DE69926535T2

DE69926535T2 - Behandlung von erkrankungen mit zystenbildung

Info

Publication number: DE69926535T2
Application number: DE69926535T
Authority: DE
Inventors: F. George SCHREINER; Alison Joly; Tyler R. White
Original assignee: Scios LLC
Current assignee: Scios LLC
Priority date: 1998-12-18
Filing date: 1999-12-15
Publication date: 2006-03-30
Anticipated expiration: 2019-12-16
Also published as: DE69926535D1; US20030008864A1; US6380183B1; ATE300947T1; EP1140106A1; AU2185000A; ES2246588T3; WO2000037085A1; EP1140106B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung von Erkrankungen, die mit Zystenbildung wie beispielsweise polyzystische Nierenerkrankung einhergehen. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls verschiedene endogene und exogene Liganden eines Benzodiazepinrezeptors vom peripheren Typ und insbesondere deren Verwendung bei der Vorbeugung oder Behandlung der Zystenbildung.
Hintergrund der Erfindung
A. Erkrankungen, die mit Zystenbildung einhergehen
Es gibt mehrere menschliche Erkrankungen, die zur Bildung von Zysten führen, die entweder halbfestes oder flüssiges Material enthalten. Bösartige Zysten können zum Beispiel in den Eierstöcken, der Milz, den Lungen, der Niere und der Leber auftreten, wo sie oft erblich sind. Zysten können wie bei der Darmdivertikulose erworben oder wie bei der zystischen Fibrose als sekundäre Folge einer vererbten Erkrankung erworben sein, oder sie können wie bei der polyzystischen Nierenerkrankung direkt vererbt sein, was auch die Leber und das Gehirn betreffen kann.
Nierenzysten treten im Nierenparenchym auf und beginnen als Erweiterungen oder Ausstülpungen von bestehenden Nephronen oder Sammelkanälen oder von den Entwicklungsgegenstücken dieser Strukturen. Nierenzysten enthalten eine Flüssigkeit, die vermutlich von ihrem ursprünglichen Nephron stammt und/oder eine lokale Sekretion darstellt. Sie können erblich sein, in der Entwicklung auftreten oder erworben sein und können in der Cortex, der Medulla oder beiden auftreten und können mit anderen Nieren- oder systemischen Abnormalitäten in Verbindung stehen oder nicht. Weitere Einzelheiten sind beispielsweise in Brenner & Rector, The Kidney, Vierte Ausgabe, 1991, Bd. II, Seite 1657–1659 zu finden.
Die polyzystische Nierenerkrankung (PKD) ist eine Untergruppe der zystischen Nierenerkrankungen, bei denen Zysten über die Kortex und die Medulla beider Nieren verteilt sind. Die PKD ist normalerweise das Kennzeichen einer einzigartigen autosomalen dominanten (autosomale dominante polyzystische Nierenerkrankung, ADPKD) oder einer autosomalen rezessiven (autosomale rezessive polyzystische Nierenerkrankung, ARPKD) Störung, ist aber auch in Verbindung mit einer Vielzahl von klinischen Bedingungen zu finden oder kann zu einem bestimmten Zeitpunkt im Leben eines Patienten mit einer zu Grunde liegenden nicht-zystischen Nierenerkrankung erworben werden. Die PKD ist die am häufigsten anzutreffende erbliche Nierenstörung und ist die Ursache für über 5% von Patienten mit chronischer Hämodialyse.
Die ADPKD ist die häufigste dominant vererbte Nierenerkrankung, die gewöhnlich in der Lebensmitte auftritt, und ist morphologisch gekennzeichnet durch eine massive Zystenvergrößerung, eine moderate interstitielle Infiltration mit mononuclearen Zellen und eine umfangreiche Fibrose. Kennzeichnende Symptome schließen eine Proteinurie, Bauchschmerzen und tastbare Nieren ein, gefolgt von Hämaturie, Bluthochdruck, Pyurie, Uremie und Calculi. Bei etwa 15% der Patienten führen Hirnarterienaneurysmen zum Tod. Die ADPKD wird durch Mutationen bei einem von drei Genen verursacht: PKD1 auf Chromosom 16 ist für etwa 85% der Fälle verantwortlich, wohingegen PKD2 auf Chromosom 4 für etwa 15% verantwortlich ist. Mutationen in dem bisher nicht kartierten PKD3-Gen sind selten. (Reeders et al., Nature 317: 542–544 (1985); Kimberling et al., Genomics 18: 467–472 (1993); Daoust et al., Genomics 25: 733–736 (1995); Koptides et al., Hum. Mol. Genet. 8: 509–513 (1999)).
Die ARPKD ist eine seltene erbliche Erkrankung, die sich normalerweise in der frühen Kindheit klinisch manifestiert, obwohl in vielen Fällen beim Auftreten der ARPKD zu einem späteren Zeitpunkt auch ein Überleben bis ins Erwachsenenalter beobachtet wurde. Die ARPKD wurde zuerst in C57BL/6J-Mäusen untersucht, bei denen sie spontan auftritt (Preminger et al., 7. Urol. 127: 556–560 (1982)). Die cpk-Mutation, das Kennzeichen dieser Erkrankung wurde auf dem Mauschromosom 12 kartiert (Davisson et al., Genomics 9: 778–781 (1991). Das Gen, das für die ARPKD bei Menschen verantwortlich ist, wurde auf Chromosom 6p kartiert. In jüngster Zeit wurde über das genaue Kartieren des Locus der autosomalen rezessiven poyzystischen Nierenerkrankung (PKHD1) berichtet (Mucher et al., Genomics 48: 40–45 (1998)).
Es wurde berichtet, dass Taxol und Taxolderivate die weitere Entwicklung der PKD hemmen und das Überleben von polyzystischen cpk-Mäusen verlängern (Woo et al., Nature 368: 750–753 (1994); PCT-Veröffentlichung WO 94/08041; US-Patent Nr. 5,882,881). Da Taxol insbesondere die Expression von TNF-α in Macrophagen und Lymphocyten induziert, wurde ebenfalls nahegelegt, dass TNF-α zur Behandlung von PKD von Nutzen ist (US-Patent Nr. 5,750,495).
Bei der APKD bleiben die Nierenzysten 30 bis 40 Jahre lang klein. Dann beginnen sie, zu expandieren und ersetzen nach und nach normal funktionierendes Nierenparenchym. Faktoren, die mit der Zystenexpansion einhergehen, schließen den Verlust der epithelialen Differenzierung, eine erhöhte Proliferation und Apoptose, die Sekretion von Chlorid und anderen Ionen in die Zystenflüssigkeit und die Entstehung einer Entzündung um den äußeren Umkreis der Zystenwand ein (Grantham, J. Am. J. Kid. Dis. 28: 788–803 (1996)).
Die Identifizierung der endogenen und exogenen Faktoren, die für die Vorbeugung und Behandlung von Erkrankungen, die mit der Zystenbildung und der Zystenexpansion einhergehen, ist notwendig. Angesichts der Schwere und Häufigkeit des Auftretens von PKD ist es besonders notwendig, therapeutische Mittel zu finden, die für die Vorbeugung und Behandlung dieser Erkrankung nützlich sind.
B. Liganden eines Benzodiazepinrezeptors vom peripheren Typ (PTBR)
Liganden der PTBRs sind seit vielen Jahren bekannt und angstlösende ZNS-Wirkungen von PTBR-Agonisten (z.B. Valium) sind weit bekannt. In Bezug auf Benzodiazepin-Rezeptoren außerhalb des ZNS (PTBR) betreffen die meisten bekannten Aspekte die Rolle solcher Rezeptoren bei der Vermittlung der Muskelentspannung, insbesondere der Entspannung der glatten Muskeln. Man fand heraus, dass sich der Vagustonus nach intravenöser Verabreichung von Diazepam verringert. (Adinoff et al., Psychiatry Research 41: 89–97 (1992)). Es gibt Beweise für die Kontrolle des Herzvagustonus durch Benzodiazepinrezeptoren (DiMicco, Neuropharmacology 26: 553–559 (1987)). Es wurde beschrieben, dass PTBR-Liganden Ro5-4864 und PK 11195, nicht jedoch Diazepam, die Herzfunktion im isolierten arbeitenden Rattenherzmodell unterdrückte (Edoute et al., Pharmacology 46: 224–230 (1993)). Es wurden ebenfalls berichtet, dass Ro5-4864 den Koronarfluss bei einem isolierten perfundierten Langendorf-Rattenherz steigerte, ohne die Herzrate und die Fähigkeit zur Kontraktion der linken Kammer zu beeinflussen. PK 11195 hemmte diese gefäßerweiternde Wirkung nicht (Grupp et al., Eur. J. Pharm. 143: 143–147 (1987)). In einer isolierten Rattenherzpräparation induzierte Diazepam eine vorübergehende negative inotrope Wirkung, gefolgt von einer positiven inotropen Antwort. Die positive inotrope Antwort wurde durch PK 11195 gehemmt (Leeuwin et al., Eur. J. Pharm. 299: 149–152 (1996)). Diazepam erhöhte die Kontraktionskraft bei dem Langendorf-Herzen (Leeuwin et al., Arch. Int. Pharmacodyn. 326: 5–12 (1993)). Es wurde gezeigt, dass Ro5-4864 eine geringe (20%) unterdrückende Wirkung auf die Kontraktionsamplitude (negative inotrope Wirkung) von menschlichen Vorhofstreifen besitzt, die nicht durch PK 11195 gehemmt wurde (Shany et al., Eur. J. Pharm. 253: 231–236 (1994)). Bei einer Herzpräparation eines Meerschweinchens verringerte Ro5-4864 die Dauer des intrazellulären Aktionspotentials und der Fähigkeit zur Kontraktion. Diazepam war weniger wirksam und Clonazepam unwirksam. Die Wirkung von Ro5-4864 wurde durch PK 11195 umgekehrt, nicht aber durch einen spezifischen Antagonisten von ZNS-BZR (Mestre et al., Life Sciences 35: 953–962 (1984)). Das Vorhandensein von PTBR-Bindungsstellen in den Herzen von Hunden und Menschen wurde in vivo durch Positronemissionstomographie unter Verwendung von [¹¹C]-PK 11195 gezeigt (Charmonneau et al., Circulation 73: 476–483 (1986)). Es wurde ebenso berichtet, dass Ro5-4862 und Dipyridamol mit der Bindung von [³H]Diazepam an das Herzgewebe konkurriert. Diazepam potenziert die Wirkung von Adenosin auf isolierte Herz- und glatte Muskeln und die koronare gefäßerweiternde Wirkung von Adenosin bei Hunden. Es gibt Beweise, dass Diazepam möglicherweise durch die Hemmung der Adenosinaufnahme eine ähnliche Wirkung wie Dipyridamol besitzt (Davies und Huston, Eur. J. Pharm. 73: 209–211 (1981)).
In jüngster Zeit wurde gezeigt, dass PTBRs eine Rolle bei Zellwegen spielen, die der Apoptose zugrunde liegen. PTBRs, die auf Mitochondrien exprimiert werden, dienen als Ankopplungsrezeptoren für Bcl₂, ein Protein, das die Apoptose hemmt. Die biologischen Wege bei der Apoptose, die durch PTBR-Liganden-Wechselwirkungen verändert werden, sind nicht genau bekannt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, dass Liganden, die mit PTBRs in Wechselwirkung treten, für die Behandlung von Erkrankungen nützlich sind, die mit Zystenbildung einhergehen, und insbesondere das Fortschreiten der polyzystischen Nierenerkrankung (PKD) zum Nierenversagen verlangsamen oder verhindern und/oder die begleitende Neigung zu Bluthochdruck verlangsamen oder verhindern.
Das Ziel der Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert. Die Erfindung ist für die Behandlung einer Erkrankung, die mit Zystenbildung einhergeht, nützlich, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Liganden eines Benzodiazepinrezeptors des peripheren Typs (PTBR) an einen Patienten, der die Erkrankung hat oder gefährdet ist, sie zu entwickeln. Der Patient ist vorzugsweise ein Säuger, stärker bevorzugt ein Mensch. In einer besonderen Ausführungsform ist die zu behandelnde Erkrankung polyzystische Nierenerkrankung (PKD). In einer bevorzugten Ausführungsform verhindert oder verlangsamt die Verabreichung eines PTBR-Liganden das Fortschreiten der PKD. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform verhindert oder verlangsamt die Verabreichung eines PTBR-Liganden die Entwicklung eines Symptoms der PKD wie beispielsweise Bluthochdruck, der in Verbindung mit PKD steht, das Bluten in die Zyste oder Schmerzen, die in Verbindung mit der Zystenexpansion stehen.
