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ERFINDUNGSGEBIET
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Diese
Erfindung betrifft allgemein Verwendungen zur Behandlung von Krebs
und insbesondere Verwendungen zur Behandlung von Krebs unter Verwendung
von Dithiocarbamat.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Krebs,
das unkontrollierte Wachstum bösartiger
Zellen, ist ein sehr grobes Gesundheitsproblem der modernen medizinischen Ära und rangiert
in den USA auf dem zweiten Platz nur nach Herzerkrankung als einer
Todesursache. Während
einige Malignitäten,
wie etwa Adenokarzinom der Brust und Lymphoma, wie etwa Hodgkins-Krankheit,
relativ gut auf gegenwärtige
chemotherapeutische antineoplastische Wirkstoff-Behandlung reagieren,
reagieren andere Krebsarten schlecht auf Chemotherapie, insbesondere
nicht-kleinzelliger Lungenkrebs
und Bauchspeicheldrüsen-,
Prostata- und Darmkrebsarten. Selbst der kleinzellige Krebs der Lunge,
der anfänglich
Chemotherapie gegenüber
empfindlich ist, tendiert dazu, nach Remission mit weit verbreiteter
Metastasenverteilung zurückzukehren,
was zum Tod des Patienten führt.
Daher sind für
diese Krankheit bessere Behandlungsansätze notwendig. Da auch alle gegenwärtig erhältlichen
antineoplastischen Mittel signifikante Toxizität aufweisen, wie etwa Knochenmarkssuppression,
Nierendysfunktion, Stomatitis, Enteritis und Haarverlust, wäre es ein
sehr großer
Vorteil, ein relativ weniger toxisches Mittel zur Verfügung zu
haben, zur Verwendung allein oder in Kombination mit gegenwärtigen Wirkstoffen,
um den Patienten besser zu behandeln, ohne Schaden durch die Therapie
selbst zu riskieren.
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In
jüngerer
Zeit ist gezeigt worden, dass Dithiocarbamate, welche eine reduzierte
Sulfhydryl-Gruppe enthalten, z.B. Pyrrolidindithiocarbamat (PDTC),
die Proliferation von kultivierten, vaskulären, glatten Muskelzellen sowie
kultivierter, kolorektaler Krebszellen inhibieren. Siehe z.B. Tsai
et al., J. Biol. Chem. 271:3667–3670
(1996); Chinery et al., Nature Med. 11:1233–1241 (1997); Chinery et al.,
Cancer Res. 58:2323–2327
(1998). Es ist vorgeschlagen worden, dass Antioxidantien mit einer
reduzierten Sulfhydryl-Gruppe zur Behandlung von kolorektalem Krebs
verwendet werden können.
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Dithiocarbamate,
wie etwa Pyrrolidindithiocarbamat (PDTC) und Diethyldithiocarbamat
(DEDC) inhibieren laut Berichten Apoptose in verschiedenen Zelltypen,
z.B. in Rattenthymocyten und Jurkat T-Lymphocyten, bei Kurzzeit-Inkubationen. Siehe
z.B. Nobel et al., Chem. Res. Toxicol. 10(6):636–643 (1997). In diesem Artikel
wird offenbart, dass Kupfer bei der Inhibierung von Apoptose durch
PDTC und DEDC erforderlich ist. Es wird auch offenbart, dass Thiuramdisulfide,
wie etwa Disulfiram (oxidiertes Disulfid von Diethyldithiocarbamat,
welches keine reduzierte Sulfhydryl-Gruppe enthält) viel potentere Apoptose- Inhibitoren sind
als PDTC oder DEDC. Darüber
hinaus ist, verglichen mit den reduzierten Molekülen, Disulfiram-Inhibierung von Thymocyten-Apoptose
nicht abhängig
von Kupfer.
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In
einem anderen Bericht wird jedoch berichtet, dass bei Langzeit-Inkubierung
mit Ratten-Thymocyten sowohl die reduzierten Dithiocarbamate als
auch ihre Disulfide fähig
sind, Apoptose zu induzieren. Siehe Burkitt et al., Arch. Biochem.
Biophysics 353(1):73–84
(1998). Reduzierte Dithiocarbamate erfordern jedoch Kupfer, während die
Thiuramdisulfid-Induktion von Apoptose durch das Entfernen von Kupferionen
im Wesentlichen nicht beeinflusst wird. Es wird vorgeschlagen, dass
Kupferionen zur Oxidation von Dithiocarbamaten zu Thiuramdisulfiden
erforderlich sind, aber nicht erforderlich sind für die Apoptose
induzierende Wirkung von Thiuramdisulfiden. Siehe Nobel et al.,
J. Biol. Chem. 270:26202–26208
(1995); Burkitt et al., Arch. Biochem. Biophysics 353(1):73–84 (1998).
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Der
antioxidierende Effekt von Disulfiram ist im Fachbereich ebenfalls
untersucht worden. Rao et al., Jpn. J. Cancer Res. 80(12)1171–5 (1989)
untersucht die Wirkung von Disulfiram auf transmammäre Karzinogese-Induktion
in Mäusen
durch Anthracen. Es wird offenbart, dass mit Anthracen assoziiertes
Tumor-Auftreten bei säugenden
Müttermäusen, welche
mit Disulfiram vorbehandelt wurden, geringer ist als bei den unbehandelten.
Es wird vorgeschlagen, dass Disulfiram der Wirkung des karzinogenen
Anthracens entgegenwirken kann, und damit transmammäre Karzinogese
in Mäusen
inhibieren kann.
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Mashiba
et al., Toxicol. Lett. 61(1):75–80
(1992) offenbart, dass die kombinierte Verwendung von Disulfiram
mit dem antioxidierenden Enzym Katalase Inhibierung von Zellproliferation
induziert. Es wird vorgeschlagen, dass die Antiproliferationswirkung
auf die Bildung von Verbindungen oder Metaboliten mit zytostatischer
Aktivität
als ein Ergebnis der Reaktion von Disulfiram mit Katalase zurückzuführen ist.
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Mashiba
et al., Jpn. J. Exp. Med. 60(4):209–14 (1990) untersucht die Rollen
von freien Sauerstoff-Radikalen bei der Inhibierung von Tumorzellen-Proliferation.
Disulfiram wird als ein Metallchelator zum Inaktivieren von Superoxid-Dismutase verwendet.
Ascorbinsäure
wird verwendet, um Katalase zu inhibieren. Es wird offenbart, dass
Meth A-Tumorzellen-Proliferation
bei simultaner Zugabe von Disulfiram und Ascorbinsäure inhibiert
wird. Es wird vorgeschlagen, dass die kombinierte Verwendung von
Disulfiram und Ascorbinsäure
die intrazellulären
freien Sauerstoff-Radikale innerhalb der Tumorzellen erhöht.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Gemäß einem
ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird Verwendung einer wirksamen
Menge eines Thiuramdisulfids und eines Schwermetallions für die Herstellung
eines Medikaments zur Behandlung einer bei einem Säugetier
festgestellten Krebserkrankung bereitgestellt.
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Es
ist entdeckt worden, dass Thiuramdisulfid in Abwesenheit von Katalase
oder Ascorbinsäure
allein potente inhibitorische Wirkung auf festgestellte Tumorzellen aufweist.
Disulfiram ist sogar wirksam bei der Inhibierung des Wachstums von
festgestellten Melanomzellen und nicht-kleinzelligen Lungenkrebszellen, von denen
bekannt ist, dass sie schlecht auf gegenwärtig erhältliche antineoplastische Mittel
reagieren.
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Zusätzlich ist,
im Gegensatz zu den oben diskutierten Lehren des Standes der Technik,
weiter überraschend
entdeckt worden, dass die antiproliferative und antineoplastische
Wirkung von Disulfiram auf festgestellte Tumorzellen Schwermetallionen-abhängig ist.
Ferner kann die Inhibierungswirkung von Disulfiram auf Tumorzellwachstum
signifikant erhöht
werden durch die Zugabe von Schwermetallionen, wie etwa Kupfer-, Zink-,
Gold- und Silberionen, oder eines Schwermetallionen-Stimulanz, z.B.
Ceruloplasmin oder einem Cytokinen, welches eine Akute-Phase-Reaktion in
den Tumorzellen induzieren kann.
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Diese
Erfindung stellt auch Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids
zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von bei einem Patienten
festgestellten Krebs bereit. Vorteilhaft wird ein Tetralkylthiuramdisulfid,
wie etwa Tetraethylthiuramdisulfid, besser bekannt als Disulfiram,
verwendet.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt dieser Erfindung wird Verwendung einer wirksamen
Menge eines Thiuramdisulfids zur Herstellung eines Medikaments zum
Behandeln von bei einem Patienten festgestellten Krebs, vorzugsweise
Disulfiram, und eines Schwermetallions bereitgestellt. In einer
bevorzugten Ausführungsform
wird das Schwermetallion als ein Komplex oder Chelat mit dem Thiuramdisulfid verabreicht.
Geeignete Schwermetallionen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf
Ionen von Arsen, Wismut, Kobalt, Kupfer, Chrom, Gallium, Gold, Eisen,
Mangan, Nickel, Silber, Titan, Vanadium, Selen und Zink. In einer
weiteren bevorzugen Ausführungsform
werden das Thiuramdisulfid und das Schwermetallion in Kombination
mit einem weiteren Anti-Krebs-Mittel verabreicht.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt dieser Erfindung wird Verwendung einer wirksamen
Menge eines Thiuramdisulfids, vorzugsweise Disulfiram, und Ceruloplasmin
für die
Herstellung eines Medikaments zum Behandeln von bei einem Patienten
festgestellten Krebs bereitgestellt.
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Die
aktiven Verbindungen dieser Erfindung können über vielfältige Verabreichungsrouten
verabreicht werden. Beispielsweise können sie oral, intravenös, intradermal,
subkutan oder topisch verabreicht werden.
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Die
vorliegende Erfindung ist wirksam zur Behandlung verschiedener Typen
von Krebs, einschließlich, jedoch
nicht beschränkt
auf Melanome, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, kleinzelligem Lungenkrebs,
Nierenkrebs, kolorektalem Krebs, Brustkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs,
Magenkrebs, Blasenkrebs, Ovarienkrebs, Uteruskrebs, Lymphomen- und
Prostatakrebs. Insbesondere ist die vorliegende Erfindung besonders
wirksam bei der Behandlung von Melanomen, Lungenkrebs, Brustkrebs
und Prostata-Karzinomen.
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Thiuramdisulfide,
wie etwa Disulfiram, sind klinisch über viele Jahre bei der Behandlung
verschiedener anderer Krankheiten, wie etwa Alkoholmissbrauch, verwendet
worden und haben sich als relativ nicht-toxisch und sicher herausgestellt.
(Disulfiram ist als eine orale Formulierung in den USA als Antabuse® von
Wyeth-Ayerst Laboratories, Philadelphia, PA erhältlich.) Damit stellt die erfindungsgemäße Verwendung
von Thiuramdisulfiden eine leicht erhältliche und leicht verwendete
Behandlung für
Krebsarten in Menschen und anderen Säugern bereit.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1A zeigt,
dass Disulfiram Proliferation von M1619 menschlichen Melanom-Zelllinien
inhibiert;
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1B zeigt,
dass der zell-undurchlässige
Cu2+-Chelator Bathocuproindisulfonsäure Wachstumsinhibierung
durch Disulfiram verhindert.
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1C ist
ein schematisches Diagramm, welches zeigt, dass Ergänzung von
Wachstumsmedium mit Kupfer die antiproliferative Aktivität von Disulfiram
verstärkt.
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1D zeigt,
dass Ceruloplasmin als eine Quelle für Kupfer zur Verstärkung der
antiproliferativen Aktivität
von Disulfiram dienen kann.
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2A zeigt
das Ergebnis eines Vergleichsexperiments, in welchem M1619-Melanom-Zellen
mit DMSO-Vehikel behandelt wurden.
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2B zeigt,
dass Apoptose in M1619-Melanom-Zellen, welche mit 5 μM Disulfiram
behandelt wurden, induziert wurde.
