DE69929330T2

DE69929330T2 - Neue verwendung von hiv-protease hemmern

Info

Publication number: DE69929330T2
Application number: DE69929330T
Authority: DE
Inventors: Patrice Andre; Vincent Lotteau; Rolf Zinkernagel; Paul Klenerman; Marcus Groettrup
Original assignee: Biomerieux SA; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Biomerieux SA; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1998-06-11
Filing date: 1999-06-11
Publication date: 2006-09-21
Anticipated expiration: 2019-06-12
Also published as: US20030082207A1; EP1637139A3; FR2779653B1; JP2002517441A; EP1637139A2; FR2779653A1; ES2258842T3; ATE314847T1; CA2334990A1; DE69929330D1; WO1999063998A1; AU4049399A; EP1083898B1; EP1083898A1; US6506555B1

Description

Die Erfindung betrifft die therapeutische Verwendung einer Verbindung, welche die Protease des humanen Immunschwächevirus (HIV) inhibiert und aus Ritonavir, Saquinavir oder deren pharmazeutisch verträglichen Salzen ausgewählt ist, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger zur Herstellung eines Arzneimittels für die Verhütung und/oder Behandlung einer Infektion mit dem Hepatitis-C-Virus.
Das Proteasom, das zentrale Enzymsystem zum gleichzeitig im Cytosol und im Kern stattfindenden Proteinabbau, ist ein Komplex, der mehrere Peptidaseaktivitäten aufweist. Eine seiner Funktionen ist die Erzeugung von durch intrazelluläre Proteolyse gebildeten kleinen Peptiden, die in den T-Lymphocyten vorhanden sind, um Immunantworten auszulösen.
Dabei hat es sich gezeigt, dass Peptidaldehyde Inhibitoren des Proteasoms sind und den Abbau der meisten Zellproteine und die Erzeugung der Peptide, die auf der Oberfläche der Antigene aufweisenden Zellen vorhanden sind, zusammen mit den Molekülen des großen Histokompatibilitätskomplexes der Klasse I hemmen (Rock et al., Cell., 78, 761–771 (1994)). Weiterhin offenbaren mehrere Patentanmeldungen Proteasominhibitoren, die für die Behandlung von Krankheiten, bei welchen ein Verlust an Körpergewicht beobachtet wird (WO 95/24 914), Krankheiten, die zu einer Zellproliferation führen (WO 98/13 061) und, allgemeiner, Krankheiten, an welchen die proteolytische Funktion des Proteasoms beteiligt ist, wie insbesondere entzündliche Erkrankungen und Krebs (WO 96/32 105 und WO 96/13 266), verwendbar sind.
Überraschenderweise ist von den Erfindern festgestellt worden, dass bestimmte Verbindungen, welche die Protease des humanen Immunschwächevirus (HIV) hemmen, eine die Aktivität des Proteasoms verändernde Wirkung besitzen.
Dabei handelt es sich um:

– Ritonavir und seine pharmazeutisch verträglichen Salze, wobei eine pharmazeutische Spezialität, die Ritonavir als Wirkstoff enthält, Norvir^® (Abbott) ist, und
– Saquinavir und seine pharmazeutisch verträglichen Salze, wobei eine pharmazeutische Spezialität, die Saquinavir in Form von Saquinavirmesylat als Wirkstoff enthält, Invirase^® (Roche) ist.

Dabei können Ritonavir, Saquinavir oder ihre Salze allein oder im Gemisch verwendet werden. Eine Kombination aus Ritonavir und Saquinavir ist besonders vorteilhaft, da sie es erlaubt, die Pharmakokinetik von Saquinavir zu verbessern, dessen Abbau durch das Vorhandensein von Ritonavir verlangsamt wird.
Diese Inhibitoren (die in den Patentanmeldungen WO 94/14 436 und EP 432 695 beschrieben sind) der Protease des humanen Immunschwächevirus (HIV) werden in breitem Umfang bei der Behandlung von Aids verwendet. Diese Verbindungen blockieren die virale Replikation und inhibieren spezifisch die virale Protease, welche die Spaltung der viralen Proteinvorläufer in reife Virusproteine erlaubt. Die Dreifachtherapie, in welcher ein solcher Proteaseinhibitor zusammen mit zwei Nucleosidanalogen verwendet wird, ist somit gegenwärtig die wirksamste Strategie zur Behandlung einer HIV-Infektion.
Die Erfindung hat deshalb die Verwendung mindestens einer Verbindung, welche die Protease des humanen Immunschwächevirus (HIV) inhibiert und aus Ritonavir, Saquinavir oder deren pharmazeutisch verträglichen Salzen ausgewählt ist, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger zur Herstellung eines Arzneimittels für die Verhütung und/oder Behandlung einer Infektion mit dem Hepatitis-C-Virus zum Gegenstand.
Von den Erfindern ist somit festgestellt worden, dass Ritonavir und Saquinavir die "chymotrypsinartige" Aktivität des Proteasoms hemmen und die "Trypsin-Aktivität" des Proteasoms verstärken.
Die Modifizierung des Proteasoms erlaubt es, in eine bestimmte Anzahl nachgelagerter Ereignisse einzugreifen.
Von den Erfindern ist insbesondere festgestellt worden, dass es diese Verbindungen, welche die Protease des humanen Immunschwächevirus (HIV) hemmen und eine die Aktivität des Proteasoms modifizierende Wirkung aufweisen, erlauben, zusammen mit dem großen Histokompatibilitätskomplex der Klasse I (MHC1) das Vorhandensein von Antigenen auf der Zelloberfläche zu modifizieren und infolgedessen die Aktivierung der cytotoxischen T-Lymphocyten CD8⁺ zu inhibieren oder zu modifizieren. Diese Verbindungen haben daher den entscheidenden Vorteil, dass sie in therapeutischen Konzentrationen die Aktivität der T-Helfer-Lymphocyten nicht direkt beeinflussen. Die Verbindungen, welche die Protease des humanen Immunschwächevirus (HIV) inhibieren und eine modifizierende Wirkung auf die Aktivität des Proteasoms besitzen, sind daher besonders nützlich für die Prävention und/oder Behandlung von Störungen, bei welchen eine inadäquate Antwort, beispielsweise eine übermäßige Antwort der cytotoxischen T-Lymphocyten CD8+, beobachtet worden ist. Ganz allgemein sind sie auf Störungen gerichtet, für deren Behandlung eine Modifizierung (wie insbesondere eine Abschwächung) der Immunantwort, die mit den cytotoxischen T-Lymphocyten CD8+ verbunden ist, erwünscht ist.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen, welche die HIV-Protease hemmen und das Proteasom modifizieren, besitzen außerdem eine die Apoptose modifizierende Wirkung, die aus der Modifizierung des Proteasoms folgt (Nagata et al., Cell, 88, 355–365 (1997), Ruggieri et al., Virology, 229, 68–76 (1997) und WO 98/13 061).
