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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft Verfahren zur Klonierung von Schweinen.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
nachfolgende Diskussion des Hintergrunds der Erfindung dient allein
dazu, dem Leser das Verständnis
der Erfindung zu erleichtern, und ist nicht als Beschreibung oder
Bestandteil des Standes der Technik der vorliegenden Erfindung zulässig.
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Forscher
haben während
der vergangenen beiden Dekaden Verfahren zur Klonierung von Säugetieren
entwickelt. Einige der publizierten Verfahren umfassen die Schritte:
(1) Isolieren einer Zelle, meistens einer embryonalen Zelle; (2)
Inserieren dieser Zelle oder eines Kerns, der aus der Zelle isoliert
wurde, in eine entkernte Oocyte (zum Beispiel wurde der Nukleus
vorher extrahiert); und (3) Maturierenlassen des Embryos in vivo.
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Das
erste erfolgreiche nukleäre
Transferexperiment unter Verwendung von Säugetierzellen wurde 1983 publiziert,
wobei Pronuklei, die aus einer murinen (Maus) Zygote isoliert wurden,
in eine entkernte Oocyte inseriert wurden und lebende Nachkommen erbrachten.
McGrath & Solter,
1983, Science 220: 1300–1302.
Danach beschrieben andere die Herstellung chimärer muriner Embryos (zum Beispiel
Embryos, die eine Untermenge an Zellen enthalten, die gegenüber anderen
Zellen des Embryos eine signifikant unterschiedliche nukleäre DNA aufweisen)
unter Verwendung muriner primordialer Keimzellen (PGCs). Diese Zellen
sind und können
zu pluripotenten Zellen führen.
Matsui et al., 1992, Cell 70: 841–847 und Resnick et al., 1992, Nature
359: 550; Kato et al., 1994, Journal of Reproduction and Fertility
Abstract Series, Society For the Study of Fertility, Annual Conference,
Southampton, 13: 38. Forscher berichteten 1998, dass murine Kumuluszellen
als nukleäre
Donoren in Klonierungsverfahren zur Herstellung klonierter muriner
Tiere verwendet werden können.
Wakayama et al., 1998, Nature 394: 369–374.
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Ein
weiteres nukläres
Transferexperiment wurde 1986 publiziert, wobei eine ovine (Schaf)
embryonale Zelle als nukleärer
Donor in einem Klonierungsverfahren verwendet wurde, aus dem ein
kloniertes Lamm hervorging. Willadsen, 1986, Nature 320: 63–65. Kürzlich wurde über weitere
Lämmer
berichtet, die aus ovinen embryonalen Zellen, serumfreien (serum
deprived) somatischen Zellen, aus embryonalen Discs isolierten Zellen
und aus somatischem Brustgewebe (mammary tissue) kloniert wurden.
Campbell et al., 1996, Nature 380: 64–66; PCT Publikation WO 95/20042;
Wilmut et al., 1997, Nature 385: 10–813; und PCT Publikationen
WO 96/07732 and WO 97/07669. Weitere Ansätze zur Klonierung oviner Tiere
beinhalteten die Manipulation des Aktivierungszustandes einer in
vivo maturierten Oocyte nach dem nukleärem Transfer. PCT Publikation
WO 97/07668. Publikationen, die klonierte Lämmer offenbaren, berichten über eine
Klonierungseffizienz, die bestenfalls bei ungefähr 0.4% liegt. Die Klonierungseffizienz,
wie für
die vorangegangene Abschätzung kalkuliert,
entspricht einem Verhältnis
aus der Anzahl der klonierten Lämmer
dividiert durch die Anzahl der nukleären Transfers, die zur Herstellung
dieser Anzahl klonierter Lämmer
verwendet wurde.
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Ein
weiteres nukleäres
Transferexperiment erbrachte ein kloniertes bovines Tier (Kalb),
wobei das Tier unter Verwendung einer embryonalen Zelle kloniert
wurde, die aus einem Embryo im 2–64 Zellstadium als nukleärem Donor
stammte. Dieses bovine Tier wurde, wie berichtet wurde, mit Hilfe
von Transfertechniken kloniert, wie sie in den U.S. Patenten 4,994,384
und 5,057,420 dargelegt wurden. Andere berichteten, dass klonierte
bovine Embryos erzeugt wurden, wobei eine Zelle der inneren Zellmasse
(inner cell mass) eines Embryos im Blastozystenstadium als nukleärer Donor
in einem nuklären Transferverfahren
verwendet wurde. Sims & First, 1993,
Theriogenology 39: 313 und Keefer et al., 1994, Mol. Reprod. Dev.
38: 264–268.
Zusätzlich
berichtet eine weitere Publikation darüber, dass klonierte bovine
Embryos durch nukleäre
Transfertechniken erzeugt wurden, die eine PGC als nukleären Donor verwenden,
welche aus fötalem
Gewebe isoliert wurde. Delhaise et al., 1995, Reprod. Fert. Develop.
7: 1217–1219;
Lavoir 1994, J. Reprod. Dev. 37: 413–424; und PCT Anmeldung WO
95/10599 mit dem Titel "Embryonic
Stem Cell-Like Cells".
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Im
Hinblick auf porcine Tiere (Schwein) haben Forscher Verfahren zum
Erhalt chimärer
Tiere berichtet, besonders wobei ein nukleärer Donor in eine entkernte
embryonalen Zelle eingebracht wurde. Prather et al., 1989, Biology
of Reproduction 41: 414–418;
Piedrahita et al., 1998, Biology of Reproduction 58: 1321–1329; und
WO 94/26884, "Embryonic
Stem Cells for Making Chimeric and Transgenic Ungulates," Wheeler, veröffentlicht
am 24. November 1994.
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Forscher
haben ebenfalls nukleäre
Transferexperimente für
nukleäre
Donoren aus Schweinen und Schweineoocyten publiziert. Siehe zum
Beispiel Nagashima et al., 1997, Mol. Reprod. Dev. 48: 339–343; Nagashima
et al., 1992, J. Reprod. Dev. 38. 73–78; Prather et al., 1989,
Biol. Reprod. 41. 414–419;
Prather et al., 1990, Exp. Zool. 255: 355–358; Saito et al., 1992, Assis.
Reprod. Tech. Andro. 259: 257–266;
und Trelouw et al., 1992, Theriogenology 37: 309.
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Zusätzlich haben
Forscher Verfahren zur Aktivierung von Schweineoocyten publiziert.
Grocholová et
al., 1997, J. Exp. Zoology 277: 49–56; Schoenbeck et al., 1993,
Theriogenology 40: 257–266; Prather
et al., 1991, Molecular Reproduction and Development 28: 405–409; Jolliff & Prather, 1997,
Biol. Reprod. 56: 544–548;
Mattioli et al., 1991, Molecular Reproduction and Development 30:
109–125;
Terlouw et al., 1992, Theriogenology 37: 309; Prochazka et al.,
1992, J. Reprod. Fert. 96: 725–734;
Funahashi et al., 1993, Molecular Reproduction and Development 36:
361–367;
Prather et al., Bio. Rep. Vol. 50 Sup 1: 282; Nussbaum et al., 1995,
Molecular Reproduction and Development 41: 70–75; Funahashi et al., 1995,
Zygote 3: 273–281;
Wang et al., 1997, Biology of Reproduction 56: 1376–1382; Piedrahita
et al., 1989, Biology of Reproduction 58: 1321–1329, Macháty et al., 1997, Biology
of Reproduction 57: 85–91;
und Macháty
et al., 1995, Biology of Reproduction 52: 753–758.
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Seit
langem besteht jedoch ein Bedarf für Materialien und Verfahren,
die zu einem effizienten nukleären
Transfer unter Verwendung eines nukleären porcinen Donors führen. Dieser
seit langem bestehende Bedarf basiert zum Teil auf einer potentiellen
medizinischen Anwendung, die als Xenotransplantation bekannt ist,
welche Verfahren zur Extraktion von Organen aus Schweinen und Transplantation dieser
Organe in Menschen umfasst, welche derartiger Organe bedürfen. U.S.
Patent Nr. 5,589,582, Hawley et al., erteilt am 31. Dezember 1991;
PCT Anmeldung WO 95/28412, Baetsher et al., veröffentlicht am 26. Oktober 1995;
PCT Anmeldung WO 96/06165, Sachs et al., veröffentlicht am 29. Februar 1996;
PCT Anmeldung WO 93/16729, Bazin, veröffentlicht am 2. September
1993; PCT Anmeldung WO 97/12035, Diamond et al., veröffentlicht
am 3. April, 1997; PCT Anmeldung WO 98/16630, Piedrahita & Bazer, veröffentlicht
am 23. Apri, 1998.
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ZUSAMMENFASSUNG
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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines klonierten
Schweineembryos (porcine embryo; porciner Embryo), ein nicht-chirurgisches Verfahren
zur Erzeugung eines klonierten Schweinefötus (porcine fetus; porciner
Fötus)
und ein nicht-chirurgisches Verfahren zur Erzeugung eines lebendgeborenen
klonierten Schweins (porcine animal; porcines Tier).
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Die
vorliegende Erfindung schafft zahlreiche Vorteile gegenüber Werkzeugen
und Verfahren, die gegenwärtig
zur Klonierung von Schweinen verwendet werden. Derartige Merkmale
und Vorteile umfassen:
Ein Verfahren zur Erzeugung eines klonierten Schweineembryos,
wobei dieses Verfahren umfasst:
- (a) Maturieren
einer Schweineoocyte für
einen Zeitraum von 42 bis 46 Stunden;
- (b) Translozieren einer totipotenten nukleären Donorzelle oder eines Kerns
davon in eine entkernte Schweineoocye, um eine nukleäre Transferoocyte
herzustellen; und
- (c) Aktivieren der nukleären
Transferoocyte, um das Schweineembryo herzustellen.
Ein
nicht-chirurgisches Verfahren zur Erzeugung eines klonierten Schweinefötus, wobei
das Verfahren umfasst: - (a) Erzeugen eines klonierten
Schweineembryos mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens; und
- (b) Implantieren des klonierten Schweineembryos in den Uterus
eines Mutterschweins, um sich zum klonierten Fötus zu entwickeln.
Ein
nicht-chirurgisches Verfahren zur Erzeugung eines lebendgeborenen
klonierten Schweins, wobei dieses Verfahren umfasst: - (a) Erzeugen eines klonierten Embryos mit Hilfe des oben beschriebenen
Verfahrens; und
- (b) Implantieren des klonierten Schweineembryos in den Uterus
des Mutterschweins, um einen Fötus
zu erzeugen, der die vollständige
fötale
Entwicklung und die Geburt durchläuft, um das lebendgeborene
Schwein zu generieren.
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Die
Klonierungseffizienz kann ausgedrückt werden als das Verhältnis zwischen
der Anzahl an Embryos, die aus dem nukleären Transfer resultieren, und
der Anzahl an nukleären
Transfers, die zur Erzeugung der Embryos durchgeführt wurden.
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Alternativ
kann die Klonierungseffizienz ausgedrückt werden als das Verhältnis zwischen
der Anzahl lebendgeborener Tiere und der Anzahl nukleärer Transfers,
die zur Erzeugung dieser Tiere durchgeführt wurden.
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Kultivierte
Zellen
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Es
wird eine totipotente Schweinezelle beschrieben, wobei die totipotente
Zelle selbst keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellt.
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Der
Begriff "porcin", wie hier verwendet, kann
ein beliebiges Tier aus der Familie Suidae bezeichnen. Ein porcines
Tier kann ein Schwein einer beliebigen Art bezeichnen einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf Wildschwein, Hausschwein, Zwergschwein, Warzenschwein, Pekari
und Barboosa. Für Zwergschweine
siehe zum Beispiel Bustad & McClellan,
1968. Lab. Anim. Care. 18: 280–287
und England & Panepinto,
1986, "Conceptual
and operational history of the development of miniature swine," Swine in Biomedical
Research (M. E. Tubleson, Hrsg.), Plenum Press, NY S. 17–22.
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Der
Begriff "totipotent", wie hier verwendet, kann
eine Zelle bezeichnen, die ein lebendgeborenes Tier erzeugt. Der.
Begriff "totipotent" kann ebenfalls eine
Zelle bezeichnen, die zu allen Zellen in einem bestimmten Tier führt. Eine
totipontent Zelle kann zu allen Zellen eines Tieres führen, wenn
sie in einem Verfahren zur Entwicklung eines Embryos aus einem oder
mehr nukleären
Transferschritten verwendet wird. Totipotente Zellen können ebenfalls
verwendet werden, um unvollständige
Tiere zu erzeugen, wie zum Beispiel diejenigen, die zur Organentnahme
(organ harvesting) zweckdienlich sind, zum Beispiel diejenigen,
die genetische Modifikationen aufweisen, um das Wachstum eines Organs
oder eines Fortsatzes durch Manipulation eines homeotischen Gens
zu eliminieren.
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Der
Begriff "lebendgeboren", wie hier verwendet,
bezeichnet vorzugsweise ein Tier, das ex utero existiert. Ein "lebendgeborenes" Tier kann ein Tier
sein, das mindestens eine Sekunde von dem Zeitpunkt lebt, seit dem
es in seiner Mutter (maternal host) existiert. Ein "lebendgeborenes" Tier braucht für sein Überleben
kein Kreislaufsystem einer in utero Umgebung. Ein "lebendgeborenes" Tier kann ein gehfähiges Tier
sein. Solche Tiere können
prä- und post-pubertäre Tiere
umfassen. Wie oben diskutiert, kann einem lebendgeborenen Tier ein
Teil dessen fehlen, was ein normales Tier seiner Art aufweist.
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In
bevorzugten Ausführungsformen,
die keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellen, werden die
totipotenten Zellen (1) kultiviert; (2) als Zelllinien kultiviert;
und (3) als permanente Zelllinien kultiviert.
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Der
Begriff "kultiviert", wie hier im Zusammenhang
mit Zellen verwendet, kann eine oder mehr Zellen bezeichnen, die
in einer in vitro Umgebung eine Zellteilung durchlaufen oder keine
Zellteilung durchlaufen. Eine in vitro Umgebung kann ein beliebiges,
im Stand der Technik bekanntes Medium sein, das zum Erhalt der Zellen
in vitro geeignet ist, wie zum Beispiel geeignete Flüssigmedien
oder Agar. Spezifische Beispiele für geeignete in vitro Umgebungen
für Zellkulturen
werden beschrieben in Culture of Animal Cells: a manual of basic
techniques (3. Auflage), 1994, R. I. Freshney (Hrsg.), Wile-Liss, Inc.; Cells:
a laboratory manual (Vol. 1), 1998, D. L. Spector, R. D. Goldman,
L. A. Leinwand (Hrsg.), Cold Spring Habor Laboratory Press; und
Animal Cells: culture and media, 1994, D. C. Darling, S. J. Morgan John
Wiley and Sons, Ltd. Zellen können
in Suspension und/oder in Monolayern mit einer oder mehr im wesentlichen
gleichen Zellen kultiviert werden. Zellen können in Suspension und/oder
in Monolayern mit einer heterogenen Population von Zellen kultiviert
werden. Der Begriff "heterogen", wie im vorangegangen Satz
verwendet, kann beliebige Zellcharakteristika bezeichnen, wie zum
Beispiel Zelltyp und Phase des Zellzyklus. Zellen können zum
Beispiel in Suspension kultiviert werden, als Monolayer angeheftet
an einen festen Träger
kultiviert werden und/oder auf einer Schicht aus Feeder-Zellen kultiviert
werden. Der Begriff "Feeder-Zellen" wird anschließend definiert. Weiterhin
können
Zellen erfolgreich durch Ausplattieren der Zellen unter Bedingungen
kultiviert werden, unter denen die Zellen keinen Zell/Zell-Kontakt
aufweisen. Vorzugsweise durchlaufen die kultivierten Zellen eine
Zellteilung und werden mindestens 5 Tage kultiviert, vorzugsweise
mindestens 10 Tage oder 20 Tage und am meisten bevorzugt mindestens 30
Tage. Vorzugsweise stirbt (terminate) eine signifikante Anzahl der
kultivierten Zellen nicht ab, während sie
sich in Kultur befinden. Die Begriffe "absterben" und "signifikante Anzahl" werden anschließend definiert. Beinahe jeder
Zelltyp kann unter Zellkulturbedingungen kultiviert werden. Kultivierte
Zellen können
verwendet werden, um eine Zelllinie zu erzeugen.
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Der
Begriff "Zelllinie", wie hier verwendet, kann
kultivierte Zellen bezeichnen, die mindestens einmal ohne Absterben
passagiert werden können. Es
werden Zelllinien beschrieben, die mindestens ein-, zwei-, fünf-, zehn-,
15-, 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 80-, 100-, und 200-mal passagiert
werden könne. Das
Passagieren von Zellen wird anschließend definiert.