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3A zeigt
die flusszytometrische Analyse des Wachstums von unsynchronisierten
M1619-Melanom-Zellen in der Gegenwart von DMSO-Vehikel.
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3B zeigt
die flusszytometrische Analyse von Zellen, welche mit 5 μM Disulfiram
behandelt wurden, welche zeigt, dass Disulfiram die Anzahl von Zellen
in G0-G1 verringert
und den Anteil des Zellzyklus in S-Phase in M1619-Melanom-Zellen erhöht.
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3C zeigt
die flusszytometrische Analyse von Zellen, welche mit 5 μM Disulfiram
plus 250 μg/ml Ceruloplasmin
(Cerulo) behandelt wurden, welche G2-Zell-Zyklus-Arrest
und Apoptose in M1619-Melanom-Zellen induzieren.
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4 zeigt,
dass antiproliferative Aktivität
von Disulfiram nicht durch Stickoxid vermittelt wird.
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5A ist
eine Fotografie einer Western Blot Analyse von Cyclin A Expression
in M1619-Zellen, welche mit DMSO oder Disulfiram behandelt wurden. 5A zeigt,
dass Disulfiram plus Kupfer Expression des Zell-Zyklus-Proteins
Cyclin A verringert.
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5B ist
eine Fotografie eines Gel-Shift-Assays, welches zeigt, dass Disulfiram
und Kupfer Transkriptions-Faktor-Bindung
an das cAMP responsive Element (CRE) inhibieren.
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5C ist
eine Fotografie eines Gel-Shift-Assays, in welchem Disulfiram oder
Disulfiram plus Kupfer direkt zu der Bindungsreaktion zugefügt wurden.
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6A zeigt,
dass Zink die antiproliferative Aktivität von Disulfiram potenziert.
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6B zeigt,
dass die antiproliferative Aktivität von Disulfiram durch Ergänzung des
Mediums mit anderen Schwermetallen verstärkt wird.
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6C zeigt,
dass Komplexe von Disulfiram mit Gold erhöhte antiproliferative Aktivität zeigen.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung wird nun hiernach vollständiger unter Bezugnahme auf
die begleitenden Beispiele beschrieben, in welchen bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung gezeigt sind. Diese Erfindung kann jedoch in vielen
verschiedenen Formen ausgeführt
werden und sollte nicht als auf die hierin aufgeführten Ausführungsformen
beschränkt
angesehen werden; diese Ausführungsformen
sind vielmehr bereitgestellt, damit diese Offenbarung gründlich und
vollständig
ist und den Fachleuten auf diesem Gebiet den Umfang der Erfindung
vollständig
vermittelt.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Thiuramdisulfide" auf Verbindungen mit der Formel:
wobei R
1,
R
2, R
3 und R
4 gleich oder verschieden sind und Wasserstoff,
und unsubstituierte oder substituierte Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-,
Aryl-, Alkoxy- und Heteroaryl-Gruppen bedeuten. Es wird angemerkt,
dass die Alkyl-Gruppen Cycloalkyl- und Heterocycloalkyl-Gruppen
umfassen können.
R
1, R
2 und das N-Atom
in der Formel können
zusammen einen N-heterocyklischen
Ring ausbilden, welcher zum Beispiel Heterocycloalkyl oder Heterocycloaryl
ist. Ähnlich
können
R
3, R
4 und das N-Atom
in der Formel zusammen einen N-heterocyclischen Ring
bilden, welcher zum Beispiel Heterocycloalkyl oder Heterocycloaryl
ist. Typischerweise sind R
1 und R
2 nicht beide Wasserstoff, und sind R
3 und R
4 nicht beide
Wasserstoff. Damit ist Thiuramdisulfid eine Disulfid-Form von Dithiocarbamaten,
welche eine reduzierte Sulfhydryl-Gruppe haben. Viele Dithiocarbamate
sind bekannt und im Fachbereich synthetisiert worden. Nicht einschränkende Beispiele
für Dithiocarbamate
umfassen Diethyldithiocarbamat, Pyrrolidindithiocarbamat, N-Methyl-,
N-Ethyldithiocarbamate, Hexamethylendithiocarbamat, Imadazolindithiocarbamate,
Dibenzyldithiocarbamat, Dimethylendithiocarbamat, Dipropyldithiocarbamat,
Dibutyldithiocarbamat, Diamyldithiocarbamat, N-Methyl-, N-Cyclopropylmethyldithiocarbamat,
Cyclohexylamyldithiocarbamat, Pentamethylendithiocarbamat, Dihydroxyethyldithiocarbamat,
N-Methylglucosamindithiocarbamat
und Salze und Derivate davon. Typischerweise kann ein Sulfhydryl-enthaltendes
Dithiocarbamat oxidiert werden, um ein Thiuramdisulfid zu bilden.
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Es
kann eine jegliche pharmazeutisch akzeptable Form von Thiuramdisulfiden
wie oben definiert verwendet werden. Beispielsweise wird Tetraalkylthiuramdisulfid,
vorzugsweise Tetraethylthiuramdisulfid, welches als Disulfiram bekannt
ist, in dem Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet. Disulfiram hat die folgende Formel:
wobei R
1,
R
2, R
3 und R
4 alle Ethyl sind. Disulfiram ist klinisch
bei der Behandlung von Alkoholmissbrauch verwendet worden, wobei
Disulfiram hepatische Aldehyd-Dehydrogenase inhibiert. Verfahren
zum Herstellen von Thiuramdisulfiden sind allgemein im Fachbereich
bekannt. Beispielhafte Verfahren sind beispielsweise offenbart in
Thorn, et al., The Dithiocarbamates and Related Compounds, Elsevier,
New York, 1962 und US-Patenten Nr. 5,166,387, 4,144,272, 4,066,697,
1,782,111 und 1,796,977.
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Der
Begriff "Krebs behandeln", wie hierin verwendet,
bezieht sich spezifisch auf Verabreichen von therapeutischen Mitteln
an einen Patienten, bei welchem Krebs diagnostiziert wurde, d.h.
Krebs bei einem Patienten festgestellt wurde, um weiteres Wachstum
oder Verbreitung der bösartigen
Zellen in dem Krebsgewebe zu inhibieren und/oder den Tod der bösartigen
Zellen zu verursachen.
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Diese
Erfindung stellt ein Verfahren zum Behandeln von Krebs bei einem
Patienten bereit. Gemäß der vorliegenden
Erfindung ist entdeckt worden, dass Thiuramdisulfide, wie etwa Disulfiram,
das Wachstum von Tumorzellen in einer Schwermetallionen-abhängigen Weise
inhibieren können.
Insbesondere verstärken Schwermetallionen,
wie etwa Kupfer, Zink-, Gold- und Silberionen die inhibierende Wirkung
der Thiuramdisulfide auf Tumorzellen signifikant, während die Verarmung
an solchen Schwermetallionen Wachstumsinhibierung durch Disulfiram
verhindert.
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Dementsprechend
wird gemäß einem
Aspekt dieser Erfindung eine Verwendung zum Behandeln eines festgestellten
Krebses bei einem Patienten bereitgestellt. Einem Patienten, bei
dem Krebs festgestellt wurde, kann Thiuramdisulfid verabreicht werden,
um den Krebs zu behandeln. Vorzugsweise ist das verabreichte Thiuramdisulfid
ein Tetraalkylthiuramdisulfid, wie etwa Tetraethylthiuramdisulfid,
d.h. Disulfiram.
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Unter
einem weiteren Aspekt dieser Erfindung wird Verwendung einer wirksamen
Menge eines Thiuramdisulfids und eines Schwermetallions für die Herstellung
eines Medikaments zum Behandeln von Krebs in einem Patienten bereitgestellt.
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Nicht
einschränkende
Beispiele für
Schwermetallionen umfassen Ionen von Arsen, Wismut, Kobalt, Kupfer,
Chrom, Gallium, Gold, Eisen, Mangan, Nickel, Silber, Titan, Vanadium,
Selen und Zink. Vorzugsweise werden Gold-, Silber-, Zink-, Selen-
und Kupferionen verwendet. Quellen für solche Schwermetallionen
sind dem Durchschnittsfachmann bekannt. Beispielsweise können solche
Ionen in einer Sulfatsalz- oder Chloridsalzform bereitgestellt werden,
oder jeglichen anderen pharmazeutisch geeigneten Formen.
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Es
können
einem Patienten eine oder mehrere Thiuramdisulfid-Verbindungen und
ein oder mehr Schwermetallionen verabreicht werden. Die Thiuramdisulfid-Verbindung und das
Schwermetallion können
in Kombination oder getrennt voneinander verabreicht werden. Vorzugsweise
werden sie als ein Chelat-Komplex verabreicht. Wie im Fachbereich
bekannt ist, sind Thiuramdisulfid-Verbindungen exzellente Chelatbildner
und können
Schwermetallionen als Chelat komplexieren, um Chelate zu bilden.
Herstellung von Chelaten von Thiuramdisulfid-Verbindungen und Schwermetallionen
sind dem Durchschnittsfachmann bekannt. Beispielsweise können Chelate
von Disulfiram und Kupfer-, Zink-, Silber- oder Goldionen ohne Weiteres
synthetisiert werden durch Mischen von Disulfiram mit z.B. CuSO4, ZnCl2, C3H5AgO3 oder
HAuCl4·3H2O in einem geeigneten Lösungsmittel, um zu ermöglichen,
dass Chelate gebildet werden. Andere Thiuramdisulfid-Verbindungs-Schwermetallionen-Chelate
sind beispielsweise offenbart in Burns et al., Adv. Inorg. Chem.
Radiochem. 23:211–280 (1980).
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Gemäß einem
anderen Aspekt dieser Erfindung wird Verwendung einer wirksamen
Menge einer Disulfid-Verbindung und eines intrazellulären Schwermetallionen-Stimulanz
bereitgestellt, welches den intrazellulären Gehalt an den oben beschriebenen
Schwermetallionen in dem Patienten erhöhen kann.
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Es
sind intrazelluläre
Schwermetallionen-Träger
bekannt. Beispielsweise kann dem Patienten Ceruloplasmin verabreicht
werden, um den intrazellulären
Kupfergehalt zu erhöhen.
Andere Schwermetallionen-Träger,
welche im Fachbereich bekannt sind, können gemäß diesem Aspekt der Erfindung
ebenfalls verabreicht werden. Die Schwermetallionen-Träger und
die Thiuramdisulfid-Verbindung können
zusammen oder getrennt und vorzugsweise in getrennten Zusammensetzungen
verabreicht werden.
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Ceruloplasmin
ist ein Protein, welches natürlicherweise
von dem menschlichen Körper
produziert wird und aus menschlichem Serum gereinigt werden kann.
Dieses 132-kD-Glycoprotein,
welches 7 Kupferatome trägt,
welche über
drei 42–45
kD-Domänen
komplexiert sind, ist ein Akute-Phase-Reaktant und das Haupt-Kupfer-tragende
Protein in menschlichem Plasma. Siehe Halliwell, et al., Methods
Enzymol 186:1–85 (1990).
Nach Transport in Zellen können
wenigstens einige der gebundenen Kupferionen für Komplexierung mit der Thiuramdisulfid-Verbindung,
welche dem Patienten verabreicht wurde, zugänglich sein. Percival, et al., Am.
J. Physiol. 258:3140–3146
(1990).