In einem weiteren Aspekt kann die Erfindung für die Behandlung von fortschreitender Niereninsuffizienz verwendet werden, die in Verbindung mit dem Fortschreiten der zystischen Erkrankung steht.
In einem weiteren Aspekt ist die Erfindung für die Behandlung von Bluthochdruck von Nutzen, der eine Begleiterscheinung der polyzystischen Nierenerkrankung (PKD) ist, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Liganden eines Benzodiazepinrezeptors des peripheren Typs (PTBR) an einen Patienten.
In noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Arzneimittel für die Behandlung einer Krankheit, die mit Zystenbildung oder Zystenexpansion einhergeht, umfassend eine wirksame Menge eines Liganden eines Benzodiazepinrezeptors des peripheren Typs (PTBR) in Beimischung von Taxol oder eines Taxolderivats und eines pharmazeutisch verträglichen Trägers.
In allen Aspekten ist die zu behandelnde Erkrankung bevorzugt polyzystische Nierenerkrankung (PKD), wobei sowohl die autosomale dominante polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD) als auch die autosomale rezessive polyzystische Nierenerkrankung (ARPKD) eingeschlossen sind. Die Behandlung schließt spezifisch die Verhinderung und das Verlangsamen des Fortschreitens der Erkrankung ein. Wenn es das Ziel ist, das Fortschreiten der PKD zu verhindern oder zu verlangsamen, kann bei Patienten, die empfänglich für die Erkrankung sind, durch die Identifizierung von Mutationen bei den PKD1-, PKD2- oder PKD3-Genen, die mit der PKD in Verbindung stehen, eine Diagnose getroffen werden.
In allen Aspekten kann der PTBR-Agonist zum Beispiel ein PTBR-Ligand mit einer nativen Sequenz oder ein Fragment oder eine funktionelle Untereinheit davon, ein organisches kleines Molekül oder Peptid, eine Polypeptidvariante oder ein Ligand mit einer nativen Sequenz, ein Antikörper, ein Glycopeptid, ein Glycolipid, ein Polysaccharid, ein Oligosaccharid, eine Nucleinsäure, ein Peptidomimetikum, ein pharmakologisches Mittel oder ein Metabolit davon, eine transkriptionelle oder translationale Kontrollsequenz und ähnliches sein. In ähnlicher Weise kann der PTBR-Antagonist ein Polypeptid, ein organisches kleines Molekül oder Peptid, eine Polypeptidvariante eines Liganden mit einer nativen Sequenz, ein Antikörper, ein Glycopeptid, ein Glycolipid, ein Polysaccharid, ein Oligosaccharid, eine Nucleinsäure, ein Peptidomimetikum, ein pharmakologisches Mittel oder ein Metabolit davon, eine transkriptionelle oder translationale Kontrollsequenz und ähnliches sein. Zum Beispiel schließen PTBR-Antagonisten Polypeptidvarianten eines PTBR-Liganden mit einer nativen Sequenz, Varianten von PTBR mit einer nativen Sequenz, die die Fähigkeit, an einen endogenen Liganden zu binden, beibehalten, denen aber die Fähigkeit fehlt, biologische Aktivität zu vermitteln, anti-PTBR- oder anti-PTBR-Ligand-Antikörper und selektive Inhibitoren der in-vivo-Produktion eines endogenen PTBR-Liganden ein. Die organischen kleinen Moleküle sind ausgewählt aus den chemischen Klassen der Benzodiazepine, Isoquinolin-Carboxamide, Imidazopyridine, 2-Aryl-3-Indolacetamide und Pyrolobenzoxazepine. Ein besonders bevorzugter Agonist ist Ro5-4864, wohingegen PK 11195 ein besonders bevorzugter Antagonist ist.
Die PTBR-Liganden können in Kombination mit einem zusätzlichen Therapeutikum, vorzugsweise mit einem Mittel verabreicht werden, von dem bekannt ist, dass es zur Behandlung der Zielerkrankung oder eines damit verbundenen Zustands von Nutzen ist. Zum Beispiel können die PTBR-Liganden der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem oder mehreren Therapeutika verabreicht werden, die die Abgabe von Membranproteinen an die Zellmembran des behandelten Patienten hemmen. Derartige Mittel schließen zum Beispiel Taxol, Cytochalasin-B, Cytochalasin-D, Phalloidin und Derivate von einem der vorstehend Genannten sowie TNF-α ein. Die PTBR-Liganden können ebenfalls in Kombination mit generischen Inhibitoren des Fortschreitens der Niereninsuffizienz wie Blutdruck senkenden Therapeutika, einschließlich ACE-Inhibitoren, verabreicht werden.
Die Verabreichung kann auf verschiedenen im Stand der Technik bekannten Wegen erfolgen, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, intravenöse, introperitoneale, intraarterielle, subkutane, orale oder intramuskuläre Verabreichung.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt Alignmentdaten, die die cDNA, die das differenziell exprimierte Gen des Benzodiazepinrezeptors des pheripheren Typs der Ratte (P0268) codiert, mit menschlicher cDNA vergleicht, die PTBR entspricht (SEQ ID NO.: 1 und 2).
2 zeigt die Aminosäuresequenz von menschlichem PTBR (SEQ ID NO.: 3).
3 zeigt Alignmentdaten, die die cDNA-Sequenz, die das differenziell exprimierte Gen des Diazepam bindenden Inhibitors (DBI) codiert, mit menschlicher cDNA vergleicht, die DBI entspricht (SEQ ID NO.: 4 und 5).
4 zeigt die Aminosäuresequenz von menschlichem DBI (SEQ ID NO.: 6).
5 zeigt den chemischen Aufbau von ausgewählten PTBR-Liganden, einschließlich PTBR-Agonist Ro5-4864, und Antagonist PK 11195.
6 ist eine graphische Darstellung der Wirkung des PTBR-Agonisten Ro5-4864 auf die Proliferation von menschlichen ADPKD-Zellen. In der Figur stellt „A" Ro5-4864 dar und die folgenden Nummern stehen für die molare Konzentration des Agonisten. Daher bedeutet die Zahl „–12" nach dem „A", dass der Agonist Ro5-4864 in einer Konzentration von 10^–12 M verwendet wurde.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
1. Definitionen
Außer wenn sie anders definiert werden, haben die hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke die gleiche Bedeutung, wie sie vom Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet dieser Erfindung verstanden wird. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2. Ausgabe, J. Wiley & Sons (New York, NY 1994) und March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4. Ausgabe, John Wiley & Sons (New York, NY 1992) sind dem Fachmann ein allgemeines Nachschlagewerk für viele der in der vorliegenden Anwendung verwendeten Ausdrücke.
Der Fachmann wird viele Verfahren und Materialien, die ähnlich oder gleich den hierin beschriebenen sind, erkennen, die in der Praxis dieser Erfindung verwendet werden könnten. In der Tat ist die vorliegende Erfindung keineswegs auf die beschriebenen Verfahren und Materialien beschränkt. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind die folgenden Ausdrücke nachstehend definiert.
Die Ausdrücke „Benzodiazepinrezeptor des pheripheren Typs", „PTBR" und „PTBR-Polypeptid", egal ob diese im Singular oder Plural verwendet werden, werden austauschbar verwendet und umfassen jedes PTBR-Polypeptid mit einer nativen Sequenz. Derartige PTBR-Polypeptide können von einer Vielzahl von Quellen isoliert werden, wie beispielsweise einer Vielzahl von menschlichen oder nicht-menschlichen Gewebenarten, oder können durch rekombinante und/oder synthetische Verfahren hergestellt werden. Alle derartige Polypeptide sind im Rahmen der Definition spezifisch, egal mit welchen Verfahren sie hergestellt wurden, und schließen Varianten davon ein. Somit beziehen sich die Ausdrücke „Benzodiazepinrezeptor des pheripheren Typs", „PTBR" und „PTBR-Polypeptid", egal ob im Singular oder Plural verwendet, auf Rezeptorpolypeptide, die Benzodiazepinmoleküle binden, sich aber von denen unterscheiden, die mit den Benzodiazepinrezeptoren den zentralen Typs assoziieren, und die die gleiche Aminosäuresequenz wie das jeweilige aus der Natur gewonnene Polypeptid besitzen. Derartige PTBR-Polypeptide können von der Natur isoliert oder durch rekominante und/oder synthetische Verfahren hergestellt werden. Der Ausdruck „PTBR" umfasst insbesondere natürlich vorkommende verkürzte oder sekretierte Formen (z.B. eine Sequenz mit einer extrazellulären Domäne) sowie natürlich vorkommende Variantenformen (z.B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich vorkommende allelische Varianten. PTBRs stellen eine Untergruppe der Benzodiazepinrezeptorfamilie dar, die sich außerhalb des zentralen Nervensystems befindet. Kruger et al., in: GABA and Benzodiazepine Receptor Subtypes, Biggio and Costa Hrsg., S. 1–14 (1990) berichten über die Reinigung, die Clonierung und die Expression eines Benzodiazepinrezeptors des peripheren Typs. Die cDNA eines 18 kDa-PTBR-Polypeptids, das ursprünglich im Herzgewebe identifiziert wurde, wurde anschließend von verschiedenen Quellen cloniert, wie Nebennieren von Ratten (Sprenger et al., J. Biol. Chem. 264: 20,415–20,421 (1989); Nebennieren von Rindern (Parola et al., J. Biol. Chem, 266: 14,082–14,087 (1991); einer menschlichen Lymphomzelllinie (Riond et al., Eur. J. Biochem. 195: 305–311 (1991); und einer Leydig-Tumorzelllinie der Maus (Garnier et al., Mol. Pharmac. 45: 201–211 (1993). Dieses 169 Aminosäuren lange Protein besitzt etwa 80% Homologie zwischen den Arten. Verschiedene Zellen, die mit diesen cDNAs transfiziert wurden, zeigten Bindungseigenschaften für PTBR-Liganden Ro5-4864 und PK 11195. Es wurde angenommen, dass PTBR ein multimerer Komplex ist, in dem sich die PK 11195-Bindungsstelle auf der 18 kDa-Untereinheit befindet und die Expression der Benzodiazepinbindung eine weitere Untereinheit benötigt, die als VDAC bezeichnet wird. Ein weiteres 10 kDa-Protein, das mit PTBR assoziiert ist, wurde ebenfalls versuchsweise als weiterer Bestandteil des PTBR-Komplexes identifiziert (vgl. z.B. Zisterer und Williams, vorstehend). Alle diese Polypeptide allein oder in irgendeiner funktionellen Kombination liegen spezifisch innerhalb der Definition von „PTBR". In einer besonderen Ausführungsform hat der Benzodiazepinrezeptor des peripheren Typs die Aminosäuresequenz des menschlichen PTBR (SEQ ID NO.: 3).
Die Ausdrücke „Ligand", „PTBR-Ligand" und „Ligand eines PTBR (mit nativer Sequenz)" sind austauschbar und werden im weitesten Sinne verwendet, um endogene oder exogene Faktoren einzuschließen, die mit einem PTBR in Wechselwirkung treten, einschließlich PTBR-Liganden mit nativer Sequenz und deren Varianten sowie synthetische Polypeptid- oder kleine Molekülliganden. Die „Wechselwirkung" ist als die Fähigkeit definiert, die Funktion eines PTBR zu beeinflussen, und kann, muss jedoch nicht, spezifische Bindung an den PTBR mit nativer Sequenz mit sich bringen. Der Ausdruck „PTBR-Ligand" schließt Antagonisten und Agonisten, wie nachstehend beschrieben, ein.
Der Ausdruck „Ligand mit nativer Sequenz", „PTBR-Ligand mit nativer Sequenz", „Ligand mit nativer Sequenz von PTBR" und grammatikalische Äquivalente davon werden austauschbar verwendet und beziehen sich auf endogene Liganden eines PTBR, die entweder bekannt sind oder nach der vorliegenden Erfindung entdeckt werden. Derartige Polypeptide mit nativer Sequenz können von der Natur isoliert oder durch rekombinante und/oder synthetische Verfahren hergestellt werden. Der Ausdruck „native Sequenz" in Verbindung mit der Bezeichnung eines bestimmten Polypeptids umfasst spezifisch natürlich vorkommende verkürzte oder sekretierte Formen (z.B. eine Sequenz mit extrazellulärer Domäne) sowie natürlich vorkommende Variantenformen (z.B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich vorkommende allelische Varianten der genannten Polypeptide ein.