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Der
Begriff "absterbend" (terminating) und "absterben" (terminate), wie
hier in Bezug auf kultivierte Zellen verwendet, kann Zellen bezeichnen,
die einen Zelltod erleiden, der mit Hilfe vielfältiger, Fachleuten bekannter
Verfahren gemessen werden kann. (zum Beispiel CytoTox96® Cytotoxicity
Assay, Promega, Inc. Katalog Nr. G1780; Celltiter 96® Aqueous
Cell Proliferatioln Assay Kit, Promega, Inc. Katalog Nr. G3580;
und Trypan Blue solution for cytotoxicity assays, Sigma Katalog
Nr. T6146). Ein Absterben kann ferner das Ergebnis von Apoptose
sein, die mit Hilfe zahlreicher, Fachleuten bekannter Verfahren
gemessen werden kann (zum Beispiel Dead EndTM Apoptosis
Detection Kit, Progema, Inc. Katalog Nr. G7130). Abgestorbene Zellen
können
als diejenigen identifiziert werden, die Zelltod und/oder Apoptose
erlitten haben, und die von einer festen Oberfläche in die Kultur freigesetzt
wurden. Zusätzlich
können
abgestorbenen Zellen intakte Membranen fehlen, die mit Hilfe der
oben beschriebenen Verfahren identifiziert werden könne. Abgestorbene
Zellen können
ebenfalls eine verminderte metabolische Aktivität aufweisen, die zum Teil durch
eine verminderte mitochondriale Aktivität hervorgerufen werden kann,
welche zum Beispiel durch Rhodamin 1, 2, 3 identifiziert werden
kann. Weiterhin kann "absterben" Zellkulturen bezeichnen,
in denen eine signifikante Zahl kultivierter Zellen abstirbt. Der
Begriff "signifikante
Zahl" im vorangegangenen
Satz kann sich auf etwa 80% der Zellen in der Kultur beziehen, vorzugsweise
auf etwa 90% der Zellen in der Kultur, noch mehr bevorzugt auf etwa
100% der Zellen in der Kultur, und am meisten bevorzugt auf 100%
der Zellen in der Kultur.
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Der
Begriff "Suspension", wie hier verwendet,
kann Zellkulturbedingungen bezeichnen, unter denen die Zellen nicht
an einem festen Träger
angeheftet sind. In Suspension proliferierende Zellen können während der
Proliferation unter Verwendung einer Fachleuten bekannten Vorrichtung
gerührt
werden.
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Der
Begriff "Monolayer", wie hier verwendet, kann
Zellen bezeichnen, die an einen festen Träger angeheftet sind, während sie
unter geeigneten Kulturbedingungen proliferieren. Ein kleiner Teil
der Zellen, die in einem Monolayer unter geeigneten Wachstumsbedingungen
proliferieren, können
an Zellen im Monolayer, nicht aber am festen Träger angeheftet sein. Vorzugsweise
sind weniger als 15% dieser Zellen nicht an den festen Träger angeheftet,
bevorzugt sind weniger als 10% dieser Zellen nicht an den festen
Träger
angeheftet, und am meisten bevorzugt sind weniger als 5% dieser
Zellen nicht an den festen Träger
angeheftet.
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Der
Begriff "im wesentlichen
gleich", wie hier in
Bezug auf Schweinezellen verwendet, kann sich auf Zellen des gleichen
Organismus und des gleichen Gewebes beziehen. Der Begriff "im wesentlichen gleich" kann sich auch auf
Zellpopulationen beziehen, die sich nicht signifikant differenziert
haben. Vorzugsweise haben sich etwa weniger als 15% der Zellen in
einer Population von Zellen differenziert, bevorzugt haben sich
weniger als 10% der Zellpopulation differenziert, und am meisten
bevorzugt haben sich weniger als 5% der Zellpopulation differenziert.
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Der
Begriff "plattiert" oder "plattieren", wie hier in Bezug
auf Zellen verwendet, kann sich auf die Erzeugung von Zellkulturen
in vitro beziehen. Beispielsweise können Zellen in Zellkulturmedien
verdünnt
und im Anschluss in eine Zellkulturplatte, -schale oder -flache
gegeben werden. Zellkulturplatten sind Durchschnittsfachleuten üblicherweise
bekannt. Zellen können
in einer Vielzahl von Konzentrationen und/oder Zelldichten plattiert
werden.
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Der
Begriff "Plattieren
von Zellen" kann
ferner zum Begriff "Passagieren
von Zellen" ausgeweitet
werden. Die Zellen der Erfindung können mit Hilfe Fachleuten bekannter
Zellkulturverfahren passagiert werden. Der Begriff "Passagieren von Zellen" kann sich auf ein
Verfahren beziehen, dass die Schritte umfasst: (1) Freisetzen der
Zellen von einem festen Träger
oder Substrat und Dissoziation dieser Zellen, und (2) Verdünnen der
Zellen in Medien, die für
die weitere Zellproliferation geeignet sind. Passagieren von Zellen
kann sich ferner das Entfernen eines Teils des Flüssigmediums,
das die kultivierten Zellen enthält,
und das Hinzufügen
von Flüssigmedium
zum ursprünglichen
Kulturgefäß bezeichnen,
um die Zellen zu verdünnen
und die weitere Zellproliferation zu ermöglichen. Zusätzlich können auch
Zellen in ein neues Kulturgefäß überführt werden,
das mit einem für die
weitere Zellproliferation geeigneten Medium supplementiert wurde.
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Der
Begriff "Proliferation", wie hier in Bezug auf
Zellen verwendet, kann sich auf eine Gruppe von Zellen beziehen,
deren Zahl während
einer bestimmten Zeitperiode zunehmen kann.
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Der
Begriff "Konfluenz", wie hier verwendet, kann
sich auf eine Gruppe von Zellen beziehen, wobei ein hoher Prozentanteil
der Zellen physikalisch mit mindestens einer anderen Zelle in dieser
Gruppe in Kontakt steht. Konfluenz kann ebenfalls definiert werden
als eine Gruppe von Zellen, die unter den bereitgestellten Bedingungen
bis zu einer maximalen Zelldichte wächst. Falls zum Beispiel eine
Gruppe von Zellen in einem Monolayer proliferieren kann, und diese
in eine Kulturgefäß in ein
geeignetes Wachstumsmedium gegeben wird, sind diese Zellen konfluent,
wenn sich der Monolayer über
einen signifikanten Oberflächenbereich
des Kulturgefäßes ausgedehnt
hat. Der mit den Zellen bedeckte Oberflächenbereich repräsentiert
vorzugsweise etwa 50% des gesamten Oberflächenbereichs, noch bevorzugter
repräsentiert
er etwa 70% des gesamten Oberflächenbereichs
und am meisten bevorzugt repräsentiert
er etwa 90% des gesamten Oberflächenbereichs.
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Der
Begriff "permanent" oder "immortalisiert", wie hier in Bezug
auf Schweinezellen verwendet, kann sich auf Zellen beziehen, die
eine Zellteilung durchlaufen und sich hinsichtlich der Zellzahlen verdoppeln
können,
während
sie in einer in vitro Umgebung viele Male kultiviert werden, bis
die Zellen absterben. Eine permanente Zelllinie kann sich mehr als
10-mal verdoppeln, bevor eine signifikante Zahl an Zellen in der
Kultur abstirbt. Vorzugsweise kann sich eine permanente Zelllinie
mehr als 20-mal oder mehr als 30-mal verdoppeln, bevor eine signifikante Zahl
an Zellen in der Kultur abstirbt. Noch bevorzugter kann sich eine
permanente Zelllinie über
40-mal oder 50-mal
verdoppeln, bevor eine signifikante Zahl an Zellen in der Kultur
abstirbt. Am meisten bevorzugt kann sich eine permanente Zelllinie über 60-mal verdoppeln,
bevor eine signifikante Zahl an Zellen in der Kultur abstirbt. Der
Begriff "absterben" wurde oben beschrieben.
Eine Zellverdopplung kann durch Zählen der Zellzahlen in der
Kultur mit Hilfe von Durchschnittsfachleuten bekannten Verfahren
bestimmt werden. Als ein Maß für die Zellkulturdauer (permanence)
kann die Anzahl von Verdopplungen gemessen werden, bis eine signifikante
Zahl an Zellen in der Kultur abstirbt. Der Begriff "signifikante Zahl" wurde ebenfalls
oben beschrieben.
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Permanente
Zellen können
von nicht-permanenten Zellen auf der Grundlage unterschieden werden,
dass permanente Zellen in geringeren Dichten passagiert werden können als
nicht-permanente
Zellen. Insbesondere können
permanente Zellen bis zur Konfluenz angezogen werden (anschließend beschrieben),
wenn die Bedingungen der Plattierung keinen physischen Kontakt zwischen
den Zellen erlauben. Daher können
permanente Zellen von nicht-permanenten Zellen unterschieden werden, wenn
die Zellen in Zelldichten plattiert werden, bei denen die Zellen
nicht physisch in Kontakt miteinander stehen.
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(1)
Totipotente Zellen, wobei die totipotente Zellen selbst keinen Teil
der vorliegenden Erfindung darstellen, sind nicht positiv für alkalische
Phosphatase (die Zellen zeigen zum Beispiel keine nennenswerte Färbung für alkalische
Phosphatase); (2) totipotente Zellen entstehen aus mindestens einer
Vorläuferzelle
(precursor cell); (3) eine Vorläuferzelle wird
isoliert aus und/oder entsteht aus einer beliebigen Region eine
Schweins; (4) eine Vorläuferzelle wird
isoliert aus und/oder entsteht aus einer beliebigen Zelle in Kultur;
(5) eine Vorläuferzelle
wird aus der Gruppe ausgewählt,
die aus einer nicht-embryonalen Zelle, einer nicht-fötalen Zelle;
einer differenzierten Zelle, einer undifferenzierten Zelle, einer
somatischen Zelle, einer embryonalen Zelle, einer fötalen Zelle,
einer embryonalen Stammzelle, einer primordialen Keimzelle, einer
Zelle der Keimleiste, einer Kumuluszelle, einer amniotischen Zelle,
einer fötalen Fibroblastenzelle,
einer Hepatocyte, einer embryonalen Keimzelle, einer adulten Zelle,
einer aus einer asynchronen Population von Zellen isolierten Zelle und
einer aus einer synchronisierten Population von Zellen isolierten
Zelle besteht, wobei die synchrone Population nicht im G0 Zustand des Zellzyklus arretiert ist; (6)
totipotente Zellen weisen eine Morphologie embryonaler Keimzellen
auf.
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Der
Begriff "positiv
für alkalische
Phosphatase", wie
hier verwendet, kann sich auf die detektierbare Präsenz zellulärer alkalischer
Phosphatase beziehen. Zellen, die nicht positiv für alkalische
Phosphatase sind, zeigen keine nennenswerte Färbung bei Verwendung eines
Verfahrens zur Visualisierung zellulärerer alkalischer Phosphatase.
Verfahren zum Detektieren der Gegenwart zellulärerer alkalischer Phosphatase
sind Durchschnittsfachleuten bekannt. Siehe zum Beispiel Matsui
et al., 1991, "Effect
of Steel Factor and Leukemia Inhibitory Factor on Murine Primordial
Germ Cells in Culture," Nature
353: 750–752.
Beispiele für
Zellen, die eine nennenswerte Färbung
für alkalische
Phosphatase zeigen, sind dem Stand der Technik bekannt. Siehe zum
Beispiel das U.S. Patent 5,453,357 mit dem Titel "Pluripotent Embryonic
Stem Cells and Methods of Making Same," erteilt an Hogan am 26. September 1995.
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Der
Begriff "Vorläuferzelle" oder "Vorläuferzellen", wie hier verwendet,
kann eine Zelle oder Zellen bezeichnen, die zur Erzeugung kultivierter Schweinezellen
oder einer kultivierten Schweinezelllinie verwendet werden. Eine
Vorläuferzelle
oder Vorläuferzellen
können
aus nahezu jeder zellulären
Einheit isoliert werden. Beispielsweise können eine Vorläuferzelle
oder Vorläuferzellen
aus Blastozysten, Embryos, Föten
und Zelllinien isoliert werden (zum Beispiel Zelllinien, die aus
embryonalen Zellen erzeugt wurden), werden vorzugsweise aus Föten und/oder
Zelllinien isoliert, die aus fötalen
Zellen erzeugt wurden, und werden noch bevorzugter aus ex utero
Tieren und/oder Zellkulturen und/oder Zelllinien isoliert, die aus
solchen ex utero Tieren etabliert wurden. Ein ex utero Tier kann
als neugeborenes Tier vorliegen (zum Beispiel 5 Tage nach der Geburt),
als heranwachsendes (adolescent) Tier (zum Beispiel als präpubertierendes
Tier), als pubertierendes Tier (zum Beispiel nach Ovulation oder
der Produktion lebensfähiger
Spermien) und als adultes Tier (zum Beispiel postpubertär). Ex utero
Tiere können
lebend sein oder post mortem. Vorläuferzellen können kultiviert
werden oder nicht kultiviert werden. Weiterhin können Vorläuferzellen zu einem bestimmten
Zeitpunkt kryokonserviert oder eingefroren sein (zum Beispiel können kryokonservierte
Zellen als Vorläuferzellen
zur Erzeugung einer Zellkultur verwendet werden). Diese Beispiele
sind als nicht einschränkend
zu verstehen, und eine weitere Beschreibung dieser beispielhaften
Vorläuferzellen
wird nachfolgend bereitgestellt.
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Der
Begriff "entstehen
aus" (arise from),
wie hier verwendet, kann sich auf die Umwandlung von ein oder mehr
Zellen in eine oder mehr Zellen beziehen, welche mindestens eine
unterschiedliche Eigenschaft aufweisen. Beispielsweise kann (1)
eine nicht-totipotente Vorläuferzelle
durch Verwenden der nachfolgend beschriebenen Merkmale der Erfindung in
eine totipotente Zelle umgewandelt werden; (2) eine Vorläuferzelle
kann eine Zellmorphologie einer embryonalen Keimzelle entwickeln;
(3) eine Vorläuferzelle
kann zu einer kultivierten Zelle führen; (4) eine Vorläuferzelle
kann zu einer kultivierten Zelllinie führen; und (5) eine Vorläuferzelle
kann zu einer kultivierten permanenten Zelllinie führen. Ein
Umwandlungsverfahren kann als Reprogrammierungsschritt bezeichnet
werden. Zusätzlich
kann sich der Begriff "entstehen
aus" auf die Erzeugung
totipotenter Embryos aus totipotenten Zellen und unter Verwendung eines
nukleären
Transferprozesses beziehen, wie nachfolgend beschrieben.
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Der
Begriff "reprogrammieren" oder "reprogrammiert", wie hier verwendet,
kann sich auf Materialien und Verfahren beziehen, die eine Zelle
in eine andere Zelle umwandeln können,
welche mindestens eine unterschiedliche Eigenschaft aufweist. Solche Materialien
und Methoden können
ferner eine Zelle in einen anderen Zelltyp reprogrammieren oder
umwandeln, welcher typischerweise nicht während des Lebenszyklus der
ursprünglichen
Zelle exprimiert wird. Beispielsweise kann (1) eine nicht-totipotente Zelle
in eine totipotente Zelle Reprogrammiert werden; (2) eine Vorläuferzelle
kann in eine Zelle mit der Morphologie einer EG-Zelle reprogrammiert
werden; und (3) eine Vorläuferzelle
kann in eine totipotente Zelle reprogrammiert werden. Ein Beispiel
für Materialien
und Verfahren zur Umwandlung einer Vorläuferzelle in eine totipotente
Zelle mit EG-Zellmorphologie wird anschließend beschrieben.
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Der
Begriff "isoliert", wie hier verwendet, kann
sich auf eine Zelle beziehen, die mechanisch von einer weiteren
Gruppe von Zellen getrennt ist. Beispiele für eine Gruppe von Zellen sind
eine sich entwickelnde Zellmasse, eine Zellkultur, eine Zelllinie und
ein Tier. Diese Beispiele sind als nicht einschränkend zu verstehen, und die
Erfindung betrifft isolierte Zellen, die aus der Gruppe ausgewählt werden,
welche aus einer nicht-embryonalen Zelle, einer differenzierten
Zelle, einer Fibroblastenzelle, einer primordialen Keimzelle, einer
Zelle der Keimleiste, einer embryonalen Zelle, einer Kumuluszelle
und einer amnyotischen Zelle besteht. Verfahren zur Isolierung von einer
oder mehr Zellen aus einer weiteren Gruppe von Zellen sind im Stand
der Technik bekannt. Siehe zum Beispiel Culture of Animal Cells:
a manual of basics techniques (3. Auflage), 1994, R. I: Freshney (Hrsg.),
Wiley-Liss, Inc.;
Cells: a laboratory manual (Vol. 1), 1998, D. L. Spector, R. D.
Goldman, L. A. Leinwand (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press;
und Animal Cells: culture and media, 1994, D. C. Darling, S. J.
Morgan, John Wiley and Sons, Ltd.
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Der
Begriff "nicht-embryonale
Zelle", wie hier verwendet,
kann sich auch eine Zelle beziehen, die nicht aus einem Embryo isoliert
wurde. Nicht-embryonale Zellen können
differenziert oder nicht-differenziert sein. Nicht-embryonale Zellen
können
nahezu jede somatische Zelle betreffen, wie zum Beispiel Zellen,
die aus einem ex utero Tier isoliert wurden. Diese Bespiele sind
als nicht einschränkend
zu verstehen.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff "Embryo" oder "embryonal", wie hier verwendet,
eine sich entwickelnde Zellmasse, die nicht in eine Uterusmembran
eines maternalen Wirts eingesetzt wurde. Daher kann der Begriff "Embryo", wie hier verwendet,
eine fertilisierte Oocyte, ein Cybrid (hierin definiert), eine sich
entwickelnde Zellmasse im Präblastocystenstadium
und/oder eine beliebige andere sich entwickelnde Zellmasse bezeichnen,
die sich in einem Entwicklungsstadium vor der Implantation in eine
Uterusmembran eines maternalen Wirts befindet. Embryos der Erfindung
müssen
keine Keimleiste aufweisen. Daher wird eine "embryonale Zelle" aus einem Embryo isoliert und/oder
ist aus diesem entstanden.
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Ein
Embryo kann multiple Stadien der Zellentwicklung darstellen. Beispielsweise
kann ein Zellembryo als eine Zygote bezeichnet werden, eine feste
sphärische
Masse aus Zellen, die aus einem geteilten Embryo stammt, kann als
eine Morula bezeichnet werden, und ein Embryo, der ein Blastocoel aufweist,
kann als ein Blastocyst bezeichnet werden.