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Ceruloplasmin
kann aus tierischem oder menschlichem Serum isoliert werden. Alternativ
kann genmanipuliertes Ceruloplasmin auch in vitro in, z.B., Bakterien,
Hefe, Pflanzen-, Tier- oder menschlichen Zellen exprimiert und daraus
gereinigt werden. Ceruloplasmin und Thiuramdisulfid werden typischerweise
in unterschiedlichen Zusammensetzungen verabreicht. Thiuramdisulfid
und Ceruloplasmin können
zu etwa der gleichen Zeit oder in einigem zeitlichen Abstand verabreicht
werden. Zum Beispiel kann Ceruloplasmin dem Patienten von etwa fünf Minuten
bis etwa 12 Stunden vor oder nach Thiuramdisulfid-Verabreichung
verabreicht werden.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt dieser Erfindung kann das Verfahren dieser Erfindung
in Kombination mit einer herkömmlichen
Anti-Krebs-Therapie verwendet werden. Zum Beispiel kann das Verfahren
gemäß dieser
Erfindung durch eine herkömmliche
Strahlentherapie oder Chemotherapie ergänzt werden. In einer Ausführungsform
dieser Erfindung umfasst es das erfindungsgemäße Verfahren damit, einem Patienten
eine Thiuramdisulfid-Verbindung und Schwermetalle und ein weiteres
Anti-Krebs-Mittel zu verabreichen.
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Behandlung
durch Ceruplasmin und eine Thiuramdisulfid-Verbindung kann auch zusammen mit der Behandlung
mit einem anderen Anti-Krebs-Mittel durchgeführt werden.
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Jegliche
Anti-Krebs-Mittel, welche im Fachbereich bekannt sind, können in
dieser Erfindung verwendet werden, solange sie pharmazeutisch kompatibel
sind mit den Thiuramdisulfid-Verbindungen,
Schwermetallionen und/oder Ceruloplasmin, welche verwendet werden.
Mit "pharmazeutisch
kompatibel" ist
gemeint, dass das andere Anti-Krebs-Mittel mit der obigen Zusammensetzung
nicht direkt oder indirekt derart wechselwirken oder reagieren wird,
dass die Wirkung der Krebsbehandlung negativ beeinflusst wird oder
irgendeine signifikante, beeinträchtigende
Nebenreaktion bei dem Patienten verursacht.
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Beispiele
für Anti-Krebs-Mittel,
welche im Fachbereich bekannt sind, umfassen Cisplatin, Carmustin, Herceptin,
Carboplatin, Cyclophosphamid, Nitrosoharnstoffe, Fotemustin, Vindesin,
Etoposid, Daunorubicin, Adriamycin, Taxol, Taxoter, Fluorouracil,
Methotrexat, Melphalan, Bleomycin, Salicylate, Aspirin, Piroxicam, Ibuprofen,
Indomethacin, Maprosyn, Diclofenac, Tolmetin, Ketoprofen, Nabumeton,
Oxaprozin, Doxirubicin, nicht-selektive Cyclooxygenase-Inhibitoren,
wie etwa nicht-steroidale Anti-Entzündungs-Mittel
(nonsteroidal anti-inflammatory agents NSAIDS) und selektive Cyclooxygenase-2
(COX-2) Inhibitoren.
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Das
verwendete Anti-Krebs-Mittel kann simultan in der gleichen pharmazeutischen
Präparation
mit der Thiuramdisulfid-Verbindung, Schwermetallionen und/oder Ceruloplasmin
wie oben beschrieben verabreicht werden. Das Anti-Krebs-Mittel kann
auch zu etwa der gleichen Zeit, aber durch eine getrennte Verabreichung verabreicht
werden. Alternativ kann das Anti-Krebs-Mittel zu einer unterschiedlichen
Zeit wie die der Verabreichung von Thiuramdisulfid-Verbindung, Schwermetallionen,
und/oder Ceruloplasmin verabreicht werden. Es kann ein geringer
Grad an Experimentierarbeit von Nöten sein, um die beste Art
und Weise der Verabreichung zu bestimmen, wobei dies sehr wohl innerhalb
der Fähigkeit
eines Fachmanns liegt, welcher die vorliegende Offenbarung kennt.
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Die
Verfahren gemäß dieser
Erfindung sind geeignet zur Behandlung von Krebsarten in Tieren,
insbesondere Säugetieren,
wie etwa Hunden, Rindern, Schweinen und anderen Tieren. Vorteilhaft
werden die Verfahren zur Behandlung von menschlichen Patienten verwendet.
Die Verfahren sind nützlich
zur Behandlung verschiedener Krebstypen, einschließlich Melanomen,
nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, kleinzelligem Lungenkrebs, Nierenkrebs,
kolorektalem Krebs, Brustkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Magen-Krebs, Blasen-Krebs,
Eierstock-Krebs, Uterus-Krebs, Lymphomen und Prostata-Krebs, jedoch
nicht auf diese beschränkt.
Insbesondere ist die vorliegende Erfindung besonders wirksam bei
der Behandlung von Melanomen, Lungenkrebs, Brustkrebs und Prostata-Krebs.
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Die
aktiven Verbindungen gemäß dieser
Erfindung werden typischerweise in einem pharmazeutisch akzeptablen
Träger über jegliche
geeignete Routen, wie etwa parenteral, intravenös, oral, intradermal, subkutan
oder topisch verabreicht. Die erfindungsgemäßen aktiven Verbindungen werden
in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht, um den erwünschten
therapeutischen Effekt zu erzielen, ohne ernsthafte Nebenwirkungen
bei dem behandelten Patienten zu verursachen.
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Die
Thiuramdisulfid-Verbindung Disulfiram kann wirksam sein, wenn sie
in einer Menge verabreicht wird, welche innerhalb der herkömmlichen
klinischen Bereiche liegt, welche im Fachbereich bestimmt wurden. Typischerweise
kann sie in einer Menge von etwa 125 bis etwa 1000 mg pro Tag wirksam
sein, bevorzugt von etwa 250 bis etwa 500 mg pro Tag. Die Menge
kann jedoch in Abhängigkeit
von dem Körpergewicht
des behandelten Patienten veränderlich
sein. Der aktive Inhaltsstoff kann auf einmal verabreicht werden,
oder kann in eine Anzahl von kleineren Dosen aufgeteilt werden,
die zu vorbestimmten Zeitintervallen verabreicht werden. Die geeignete
Dosierungseinheit für
jede Verabreichung von Disulfiram kann beispielsweise von etwa 50 bis
etwa 1000 mg, vorzugsweise von etwa 250 bis etwa 500 mg sein. Die
erwünschte
Spitzen-Plasmakonzentration an Disulfiram ist im Allgemeinen etwa
0,05 bis etwa 10 μM,
vorzugsweise etwa 0,5 bis etwa 5 μM,
um eine detektierbare therapeutische Wirkung zu erreichen. Eine
Plasmakonzentration außerhalb
solcher Bereiche kann jedoch ebenfalls funktionieren.
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Disulfiram
ist bei der Behandlung von Alkoholmissbrauch klinisch eingesetzt
worden. Eine Dosierungsform von Disulfiram, welche von der U.S.
Food und Drug Administration genehmigt wurde (Antabuse®), kann
in 250 mg und 500 mg Tabletten zur oralen Verabreichung von Wyeth-Ayerst Laboratories
(P.O. Box 8299, Philadelphia, Pa 19101, Telefon 610-688-4400) erworben
werden.
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Es
wurde auch gezeigt, dass Disulfiram, welches subkutan zur verzögerten Freisetzung
implantiert wurde, in einer Menge von 800 bis 1600 mg wirksam ist,
um eine geeignete Plasmakonzentration zu erreichen. Dies kann durch
Verwendung von aseptischen Techniken zum chirurgischen Implantieren
von Disulfiram in den subkutanen Raum der anterioren Abdominalwand
bewerkstelligt werden. Siehe z.B. Wilson et al., J. Clin. Psych.
45:242–247
(1984).
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Eine
Formulierung einer Dosierung zur verzögerten Freisetzung, welche
aus 80 % Poly(Glycol-co-L-Milchsäure)
und 20 % Disulfiram besteht, wurde auch in Phillips et al., J. Pharmaceut.
Sci., 73:1718–1720
(1984) beschrieben.
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Die
Pharmakologie und Toxikologie von Antabuse® sind
detailliert beschrieben in Physicians Desk Reference, 50. Ausgabe,
Medical Economics, Montvale, NJ, Seiten 2695–2696. Stabile Serumgehalte
von etwa 1,3 μM
sind in Menschen gemessen worden, welche täglich wiederholt Dosen von
250 mg Disulfiram einnahmen. Siehe, z.B., Fairman et al., Clin.
Pharmacol. Ther. 36:520–526
(1984); und Johansson, Acta Psychiatr. Scand., Suppl. 369:15–26 (1992).
Disulfiram ist relativ nicht-toxisch, mit einer LD50 bei
Nagetieren von 8,6 g/kg. Siehe z.B. Der Merck Index, 10. Ausgabe,
Referenz 3382, Merck & Co.,
Rahway, NJ, 1983, Seite 491.
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Disulfiram
kann in der vorliegenden Erfindung in einer ähnlichen Dosierung verwendet
werden. Die therapeutisch wirksame Menge für andere Thiuramdisulfid-Verbindungen
kann auch geschätzt
oder auf Basis der obigen Dosierungsbereiche von Disulfiram und
den Molekulargewichten von Disulfiram und den anderen Thiuramdisulfid-Verbindungen
berechnet werden, oder mittels anderer im Fachbereich bekannter
Verfahren.
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Schwermetallionen
können
separat als eine wässrige
Lösung
in einer pharmazeutisch geeigneten Salzform verabreicht werden.
Sie werden jedoch vorzugsweise in einer Chelat-Form verabreicht,
in welcher die Ionen mit Thiuramdisulfid-Verbindungen komplexiert sind. Damit
ist die zu verwendende Menge an Schwermetallionen in vorteilhafter
Weise proportional zu der Menge an Thiuramdisulfid-Verbindung, welche auf
der Basis des molaren Verhältnisses
zwischen einem Schwermetallion und der Thiuramdisulfid-Verbindung in
dem Chelat verabreicht werden soll. Verfahren zum Herstellen solcher
Chelate oder Komplexe sind bekannt, und die bevorzugten Verfahren
sind oben und in den Beispielen unten beschrieben.
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Die
therapeutisch wirksame Menge für
IL-6 kann von etwa 1 bis zu etwa 100 μg/kg pro Tag, vorzugsweise von
etwa 5 bis etwa 50 μg/kg
pro Tag betragen. Interferon a kann von etwa 0,1 × 106 bis etwa 10 × 106 internationalen
Einheiten pro Tag verabreicht werden, vorzugsweise von etwa 3 bis
etwa 8 × 106 internationalen Einheiten pro Tag, und
die Verabreichungshäufigkeit
kann von etwa 3 Malen pro Woche bis etwa einmal pro Tag sein. Eine
geeignete Dosierung für
Interferon β kann
von etwa 1 bis etwa 200 μg
pro Tag reichen, vorzugsweise von etwa 10 bis etwa 100 μg pro Tag,
einmal pro Woche bis einmal pro Tag verabreicht. Interferon γ kann in
einer Dosierung von etwa 1 bis etwa 1000 μg pro Tag verabreicht werden,
vorzugsweise von etwa 50 bis etwa 250 μg pro Tag. Ceruloplasmin kann
in einer Menge von etwa 1 bis etwa 100 mg pro Tag verabreicht werden,
vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 30 mg pro Tag.
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Es
ist zu verstehen, dass die oben aufgeführten Dosierungsbereiche lediglich
beispielhaft sind und den Umfang dieser Erfindung nicht einschränken sollen.
Die therapeutisch wirksame Menge für jede aktive Komponente kann
mit Faktoren variieren, welche die Aktivität der verwendeten Verbindung,
Stabilität
der aktiven Verbindung in dem Körper
des Patienten, die Ernsthaftigkeit der zu lindernden Zustände, das
Gesamtgewicht des behandelten Patienten, die Verabreichungsroute,
die Leichtigkeit der Absorption, Verteilung und Exkretion der aktiven
Verbindung durch den Körper,
das Alter und die Empfindlichkeit des behandelten Patienten und
dergleichen umfassen, jedoch nicht darauf beschränkt sind, wie es Fachleuten
auf diesem Gebiet offensichtlich sein wird. Die Verabreichungsmenge
kann auch angepasst werden, wenn die verschiedenen Faktoren sich über die
Zeit verändern.
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Die
aktiven Verbindungen gemäß dieser
Erfindung können
einem zu behandelnden Patienten über jegliche
geeignete Verabreichungswege verabreicht werden.