Von den Störungen, bei welchen es interessant ist, die Aktivität des Proteasoms zu modifizieren, sind insbesondere entzündliche, infektiöse und/oder Krankheiten, für deren Behandlung eine Modifizierung oder Kontrolle der Apoptose erwünscht ist, zu nennen. Insbesondere richtet man sich auf Virusinfektionen, insbesondere auf solche mit nicht-cytopathogenen Viren wie Infektionen mit Hepatitisviren, speziell dem Hepatitis-C-Virus.
Dabei ist es selbstverständlich, dass das erworbene Immunschwächesyndrom (Aids) keine erfindungsgemäße Störung ist, da die Verringerung der Anzahl der T-Lymphocyten, CD8+, bei der Behandlung dieses Syndroms nicht erwünscht ist.
Das Arzneimittel, das erfindungsgemäß hergestellt ist und mindestens eine die Aktivität des Proteasoms modifizierende Verbindung, die aus Ritonavir, Saquinavir oder deren pharmazeutisch verträglichen Salzen ausgewählt ist, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthält, kann in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung vorliegen, die für eine orale Verabreichung, beispielsweise in Form einer Tablette, einer Kapsel und einer trinkbaren Lösung, oder für eine rektale Verabreichung, beispielsweise in Form eines Zäpfchens, vorgesehen ist. Es kann auch parenteral, speziell in Form einer injizierbaren Lösung, insbesondere intravenös, intradermal und subkutan, verabreicht werden. Schließlich kann es in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die für eine topische Verabreichung vorgesehen ist, wie eine Salbe, vorliegen. Eine solche Formulierung ist im Fall der Behandlung der Schuppenflechte und von Kontaktallergien besonders vorteilhaft.
Das erfindungsgemäß hergestellte Arzneimittel enthält vorzugsweise 1 bis 2 000 mg und vorzugsweise 100 bis 500 mg der Verbindung, die eine die Aktivität des Proteasoms modifizierende Wirkung aufweist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur therapeutischen Behandlung, in welchem einem Patienten, der an einer Störung leidet, bei deren Behandlung eine Modifizierung des Proteasoms erwünscht ist, eine therapeutisch wirksame Menge von mindestens einer die HIV-Protease inhibierenden Verbindung, die aus Ritonavir, Saquinavir oder einem ihrer pharmazeutisch verträglichen Salze ausgewählt ist, allein oder im Gemisch, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger verabreicht wird.
Dabei ist die Dosierung von der Schwere der Störung, dem Alter und dem Gewicht des Patienten abhängig. Sie kann insbesondere 100 bis 1 500 mg pro Tag und vorzugsweise 600 bis 1 200 mg pro Tag betragen.
Von Rutschmann et al. ist die Wirkung der Behandlung eines Patienten, der mit dem HIV- und dem HCV-Virus koinfiziert war, mit HIV-Proteasehemmern (Ritonavir, Indinavir und Kombination aus Saquinavir und Ritonavir) berichtet worden. Nach den Autoren haben die HIV-Proteasehemmer keine direkte Wirkung auf das HCV und können sogar die virale Belastung mit dem HCV verschlimmern ("Impact of treatment with Human Immunodeficiency Virus (HIV) Protease Inhibitors on Hepatitis C viremia in Patients Coinfected with HIV", THE JOURNAL OF INFECTIOUS DISEASES, 177, Nr. 3, 783–785, März 1998 (1998–03)).
Mauss et al. betrifft den Einfluss von HIV-Proteasehemmern auf die virale Belastung mit Hepatitis C bei Personen, die mit HIV und HCV coinfiziert waren. Sie stellen fest, dass wenigstens Saquinavir und Indinavir keinen merklichen Einfluss auf die HCV-Replikation haben ("Influence of HIV protease inhibitors on hepatitis C viral load in individuals with HIV and HCV coinfection.", ABSTRACTS OF THE INTERSCIENCE CONFERENCE ON ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, Band 37, 218ff (1997), MEETING INFO: 37TH INTERSCIENCE CONFERENCE ON ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY TORONTO, ONTARIO, CANADA, 28. September bis 1. Oktober, 1997, ICA).
Die folgenden Beispiele und die Figuren erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch zu beschränken.
Erläuterung der Figuren
In 1A ist die Dicke des Pfotenballens von Mäusen, die mit Ritonavir behandelt worden waren, verglichen mit Kontrollmäusen in Abhängigkeit von der Zeit gezeigt.
In 1B ist die Dicke des Pfotenballens von Mäusen am B. Tag nach dem Beginn der Behandlung mit Ritonavir, wobei die täglichen Ritonavirdosen veränderlich waren, gezeigt.
In 1C ist der Prozentsatz der spezifischen Lyse der Targetzellen EL4, die mit dem Peptid GP33–41 sensibilisiert worden waren, durch Lymphocyten, die aus der Milz von gegebenenfalls mit Ritonavir behandelten Mäusen isoliert worden waren, gezeigt.
In 1D ist der Prozentsatz der spezifischen Lyse der Targetzellen EL4, die mit dem Peptid NP 396–404 sensibilisiert worden waren, durch Lymphocyten, die aus der Milz von gegebenenfalls mit Ritonavir behandelten Mäusen isoliert worden waren, gezeigt.
In 1E ist der Prozentsatz an CD8⁺-Zellen in Bezug auf die Gesamtzahl der Milzzellen bei Mäusen, die gegebenenfalls mit dem LCM-Virus infiziert und gegebenenfalls mit Ritonavir behandelt worden waren, gezeigt.
In 1F ist die Wirkung von Ritonavir auf die virale Belastung mit dem LCM-Virus gezeigt.
In 2A ist der Prozentsatz der spezifischen Lyse der Targetzellen (mit dem LCM-Virus infizierte Fibroblasten MC57), die, gegebenenfalls in Anwesenheit von Ritonavir, mit cytotoxischen Anti-LCM-Virus-T-Lymphocyten inkubiert worden waren, gezeigt.
In 2B ist der Prozentsatz der spezifischen Lyse der Targetzellen (mit dem Glykoprotein GP transfektierte Fibroblasten MC57), die, gegebenenfalls in Anwesenheit von Ritonavir mit cytotoxischen Anti-GP-T-Lymphocyten inkubiert worden waren, gezeigt.
In 3A ist der maximale Prozentsatz der Freisetzung von TNFα in Abhängigkeit von der Ritonavirdosis gezeigt.
In 3B ist der inhibierte Prozentsatz der Proliferation von T-Lymphocyten M77–84 in Abhängigkeit von der Ritonavirdosis gezeigt.
In 4A ist der inhibierte Prozentsatz des Abbaus der Proteine mit kurzer Lebensdauer in Abhängigkeit von der Ritonavirdosis gezeigt.