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Der
Begriff "Fötus", wie hier verwendet,
kann eine sich entwickelnde Zellmasse bezeichnen, die in die Uterusmembran
eines maternalen Wirts implantiert wurde. Ein Fötus kann solch definierende
Merkmale wie zum Beispiel eine Keimleiste umfassen. Eine Keimleiste
ist ein für
den Durchschnittsfachmann leicht zu identifizierendes Merkmal und
ist in den Föten
der meisten Tierarten ein wiedererkennbares Merkmal. Der Begriff "fötale Zelle", wie hier verwendet, kann eine beliebige
Zelle bezeichnen, die aus einem Fötus isoliert wurde und/oder
daraus entstanden ist oder aus einem Fötus abstammt, einschließlich amniotischer
Zellen. Der Begriff "nicht-fötale Zelle" ist eine Zelle,
die nicht aus einem Fötus abstammt
oder daraus isoliert wurde.
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Wenn
Vorläuferzellen
aus einem Fötus
isoliert werden, werden solche Vorläuferzelle vorzugsweise aus
Schweineföten
isoliert, wobei sich das Alter des Fötus zwischen 20 Tagen und der
Geburt bewegt, zwischen 30 Tagen und 100 Tagen, bevorzugter zwischen
35 Tagen und 70 Tagen und zwischen 40 Tagen und 60 Tagen, und am
meisten bevorzugt wird ein etwa 55 Tage alter Fötus. Das Alter eines Fötus kann
durch den Zeitpunkt bestimmt werden, an dem ein Embryo, der sich
in den Fötus
entwickelt, etabliert wird. Ein Zweizell-Embryo kann beispielsweise
als ein Tag 1-Embryo bezeichnet werden, der sich in einen Tag 54-Fötus entwickeln
kann. Der Begriff "etwa" im Hinblick auf
Föten kann
plus oder minus fünf
Tage bedeuten.
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Der
Begriff "Geburt" (parturition), wie
hier verwendet, kann den Zeitpunkt bezeichnen, zu dem ein Fötus vom
weiblichen Empfänger
entbunden wird, Ein Fötus
kann vom weiblichen Empfänger durch
Schwangerschaftsabbruch, Kaiserschnitt (c-section) oder natürliche Geburt entbunden werden.
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Der
Begriff "primordiale
Keimzelle", wie
hier verwendet, kann eine diploide Vorläuferzelle bezeichnen, die dazu
in der Lage ist, eine Keimzelle zu werden. Primordiale Keimzellen
können
aus einem beliebigen Gewebe einer sich entwickelnden Zellmasse isoliert
werden und werden vorzugsweise aus den Zellen der Keimleiste einer
sich entwickelnden Zellmasse isoliert. Eine Keimleiste ist ein Bereich
einer sich entwickelnden Zellmasse, der Durchschnittsfachleuten
bekannt ist. Siehe zum Beispiel Strelchenko, 1996, Theriogenology
45: 130–141
und Lavoir 1994, J. Reprod. Dev. 37: 413–424.
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Der
Begriff "embryonale
Stammzelle", wie hier
verwendet, kann pluripotente Zellen bezeichnen, die aus einem Embryo
isoliert werden, und die in in vitro Zellkultur kultiviert werden.
Embryonale Stammzellen können
mit oder ohne Feeder-Zellen
kultiviert werden. Embryonale Stammzellen können aus embryonalen Zellen
etabliert werden, welche aus Embryos in einem beliebigen Entwicklungszustand
isoliert werden, einschließlich
Embryos im Blastocystenstadium und Embryos im Präblastocystenstadium. Embryonale
Stammzellen können
eine abgerundete Zellmorphologie aufweisen und können in abgerundeten Zellklumpen
auf Feeder-Schichten wachsen. Embryonale Stammzellen sind Durchschnittsfachleuten
bekannt. Siehe zum Beispiel WO 97/37009 mit dem Titel "Cultured Inner Cell
Mass Cell-Lines Derived from Ungulate Embryos," Stice and Golueke, veröffentlicht
am 9. Oktober 1997, und Yang & Anderson,
1992, Theriogenology 38: 315–335;
Piedrahita et al., 1998, Biol. Reprod. 58: 1321–1329; Wianny et al., 1997,
Biol. Reprod. 57: 756–764;
Moore & Piedrahita,
1997, In Vitro Cell Biol. Anim. 33: 62–71; Moore, & Piedrahita, 1996,
Mol. Reprod. Dev. 45: 139–144; Wheeler,
1994, Reprod. Fert. Dev. 6: 563–568;
Hochereau-de Riviers & Perreau,
Reprod. Nutr. Dec. 33: 475–493;
Strojek et al., 1990, Theriogenology 33: 901–903; Piedrahita et al., 1990,
Theriogenology 34: 879–901;
und Evans et al., 1990 Theriogenology 33: 125–129.
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Der
Begriff "differenzierte
Zelle", wie hier
verwendet, kann eine Vorläuferzelle
bezeichnen, die sich aus einem unspezialisierten Phänotyp in
einen spezialisierten Phänotyp
entwickelt hat. Beispielsweise können
sich embryonale Zellen in epitheliale Zellen differenzieren, welche
den Magen auskleiden. Materialien und Verfahren der Erfindung können differenzierte
Zelle in totipotente Zellen reprogrammieren. Differenzierte Zellen
können
zum Beispiel aus einem Fötus
oder einem lebend geborenen Tier isoliert werden.
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Der
Begriff "undifferenzierte
Zelle", wie hier verwendet,
kann eine Vorläuferzelle
bezeichnen, die einen unspezialisierten Phänotyp aufweist und zur Differenzierung
imstande ist. Ein Beispiel einer undifferenzierten Zelle ist eine
Stammzelle.
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Der
Begriff "asynchrone
Population", wie
hier verwendet, kann Zellen bezeichnen, die nicht in einem beliebigen
Zustand des Zellzyklus arretiert sind. Viele Zellen können den
Zellzyklus durchlaufen und werden in keinem Stadium arretiert, während andere Zellen
in einem Stadium des Zellzyklus für eine bestimmte Zeitdauer
arretiert werden. Einige bekannte Stadien des Zellzyklus sind G1, S, G2 und M. Eine asynchrone
Population von Zellen wird nicht manipuliert, um die Zellen in einer beliebigen
oder vorzugsweise in einer bestimmten dieser Phasen zu synchronisieren.
Die Zellen können
beispielsweise mit Hilfe zahlreicher, im Stand der Technik bekannter
Verfahren, wie zum Beispiel durch Einwirkung Colcemid, im M Stadium
des Zellzyklus arretiert werden. Beispiele für Verfahren zur Arretierung
von Zellen in einem Stadium des Zellzyklus werden in WO 97/07669
mit dem Titel "Quiescent
Cell Populations for Nuclear Transfer" diskutiert.
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Die
Begriffe "synchrone
Population" und "synchronisieren", wie hier verwendet,
können
eine Fraktion von Zellen in einer Population bezeichnen, die sich
im selben Stadium des Zellzyklus befinden. Vorzugsweise werden etwa
50% der Zellen in einer Zellpopulation in einem Stadium des Zellzyklus
arretiert, bevorzugt werden etwa 70% der Zellen einer Zellpopulation
in einem Stadium des Zellzyklus arretiert, und am meisten bevorzugt
werden etwa 90% der Zellen einer Zellpopulation in einem Stadium
des Zellzyklus arretiert. Ein Stadium des Zellzyklus kann aufgrund
der relativen Zellgröße sowie
durch eine Vielzahl von Zellmarkern unterschieden werden, die Durchschnittsfachleuten
bekannt sind. Beispielsweise können
Zellen anhand solcher Marker mit Hilfe von Durchflusscytometrieverfahren
unterschieden werden, die Durchschnittsachleuten bekannt sind. Alternativ
können
die Zellen durch größenabhängige (size
utilizing) Verfahren unterschieden werden, die Durchschnittsfachleuten
bekannt sind, wie zum Beispiel durch Verwendung eines Lichtmikroskops
und eines Mikrometers. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen
durch Arretierung in einem diskreten Zustand des Zellzyklus synchronisiert (i.e.
die Zellen teilen sich nicht).
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Die
Begriffe "embryonale
Keimzelle" und "EG-Zelle", wie hier verwendet,
können
eine kultivierte Zelle bezeichnen, die eine distinkte abgeflachte Morphologie
aufweist und innerhalb von Monolayern in Kultur wachsen kann. Eine
EG-Zelle kann verschieden sein von einer Fibroblastenzelle. Diese
EG Zellmorphologie ist zu unterscheiden von Zellen, die eine sphärische Morphologie
aufweisen und multizelluläre
Klumpen auf Feeder-Schichten ausbilden. Embryonale Keimzellen aus
Schweinen brauchen nicht notwendigerweise die Gegenwart von Feeder-Schichten
oder die Gegenwart von Wachstumsfaktoren in den Zellkulturmedien.
Embryonale Keimzellen aus Schweinen wachsen ebenfalls bei verminderten
Verdopplungsraten, wenn sich die Zellen auf den Kulturplatte ihrer
Konfluenz nähern.
Embryonale Keimzellen aus Schweinen können totipotent sein. Embryonale
Keimzellen aus Schweinen müssen nicht
nennenswert hinsichtlich alkalischer Phosphatase gefärbt werden.
Vorzugsweise werden embryonale Keimzellen aus Schweinen in Kulturmedien
etabliert, die eine signifikante Konzentration an Glukose enthalten,
wie hier beschrieben.
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Embryonale
Keimzellen aus Schweinen können
aus einer Zellkultur eines nahezu jeden Typs von Schweinevorläuferzellen
erzeugt werden. Beispiele für
Vorläuferzellen
werden hier diskutiert, und eine bevorzugte Vorläuferzelle zur Erzeugung von
embryonalen Schweinekeimzellen ist eine Zelle aus der Keimleiste
eines Fötus.
Zellen aus der Keimleiste werden vorzugsweise aus Schweineföten isoliert, wobei
das Alter des Fötus
zwischen 20 Tagen und der Geburt, zwischen 30 Tagen und 100 Tagen
liegt, bevorzugter zwischen 35 Tagen und 70 Tagen, bzw. zwischen
40 Tagen und 60 Tagen, und am meisten bevorzugt wird ein etwa 55
Tage alter Fötus.
Das Alter eines Fötus
kann wie oben beschrieben bestimmt werden. Der Begriff "etwa" im Hinblick auf
Föten kann sich
auf plus oder minus fünf
Tage erstrecken. Wie hier beschrieben, können EG-Zellen physikalisch
aus primären
Zellkulturen isoliert werden, diese isolierten EG-Zellen können verwendet
werden, um eine Zellkultur zu erzeugen, die eventuell eine homogene oder
nahezu homogene Zelllinie aus EG-Zellen bildet.
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Die
Begriffe "Morphologie" und "Zellmorphologie", wie hier verwendet,
können
die Form, Struktur sowie die physikalischen Eigenschaften von Zellen bezeichnen. Beispielsweise
betrifft eine Zellmorphologie signifikante Spiegel an alkalischer
Phosphatase, und diese Zellmorphologie kann identifiziert werden,
indem bestimmt wird, ob eine Zelle nennenswert im Bezug auf alkalische
Phosphatase gefärbt
wird. Ein weiteres Beispiel einer Zellmorphologie ist es, ob eine
Zelle ein flaches oder rundes Erscheinungsbild aufweist, wenn sie
auf einer Oberfläche
oder in Gegenwart einer Schicht aus Feeder-Zellen kultiviert wird.
Viele andere Zellmorphologien sind Durchschnittsfachleuten bekannt,
und Zellmorphologien sind einfach mit Hilfe von Materialen und Methoden, die
im Stand der Technik bekannt sind, identifizierbar. Siehe zum Beispiel
Culture of Animal Cells: a manual of basic techniqes (3. Auflage),
1994, R. I. Freshney (Hrsg.), Wiley-Liss, Inc.
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Der
Begriff "Kumuluszelle", wie hier verwendet,
kann eine beliebige kultivierte oder nicht-kultivierte Zelle bezeichnen,
die aus Zellen und/oder Geweben isoliert wird, welche eine Oocyte
umgeben. Fachleute können
eine Kumuluszelle einfach identifizieren. Beispiele für Verfahren
zur Isolation und Kultivierung von Kumuluszellen werden diskutiert
in Damiani et al., 1996, Mol. Reprod. Dev. 45: 521–534; Long
et al., 1994, J. Reprod. Fert. 102: 361–369; und Wakayama et al.,
1998, Nature 394: 396–373.
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Der
Begriff "amniotische
Zelle", wie hier
verwendet, kann eine kultivierte oder nicht-kultivierte Zelle bezeichnen,
die aus amniotischen Fluid oder Geweben in Kontakt mit dem amniotischen
Fluid isoliert wird. Fachleute können
eine amniotische Zelle einfach identifizieren. Beispiele für Verfahren
zur Isolierung und Kultivierung amniotischer Zellen werden diskutiert
in Bellow et al., 1996, Theriogenology 45: 225; Gracia & Salaheddine,
1997, Theriogenology 47: 1003–1008;
Leibo & Rail,
1990 Theriogenology 33: 531–552;
und Vos et al., 1990, Vet. Rec. 127: 502–504.
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Der
Begriff "fötale Fibroblastenzelle", wie hier verwendet,
kann eine beliebige differenzierte fötale Schweinezelle bezeichnen,
die das Erscheinungsbild eines Fibroblasten aufweist. Fibroblasten können ein
abgeflachtes Erscheinungsbild aufweisen, wenn sie in Kulturmedienplatten
kultiviert werden. Fötale
Fibroblastenzellen können
ferner eine spindelähnliche
Morphologie aufweisen, wobei die Dichte limitierend für das Wachstum
ist, und können eine
begrenzte Lebensspanne in Kultur von etwa 50 Generationen aufweisen.
Zusätzlich
können
fötale Fibroblastenzellen
rigide einen diploiden Chromosomensatz aufrechterhalten und können. Typ
I Kollagen generieren. Für
eine Beschreibung von Fibroblastenzellen siehe zum Beispiel Culture
of Animal Cells: a manual of basic techniques (3. Auflage), 1994,
R. I. Freshney (Hrsg.), Wiley-Liss, Inc.
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Der
Begriff "adulte
Zelle", wie hier
verwendet, kann eine beliebige Zelle bezeichnen, die aus einem adulten
Schwein isoliert wurde. Eine derartige adulte Zelle kann aus einem
beliebigen Teil des Schweins isoliert werden einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf die Haut von einem Ohr, die Haut von einer Abdominalregion,
Niere, Leber, Herz und Lunge. Verfahren zur Kultivierung derartiger
adulter Zellen sind nachfolgend dargestellt.
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(1)
Totipotente Schweinezellen, wobei die totipotenten Zellen selbst
keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellen, umfassen modifizierte
nukleäre DNA;
(2) eine modifizierte nukleäre
DNA umfasst eine DNA-Sequenz, die ein rekombinantes Produkt kodiert;
(3) ein rekombinantes Produkt ist ein Polypeptid; (4) ein rekombinantes
Produkt ist ein Ribozym; (4) ein rekombinantes Produkt wird in einem
biologischen Fluid oder einem Gewebe exprimiert; (5) ein rekombinantes
Produkt verleiht Resistenz oder verleiht teilweise Resistenz gegenüber einer
oder mehr Erkrankungen; (6) ein rekombinantes Produkt verleiht Resistenz
oder teilweise Resistenz gegenüber
einem oder mehr Parasiten; (7) eine modifizierte nukleäre DNA umfasst
mindestens eine andere DNA Sequenz, die als regulatorisches Element
fungieren kann; (8) ein regulatorisches Element wird aus der Gruppe ausgewählt, die
aus Promotor, Enhancer, Insulator und Repressor besteht; und (9)
ein regulatorisches Element wird aus der Gruppe ausgewählt, die aus
Milchproteinpomotor, Urinproteinpromotor, Blutproteinpromotor, Tränenkanalproteinpromotor,
Synovialproteinpromotor, Manibulärdrüsenproteinpromotor,
Caseinpromotor, β-Caseinpromoter, Melanorcortinpromotor,
Milchserumproteinpromotor, dem α-Lactalbuminpromotor,
saurer Molkeproteinpromotor, Uroplaktipromotor und α-Aktinpromotor
besteht.
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Der
Begriff "modifizierte
nukleäre
DNA", wie hier verwendet,
kann eine nukleäre
Deoxyribonukleinsäuresequenz
einer Zelle, eines Embryos, eines Fötus oder eines Tiers bezeichnen,
die mit Hilfe von einem oder mehr rekombinanten DNA Verfahren manipuliert
wurde. Beispiele für
rekombinante DNA Verfahren sind Durchschnittsfachleuten bekannt.
Diese können
umfassen: (1) Inserieren einer DNA-Sequenz aus eines anderen Organismus
(zum Beispiel einem humanen Organismus) in eine nukleäre Ziel
(target)-DNA, (2) Deletieren von einer oder mehr DNA-Sequenzen aus
einer nukleären
Ziel-DNA, und (3) Einführen
von einer oder mehr Basenmutationen (zum Beispiel ortsgerichtete
Mutationen) in eine nukleäre
Ziel-DNA. Zellen mit einer modifizierten nukleären DNA können im Rahmen dieser Erfindung
als "transgene Zellen" bezeichnet werden.
Transgene Zellen können
als Materialien für
Klonierungsverfahren mittels nukleärem Transfer zweckdienlich
sein, die hier bereitgestellt werden.