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Vorteilhaft
werden die aktiven Verbindungen dem Patienten parenteral, d.h. intravenös oder intramuskulär zugeführt. Für parenterale
Verabreichung können
die aktiven Verbindungen in Lösungen
oder Suspensionen oder in lyophilisierten Formen zur Umwandlung
in Lösungen
oder Suspensionen vor Verwendung formuliert werden. Steriles Wasser,
physiologische Salzlösung,
z.B. Phosphat-gepufferte Salzlösung
(PBS) können bequem
als die pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel
verwendet werden. Herkömmliche
Lösungsmittel,
oberflächenaktive
Substanzen, Stabilisatoren, pH-ausgleichende Puffer, antibakterielle Mittel
und Antioxidanzien können
alle in den parenteralen Formulierungen verwendet werden, einschließlich, jedoch
nicht beschränkt
auf Acetate, Citrate oder Phosphate-Puffer, Natriumchlorid, Dextrose, fette Öle, Glycerin,
Polyethylenglykol, Propylenglykol, Benzylalkohol, Methylparabene,
Ascorbinsäure,
Natriumbisulfit und dergleichen. Die parenterale Formulierung kann
in jeglichen herkömmlichen
Behältnissen,
wie etwa Röhrchen, Ampullen
und Spritzen aufbewahrt werden.
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Die
aktiven Verbindungen können
auch oral in verschlossenen Gelatinekapseln oder komprimierten Tabletten
zugeführt
werden. Kapseln und Tabletten können
mittels jeglicher herkömmlicher
Techniken hergestellt werden. Beispielsweise können die aktiven Verbindungen
in eine Formulierung eingefügt
werden, welche pharmazeutisch akzeptable Träger, wie etwa Exzipienten (z.B.
Stärke,
Lactose), Bindemittel (z.B. Gelatine, Cellulose, Gummitragacanth),
auflösende
Mittel (z.B. Alginat, Primogel und Maisstärke), Schmiermittel (z.B. Magnesiumstearat,
Siliciumdioxid) und Süßungs- oder
Geschmacks-Mittel (z.B. Glukose, Sucrose, Saccharin, Methylsalicylat
und Pfefferminz) umfassen. Es können
auch verschiedene Beschichtungen für die Kapseln und Tabletten
hergestellt werden, um den Geschmack, die Geschmacksrichtungen,
Farben und Formen der Kapseln und Tabletten zu modifizieren. Zusätzlich können flüssige Träger, wie
etwa Fettöl,
in den Kapseln umfasst sein.
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Es
können
auch andere Formen oraler Formulierungen hergestellt werden, wie
etwa Kaugummi, Suspension, Sirup, Waffel, Elixier und dergleichen,
welche die in dieser Erfindung verwendeten aktiven Verbindungen
enthalten. Verschiedene Modifizierungsmittel für Geschmack, Geschmacksrichtungen,
Farben und Formen können
ebenfalls umfasst sein. Zusätzlich
können
zur bequemen Verabreichung mittels enteraler Zuführröhre bei Patienten, welche nicht
fähig sind,
zu schlucken, die aktiven Verbindungen in einem akzeptablen lipophilen
Pflanzenöl-Vehikel,
wie etwa Olivenöl,
Maisöl
und Distelöl
aufgelöst
werden.
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Die
aktiven Komponenten können
auch topisch über
rektale, vaginale, nasale oder mukosale Anwendungen verabreicht
werden. Topische Formulierungen sind im Fachbereich allgemein bekannt
und umfassen Cremes, Gele, Salben, Lotionen, Pulver, Pasten, Suspensionen,
Sprays und Aerosole. Typischerweise umfassen topische Formulierungen
ein oder mehr Verdickungsmittel, Feuchthaltemittel und/oder Emollienzien,
einschließlich,
jedoch nicht beschränkt
auf Xanthan-Gummi, Petrolatum, Bienenwachs oder Polyethylenglycol, Sorbitol,
Mineralöl,
Lanolin, Squalen und dergleichen. Eine spezielle Form topischer
Verabreichung ist die Zufuhr mittels eines transdermalen Pflasters.
Verfahren zum Herstellen transdermaler Pflaster sind beispielsweise
offenbart in Brown et al., Annual Review of Medicine, 39:221–229 (1988),
welches durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist.
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Die
aktiven Verbindungen können
auch durch subkutane Implantation zur verzögerten Freisetzung zugeführt werden.
Dies kann erreicht werden durch Verwendung aseptischer Techniken
zum chirurgischen Implantieren der aktiven Verbindungen in einer
jeglichen geeigneten Formulierung in den subkutanen Raum der anterioren
Abdominalwand. Siehe, z.B., Wilson et al., J. Clin. Psych. 45:242–247 (1984).
Langzeitfreisetzung kann erreicht werden durch Einfügung der
aktiven Inhaltsstoffe in einen speziellen Träger, wie etwa ein Hydrogel.
Typischerweise ist ein Hydrogel ein Netzwerk biokompatibler Polymere
hohen Molekulargewichts, welche in Wasser quellen können, um
ein gelähnliches
Material zu bilden. Hydrogele sind allgemein im Fachbereich bekannt.
Beispielsweise sind Hydrogele aus Polyethylenglykolen oder Collagen
oder Poly(Glykol-co-L-Milchsäure) für diese
Erfindung geeignet. Siehe, z.B. Phillips et al., J. Pharmaceut.
Sci. 73:1718–1720
(1984).
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Die
aktiven Verbindungen können
auch verbunden, d.h. kovalent verknüpft werden mit einem wasserlöslichen,
nicht immunogenen Polymer hohen Molekulargewichts, um ein Polymer-Konjugat
zu bilden. Vorteilhafter Weise können
solche Polymere, z.B. Polyethylenglykol, den aktiven Verbindungen
Löslichkeit,
Stabilität und
verminderte Immunogenizität
verleihen. Als Ergebnis davon kann die aktive Verbindung in dem
Konjugat, wenn sie einem Patienten verabreicht wird, eine längere Halbwertszeit
in dem Körper
aufweisen und bessere Effizienz zeigen. PEGylierte Proteine werden
gegenwärtig
in Protein-Ersatz-Therapien und für andere therapeutische Verwendungen
eingesetzt.
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Beispielsweise
wird PEGylierte Adenosin-Deaminase (ADAGEN®) verwendet,
um schwerwiegende kombinierte Immunodefizienz-Krankheit (SCIDS) zu behandeln. PEGylierte
L-Asparaginase (ONCAPSPAR®) wird verwendet, um akute
lymphoblastische Leukämie
(ALL) zu behandeln. Für
einen allgemeinen Überblick über PEG-Protein-Konjugate
mit klinischer Effizienz, siehe z.B. Burnham, Am. J. Hosp. Pharm.
15:210–218 (1994).
Vorzugsweise ist die kovalente Bindung zwischen dem Polymer und
der aktiven Verbindung hydrolytisch abbaubar und gegenüber Hydrolyse
unter physiologischen Bedingungen empfindlich. Solche Konjugate sind
als "Pro-Wirkstoffe" bekannt, und das
Polymer in dem Konjugat kann im Körper leicht unter Freisetzung der
freien aktiven Verbindungen abgespalten werden.
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Alternativ
sind andere Formen gesteuerter Freisetzung oder Schutz, einschließlich Mikrokapseln
und Nanokapseln, im Fachbereich allgemein bekannt, und alle oben
beschriebene Hydrogele können
bei oraler, parenteraler, topischer- und subkutaner Verabreichung
der aktiven Verbindungen verwendet werden.
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Eine
andere bevorzugte Zufuhrform besteht in der Verwendung von Liposomen
als Träger.
Liposome sind Mizellen, welche von verschiedenen Lipiden, wie etwa
Cholesterin, Phospholipiden; Fettsäuren und Derivaten davon gebildet
werden. Aktive Verbindungen können
im Inneren solcher Mizellen eingeschlossen werden. Verfahren zum
Herstellen liposomaler Suspensionen, welche darin aktive Inhaltsstoffe
enthalten, sind allgemein im Fachbereich bekannt und beispielsweise
in US-Patent Nr. 4,522,811 beschrieben. Verschiedene Anti-Krebs-Wirkstoffe,
welche in der Form von Liposomen verabreicht werden, sind im Fachbereich
bekannt und kommerziell von Liposome Inc. of Priceton, New Jersey,
USA erhältlich.
Es ist gezeigt worden, dass liposomale Verabreichung die Toxizität der aktiven
Verbindungen verringern und ihre Stabilität erhöhen kann.
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Die
aktiven Verbindungen können
in Kombination mit anderen aktiven Mitteln verabreicht werden, welche
eine andere Krankheit oder ein anderes Symptom in dem behandelten
Patienten behandeln oder dieser/diesem vorbeugen. Es ist jedoch
zu verstehen, dass solche anderen aktiven Mittel nicht mit den Wirkungen der
aktiven Verbindungen gemäß dieser
Erfindung auf den behandelten Krebs interferieren oder diese negativ beeinflussen
sollten. Solche anderen aktiven Mittel umfassen, sind jedoch nicht
beschränkt
auf Antivirenmittel, Antibiotika, Antipilzmittel, entzündungshemmende
Mittel, antithrombotische Mittel, kardiovaskuläre Wirkstoffe, Cholesterin-senkende
Mittel, Hypertensions-Wirkstoffe und dergleichen.
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Es
ist zu verstehen, dass Individuen, welche aufgrund ihres Krebses
Disulfiram-Therapie unterzogen werden, vor Alkohol-Exponierung in jeglicher
Form gewarnt werden müssen,
um das Auftreten von Schwindel und Erbrechen aufgrund des Anstiegs
von Acetaldehyd im Blutstrom zu vermeiden. Die Betreffenden müssen daher
nicht nur von der Aufnahme von Alkohol-enthaltenden Getränken Abstand nehmen, sondern
sollten Alkohol auch nicht über
die frei erhältlichen
Formulierungen, wie etwa Hustensirupe, welche Alkohol enthalten, oder
sogar Verwendung von Alkohol zum topischen Abreichen aufnehmen.
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EXPERIMENTELLER
TEIL VERFAHREN
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Kultur
von bösartigen
Zelllinien. Menschliche bösartige
Zelllinien wurden von der American Type Tissue Culture Collection
(Rockville, MD) erhalten. Melanom-Zelllinien CRL 1585 und 1619 wurden
in RPMI 1640 (GIBCO-BRL, Life Technologies, Grand Island, NY) mit
10 % FBS kultiviert und mit nicht-enzymatischer Zell-Dissoziierungs-Lösung 7 abgelöst (Sigma).
Die Prostata-Adenokarzinom-Zelllinie CRL 1435 (PC-3) wurde ebenfalls
in RPMI 1640 mit 10 % FBS kultiviert, aber mit 0,05 % Trypsin und
0,53 mM EDTA abgelöst.
Die Pflasterlungenkarzinom(squamöses
Lungenkarzinom)-NCI-H520- und die Adeno-Pflaster-Lungenkarzinom-NCI-H596-Zelllinien wurden
in RPMI 1640 wachsen gelassen, welches mit 10 % FBS, 10 mM HEPES
und 1,0 mM Natriumpyruvat ergänzt
war, und mit Trypsin/EDTA abgelöst.
Das kleinzellige Lungenkarzinom NCI-H82 wurde als eine Suspension
in RPMI 1640 mit 10 % FBS kultiviert. Alle Obigen ließ man in
einer angefeuchteten Atmosphäre
von 37°C
wachsen, welche 5 % CO2/Luft enthielt. Die
Brustkarzinom-Zelllinie MDA-MB-453
wurde in einer 37°C
warmen, angefeuchteten Umgebung bei freiem Gasaustausch mit atmosphärischer
Luft unter Verwendung von Leibovitz's L-15-Medium mit 2 mM L-Glutamin und 10 %
FBS wachsen gelassen und mit Trypsin/EDTA abgelöst.