Der Ausdruck „Antagonist" wird im weitesten Sinne verwendet und schließt jedes Molekül ein, das partiell oder gänzlich eine biologische durch einen PTBR mit nativer Sequenz vermittelte Aktivität blockiert, hemmt oder neutralisiert, indem die Bindung eines Agonisten an den PTBR mit nativer Sequenz verhindert wird, wodurch die biologische Aktivität des durch den PTBR vermittelten Agonisten blockiert wird. In ähnlicher Weise wird der Ausdruck „Agonist" im weitesten Sinne verwendet und schließt jedes Molekül ein, das eine durch einen PTBR vermittelte biologische Aktivität nachahmt und spezifisch die Funktion oder Expression eines PTBR oder die Signalwirkung durch einen PTBR ändert, wodurch eine bereits bestehende biologische Aktivität verändert (erhöht oder gehemmt) wird oder eine neue biologische Aktivität ausgelöst wird.
Die Ausdrücke „Variante" und „Aminosäurenvariante" werden austauschbar verwendet und bezeichnen Polypeptide, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren am N- oder C-Terminus oder irgendwo innerhalb der entsprechenden nativen Sequenz hinzugefügt und/oder ersetzt und/oder deletiert und/oder eingefügt sind und die mindestens eine Aktivität (wie nachstehend beschrieben) des entsprechenden nativen Polypeptids beibehalten. In verschiedenen Ausführungsformen besitzt eine „Variante" eines Polypeptids normalerweise mindestens etwa 75% Aminosäuresequenzidentität oder mindestens etwa 80% Aminosäuresequenzidentität, bevorzugt mindestens etwa 85% Aminosäuresequenzidentität, noch stärker bevorzugt mindestens etwa 90% Aminosäuresequenzidentität und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 95% Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz des entsprechenden nativen Sequenzpolypeptids.
„Sequenzidentität" ist als der Prozentsatz von Aminosäureresten in einer Kandidatensequenz definiert, die zu den Aminosäureresten in einer nativen Polypeptidsequenz nach dem Alignement der Sequenzen und dem Einfügen von Lücken, wenn nötig, identisch sind, um eine maximale Sequenzidentität zu erhalten, wobei konservative Substitutionen als Teil der Sequenzidentität nicht in Betracht gezogen werden.
Der lokale Homologiealgorithmus von Smith und Waterman (Smith et al., Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)) kann eine optimale Alignment von Sequenzen zum Vergleich z.B. durch den Homologiealignment-Algorithmus von Needleman und Wunsch (Needleman et al., J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)), durch das Verfahren der Suche nach Ähnlichkeit nach Pearson und Lipman (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)), durch computergestützes Durchführen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA in dem Wisconsin Genetics Software-Packet, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch Beobachtung durchführen.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die Homologiealignment-Algorithmen, die im BLAST-Programm (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402 (1997)) verwendet wurden, herangezogen werden. Die BLAST-Programmfamilie erlaubt alle Kombinationen von DNA- oder Proteinabfragesequenzen mit Suche in DNA- oder Proteindatenbanken. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung schließen die spezifischen BLAST-Programme, die verwendet werden können, ein: blastp, welches eine Aminosäureabfragesequenz mit einer Proteinsequenzdatenbank vergleicht; blastn, welches eine Nucleotidabfragesequenz mit einer Nucleotidsequenzdatenbank vergleicht; blastx, welches begriffliche sechs-Rahmen-Translationsprodukte einer Nucleotidabfragesequenz (beide Stränge) mit einer Proteinsequenzdatenbank vergleicht; tblastn, welches eine Proteinabfragesequenz mit einer Nucleotidsequenzdatenbank, die dynamisch in alle sechs Leserahmen (beide Stränge) translatiert wurde, vergleicht; und tblastx, welches die sechs-Rahmen-Translationen einer Nucleotidabfragesequenz gegen die sechs-Rahmen-Translationen einer Nucleotidsequenzdatenbank vergleicht. Für das blastn-Programm werden die folgenden Parameter und ihre Standardwerte verwendet: –G: Kosten, um ein Gap zu öffnen, Standardwert = 5; E: Kosten, um ein Gap auszuweiten, Standardwert = 2; –q: Strafe für eine Fehlpaarung in dem blast-Anteil des Durchlaufs, Standardwert = –3; –r: Behlohung für eine Übereinstimmung in dem blast-Anteil des Durchlaufs, Standardwert = 1; –e: Erwartungswert (E), Standardwert = 10,0; –W: Wortgröße, Standardwert ist 11 für blastn, 3 für andere Programme; –v: Zahl der einzeiligen Beschreibungen (V), Standardwert = 100; und –b: Zahl der zu zeigenden Alignments (B), Standardwert = 100.
Am stärksten bevorzugt werden die Werte für den Prozentsatz an Sequenzidentität durch NCBI BLAST 2.0-Software, wie von Altschul et al., (1997), „Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res., 25: 3389–3402 definiert, erzeugt. Die Parameter werden mit Ausnahme der Strafe für eine Fehlpaarung, welche mit –1 festgesetzt wird, auf Standardwerte festgesetzt.
„Aktiv" oder „Aktivität" bedeutet eine qualitative biologische und/oder immunologische Eigenschaft. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung ist eine bevorzugte biologische Aktivität eines PTBR-Antagonisten die Fähigkeit, das Fortschreiten der Zystenbildung oder Zystenexpansion zu verhindern oder zu verlangsamen oder diese zu eliminieren, oder eine Erkrankung, die von der Zystenbildung abhängt oder diese vermittelt, zu behandeln. Noch stärker bevorzugt ist ein PTBR-Antagonist dann biologisch aktiv, wenn er bei der Behandlung von polyzystischer Nierenerkrankung (PKD) wirksam ist.
Der Ausdruck „immunologische Eigenschaft" bedeutet die immunologische Kreuzreaktivität mit mindestens einem Epitop des Referenz-Polypeptidmoleküls (mit nativer Sequenz), wobei „immunologische Kreuzreaktivität" bedeutet, dass das Kandidatenpolypeptid die qualitative biologische Aktivität des Referenz-Polypeptids (mit nativer Sequenz) kompetitiv hemmen kann. Die immunologische Kreuzreaktivität ist bevorzugt „spezifisch", was bedeutet, dass die Bindungsaffinität des immunologisch kreuzreaktiven Moleküls, die für das entsprechende Polypeptid identifiziert wurde, deutlich höher (vorzugsweise mindestens etwa zwei Mal, stärker bevorzugt mindestens etwa vier Mal, am stärksten bevorzugt mindestens etwa sechs Mal höher) als die Bindungsaffinität des Moleküls zu irgendeinem anderen bekannten nativen Polypeptid ist.
Der Ausdruck „polyzystische Nierenerkrankung", „PKD" und „polyzystische renale Erkrankung" werden austauschbar verwendet und beziehen sich auf eine Gruppe von Störungen, die durch eine große Zahl an Zysten, die über dramatisch vergrößerte Nieren verteilt sind, gekennzeichnet sind. Die daraus resultierende Zystenentwicklung führt zur Beeinträchtigung der Nierenfunktion und kann letztendlich zu Nierenversagen führen. „PKD" schließt spezifisch die autosomale dominante polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD) und die autosomale rezessive polyzystische Nierenerkrankung (ARPKD) in allen Stadien der Entwicklung ein, egal welche Ursache ihnen zu Grunde liegt.
Der Ausdruck „behandeln" und „Behandlung" bezieht sich sowohl auf die therapeutische Behandlung als auch auf die prophylaktischen oder vorbeugenden Maßnahmen, wobei es das Ziel ist, eine unerwünschte physiologische Veränderung oder Störung oder die Ausweitung einer solchen Störung wie die Entwicklung von polyzystischer Nierenerkrankung zu verhindern oder zu verlangsamen (reduzieren). Zum Zwecke dieser Erfindung schließen vorteilhafte oder gewünschte klinische Ergebnisse die Linderung von Symptomen, die Verringerung des Ausmaßes der Erkrankung, den stabilisierten (d.h. nicht schlechter werdenden) Krankheitszustand, die Verzögerung oder Verlangsamung des Fortschreitens der Erkrankung, die Verbesserung oder Milderung des Stadiums der Erkrankung und die vorübergehende Besserung (egal ob teilweise oder gänzlich), egal ob nachweisbar oder nicht nachweisbar, ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. „Behandlung" kann außerdem das Verlängern des Überlebens im Vergleich zum erwarteten Überleben ohne Behandlung bedeuten. Diejenigen, die der Behandlung bedürfen, schließen diejenigen, die bereits den Erkrankungszustand oder die Störung haben, sowie diejenigen, die zu dem Erkrankungszustand oder der Störung neigen, oder diejenigen ein, bei denen der Erkrankungszustand oder die Störung verhindert werden soll.
„Chronische" Verabreichung bezieht sich auf die Verabreichung des Wirkstoffs/der Wirkstoffe in einer kontinuierlichen Weise im Gegensatz zu einer akuten Weise, um die gewünschte Wirkung über einen längeren Zeitraum aufrecht zu erhalten.
„Periodische" Verabreichung ist die Behandlung, die nicht aufeinanderfolgend ohne Unterbrechung erfolgt, sondern eher zyklisch ist.
Verabreichung „in Kombination mit" einem oder mehreren weiteren therapeutischen Agentien schließt die gleichzeitige (gemeinsame) und aufeinanderfolgende Verabreichung in jeglicher Reihenfolge ein.
Ein „Patient" ist ein Wirbeltier, vorzugsweise ein Säuger, stärker bevorzugt ein Mensch.
„Säuger" für die Zwecke der Behandlung bezieht sich auf jegliches Tier, das als Säuger klassifiziert ist, einschließlich Menschen, Haustiere, Tiere auf dem Bauernhof, Zoo-, Sport- oder stubenreine Haustiere wie Hunde, Pferde, Katzen, Kühe, usw. Bevorzugt ist der Säuger dabei ein Mensch.
Eine „wirksame Menge" ist die Menge, die ausreicht, um vorteilhafte oder gewünschte klinische Ergebnisse zu erzielen. Eine wirksame Menge kann in einer oder mehreren Verabreichungen verabreicht werden. Zum Zwecke dieser Erfindung ist eine wirksame Menge eines PTBR-Liganden eine Menge, die ausreicht, um die gewünschte Behandlung, wie vorstehend definiert, zu erzielen.
Der Ausdruck „rekombinant", wenn in Bezug auf eine Zelle, ein Tier oder ein Virus verwendet, zeigt an, dass die Zelle, das Tier oder das Virus eine fremde DNA oder RNA codiert. Zum Beispiel exprimieren rekombinante Zellen gegebenenfalls Nucleinsäuren (z.B. RNA), die nicht in einer nativen (nicht-rekombinanten) Form der Zelle gefunden werden.