In 4B ist die Hydrolyse des fluorogenen Substrats Suc-LLVY-MCA durch das Proteasom in Abhängigkeit von der Ritonavirdosis gezeigt.
In 4C ist die Hydrolyse des fluorogenen Substrats (Z)-GGL-MCA durch Proteasom in Abhängigkeit von der Ritonavirdosis gezeigt.
In 4D ist die Hydrolyse des fluorogenen Substrats Bz-VGR-MCA durch das Proteasom in Abhängigkeit von der Ritonavirdosis gezeigt.
In 4E ist die Hydrolyse des fluorogenen Substrats Suc-LLVY-MCA durch das Proteasom in Gegenwart von Nelfinavir, Saquinavir, Indinavir oder Ritonavir gezeigt.
In 5 ist der Prozentsatz an nicht-diabetischen NOD-Mäusen bei einer Behandlung mit Ritonavir im Vergleich mit der Verabreichung eines Verdünnungsmittels in Abhängigkeit von der Zeit gezeigt.
– In 6 sind die klinischen Punktzahlen von Ratten, die eine experimentelle allergische Enzephalitis (EAE) erworben hatten und mit Ritonavir behandelt worden waren, gezeigt.
In 7 ist die Veränderung einer chronischen Infektion mit dem Hepatitis-C-Virus bei einem mit HIV infizierten Patienten, der mit Ritonavir behandelt worden war, gezeigt.
Beispiele
Vergleichsbeispiel 1: Wirkung von Ritonavir auf die in-vivo-Aktivität der cytotoxischen T-Lymphocyten
1. Hemmung der Schwellung der Pfotenballen von Mäusen nach Infektion mit dem LCM-Virus
Verfahren
Von den Erfindern wurde ein LCM-(Choriomeningitis lymphocytaria)Virus-Maus-Tierversuch durchgeführt. Dieses nicht-cytopathogene Virus löst eine Infektion aus, in welcher die cytotoxischen T-Lymphocyten gleichzeitig für die anfängliche Kontrolle der Virusreplikation und der von dem Virus ausgelösten Immunerkrankung verantwortlich sind. C57BL6-Mäuse wurden an den Ballen der Pfoten am Tag J0 infiziert (300 pfu – Plättchen bildende Einheiten des LCM-WE-Virus, geliefert von F. Lehmann-Grube, Hamburg), und die Schwellung des Pfotenballens wurde im Laufe der Zeit gemessen. Ritonavir (1,25 mg/Maus/Tag, gelöst in 10 % Alkohol, 90 % phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PBS) oder ein Plazebo (gleiches PBS-Volumen, 10 Alkohol) wurde intraperitoneal ab dem Tag J0 verabreicht. In diesem Versuch und in den folgenden Versuchen wurden die Ergebnisse anhand von zwei Pfotenballen von zwei bis drei Mäusen pro Gruppe angegeben, wobei diese Ergebnisse für drei bis vier getrennte Versuche repräsentativ sind. Die Messung der Dicke der Pfotenballen wurde täglich entsprechend der Vorschrift von R.M. Zinkernagel, T. Leist, H. Hengartner und A. Althage, J. Exp. Med., 162, 2125 (1985) (1A) durchgeführt.
Die Schwellung des Pfotenballens, die von der Infektion mit dem LCM-Virus ausgelöst worden war, wurde am Tag J8 bei den Mäusen gemessen, die mit variablen Ritonavirdosen behandelt worden waren (1B).
Ergebnisse:
Die Mäuse C57BL/6, denen das LCM-WE-Virus injiziert worden war, wiesen nach sieben bis acht Tagen eine Schwellung des Pfotenballens auf, die ein direktes invivo-Maß für die Aktivität der cytotoxischen T-Lymphocyten ist. Diese Schwellung wurde stark durch eine Behandlung mit Ritonavir auf eine dosisabhängige Art und Weise gehemmt. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, indem verschiedene Virusstämme (Stamm LCM-Virus-Docile 10 pfu/ml, erhalten von C. Pfau, Troy, oder der Stamm LCM-Virus-Armstrong, 10⁴ PFU/ml, erhalten von M. Buchmeier, La Jolla) mit verschiedenen Maus-Haplotypen (BALB/c: H2^d) verwendet wurden, wobei der Verabreichungsweg entweder parenteral oder oral (Magensonde) war.
2. Inhibition der in-vivo-Aktivität von cytotoxischen T-Lymphocyten
Verfahren:
Mäuse C57BL/6, die mit Ritonavir (1,25 mg/Maus/Tag) oder mit einem Plazebo behandelt worden waren, wurden mit 200 PFU LCM-WE-Virus intravenös infiziert. Acht Tage nach der Infektion wurden die Milzzellen gewonnen und für die Lyse der Zellen EL4 (H-2⁰) getestet, die mit 500 nM des Peptids GP33–41 (Aminosäuren 33 bis 41 des Glykoproteins des LCM-Virus, d. h. KAVYNFATC (1C) oder des Peptids NP 396–407 (Aminosäuren 396 bis 407 des Glykoproteins des LCM-Virus, d. h. EQPQNGFIH, 1D) sensibilisiert worden waren.
Ergebnisse:
Die Behandlung mit Ritonavir inhibierte die Antwort der cytotoxischen T-Lymphocyten auf eine systemische Infektion mit dem LCM-Virus. Die Lyse der Targetzellen war verringert, nachdem die Mäuse die Behandlung mit Ritonavir erhalten hatten.
3. In-vivo-Inhibition der Proliferation der T-Lymphocyten CD8⁺
Verfahren:
Mäuse wurden mit 200 PFU von LCM-Virus-WE intravenös infiziert und mit Ritonavir oder einem Plazebo wie zuvor beschrieben behandelt. Die Milzzellen wurden mit einem Anti-CD8-Antikörper, konjugiert mit FITC (Pharmingen, San Diego), identifiziert und durch FACS analysiert.
Ergebnisse:
Es wurde eine Inhibition der Proliferation beobachtet, die normalerweise bei den T-Lymphocyten CD8+ als Antwort auf das LCM-Virus (1E) festgestellt wird.
4. Wirkung von Ritonavir auf die Belastung mit dem LCM-Virus
Verfahren:
Mäuse wurden mit dem LCM-Virus (200 pfu) intravenös infiziert und mit Ritonavir oder einem Plazebo wie in Punkt 2 zuvor beschrieben behandelt. Der Virengehalt in der Milz wurde am Tag J8 entsprechend der Vorschrift bestimmt, die beschrieben ist in Battegay et al., J. Virol. Methods, 33, 191 (1991).
Ergebnisse:
Die Verringerung der Lyse der Targetzellen, wie sie weiter oben beobachtet worden ist, geht mit einer Verringerung der viralen Clearance einher (1F), ein Ergebnis, das bestätigt, dass Ritonavir direkt auf die Immunantwort anstatt indirekt durch eine antivirale Wirkung auf das LCM-Virus einwirkt.