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Messung
von Proliferation in Zellkulturen. Proliferation von kultivierten
Zellen wurde unter Verwendung eines zuvor veröffentlichten colorimetrischen
Verfahrens quantifiziert, auf der Basis von metabolischer Reduzierung
des löslichen,
gelben Tetrazoliumfarbstoffs 3-[4,5-Dimethylthiazol]-2yl-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)
in sein unlösliches,
violettes Formazan durch die Wirkung mitochondrialer Succinyldehydrogenase.
Siehe Hirst et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 7:574–581 (1992)
Dashtaki, et al., J. Pharmacol. Exper. Ther. 285:876–219 (1998).
Dieses Assay unterscheidet empirisch zwischen toten und lebenden
Zellen. Für
Proliferationsstudien wurden Zellen auf unbeschichteten 24-Well-Plastikplatten
(Costar) zu 50.000 Zellen pro Well gesät und mit jeweiligen Medien
und Mitogenen kultiviert. Nach 24–96 Stunden wurde das Medium
entfernt, die Zellen wurden zweimal mit 1 ml steriler Dulbecco's modifizierter Phosphat-gepufferter
Salzlösung
ohne Ca2+ oder Mg2+ (DPBS) gewaschen,
das Medium durch 1 ml/Weil frisches Medium, welches 100 μg/ml MTT enthielt,
ersetzt, und die Platten eine weitere Stunde lang inkubiert. MTT
enthaltendes Medium wurde entfernt, jedem Well 0,5 ml Dimethylsulfoxid
(DMSO) zugesetzt, und die Extinktion des gelösten, violetten Formazan-Farbstoffs
bei 540 nm gemessen. Insgesamt 4 – 6 Wells wurden bei jedem
Behandlungszustand studiert. Vorläufige Studien wurden ausgeführt mit
50–200 μg/ml MTT,
welches über
15 min, bis 3 Stunden lang inkubiert wurde, um die optimale Konzentration
und die optimale Inkubationszeit zu bestimmen, bei welcher die Konversionsrate
linear und der Anzahl der gegenwärtigen
Zellen proportional war. Die Extinktion des MTT-Formazan-Reduktionsprodukts
(A540) korrelierte mit Zellanzahlen, welche
mittels Hämozytometer
mit einem R2 = 0,99 gezählt wurden. In einigen Experimenten
wurde das MTT-Assay und Reaktionen auf FBS und Inhibitoren auch
durch Ausführen
von Zellzählungen
an 10 zufälligen
Feldern/Well von Giemsa-modifizierten Wright-gefärbten Monolagen bestätigt, welche
bei 40facher Vergrößerung unter
Verwendung eines 0,01-cm2 Okularrasters
betrachtet wurden.
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Zellkulturbehandlungen.
Die Wirkung von Disulfiram (0,15 bis 5,0 μM) und PDTC (0,625 bis 5,0 μM) (beide
von Sigma Chemicals, St. Louis, MO) auf Proliferation von bösartigen
Zelllinien wurde in Kulturen studiert, welche mit 10 % FBS stimuliert
wurden. Disulfiram wurde in Dimethylsulfoxid (DMSO) solubilisiert,
so dass die endgültige
Konzentration von DMSO weniger als 0,3–0,5 % betrug. Gleiche Volumina
von DMSO wurden zu Vergleichsexperimenten zugefügt. Zellanzahlen wurden mit
dem MTT-Assay 24–72
Stunden später quantifiziert.
In einigen Experimenten wurde Disulfiram oder PDTC unmittelbar nach
Aufbringen der Zellen auf die Platten zugegeben. In anderen Experimenten
wurden die Zellen auf die Platten gegeben und 24–72 Stunden lang wachsen gelassen,
bevor frische Medien mit Disulfiram oder PDTC zugefügt wurden,
und die Zellanzahlen mittels des MTT-Assays 24 – 72 Stunden später studiert.
Synergie zwischen Disulfiram und N,N'-Bis(2-chlorethyl)-N-nitrosoharnstoff
(Carmustin oder BCNU, 1,0 bis 1.000 μM) oder Cisplatin (0,1 bis 100 μg/ml), welche
dem Medium zugegeben wurden, wurde studiert. Die Wirkung von Metallen
auf Disulfiram wurde mit 0,2 bis 10 μM Kupfer (bereitgestellt als
CuSO4), Zink (als ZnCl2),
Silber (als Silberlaktat) oder Gold (als HAuCl4·3H2O)-Ionen studiert, welche dem Wachstumsmedium
zugegeben wurden. Bei Zugabe von Metallsalzen zu Kulturmedium traten
keine pH-Änderungen
auf. Um eine biologisch relevante Kupferquelle bereitzustellen,
wurde in einigen Experimenten menschliches Ceruloplasmin (Sigma)
in Dosen zugefügt,
welche niedrigen und hohen normalen Erwachsenen-Serumkonzentrationen
(250 und 500 μg/ml)
entsprechen.
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Potentielle
Redox-Effekte von Disulfiram wurden in drei Sätzen von Experimenten studiert.
Die Wichtigkeit von zellulärem
Glutathion (GSH) bei der Vermittlung oder Modulierung von Dithiocarbamat-Toxizität wurde
durch Messung von Gehalten von intrazellulärem GSH nach Behandlung mit
Disulfiram studiert. Disulfiram (5 μM), mit oder ohne 1,6 μM CuSO4, wurde zu Zellen zugegeben, welche bis
zur Konfluenz auf 100 × 15
mm Plastik-Schalen wachsen gelassen wurden, und die Zellen wurden
24 Stunden später
geerntet, zur Messung von GSH wie unten stehend beschrieben. Um
zu beurteilen, ob ein nicht-spezifischer Antioxidationsmittel-Effekt
von Disulfiram oder PDTC Inhibierung zellulären Wachstums erklären könnte, haben
wir auch die Wirkung des potenten lipophilen Antioxidationsmittels
Probucol (1,0 bis 1.000 μM)
auf die Proliferation bösartiger
Zelllinien studiert. Schließlich
wurde die Erzeugung intrazellulärer
Oxidationsmittel als Reaktion auf Disulfiram (0,625 bis 5 μM), Kupfer
(0,2 bis 1,6 μM
CuSO4) oder 1,25 μM Disulfiram plus verschiedene
Konzentrationen an Kupfer direkt gemessen, wie unten beschrieben.
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Um
die Rolle von Cyclooxygenase-Inhibierung bei Thiocarbamat-Toxizität zu erforschen,
wurden Zellen mit oder ohne Disulfiram in der Anwesenheit oder Abwesenheit
der COX1- und COX2-Inhibitoren Indomethacin (5 μg/ml) oder Natriumsalicylat
(1 mM) kultiviert. Um zu sondieren, ob Disulfiram Wachstumsverzögerung durch
Unterbrechung oder Stimulierung von Stickoxid (NO)-Produktion induzieren
könnte,
wurde Proliferation mit und ohne Disulfiram in der Gegenwart und
Abwesenheit des Stickoxid-Synthase-Inhibitors Nω-Nitro-L-arginin studiert,
welcher zu Wachstumsmedium (100 μM)
zugegeben wurde.
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Um
die Rolle von Kupfer bei der Vermittlung von Cytotoxizität von Disulfiram
weiter zu testen, wurden Zellen mit oder ohne Zugabe des impermeaten
Cu2+-Chelators Bathocuproindisulfonsäure (BCPS,
100 μM) kultiviert,
welcher dem Medium zugesetzt wurde, um Cu2+ in
dem extrazellulären
Raum zu sequestrieren. Zellen wurden auch 12 Stunden lang mit verschiedenen
Konzentrationen von Disulfiram (0,625 bis 5,0 μM) behandelt und intrazelluläre Kupfer-Gehalte
wie unten stehend beschrieben gemessen.
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In
zusätzlichen
Experimenten wurden Zellen bis zur Konfluenz auf 60 × 15 mm
Plastik-Petri-Schalen wachsen gelassen und mit 5 μM Disulfiram
oder 5 μM
Disulfiram plus 1,6 μM
CuSO4 2 bis 48 Stunden lang behandelt. Zellen
wurden lysiert und Gehalte des pro-apoptotischen Proteins p53, des
anti-apoptotischen Proteins Bcl-2, des Cyclin-Inhibitors p21WAF1/Cip1, und der Cycline A und B1 wie unten
beschrieben mittels Immunoblot-Assay gemessen.
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Um
die Wirkung von Disulfiram auf für
zelluläre
Proliferation wichtige, ausgewählte
Gene zu erforschen, wurden schließlich Zellen bis zur Konfluenz
auf 100 × 15
mm Petri-Schalen aus Plastik wachsen gelassen und mit 5 μM Disulfiram
oder 5 μM
Disulfiram plus 1,6 μM
CuSO4 behandelt. Nukleares Protein wurde
geerntet, und es wurden elektrophoretische Mobilitäts-Gel-Shift-Assays
durchgeführt,
um DNA-Konsens-Bindungssequenz für
das cyclische AMP responsive Element (CRE) wie unten beschrieben
zu verwenden. Um zu bestimmen, ob Disulfiram und Metalle Transkriptionsfaktor-Bindung
direkt beeinflussen könnten,
wurden in einigen Experimenten 5 μM
Disulfiram und/oder CuSO4 1,6 μM CuSO4 (endgültige
Konzentrationen) zu der Bindungsreaktion von nuklearem Protein zugegeben,
welches von Vergleichszellen erhalten wurde, welche in der Abwesenheit
von Wirkstoffen oder Metallen lediglich mit 10 % FBS stimuliert
wurden. In vitro-Zugabe von Disulfiram und CuSO4 zu
der Bindungsreaktion wurde durchgeführt unter Verwendung von entweder
2,5 mM Dithiothreitol (DTT) oder 3,0 mM GSH als ein Reduktionsmittel
in dem Bindungspuffer.
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Messung
von Cytotoxizität
und Apoptose. Um Cytotoxizität
zu untersuchen, wurden Zellen in einer Dichte von 50.000 pro Well
auf 24-Well-Platten aufgebracht und 24 Stunden lang wachsen lassen.
Dann wurde Disulfiram zugegeben. Nach weiteren 36 Stunden wurde
das Medium entfernt und durch 0,1 % Trypanblau enthaltende DPBS
ersetzt. Zelltod wurde untersucht durch Zählen der durchschnittlichen
Anzahl von Trypanblau-positiven Zellen pro 10X Feld in 5 zufälligen Feldern
für 4 getrennte
Wells. Um zu bestimmen, ob Disulfiram Apoptose induzierte, wurden
Zellen, welche auf 35 mm Petri-Schalen oder auf Glas-Plättchen bis
zur Konfluenz wachsen gelassen wurden, mit Disulfiram oder DMSO
als Vehikel behandelt. Apoptose wurde studiert mittels Terminus-Deoxynucleotidyl-Transferase
(TdT)-abhängiger
3'-OH-Fluoreszin-Endlabelmarkierung von
DNA-Fragmenten unter Verwendung eines Fluoreszin-FragELTM DNA-Fragmentierungs-Detektions-Baukastens
(Oncogene Research Products, Cambridge, MA). Apoptose wurde auch
untersucht mittels visueller Untersuchung von Endonuclease-abhängiger DNA-Fragmentierung auf
mit Ethidiumbromid gefärbten
Agarose-Gelen, wie
zuvor berichtet. Siehe Dashtaki, et al., J. Pharmacol. Exper. Ther.
285:876–219
(1998).
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DNA-Zell-Zyklus-Messungen.
Um die Wirkung von Disulfiram auf den DNA-Zell-Zyklus zu untersuchen,
wurden Zellen bis zur Konfluenz in 25 cm2 Plastikkolben
wachsen gelassen und behandelt mit 10 % FBS plus DMSO-Vehikel, FBS
und DMSO-Vehikel
plus 1,6 μM
CuSO4, FBS plus 5 μM Disulfiram oder FBS plus 5 μM Disulfiram
und 1,6 μM
CuSO4. Nach 24 Stunden wurden die Zellen
trypsiniert, zweimal in kalter DPBS mit 1 mM EDTA und 1 % BSA gewaschen,
30 Minuten lang in eiskaltem 70 % Ethanol fixiert, und durch Inkubation 30
Minuten lang bei 37°C
in einer 10 μg/ml-Lösung von
Propidiumiodid in DPBS und 1 mg/ml RNase A gefärbt. DNA- Zell-Zyklus-Messungen wurden durchgeführt unter
Verwendung eines FACStarPLUS Flusszytometers (Becton-Dickenson,
San Jose, CA).