Der Ausdruck „Antikörper" wird im weitesten Sinne verwendet und deckt spezifisch monoclonale anti-PTBR-Antikörper (einschließlich Agonisten-, Antagonisten- und neutralisierende Antikörper), polyclonale Antikörper, multi-spezifische Antikörper (z.B. bispezifische Antikörper) sowie Antikörperfragmente ab. Die monoclonalen Antikörper schließen spezifisch „chimäre" Antikörper, bei denen ein Teil der schweren und/oder leichten Kette mit den entsprechenden Sequenzen von Antikörpern identisch oder homolog ist, die von einer besonderen Spezies stammen oder zu einer besonderen Antikörperklasse oder -unterklasse gehören, während der Rest der Kette(n) mit den entsprechenden Sequenzen von Antikörpern identisch oder homolog ist, die von einer anderen Art stammen oder zu einer anderen Antikörperklasse oder -unterklasse gehören, sowie Fragmente solcher Antikörper ein, so lang sie die gewünschte biologische Aktivität aufweisen (US-Patent Nr. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851–6855 (1984)). Die monoclonalen Antikörper schließen weiterhin „humanisierte" Antikörper oder Fragmente davon (wie Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere antigenbindene Untersequenzen von Antikörpern) ein, die minimale Sequenzen enthalten, die von nicht-menschlichem Immunglobulin stammen. Größtenteils sind humanisierte Antikörper menschliche Immunglobuline (Empfängerantikörper), bei denen Reste einer CDR des Empfängers durch Reste einer CDR einer nicht-menschlichen Art (Spenderantikörper) wie Maus, Ratte oder Kaninchen mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Fähigkeit ersetzt sind. In manchen Fällen werden die Fv-FR-Reste des menschlichen Immunglobulins durch die entsprechenden nicht-menschlichen Reste ersetzt. Weiterhin können humanisierte Antikörper Reste umfassen, die weder in dem Empfängerantikörper noch in der importierten CDR oder Gerüstsequenz gefunden werden. Diese Modifikationen werden durchgeführt, um die Leistung der Antikörper zu verfeinern und maximieren. Im Allgemeinen wird der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von mindestens einer und typischerweise zwei variable Domänen umfassen, bei denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen denen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen diejenigen einer menschlichen Immunglobulinsequenz sind. Der humanisierte Antikörper wird optimalerweise ebenfalls mindestens einen Teil einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise von einem menschlichen Immunglobulin umfassen. Weitere Details sind in Jones et al., Nature 321: 522–525 (1986); Reichmann et al., Nature 332: 323–329 (1988) zu finden. Der humanisierte Antikörper schließt einen PRIMATIZED^® Antikörper ein, wobei die antigenbindende Region des Antikörpers von einem Antikörper stammt, der durch Immunisieren von Macaque-Affen mit dem Antigen von Interesse produziert wird.
„Antikörperfragmente" umfassen einen Teil eines intakten Antikörpers, bevorzugt die antigenbindende oder variable Region des intakten Antikörpers. Beispiele von Antikörperfragmenten schließen Fab-, Fab'-, F(ab')₂- und Fv-Fragmente; Diabodies; lineare Antikörper (Zapata et al., Protein Eng. 8 (10): 1057–1062 (1995); einzelkettige Antikörpermoleküle; und multispezifische Antikörper, die von Antikörperfragmenten gebildet werden, ein.
II. Arten der Durchführung der Erfindung
A. PTBR-Liganden
Es gibt verschiedene native Polypeptide, die vermutlich als endogene Liganden von PTBR oder als Bestandteile solcher Liganden identifiziert wurden. Ein möglicher endogener Ligand ist der Diazepam-Bindungshemmer (DBI) (Berkovich et al., Mol. Pharmac. 37: 164–172 (1990); Guidotti et al., Nature 257: 533–535 (1978)), ein endogenes 11 kDa großes Polypeptid mit 86 Aminosäuren (Besman et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 4897–4901 (1989). Der gleiche Ligand wird in der Literatur auch als Acyl-Coenzym A bindendes Protein bezeichnet (Knudsen et al., Biochem. J. 26: 513–519 (1989)). Dieser Ligand ist nicht selektiv, da er die selbe Affinität (im μM-Bereich) sowohl für den GABA_A/Benzodiazepin-Rezeptor als auch für PTBR besitzt. Ein kürzeres DBI-Fragment (Fragment 17–50, auch als Trikontetraneuropeptid bezeichnet) ist mehr selektiv für PTBR.
Ein anderer Satz von vermutlichen endogenen Liganden sind die natürlich vorkommenden Porphyrine, von denen berichtet wurde, dass sie eine hohe Affinität für PTBR besitzen (Taketani et al., J. Biochem. 117: 875–880 (1995) und Zisterer und Williams, vorstehend).
Synthetische Liganden von PTBR sind ebenfalls bekannt und gut charakterisiert. Derartige synthetischen Liganden schließen Benzodiazepine wie beispielsweise Ro5-4864 und Clonazepam; Isochinolincarboxamide, z.B. PK 11195 [1-(2-Chlorphenyl)-N-methyl-N-(1-methylpropyl)-3-isochinolincarboxamid] und PK 14105 [(2-Fluor-5-nitrophenyl)-N-methyl-N-(1-methylpropyl)-3-isochinolincarboxamid]; Imidazopuridine, z.B. Alpidem und Zolpidem; und 2-Amyl-3-indoleactamide, z.B. FGIN-1-27; und Pyrolobenoxapine, z.B. NF 182 ein. Die chemischen Strukturen einiger ausgewählter synthetischer PTBR-Liganden sind in 5 gezeigt. Weitere PTBR-Liganden sind im Stand der Technik ebenfalls wohl bekannt und werden beispielsweise diskutiert in Zister und Williams, vorstehend; Anzini et al., J. Med. Chem. 4275 (1996); Cappelli et al., J. Med. Chem. 2910 (1997) (eingeschränkte Konformationsanaloge von Ro5-4864); WO 96/32383 [(2-Phenylpyrimidin-4-yl)(oxy oder amino)acetamid-Derivate]; FR 2,678,269 [1-(4-Chlorphenyl)-2-(1-piperidinyl)ethanol-Derivate]; EP-524,846 [2-(1-Piperidinyl)-2-(6-(3,4-chinolin-2-(1H)-on))-ethanol-Derivate]; FR 2,669,926 (Phenylharnstoff-Derivate); US 5,128,338 und EP 446,141 [Imidazol(1,2-c)chinazolin-Derivate]; US 5,026,711 (4-substituierte Aminochinolin- oder Naphtyridin-3-Carboxylsäure-Derivate); US 4,808,599 und EP 248,734 (Benzothiphen- oder Benzofurancarboxamid-Derivate); und EP 210,084 (Amid- oder Carbamatderivate von (Iso)chinolin und chinazolin).
Die Verwendung von diesen und ähnlichen Liganden, egal ob nativ oder synthetisch, ob bekannt oder nachstehend entdeckt, ist innerhalb des Rahmens dieser Erfindung spezifisch. Bevorzugte Liganden zeigen eine hohe Selektivität für PTBR relativ zu den im Gehirn vorhandenen Benzodiazepin-Rezeptoren (CBR) oder GABA. In kompetitiven Bindungsversuchen ist der Unterschied bei der Bindungsaffinität bevorzugt mindestens das Zehnfache, stärker bevorzugt mindestens das Hundertfache, noch stärker bevorzugt mindestens das Tausendfache.
PTBR-Liganden schließen einen Agonisten und Antagonisten von PTBR ein. Repräsentative PTBR-Agonisten schließen Benzodiazepine, z.B. Ro5-4864 und dessen Derivate ein, während repräsentative PTBR-Antagonisten Isochinolincarboxamide, z.B. PK 11195 und PK 14105 und Derivate davon einschließen.
B. Durchmusterung nach neuen PTBR-Antagonisten und -Agonisten
Der erste Schritt bei der Identifizierung neuer PTBR-Liganden (egal ob Agonisten oder Antagonisten) besteht in der in-vitro-Durchmusterung zur Identifizierung von Verbindungen, die den Rezeptor des peripheren Typs selektiv binden. Eine Rezeptorbindung kann unter Verwendung von Rezeptoren des peripheren Typs und von vom Gehirn stammender Rezeptoren, die von ihrer jeweiligen nativen Quelle isoliert wurden oder mittels rekombinanter DNA-Technik und/oder chemischer Synthese hergestellte wurden, getestet werden. Die Bindungsaffinität der Kandidatenverbindung kann durch direkte Bindung (vgl. z.B. Schoemaker et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 285: 61–69 (1983)) oder durch indirekte, z.B. kompetitive Bindung getestet werden. Bei Experimenten mit kompetitiver Bindung wird normalerweise die Konzentration einer Verbindung, die notwendig ist, um 50% einer anderen an den Rezeptor gebundenen Verbindung zu verdrängen (IC₅₀), als Maß für die Bindungsaffinität verwendet. Der andere Ligand kann irgendeine Verbindung sein, von der man weiß, dass sie PTBR mit hoher Affinität und Selektivität bindet, zum Beispiel PK 11195 oder Ro5-4864.
In einer spezifischen Ausführungsform wird zur Identifikation neuer Liganden DNA, die die Volllängensequenz des menschlichen peripheren Benzodiaepin-Rezeptors (GenBank M36035) codiert, in einen Expressionsvektor cloniert, der einen selektierbaren Marker enthält. Der Vektor wird zum Transfizieren rekombinanter Wirtszellen, z.B. Säugerzellen, z.B. die menschliche embryonische Nierenzelllinie (HEK-293), verwendet. Nach mehreren Selektionsrunden werden stabile Linien, die PTBRs exprimieren, mittels Western-Blot-Verfahren unter Verwendung von Immunreaktivität gegenüber einem Epitopmarker, der mittels Gentechnik in das PTBR-Gen eingebracht wurde, identifiziert. Membranfraktionen werden von den stabil expimierenden Zelllinien in großen Mengen hergestellt und zur HTP-Durchmusterung eingefroren. Die Bestätigung der PTBR enthaltenden Membranfraktionen wird durch Reproduzieren von Bindungskoeffizienten von bekannten radioaktiv markierten Liganden (wie [3H]Ro5-4864) erreicht. Die Durchmusterung nach neuen Liganden wird mittels ihrer Fähigkeit, wirksam mit [3H]Ro5-4864 in kompetitiven Bindungstests zu kompetitieren, durchgeführt. Bindungskoeffizienten können in jeder bekannten Art und Weise, z.B. der Scatchard-Analyse, bestimmt werden.
Es kann auch notwendig sein, zwischen PTBR-Agonisten und -Antagonisten zu unterscheiden. Dies kann in in-vitro- oder in-vivo-Experimenten durch Beobachtung der Antwort einer Zelle nach der Bindung des Liganden an den Rezeptor erreicht werden. Ein Agonist wird eine zelluläre Antwort produzieren, die einen Anstieg oder eine neue Aktivität oder die Hemmung einer bereits auftretenden zellulären Aktivität zur Folge hat. Im Gegensatz dazu wird ein Antagonist keine Wirkung auf die zelluläre Antwort haben und wird vielmehr den Effekt haben, die Bindung von Agonisten an die gleichen Rezeptorstellen zu verhindern. Es kann auch wünschenswert sein, nach Antagonisten in einer Art und Weise zu suchen, dass das Ablesen die Funktion hat, Moleküle zu finden, die den Rezeptor ohne Beeinflussung der Bindungsstelle(n) des (der) nativen Liganden aktivieren. Nach Antagonisten kann in ähnlicher Weise gesucht werden.
Zum Beispiel sind die folgenden Verfahren zur Identifizierung von Antagonisten und Agonisten von PTBR geeignet, die für die Verfahren der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind:

1. Die Proliferation von Nierenepithel-, Fibroblasten- oder glatten Muskelzellen, die von normalen oder polyzystischen Säugernieren (einschließlich menschlicher) stammen.
2. Die Regulierung von induzierter Apoptose in Nierenepithel- oder Fibroblastenzellen, die von normalen oder polyzystischen Säugernieren (einschließlicher menschlicher) stammen.
3. Beobachtung der in-vitro-Bildung von Zysten durch Zellen, die von menschlichen oder nicht-menschlichen Säugern mit polyzystischer Nierenerkrankung stammen.
4. Die Expression eines Phänotyps, der einen Verlust der Differenzierung durch Nierenepithelzellen anzeigt.
5. Veränderungen der Leitfähigkeit von Ionen oder der elektrischen Phänomene, die von der Leitfähigkeit der Ionen abhängen, in Nierenepithelzellen oder instertitiellen Zellen, die von normalen oder polyzystischen Nieren stammen.
6. Modulation der Sekretion von Protein- oder Lipid- oder Kohlenhydratfaktoren, die mit der Expression oder dem Fortschreiten der polyzystischen Nierenerkrankung in Verbindung stehen, einschließlich Cytokine und Lipidfaktoren, die in oder um die Zysten herum hergestellt werden, durch Nierenzellen oder zirkulierende Zellen.

C. Andere PTBR-Antagonisten
Die PTBR-Antagonisten der vorliegenden Erfindung sind nicht auf die PTBR-Liganden beschränkt. Andere PTBR-Antagonisten schließen (1) Varianten eines nativen PTBR, die die Fähigkeit, einen endogenen PTBR-Liganden zu binden, beibehalten, denen aber die Fähigkeit fehlt, eine biologische Antwort zu vermitteln, (2) lösliche Rezeptoren, (3) Antikörper, die spezifisch einen endogenen PTBR-Liganden an seiner oder um seine Rezeptorenbindungsstelle herum binden, so dass sie die Bindung des Liganden an dessen nativen Rezeptor blockieren, und (4) selektive Inhibitoren der in-vivo-Produktion eines endogenen PTBR-Liganden wie transkriptionelle Regulatoren der in-vivo-Expression eines endogenen PTBR-Liganden ein. Ein anderer bevorzugter PTBR-Antagonist ist ein bioorganisches Molekül, normalerweise eine oral aktive Verbindung, die auf synthetischen und/oder Molekül modulierenden Studien beruht und eine Wechselwirkung zwischen einem nativen PTBR-Rezeptor und seinem endogenen Liganden verhindern kann. Solche PTBR-Antagonisten können unter Verwendung der selben Art von Test, wie vorstehend diskutiert, identifiziert werden.
