epithelialen Verabreichung in die Mukosa angewandt sein. Das chemische Reizmittel kann ebenfalls zusammen mit einem mechanischen Reizmittel verwendet sein (wie es zum Beispiel der Fall wäre, wenn die MONO-VACC Nadel ebenfalls mit dem chemischen Reizmittel beschichtet wäre). Die ISS kann in einem Träger suspendiert sein, der ebenfalls das chemische Reizmittel enthält oder mit diesem gemeinsam verabreicht wird.
Ein weiteres Abgabesystem zur Verabreichung ISS-haltiger Zusammensetzungen verwendet nichtlipide Polymere, wie ein synthetisches polykationisches Aminopolymer. Leff (1997) Bioworld 86:1-2.
Parenterale Wege umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, die elektrische (Iontophorese) oder die direkte Injektion, wie eine direkte Injektion in ein zentrales venöses Gefäß, eine intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale, intradermale oder subkutane Injektion. Zusammensetzungen, die für eine parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, pharmazeutisch verträgliche sterile isotonische Lösungen. Derartige Lösungen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Saline und Phosphat-gepufferte Saline für eine Injektion der ISS-haltigen Zusammensetzungen.
Gastrointestinale Verabreichungswege umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, die Ingestion und den rektalen Weg. Die Erfindung umfasst für eine gastrointestinale Verabreichung geeignete ISS-haltige Zusammensetzungen, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, pharmazeutisch verträgliche Pulver, Pillen oder Flüssigkeiten für eine Ingestion und Suppositorien für eine rektale Verabreichung.
Nasopharyngale und pulmonäre Verabreichungswege umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Inhalation, transbronchiale und transalveoläre Wege. Die Erfindung umfasst für eine inhalative Verabreichung geeignete ISS-haltige Zusammensetzungen, umfassend, jedoch nicht darauf beschränkt, verschiedene Aerosolarten für eine Inhalation, wie auch Pulverformen für Abgabesysteme. Für eine inhalative Verabreichung von ISS-haltigen Zusammensetzungen geeignete Vorrichtungen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Zerstäuber und Verdampfer. Zerstäuber und Verdampfer, die mit den Pulvern befüllt sind, gehören zu einer Reihe von Vorrichtungen, die für eine Verwendung zur inhalativen Abgabe von Pulvern geeignet sind. Siehe z.B. Lindberg (1993) Summary of Lecture at Management Forum, 6.–7. Dezember 1993 „Creating the Future for Portable Inhalers."
Die Verfahren zur Herstellung geeigneter Vorrichtungen für eine Injektion, topische Applikation, für Zerstäuber und Verdampfer sind in der Wissenschaft bekannt und sind deshalb nicht detailliert beschrieben.
Die Wahl der Übertragungswege kann für eine Modulation der ausgelösten Immunantwort genutzt sein. Zum Beispiel waren die IgG-Titer und CTL-Aktivitäten identisch, wenn ein Influenzavirusvektor über intramuskuläre oder epidermale Wege (Genkanone) verabreicht wurde; allerdings ergab die muskuläre Inokulation primär IgG2A, während der epidermale Weg meistens IgG1 ergab. Pertmer et al. (1996) J. Virol. 70:6119-6125. Folglich kann der Fachmann aus geringen Differenzen bei der Immunogenität, die durch die verschiedenen Verabreichungswege der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung hervorgerufen sind, einen Vorteil ziehen.
Die oben erwähnten Zusammensetzungen und Verfahren zur Verabreichung dienen der Beschreibung und nicht der Beschränkung der Verfahren der Erfindung. Die Ver fahren zur Herstellung der verschiedenen Zusammensetzungen und Vorrichtungen liegen im Rahmen der Fähigkeiten des Fachmanns und sind hier nicht detailliert beschrieben.
Dosierungen
Die Dosierungen der IgE-Hemmer (insbesondere anti-IgE-Antikörper) und des Antigens sind oben diskutiert worden und umfassen im Allgemeinen empirische Bestimmungen, die im Rahmen der Fachkenntnisse liegen. Bezüglich der ISS ist im Allgemeinen ein geeigneter Dosisbereich, der eine ausreichend ISS-haltige Zusammensetzung liefert, um eine Gewebekonzentration von etwa 1-10 μM zu erreichen, wie es mit Hilfe von Blutlevels gemessen ist. Wie beim IgE-Hemmer und Antigen kann eine geeignete Dosierung für ISS vom Fachmann empirisch bestimmt sein.
Die Zusammensetzungen können in einer beliebigen Reihenfolge oder gleichzeitig gegeben werden.