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Verfahren
und Werkzeuge zur Insertion, Deletion und Mutation nukleärer DNA
aus Säugetierzellen
sind Durchschnittsfachleuten bekannt. Siehe Molecular Cloning, a
Laboratory Manual, 2nd Ed., 1989, Sambrook, Fritsch and Maniatis,
Cold Spring Habor Laboratory Press; U.S. Patent 5,633,067, "Method of Producing
a Transgenetic Bovine or Transgenetic Bovine Embryo," DeBoer et al., erteilt
am 27. Mai 1997; U.S. Patent 5,612,205, "Homologous Recombination in Mammalian
Cells," Kay et al.,
erteilt am 18. März,
1997; und PCT Publikation WO 93/22432, "Method of Identifying Transgenic Pre-Implantation Embryos"; WO 98/16630, Piedrahita & Bazer, veröffentlicht
am 23. April 1998, "Methods
for the Generation of Primorial Germ Cells and Transgenetic Animal Species,". Diese Verfahren
umfassen Techniken zur Transfektion von Zellen mit fremden DNA Fragmenten
und das exakte Design der fremden DNA Fragmente, sodass sie die
Insertion, Deletion und/oder Mutation des Ziel DNA-Genoms bewirken.
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Transgene
Zellen können
auf eine Vielzahl von Arten erhalten werden. Zum Beispiel können transgene
Zellen aus einem transgenen Tier isoliert werden. Beispiele transgener
Schweine sind im Stand der Technik bekannt. Aus einem transgenen Tier
isolierte Zellen können
mit Hilfe der hier bereitgestellten Materialien und Methoden in
totipotente Zellen umgewandelt werden. In einem weiteren Beispiel können transgene
Zellen aus totipotenten Zellen hergestellt werden. Materialen und
Methoden für
die Umwandlung nicht-transgener Zellen in transgene Zellen sind
im Stand der Technik bekannt, wie zuvor beschrieben.
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Eine
beliebige der hier definierten Zelltypen kann verändert werden,
um modifizierte nukleäre DNA
zu enthalten. Beispielsweise können
embryonale Stammzellen, embryonale Keimzellen, fötale Zellen und eine beliebige
der hier definierten totipotenten Zellen verändert werden, um modifizierte
nukleäre
DNA zu enthalten.
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Beispiele
für Verfahren
zur Modifikation eines Ziel DNA-Genoms
durch Insertion, Deletion und/oder Mutation sind die retrovirale
Insertion, artifizielle Chromosomentechniken, Gen-Insertion, Zufallsinsertion
mit gewebespezifischen Promotoren, homologe Rekombination, Gen-Targeting,
transposable Elemente und/oder ein beliebiges anderes Verfahren
zur Einführung
fremder DNA. Weitere Modifikationstechniken, die Durchschnittsfachleuten
bekannt sind, umfassen das Deletieren von DNA Sequenzen aus einem
Genom und/oder die Veränderung nuklearer
DNA Sequenzen. Beispiele für
Techniken zur Veränderung
nukleärer
DNA Sequenzen sind die ortsgerichtete Mutagenese (site directed
mutagenesis) und Verfahren der Polymerasekettenreaktion. Daher sind
Schweinezellen gleichzeitig totipotent und transgen. Solche transgenen
und totipotenten Zellen können
als nahezu unbegrenzte Quelle für Donorzellen
zur Produktion klonierter transgener Schweine dienen.
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Der
Begriff "rekombinantes
Produkt", wie hier
verwendet, kann das Produkt bezeichnen, das aus einer DNA Sequenz
erzeugt wurde, welche mindestens einen Teil der modifizierten nukleären DNA enthält. Dieses
Produkt kann beispielsweise ein Peptid sein, ein Polypeptid, ein
Protein, ein Enzym, ein Antikörper,
ein Antikörperfragment,
ein Polypeptid, das ein regulatorisches Element bindet (ein Begriff, der
anschließend
beschrieben wird), ein strukturelles Protein, ein RNA Molekül und/oder
ein Ribozym. Diese Produkte sind im Stand der Technik bekannt.
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Der
Begriff "Ribozym", wie hier verwendet, kann
Ribonukleinsäuremoleküle bezeichnen,
die andere RNA Moleküle
in spezifischen Regionen spalten können. Ribozyme können an
diskrete Regionen in einem RNA Molekül binden und im Anschluss eine Region
innerhalb dieser Binderegion oder angrenzend an die Binderegion
spalten. Ribozymtechniken können
dadurch die Menge an Polypeptid vermindern, die von ursprünglich intakten
Messanger RNA Molekülen
translatiert wird. Für
spezifische Beschreibungen von Ribozymen siehe U.S. Patent 5,354,855, mit
dem Titel "RNA Ribozyme
which Cleaves Substrat RNA without Formation of a Colvalent Bond," Chech et al., erteilt
am 11. Oktober 1994, und U.S. Patent 5,591,610, mit dem Titel "RNA Ribozyme Polymerases,
Dephosphorylases, Restriction Endoribonucleases and Methods," Chech et al., erteilt
am 7. Januar 1997.
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Die
Begriffe "biologisches
Fluid" oder "Gewebe", wie hier verwendet,
können
ein beliebiges Fluid oder Gewebe in einem biologischen Organismus
bezeichnen. Fluids können
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf Tränen,
Speichel, Milch, Urin, amniotische Flüssigkeit, Samenflüssigkeit,
Plasma, Eileiterflüssigkeit
und synoviales Fluid. Gewebe können umfassen,
sind aber nicht beschränkt
auf Lunge, Herz, Blut, Leber, Muskel, Hirn, Bauchspeicherdrüse, Haut
und andere.
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Der
Begriff "verleit
Resistenz", wie
hier verwendet, kann die Fähigkeit
eines rekombinanten Produkts bezeichnen, die Symptome einer Erkrankung oder
eines parasitären
Zustands vollständig
aufzuheben oder partiell zu mildern. Falls daher eine Erkrankung
zum Beispiel eine Entzündung
betrifft, kann ein rekombinantes Produkt Resistenz gegenüber dieser Entzündung verleihen,
falls die Entzündung
nach Expression des rekombinanten Produkts abnimmt. Ein rekombinantes
Produkt kann Resistenz oder partielle Resistenz gegenüber einer
Erkrankung oder einem parasitären
Zustand verleihen, falls beispielsweise ein rekombinantes Produkt
eine Antisense RNA-Molekül
darstellt, das spezifisch an ein mRNA Molekül bindet, welches an Polypeptid
kodiert, das für
die Entzündung
verantwortlich ist. Weitere Beispiele für das Verleihen von Resistenz
gegenüber
Erkrankungen oder Parasiten werden anschließend beschrieben. Zusätzlich werden
im Anschluss Beispiel für Krankheiten
beschrieben.
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Beispiele
für Parasiten
und Strategien zu Verleihung von Resistenz gegenüber diesen Parasiten werden
anschließend
beschrieben. Diese Beispiele umfassen, sind aber nicht beschränkt auf
Würmer,
Nematoden, Insekten, Invertebraten, bakterielle, virale und eukaryontische
Parasiten. Diese Parasiten können
zu Krankheitszuständen
führen,
welche durch die Materialien und Methoden der Erfindung kontrolliert
werden können.
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Der
Begriff "regulatorisches
Element", wie hier
verwendet, kann eine DNA Sequenz bezeichnen, welche eine Menge eines
Produkts erhöht
oder vermindert, das von einer anderen DNA Sequenz erzeugt wurde.
Ein regulatorisches Element kann die konstitutive Produktion dieses
Produkts hervorrufen (zum Beispiel kann das Produkt konstant exprimiert werden).
Alternativ kann ein regulatorisches Element die Produktion eines
rekombinanten Produkts in einer induzierbaren Art und Weise erhöhen oder
vermindern (zum Beispiel kann das Produkt als Antwort auf ein spezifisches
Signal exprimiert werden). Ein regulatorisches Element kann beispielsweise
durch Nährstoffzugabe,
durch Licht, oder durch Zugabe einer Substanz zum System des transgenen
Organismus kontrolliert werden. Beispiele für regulatorische Elemente,
die Durchschnittsfachleuten bekannt sind, sind Promotoren, Enhancer,
Insulatoren und Repressoren. Siehe zum Beispiel, Transgenic Animals,
Generation and Use, 1997, herausgegeben von L. M. Houdebine, Hardwood
Academic Publishers, Australia.
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Der
Begriff "Promotoren" oder "Promotor", wie hier verwendet,
kann eine DNA Sequenz bezeichnen, die angrenzend an eine DNA Sequenz
lokalisiert ist, welche ein rekombinantes Produkt kodiert. Ein Promotor
ist vorzugsweise operativ mit einer angrenzenden DNA Sequenz verknüpft. Ein
Promotor erhört
typischerweise eine Menge eines rekombinanten Produkts, das von
einer DNA Sequenz exprimiert wird, im Vergleich zur Menge des exprimierten
rekombinanten Produkts ohne Vorhandensein des Promotors. Ein Promotor
aus einer Organismenspezies kann verwendet werden, um die Expression
eines rekombinanten Produkts von einer DNA Sequenz zu erhöhen, welche
von einer anderen Organismenspezies stammt. Zusätzlich kann ein Promotorelement
eine Menge rekombinanter Produkte erhöhen, die von multiplen in tandem
arrangierten DNA Sequenzen exprimiert werden. Daher kann ein Promotorelement
die Expression eines oder mehrerer rekombinanter Produkte erhöhen. Multiple
Promotorelemente sind Durchschnittsfachleuten bekannt. Beispiele
für Promotorelemente
werden anschließend
beschrieben.
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Der
Begriff "Enhancers" oder "Enhancer", wie hier verwendet,
kann eine DNA Sequenz bezeichnen, die angrenzend an eine DNA Sequenz
lokalisiert ist, welche ein rekombinantes Produkt kodiert. Enhancerelemente
sind typischerweise oberhalb (upstream) eines Promotorelements lokalisiert oder
können
unterhalb (downstream) einer kodierenden DNA Sequenz lokalisiert
sein (zum Beispiel eine DNA Sequenz, die in ein rekombinantes Produkt
oder in rekombinante Produkte transkribiert oder translatiert wird).
Ein Enhancerelement kann daher 100 Basenpaare, 200 Basenpaare oder
300 oder mehr Basenpaare oberhalb einer DNA Sequenz lokalisiert sein,
welche ein rekombinantes Produkt kodiert. Enhancerelemente können eine
Menge eines rekombinanten Produkt, das von einer DNA Sequenz exprimiert
wird, über
die erhöhte
Expression, die durch ein Promotorelement hervorgerufen wird, erhöhen. Multiple
Enhancerelemente sind Durchschnittsfachleuten leicht zugänglich.
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Der
Begriff "Insulatoren" oder "Insulator", wie hier verwendet,
kann DNA Sequenzen bezeichnen, welche die DNA Sequenz flankieren,
die das rekombinante Produkt kodiert. Insolatorelemente können die
Expression eines rekombinanten Produkts zu spezifischen Geweben
in einem Organismus dirigieren. Multiple Insulatorelemente sind
Durchschnittsfachleuten bekannt. Siehe zum Beispiel Geyer, 1997, Curr.
Opin. Genet. Dev. 7: 242–248.
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Der
Begriff "Repressor" oder "Repressorelement", wie hier verwendet,
kann eine DNA Sequenz bezeichnen, die in der Nähe der DNA Sequenz lokalisiert
ist, welche das rekombinante Produkt kodiert, wobei eine Repressorsequenz
eine Menge des rekombinanten Produkts, das von dieser DNA Sequenz exprimiert
wird, vermindern kann. Repressorelemente können durch die Bindung eines
spezifischen Moleküls
oder spezifischer Moleküle
an eine DNA-Sequenz eines Respressorelements kontrolliert werden.
Diese Moleküle
können
ein Repressorelement entweder aktivieren oder deaktivieren. Multiple
Repressorelemente sind Durchschnittsfachleuten bekannt.
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Die
Begriffe "Milchproteinpromotor", "Urinproteinpromotor", "Blutproteinpromotor", "Tränengangproteinpromotor", "Synovialproteinpromotor" und "Mandibulärdrüsenpromotor" bezeichnen Promotorelemente,
welche die spezifische Expression von Proteinen innerhalb des spezifizierten
Fluids oder der Drüse
oder des Zelltyps in einem Tier regulieren. Beispielsweise ist ein
Milchproteinpromotor ein regulatorisches Element, das die Expression
eines Proteins kontrollieren kann, welches in der Milch eines Tieres
exprimiert wird. Weitere Promotoren, wie zum Beispiel der Caseinpromotor,
der α-Lactalbuminpromotor,
der Promotor des sauren Molkeproteins, der Uroplaktinpromotor und
der α-Actinpromotor
sind beispielsweise Durchschnittsfachleuten bekannt.
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(1)
Die totipotente Schweinezelle, wobei die totipotente Schweinezelle
selbst keine Teil der vorliegende Erfindung darstellt, wird einer
Manipulation unterworfen; (2) die Manipulation umfasst den Schritt der
Verwendung einer totipotenten Schweinezelle in einem Verfahren eines
nukleären
Transfers; (3) die Manipulation umfasst den Schritt der Cryokonservierung
totipotenter Zellen; (4) die Manipulation umfasst den Schritt des
Auftauens totipotenter Zellen; (5) die Manipulations umfasst den
Schritt des Passagierens totipotenter Zellen; (6) die Manipulation
umfasst den Schritt des Synchronisierens totipotenter Zellen; (7) die
Manipulation umfasst den Schritt des Transfizierens totipotenter
Zellen mit fremder DNA; und (8) die Manipulation umfasst den Schritt
des Dissoziierens einer Zelle von einer anderen Zelle oder von einer Gruppe
von Zellen.
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Der
Begriff "Manipulation", wie hier verwendet,
kann die übliche
Verwendung dieses Begriffs bezeichnen, die das Management oder die
Handhabung gegenüber
bestimmten Objekten ist. Beispiele für Manipulationen werden hier
beschrieben.
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Der
Begriff "nukleärer Transfer", wie hier verwendet,
kann das Einbringen eines vollständigen Komplements
nuklearer DNA von einer Zelle in eine entkernte Zelle bezeichnen.
Verfahren zum nuklearen Transfer sind Durchschnittsfachleuten bekannt. Siehe
zum Beispiel Nagashima et al., 1997, Mol. Reprod. Dev. 48: 339–343; Nagashima
et al.; 1992, J. Reprod. Dev. 38: 73–78; Prather et al., 1989,
Biol. Reprod. 41: 414–419;
Prather et al., 1990, Exp. Zool. 255: 355–358; Saito et al., 1992, Assis.
Reprod. Tech. Andro. 259: 57–266;
and Terlouw et al., 1992, Theriogenology 37: 09. Ein nukleärer Transfer
kann durch Verwendung von Oocyten erreicht werden, die nicht von
einer Zona pellucida umgeben sind.
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Der
Begriff "Kryokonservierung", wie hier verwendet,
können
das Einfrieren einer Zelle, eines Embryos oder eines Tiers bezeichnen.
Zellen, Embryos oder Teile von Tieren werden bei Temperaturen vorzugsweise
unterhalb von 0°C,
bevorzugter unterhalb von –80°C und am
meisten bevorzugt bei Temperaturen unterhalb von –196°C eingefroren.
Zellen und Embryos können
für eine
unbestimmte Zeitdauer kryokonserviert werden. Es ist bekannt, dass
biologische Materialien für
mehr als 50 Jahre kryokonserviert werden können und weiterhin lebensfähig bleiben.
Beispielsweise kann die Verwendung boviner Samenflüssigkeit,
die mehr als 50 Jahre kryokonserviert ist, zur artifiziellen Besamung
einer Kuh verwendet werden und die Geburt lebender Nachkommen zur
Folge haben. Verfahren und Werkzeuge zur Kryokonservierung sind
Fachleuten bekannt. Siehe zum Beispiel die U.S. Patent Nr. 5,160,312,
mit dem Titel "Cryopreservation
Process for Direkt Transfer of Embryos," erteilt an Voekel am 3. November 1992.
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Der
Begriff "Auftauen", wie hier verwendet, kann
ein Verfahren zur Erhöhung
der Temperatur einer kryokonservierten Zelle, eines Embryos oder
von Teilen eines Tiers bezeichnen. Verfahren zum Auftauen kryokonservierten
Materials, sodass dieses nach dem Auftauvorgang aktiv ist, sind
Durchschnittsfachleuten bekannt.
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Die
Begriffe "transfiziert" und "Transfektion", wie hier verwendet,
bezeichnen Verfahren zur Abgabe exogener DNA in eine Zelle. Diese
Verfahren beinhalten eine Vielzahl von Techniken, wie zum Beispiel
die Behandlung von Zellen mit hohen Salzkonzentrationen, einem elektrischen
Feld, Liposomen, polykationischen Micellen oder einem Detergenz,
um die äußere Membran
oder Wand einer Wirtszelle permeabel für Nukleinsäuremoleküle von Interesse zu machen.
Diese spezifizierten Verfahren sind nicht einschränkend, und
die Erfindung betrifft ein beliebiges Transformationsverfahren,
das Durchschnittsfachleuten bekannt ist. Siehe zum Beispiel Molecular Cloning,
a Laboratory Manual, 2nd Ed., 1989, Sambrool, Fritsch, and Maniatis,
Cold Spring Harbor Laboratory Press und Transgenic Animals, Generation and
Use, 1997, herausgegeben von L. M. Houdebine, Hardwood Academic
Publishers, Australia.
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Der
Begriff "fremde
DNA", wie hier verwendet,
kann DNA bezeichnen, die in eine Zielzelle transfiziert werden kann,
wobei die fremde DNA mindestens eine Basenpaarmodifikation verglichen
mit der nukleären
DNA des Zielorganismus enthält.
Fremde DNA und Transfektion können
weiterhin in Verbindung mit dem Begriff "modifizierte nukleäre DNA", der zuvor beschrieben wurde, verstanden
und definiert werden.