D. Verfügbarkeit von PTBR-Antagonisten und -Agonisten
Die PTBR-Antagonisten und -Agonisten der vorliegenden Erfindung können kleine Moleküle, z.B. organische Verbindungen oder Peptide sein, die mittels bekannter chemischer Synthesetechniken synthetisiert werden können. Einige PTBR-Antagonisten oder -Agonisten sind Polypeptide, z.B. PTBR-Liganden mit nativer Sequenz, oder Fragmente, Varianten oder Derivate davon, und können mittels rekombinanter DNA-Technik, chemischer Synthese oder einer Kombination dieser oder ähnlicher Techniken hergestellt werden. Einige PTBR-Agonisten oder -Antagonisten sind im Handel erhältlich, z.B. von Hoffmann-La Roche AG (Nutley, NJ) und Synthelabo (Frankreich).
Die PTBR-Liganden, entweder Agonisten oder Antagonisten, der vorliegenden Erfindung können ebenfalls Agonisten- oder Antagonistantikörper für PTBR sein. Verfahren zur Herstellung von polyclonalen Antikörpern sind im Stand der Technik bekannt. Polyclonale Antikörper können in einem Säuger, z.B. mit einer oder mehreren Injektionen eines immunisierenden Mittels und, wenn gewünscht, einem Adjuvans synthetisiert werden. Typischerweise wird das immunisierende Mittel und/oder das Adjuvans in den Säuger mit mehreren subkutanen oder intraperitonealen Injektionen injiziert. Es kann nützlich sein, das immunisierende Mittel an ein Protein zu konjugieren, von dem man weiß, dass es in dem immunisierten Säuger immunogen ist, wie beispielsweise Serumalbumin oder Sojabohnentrypsininhibitor. Beispiele von Adjuvantien, die verwendet werden können, schließen komplettes Freundsches Adjuvans und MPL-TDM ein.
Gemäß einem Ansatz können monoclonale Antikörper unter Verwendung von Hybridomverfahren wie beispielsweise die, die von Köhler und Milstein, Nature 256: 495 (1975) beschrieben wurden, hergestellt werden. In einem Hybridomverfahren wird eine Maus, ein Hamster oder ein anderes geeignetes Wirtstier typischerweise mit einem immunisierenden Mittel immunisiert, um Lymphocyten hervorzurufen, die Antikörper produzieren oder produzieren können, die spezifisch an das immunisierende Mittel binden werden. Alternativ können die Lymphocyten in vitro immunisiert werden. Generell werden entweder periphere Blutlymphocyten („PBLs") verwendet, wenn Zellen menschlichen Ursprungs erwünscht sind, oder es werden Milzzellen oder Lymphknotenzellen verwendet, wenn nicht-menschliche Säugerquellen erwünscht sind. Die Lymphocyten werden anschließend mit einer immortalisierten Zelllinie unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittel wie Polyethylenglycol zur Bildung einer Hybridomzelle fusioniert (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986), Seiten 59–103). Immortalisierte Zelllinien sind normalerweise transformierte Säugerzellen, insbesondere Myelomzellen von Nagetier-, Rinder- und menschlichem Ursprung. Normalerweise werden Myelomzelllinien von Ratten oder Mäusen verwendet. Die Hybridomzellen können in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet werden, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder das Überleben der nicht fusionierten, immortalisierten Zellen hemmen. Bevorzugte immortalisierte Zelllinien sind diejenigen, die wirksam fusionieren, einen stabilen hohen Antikörperexpressionsspiegel durch die ausgewählten Antikörper produzierenden Zellen unterstüzen und empfindlich gegenüber einem Medium wie HAT-Medium sind.
Das Kulturmedium, in dem die Hybridomzellen gezüchtet werden, kann dann auf das Vorhandensein von monolclonalen Antikörpern untersucht werden, die gegen den speziellen verwendeten PTBR gerichtet sind. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität der von den Hybridomzellen produzierten monoclonalen Antikörper mittels Immunpräzipitation oder eines in-vitro-Bindungstests wie eines Radioimmuntests (RIA) oder eines enzymverbundenen Immunadsorptionstests (ELISA) bestimmt. Derartige Techniken und Tests sind im Stand der Technik bekannt. Die Bindungsaffinität des monoclonalen Antikörpers kann zum Beispiel durch die Scatchard-Analyse von Munson und Pollard, Anal. Biochem. 107: 220 (1980) bestimmt werden.
Nachdem die gewünschten Hybridomzellen identifiziert sind, können die Clone durch Grenzverdünnungsverfahren subcloniert und mittels Standardverfahren gezüchtet werden (Goding, vorstehend). Für diesen Zweck geeignete Kulturmedien schließen zum Beispiel Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium und RPMI-1640-Medium ein. Alternativ können die Hybridomzellen in vivo als Aszites in einem Säuger gezüchtet werden.
Die monoclonalen Antikörper, die durch die Subclone sekretiert wurden, können von dem Kulturmedium oder der Aszitesflüssigkeit mittels herkömmlicher Immunglobulinreinigungsverfahren wie zum Beispiel Protein A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie isoliert oder gereinigt werden.
Alternativ können monoclonale Antikörper mittels rekombinanter DNA-Verfahren wie beispielsweise die im US-Patent Nr. 4,816,567 beschriebenen hergestellt werden. DNA, die die erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper codiert, kann einfach unter Verwendung herkömmlicher Verfahren (z.B. unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, die spezifisch an Gene binden können, die die schweren und leichten Ketten von murinen Antikörpern codieren) isoliert und sequenziert werden. Die vorstehend diskutierten Hybridomzellen dienen als bevorzugte Quelle einer derartigen DNA. Nachdem sie isoliert wurde, kann die DNA in Expressionsvektoren eingebracht werden, die dann in Wirtszellen wie COS-Zellen, Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) oder Myelomzellen, die ansonsten kein Immunglobulinprotein produzieren, transfiziert werden, um die Synthese von monoclonalen Antikörpern in den rekombinanten Wirtszellen zu erhalten.
Die Antikörper, einschließlich der Antikörperfragmente wie beispielsweise Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere Antigen bindende Untersequenzen von Antikörpern, können humanisiert sein. Humanisierte Antikörper enthalten minimale Sequenzen, die von einem nicht-menschlichen Immunglobulin stammen. Genauer gesagt werden in humanisierten Antikörpern Reste einer komplementäritätsbestimmenden Region (CDR) eines menschlichen Immunglobulins (Empfänger) durch Reste einer CDR einer nicht-menschlichen Art (Geberantikörper) wie Maus, Ratte oder Kaninchen, die die gewünschte Spezifität, Affinität und Fähigkeit besitzen, ersetzt. In einigen Fällen werden auch Reste der Fv-Gerüstregion des menschlichen Immunglobulins durch die entsprechenden nicht-menschlichen Reste ersetzt. Humanisierte Antikörper können zusätzlich Reste umfassen, die weder im dem Empfängerantikörper noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen gefunden wurden (Jones et al., Nature, 321: 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323–329 (1988)).
Verfahren zum Humanisieren von nicht-menschlichen Antikörpern sind im Stand der Technik wohl bekannt. Im Allgemeinen besitzt ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste, die von einer nicht-menschlichen Quelle in diesen eingeführt wurden. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden oft als „importierte" Reste bezeichnet, die typischerweise von einer „importierten" variablen Domäne stammen. Das Humanisieren kann im Wesentlichen nach dem Verfahren von Winter und Mitarbeitern (Jones et al., Nature, 321: 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323–327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534–1536 (1988)), durch Ersetzen von CDRs oder CDR-Sequenzen von Nagetieren durch die entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durchgeführt werden. Zusätzlich können menschliche Antikörper unter Verwendung verschiedener im Stand der Technik bekannter Verfahren, einschließlich Phagendisplaybibliotheken hergestellt werden (Hoogenboom und Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581 (1991)). Die Techniken von Cole et al., und Boerner et al. stehen ebenfalls für die Herstellung von menschlichen monoclonalen Antikörpern zur Verfügung (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Seite 77 (1985) und Boerner et al., J. Immunol. 147: 86–95 (1991)). In ähnlicher Weise können menschliche Antikörper durch Einfügen von menschlichen Immunglobulinloci in transgene Tiere, z.B. Mäuse, hergestellt werden, in denen die endogenen Immunglobulingene teilweise oder gänzlich inaktiviert sind. Nach der Anregung wird die Produktion des menschlichen Antikörpers beobachtet, die der bei Menschen beobachteten in allen Punkten, einschließlich Umlagerungsgen, Zusammenstellung und Antikörperrepertoire, sehr ähnlich ist. Dieser Ansatz ist zum Beispiel in den US-Patent-Nrn. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016 und in den folgenden wissenschaftlichen Publikationen: Marks et al., Bio/Technology 10, 779–783 (1992); Lonberg et al., Nature 368, 856–859 (1994); Morrison, Nature 368, 812–13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845–51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 826 (1996); Lonberg und Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65–93 (1995) beschrieben.
Die Antikörper können bispezifisch sein, wobei eine Spezifität für PTBR ist und die andere Spezifität für ein anderes Protein wie beispielsweise einen zweiten, verschiedenen PTBR oder ein anderes Epitop des gleichen PTBR oder einen PTBR-Ligand ist.
D. Zusammensetzungen, die PTBR-Agonisten und -Antagonisten umfassen
Die PTBR-Agonisten und -Antagonisten (Liganden und andere) können einem Patienten in einer therapeutisch wirksamen Dosis zur Behandlung (einschließlich der Vorbeugung) einer bestimmten zystischen Erkrankung, z.B. polyzystischer Nierenerkrankung, verabreicht werden. Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich auf die Menge der Verbindung, die ausreicht, um die gewünschte Behandlung zur Folge zu haben.
Die Toxizität und die therapeutische Wirksamkeit solcher Verbindungen kann mittels pharmazeutischer Standardverfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren, z.B. zur Bestimmung der LD₅₀ (die Dosis, die für 50% der Population tödlich ist) und der ED₅₀ (die Dosis, die bei 50% der Population therapeutisch wirksam ist) bestimmt werden. Das Verhältnis der Dosen zwischen toxischer und therapeutischer Wirkung ist der therapeutische Index und kann als Verhältnis LD₅₀/ED₅₀ ausgedrückt werden. Verbindungen, die große therapeutischen Indices besitzen, sind bevorzugt. Während Verbindungen, die toxische Nebenwirkungen besitzen, verwendet werden können, sollte darauf geachtet werden, ein Abgabesystem zu schaffen, das solche Verbindungen zu der Stelle des betroffenen Gewebes transportiert, um eine mögliche Schädigung der nicht infizierten Zellen zu minimieren und dadurch die Nebenwirkungen zu verringern.
Daten, die man von Zellkulturtests und Tierstudien erhalten hat, können zur Formulierung eines Dosierungsbereichs zur Verwendung beim Menschen verwendet werden. Die Dosierung solcher Verbindungen liegt vorzugsweise im Bereich von zirkulierenden Konzentrationen, die den ED₅₀ mit nur geringer oder keiner Toxizität einschließen. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereiches variieren, abhängig von der verwendeten Darreichungsform und dem verwendeten Verabreichungsweg. Für jede in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis anfänglich aus Zellkulturtests geschätzt werden. Eine Dosis kann in Tiermodellen formuliert werden, um einen Bereich einer zirkulierenden Plasmakonzentration zu erzielen, der den IC₅₀ (d.h. die Konzentration der Testverbindung, die eine halb-maximale Hemmung der Symptome erreicht), wie in der Zellkultur bestimmt, einschließt. Solche Informationen können verwendet werden, um nützliche Dosen beim Menschen genau zu bestimmen. Spiegel im Plasma können zum Beispiel durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gemessen werden. Eine typische tägliche Dosis für einen PTBR-Agonisten oder -Antagonisten der vorliegenden Erfindung kann im Bereich von etwa 1 μg/kg bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht des Patienten oder mehr pro Tag liegen, abhängig von den vorstehend genannten Faktoren, bevorzugt bei etwa 10 μg/kg/Tag bis 10 mg/kg/Tag.