Bewertung der Immunantwort
Eine Analyse (sowohl qualitativ als auch quantitativ) der Immunantwort auf Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung kann mit Hilfe eines in der Wissenschaft bekannten Verfahrens erfolgen, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Messen der Produktion Antigen-spezifischer Antikörper, Aktivierung spezifischer Populationen von Lymphozyten, wie CD4⁺-T-Zellen oder NK-Zellen, und/oder Produktion von Zytokinen, wie IFN, IL-2, IL-4 oder IL-12. Verfahren zum Messen spezifischer Antikörper-Antworten umfassen einen Festphasen-Enzymimmunoassay (ELISA) und sind in der Technik gut bekannt. Die Bestimmung der Anzahl spezifischer Lymphozyten-Typen, wie CD4⁺-T-Zellen, kann zum Beispiel mit der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) erfolgen. Zytotoxizitätstests können, zum Beispiel wie in Raz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519-9523 beschrieben, durchgeführt werden. Serumkonzentrationen von Zytokinen können zum Beispiel mittels ELISA gemessen werden. Diese und andere Tests zur Bewertung der Immunantwort auf ein Immunogen sind in der Wissenschaft bekannt. Siehe zum Beispiel Selected Methods in Cellular Immunology (1980) Mishell und Shiigi, eds., W.H. Freeman and Co. Die Bewertung einer Immunantwort kann ebenfalls subjektiv erfolgen. Zum Beispiel kann ein Individuum von einer verminderten Häufigkeit und Schwere allergischer Reaktionen gegen bestimmte Antigene berichten.
Kits und Zusammensetzungen
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Kits und Zusammensetzungen bereit, die für eine Verwendung mit den hier beschriebenen Verfahren geeignet sind.
Kits der Erfindung umfassen eine beliebige der folgenden Zusammensetzungen in einer geeigneten Packung: (a) einen IgE-Hemmer und ein Antigen; (b) ein Antigen in einer höheren Konzentration als die normalerweise für eine herkömmliche Desensibilisierungstherapie formulierte Konzentration (siehe Diskussion unten); (c) einen IgE-Hemmer und eine oder mehrere ISS; (d) einen IgE-Hemmer und eine oder mehrere ISS und ein Antigen; (e) einen IgE-Hemmer und ein ISS-Ag-Konjugat; (f) einen IgE-Hemmer und eine unmittelbar mit Antigen assoziierten ISS. Die Kits der Erfindung können gegebenenfalls Anleitungen für ihre Verwendung und/oder beliebige weitere Komponenten enthalten.
Die Zusammensetzungen der Erfindung sind neuartige Formulierungen, in denen die Konzentration von Antigen(en) höher ist, als diejenige(n), die in gegenwärtigen, herkömmlichen Desensibilisierungstherapien eingesetzt ist/sind. Dementsprechend ist die Menge an Antigen pro Volumeneinheit in den neuartigen Formulierungen der Erfindung eine wirksame Menge, um eine Desensibilisierung gegen das Antigen zu induzieren (was im Allgemeinen über eine Reihe an zunehmenden Dosierungen erreicht wird), während keine Anaphylaxie induziert wird. Die Menge an Antigen(en) in den neuartigen Formulierungen sind signifikant höher als in, und außerdem nicht empfohlen mit, den Formulierungen nach dem Stand der Technik. Bei einigen Anwendungsformen ist die Konzentration eine beliebige aus den folgenden: etwa 2, etwa 3, etwa 5, etwa 10, etwa 15, etwa 20, etwa 25, etwa 50, etwa 75, etwa 100fach konzentrierter als die in einer herkömmlichen Therapie eingesetzten Formulierungen. Konzentrationen von Antigen-Formulierungen, die gegenwärtig in Gebrauch sind, sind in der Wissenschaft bekannt und müssen hier nicht beschrieben werden.
Die Erfindung stellt ebenfalls Zusammensetzungen bereit, umfassend eine Zusammensetzung oder Agens, welches) die Aktivität von IgE hemmt, und ein immunstimulatorisches Oligonukleotid (ISS).
Im Allgemeinen umfassen die Zusammensetzungen der Erfindung vorzugsweise außerdem einen pharmazeutisch verträglichen Arzneimittelträger. Wie in der Wissenschaft bekannt, ist ein pharmazeutisch verträglicher Arzneimittelträger eine relativ inerte Substanz, die eine Verabreichung einer pharmakologisch wirksamen Substanz erleichtert. Zum Beispiel kann ein Arzneimittelträger eine Form oder Konsistenz verleihen oder als Verdünnungsmittel dienen. Geeignete Arzneimittelträger umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Stabilisatoren, Befeuchtungsmittel und Emulgatoren, Salze zum Variieren der Osmolarität, Verkapselungsmittel, Puffer und Penetrationsverbesserer der Haut. Arzneimittelträger wie auch Formulierungen für eine parenterale und nicht-parenterale Medikamentabgabe sind in Remington's Pharmaceutical Sciences 19. Ausgabe, Mack Publishing (1995), angegeben.
Andere Formulierungen umfassen in der Wissenschaft bekannte, geeignete Abgabeformen, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Träger wie Liposomen. Mahato et al. (1997) Pharm. Res. 14:853-859. Liposomen-Präparate umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Zytofektine, multilamellare Vesikel und unilamellare Vesikel.