5. Bewertung der Antikörperantwort
Verfahren:
Die Antikörper, die spezifisch für das Nucleoprotein des LCM-Virus und das Glykoprotein des LCM-Virus waren, wurden nach vier und nach acht Wochen durch ELISA bestimmt, wie beschrieben in 0. Planz, P. Seiler, H. Hengartner und R.M. Zinkernagel, Nature, 382, 629 (1990).
Ergebnisse:
Ritonavir hatte das Vermögen zur Synthese von Anti-Virus-Antikörpern nicht verringert.
Vergleichsbeispiel 2: Wirkung von Ritonavir auf das Vorhandensein von Antigen-Peptiden durch den MHC der Klasse I bei cytotoxischen T-Lymphocyten von Mäusen
1. Wirkung von Ritonavir auf die Lyse, die von den cytotoxischen T-Lymphocyten der Targetzellen vermittelt wird, die mit LCM-WE-Virus infiziert und in vitro mit Ritonavir behandelt worden waren
Verfahren:
Cytotoxische T-Lymphocyten wurden aus Milzzellen von Mäusen, die mit dem LCM-Virus infiziert waren, hergestellt und in vitro durch Zellen, die entweder mit dem Peptid GP33–41 (2A) oder mit dem Peptid NP396-404 (2B) sensibilisiert worden waren, restimuliert.
Ihre cytolytische Aktivität wurde gegenüber Fibroblasten MC57 (H-2⁰), die mit dem LCM-Virus mit einer Infektionshäufigkeit von 0,04 infiziert und gegebenenfalls in Anwesenheit von Ritonavir mit 5 μg/ml 36 Stunden lang inkubiert worden waren, getestet.
Die direkte in-vitro-Wirkung von Ritonavir auf die cytotoxischen T-Lymphocyten war ausgeschlossen worden, indem die Targetzellen vor dem Lyseversuch umfangreich gewaschen worden waren.
Ergebnisse:
Diese in-vitro-Versuche mit Zellen, die Virenantigene nach Infektion mit einem Virus aufwiesen, zeigen, dass die Inhibierung der Antworten der cytotoxischen T-Lymphocyten in das Vorhandensein des Antigens eingreift. Die Inkubation der mit dem LCM-Virus infizierten MC57-Zellen mit Ritonavir inhibiert die Lyse durch die cytotoxischen Anti-LCM-Virus-T-Lymphocyten stark (2A). Eine ähnliche inhibierende Wirkung ist auch an den MC57-Zellen beobachtet worden, die mit Ritonavir behandelt worden waren und durch Transfektion das Glykoprotein des LCM-Virus exprimierten (2B).
Vergleichsbeispiel 3: Wirkung von Ritonavir auf das Vorhandensein von Antigenpeptiden durch MHC1 bei humanen T-Lymphocytenklonen
Verfahren:

a) In diesem Versuch wurden M113- und M77–84-Zellen, die jeweils eine Melanomlinie HLA-A2, die das Antigen MART-1 aufweist, sind, und ein Klon von cytotoxischen T-Lymphocyten CD8+, der dieses Antigen erkennt, verwendet (Y. Kawakami et al., J. Exp. Med., 180, 347 (1994) und N. Gervois, Y. Guilloux, E. Diez, F. Jotereau, J. Exp. Med., 183, 2403–7 (1996)). Die M113-Zellen wurden 24 Stunden lang mit verschiedenen Ritonavirkonzentrationen kultiviert, anschließend resuspendiert und in Paraformaldehyd fixiert. Als Kontrolle wurden dieselben Konzentrationen an Indinavir verwendet. Die Produktion von TNFα durch antwortende T-Lymphocyten M77–84 im Überstand wurde gemessen und ist in 3 als Prozentsatz der maximalen Freisetzung, die mit unbehandelten M113-Zellen erhalten wurde, angegeben.
b) Die M113-Zellen wurden 24 Stunden lang in Gegenwart von Ritonavir (0,1 bis 5 μg/ml) kultiviert und anschließend als Stimulans in einem Proliferationsversuch mit T-Lymphocyten M77–84 als antwortenden Zellen verwendet. Die Proliferation wurde nach 48 Stunden in Gegenwart von Thymidin, das mit 1 μCi/Vertiefung in den letzten 18 Stunden zugesetzt worden war (3B), gemessen.

Ergebnisse:
Diese Versuche, in welchen Klone von humanen cytotoxischen T-Lymphocyten, die gegen Melanomantigene gerichtet waren, verwendet worden waren, führten zu ähnlichen Ergebnissen wie die weiter oben erläuterten vorhergehenden Versuche. In den 3A und 3B ist die Inhibition des Vorhandenseins des Antigens MART-1 von humanen Melanomen durch Zellen gezeigt, die in Gegenwart von Ritonavir zu T-Lymphocyten CD8+ wuchsen. Die Inhibition ist dosisabhängig und wirksam bei therapeutischen Dosen wie derjenigen, die beobachtet wurde, wenn Antigene enthaltende Zellen in dem Serum kultiviert wurden, das von HIV-negativen Freiwilligen nach Einnahme einer einzigen oralen Dosis von 500 mg Ritonavir erhalten worden war. Es wurden bis zu 70 Inhibition der Proliferation mit Seren beobachtet, die drei Stunden nach Einnahme entnommen worden waren, was dem Konzentrationspeak von Plasma-Ritonavir entspricht.
Vergleichsbeispiel 4: Wirkung von Ritonavir auf die "chymotrypsinartige" Aktivität des Proteasoms
1. Wirkung von Ritonavir auf den Abbau von Proteinen mit kurzer Lebensdauer
Verfahren:
Für diese Analysen wurden die Zellen eine Nacht lang in Anwesenheit einer veränderlichen Ritonavirkonzentration kultiviert, in einem Medium ohne Methionin und ohne Cystein 1 Stunde lang vorinkubiert, mit ³⁵S-Methionin und Stunde lang markiert, in PBS gewaschen und eine Stunde lang einer Spülung unterworfen. Nach einer Stunde wurde TCA (Trichloressigsäure mit einer Endkonzentration von 10 %) zu dem Überstand zugegeben und die Radioaktivität des Überstands, der nicht mit TCA ausgefällt worden war, mit einem Lumaplate (Topcount Packard) (4A) gemessen.
Ergebnisse:
Ritonavir inhibiert dosisabhängig den Abbau von Proteinen mit kurzer Lebensdauer, ein Vorgang, der dafür bekannt ist, dass er hauptsächlich vom Weg des Proteasomen-Ubiquitins abhängig ist. Diese Ergebnisse legen sehr nahe, dass die Aktivität des Proteasoms von Ritonavir modifiziert wird.