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Der
Begriff "dissoziieren", wie hier verwendet,
kann Materialien und Methoden bezeichnen, die zur Separierung einer
Zelle von anderen Zellen zweckmäßig sind,
wobei die Zellen ursprünglich
miteinander in Kontakt stehen. Beispielsweise kann ein Blastomer
(i.e. ein zellulärer
Teil eines Embryos im Morulastadium) vom Rest der sich entwickelnden Zellmasse
mit Hilfe von Techniken und Vorrichtungen, die Durchschnittsfachleuten
bekannt sind, entfernt werden. Siehe zum Beispiel das U.S. Patent 4,994,384
mit dem Titel "Multiplying
Bovine Embryos",
erteilt am 19. Februar 1991. Alternativ können in Kultur proliferierende
Zellen voneinander separiert werden, um Prozesse zu erleichtern,
wie zum Beispiel das Passagieren von Zellen und die Bildung von EG
Zellen, die hier beschrieben sind. Zusätzlich kann die Dissoziation
einer kultivierten Zelle aus einer Gruppe kultivierter Zellen als
erster Schritt in einem Verfahren zum nuklearen Transfer zweckmäßig sein, wie
er im Anschluss beschrieben wird. Wenn eine Zelle aus einem Embryo
dissoziiert wird, kann eine Dissoziation für Prozesse zweckmäßig sein,
wie zum Beispiel die Reklonierung, ein Prozess, der hier beschrieben
wird, sowie als Schritt zur Multiplikation einer Anzahl von Embryos.
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In
einem weiteren Aspekt wird eine totipotente Schweinezelle beschrieben,
die mit Hilfe eines Verfahrens hergestellt wird, das die Schritte
umfasst: (a) Isolieren mindestens einer Vorläuferzelle (precursor cell);
und (b) Kultivieren der Vorläuferzelle
in einem Zellkulturmedium, wobei mindestens eine Zelle in dem Kulturmedium
eine Morphologie einer embryonalen Keimzelle entwickelt. In bevorzugten
Ausführungsformen
(1) umfasst das Verfahren den Schritt des Einbringens eines Stimulus
in die Vorläuferzelle, der
die Vorläuferzelle
in die totipotente Schweinezelle umwandelt; (2) umfasst das Verfahren
den Schritt des Kultivierens der Vorläuferzelle in einem Zellkulturmedium,
das eine signifikante Konzentration mindestens eines Kohlehydrats
umfasst; (3) ist das Kohlehydrat Glukose; und (4) umfasst das Zellkulturmedium
ein oder mehr Antibiotika.
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Der
Begriff "umwandeln", wie hier verwendet,
kann das Phänomen
bezeichnen, bei dem die Vorläuferzellen
totipotent werden. Der Begriff "umwandeln" ist synonym mit
dem Begriff "reprogrammieren", wie hier verwendet,
wenn die Vorläuferzelle nicht
totiotent ist. Vorläuferzellen
können
in variierenden Anteilen in totipotente Zellen umgewandelt werden.
Beispielsweise ist es möglich,
dass nur ein kleiner Teil der Vorläuferzellen in totipotente Zellen
umgewandelt wird.
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Der
Begriff "Stimulus", wie hier verwendet, kann
Materialien und/oder Verfahren bezeichnen, die für die Umwandlung von Vorläuferzellen
in totipotente Zellen zweckmäßig sind.
Ein Stimulus kann zum Beispiel elektrisch, mechanisch, temperaturbezogen und/oder
chemisch sein. Der Stimulus kann eine Kombination aus einem oder
mehr unterschiedlichen Typen an Stimuli sein, Ein Stimulus kann
in die Vorläuferzellen
für eine
Zeitspanne eingebracht werden, welche die Umwandlung der Vorläufererzellen
in die totipotenten Zellen bewerkstelligt.
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Der
Begriff "einbringen", wie hier in Bezug auf
einen Stimulus verwendet, kann einen Schritt oder Schritte bezeichnen,
bei denen die Vorläuferzellen
mit einem Stimulus in Kontakt gebracht werden. Falls zum Beispiel
ein Stimulus chemischer Natur ist, kann solch ein Stimulus in die
Vorläuferzellen
durch mischen des Stimulus mit einem Zellkulturmedium eingebracht
werden.
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Der
Begriff "signifikante
Konzentration mindestens eines Kohlehydrats", wie hier verwendet, kann ein Zellkulturmedium
bezeichnen, das mindestens ein Kohlehydrat in einer Konzentration
aufweist, welche die kultivierten Zellen nicht lysiert oder schrumpfen
lässt.
Kultivierte Zellen können
lysieren oder schrumpfen, wenn der osmotische Druck eines Kulturmediums
zu groß ist.
Zellen können
einen großen
Bereich an Osmolaritäten
tolerieren (zum Beispiel zwischen 260 mOsm/kg und 320 mOsm/kg). Ansteigende
Konzentrationen an Kohlehydraten im Kulturmedium können den
osmotischen Druck eines Kulturmediums dramatisch erhöhen, was
die Lebensfähigkeit
der Zellen beeinflussen kann. Siehe zum Beispiel Cells: a laboratory
manual (Vol. 1), 1998, D. L. Spector, R. D. Goldman, L. A. Leinwand (Hrsg.),
Cold Spring Harbor Laboratory Press.
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Ein
Kohlehydrat kann ein beliebiges Monosaccharid, Disaccharid oder
Polysaccharid sein, das im Stand der Technik bekannt ist. Beispiele
für Kohlehydrate
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf Glukose, Mannose, Dextrose, Mannose, Idose, Galaktose, Talose,
Gulose, Altrose, Allose, Ribose, Arabinose, Xylose, Lyxose, Triose,
Erytrose, Glyzerinaldehyd, Sucrose, Laktose, Maltose, Zellulose
und Glykogen. Ein speziell bevorzugtes Kohlehydrat ist Glukose.
Die Konzentration an Glukose im Zellkulturmedium ist größer als 10
mM Glukose. Der Begriff "etwa", wie in Verbindung
mit Glukosekonzentrationen verwendet, kann sich auf plus oder minus
2 mM Glukose beziehen.
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Der
Begriff "Antibiotikum", wie hier verwendet,
kann ein beliebiges Molekül
bezeichnen, das die Wachstumsraten eines Bakteriums, einer Hefe,
eines Pilzes, eines Schleimpilzes oder anderer Kontaminanten in
einer Zellkultur vermindert. Antibiotika sind optionale Bestandteile
eines Zellkulturmediums. Beispiele für Antibiotika sind im Stand
der Technik bekannt. Siehe die Kataloge von Sigma und DIFCO.
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(1)
Die Vorläuferzellen,
wobei die Vorläuferzellen
selbst keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellen; werden
mit Feeder-Zellen co-kultiviert; (2) die Vorläuferzellen werden nicht mit
Feeder-Zellen co-kultiviert; (3) die Feeder-Zellen werden aus fötalen Zellen
erzeugt; (4) die fötalen
Zellen entstehen aus einem Fötus,
wobei kein Zelltyp aus dem Fötus entfernt
wurde (z.B. wird der gesamte Fötus
dissoziiert und in ein Zellkultursystem gegeben); (5) die fötalen Zellen
entstehen aus einem Fötus,
wobei ein oder mehr Zelltypen aus dem Fötus entfernt wurden (z.B. wird
die Kopfregion entfernt, und der verbleibende Fötus wird dissoziiert und in
ein Zellkultursystem gegeben); (6) ein Stimulus wird durch die Feeder-Zellen
in die Vorläuferzellen
eingebracht; (7) die Fiederzellen sind die einzige Quelle des Stimulus;
(8) der Stimulus wird auf mechanische Weise in die Vorläuferzellen
eingebracht; (9) der einzige Stimulus, der in die Vorläuferzellen
eingebracht wird, wird auf mechanische Weise eingebracht; (10) der
Stimulus wird durch die Feeder-Zellen und auf mechanische Weise
in die Vorläuferzellen
eingebracht; (11) der Stimulus umfasst den Schritt des Inkubierens
der Vorläuferzellen
mit einem Cocktail aus Rezeptorliganden; (12) die Vorläuferzellen
werden aus einem Huftier und vorzugsweise aus einem Schwein isoliert; (13)
die Vorläuferzellen
werden aus der Gruppe ausgewählt,
die aus nicht-embryonalen Zellen, nicht-fötalen, differenzierten Zellen,
undifferenzierten Zellen, somatischen Zellen, embryonalen Zellen,
fötalen
Zellen, embryonalen Stammzellen, primordialen Keimzellen, Zellen
der Keimzellen, Kumuluszellen, amniotischen Zellen, fötalen Fibroblasten,
Hepatocyten, embryonalen Keimzellen, adulten Zellen, Zellen, die aus
einer asynchronen Population von Zellen isoliert werden, und Zellen,
die aus einer synchronisierten Populationen von Zellen isoliert
werden, besteht, wobei die synchrone Population nicht im G0 Zustand des Zellzyklus arretiert ist; (14)
der Cocktail aus Rezeptorliganden mindestens eine Komponenten umfasst, die
aus der Gruppe ausgewählt
wird, welche aus Cytokinen, Wachstumsfaktor, trophischer Faktor
und neurotrophischer Faktor, LIF und FGF besteht; (15) der LIF eine
Aminosäuresequenz
aufweist, die substantiell ähnlich
der Aminosäuresequenz
von humanem LIF ist; und (16) der FGF eine Aminosäuresequenz
aufweist, die substantiell ähnlich
der Aminosäuresequenz
von bovinem bFGF ist.
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Die
Begriffe "mechanische
Weise" und "mechanischer Stimulus", wie hier verwendet,
können das
Einbringen eines Stimulus in Zellen bezeichnen, wobei der Stimulus
nicht durch Feeder-Zellen eingebracht wird. Zum Beispiel können gereinigter
LIF und bFGF (im Anschluss definiert) als ein Stimulus in Vorläuferzellen
eingebracht werden, indem diese gereinigten Produkte zu einem Zellkulturmedium
zugefügt werden,
in welchem die Vorläuferzellen
wachsen. Wie ebenfalls hier erläutert,
kann eine signifikante Menge an Glukose als Stimulus für die Zellen
zu einem Kulturmedium zugegeben werden.
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Der
Begriff "Feeder-Zellen", wie hier verwendet,
kann Zellen bezeichnen, die in Kultur gehalten werden, und die mit
Zielzellen co-kultiviert werden. Zielzellen können zum Beispiel Vorläuferzellen,
embryonale Stammzellen, embryonale Keimzellen, kultivierte Zellen
und totipotente Zellen sein. Feeder-Zellen können zum Beispiel Peptide,
Polypeptide, elektrische Signale, organische Moleküle (z.B. Steroide), Nukleinsäuremoleküle, Wachstumsfaktoren
(z.B. bFGF), weitere Faktoren (z.B. Cytokine, wie etwa LIF und Steel-Faktor)
sowie metabolische Nahrungsstoffe für die Zielzellen bereitstellen.
Bestimmte Zellen, wie z.B embryonale Keimzellen, kultivierte Zellen
und totpotente Zellen, brauchen für gesundes Wachstum keine Feder-Zellen.
Feeder-Zellen wachsen vorzugsweise in einem Monolayer.
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Feeder-Zellen
können
aus multiplen Zelltypen erzeugt werden. Beispiele für diese
Zelltypen sind fötale
Zellen, Mauszellen, Buffalo Rattenleberzellen und Eileiterzellen.
Diese Beispiel sind als nicht einschränkend zu verstehen. Gewebeproben
können zur
Etablierung einer Feeder-Zelllinie durch im Stand der Technik bekannte
Verfahren (z.B durch Verwendung eines Mixers) aufgearbeitet werden.
Feeder-Zellen können
aus der gleichen oder einer anderen Tierart stammen als die Vorläuferzellen.
Feeder-Zellen können
aus fötalen
Huftierzellen, fötalen Schweinezellen
oder fötalen
murinen Zellen etabliert werden. Ein oder mehr Zelltypen können aus
einem Fötus
entfernt werden (z.B. primordiale Keimzellen, Zellen in der Kopfregion
und Zellen in der Region des Körperhohlraums),
und eine Feeder-Schicht kann aus den Zellen etabliert werden, die
entfernt wurden, oder den Zellen im verbliebenen unzerteilten Fötus. Wenn
ein vollständiger
Fötus zur
Etablierung fötaler Feeder-Zellen
verwendet wird, können
Feeder-Zellen (z.B. Fibroblastenzellen) und Vorläuferzellen (z.B. primordiale
Keimzellen) aus dem gleichen Ursprung entstehen (z.B. einem Fötus).
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Der
Begriff "Cocktail
aus Rezeptorligandten", wie
hier verwendet, kann ein Gemisch aus einem oder mehr Rezeptorliganden
bezeichnen. Ein Repzeptorligand kann ein beliebiges Molekül bezeichnen,
das an ein Rezeptorprotein bindet, welches an der Außenseite
oder der Innenseite einer Zelle lokalisiert ist. Rezeptorliganden
können
aus den Molekülen
der Cytokinfamilie von Liganden, der Neutrophinfamilie von Liganden,
der Wachstumsfaktorfamilie von Liganden und der Mitogenfamilie von
Liganden ausgewählt
werden, die Durchschnittsfachleuten sämtlich bekannt sind. Beispiele
für Rezeptor/Ligandenpaare
sind: epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor/epidermaler Wachstumsfaktor,
Indulinrezeptor/Insulin, cAMP-abhängige Proteinkinase/cAMP, Wachstumshormonrezeptor/Wachstumshormon
und Steroidrezeptor/Steroid. Es wurde gezeigt, dass bestimmte Rezeptoren
Kreuzreaktivität
aufweisen. Zum Beispiel können
heterologe Rezeptoren, wie zum Beispiel der Insulin-ähnliche
Wachstumsfaktorrezeptor 1 (IGFR1) und der Insulin-ähnliche
Wachstumsfaktorrezeptor 2 (IGFR2) beide IGF1 binden. Wenn ein Cocktail
aus Rezeptorliganden einen Stimulus umfasst, kann der Cocktail aus
Rezeptorliganden auf eine Vielzahl von Arten in eine Vorläuferzelle
eingebracht werden, die Durchschnittsfachleuten bekannt sind.
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Der
Begriff "Cytokin", wie hier verwendet, kann
eine große
Familie von Rezeptorliganden bezeichnen, die Durchschnittsfachleuten
bekannt sind. Die Cytokinfamilie von Rezeptorliganden umfasst Mitglieder
wie etwa den Leukämie-Inhibitorfaktor (LIF);
Cardiotrophin 1 (CT-1); den ciliären
neurotrophen Faktor (CNTF); den Stammzellfaktor (SCF), der ebenfalls
als Steel-Faktor bekannt ist; Oncostatin M (OSM); und alle Mitglieder
der Interleukin (IL)-Familie einschließlich IL-6, IL-11 und IL-12.
Die Lehren der Erfindung erfordern nicht die mechanische Zugabe von
Steel-Faktor (im Stand der Technik ebenfalls als Stammzellfaktor
bekannt) für
die Umwandlung von Vorläuferzellen
in totipotentente Zellen.
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Der
Begriff "Wachstumsfaktor", wie hier verwendet,
kann einen beliebigen Rezeptorliganden bezeichnen, der einen Zellwachstumseffekt
hervorrufen kann, einen Zellproliferationseffekt hervorrufen kann und/oder
die Zellmorphologie beeinflussen kann. Beispiele für Wachstumsfaktoren
sind im Stand der Technik bekannt. Der Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF)
ist ein Beispiel für
einen- Wachstumsfaktor.
Der Begriff "bFGF" kann den basischen
FGF bezeichnen.
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Der
Begriff "substantiell ähnlich", wie hier in Bezug
auf Aminosäuresequenzen
verwendet, kann zwei Aminosäuresequenzen
bezeichnen, die vorzugsweise 50% oder mehr Aminosäureidentität aufweisen,
bevorzugter 70% oder mehr Aminosäureidentität und am
meisten bevorzugt 90% oder mehr Aminosäureidentität. Aminosäureidentität ist eine Eigenschaft von
Aminosäuresequenzen,
die ihre Ähnlichkeit
oder Verwandtschaft misst. Die Identität wird gemessen durch Dividieren
der Anzahl identischer Reste in den beiden Sequenzen durch die Gesamtzahl
an Resten und Multiplizieren des Produkts mit 100. Demzufolge weisen
zwei Kopien der exakt gleichen Sequenz 100% Identität auf, während Sequenzen,
die in geringerem Maße
konserviert sind und Deletionen, Additionen oder Substitutionen
aufweisen, einen geringeren Grad an Identität. Durchschnittsfachleute werden
erkennen, dass mehrere Computerprogramme zur Durchführung von
Sequenzvergleichen und zur Bestimmung der Sequenzidentität zur Verfügung stehen.
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Wenn
Vorläuferzellen
in vitro kultiviert werden, wurde entdeckt, dass Vorläuferzellen
ohne Einbringen eines Stimulus in die Vorläuferzellen Zellen hervorbringen
können,
die eine andere Zellmorphologie aufweisen als die Vorläuferzellen.
Es wurde zum Beispiel entdeckt, dass sich Vorläuferzellen aus der Keimleiste
ohne Inkontaktbringen der Vorläuferzellen mit
Feeder-Zellen, einem Rezeptorliganden oder einem Wachstumsfaktor
in Zellen entwickeln können, die
eine EG-Zellmorphologie
aufweisen. (1) Vorläuferzellen,
wobei die Vorläuferzellen
selbst keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellen, werden nicht
mit einem exogenen Rezeptorliganden in Kontakt gebracht; (2) Vorläuferzellen
werden nicht mit einem exogenen Wachstumsfaktor in Kontakt gebracht;
(3) Vorläuferzellen
werden nicht mit Feeder-Zellen in Kontakt gebracht; (4) Vorläuferzellen werden
nicht mit einem exogenen Rezeptorliganden in Kontakt gebracht, und
werden nicht mit einem exogenen Wachstumsfaktor in Kontakt gebracht;
(5) Vorläuferzellen
werden nicht mit einem exogenen Rezeptorliganden in Kontakt gebracht,
und werden nicht mit Feeder-Zellen in Kontakt gebracht; (6) Vorläuferzellen
werden nicht mit einem exogenen Wachstumsfaktor in Kontakt gebracht,
und werden nicht mit Feeder-Zellen in Kontakt gebracht; und (7)
Vorläuferzellen
werden nicht mit einem exogenen Rezeptorliganden in Kontakt gebracht,
und werden nicht mit einem exogenen Wachstumsfaktor in Kontakt gebracht,
und werden nicht mit Feeder-Zellen in Kontakt gebracht.