Arzneimittel zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindungen können auf herkömmliche Weise unter Verwendung einer oder mehrerer physiologisch verträglicher Träger oder Exzipienten formuliert werden. Daher können die Verbindungen und ihre physiologisch verträglichen Salze und Solvate zur Verabreichung durch Inhalation oder Insufflation (entweder durch den Mund oder durch die Nase) oder zur oralen, bukkalen, parenteralen oder rektalen Verabreichung formuliert werden.
Zur oralen Verabreichung können die Arzneimittel zum Beispiel die Form von Tabletten oder Kapseln annehmen, die auf herkömmliche Weise mit pharmazeutisch verträglichen Exzipienten wie Bindemitteln (z.B. vorgelierte Maisstärke, Polyvinylpyrrolidon oder Hydroxypropylmethylcellulose); Füllmitteln (z.B. Lactose, mikrokristalline Cellulose oder Calciumhydrogenphosphat); Gleitmitteln (z.B. Magnesiumstearat, Talkum oder Siliciumdioxid); Zerfallsmitteln (z.B. Kartoffelstärke oder Natriumstärkeglycolat); oder Benetzungsmitteln (z.B. Natriumlaurylsulfat) hergestellt werden. Die Tabletten können mit im Stand der Technik wohl bekannten Verfahren überzogen werden. Flüssige Zubereitungen zur oralen Verabreichung können zum Beispiel in Form von Lösungen, Sirupen oder Suspensionen vorliegen oder sie können als Trockenprodukt zur Zusammensetzung mit Wasser oder einem anderen geeigneten Träger vor der Verwendung dargereicht werden. Solche flüssigen Zubereitungen können mit herkömmlichen Mitteln mit pharmazeutisch verträglichen Zusatzstoffen wie Suspensionsmitteln (z.B. Sorbitsirup, Cellulosederivate oder gehärtete essbare Fette); Emulgatoren (z.B. Lecithin oder Akazie); nicht-wässrigen Vehikeln (z.B. Mandelöl, ölige Esther, Ethylalkohol oder fraktionierte Pflanzenöle); und Konservierungsstoffen (z.B. Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoate oder Sorbinsäure) hergestellt werden. Die Zubereitungen können ebenfalls, wie es angebracht ist, Puffersalze, Geschmacks-, Farb- oder Süßungsmittel enthalten.
Die Zubereitungen zur oralen Verabreichung können geeigneterweise formuliert werden, um eine kontrollierte Freisetzung der aktiven Verbindung zu erzielen. Zur bukkalen Verabreichung können die Zusammensetzungen in Form von Tabletten oder Pastillen vorliegen, die auf herkömmliche Weise formuliert werden.
Zur Verabreichung durch Inhalation werden die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Verbindungen zweckmäßig in Form einer Aerosolspraydarbietung aus unter Druck stehenden Verpackungen oder einem Zerstäuber unter Verwendung eines geeigneten Treibgases, z.B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder einem anderen geeigneten Gas abgegeben. Im Fall von unter Druck stehendem Aerosol kann die Dosierungseinheit durch Bereitstellen eines Ventils zur Abgabe einer abgmessenen Menge bestimmt werden. Kapseln und Patronen aus z.B. Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator können so formuliert werden, dass sie ein Pulvergemisch aus der Verbindung und einer geeigneten Pulverbasis wie Lactose oder Stärke enthalten.
Die Verbindungen können zur parenteralen Verabreichung durch Injektion, z.B. Bolusinjektion, oder zur kontinuierlichen Infusion formuliert werden. Formulierungen zur Injektion können in Form einer Einheitsdosierungsform, z.B. als Ampullen oder in Mehrfachdosenbehältern, mit zugegebenem Konservierungsmittel vorliegen. Die Zusammensetzungen können solche Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln annehmen und können Formulierungsmittel wie Suspensionsmittel, Stabilisierungsmittel oder Dispersionsmittel enthalten. Alternativ kann der Wirkstoff in Pulverform zur Verbindung mit einem geeigneten Vehikel, z.B. sterilem pyrogenfreiem Wasser, vor Gebrauch vorliegen. Die Verbindungen können ebenfalls in rektalen Zusammensetzungen wie Zäpfchen oder Retentionsklysmen, z.B. solche, die herkömmliche Zäpfchenbasen wie Kakaobutter oder andere Glycerole enthalten, formuliert werden.
Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen auch als Depotpräparat formuliert werden. Derartige Formulierungen mit lang anhaltender Wirkung können durch Implantation (zum Beispiel subkutan oder intramuskulär) oder durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Somit können die Verbindungen zum Beispiel mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Substanzen (z.B. als Emulsion in einem verträglichen Öl) oder Ionenaustauschharzen oder als begrenzt lösliche Derivate, zum Beispiel als begrenzt lösliches Salz, formuliert werden.
Die Zusammensetzungen können, wenn gewünscht, in einer Packung oder in einer Spendervorrichtung vorliegen, die eine oder mehrere Einheitsdosierungsformen mit dem Wirkstoff enthalten können. Die Packung kann zum Beispiel Metall- oder Plastikfolie wie eine Klarsichtpackung umfassen. Die Packung oder die Spendervorrichtung kann von einer Gebrauchsanweisung begleitet sein.
Wenn ein Agonist oder ein Antagonist zusammen mit einem anderen Agonisten oder Antagonisten oder zusammen mit einem anderen Mittel, das eine ähnliche biologische Eigenschaft besitzt, verabreicht wird, können verschiedene Wirkstoffe zusammen in einem geeigneten Trägervehikel formuliert werden, um ein Arzneimittel zu bilden. Die PTBR- Agonisten der vorliegenden Erfindung können zum Beispiel mit anderen Therapeutika kombiniert oder anderweitig zusammen verabreicht werden, die für die Behandlung der Zielerkrankung, z.B. polyzystischer Nierenerkrankung, verwendet werden, einschließlich Taxol und Taxolderivate, TNF-α, blutdrucksenkende Mittel, einschließlich ACE-Hemmer, Therapeutika, die auf Proteinfaktoren oder ihre Rezeptoren abzielen, etc.
E. Gentherapie
Die zystischen Erkrankungen, z.B. die polyzystische Nierenerkrankung, können gemäß der vorliegenden Erfindung auch durch genbasierende Therapien unter Verwendung von entweder ex-vivo- oder in-vivo-Transfer eines Gens, das ein PTBR-Ligandenpolypeptid oder einen anderen Polypeptid-PTBR-Agonisten oder -Antagonisten codiert, behandelt werden. In der ex-vivo-Form der Genabgabe werden die Zellen, die entweder von dem Patienten oder von anderen Quellen stammen, zuerst außerhalb des Körpers durch Einführen eines bestimmten Genes oder von bestimmten Genen modifiziert. Diese modifizierten Zellen werden anschließend in den Körper des Patienten wieder eingeführt, um eine lokale, regionale oder großflächige Verteilung zu erzielen.
Es gibt eine Vielzahl von verfügbaren Techniken zum Einführen von Nucleinsäuren in lebensfähige Zellen. Die Techniken variieren abhängig davon, ob die Nucleinsäure in vitro in gezüchtete Zellen oder in vivo in die Zellen des beabsichtigten Wirts übertragen werden. Techniken, die zum Transfer von Nucleinsäuren in Säugerzellen in vitro geeignet sind, schließen die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Mikroinjektion, Zellfusion, DEAE-Dextran, Calciumphosphatpräzipitationsverfahren, etc. ein. Die derzeit bevorzugten in-vivo-Gentransfer-Techniken schließen die Transfektion mit viralen (typischerweise retroviralen) Vektoren und die Transfektion, die durch virale Hüllproteinliposomen vermittelt wird, ein (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11: 205–210 (1993)). In einigen Situationen ist es wünschenswert, die Nucleinsäurequelle mit einem Mittel zu versehen, das auf die Zielzellen abzielt, wie zum Beispiel ein Antikörper, der für ein Zelloberflächenmembranprotein oder die Zielzelle spezifisch ist, ein Ligand für einen Rezeptor auf der Zielzelle, etc.
Werden Liposomen verwendet, können Proteine, die an ein Zelloberflächenmembranprotein binden, das mit Endocytose in Verbindung steht, zum zielgerichteten Hinführen und/oder zur Erleichterung der Aufnahme verwendet werden beispielsweise Kapsidproteine oder Fragmente davon, die für einen bestimmten Zelltyp tropisch sind, Antikörper für Proteine, die eine cyclische Internalisierung im Kreisprozess durchmachen, und Proteine, die auf einen intrazellulären Ort abzielen und die intrazelluläre Halbwertszeit verbessern. Die Technik der rezeptorvermittelten Endocytose ist zum Beispiel in Wu et al., J. Biol. Chem. 262: 4429–4432 (1987); und Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3410–3414 (1990) beschrieben. Eine Übersicht über die derzeit bekannten Genmarkierungs- und Gentherapieprotokolle findet sich in Anderson et al., Science 256: 808–813 (1992).
Die fortschrittlichsten Technologien zur Verwendung von Nucleinsäuren im Verlauf der Gentherapie verwenden retrovirale Systeme zur Abgabe der Gene in die Zelle (Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 439–443 (1990) und Kasid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 473–477 (1990).
Ein wirksamer Gentransfer in die Niere ist relativ schwierig, insbesondere da die Niere ein strukturell komplexes Organ ist, das einen relativ niedrigen mitotischen Index besitzt. Darüber hinaus ist die architektonische Organisation der Niere für eine korrekte Organfunktion entscheidend. Daher ist eine wirksame Genabgabe an einen bestimmten Zelltyp innerhalb der Niere relativ schwierig zu erreichen. Ein spezifisches Verfahren zum Gentransfer in die Niere ist zum Beispiel im US-Patent Nr. 5,869,230, das am 9. Februar 1999 erteilt wurde, offenbart. Gemäß diesem Ansatz wird ein Vektor, der das genetische Material von Interesse trägt, in das Gefäßsystem der Niere unter Bedingungen eingeführt, die die Infektion der Niere erlauben, jedoch deren ischämische Schädigung, zum Beispiel durch Lagern der Niere bei einer niedrigen Temperatur (z.B. auf Eis) während der Inkubation mit dem Gentransfervektor, verhindern.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, schränken diese jedoch nicht ein. Sämtlichen Referenzen, die innerhalb der Beschreibung einschließlich der Beispiele zitiert werden, sind hierbei ausdrücklich durch Bezugnahme eingeschlossen.
Beispiel 1
Differenzielle Expression von PTBR in einem in-vivo-Modell einer Nierenerkrankung, wie durch Mikroarray-Analyse bestimmt
Das Expressionsprofil von repräsentativen Genen wurde in normalen Geweben und in Geweben, die von Patienten stammen, die unter einer Erkrankung, insbesondere Herz-, Nieren- oder Entzündungserkrankung leiden, untersucht. Die Identifikation der differenziell exprimierten Gene umfasste die folgenden Schritte: (1) Aufbauen von normalisierten und subtrahierten cDNA-Bibliotheken aus mRNA, die von den Zellen oder dem Gewebe von gesunden Tieren und einem Tiermodell der Erkrankung extrahiert wurden; (2) Reinigung der DNA; (3) Durchführen von Mikroarrays der gereinigten DNA zur Expressionsanalyse; und (4) Durchmustern der Mikroarrays zur Identifikation der Gene von den Clonen, die differenziell exprimiert werden, unter Verwendung von markierter cDNA von gesunden und erkrankten Zellen oder Geweben.
(1) In-vivo-Modell der Nierenerkrankung
Als in-vivo-Modell einer Nierenerkrankung wurde ein Rattenmodell einer vererbten Form der autosomalen dominanten polyzystischen Nierenerkrankung (ADPKD) verwendet, basierend auf der Beobachtung, dass sich ADPKD in Han:SPRD-Ratten entwickelt (Kaspareit-Rittinghaus et al., Transplant Proc. 6: 2582–3 (1990); Cowley et al., Kidney Int. 43: 522–34 (1993)). Nierenzysten und Nierenversagen traten bei sechs Monate alten männlichen heterozygoten (Cy/+) Ratten auf, wohingegen Kontrollratten (+/+) keine Anzeichen von Zysten oder Nierenversagen aufwiesen. Fünf erkrankte Tiere (Cy/+) und eine normales Tier (+/+) wurden getötet und die Nieren wurden entnommen.