2. Wirkung von Ritonavir auf das Proteasom
Verfahren:
In den 4B, 4C und 4D ist die Hydrolyse des fluorogenen Substrats (100 μM Suc-LLVY-MCA, 100 μM (Z)-GGL-MCA und 400 μM Bz-VGR-MCA) der Proteasomen 205, die aus Mausfibroblasten B8 isoliert worden waren, in Abhängigkeit von variablen Konzentrationen an Ritonavir und an LLnL (N-Acetyl-L-leucinyl-L-leucinal-L-norleucinal, bekannter Inhibitor des Proteasoms) gezeigt. Die Ergebnisse sind auf eine Stunde Verdauung mit dem Proteasoms 20S (500 ng) in einem Endvolumen von 100 μl bezogen. Die Werte wurden innerhalb eines linearen Detektionsbereichs lokalisiert und sind die Mittelwerte von drei Wiederholungen mit einer Standardabweichung von weniger als 3 %.
Ergebnisse:
Die in den 4B, 4C und 4D dargestellten Ergebnisse zeigen, dass Ritonavir ein leistungsfähiger Inhibitor der Hydrolyse ist, die von dem Proteasom des fluorogenen Substrats Suc-LLVY-MCA vermittelt wird (Abschneiden der Carboxyseite des Tyrosins). Andererseits war die Hydrolyse des Substrats (Z)-GGL-MCA (Abschneiden der Carboxyseite des Leucins) wenig beeinflusst, und die Spaltung des Substrats Bz-VGR-MCA (Abschneiden der Carboxyseite des Arginins durch eine Aktivität vom Typ "Trypsin") war demzufolge verstärkt. Diese selektive Inhibierung durch Ritonavir kontrastiert mit der Inhibierung durch das Peptidaldehyd LLnL des Proteasoms, das dafür bekannt ist, kovalent alle aktiven Stellen der Proteasomen 20S zu blockieren und auf ähnliche Weise die Proteolyse der drei untersuchten fluorogenen Substrate inhibiert (V. Cerundolo et al., Eur. J. Immunol., 27, 336 (1997), A. Vinitsky et al., J. Immunol., 159, 554 (1997) und M. Groll et al., Nature, 386, 463 (1997)).
Die Reifung der Moleküle der Klasse I im endoplasmatischen Retikulum, um Widerstandsfähigkeit gegen die H-Endoglykosidase zu erwerben, und die Expression auf der Oberfläche der Moleküle der Klasse I war nicht signifikant durch die Behandlung mit Ritonavir blockiert worden, was mit einer selektiven Inhibierung übereinstimmt.
3. Vergleich von vier HIV-1-Protease-Inhibitoren
Verfahren
Die Hydrolyse von Suc-LLVY-MCA durch Mausproteasomen 20S wurde gemäß dem in Beispiel 4.2 beschriebenen Verfahren unter gleichen Bedingungen, mit Ausnahme der Tatsache, dass ein anderes Los aus gereinigten Proteasomen verwendet wurde, untersucht. Die Hydrolyse von Suc-LLVY-MCA wurde in Gegenwart von zunehmenden Konzentrationen an Ritonavir, Nelfinavir (Roche), Saquinavir (Mesylat) und Indinavir (Wirkstoff von Crixivan^®, vertrieben von Merck und von Sharp and Dohme) gemessen. Die HIV-Protease-Inhibitoren waren zuvor in Ethanol, Methanol, DMSO bzw. Wasser für eine in-vitro-Verwendung (4E) gelöst worden.
Ergebnisse:
Außer Ritonavir hemmte das Saquinavirmesylat die "chimotrypsinartige" Aktivität, während keine Inhibierung mit Indinavir und Nelfinavir beobachtet wurde. Das Anschwellen des Pfotenballens nach Injektion des LCM-Virus, und die direkte ex-vivo-Lyse nach systemischer Infektion wurden von Indinavir oder Nelfinavir nicht inhibiert. Dafür konnte eine Hemmung des Anschwellens der Pfotenballen mit Saquinavir (bis zu 73 % Hemmung am 7. Tag nach Behandlung mit einer oralen Tagesdosis von 4 mg Saquinavir) beobachtet werden.
Als Schlussfolgerung erklärt die spezifische und selektive Inhibierung des Proteasoms durch Ritonavir sowie durch Saquinavir die modifizierenden Wirkungen auf das in vivo beobachtete Vorhandensein des Antigens.
Schlussfolgerung:
Die Mäuse, die durch eine Injektion des LCM-Virus in den Pfotenballen infiziert worden waren, entwickelten eine lokale Entzündung mit einem Reaktionsödem, das in direkter Beziehung zur Stärke der Antwort der cytotoxischen T-Lymphocyten steht. Die Mäuse litten an keiner entzündlichen Reaktion an der Injektionsstelle mehr, nachdem sie Ritonavir intraperitoneal oder oral erhalten hatten, und die Anzahl von Milz-T-Lymphocyten CD8 war bei den behandelten Mäusen nicht erhöht. Die Milzzellen dieser behandelten Mäuse hatten eine sehr geringe cytolytische Aktivität gegenüber Targetzellen, die mit den Peptiden des LCM-Virus sensibilisiert worden waren. Gleichzeitig war die Clearance der Viren verzögert und verringert.
Die in-vitro-Studien mit infizierten oder transfektierten und tumoralen Zellen zeigen, dass sich die Modifizierung der cytotoxischen Antwort auf der Ebene des Vorhandenseins der Antigene vollzieht. Dabei wird die Wirkung dieser Inhibitoren sowohl bei humanen als auch bei Mauszellen und bei Konzentrationen, die mit den therapeutischen Dosen erhalten worden, die während der Infektionen mit dem humanen Immunschwächevirus gegeben worden waren, beobachtet.
In vitro wird der Abbau der Proteine mit kurzer Lebensdauer, ein Phänomen, das hauptsächlich vom Proteasom verursacht wird, in Anwesenheit von Ritonavir verringert. Die gereinigten Proteasompräparate modifizieren ihre Enzymaktivität in Anwesenheit von Ritonavir. Die Entstehung der endogenen Peptide, die in der Lage sind, sich an den großen Histokompatibilitätskomplex der Klasse I (MHC-1) anzuheften, wird daher modifiziert, was zu einer Modifizierung der Bildung und Stimulation der T-Lymphocyten CD8 führt. Die Wirkung von Ritonavir wurde bei verschiedenen humanen oder Mauszellen, die Antigene gegenüber verschiedenen T-Zellen CD8 aufwiesen, beobachtet. Weiterhin wurde eine Modifizierung der Enzymaktivität des Proteasoms durch das Saquinavirmesylat beobachtet.