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Der
Begriff "exogen", wie hier in Bezug
auf einen Wachstumsfaktor oder Rezeptorliganden verwendet, kann
eine äußere Quelle
eines Rezeptorliganden und/oder Wachstumsfaktor bezeichnen, die zu
einem Substrat oder Medium zugegeben werden kann, das in Kontakt
mit den Zielzellen steht. Zum Beispiel kann gereinigter bFGF, der
Durchschnittsfachleuten kommerziell verfügbar ist, zu einem Zellkulturmedium
gegeben werden, das in Kontakt mit Vorläuferzellen steht. In diesem
letzteren Beispiel kann solch ein gereinigter bFGF als "exogener bFGF" bezeichnet werden.
Multiple exogene Rezeptorliganden und/oder multiple exogene Wachstumsfaktoren
oder Kombinationen davon können
zu einem Flüssigmedium
gegeben werden, das in Kontakt mit Zellen steht. Alternativ muss
es nicht erforderlich sein, dass die Vorläuferzellen mit einem exogenen Wachstumsfaktor
oder einem exogenen Rezeptorliganden in Kontakt stehen, wie zuvor
diskutiert.
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In
ihrem Hauptaspekt betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung
eines klonierten Schweineembryos, eines klonierten Schweinefötus bzw.
eines lebendgeborenen klonierten Schweins gemäß den Ansprüchen 1, 16 bzw. 17.
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Klonierte
Embryos
-
Die
Erfindung betrifft nicht-chirurgische Verfahren zur Herstellung
eines klonierten Schweinefötus
und eines lebendgeborenen Schweins. Daher betreffen Aspekte der
Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines klonierten Schweineembryos,
wobei (1) der Embryo totipotent ist; (2) der Embryo aus einer totipotenten
Zelle entsteht; (3) der Embryo aus einer nicht-embryonalen Schweinezelle
entsteht; und (4) eine beliebige Kombination des vorangegangenen.
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Der
Begriff "totipotent", wie hier in Bezug
auf Embryos verwendet, kann Embryos bezeichnen, die sich in ein
lebendgeborenes Schwein entwickeln. Der Begriff "lebendgeboren" wurde oben definiert.
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Der
Begriff "kloniert", wie hier verwendet, kann
eine Zelle, eine embryonale Zelle, eine fötale Zelle und/oder eine tierische
Zelle bezeichnen, die eine nukleäre
DNA Sequenz aufweist, welche substantiell ähnlich oder identisch zu einer
nukleären DNA
einer anderen Zelle, einer embryonalen Zelle, einer fötalen Zelle
und/oder einer tierischen Zelle ist. Die Begriffe "im wesentlichen ähnlich" und "identisch" werden hier beschrieben.
Ein kloniertes Embryo kann aus einem nukleären Transferprozess entstehen
oder alternativ kann ein kloniertes Embryo aus einem Klonierungsprozess
entstehen, der mindestens einen Reklonierungsschritt umfasst. Falls
ein klonierter Embryo aus einem Klonierungsverfahren entsteht, das
mindestens einen Reklonierungsschritt umfasst, dann kann der klonierte
Embryo indirekt aus einer totipotenten Zelle entstehen, da der Reklonierungsschritt
embryonale Zelle verwenden kann, welche aus einem Embryo isoliert
worden, das aus einer totipotenten Zelle entstand.
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(1)
Das klonierte Schweineembryo, wobei das klonierte Schweineembryo
selbst keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellt, kann ein
Mitglied einer Mehrheit von Embryos sein, wobei die Mehrheit von
Embryos eine substantiell ähnliche
nukleäre DNA
Sequenz aufweist; (2) das klonierte Schweineembryo kann ein Mitglied
einer Mehrheit von Embryos sein, und die Mehrheit von Embryos kann
eine identische nukleäre
DNA Sequenz aufweisen; (3) das klonierte Schweineembryo weist eine
nukleäre DNA
Sequenz auf, die im wesentlichen ähnlich zu einer DNA Sequenz
eines lebendgeborenen Schweins ist; (4) ein oder mehr Zellen des
klonierten Schweineembryos weisen eine modifizierte nukleäre DNA auf;
(5) das klonierte Schweineembryo wird einer Manipulation unterworfen;
(6) die Manipulation umfasst den Schritt des Kultivierens des Embryos
in einem geeigneten Medium; (7) das Medium kann Feeder-Zellen umfassen;
(8) die Manipulation eines Embryos umfasst den Schritt des Implantierens
des Embryos in das reproduktive System eines weiblichen Tiers; (9)
das weibliche Tier ist vorzugsweise ein Huftier und noch bevorzugter
ein Schwein; (10) der Östrus-Zyklus des weiblichen
Tiers ist synchronisiert mit dem Entwicklungszyklus des Embryos;
und (11) die Manipulation umfasst den Schritt des Inkubierens des
Embryos in einer künstlichen
Umgebung.
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Die
modifizierte nukleäre
DNA für
totipotente Zellen erstreckt sich auf klonierte Embryos. Zusätzlich kann
eine beliebige der in Verbindung mit totipotenten Zellen beschriebenen
Manipulationen für
klonierte Embryos angewendet werden.
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Der
Begriff "im wesentlichen ähnlich", wie hier in Bezug
auf nukleäre
DNA Sequenzen verwendet, bezeichnet zwei nukleäre DNA Sequenzen, die nahezu
identisch sind. Zwei Sequenzen können
sich durch Kopierfehler unterscheiden, die normalerweise während der
Replikation der nukleären
DNA entstehen. Im wesentlichen ähnliche
DNA Sequenzen sind vorzugsweise mehr als 97% identisch, bevorzugte mehr
als 98% identisch und am meisten bevorzugt mehr als 99% identisch.
Der Begriff "Identität", wie hier in Bezug
auf nukleäre
DNA Sequenzen verwendet, kann sich auf die Verwendung des Begriffs
in Bezug auf Aminosäuresequenzen
beziehen, der hier zuvor beschrieben wurde. Es wird bevorzugt und
erwartet, dass nukleäre
DNA Sequenzen für
klonierte Tiere identisch sind. Beispiele für Verfahren zur Bestimmung,
ob klonierte Tiere und Zellen, aus denen sie kloniert wurden, im
wesentlichen ähnliche
oder identische nukleäre
DNA Sequenzen aufweisen, sind die Mikrosatellitenanalyse und die
DNA Fingerprinting-Analyse.
Ashworth et al., 1998, Nature 394: 329 and Signer et al., 1998,
Nature 394: 329.
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Der
Begriff "Mehrzahl", wie hier in Bezug
auf Embryos verwendet, kann eine Gruppe von Embryos bezeichnen,
die eine im wesentlichen ähnliche
nukleäre
DNA Sequenz aufweisen. In bevorzugten Ausführungsformen besteht eine Mehrzahl
aus fünf
oder mehr Embryos, zehn oder mehr Embryos, 15 oder mehr Embryos,
20 oder mehr Embryos, 50 oder mehr Embryos, 75 oder mehr Embryos,
100 oder mehr Embryos und 1000 oder mehr Embryos.
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Der
Begriff "kultivieren", wie hier in Hinblick auf
Embryos verwendet, kann Laborverfahren bezeichnen, die das Einbringen
eines Embryos in ein Kulturmedium beinhalten. Ein Embryo kann für eine angemessene
Zeitdauer in ein Kulturmedium eingebracht werden, um die Stasis
des Embryos zu ermöglichen
oder das Wachstum des Embryos in dem Medium zu ermöglichen.
Geeignete Kulturmedien für
die Kultivierung von Embryos sind Fachleuten bekannt. Siehe zum
Beispiel Nagashima et al., 1997, Mol. Reprod. Dev. 48: 339–242, Petters & Wells, 1993,
J. Reprod. Fert. (Suppl) 48: 61–73;
Reedd et al., 1992, Theriogenology 37: 95–109; Dobrinsky et al., 1996, Biol.
Reprod. 55: 1069–1074;
U.S. Patent Nr. 5,213,979, First et al., In Vitro Culture of Bovine
Embryos," 25. Mai
1993; U.S. Patent Nr. 5,096,822, Rosenkrans, Jr. et al., "Bovine Embryo Medium," 17. März 1992.
-
Der
Begriff "geeignetes
Medium", wie hier verwendet,
kann ein beliebiges Medium bezeichnen, das die Zellproliferation
ermöglicht,
oder das die Stasis eines Embryos ermöglicht. Falls ein Medium die Zellproliferation
ermöglicht,
braucht ein geeignetes Medium nicht die maximale Poliferation zu
unterstützen,
sondern nur eine messbare Zellproliferstion. Ein geeignetes Medium
für die
Embryonalentwicklung kann ein embryonales Kulturmedium sein, das
hier beispielhaft beschrieben wird. Der Begriff "Feeder-Zellen" wurde oben definiert. Die Embryos gemäß der Erfindung
können
in Medien mit oder ohne Feeder-Zellen kultiviert werden. In anderen
bevorzugten Ausführungsformen
können
die Feeder-Zellen Kumuluszellen sein.
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Der
Begriff "Implantieren", wie hier in Bezug auf
Embryos verwendet, kann das Schwängern
eines weiblichen Tieres mit einem hier beschriebenen Embryo bezeichnen.
Implantationsverfahren sind Durchschnittsfachleuten bekannt. Siehe
z.B. Polge & Day, 1982, "Embryo transplantation
and preservation," Control
of Pig Reproduction, D. J. A Cole and G. R. Foxcroft, Hrsg., London,
UK, Butterworths, S. 227–291;
Gordon, 1997, "Embryo
transfer and associated techniques in pigs," Controlled reproduction in pigs (Gordon,
Hrsg.), CAB International, Wallingford UK, S 164–182; und Kojima, 1998, "Embryo transfer," Manual of pig embryo
transfer procedures, National Livestock Breeding Center, Japanese
Society of Development of Swine Technology, S 76–79.
-
Der
Embryo kann sich in utero entwickeln, oder alternativ kann der Fötus vor
der Geburt aus der Uterusumgebung entfernt werden.
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Der
Begriff "synchronisiert", wie hier in Bezug
auf den Östrus-Zyklus
verwendet, kann unterstützte
Reproduktionsverfahren bezeichnen, die Durchschnittsfachleuten bekannt
sind. Diese Verfahren werden vollständig in den im vorangegangenen Absatz
zitierten Referenzen beschrieben. Typischerweise werden die Hormone Östrogen
und Progesteron verwendet, um den Östrus-Zyklus eines weiblichen
Tieres mit dem Entwicklungszyklus des Embryos zu synchronisieren.
Der Begriff "Entwicklungsstadium", wie hier verwendet,
kann Embryos gemäß der Erfindung
und morphologische und biochemische Veränderungen während der Embryonalentwicklung bezeichnen.
Dieser Entwicklungsprozess ist für
Embryos von Huftieren vorhersagbar und kann mit dem Östrus-Zyklus
eines Empfängertieres
synchronisiert werden. Ein Verfahren zur Synchronisierung eines weiblichen
Schweins wird anschließend
dargestellt.
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Der
Begriff "artifizielle
Umgebung" bezeichnet
eine Umgebung, welche die Entwicklung eines Embryos oder einer anderen
sich entwickelnden Zellmasse unterstützt. Eine artifizielle Umgebung
kann eine Uterusumgebung oder eine Eileiterumgebung einer Spezies
sein, die sich von der einer sich entwickelnden Zellmasse unterscheidet.
Beispielsweise kann ein sich entwickelnder boviner Embryo in einen Uterus
oder einen Eileiter eines Schafs gegeben werden. Stice & Keefer, 1993, "Multiple generational
bovine embryo cloning," Biology
of Reproduction 48: 715–719.
Alternativ kann eine artifizielle Entwicklungsumgebung in vitro
zusammengesetzt werden. Dieser Typus einer artifiziellen Uterusumgebung kann
mit Hilfe biologischer und chemischer Komponenten synthetisiert
werden, die im Stand der Technik bekannt sind.
-
In
einem weiteren Aspekt wird ein klonierter Säugetierembryo beschrieben,
wobei der Embryo totipotent ist und mit Hilfe des Verfahrens gemäß der vorliegenden
Erfindung hergestellt wurde, welches den Schritt des nukleären Transfers
umfasst. Vorzugsweise erfolgt der nukleäre Transfer zwischen (a) einem
nukleären
Donor und (b) eine Oocyte, wobei sich die Oocyte in einem Stadium
befindet, das die Bildung des Embryos ermöglicht.
-
(1)
Die Oocyte, wobei die Oocyte selbst keinen Teil der vorliegenden
Erfindung darstellt, ist eine entkernte Schweineoocyte; (2) die
Oocyte stammt aus einem Schwein; (3) die Oocyte wurde maturiert; (4)
die Oocyte wurde für
eine Zeitspanne von 42 bis 46 Stunden maturiert; (5) der nukleäre Donor
wird in dem perivitellinen Raum der Oocyte gegeben; (6) der nukleäre Donor,
der zum nukleären
Transfer verwendet wird, kann aus einer beliebigen der zuvor beschriebenen
Zellen hervorgehen (z.B. eine nicht-embryonale Zelle, eine primordiale
Keimzelle, eine Zelle der Keimleiste, eine differenzierte Zelle,
eine embryonale Stammzelle, eine embryonale Keimzelle, eine amniotische
Zelle, eine Kumuluszelle und eine fötale Fibroplastenzelle); (7)
der nukleäre
Transfer umfasst den Schritt der Translokation des nukleären Donors in
die Empfängeroocyte;
(8) die Translokation kann den Schritt der Injektion des nukleären Donors
in die Empfängeroocyte
umfassen; (9) die Translokation kann den Schritt der Fusion des
nukleären
Donors und der Oocyte umfassen; (10) die Fusion kann den Schritt
der Abgabe von einem oder mehr elektrischen Pulsen an den nukleären Donor
und die Oocyte umfassen; (11) die Fusion kann den Schritt der Abgabe einer
geeigneten Konzentration mindestens eines Fusionsagens an den nukleären Donor
und die Oocyte umfassen; (12) der nukleäre Transfer kann den Schritt
der Aktivierung des nukleären
Donors und der Oocyte umfassen; (13) die Aktivierung wird erreicht durch
(i) Erhöhen
der intrazellulären
Spiegel an divalenten Kationen in einer Zelle, und (ii) Reduzieren
der Phosphorylierung zellulärer
Proteine in der Zelle; (14) die Aktivierung wird erreicht durch
Einführen
von DMAP und Ianomycin in eine Zelle.
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Der
Begriff "nukleärer Donor", wie hier verwendet,
kann eine Zelle oder einen Nukleus einer Zelle bezeichnen, der in
einen nukleären
Akzeptor transloziert wird. Ein nukleärer Donor kann eine totipotente
Schweinezelle sein. Zusätzlich
kann ein nukleärer
Donor eine beliebige hier beschriebene Zelle sein einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf eine nicht-embryonale Zelle, eine differenzierte Zelle, eine embryonale
Zelle, eine primordiale Keimzelle, eine Zelle der Keimleiste, eine
Kumuluszelle und eine amniotische Zelle. Eine nukleäre Donorzelle
kann ferner eine Zelle sein, die sich aus einer embryonalen Stammzelle
differenziert hat. Siehe z.B. Piedrahita et al., 1998, Biol. Reprod.
58: 1321–1329;
Shim et al., 1997, Biol. Reprod. 57: 1089–1095; Tsung et al., 1995,
Shih Yen Sheng Wu Hsueh Pao 28: 173–189; und Wheeler, 1994, Reprod.
Fertil. Dev. 6: 563–568. Weiterhin
kann ein nukleärer Donor
eine Zelle sein, die zuvor eingefroren oder kryokonserviert wurde.
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Der
Begriff "entkernte
Oocyte", wie hier
verwendet, kann eine Oocyte bezeichnen, deren Nukleus entfernt wurde.
Typischerweise kann eine Nadel in eine Oocyte gegeben werden, und
der Kern kann in die Nadel abgesaugt werden. Die Nadel kann aus
der Oocyte ohne Zerstörung
der Plasmamembran entfernt werden. Dieses Entkernungsverfahren ist Durchschnittsfachleuten
bekannt. Siehe das U.S. Patent 4,994,384; das U.S. Patent 5,057,420;
und Willadsen, 1986, Nature 320: 63–65. Eine entkernte Oocyte
wird aus einer Oocyte erzeugt, die für eine Zeitspanne von 42 bis
46 Stunden maturiert wurde.
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Die
Begriffe "Reifung" und "gereift", wie hier verwendet,
können
ein Verfahren bezeichnen, in dem eine Oocyte in vitro in einem Medium
inkubiert wird. Maturierungsmedien können vielfältige Arten von Komponenten
enthalten einschließlich
Hormone und Wachstumsfaktoren. Die Maturierungszeit kann bestimmt
werden von der Zeit, zu der eine Oocyte in das Maturierungsmedium
gegeben wird, bis zu der Zeit, zu der die Oocyte einer Manipulation
unterworfen wird (z.B. Entkernung, nukleärer Transfer, Fusion und/oder
Aktivierung). Oocyten können
in multiplen Medien maturiert werden, die Durchschnittsfachleuten
bekannt sind. Siehe z.B. Mattioli et al., 1989, Theriogenology 31:
1201–1207;
Jolliff & Prather,
1997, Biol. Reprod. 56: 544–548;
Funahashi & Day,
1993, J. Reprod. Fert. 98: 179–185;
Nagashima et al., 1997, Mol. Reprod. Dev. 38: 339–343; Abeydeera
et al., 1998, Biol. Reprod. 58: 213–218; Funahashi et al., 1997,
Biol. Reprod. 57: 49–53;
und Sawai et al., 1997, Biol Reprod. 57: 1–6. Oocyten werden für eine Zeitspanne
von 42 bis 46 Stunden maturiert.