(2) Herstellung normalisierter und subtrahierter cDNA-Bibliotheken
Poly A+-mRNA wurde von den Nieren normaler und erkrankter Tiere mit im Stand der Technik bekannten Verfahren wie diejenigen, die in Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons (New York, NY 1993) beschrieben sind, isoliert. Große Mengen von Gewebeproben können einfach unter Verwendung von im Stand der Technik wohl bekannten Verfahren wie beispielsweise den Einzelschritt-RNA-Isolierungsverfahren von Chomczynski (U.S.-Patent Nr 4,843,155), das hierbei durch Bezugnahme in seiner Gänze ausdrücklich eingeschlossen ist, weiter verarbeitet werden. Verfahren zur Herstellung von normalisierten cDNA-Bibliotheken sind ebenfalls im Stand der Technik wohl bekannt, vgl. zum Beispiel Soares et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (20): 9228–32 (1994); und Bonaldo et al., Genome Res. 6 (9): 791–806 (1996). Gemäß dem Verfahren nach Bonaldo et al., vorstehend, wurde eine normalisierte Form einer cDNA-Bibliothek von normalem und erkranktem Gewebe hergestellt. Insbesondere wurde poly A+-RNA von den normalen und erkrankten Gewebenproben gereinigt, die durch das vorstehend beschriebene in-vivo-Modell einer Nierenerkrankung bereitgestellt wurden. Zuerst wurde eine gerichtet clonierte cDNA-Bibliothek mittels herkömmlicher Verfahren hergestellt. Kurz gesagt wurde eine doppelsträngige cDNA durch Primen der ersten Strangsynthese zur reversen Transkription unter Verwendung von Oligo-dT-Primern hergestellt, die eine NotI- Restriktionsschnittstelle enthielten. Nach der zweiten Strangsynthese wurden XbaI-Adaptoren zum 5'-Ende der cDNA hinzugefügt, und die cDNA-Größe wurde auf > 500 bp selektiert und in die entsprechenden Restriktionsschnittstellen des Phagemid-Vektors pCR2.1 (Invitrogen, San Diego CA) ligiert.
Aus der gesamten cDNA-Bibliothek wurde dann eine normalisierte Bibliothek hergestellt, wie anderswo genau ausgeführt (Bonaldo et al., vorstehend) und hierin kurz beschrieben. Der Phagemid-Vektor pCR2.1 enthält einen F1-Replikationsursprung. Somit kann die cDNA-Bibliothek als einzelsträngiger Phage mit einem passenden Helfervirus vermehrt werden. Einzelsträngige, kreisförmige DNA wurde aus der Phagenbibliothek extrahiert und dient als „Test"-DNA in dem Hybridisierungsschritt bei der Normalisierung. Der andere Bestandteil der Hybridisierung, die „Antriebs"-DNA wurde aus der Bibliothek durch PCR-Amplifikation unter Verwendung eines Satzes von Primern hergestellt, die für die Region des Vektors spezifisch sind, die die clonierten Insertionen flankiert. Gereinigte Test-DNA (50 ng) und Antriebs-DNA (0,5 μg) wurden in 120 mM NaCl, 50% Formamid, 10 mM Tris (pH 8,0), 5 mM EDTA und 1% SDS kombiniert. Ein Paar von Oligonucleotiden (jeweils 10 μg), die der Polylinkersequenz (gleicher Strang wie Test-DNA) entsprachen, die in dem PCR-Produkt vorhanden ist, wurde in die Hybridisationsreaktion aufgenommen, um das Anlagern verktorspezifischer Sequenzen zu blockieren, die die Test- und die Antriebs-DNA gemein haben.
Das Reaktionsgemisch, das sich unter Öl befand, wurde 3 min bei 80°C erhitzt und die Hybridisierung wurde bei 30°C 24 Stunden lang (berechneter Wert C_ot ''5) durchgeführt. Einzelsträngige, kreisförmige DNA wurde aus dem Reaktionsgemisch mittels Hydroxylapatit (HAP)-Chromatographie gereinigt, in doppelsträngige DNA umgewandelt und in Bakterien mittels Elektroporation eingebracht, um eine normalisierte cDNA-Bibliothek zu schaffen, die Gene repräsentiert, die in dem linken Ventrikel einer Ratte exprimiert werden. Zur Bewertung der Wirksamkeit des Normalisierungsprotokolls wurde die Häufigkeit einiger weniger Clone (ANP, BNP, Actin und Myosin) sowohl in der Ausgangsbibliothek als auch in der normalisierten Bibliothek untersucht. Die Häufigkeit reichlich vorkommender cDNAs (Actin und Myosin) war verringert und entsprach in etwa den seltener vorkommenden cDNA-Clonen (ANP und BNP). Die Clonhäufigkeit in den beiden Bibliotheken wurde mit Standard-Durchmusterungsverfahren durch Immobilisieren von Kolonien auf Nylonmembranen und Hybridisieren mit radioaktiv markierten DNA-Sonden bestimmt.
Bestimmte Gene, die in einem normalen Gewebe nicht exprimiert werden und in erkranktem Gewebe angeschaltet werden, können in einer normalisierten cDNA-Bibliothek, die aus normalem Gewebe hergestellt wurde, nicht vorhanden sein. Um krankheitsspezifische Clone zu erhalten, um sie in dem Mikroarray einzuschließen, kann man das Normalisierungsverfahren, das vorstehend dargestellt wurde, unter Verwendung von erkranktem Gewebe, das von dem geeigneten Erkrankungsmodell erhalten wurde, wiederholen. Da jedoch die meisten Gene zwischen normalem und erkranktem Gewebe gleich exprimiert werden, kann das Mikroarrayverfahren von normalisierten Bibliotheken aus erkranktem und normalem Gewebe einer deutlichen Redundanz führen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Clonredundanz verringert, dennoch erhält man cDNAs, die in dem erkrankten Gewebe sowohl spezifisch als auch wesentlich erhöht exprimiert werden. Um erkrankungsspezifische cDNAs zu erhalten, kann man eine subtrahierte Bibliothek unter Verwendung von Protokollen herstellen, die denjenigen ähnlich sind, die zur Herstellung normalisierter Bibliotheken verwendet werden. Wiederum wird das hierin kurz beschriebene Verfahren von Bonaldo et al., vorstehend, verwendet.
Zur Herstellung einer subtrahierten Bibliothek wird eine gesamte cDNA-Bibliothek aus dem von dem Erkrankungsmodell erhaltenen Gewebe hergestellt. Die cDNA-Bibliothek wird gerichtet in den pCR2.1-Vektor cloniert und eine einzelsträngige Test-DNA wird, wie vorstehend für die Normalisierung einer Bibliothek beschrieben, erhalten. Die Antriebs-DNA wird durch PCR-Amplifikation von clonierten Insertionen aus der gesamten cDNA-Bibliothek hergestellt, die von normalen Nieren hergestellt wurde. Die Hybridisierung tritt zwischen Sequenzen auf, die normale und erkrankte Nieren gemein haben. Für diese subtrahierte Bibliothek wird die Reaktion gründlicher (berechneter Wert C_ot ''27) als bei der Normalisierung unter Verwendung einer größeren Antriebsmenge (1,5 μg im Vergleich zu 0,5 μg) und einer längeren Hybridisierungszeit (48 Stunden im Vergleich zu 24 Stunden) durchgeführt. Reinigung von nicht hybridisierten, einzelsträngigen Zyklen durch HAP-Chromatographie, Umwandlung zu doppelsträngiger DNA und Elektroporation in Bakterien führt zu einer substrahierten cDNA-Bibliothek, die mit Genen angereichert ist, die in erkrankten Rattennieren exprimiert werden.
(3) Mikroarray-Analyse
Ein Mikrotiterplattenprotokoll zur PCR-Amplifikation von DNA und ihrer anschließenden Reinigung wurde aufgestellt, das eine akzeptable Qualität und Quantität von DNA zum Printen auf Mikroarrays für die Verwendung in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bereitstellt. Insbesondere wurden PCR-Primer synthetisiert, die Insertions-DNA von dem Vektor pCR2.1 amplifizieren, der zur Herstellung der Bibliothek verwendet wurde. Nach 30 Amplifikationszyklen wird jedes PCR-Produkt über eine Gelfiltrationssäulegeschick passiert, um nicht eingebaute Primer und Salze zu entfernen. Um die Robustheit zu erhalten, werden Säulen in Filterplatten mit 96 Vertiefungen eingebracht und die Behandlung der Flüssigkeit wird von Robotern durchgeführt. Die Ausbeute pro PCR-Reaktion ist im allgemeinen 2–5 μg, also genug DNA zum Printen von mehreren Hundert Chips.
Um die Qualität der DNA zu testen, die durch dieses PCR-Verfahren hergestellt wurde, wurden 96 gereinigte Proben von einer einzigen Mikrotiterplatte als Mikroarray hergestellt. Unter Verwendung von flüssigkeitshandhabenden Robotern (Biomek 2000, Beckman) wurden 85 μl des PCR-Reaktionsgemischs in jede Vertiefung einer dünnwandigen Platte mit 96 0,2 ml-Vertiefungen aliquotiert. Das Reaktionsgemisch enthielt jeweils 0,2 mM dNTP, 1,25 Einheiten Taq-Polymerase und 1 × Taq-Puffer (Boehringer Mannheim). Primer, jeweils 1 μM, stammen von Vektorregionen, die die Clonierungsstelle von pCR2.1 flankieren und ein primäres 5'-Amin mit einem 6-Kohlenstoff-Linker einschließen, um das Anlagern von DNA-Produkt an die Glasoberfläche des Mikroarraychips zu fördern. 1,0 μl der Bakterienkultur der einzelnen cDNA-Clone wurde in jede Vertiefung zugegeben. PCR-Bedingungen lauten wie folgt: 2 min, 95°C zum Denaturieren, anschließend 30 Zyklen mit 95°C, 30 s/65°C, 40 s/72°C, 1 min 30 s und eine abschließende Verlängerung von 72°C, 5 min unter Verwendung des MJResearch PTC 100-Thermal-Cyclers.
Die PCR-Produkte wurden durch Gelfiltration über Sephacryl 400 (Sigma) gereinigt. Kurz gesagt wurden 400 μl des vorgequollenen Sephacryl 400 in jede Vertiefung einer Filterplatte mit 96 Vertiefungen (PallBiosupport) gegeben und in eine Sammelplatte bei einer Geschwindigkeit von 800 g pro Minute zentrifugiert. Die Vertiefungen wurden 5 Mal mit 0,2 × SSC gewaschen. Die PCR-Reaktiongemische wurden auf die Säule geladen und gereinigte DNA (Durchfluss) wurde bei 800 g eine Minute lang gesammelt. Proben wurden bei 50°C über Nacht getrocknet und als Arrays angeordnet.
Fluoreszierende Sondenpaare wurden durch reverse Transkription von poly A+-RNA unter getrennter Verwendung von Cy3-dCTP und Cy5-dCTP (Amersham) synthetisiert. In 16,5 μl wurden 1 μg poly A+-RNA und 2 μg oligo-dT-21mer bei 65°C 5 Minuten lang denaturiert und bei 25°C 10 Minuten lang angelagert. Eine reverse Transkription wurde 2 Stunden lang bei 37°C mit Superscript RT (Life Technologies, Gaithersburg, MD) in 1 × Puffer, 10 Einheiten RNase-Block, jeweils 500 μM dATP/dGTP/dTTP, 280 μM dCTP, 40 μM Cy5- oder Cy3-dCTP und 200 Einheiten RT durchgeführt. RNA wird in 0,1 M NaOH bei 65°C 10 Minuten lang abgebaut. Markierte cDNA wurde durch aufeinanderfolgende Filtration mit Chroma Spin 30-Spinsäulen (Clontech) gemäß den Angaben des Herstellers gereinigt. Proben wurden bei Raumtemperatur im Dunkeln unter Verwendung einer abgedeckten Speed-Vac getrocknet. Sonden wurden auf den Test-Chip zur Hybridisierung aufgebracht und die Daten wurden im Wesentlichen, wie in Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (20): 106–49 (1996) beschrieben, gesammelt. Die Intensität des Hybridisierungssignals bei jedem Element spiegelte den Expressionsspiegel der mRNA für jedes Gen in dem Rattenventrikel wider. Digitalisierte Signaldaten wurden gespeichert und zur Analyse aufbereitet. Eine Serie von Kontroll-DNA-Elementen wurde auf jedem Chip aufgebracht, um eine Konsistenz beim Markieren und Hybrisidisieren zwischen den Experimenten sicherzustellen und um bei Verwendung von zwei Fluoreszenzkanälen den Ausgleich des Signals zu unterstützen. Für jedes mit zweifach markierten Sonden hybridisierte Element wurde die absolute und die relative Intensität des Signals bestimmt. Die Ergebnisse von diesem und anderen Experimenten zeigen, dass diese Verfahren zur Herstellung von Matrizen-DNA und markierten cDNA-Sonden zur Herstellung von Mikroarrays von hoher Qualität innerhalb einer bevorzugten Ausführungsform der Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Die Auswertung von Zehntausenden von Genen zur Expression erzeugt eine große Menge von Daten, die durch im Handel erhältliche Softwarepakete manipuliert werden können, die den Umgang mit dieser Art und Quantität von Daten erleichtert. Die Expressionsdaten können unter Verwendung dieser Software für jedes Experiment gespeichert, analysiert und sortiert werden. Zusätzlich kann die Expression von jedem Clon von Experiment zu Experiment unter Verwendung von bekannten Methodiken verfolgt werden.