Vergleichsbeispiel 5: Wirkung von Ritonavir bei der Behandlung von Diabetes Typ 1
Verfahren
Ritonavir (0,6 mg pr 10 g Körpergewicht und Tag) oder ein Plazebo (Phosphatpuffer PBS) wurde intraperitoneal NOD-Mäusen verabreicht. Die Langerhansschen Inseln wurden gewonnen und 24 Stunden lang in Gegenwart oder Abwesenheit von 2,5 μg/ml Ritonavir kultiviert. Die Zellen wurden anschließend mit Hybridoma-Zellen, die mit MHC-1 (FT6.9 und FT7.9 24 Stunden lang) beschränkt worden waren, cokultiviert. Die IL-2-Menge im Überstand wurde bestimmt.
Ergebnisse:
In den folgenden Tabellen sind die IL-2-Mengen, gemessen mit einem Proliferationstest (cpm·10^–3), gezeigt.
a) Hybridom ETG.9 (MHC-1)
b) Hybridom FT7.9 (MHC-1)
In diesem NOD-Maus-Diabetes-Modell wurden die Langerhansschen Zellen, die von mit Ritonavir behandelten Mäusen isoliert worden waren, ex vivo nicht mehr von cytotoxischen T-Klonen erkannt.
Außerdem verzögerte, wie in 5 gezeigt, die Behandlung mit Ritonavir das Auftreten von Diabetes Typ 1 bei den NOD-Mäusen.
Vergleichsbeispiel 6: Wirkung von Ritonavir bei der Behandlung der experimentellen allergischen Enzephalitis bei Ratten und Mäusen, Modell der humanen Plaquesklerose
a) Bei Ratten:
Verfahren:
Die experimentelle allergische Enzephalitis bei Ratten ist das einzige Plaquesklerosemodell für den Menschen. Allen weiblichen Lewis-Ratten wurde 7 Wochen lang Meerschweinchen-MBP (Myelin Basic Protein oder Bindungsprotein an Myelin) mit einer subkutanen Injektion von 50 μg MBP in 100 μl komplettem Freundschem Adjuvans, ergänzt mit 4 μg/ml Mykobakterien, in den Pfotenballen verabreicht. Außerdem wurde diesen Ratten täglich entweder Ritonavir 1 mg, 5 mg bzw. 10 mg pro Tier oder ein Plazebo (Phosphatpuffer) mit der Injektion von MBP bis zur Genesung der nicht mit Ritonavir behandelten Tiere verabreicht. Die klinischen Punktzahlen, mit welchen der Verlauf der experimentellen allergischen Enzephalitis gemessen wurde, sind folgende:

1: Schwächung der Schwanzbewegungen
2: unvollständige Lähmung der hinteren Gliedmaßen
3: vollständige Lähmung der hinteren Gliedmaßen
4: unvollständige Lähmung der vorderen Gliedmaßen und
5: vollständige Unbeweglichkeit.

Etwa acht Tage nach dieser Immunisierung mit MBP begannen die Kontrollratten die ersten Stadien einer (vorübergehenden) Lähmung aufgrund der Immunantwort, die von der Verabreichung von Myelin ausgelöst wird, zu zeigen.
Ergebnisse:
Das Auftreten der ersten Lähmungserscheinungen war bei den Ratten, die mit Ritonavir (1 und 5 mg) behandelt worden waren, verzögert. Von den Ratten, die mit 10 mg Ritonavir behandelt worden waren, erwarben zwei keine Krankheit, und die anderen Ratten wiesen nur die abgeschwächten EAE-Symptome auf (klinische Punktzahl 1) (6).
b) Bei Mäusen
Bei Mäusen wurden ähnliche Ergebnisse wie die bei Ratten beschriebenen erhalten. Es wurden zusätzliche Informationen gewonnen, welche die Möglichkeit einer Übertragung des von Ritonavir ausgelösten Schutzes zeigen.
Verfahren und Ergebnisse:
In diesem Versuch erhielten nicht mit Ritonavir behandelte gesunde Empfängermäuse intravenös und/oder peritoneal Zellen von Lymphknoten und der Milz, die von Spendermäusen stammten, die mit Ritonavir behandelt und der in Beispiel a) beschriebenen und an die Maus angepassten Vorschrift zur Auslösung einer EAE unterworfen worden waren.
Knie-, Leisten- und Mesenteriumganglien und Milz wurden am 10. Tag (J10) nach der MBP-Injektion entnommen und in Gegenwart von 50 μg/ml MBP kultiviert. Am 3. Tag der Kultivierung wurden die nicht anhaftenden Zellen gewonnen, durch einen Ficoll geschickt und den Empfängermäusen injiziert (1010⁶ injizierte Zellen). Die Vorschrift zur Auslösung einer EAE verursachte am 30. Tag (J30) nach Übertragung der Zellen kein EAE-Symptom bei den Empfängertieren.
Schlussfolgerung:
Durch die Behandlung mit Ritonavir werden Mäuse und Ratten vor EAE geschützt. Dieser Schutz kann über Zellen der Lymphknoten und der Milz von behandelten Mäusen auf nicht mit Ritonavir behandelte Empfängermäuse übertragen werden.
Beispiel 7: Wirkung von Ritonavir bei der Behandlung von Hepatitis C
1. Zielsetzung
Das Hepatitis-C-Virus (HCV) ist das hauptsächliche ätiologische Agens, das für eine posttransfusionelle und sporadische Non-A-Non-B-Hepatitis verantwortlich ist. Mindestens 70 % der Infektionen werden chronisch und entwickeln sich sehr häufig zu einer Leberzirrhose und zu Leberkrebs. HCV-Infektionen sind ein großes Problem der Volksgesundheit, und die Behandlungen auf der Basis von Interferon, die meist angewendet werden, sind nur in 25 der Fälle wirkungsvoll.
Die Anti-HCV-T-Lymphocyten CD8 herrschen in den entzündeten Leberinfiltraten bei chronischen Infektionen vor. Ihre verstärkte Aktivierung bewirkt gleichzeitig eine beträchtliche Zerstörung der Leberzellen, die zu einer Leberinsuffizienz führt, und eine Immunsuppression, welche die vollständige Clearance des Virus behindert. Eine spezifische Kontrolle der Aktivierung der cytotoxischen T-Lymphocyten CD8 würde es erlauben, die Immunerkrankung der HCV-Infektion abzuschwächen, indem sie die Immunsuppression aufhebt und die Leberzerstörung vermindert.