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Eine
Oocyte kann ebenfalls in vivo gereift werden. Die Maturierungszeit
kann die Zeit sein, zu der die Oocyte einen geeigneten Stimulus
empfängt, um
die Meiose fortzusetzen, bis zu der Zeit, zu der die Oocyte manipuliert
wird. Die oben für die
in vitro maturbierten Oocyten beschriebenen Maturierungszeiten können auf
die in vivo maturbierten Oocyten angewandt werden.
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Gemäß der Erfindung
werden Oocyten aus einem peripubertären Tier isoliert (z.B. einem Schwein).
Oocyten aus präpubertären Schweinen können zur
spontanen Fortsetzung der Meiose in vitro nicht in der Lage sein.
Gemäß der Erfindung
werden die aus einem Schwein isolierten Oocyten zur Reifung und
eventuell im nukleären
Transferverfahren verwendet.
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Der
nukleäre
Transfer kann durch Kombinieren eines nukleären Donors und mehr als einer
entkernten Eizelle bewerkstelligt werden. Weiterhin kann der nukleäre Transfer
durch Kombination eines nukleären
Donors, einer oder mehr entkernter Oocyten und dem Cytoplasma von
einer oder mehr entkernten Oocyten bewerkstelligt werden.
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Der
Begriff "Cybrid", wie hier verwendet, kann
eine Oocyte bezeichnen, die einen darin inserierten nukleären Donor
aufweist. Der Begriff "Cybrid" kann eine Oocyte
bezeichnen, die einen nukleären Donor
aufweist, der in die Oocyte transloziert wurde. Ein nukleärer Donor
kann mit einer Oocyte fusioniert werden, und der Begriff "Cybrid" umfasst Oocyten, die
nicht mit einem nuklearen Donor fusioniert sind.
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Ebenfalls
beschrieben werden klonierte Säugetierembryos,
die durch nukleären
Transfer eines nukleären
Donors und einer nicht-entkernten Oocyte hergestellt werde. Ein
klonierter Embryo kann erzeugt werden, wenn die nukleäre DNA der
Donorzelle während
der Zellteilungen repliziert, während
die nukleäre
DNA eine Eizelle nicht repliziert. Siehe z.B. Wagoner et al., 1996, "Functional enucleation
of bovine oocytes: effects of centrifugation and ultraviolet light," Theriogenology 46:
279–284.
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Der
Begriff "ein weiteres
Huftier", wie hier verwendet,
kann eine Situation bezeichnen, in der ein nukleärer Donor von einem Huftier
einer anderen Spezies, Gattung oder Familie abstammt als das Huftier,
von dem die Empfängereizelle abstammt.
Dies ist als nicht einschränkend
zu verstehen, und von der Erfindung ist eine beliebige Huftierspezies/familien-Kombination aus nukleären Donoren
und Empfängeroocyten
vorgesehen.
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Der
Begriff "Translokation", wie hier in Bezug auf
nukleären
Transfer verwendet, kann das Kombinieren eines nuklearen Donors
und einer Empfängeroocyte
bezeichnen. Eine Translokation kann etwa mit Hilfe solcher Techniken
wie Fusion und/oder direkte Injektion durchgeführt werden.
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Der
Begriff "Injektion", wie hier in Bezug
auf Embryos verwendet, kann die Perforation einer Oocyte mit einer
Nadel und die Insertion eines nukleären Donors in der Nadel in
die Oocyte bezeichnen. In bevorzugten Ausführungsformen kann ein nukleärer Donor
in das Cytoplamsa einer Oocyte oder in den perivitellinen Raum einer
Oocyte injiziert werden. Dieser Ansatz einer direkten Injektion
ist Durchschnittsfachleuten bekannt, wie bereits durch die Publikationen
gezeigt wurde, die hier in Bezug auf nukleären Transfer beschrieben wurden.
Für einen
direkten Injektionsansatz zum nukleären Transfer kann eine ganze
Zelle in eine Oocyte injiziert werden, oder alternativ kann ein
Nukleus, der aus einer Zelle isoliert wurde, in eine Oocyte injiziert
werden. Solch ein isolierter Nukleus kann nur von einer nukleären Membran
umgeben werden, oder der isolierte Nukleus kann von einer nukleären Membran
und einer Cytoplasmamembran in beliebigen Anteilen umgeben werden.
Eine Oocyte kann vorbehandelt werden, um die Stärke ihrer Plasmamembran zu
erhöhren,
wie z.B. durch Inkubieren der Oocyte in Sucrose vor der Injektion
eines nukleären
Donors.
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Verfahren
zum Einbringen (placing) eines nuklearen Donors in der perivitellinen
Raum einer entkernten Oocyte sind Duchschnittsfachleuten bekannt
und vollständig
in den Patenten und Referenzen beschrieben, die hier in Bezug auf
den nukleären Transfer
zitiert wurden.
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Der
Begriff "Fusion", wie hier verwendet, kann
die Kombination von Anteilen von Lipidmembranen bezeichnen, welche einem
nukleären
Donor und einer Empfängeroocyte
entsprechen. Lipidmembranen können
z.B. Plasmamembranen von Zellen oder nukleären Membranen entsprechen.
Eine Fusion kann mit Zugabe eines Fusionsstimulus zwischen einem
nukleären
Donor und einer Empfängeroocyte erfolgen,
wenn diese beispielsweise angrenzend aneinander platziert werden,
oder wenn ein nukleärer Donor
in den perivitellinen Raum einer Empfängeroocyte eingebracht wird.
Spezifische Beispiele für
die Translokation einer Schweinezelle in eine Oocyte werden anschließend in
anderen bevorzugten Ausführungsformen
beschrieben. Diese Techniken für die
Translokation sind vollständig
in den Referenzen beschrieben, die vorher in Bezug auf den nukleären Transfer
zitiert wurden.
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Der
Begriff "elektrische
Pulse", wie hier
verwendet, kann das Aussetzen eines nukleären Donors und einer Empfängeroocyte
gegenüber
elektrischem Strom bezeichnen. Für
einen nukleären
Transfer können
ein nuklearer Donor und eine Empfängeroocyte zwischen Elektroden
ausgerichtet und elektrischem Strom ausgesetzt werden. Der elektrische Strom
kann Wechselstrom oder Gleichstrom sein. Der elektrische Strom kann
als ein Puls oder als multiple Pulse für eine Vielzahl unterschiedlicher
Zeiten an die Zellen abgegeben werden. Die Zellen werden typischerweise
in einem geeigneten Medium für
die Abgabe von elektrischen Pulsen kultiviert. Beispiele für elektrische
Pulsbedingungen, die zum nuklearen Transfer verwendet werden, sind
in den Referenzen und Patenten beschrieben, die hier zuvor in Bezug auf
den nukleären
Transfer zitiert wurden.
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Der
Begriff "Fusionsagens", wie hier verwendet,
kann eine beliebige Verbindung oder einen biologischen Organismus
bezeichnen, der die Wahrscheinlichkeit erhöhen kann, dass Teile von Plasmamembranen
unterschiedlicher Zellen fusionieren, wenn ein nukleärer Donor
angrenzend an eine Empfängeroocyte
platziert wird. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Fusionsagenzien
aus der Gruppe ausgewählt,
die aus Polyethylenglykol (PEG), Trypsin, Dimethylsulfoxid (DMSO),
Lektinen, Agglutinin, Viren und Sendai Virus besteht. Diese Beispiele
sind als nicht einschränkend
zu verstehen, und weitere im Stand der Technik bekannte Fusionsagenzien
sind anwendbar und hierin eingeschlossen.
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Der
Begriff "geeignete
Konzentration",
wie hier in Bezug auf Fusionsagenzien verwendet, kann eine beliebige
Konzentration eines Fusionsagens bezeichnen, das ein messbares Maß an Fusion
liefert. Eine Fusion kann mit Hilfe vielfältiger Techniken gemessen werden,
die Durchschnittsfachleuten bekannt sind, wie z.B. durch Verwendung
eines Lichtmikroskops, von Farbstoffen und von fluoreszierenden Lipiden.
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Der
Begriff "Aktivierung" kann ein Material und
ein Verfahren bezeichnen, die zur Stimulation einer Zelle zur Teilung
vor, während
und nach einem nukleären
Transferschritt zweckmäßig sind.
Der Begriff "Zelle", wie im vorangegangenen
Satz verwendet, kann eine Oocyte, ein Cybrid, einen nukleären Donor
und ein Embryo im frühen
Stadium bezeichnen. Diese Zelltypen können eine Stimulation erfordern,
und sich nach erfolgtem nukleären
Transfer zerteilen. Die Erfindung betrifft ein Aktivierungsmaterial
und ein Verfahren, wie in Anspruch 13 beschrieben.
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Obwohl
elektrische Pulse manchmal zur Stimulierung der Aktivierung von
Zellen ausreichend sind, sind andere nicht-elektrische Mittel zur Aktivierung zweckdienlich
und oftmals für
eine ausreichende Aktivierung einer Zelle notwendig. Chemische Materialien
und Verfahren, die zur nicht-elektrischen Aktivierung
zweckdienlich sind, werden anschließend beschrieben. Wenn zwei
oder mehr chemische Komponenten in eine Zelle zur Aktivierung der
Zelle eingebracht werden, können
die Zellen simultan oder nacheinander zugegeben werden.
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Beispiele
für elektrische
Verfahren zur Aktivierung sind im Stand der Technik bekannt. Forscher haben
ebenfalls nicht-elektrische
Verfahren zur Aktivierung publiziert. Siehe z.B. Grocholová et al.,
1997. J. Exp. Zoology 277: 49–56;
Schoenbeck et al., 1993, Theriogenology 40: 257–266; Prather et al., 1989,
Biology of Reproduction 41: 414–418;
Prather et al., 1991, Molecular Reproduction and Development 28: 405–409; Mattioli
et al., 1991, Molecular Reproduction and Development 30: 109–125; Terlouw
et al., 1992, Theriogenology 37: 309; Prochazka et al., 1992, J.
Reprod. Fert. 96: 725–734;
Funahashi et al., 1993, Molecular Reproduction and Development 36: 361–367; Prather
et al., Bio. Rep. Vol. 50 Sup 1: 282; Nussbaum et al., 1995, Molecular
Reproduction and Development 41: 70–75; Funahashi et al., 1995,
Zygote 3: 273–281;
Wang et al., 1997, Biology of Reproduction 56: 1376–1382; Piedrahita
et al., Biology of Reproduction 58: 1321–1329; Macháty et al., 1997, Biology
of Reproduction 57: 85–91;
und Macháty
et al., 1995, Biology of Reproduction 52: 753–758.
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Beispiele
für Komponenten,
die für
eine nicht-elektrische Aktivierung verwendbar sind, umfassen Ethanol;
Inositol Triphosphat (IP3); divalente Ionen
(z.B. Zugabe von Ca2+ und/oder Sr2+); Mikrotubulus-Inhibitoren (z.B. Cytochalasin
B); Ionophoren für
divalente Ionen (z.B. der Ca2+ Ionophor
Ionomycin); Proteinkinase-Inhibitoren (z.B. 6-Dimethylaminopurin (DMAP)); Proteinsynthese-Inhibitoren
(z.B. Cyclohexamid); Phorbolesther, wie z.B. Phorbol 12-Myristat
13-Acetat (PMA);
und Thapsigargin. Es ist ferner bekannt, dass Temperaturveränderungen und
mechanische Verfahren ebenfalls für eine nicht-elektrische Aktivierung
zweckdienlich sind. Die Erfindung umfasst beliebige Aktivierungsverfahren, die
im Stand der Technik bekannt sind. Siehe z.B. das U.S. Patent Nr.
5,496,720 mit dem Titel "Parthenogenic
Oocyte Activation," erteilt
am 5. März
1996, Susko-Parrish et al., und Wakayama et al., 1998, Nature 394:
369–374.
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Wenn
Ionamycin und DMAP für
eine nicht-elektrische Aktivierung verwendet werden, können Ionomycin
und DMAP in die Zellen simultan oder durch schrittweise Zugabe eingebracht
werden, wobei die letztere die bevorzugte Methode ist, die hier beschrieben
wird. Die bevorzugte Konzentration von Ionomycin und DMAO beträgt etwa
10 μM Ionomycin bzw.
etwa 2 mM DMAP, wobei der Begriff "etwa" sich auf
plus oder minus 2 μM
Ionomycin und 1 mM DMAP bezieht.
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Ebenfalls
beschrieben werden: (1) Eine oder mehr Zellen des klonierten Schweineembryos
umfassen modifizierte nukleäre
DNA; (2) der klonierte Schweineembryo wird einer Manipulation unterzogen;
(3) die Manipulation umfasst den Schritt der Disaggregation mindestens
einer einzelnen Zelle eines klonierten Embryos; (4) die Manipulation
umfasst den Schritt der Verwendung der einzelnen Zelle als nukleärer Donor
in einem nukleären
Transferverfahren; (5) die einzelne Zelle wird aus der inneren Zellmasse eines
Embryos im Blastocystenstadium disaggregiert; (6) die einzelne Zelle
wird aus einem Embryo im Präblastocystenstadium
disaggregiert; (7) die Manipulation umfasst das Verfahren der Reklonierung;
(8) der Reklonierungsprozess umfasst die Schritte: (a) Separieren
des Embryos in eine oder mehr individuelle Zellen, und (b) Durchführen mindestens
eines anschließenden
nukleären
Transfers zwischen (i) einer individuellen Zelle von (a) und (ii)
einer Oocyte; (9) die einzelne Zelle wird in den perivitellinen
Raum einer entkernten Oocyte für
den anschließenden
nukleären
Transfer eingebracht; (10) der anschließende nukleäre Transfer umfasst mindestens
einen der Schritt e. der Translokation, Injektion, Fusion und Aktivierung
der individuellen Zelle und/oder der entkernten Oocyte; (11) eine
oder mehr Zellen des klonierten Säugetierembryos, der aus dem
nachfolgenden nuklearen Transfer entstanden ist, umfasst modifizierte nukleäre DNA;
und (12) der klonierte Säugetierembryo,
der aus dem anschließenden
nukleären
Transfer entstanden ist, kann einer nachfolgenden Manipulation unterzogen
werden, wobei die nachfolgenden Manipulation ein beliebiger der
Manipulationsschritte ist, die zuvor hier in. Bezug auf totipotente
Zellen und/oder klonierte Embryos beschrieben wurden.
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Der
Begriff "individuelle
Zellen", wie hier
verwendet, kann Zellen bezeichnen, die aus einem klonierten Säugetierembryo
gemäß der Erfindung
isoliert wurden. Eine individuelle einzelne Zelle kann aus einem
Embryo mit Hilfe von Techniken isoliert werden, die Fachleuten bekannt
sind, wie in den zuvor hier zitierten Referenzen diskutiert wurde.
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Der
Begriff "nachfolgender
nukleärer
Transfer", wie hier
beschrieben, wird ebenfalls als "Reklonierungsschritt" bezeichnet. Vorzugsweise
kann ein Reklonierungsschritt verwendet werden, um die nukleäre Reprogrammierung
während
des nuklearen Transfers zu erhöhen,
sodass ein Produkt des nukleären
Transfers ein lebendgeborenes Tier ist. Eine Reihe nachfolgender
nukleärer
Transferschritte wird im Anschluss im Detail diskutiert.
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Eine
beliebige bevorzugte Ausführungsform, welche
die zuvor beschriebenen Translokations-, Injektions-, Fusions- und
Aktivierungsschritte betrifft, kann einen beliebigen nachfolgenden
Transferschritt betreffen.
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Der
Begriff "innere
Zellmasse", wie
hier verwendet, kann Zellen bezeichnen, aus denen ein korrekter
Embryo entsteht. Zellen, welche die Außenseite eines Blastocysten
säumen,
können
als Trophoblast des Embryos bezeichnet werden. Verfahren zur Isolierung
der Zellen der inneren Zellmasse eines Embryos sind Durchschnittsfachleuten
bekannt, wie zuvor diskutiert. Der Begriff "Präblastocyst" ist im Stand der
Technik bekannt und wurde zuvor bezeichnet.
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Der
Begriff "ovuliert
in vivo", wie hier
verwendet, kann eine Oocyte bezeichnen, die aus einem Tier eine
bestimmte Anzahl von Stunden isoliert wurden, nachdem das Tier Charakteristika
zeigt, die mit Östrus
assoziiert sind, oder nach Injektion exogener Gonadotrophine, von
denen bekannt ist, dass sie die Ovulation induzieren. Die Charakteristika
eines Tiers im Östrus
sind Durchschnittsfachleuten bekannt, wie in den hier offenbarten
Referenzen beschrieben. Siehe z.B. Gordon, 1977, "Embryo transfer and
associated techniques in pigs (Gordon, Hrsg.)," CAB International, Wallingford UK,
S. 60–76
and Kojima, 1998, "Embryo
transfer," Manual
of pig embryo transfer procedures, National Livestock Breeding Center,
Japanese Society for Development of Swine Technology, S. 7–21.