-
Messung
intrazellulären
Kupfers. Zellen wurden in 12-Well-Plastik-Zellkultur-Schalen bei einer
anfänglichen
Plattierungsdichte von 50.000 Zellen/Well kultiviert, bis zur Konfluenz
wachsen gelassen und mit Disulfiram oder Vehikel-DMSO wie oben beschrieben
behandelt. Die Medien wurden entfernt und die Zellen zweimal mit
DPBS gewaschen. Die Zellen wurden dann in 1,0 ml 3N HCl/10,0 Trichloressigsäure geschabt
und bei 70°C
16 Stunden lang hydrolysiert. Das Hydrolysat wurde bei 600 g 10
Minuten lang zentrifugiert, um Abfall zu entfernen, und Kupfer wurde
in dem Überstand
unter Verwendung von ICP-Emissionsspektroskopie
(Modell P30, Perkin Elmer, Norwalk, CT) bei Wellenlängen von
325,754 und 224,700 nm gemessen. Um Metallkontamination zu minimieren,
wurde statt Glasware in diesen Experimenten Plastikware und doppelt
destilliertes, deionisiertes Wasser für alle wässrigen Medien verwendet. Die
Ergebnisse sind als ng-Kupfer/ml Hydrolysat angezeigt.
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Messung
der intrazellulären
Erzeugung von reaktiven Sauerstoff-Spezies. Erzeugung von reaktiven Sauerstoff-Spezies als Reaktion
auf Disulfiram mit oder ohne CuSO4 wurde
unter Verwendung von 2',7'-Dichlorfluoreszindiacetat
(DCF-DA, Molecular Probes, Eugene, OR) und einer Modifikation von
zuvor berichteten Verfahren untersucht. Siehe Royall, et al., Archiv.
Biochem. Biophys. 302:348–355
(1993).
-
Dieses
Verfahren basiert auf der Oxidation von Dichlorfluoreszin zu 2',7'-Dichlorfluoreszin
durch H2O2 in der
Gegenwart zellulärer
Peroxidasen. Zellen wurden auf 24-Well-Plastik-Schalen zu 50.000 Zellen
pro Well plattiert und bis zur Konfluenz wachsen gelassen. Medien
wurden aus den Wells abgesaugt und durch 100 μl 10 μM DCF-DA enthaltendes Medium
ersetzt, und die Platten wurden 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert.
Die DCF-DA-enthaltenden Medien wurden abgesaugt, die Zellen zweimal
mit Medien allein gewaschen und den Wells 100 μl frische Medien zugegeben.
Während
die Platte auf dem Fluoreszenz-Mikroplatten-Lesegerät (HTS 7000)
platziert war, wurden Zellen mit 25 μl Medien stimuliert, welche
5 × Konzentrationen
an Disulfiram und/oder CuSO4 enthielten,
um endgültige
Konzentrationen von jeweils 0–5,0 μM und/oder
0–1,6 μM CuSO4 bereitzustellen. Die relative Konzentration
an Dichlorfluoreszin wurde sofort durch Verfolgen der Fluoreszenz bei
37°C unter
Verwendung einer Anregungswellenlänge von 485 nm und Emissionswellenlänge von
535 nm gemessen.
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Messung
intrazellulären
Glutathions. Disulfiram (5 μM),
mit oder ohne 1,6 μM
CuSO4, wurde zu Zellen zugegeben, welche
auf 100 × 15
mm Plastik-Schalen bis zur Konfluenz wachsen gelassen worden waren,
und Zellen wurden 24 Stunden später
zur Messung von GSH unter Verwendung des 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure)-glutathion-Reduktase-Recycling-Assays
geerntet. Siehe Anderson, M.E. Methods Enzymol. 113:548–555 (1985).
-
Immunoassay
für Proteine.
Zellen wurden lysiert und Proteine isoliert und mit Immunoassay
wie zuvor im Detail beschrieben (7,10) quantifiziert, unter Verwendung
von 2 μg/ml
primärer
polyklonaler Antikörper
von Hasen gegen menschliches Bcl-2 (ΔC21), p53 (FL-393), p21WAF1/Clip1 (H-164), Cyclin A und Cyclin B1
von Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) und mit Peroxidase-Label
markiertem polyklonalem Anti-Hasen IgG vom Esel von Amersham Pharmacia
Biotech (Buckinghamshire, England). Zellen wurden auf Eis gelegt,
zweimal mit kalter DPBS gewaschen, in 0,5 ml kochenden Puffer (10
% [Vol/Vol] Glycerin und 2 % [Gew/Vol] Natriumdadecylsulfat [SDS]
in 83 mM Tris, pH 6,8) geschabt und durch vier Durchgänge durch
eine Pipette geschert. Aliquots wurden zur Proteinbestimmung unter
Verwendung des BCA-Protein-Assays (Pierce) entfernt. Nach Zugabe
von 10 β-Mercaptoethanol
und 0,05 % Bromphenolblau wurden die Lysate 5 Minuten lang gekocht
und bei –80°C aufbewahrt,
bevor der Immunoblot durchgeführt
wurde. Proteine in aufgetauten Proben wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese auf
12 % Polyacrylamidgelen getrennt (15 μg Protein/Bahn) und auf 0,45 μm Hybond
ECL Nitrozellulose-Membranen
(Amersham Life Sciences) unter Verwendung der Nass-Transblot-Methode
in Transfer-Puffer (0,025 M Tris, 0,192 M Glycin, 2,6 mM SDS und
20 % [Vol/Vol] Methanol; pH 8,8) bei 100 Volt 1 Stunde lang elektrotransferiert.
Die Blots wurden über
Nacht bei 4°C
mit Blockierungs-Puffer (PBS mit 0,1 % Tween 20) blockiert, welcher
5 % fettfreies Milchpulver (Carnation, Glendale, CA) enthielt. Nach
5maligem Spülen
für jeweils
5 Minuten in 0,1 % Tween 20 enthaltendem PBS wurden die Blots 1
Stunde lang bei Raumtemperatur mit 2,0 μg/ml primärem Antikörper inkubiert. Nach nochmaligem
Spülen wie
oben wurden die Blots 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit Meerrettich-Peroxidase(HRP)-konjugiertem sekundärem Antikörper inkubiert,
welcher 1:5.000 in Blockierungs-Puffer verdünnt war. Die Immunoblots wurden
erneut wie oben beschrieben gespült
und mittels eines Verfahrens mit verstärkter Chemilumineszenz (ECL Western-Blotting-Detektions-System,
Amersham Life Science, Buckinghamshire, England) detektiert. Autoradiografischer
Film (X-OMAT AR, Eastman Kodak, Rochester, NY) wurde den Immunoblots
10, 30 oder 60 Sekunden lang ausgesetzt, um zufriedenstellende Bilder
zu erhalten.
-
Elektrophoretische
Mobilitäts-Shift-Assays
(EMSAs). Nukleares Protein wurde isoliert und DNA-Bindungsreaktionen
durchgeführt
wie zuvor detailliert beschrieben. Siehe Dashtaki, et al., J. Pharmacol.
Exper. Ther. 285:876–219
(1998); Kennedy, et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19:366–378 (1998).
-
Monolagen
wurden zweimal in kalter DPBS gewaschen und 10 Minuten lang auf
Eis ins Gleichgewicht gebracht mit 0,7 ml kaltem, zytoplasmischem
Extraktionspuffer, CEB (10 mM Tris, pH 7,9, 60 mM KCl, 1 mM EDTA,
1 mM DTT) mit Protease-Inhibitoren,
PI (1 mM Pefabloc, 50 μg/ml
Antipain, 1 μg/ml
Leupeptin, 1 μg/ml Pepstatin,
40 μg/ml
Bestatin, 3 μg/ml
E-64 und 100 μg/ml Chymostatin).
Das oberflächenaktive
Mittel Nonidet P-40 (NP-40) wurde zu einer endgültigen Konzentration von 0,1
% zugefügt,
und Zellen wurden mit einem Zellschaber entfernt. Die Nuklei wurden
mittels Zentrifugierung zu Pellets geformt und mit CEB/PI gewaschen.
Die Nuklei wurden dann 20 Minuten lang auf Eis in nuklearem Extraktionspuffer,
NEB (20 mM Tris, pH 8,0, 400 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2,
1,5 mM EDTA, 1 mM DTT und 25 Glycerin) mit PI inkubiert, kurz geschleudert,
um Abfall zu entfernen und bis zur Durchführung der elektrophoretischen
Mobilitäts-Shift-Assays
bei –80°C aufbewahrt. Die
EMSAs wurden ausgeführt
unter Verwendung von Konsens-Oligonukleotiden
(5'-AGAGATTGCCTGACGTCAGAGAGCTAG-3' und 3'-TCTCTAACGGACTGCAGTCTCTCGATC-5') für das cyclische
AMP responsive Element CRE (ProMega, Madison, WI), durch Phosphorylierung
mit [γ32P]-ATP und T4-Polynukleotid-Kinase endständig markiert.
DNA-Protein-Bindungsreaktionen wurden durchgeführt mit 2 μg nuklearen Proteins (wie nach
der Pierce-Methode bestimmt) und 30 – 80.000 cpm an 32P-endständig-markierter,
doppelsträngiger
DNA-Sonde in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5
mM DTT (außer
wo angegeben), 1 mM MgCl2, 50 μg/ml poly
dI-dC, und 4 % Glycerin. Alle Komponenten der Bindungsreaktion,
mit Ausnahme der mit Label markierten Sonde, wurden kombiniert und
vor Zugabe der mit Label markierten Sonde bei Raumtemperatur 10
Minuten lang inkubiert, und weitere 20 Minuten lang inkubiert. Konkurrenz-Experimente
wurden ausgeführt
mit 10X nicht markierten Wild-Typ Oligonukleotid-Sequenzen für CRE oder
NF-κB (p50, 5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3' und 3'-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5'), zugefügt vor der mit Label markierten
Sonde. Die Proben wurden auf einem 5 % nicht-denaturierenden Polyacrylamidgel
in Tris-glycin-EDTA (TGE, 120 mM Glycin und 1 mM EDTA in 25 mM Tris,
pH 8,5)-Puffer Elektrophorese unterzogen. Die Gele wurden getrocknet
und mittels Autoradiografie bei –80°C unter Verwendung eines Bildintensivierschirms
analysiert.
-
Synthese
von Disulfiram-Metall-Chelaten. Chelate von Disulfiram und einer
Anzahl von Metallen wurden durch kräftiges Mischen von 150 mg Disulfiram
in Chloroform (2,5 mg/ml) mit 30 ml eines 5x molaren Überschusses
an CuSO4, ZnCl2,
C3H5AgO3 (Silberlactat)
oder HAuCl4·3H2O
in doppelt Glas-destilliertem, deionisierten Wasser synthetisiert.
Das Gemisch wurde bei 1.000 g 10 Minuten lang zentrifugiert und
die obere wässrige
Phase verworfen. Während
die untere Chloroform-Phase verdampfte, fielen die resultierenden
Disulfiram-Metall-Chelate aus.
-
Statistische
Analyse. Daten sind ausgedrückt
als Mittelwerte ± Standardfehler.
Die minimale Anzahl an Wiederholungen für alle Messungen war vier,
wenn nicht anders angegeben. Unterschiede zwischen multiplen Gruppen
wurden verglichen unter Verwendung von Einweganalyse der Varianz.
Der verwendete post-hoc-Test war der Newman-Keuls -Test multipler
Vergleiche. Es wurden Two-Tail-Tests von der Signifikanz verwendet.
Signifikanz wurde angenommen als p < 0,05.
-
Beispiel 1: Disulfiram
ist gegen bösartige
menschliche Zelllinien antiproliferativ.