(4) Nachweis von differenziell exprimierten Genen unter Verwendung von Mikroarray-Analyse
Wie vorstehend detailliert offenbart, wurden Sonden auf die Mikroarrays zur Hybridisierung aufgebracht und die Daten, im Wesentlichen wie bei Schena et al., vorstehend beschrieben, gesammelt. Die Intensität des Hybridisierungssignals bei jedem Element spiegelte den Expressionsspiegel von mRNA für jedes Gen wider. Für jedes mit zweifach markierten Sonden hybridisierte Element wird die absolute und die relative Intensität des Signals bestimmt, was auf die relativen Expressionsspiegel der fraglichen Gene übertragen wird. Die erzeugten nummerischen Daten spiegeln den relativen Expressionsspiegel des Gens in dem Erkrankungsstadium im Vergleich zum Expressionsspiegel des Gens im normalen, nicht erkrankten Stadium in den fünf PKD-Erkrankungsmodellen wider, wie vorstehend aufgezeichnet und mittels Mikroarray-Analyse bestimmt. Daten werden als differenzielle Expressionswerte mit positiven Zahlen, die für Gene stehen, die im erkrankten Gewebe im Vergleich zum normalen Gewebe mit einem höheren Spiegel exprimiert werden, und negativen Werten, die für eine niedrigere Expression bei Erkrankung stehen, widergegeben. Während im Allgemeinen Mikroarray-Daten die Durchschnittswerte aus mehreren mit getrennten DNA-Arrays durchgeführten Experimenten sind, wurde im vorliegenden Fall ein Experiment durchgeführt und die RNA wurde von einem Tier (n = 1) erhalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform wurden Clone, die nacharbeitbar in der Mikroarray-Analyse als mindestens etwa zweifach erhöht oder verringert bewertet wurden, auf getrennten sekundären Chips als Mikroarrays angeordnet und ihre Expressionsspiegel wurden bestimmt. Es ist jedoch verständlich, dass differenziell exprimierte Gene, die weniger als etwa eine zweifache Veränderung in der Expression, zum Beispiel eine Veränderung von weniger als eins, halb oder viertel, oder eine Veränderung in der Expression von größer als etwa zweifach, zum Beispiel eine Veränderung von mehr als drei-, fünf-, zehn-, 20-, 100- oder 1000-fach, aufweisen, ebenfalls von Interesse sind.
Unter Verwendung der von dem in-vivo-Nierenerkrankungsmodell erhaltenen cDNA wurden Mikroarrays erzeugt und durchmustert, wie vorstehend beschrieben. Man fand heraus, dass ein Gen, das ursprünglich die Clon-ID-Nr. P0242_B03 besaß und später als das Rattenäquivalent des menschlichen Gens des Benzodiazepin-Rezeptors des peripheren Typs (PTBR) identifiziert wurde, um den Faktor 2 in dem Rattenmodell der polyzystischen Nierenerkrankung (PKD), wie vorstehend beschrieben, im Vergleich zu normalem Nierengewebe überexprimiert wird. Weiterhin fand man heraus, dass das Gen für einen nativen Liganden von PTBR, DBI, um den Faktor –1,9 im erkrankten Nierengewebe im Vergleich zu normalem Gewebe unterexprimiert wird.
(5) Identifikation von differenziell exprimierten menschlichen Genen
Differenziell exprimierte Clone, die von der Mikroarray-Analyse der von dem vorstehend beschriebenen Erkrankungsmodell erhalten wurden, wurden sequenziert und mit bekannten Datenbanken menschlicher Gensequenzen auf Übereinstimmung mit bekannten menschlichen Genen verglichen. 1 zeigt Alignmentdaten, die Nucleotidsequenzen der cDNA, die das differenziell exprimierte Ratten-P0268-Gen codiert, mit der Sequenz der menschlichen cDNA vergleichen, die PTBR entspricht (SEQ ID NO: 1 und 2). 2 zeigt die Aminosäuresequenz des menschlichen PTBR (SEQ ID NO: 3). 3 zeigt Alignmentdaten, die die Nucleotidsequenz der cDNA, die das differenziell exprimierte Ratten-DBI-Protein (nativer PTBR-Ligand) codiert, mit der Sequenz der menschlichen cDNA vergleicht, die DBI entspricht (SEQ ID NO: 4 und 5). 4 zeigt die Aminosäuresequenz von menschlichem DBI.
Beispiel 2
Wirkung eines PTBR-Agonisten auf die Proliferation von menschlichen ADPKD-Zellen
In diesem Experiment wurde die Wirkung von Konzentrationen von 10^–12 bis 10^–6 M des bekannten PTBR-Agonisten Ro5-4864 auf die Proliferationsrate von menschlichen Zellen bei autosomaler dominanter polyzystischer Nierenerkrankung (ADPKD) untersucht.
Epithelzellen von menschlichen ADPKD-Nieren wurden von der Wölbung der Zysten gezüchtet und in Primärkultur durch mehrere Passagen aufrecht erhalten. Diese Zellen wiesen mehrere phänotypische Eigenschaften intakter Zysten auf, einschließlich epithelialer Orientierung, Flüssigkeitssekretion als Antwort auf cAMP-Stimulierung und Zellproliferation, und wurden für Studien zellulärerer Mechanismen der Flüssigkeitssekretion und Zellproliferation verwendet.
Die Rate der Zellproliferation wurde unter Verwendung des Promega-Celltiter 96 MTT Assay-Verfahrens bestimmt. Dieser Test ist eine Modifikation des Tests, der in Mosmann T. 1983 J. Immunol. Meth. 65, 55 beschrieben wurde. Bei diesem Verfahren, das die optische Dichte (O. D.) eines proliferationsabhängigen Reaktionsprodukts (MTT) misst, fand man heraus, dass es direkt mit den direkten Bestimmungen der Zellzahl unter Verwendung von klassischen Hämozytometer-Techniken korreliert. Das Verhältnis zwischen der Zellzahl und der O. D. war linear und r² war > 0,98. Zur Bestimmung der Wirkung von Agonisten auf die Proliferationsrate wurden etwa 4000 Zellen in einzelne Kammern einer Platte mit 96 Vertiefungen gesät. Die Zellen wurden anfangs in DME/F12-Medium gezüchtet, das nur mit Penicillin, Streptomycin, ITS und 1% FBS ergänzt wurde. Nach 24 Stunden wurde das FBS auf 0,002% ohne (ITS) reduziert, um das Wachstum zu stoppen. Diese geringe Menge an Serum war nötig, um die Anbindung der Zellen an die Plastikoberfläche zu potenzieren. Die menschlichen ADPKD-Zellen wurden dann 48 Stunden lang gezüchtet, nachdem cAMP (ein Stimulator der Zellproliferation) in einer Konzentration von 100 μM zugegeben worden war. Eine Kontroll- und eine Forskolingruppe wurden ebenfalls untersucht. Einleitende Studien bestimmten, dass das Wachstum über dieses gesamte Intervall anhielt.
Danach wurde die Wirkung einer Reihe von Konzentrationen von 10^–12 bis 10^–6 des bekannten PTBR-Agonisten, Ro5-4864, auf die Proliferationsrate der PTBR-Zellen, die mit cAMP vorbehandelt oder nicht behandelt waren (Bezugslinen-Proliferation), untersucht. Die Ergebnisse sind in 6 graphisch dargestellt. Jeder in 6 gezeigte Datensatz ist ein Durchschnittswert und wurde von sechs Bestimmungen erhalten. Dementsprechend sind die Ergebnisse statistisch hoch signifikant.
Die Daten zeigen, dass in allen untersuchten Konzentrationen Ro5-4864 eine Wirkung als potenter Inhibitor der Zellproliferation aufwies, der sowohl die basale Zellproliferation als auch die Proliferation von cAMP stimulierten Zellen blockierte. Optische Beobachtung der Zellen unterstützt das Ergebnis, dass der PTBR-Agonist Ro5-4864 durch Stoppen des Zellwachstums und nicht durch Abtöten der Zellen agiert.

Claims

Verwendung eines Liganden eines Benzodiazepinrezeptors des peripheren Typs (PTBR) für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit, die mit Zystenbildung einhergeht, in einem Patienten, der die Krankheit hat oder gefährdet ist, sie zu entwickeln, wobei der PTBR-Ligand eine organische Verbindung ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Benzodiazepinen, Isochinolincarboxamiden, Imidazopyridinen, 2-Aryl-3-indolacetamiden und Pyrrolbenzoxazepinen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Arzneimittel ferner einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Patient ein Säuger ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei der Säuger ein Mensch ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Krankheit die polyzystische Nierenerkrankung (PKD) ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die PKD die autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD) ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die PKD die autosomal rezessive polyzystische Nierenerkrankung (ARPKD) ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Behandlung die Vorbeugung oder Hemmung von Zystenexpansion ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei im Patienten eine Mutation, die mit polyzystischer Nierenkrankheit assoziiert ist, diagnostiziert wurde.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Mutation im PKD1-, PKD2- oder PKD3-Gen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Ligand ein PTBR-Agonist ist.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei der PTBR-Agonist Ro5-4864 ist.
Verwendung nach Anspruch 11 oder 12, wobei der Agonist die Entwicklung von Bluthochdruck verlangsamt oder verhindert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei der Ligand in Kombination mit einem zusätzlichen therapeutischen Agens verabreicht werden soll.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das zusätzliche therapeutische Agens ein Agens ist, das den Transport von Membranproteinen zur Zellmembran des Patienten hemmt.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei das zusätzliche therapeutische Agens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Taxol, Zytochalasin-B, Zytochalasin-D, Phalloidin und einem Derivat der genannten.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei das weitere therapeutische Agens TNF-α ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei das Arzneimittel intravenös, intraperitoneal, intraarteriell, subkutan, oral oder intramuskulär verabreicht werden soll.
Arzneimittel zur Behandlung einer Krankheit, die mit Zystenbildung einhergeht, umfassend eine wirksame Menge eines Liganden eines Benzodiazepinrezeptors vom peripheren Typ (PTBR), wobei der PTBR-Ligand eine organische Verbindung ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Benzodiazepinen, Isochinolincarboxamiden, Imidazopyridinen, 2-Aryl-3-indolacetamiden, und Pyrrolbenzoxazepinen, im Gemisch mit Taxol oder einem Taxolderivat und einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Mittel nach Anspruch 19, wobei die Krankheit eine polyzystische Nierenerkrankung (PKD) ist.
Diagnostisches oder prognostisches in vitro-Verfahren zum Feststellen des Vorliegens oder der Aktivität einer zystischen Krankheit oder der Anfälligkeit für die Entwicklung einer zystischen Krankheit, umfassend das Überwachen einer Änderung des Expressionsniveaus von PTBR oder eines endogenen PTBR-Liganden.
Verfahren nach Anspruch 21, umfassend das Überwachen der Geschwindigkeit der Zystenexpansion.
Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei das Expressionsniveau von PTBR oder des endogenen PTBR-Liganden in einer Biopsieprobe, einer Blutprobe oder einer Urinprobe überwacht wird.