Die Mechanismen, die für Leberschäden bei der Infektion mit dem Hepatitis-C-Virus (HCV) verantwortlich sind, sind nur wenig bekannt. Die klinische Beobachtung, dass kurze Behandlungen mit Corticosteroiden den Serumgehalt an Aminotransferasen trotz Verschlimmerung der Virämie reduzieren, legt nahe, dass die Immunantwort eine bedeutende Rolle bei der Zerstörung der Leberzellen spielt. Die Tatsache, dass die Mehrzahl der mit HCV infizierten Patienten chronisch wird, zeigt, dass das Vorhandensein von cytotoxischen Anti-HCV-T-Lymphocyten für die Vernichtung des Virus nicht ausreicht. Obwohl die T-Lymphocyten CD8 in großer Anzahl in den entzündeten Infiltraten vorhanden sind, bleibt ihre Rolle beim Schutz vor dem Virus und gleichzeitig bei der Zerstörung des Lebergewebes unklar. Patienten mit einer hohen Aktivität der cytotoxischen Anti-HCV-T-Lymphocyten haben sicher eine geringere Virämie, aber auch einen erhöhten Gehalt an Transaminasen und entwickeln eine aktivere Erkrankung (Nelson, D.R. et al., J. of Immunol., 158, 1 473 (1997)). Umgekehrt weisen Patienten mit einer starken Anti-HCV-CD4-Antwort weniger häufig klinische und histologische Anzeichen von Lebererkrankungen auf. Demzufolge ist das Gleichgewicht zwischen viraler Clearance und Leberzerstörung stark mit der Aktivität verbunden, die die für das HCV spezifische T-Lymphocyten-CD4- und -CD8-Populationen in der Leber betrifft.
Bei einem chronisch mit HCV infizierten Patienten hatte die Verminderung der T-Lymphocyten CD8 durch monoklonale Anti-CD8-Antikörper vorteilhafte Effekte (Kiefersauer, S. et al., J. of Immunol., 159, 4046 (1997)). Nach dieser Behandlung waren die Transaminasen stark gesenkt und war die Leberentzündung abgeschwächt und die proliferative Antwort auf die Antigene des HCV wiederhergestellt. Tsai et al. haben auch gezeigt, dass die in-vitro-Verminderung der T-Lymphocyten CD8 aus peripherem Blut eine proliferative Antwort auf die Antigene des HCV ermöglichte (Tsai et al., J. Hepatol., 21, 403 (1993)).
Die proliferative Antwort ist ein bestimmendes Element der viralen Clearance in der akuten Infektionsphase, und eine starke T-CD4-Antwort geht mit der Vernichtung des Virus einher. Diese Antwort ist bei Patienten, die sich zur Chronizität entwickeln oder klinische Anzeichen einer Chronizität zeigen (Diepolder, H. et al., Lancet, 346, 1006 (1995)), schwach oder fehlt ganz.
Der Maus-Tierversuch für die chronische Infektion mit dem LCM-Virus ähnelt in bestimmten Aspekten der chronischen Infektion mit dem HCV. In diesem Tierversuch können die T-Lymphocyten CD8 nicht nur die Vernichtung des LCM-Virus beeinträchtigen, sondern sie machen außerdem die Tiere unfähig, gegen eine neue VSV-Infektion zu kämpfen (Dunlop, M. und Blanden, R., J. Exp. Med., 145, 1131 (1977) und Odermatt, B. et al., Natl. Acad. Sci. USA, 88, 8252 (1991)). Die Verminderung der T-Lymphocyten CD8 durch monoklonale Anti-CD8-Antikörper geht mit einer vollständigen Wiederherstellung der Immunantwort auf das VSV einher (Leist, T.P., E. Ruedi und R.M. Zinkernagel, J. Exp. Med., 167, 1749 (1988)). Außerdem können die cytotoxischen T-Lymphocyten die infizierten Zellen wie die das Antigen aufweisenden Zellen, die T-Lymphocyten und die B-Lymphocyten, welche die neutralisierenden Antikörper produzieren, die für die Entwicklung einer Schutzantwort wesentlich sind, zerstören (Odermatt, B. et al., Natl. Acad. Sci. USA, 88, 8252 (1991) und Leist, T.P., E. Ruedi und R.M. Zinkernagel, J. Exp. Med., 167, 1749 (1988)).
Die Modifizierung der Anti-HCV-CD8-Aktivität könnte somit eine gute Strategie sein, um die Entwicklung einer schützenden humoralen Immunität zu begünstigen.
2. Klinische Fälle
Die tiefgreifenden Modifizierungen der cytotoxischen T-CD8-Antwort eröffnen einen neuen Therapieweg für chronische Infektionen mit nicht-cytopathogenen Viren. Das Beispiel LCM-Virus zeigt, dass die Anwendung von Ritonavir bei der chronischen Infektion mit dem Hepatitis-C-Virus zu einer Verringerung der cytotoxischen Antwort und der immunpathologischen Wirkungen mit vorteilhaften klinischen Folgen führen müsste.
Ein drogensüchtiger Patient wurde wegen einer Doppelinfektion mit HIV und HCV beobachtet, die 1986 festgestellt worden war, aber zweifellos älter als dieses Datum war. Die Entwicklung der HIV-Infektion erfolgte langsam mit einer etablieren Virämie von etwa 4logHIV RNA-Kopien/ml. Der Gehalt an T-Lymphocyten CD4 war mit einer ersten opportunistischen Lungeninfektion gesunken. Die HCV-Virämie schwankte um 5 bis 6logHCV RNA-Kopien/ml und der Serumgehalt an Transaminasen war moderat erhöht (das 2- oder 3fache des normalen Wertes). Ein Inhibitor der Proteasen des HIV, Ritonavir, wurde in die Therapie des Patienten eingeführt und seither verfolgt. Die HIV-Virämie wurde in den zwei Monaten, die auf den Behandlungsbeginn folgten, nicht nachweisbar, wonach das vorhergehende Niveau ab dem vierten Monat erreicht wurde. Der Gehalt an T-Lymphocyten CD4 war während dieses Zeitraums erhöht und erhöhte sich weiter, selbst nach dem Wiederauftreten der HIV-Virämie. Dafür wurde die HCV-Virämie im 7. Monat nach Einführung von Ritonavir (7) negativ und blieb es die zwei Jahre danach.
3. Retrospektive Studie der Entwicklung der Infektion mit HCV bei Aids-Patienten, die mit Ritonavir oder Indinavir behandelt wurden
Bei mit HIV-1-infizierten Patienten kann die Wirkung von Ritonavir auf die Immunantwort aus dessen antiretroviraler Aktivität, der Verringerung der Aktivität der cytotoxischen T-Lymphocyten (CTL) und der Immunerkrankung resultieren. Eine retrospektive Untersuchung von Patienten, die mit HCV und HIV coinfiziert waren, wurde durchgeführt, um die virale Belastung mit HCV, die Leberfunktion und den Gehalt an Anti-HCV-Antikörpern bei Patienten, die Ritonavir und Saquinavir oder Indinavir die ersten vier Monate der Therapie erhielten, zu vergleichen. Die beteiligten Patienten (41) hatten eine chronische HCV-Infektion, die durch das Vorhandensein von Anti-HCV-Antikörpern und von Serum-HCV-RNA, detektiert durch RT-PCR, nachgewiesen worden war. 18 Patienten erhielten Ritonavir allein (600 mg zweimal pro Tag), drei erhielten Ritonavir und Saquinavir (800 mg pro Tag) und 20 erhielten Indinavir (800 mg dreimal pro Tag). Die Kontrollpopulation bestand aus 105 Patienten ohne nachweisbare Anti-HCV- oder Anti-HBV-Antikörper und ohne opportunistische Infektion, erhielten aber Ritonavir das erste Mal wenigstens vier Monate lang.