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M1619
menschliche Melanom-Zelllinien wurden verwendet, um die antiproliferativen
Charakteristika von Disulfiram zu testen. Mit 10 % fötalem Rinderserum
(FBS) stimulierte Zellen wurden bei einer Dichte von 50.000 Zellen
pro Well plattiert. Den Wells wurde DMSO-Vehikel (5 μl pro ml)
oder Disulfiram (DS) in verschiedenen Konzentrationen zugefügt. Nach
48 Stunden wurde Proliferation durch Untersuchen der Zellanzahl-abhängigen Reduktion
des löslichen,
gelben Tetrazolium-Farbstoffs 3-[4,5-Dimethylthiazol]-2yl-2,5-diphenyltetrazoliumbromid
(MTT) zu seinem unlöslichen
Formazan quantifiziert, gemessen als die Extinktion bei 540 nm (A540). *p < 0,01
verglichen mit FBS + DMSO-Vehikel-Vergleich. Wie in 1A gezeigt,
war Disulfiram in Konzentrationen, welche in Menschen bei üblichen
klinischen Dosen ohne Weiteres erreichbar sind (siehe, z.B., Faiman,
et al., Clin. Pharmacol. Ther. 36:520–526 (1984)), ein potenter
Inhibitor von in vitro Wachstum für M1619 Melanome.
-
Eine
Vielfalt anderer bösartiger
menschlicher Zelllinien, einschließlich M1585 Melanome, prostatischer Adenokarzinome,
nicht-kleinzelligem und kleinzelligem Lungenkrebs und Brustadenokarzinome,
wurde mit dem gleichen Verfahren wie oben beschrieben getestet.
Zellen, welche mit 10 % fötalem
Rinderserum (FBS) stimuliert wurden, wurden in einer Dichte von
50.000 Zellen pro Well plattiert. In einigen Studien (Behandlung anfänglich)
wurde den Wells DMSO-Vehikel (5 μl
pro ml) oder Disulfiram (DS) in den angegebenen Konzentrationen
zugefügt.
Nach 48 Stunden wurde Proliferation wie oben beschrieben quantifiziert.
In anderen Studien (Behandlung nach 24 Stunden) wurden Zellen 24
(M1619, M1585 und H596 Lunge) oder 48 Stunden (Brust) lang wachsen
gelassen. DMSO-Vehikel (5 μl
pro ml) oder Disulfiram (DS) wurde den Wells in den angegebenen
Konzentrationen zugegeben. Nach weiteren 24 (Lunge) oder 48 Stunden
(Brust) wurde Proliferation wie oben beschrieben quantifiziert.
Prozent Wachstumsinhibierung wurde berechnet als 100 × (1,0–A540 von MTT Formazan in Disulfirambehandelten
Zellen/mittlere A540 von MTT Formazan in
mit DMSO-Vehikel behandelten Zellen). In einigen Zelllinien wurde
eine bescheidene (< 10
%), aber statistisch signifikante inhibierende Wirkung mit DMSO-Vehikel
allein beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Jeder Wert bedeutet einen Mittelwert von wenigstens 4 Experimenten. Ap < 0,01
verglichen mit FBS + DMSO-Vehikel-Vergleich.
-
Wie
in Tabelle 1 dargestellt war Disulfiram wirksam darin, das Wachstum
vieler verschiedener bösartiger
Zellen zu inhibieren. Dies traf zu, ob Disulfiram zu den Kulturmedien
zugegeben wurde, wenn die Zellen plattiert wurden oder später, nachdem
die Zellen 24–48
Stunden lang gewachsen waren.
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TABELLE
1 DISULFIRAM
IST FÜR
BÖSARTIGE
ZELLEN ANTIPROLIFERATIV
-
Beispiel 2: Antiproliferative
Aktivität
von Disulfiram hängt
von Komplexierung mit Kupfer ab.
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M1619
Melanom-Zellen wurden stimuliert und plattiert, wie in Beispiel
1 beschrieben. 1,25 μM
Disulfiram (DS) oder DMSO-Vehikel (5 μl pro ml) wurden den Wells in
der Abwesenheit oder Gegenwart von 50 oder 100 μM Bathocuproindisulfonsäure (BPS)
zugefügt.
Nach 48 Stunden wurde Proliferation wie oben beschrieben quantifiziert.
*p < 0,001 verglichen
mit FBS + DMSO; +p < 0,001
verglichen mit FBS + DS. Wie in 1B gezeigt,
verhindert der Zellen-impermeate Cu2+-Chelator
Bathocuproindisulfonsäure
Wachstumsinhibierung durch Disulfiram.
-
Beispiel 3: Kupfer verstärkt die
antiproliferative Aktivität
von Disulfiram.
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M1619
Melanom-Zellen, welche wie in Beispiel 1 plattiert und stimuliert
wurden, wurden 24 Stunden lang wachsen gelassen und ergänzt mit
CuSO4 oder CuSO4 plus
0,625 μM
Disulfiram. Nach weiteren 24 Stunden wurde Proliferation quantifiziert.
Wie in 1C gezeigt, verstärkt Ergänzung des
Wachstumsmediums mit Kupfer die antiproliferative Aktivität von Disulfiram.
Die Zugabe selbst von 0,2 μM
CuSO4 zu dem Medium wandelt 0,625 μM Disulfiram
von einer 50 % inhibierenden (IC50) Konzentration
in eine 100 inhibierende (IC100) Konzentration
an Wirkstoff um. *p < 0,001
verglichen mit keinem CuSO4.
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M1619
Melanom-Zellen wurden plattiert, stimuliert und 24 Stunden lang
wachsen gelassen in der Gegenwart oder Abwesenheit von 0,625 μM Disulfiram
oder 5 μl/ml
DMSO-Vehikel in
der Gegenwart oder Abwesenheit von menschlichem Ceruloplasmin (Cerulo)
bei einer Konzentration, welche den oberen Gehalt in normalem menschlichem
Serum wiederspiegelt (500 μg/ml).
Nach 24 Stunden wurde Proliferation quantifiziert. *p < 0,001 verglichen
mit FBS + DMSO; +p < 0,001
verglichen mit FBS + DS. Wie in 1D gezeigt,
kann Ceruloplasmin als eine Kupferquelle zum Verstärken der
antiproliferativen Aktivität
von Disulfiram dienen.
-
Beispiel 4: Disulfiram
induziert Apoptose.
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M1619
Melanom-Zellen wurden bis zur Konfluenz auf 35 mm Petri-Schalen
oder auf Glasträgern wachsen
gelassen und 15 Stunden lang mit Disulfiram oder DMSO als Vehikel
behandelt.
-
Apoptose
wurde untersucht mittels terminaler Deoxynukleotidyltransferase
(TdT)-abhängiger
3'-OH Fluoreszin-End-Markierung
von DNA-Fragmenten, unter Verwendung eines Fluoreszin-FragELTM DNA-Fragmentierungs-Detektions-Baukastens (Oncogene Research
Products, Cambridge, MA). Wie in 2A und 2B gezeigt,
wurde Apoptose in M1619 Melanom-Zellen induziert, welche mit 5 μM Disulfiram
behandelt waren. Disulfiram erhöhte
3'-OH Fluoreszin-End-Markierung
von DNA-Fragmenten merklich. Behandlung von Monolagen selbst mit
geringen Dosen von Disulfiram erhöhte die Aufnahme von Trypanblau
merklich. 6 ± 2,
8 ± 3,6
und 94 ± 18
Trypanblau-positive Zellen pro Well wurden jeweils für unbehandelte,
mit DMSO-Vehikel behandelte oder H520 Lungenadenosquamöse Karzinomzellen,
welche mit 0,625 μM
Disulfiram behandelt waren, beobachtet.
-
12 ± 0,9,
16,5 ± 2,1
bzw. 93 ± 12
Trypanblau-positive Zellen pro Well wurden für unbehandelte, mit DMSO behandelte
oder H82 kleinzellige Lungenkrebszellen, welche mit 0,625 μM Disulfiram
behandelt waren, beobachtet. p < 0,001
verglichen mit unbehandeltem oder mit DMSO-Vehikel behandelten Vergleichen.
Zusätzlich
erhöhte
Disulfiram auch DNA-Laddering auf mit Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegelen
(Daten nicht dargestellt).
-
Beispiel 5: Disulfiram
und Kupfer induzieren G2-Zellzyklus-Arrest und Apoptose.
-
Unsynchronisierte
M1619 Melanom-Zellen wurden mit DMSO (3A), 5 μM Disulfiram
(3B), oder 5 μM
Disulfiram plus 250 μg/ml
Ceruloplasmin (3C) inkubiert. Vierundzwanzig
Stunden später
wurden die Zellen geerntet und flusszytometrischer Analyse zugeführt. Der
Anteil an Nuklei in jeder Phase des Zellzyklus (in Klammern) wurde
mit MODFIT DNA Analysesoftware bestimmt.
-
Disulfiram
erhöht
den Anteil von Zellen in S-Phase. Die Kombination von Disulfiram
und Ceruloplasmin erhöht
ferner die Anzahl von Zellen in S-Phase, induziert G2-Zellzyklus-Arrest und Apoptose. 3A zeigt
den Wachstum von unsynchronisierten M1619 Melanom-Zellen in der
Gegenwart von DMSO-Vehikel. 3B zeigt,
dass 5 μM
Disulfiram die Anzahl von Zellen in G0-G1 induziert und den Anteil in S-Phase des Zellzyklus in
M1619 Melanom-Zellen erhöht. 3C zeigt,
dass 5 μM
Disulfiram plus 250 μg/ml
Ceruloplasmin (Cerulo) G2-Zellzyklus-Arrest
und Apoptose in M1619 Melanom-Zellen
induziert.
-
Beispiel 6: Disulfiram
verringert Proliferation durch Redox-Mechanismen nicht.
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M1619
Melanom-Zellen, welche mit 10 % FBS stimuliert wurden, wurden in
einer Dichte von 50.000 Zellen pro Well plattiert, 24 Stunden wachsen
gelassen und mit 5 μM
Disulfiram oder 5 μl/ml
DMSO-Vehikel behandelt, in der Gegenwart oder Abwesenheit des Stickoxidsynthase-Inhibitors
Nω-Nitro-L-arginin
(LNAME, 100 μM).
Nach weiteren 24 Stunden wurde Proliferation wie in Beispiel 1 beschrieben,
quantifiziert. *p < 0,01 verglichen
mit DMSO; +P < 0,001
verglichen mit DMSO.
-
4 zeigt,
dass die antiproliferative Aktivität von Disulfiram nicht durch
Stickoxid vermittelt wird. Während
der Stickoxidsynthase-Inhibitor Nω-Nitro-L-arginin (LNAME) alleine
zellulären
Wachstum leicht erhöht,
verringerte LNAME die antiproliferative Wirkung von Disulfiram nicht.
Daher scheint Disulfiram Wachstum durch negatives Beeinflussen des
zellulären
Redox-Zustandes nicht zu inhibieren.
-
Zusätzlich wurden
in M1619 Zellen, welche mit Disulfiram, Kupfer oder beidem behandelt
waren, reaktive Sauerstoffspezies unter Verwendung der H2O2-sensitiven intrazellulären Sonde
2',7'-Dichlorfluoreszin gemessen,
wie offenbart in Royall, et al., Archiv. Biochem. Biophys. 302:348–355 (1993).
-
Weder
Disulfiram (0,625 bis 5 μM),
CuSO4 (0,2–1,6 μM), noch die Kombination von
1,25 μM
Disulfiram und 0,2 bis 1,6 μM
CuSO4 rief messbare Erzeugung von reaktiven
Sauerstoffspezies in M1619 Zellen hervor. Die Basislinien- Fluoreszenz von 1,431 ± 23 Einheiten
wurde durch keine der Behandlungen erhöht. Gleichfalls gelang es Disulfiram
nicht, GSH in M1619 Zellen abzureichern (228 ± 18 für FBS alleine; 254 ± 7 für DMSO-Vehikel-Vergleich;
273 ± 11 μM GSH/μg Zellprotein
für 5 μM Disulfiram),
und die Kombination von 5,0 μM
Disulfiram und 1,6 μM
CuSO4 erhöhte sogar intrazelluläres GSH
(293 ± 16 μM GSH/μg Zellprotein;
p < 0,05 verglichen
mit FBS alleine). Zusätzlich
inhibierte das potente Antioxidationsmittel Probucol Wachstum einer
jeglichen unserer Tumorzelllinien nicht signifikant.