Im Allgemeinen sind diese Zusammensetzungen für eine Verabreichung mittels Injektion (z.B. intraperitoneal, intravenös, subkutan, intramuskulär, etc.) formuliert. Dementsprechend sind diese Zusammensetzungen vorzugsweise mit pharmazeutisch verträglichen Trägern kombiniert, wie Saline, Ringer-Lösung, Dextrose-Lösung und ähnlichem. Das bestimmte Dosierungsschema, d.h., Dosis, zeitliche Festlegung und Wiederholung, hängt von dem bestimmten Individuum und dessen medizinischer Vorgeschichte ab.
Andere Formulierungen umfassen in der Wissenschaft bekannte, geeignete Abgabeformen, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Träger wie Liposomen, Mahato et al. (1997) Pharm. Res. 14:853-859. Liposomen-Präparate umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Zytofektine, multilamellare Vesikel und unilamellare Vesikel.
Bei einigen Anwendungsformen können mehr als ein Antigen in einer Zusammensetzung vorliegen. Derartige Zusammensetzungen können wenigstens ein, wenigstens zwei, wenigstens drei, wenigstens vier, wenigstens fünf verschiedene Antigene enthalten. Derartige „Cocktails", wie sie oftmals in der Wissenschaft genannt werden, können besonders in der Behandlung von Individuen zweckdienlich sein, die zum Beispiel gegen mehr als ein Allergen allergisch sind.

Claims

Erste Zusammensetzung, welche die Aktivität von IgE ausreichend hemmt, um die Aktivität von IgE in einem Individuum zu vermindern, wobei die erste Zusammensetzung einen Anti-IgE-Antikörper und eine zweite Zusammensetzung, umfassend eine ausreichende Menge eines Antigens, um die Immunantwort auf das Antigen zu modulieren, wobei das Antigen an ein Polynukleotid geknüpft ist, umfassend ein immunstimulatorisches Oligonukleotid, umfasst, zur Verwendung in Kombination in der Behandlung einer allergischen Reaktion auf das Antigen oder einer Allergie-bezogenen Störung während einer Antigen-spezifischen Immuntherapie des Individuums.
Erste Zusammensetzung, welche die Aktivität von IgE ausreichend hemmt, um eine IgE-bezogene Störung abzumildern, wobei die erste Zusammensetzung einen Anti-IgE-Antikörper und eine zweite Zusammensetzung, umfassend ausreichend immunstimulatorisches Oligonukleotid, um die Aktivität der ersten Zusammensetzung zu erhöhen, umfasst, zur Verwendung in Kombination in der Behandlung eines Individuums mit einer IgE-bezogenen Störung.
Zusammensetzungen nach Anspruch 2, wobei die IgE-bezogene Störung eine Allergie oder Allergie-bezogene Störung oder eine Parasiteninfektion ist.
Zusammensetzungen nach Anspruch 3, wobei der Anti-IgE-Antikörper ein humanisierter muriner Antikörper ist.
Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 2, 3 oder 4, wobei die erste Zusammensetzung vor der zweiten Zusammensetzung verabreicht wird, die zweite Zusammensetzung vor der ersten Zusammensetzung verabreicht wird, oder die erste Zusammensetzung mit der zweiten Zusammensetzung verabreicht wird.
Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 2 bis 5, zur Behandlung einer allergischen Reaktion oder Allergie-bezogenen Störung auf ein Allergen während einer Antigen-spezifischen Immuntherapie, außerdem umfassend eine dritte Zusammensetzung, die eine ausreichende Menge des Antigens umfasst, um eine Desensibilisierung gegen das Antigen herbeizuführen.
Zusammensetzungen nach Anspruch 6, wobei die zweite Zusammensetzung und die dritte Zusammensetzung eine einzige Zusammensetzung darstellen, umfassend ein immunstimulatorisches Oligonukleotid in Konjugation an das Antigen.
Erste Zusammensetzung, umfassend ein Agens, das eine Anaphylaxe hemmt, in einer wirksamen Menge zur Hemmung einer Anaphylaxe, wobei das Agens in der ersten Zusammensetzung ein Anti-IgE-Antikörper ist, und eine zweite Zusammensetzung, umfassend ein Polynukleotid, das ein immunstimulatorisches Oligonukleotid in einer ausreichenden Menge umfasst, um die Aktivität der ersten Zusammensetzung zu erhöhen, zur Verwendung in Kombination in der Behandlung einer IgE-bezogenen Störung in einem Individuum.
Zusammensetzungen nach Anspruch 8, außerdem umfassend ein Antigen.
Zusammensetzungen nach Anspruch 9, wobei das Antigen an das Polynukleotid geknüpft ist.
Zusammensetzung, umfassend eine Zusammensetzung, welche die Aktivität von IgE hemmt, wobei die Zusammensetzung einen Anti-IgE-Antikörper und ein immunstimulatorisches Oligonukleotid umfasst.
Kit, umfassend: (a) eine Zusammensetzung, welche die Aktivität von IgE hemmt, wobei die Zusammensetzung einen Anti-IgE-Antikörper umfasst; und (b) ein immunstimulatorisches Oligonukleotid; in einer geeigneten Packung.