Anfänglich zeigten die coinfizierten Patienten die klinischen Symptome, eine virale HIV-Belastung und ein Auszählen von T-Lymphocyten und ähnlicher biologischer Werte. Eine moderate Lebercytolyse existierte bei beiden Gruppen (87 +/– 61 IU/l für Indinavir und 54 +/– 28 IU/l für Ritonavir). Die viralen HCV-Belastungen und die genotypische HCV-Verteilung zwischen den beiden Gruppen waren ähnlich. Bei den infizierten Patienten erhöhten sich die ALAT-Konzentrationen häufiger bei denjenigen, die Ritonavir einnahmen (57 %: 12/21 Patienten) als bei denjenigen, die Indinavir nahmen (10 %: 2/20 Patienten, p < 0,002). In der Ritonavir-Gruppe konnte ein Konzentrationspeak ALAT im dritten Monat mit einem mittleren Maximalwert von 418 IU/l (Standardabweichung: 96–1570) beobachtet werden.
In der Kontrollpopulation wurde eine Erhöhung der Konzentrationen von ALAT nur bei 12 Patienten von 105 beobachtet (11,4 %, p = 10^–6), was zeigt, dass die sehr hohe Häufigkeit von Patienten, die mit HCV infiziert waren und an einer cytolytischen Hepatitis während der Behandlung mit Ritonavir litten, nicht mit der Toxizität des Arzneimittels verbunden ist, sondern aus dessen Wirkung auf die mit HCV infizierten Zellen, entweder direkt oder durch Modifizierung der Immunantwort, resultiert.
In Tabelle 1 ist ein Vergleich der biologischen Marker von mit HCV infizierten Patienten mit oder ohne Transaminasenerhöhung während der Behandlung mit Ritonavir (Gruppe I bzw. II) und bei Patienten, die ohne Erhöhung von ALAT mit Indinavir behandelt worden waren (Gruppe III) gezeigt.
Aufgrund der kleinen Anzahl von Patienten wurden statistische Berechnungen mit der Gruppe IV nicht durchgeführt. Dabei handelte es sich um zwei Patienten mit einer cytolytischen Hepatitis, die mit einer beträchtlichen Erhöhung der viralen HCV-Belastung einherging (+3,57log₁₀RNA-Kopien/ml bei einem Patienten und +0,5log₁₀RNA-Kopien/ml bei dem zweiten Patienten).
Die Schwankungen der HCV-RNA-Konzentrationen und der Antikörperindizes wurden an konservierten Serumpaaren gemessen (10 Paare in Gruppe I, 6 in Gruppe II, 10 in Gruppe III und 2 in Gruppe IV). Die Seren wurden zu Beginn und in den Wochen 6,8 und 7,2 für die Gruppe I bzw. III (p >0,2) gewonnen. Die HIV-RNA- und HCV-RNA-Konzentrationen sind in Form von log₁₀RNA-Kopien/ml und die Auszählungen der T-Lymphocyten in Form von Zellen/mm³ dargestellt. Die ALAT-Konzentrationen sind in Internationalen Einheiten/l angegeben.
Die Anti-HCV-Antikörper wurden mit der Version 3.0 des Systems Axsym VHC (Abott) bestimmt, und die Veränderungen der Gehalte an Anti-HCV-Antikörpern des Serums von Patienten (Ac-Index) wird als das Verhältnis der optischen Dichten angegeben.
Die Veränderungen der viralen HIV-Belastung und der Auszählung der T-Lymphocyten waren bei den drei Gruppen I, II und III ähnlich. Die virale HCV-Belastung war bei allen Gruppen mit +0,61log₁₀RNA-Kopien/ml für Gruppe I, verglichen mit +0,41log₁₀RNA-Kopien/ml in Gruppe III (p <0,1) und +0,22log₁₀Kopien/ml in Gruppe II (p = 0,065), erhöht. Eine Erhöhung der Produktion von Anti-HCV-Antikörpern wurde nur bei Gruppe I (p < 0,05 zwischen den Gruppen I und III) beobachtet.
So war der Antikörpergehalt nur bei den Patienten erhöht, die während der Therapie mit Ritonavir eine Cytolyse aufweisen. Keine Erhöhung der Antikörpergehalte wurde mit Indinavir festgestellt, selbst wenn eine starke Erhöhung der HCV-Virämie beobachtet worden war, was zeigt, dass eine übermäßige Antigen-Stimulation nicht ausreicht, um die humorale Anti-HCV-Antwort zu stimulieren. Die Verbesserung der vorzeitigen humoralen Antwort während einer Behandlung mit Ritonavir kann die Folge der Modifizierung der CTL-Aktivität sein, da während den Infektionen mit dem HBV und LCM-Virus gezeigt worden ist, dass die antiviralen cytotoxischen T-Lymphocyten die neutralisierende Antikörper produzierenden B-Lymphocyten lysieren (Planz et al., Nature, 382, 726–729 (1996) und Barnaba et al., Nature, 345, 258–260 (1990)).
Die vorübergehende Lebercytolyse, die einige Tage nach dem Beginn der Behandlung mit Ritonavir bei den Patienten beobachtet wurde, die eine Hepatitis C erworben hatten, kann somit aus einer Erleichterung der Apoptose der mit HCV infizierten Leberzellen resultieren. Diese Beobachtung eröffnet den Weg für die Verwendung dieser Moleküle (Ritonavir und Saquinavir) zur Modifizierung der Apoptose. Tabelle I: Veränderungen der biologischen Werte bei Gruppen von mit HCV infizierten Patienten, die entsprechend dem verwendeten Inhibitor der Protease des HIV-1 und der Lebercytolyse klassifiziert wurden.

N = Anzahl Personen pro Gruppe
RTN und IDN bedeuten Ritonavir bzw. Indinavir

Claims

Verwendung mindestens einer Verbindung, welche die Protease des humanen Immunschwächevirus (HIV) inhibiert und aus Ritonavir, Saquinavir oder deren pharmazeutisch verträglichen Salzen ausgewählt ist, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger zur Herstellung eines Arzneimittels für die Verhütung und/oder Behandlung einer Infektion mit dem Hepatitis-C-Virus.
Verwendung nach Anspruch 1, bei welcher das Arzneimittel in Form einer Zusammensetzung für die orale Verabreichung vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 1, bei welcher das Arzneimittel in Form einer Zusammensetzung für die parenterale Verabreichung vorliegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei welcher das Arzneimittel 1 bis 2 000 mg der die HIV-Protease inhibierenden Verbindung enthält.
Verwendung nach Anspruch 4, bei welcher das Arzneimittel 100 bis 1 500 mg der die HIV-Protease inhibierenden Verbindung enthält.