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Beispiel 7: Disulfiram
plus Kupfer verringern Expression des Zellzyklusproteins Cyclin
A und inhibieren DNA-Bindung von Transkriptionsfaktoren an DNA-Regulierungselemente,
welche für
Cyclin A-Expression wichtig sind.
-
M1619
Melanom-Zellen wurden in gleichen Dichten in 60 × 15 mm Plastik-Schalen plattiert,
zu 80 % Konfluenz gewachsen und mit DMSO-Vehikel (5 μl/ml), Disulfiram
(5 μM) oder
der Kombination von Disulfiram und CuSO4 (1,6 μM) behandelt.
Nach den angegebenen Zeiten wurden die Zellen lysiert und Proteinextrakte SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
(PAGE) unterzogen, gefolgt von Western Blotting unter Verwendung
von polyklonalem Antikörper
vom Hasen. Typische Experimente sind für 2, 4, 8, 12, 24 und 48 Stunden
Behandlung gezeigt. 5A zeigt, dass Disulfiram plus
Kupfer Expression des Zellzyklusproteins Cyclin A verringert, was eine
potentielle, näherungsweise
Erklärung
für die
antiproliferativen Wirkungen dieser Wirkstoff-Metall-Kombination bereitstellt.
Im Gegensatz dazu blieben Gehalte an Cyclin B1 unverändert, und
in den von uns untersuchten Zelllinien hatte Disulfiram keine konsistente
Wirkung auf die Expression des Zellzyklusinhibitors p21WAF1/CIPI (Daten
nicht dargestellt).
-
Cyclin
A-Expression wird teilweise durch Bindung von c-Fos und CREB-1 Protein-Heterodimeren
an ein cAMP responsives Element (CRE) in dem Cyclin A-Promotor reguliert.
Siehe Sylvester et al., J. Clin. Invest. 101:940–948 (1998). M1619 Melanom-Zellen
wurden bis zu 80 % Konfluenz auf 100 × 15 mm Plastik-Petri-Schalen
wachsen gelassen, behandelt, nukleares Protein wurde geerntet und
elektrophoretische Mobilität-Gel-Shift-Assays
wurden durchgeführt.
CRE-Komplexe (I
und II) sind mit Label versehen. Behandlung von Zellen über 6, 12
oder 24 Stunden mit der Kombination von 5 μM Disulfiram und 1,6 μM Kupfersulfat
unterbricht Transkriptionsfaktorbindung an CRE wesentlich. 5B zeigt,
dass die Kombination von Disulfiram und Kupfer Transkriptionsfaktorbindung
an CRE nach 6 Stunden Behandlung im Wesentlichen auslöscht, wobei
eine verringerte Transkription des Cyclin A-Gens eine erwartete
Folge davon wäre.
EMSAs für
2, 6, 12 oder 24 Stunden Behandlung: Fötales Rinderserum (FBS) allein,
Bahnen 1, 5, 9 und 13; FBS + DMSO-Vehikel, Bahnen 2, 6, 10, 14;
FBS + Disulfiram, Bahnen 3, 7, 11, 15; FBS + Disulfiram + CuSO4, Bahnen 4, 8, 12, 16. Konkurrenzexperimente
sind in Bahnen 17–19
gezeigt: Bahn 17, FBS alleine; Bahn 18, FBS mit 10x nicht mit Label versehener
CRE-Sonde, zur Bindungsreaktion hinzugefügt; Bahn 19, FBS mit 10x nicht
mit Label versehener NF-κB-Sonde,
zur Bindungsreaktion hinzugefügt.
-
Zugabe
von Disulfiram und Kupfer direkt zu der Bindungsreaktion verringerte
auch DNA-Bindung an CRE (Figur 5C, Bahn 5). Diese Verringerung war
sogar noch ausgeprägter,
wenn die Bindungsreaktion mit GSH anstelle von DTT als dem Reduktionsmittel
durchgeführt
wurde (5C, Bahn 9), und Inhibierung
von CRE-Bindung durch Disulfiram und Kupfer in der Gegenwart von
GSH wurde partiell umgekehrt durch simultane Zugabe von DTT (5C,
Bahn 10). Elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays (EMSAs) wurden
mit den gleichen Verfahren wie beschrieben durchgeführt. Die
Ergebnisse sind in 5C gezeigt. In Bahn 1, fötales Rinderserum
(FBS) alleine; Bahn 2, FBS + DMSO-Vehikel; Bahn 3, FBS + Disulfiram
(5 μM);
Bahn 4, FBS + 1,6 μM
CuSO4; Bahn 5, FBS + Disulfiram + CuSO4; Bahn 6, FBS alleine; Bahn 7, FBS + Disulfiram;
Bahn 8, FBS + CuSO4; Bahn 9, FBS + Disulfiram
+ CuSO4; Bahn 10, FBS + Disulfiram + CuSO4. In Bahnen 1–5 wurde DTT (2,5 mM) als ein
Reduktionsmittel der Bindungsreaktion hinzugefügt, wohingegen in Bahn 6–9 GSH (3,0 mM)
verwendet wurde. Disulfiram und Kupfer verringerten Transkriptionsfaktorbindung
an CRE, aber die Wirkung war ausgeprägter, wenn die Bindungsreaktion
mit GSH (Bahn 9) anstelle von DTT (Bahn 5) als einem Reduktionsmittel
durchgeführt
wurde. Inhibierung von Bindung an CRE durch Disulfiram und Kupfer
in der Gegenwart von GSH wurde teilweise durch simultane Zugabe
von DTT umgekehrt.
-
Beispiel 8: Andere Metalle
als Kupfer können
die antiproliferative Aktivität
von Disulfiram erhöhen.
-
Die
Absorption von Kupfer sowohl auf dem intestinalen als auch dem zellulären Niveau
wird durch Zinkkationen blockiert, was zu der Verwendung von Zinkacetat
als der bevorzugten Behandlung für
Wilson's Krankheit
führt,
der vererbten Störung
von Kupferüberbelastung.
Siehe Brewer, et al., J. Am. Coll. Nutr. 9:487–491 (1990); Reeves, et al.,
J. Nutr. 126:1701–1712
(1996). Wir haben daher bestimmt, ob Zink-Zusatz zum Medium die
antiproliferative Aktivität
von Disulfiram inhibieren könnte,
welche Kupfer-abhängig
zu sein scheint.
-
M1619
Zellen wurden stimuliert und plattiert wie in Beispiel 1. Nach 24
Stunden wurden die Zellen mit den angegebenen Konzentrationen von
Zinkchlorid (ZnCl2) in der Gegenwart oder
Abwesenheit von 0,625 μM Disulfiram
behandelt. Nach weiteren 24 Stunden wurde die Zellanzahl quantifiziert.
Die Ergebnisse sind in 6A gezeigt. *p < 0,01 verglichen
mit keinem ZnCl2; +p < 0,001 verglichen mit keinem ZnCl2. Überraschend erhöhte auch
Zinkchlorid das antiproliferative Potential von Disulfiram wesentlich.
-
M1619
Zellen, wie oben plattiert und stimuliert, wurden mit FBS alleine,
DMSO-Vehikel (5 μl/ml),
Disulfiram (DS, 0,15 μM),
5 μM Konzentrationen
von Metallsalzen (Kupfersulfat, CuSO4; Silberlactat,
C3H5AgO3; Goldchlorid,
HAuCl4·3H2O) oder der Kombination von DS plus Metallsalzen
behandelt. Nach 48 Stunden wurde die Zellanzahl quantifiziert. *p < 0,05 verglichen
mit DMSO; +p < 0,001
verglichen mit DS alleine. 6B zeigt,
dass nicht nur Kupfer und Zink, sondern auch Salze von Gold und
Silber die antiproliferative Aktivität von Disulfiram synergistisch
verstärken
können.
-
Vor
dem Hintergrund dieser Ergebnisse haben wir Chelate von Disulfiram
mit einer Anzahl von Metallionen, einschließlich Cu2+,
Zn2+, Ag1+, oder
Au3+ synthetisiert. Während der Erzeugung der Disulfiram-Metall-Komplexe
wurde Chelierung der Metallionen aus der wässrigen Phase nahegelegt durch eine
Farbänderung
in der Disulfiram-enthaltenden Chloroformphase (von blassgelb zu
brilliantem goldenen Orange mit Komplexierung von Goldionen). M1619
Zellen, plattiert und stimuliert wie oben, wurden mit FBS alleine,
DMSO-Vehikel (5 μl/ml),
Disulfiram (DS, 160 nM) oder Konzentrationen von Gold-Disulfiram
(AuDS) wie angegeben behandelt. Nach 48 Stunden wurde die Zellanzahl
quantifiziert. *p < 0,001
verglichen mit DMSO; +p < 0,001
verglichen mit DS. 6C zeigt, dass Komplexe von
Disulfiram mit Gold erhöhte
antiproliferative Aktivität
zeigen. Alle Metallkomplexe zeigten erhöhte antiproliferative Aktivität verglichen
mit Disulfiram, aber die aktivste Verbindung wurde gebildet durch
den Komplex von Gold mit Disulfiram (6C), welcher
in nM-Konzentrationen antiproliferativ
war.
-
Beispiel 9: Disulfiram
potenziert die antineoplastische Wirkung von Cisplatin und Carmustin.
-
M1619
Melanom-Zellen wurden in 10 % FBS und RPMI 1640 bei einer Dichte
von 50.000 Zellen/Well in 24-Well-Platten kultiviert. Nach 48 Stunden
wurden dem Medium Cisplatin und 2,5 μM Disulfiram oder DMSO (5 μl pro ml)
zugegeben. Nach weiteren 24 Stunden wurde Proliferation quantifiziert.
Jede Säule
stellt mittlere MTT-Formazan-Extinktion bei einem Minimum von 4
Experimenten dar.
-
M1619
Zellen wurden wie oben kultiviert unter Zugabe von Carmustin und
0, 6 μM
Disulfiram oder DMSO (5 μl
pro ml) zu dem Medium. Nach 24 Stunden wurde Proliferation quantifiziert.
-
Tabelle
2 zeigt, dass die Kombination von Disulfiram und Cisplatin oder
Disulfiram und Carmustin signifikant stärker antiproliferativ gegen
M1619 Zellen ist als Cisplatin oder Carmustin alleine. Jede Zahl
stellt die mittlere MTT-Formazan-Extinktion
bei einem Minimum von 4 Experimenten dar. Ap < 0,05 verglichen
mit DMSO-Vehikel; Bp < 0,01 verglichen mit DMSO-Vehikel; Cp < 0,001
verglichen mit DMSO-Vehikel.
-
Disulfiram
war als ein Wachstumsinhibitor von neoplastischen Zelllinien potenter
als sein Sulfhydrylenthaltender Verwandter PDTC. Als ein Beispiel
war die 50 Inhibitor-Konzentration (IC50)
gegen M1585 Melanom-Zellen etwa 1,25 μM für PDTC, jedoch nur 0,3 μM für Disulfiram.
Dies legt nahe, dass das aktive antiproliferative Konstrukt von
Thiocarbamaten das oxidierte dimere Disulfid ist, statt der reduziertes
Thiol enthaltenden monomeren Form, welche häufig als ein Antioxidationsmittel
verwendet wird.
-
TABELLE
2 DISULFIRAM
POTENZIERT DIE ANTIPROLIFERATIVE AKTIVITÄT VON CHEMOTHERAPEUTISCHEN MITTELN
-
LITERATURSTELLEN
-
- 1. Chinery, R., Brockman, J.A., Peeler, M.O., Shyr, Y.,
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