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In
einem weiteren Aspekt wird ein klonierter Schweineembryo beschrieben,
wobei der klonierte Embryo selbst keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellt,
der mit Hilfe eines Verfahrens erzeugt wurde, das die Schritte umfasst:
(a) Translokation eines nukleären
Donors in eine Oocyte, um eine nukleare Transferoocyte zu erzeugen;
und (b) nicht-elektrische Aktivierung der nukleären Transfer-Oocyte, um den
Schweineembryo zu erzeugen.
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(1)
Der nukleäre
Donor ist eine kultivierte Zelle und wird aus der Gruppe von Zellen
ausgewählt,
die in Anspruch 6 definiert ist; (2) der nukleäre Donor ist eine totipotente
Zelle oder wird aus einer totipotenten Zelle isoliert; (3) der nukleare
Donor ist ein Zelltyp wie in Anspruch 6 definiert (z.B. eine embryonale
Keimzelle, Kumuluszelle, amniotische Zelle, Fibroblastenzelle);
(4) die Translokation umfasst den Schritt einer Fusion; und (5)
das Verfahren umfasst den Schritt des Kultivierens des Embryos in
vitro.
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In
ihrem Hauptaspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
eines klonierten Schweineembryos wie in Anspruch 1 definiert.
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Klonierte Föten
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein nicht-chirurgisches
Verfahren zur Herstellung eines klonierten Schweinefötus, wobei
das Verfahren umfasst:
- (a) Herstellen eines
klonierten Schweineembryos mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden
Erfindung; und
- (b) Implantieren des klonierten Schweineembryos in den Uterus
eines maternalen Huftiers, um sich in einen klonierten Fötus zu entwickeln.
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Weiterhin
(1) enthalten eine oder mehr Zellen des Fötus eine modifizierte nukleäre DNA (zuvor hier
definiert), wie in Anspruch 7 beschrieben; und (2) der Fötus kann
einer beliebigen Manipulation, die hier definiert ist, unterzogen
werden. Zum Beispiel kann eine Manipulation die Schritte des Isolierens
eines Fötus
aus dem Uterus eines schwangeren weiblichen Tiers. das Isolieren
einer Zelle aus dem Fötus (z.B.
eine primordiale Keimzelle) und die Verwendung der isolierten Zelle
als nukleärer
Donor für
einen nukleären
Transfer umfassen.
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Weitere
Aspekte beschreiben (1) einen klonierten Schweinefötus, wobei
der klonierte Schweinefötus
selbst keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellt, der mit
Hilfe eines Verfahrens hergestellt wurde, das die Schritte umfasst:
(a) Herstellen eines klonierten Schweineembryos, wie zuvor definiert, und
(b) Manipulation des klonierten Schweineembryos, sodass sich dieser
in einen Fötus
entwickelt; (2) ein Verfahren zur Herstellung eines klonierten Schweinefötus, das
die Schritte umfasst: (a) Herstellung eines klonierten Schweineembryos,
wie zuvor definiert, und (b) Manipulation des klonierten Schweineembryos,
sodass sich dieser in einen Fötus
entwickelt; (3) ein Verfahren zur Verwendung eines klonierten Fötus entsprechend
der Erfindung, das den Schritt der Isolation mindestens eines Zelltyps
aus einem Fötus
umfasst (z.B. zur Etablierung einer Feeder-Zelllinie); und (4) ein Verfahren zur
Verwendung eines klonierten Fötus
entsprechend der Erfindung, das den Schritt des Separierens mindestens
eines Teils des Fötus
in einzelne Zellen umfasst (z.B. zur Etablierung einer Feeder-Zelllinie).
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Klonierte Schweine
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein nicht-chirurgisches
Verfahren zur Herstellung eines lebendgeborenen klonierten Schweins, wobei
dieses Verfahren umfasst:
- (a) Herstellen eines
klonierten Embryos mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens;
und
- (b) Implantieren des klonierten Schweineembryos in den Uterus
eines maternalen Huftiers, um einen Fötus zu erzeugen, der die vollständige fötale Entwicklung
und die Geburt durchläuft,
um das lebendgeborene Schwein zu generieren.
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Ein
kloniertes Schwein entwickelt sich aus einem klonierten Embryo,
der mit Hilfe eines nuklearen Transferverfahrens zwischen einer
totipotenten Schweinezelle und eine Schweineoocyte etabliert wurde.
Eine totipotente Schweinezelle wird vorzugsweise durch Verwendung
eines beliebigen Materials oder Verfahrens etabliert, die hier zuvor
beschrieben wurden.
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In
einem weiteren Aspekt wird ein kloniertes Schwein beschrieben, wobei
das klonierte Schwein selbst keinen Teil der vorliegenden Erfindung
darstellt, wobei das Tier ein Mitglied einer Mehrzahl von Schweinen
ist, und wobei die Mehrzahl von Tieren eine im wesentlichen ähnliche
nukleäre
DNA-Sequenz aufweist. Der Begriff "im wesentlichen ähnlich" in Bezug auf nukleare DNA-Sequenzen
wurde zuvor definiert.
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(1)
die Mehrzahl besteht aus fünf
oder mehr Tieren, zehn oder mehr Tieren, 100 oder mehr Tieren und
1000 oder mehr Tieren; und (2) die Mehrzahl von Tieren kann eine
identische nukleäre
DNA-Sequenz aufweisen. Der Begriff "identisch" in Bezug auf nukleare DNA-Sequenzen
wurde zuvor beschrieben.
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In
einem weiteren Aspekt wird ein kloniertes Schwein beschrieben, wobei
das klonierte Schwein selbst keinen Teil der vorliegenden Erfindung
darstellt, das eine oder mehr Zellen aufweist, die eine modifizierte
nukleäre
DNA umfassen.
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Ebenfalls
beschrieben wird ein Verfahren zu Verwendung eines klonierten Schweins,
das den Schritt des Isolierens mindestens einer Komponente aus dem
Schwein umfasst.
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Der
Begriff "Komponente", wie hier verwendet,
kann einen beliebigen Teil eines Schweins betreffen. Eine Komponente
kann aus der Gruppe ausgewählt
werden, die aus Fluid, biologischem Fluid, Zelle, Gewebe, Organ,
Gamet, Embryo und Fötus besteht.
Zum Beispiel können
Vorläuferzellen,
wie zuvor definiert, aus Fluiden, biologischen Fluiden, Zellen,
Geweben, Organen, Gameten, Embryos und Föten entstehen, die aus den
klonierten Organismen der Erfindung isoliert wurden.
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Der
Begriff "Gamet", wie hier verwendet, kann
eine beliebige Zelle bezeichnen, die direkt oder indirekt am reproduktiven
System eines Tiers beteiligt ist. Ein Gamet kann ein spezialisiertes
Produkt aus den Gonaden eines Organismus sein, wobei der Gamet genetisches
Material transferieren kann, während
er an der Fertilisation beteiligt ist. Beispiele für Gameten
sind Spermatocyten, Spermatogonien, Oocyten und Oogonien. Gameten
können
in Fluiden, Geweben und Organen vorliegen, die Tieren entnommen
werden (z.B. liegen Spermien in Samenflüssigkeit vor). Ebenfalls beschrieben
wird die Entnahme eines beliebigen Typs einer Gamete aus einem Tier. Zum
Beispiel sind Verfahren zur Entnahme von Samen und Oocyten Durchschnittsfachleuten
bekannt. Siehe z.B. Gordon, 1997, "Introduction to controlled breeding
in pigs, Embryo transfer and associated techniques in pigs," Controlled reproduction
in pigs (Gordon, Hrsg.), CAB International, Wallingford UK, S. 1–59; Mattioli
et al., 1989, Theriogenology 31: 1207–1207; Funahashi & Day, 1993, J.
Reprod. Fert. 98: 179–185;
Funahashi. et al., 1997, Biol. Reprod. 57: 49–53; Abeydeera et al., 1998,
Biol. Reprod. 58: 213–218;
und Sawai et al., Biol. Reprod. 57: 1–6.
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Der
Begriff "Gewebe" wurde zuvor. definiert. Der
Begriff "Organ" betrifft ein beliebiges
Organ, das aus einem Tier isoliert wurde, oder ein beliebiges Teil eines
Organs. Beispiele für
Organe und Gewebe sind neuronales Gewebe, Hirngewebe, Milz, Herz,
Lunge, Gallenblase, Pancreas, Testis, Ovar und Niere. Diese Beispiele
sind nicht einschränkend,
und die Erfindung betrifft ein beliebiges Organ und ein beliebiges Gewebe,
das aus einem klonierten Tier der Erfindung isoliert wurde.
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In
bevorzugten Ausführungsformen,
die keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellen, betrifft die
Erfindung: (1) Fluide, biologische Fluide, Zellen, Gewebe, Organe,
Gameten, Embryos und Föten können einer
Manipulation unterworfen werden; (2) die Manipulation kann den Schritt
der Kryokonservierung der Gameten, Embyros und/oder fötalen Gewebe
umfassen; (3) die Manipulation kann den Schritt des Auftauens der
kryokonservierten Gegenstände umfassen;
(4) die Manipulation kann den Schritt des Separierens des Samens
in X-Chromosom tragenden
Samen und Y-Chromosom tragenden Samen umfassen; (5) die Manipulation
umfasst Verfahren zur Herstellung von Samen für eine artifizielle Besamung;
(6) die Manipulation umfasst den Schritt der Reinigung eines gewünschten
Polypeptids (gewünschter
Polypeptide) aus dem biologischen Fluid oder Gewebe; (7) die Manipulation
umfasst eine Konzentration der biologischen Fluide oder Gewebe;
(8) die Manipulation kann den Schritt des Transferierens eines oder
mehrerer Fluide, klonierter Zellen, klonierter Gewebe, klonierter
Organe und/oder von Teilen klonierter Organe in einen Empfängerorganismus umfassen
(z.B. kann der Empfängerorganismus
eine andere Spezies sein als die Donorquelle); (9) der Empfängerorganismus
ist kein Mensch; und (10) der Empfängerorganismus ist ein Mensch.
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Der
Begriff "Separieren", wie hier in Bezug auf
das Separieren von Samen verwendet, kann Verfahren zur Fraktionierung
einer Samenprobe in geschlechtsspezifische Fraktionen bezeichnen,
die Fachleuten bekannt sind. Dieser Typ Separierung kann durch Verwendung
von Flusscytometern verwendet werden, die kommerziell verfügbar sind.
Verfahren zur Verwendung von Flusscytometern zur Separierung von
Sperma bezüglich
des genetischen Gehalts sind im Stand der Technik bekannt. Weiterhin
kann Samen durch seine geschlechtsassoziierten Charakteristika mit
Hilfe anderer, Fachleuten bekannter Verfahren separiert werden.
Siehe die U.S. Patente 5,439,362, 5,346,990, und 5,021,244 mit dem
Titel "Sex-Associated
Membrane Proteins and Methods for Increasing the Probability that
Offspring Will Be of a Desired Sex," Spaulding, erteilt am 8. August 1995,
13. September 1994 bzw. 4. Juni 1991.
-
Der
Begriff "Reinigung", wie hier verwendet, kann
die Erhöhung
der spezifischen Aktivität
eines bestimmten Polypeptids oder bestimmter Polypeptide in eine
Probe bezeichnen, Die spezifische Aktivität kann als Verhältnis zwischen
der Aktivität
oder Menge eines Zielpolypeptids und der Konzentration an Gesamtpolypeptid
in der Probe ausgedrückt
werden. Aktivität
kann z.B. katalytische Aktivität
und/oder Bindungsaktivität
sein. Ferner kann die spezifische Aktivität als Verhältnis zwischen der Konzentration
des Zielpolypeptids und der Konzentration an Gesamtpolypeptid ausgedrückt werden.
Reinigungsverfahren umfassen Dialyse, Zentrifugation und Säulenchromatographieverfahren,
die Durchschnittsfachleuten bekannt sind. Siehe z.B. Young et al.,
1997, "Production
of biopharmaceutical proteins in the milk of transgenic dairy animals," BioPharm 10(6):
34–38.
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Der
Begriff "transferieren", wie hier verwendet,
kann das Übertragen
einer Gruppe von Zellen, Geweben, Organen und/oder von Teilen von
Organen in ein Tier betreffen. Zellen, Gewebe, Organe und/oder Teile
von Organen können
z.B. (a) sich in vitro entwickeln und anschließend in ein Tier transferiert
werden, (b) aus einem klonierten Schwein entfernt und in ein anderes
Tier einer unterschiedlichen Spezies transferiert werden, (c) aus
einem klonierten Schwein entfernt und in ein anderes Tier der gleichen Spezies
transferiert werden, (d) aus einem Teil eines Tiers (z.B. Zellen
aus dem Bein eines Tiers) entfernt werden und anschließend in
ein anderes Teil des gleichen Tiers (z.B. das Gehirn des gleichen
Tiers) transferiert werden und/oder (e) eine beliebige Kombination
des vorangegangenen.
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Der
Begriff "transferieren", wie hier verwendet,
kann das Zugeben von Fluiden, Zellen, Geweben und/oder Organen zu
einem Tier bezeichnen und kann das Entfernen von Zellen, Geweben
und/oder Organen aus einem Tier und Ersetzen dieser mit Zellen,
Geweben und/oder Organen aus einer anderen Quelle bezeichnen. Beispielsweise
kann neuronales Gewebe eines klonierten Schweins in einen geeigneten
Bereich des Nervensystems eines Menschen transplantiert werden,
um neurologische Erkrankungen zu behandeln (z.B. die Alzheimer Erkrankung).
In einem weiteren Beispiel kann das Herz oder der Teil eines Herzens
aus einem klonierten Schwein entfernt werden und kann chirurgisch
in einen Menschen eingepflanzt werden, dem zuvor das Nerz oder ein
Teil des Herzens entnommen wurde. Chirurgische Verfahren sind Durchschnittsfachleuten
auf dem Gebiet der Chirurgie bekannt. Transferverfahren können den Schritt
des Entfernens von Zellen, Geweben, Fluiden und/oder Organen aus
einem Empfängerorganismus vor
einem Transferschritt umfassen.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung: (1) ein nicht-chirurgisches
Verfahren zur Herstellung eines lebendgeborenen klonierten Schweins,
wobei dieses Verfahren umfasst: (a) Herstellen eines klonierten
Embryos mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens; und (b) Implantieren
des klonierten Schweineembryos in den Uterus eines maternalen Huftiers,
um einen Fötus
zu erzeugen, der die vollständige
fötale
Entwicklung und die Geburt durchläuft, um das lebendgeborene
Schwein zu generieren.
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(1)
Die Manipulation kann den Schritt des Implantierens des Embryos
in einen Uterus eines Tiers umfassen; (2) der Östrus-Zyklus des Tiers kann
mit dem Entwicklungszyklus des Embryos synchronisiert werden; und
(3) die Manipulation kann den Schritt des Implantierens des Embryos
in eine artifizielle Umgebung umfassen.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Klonierung
eines Schweins, das die Schritte umfasst: (a) Translokation eines
nukleären
Donors in eine Oocyte, um eine nukleäre Transferoocyte zu erzeugen;
(b) nicht-elektrische Aktivierung der nukleären Transferoocyte, um einen
klonierten Schweineembryo zu etablieren; und (c) Transferieren des
klonierten Schweineembryos in ein Empfängerweibchen, wobei der Schweineembryo sich
in ein kloniertes Schwein entwickelt.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
(1) ist der nukleäre
Donor eine kultivierte Zelle und wird aus einem beliebigen der Zelltypen
ausgewählt,
die hier beschrieben sind; (2) ist der nukleäre Donor eine totipotente Zelle;
(3) umfasst die Translokation eine Fusion; und (4) umfasst das Verfahren
den Schritt des Kultivierens des Schweineembryos in vitro. Jede
andere hier mit Bezug auf Schweineembryos, und insbesondere mit
Bezug auf die Aktivierung diskutierte bevorzugte Ausführungsform
betrifft diesen Aspekt der Erfindung.
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Die
oben beschriebene Zusammenfassung der Erfindung ist nicht einschränkend, und
weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung sind aus der nachfolgenden
detaillierten Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen sowie aus den
Ansprüchen
ersichtlich.
-
KURZE BESCHREIBUNG DER
FIGUREN
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1 veranschaulicht
multiple Ausführungsformen
der Erfindung, welche die Generierung totipotenter Zellen aus Vorläuferzellen
betreffen. Die Figur zeigt, dass totipotente Zellen aus embryonalen Stammzellen,
primordialen Keimzellen und aus einem Tier isolierten Zellen entstehen
können.
Die in 1 veranschaulichten Quellen
für Vorläuferzellen sind
nicht einschränkend,
und weitere Quellen für Vorläuferzellen
werden hier beschrieben.
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2 veranschaulicht
multiple Ausführungsformen
der Erfindung, die Wege zur Erzeugung totipotenter Zelllinien und
klonierter Tiere betreffen. Fibroblastenzellen können aus einer beliebigen hier
beschriebenen Quelle isoliert werden.
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3 veranschaulicht
multiple Ausführungsformen
der Erfindung zur Erzeugung klonierter transgener Zelllinien und
klonierter transgener Tiere.
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GENAUE BESCHREIBUNG DER
BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Klonierungsverfahren für Schweine.
Die vorliegende Erfindung schafft vielfältige Vorteile gegenüber Werkzeugen
und Verfahren, die gegenwärtig
auf dem Gebiet der Klonierung von Schweinen verwendet werden. Zum
Beispiel werden hier totipotente Zellen beschrieben, die zur Klonierung
von Schweinen zweckdienlich sind. Diese totipotenten Zellen können zu
Verfahren zur Erzeugung klonierter Schweine durch Verwendung eines
beinahe jeden Zelltyps führen.
Beispielsweise können
Zellen, die aus einem lebendgeborenen Tier isoliert wurden, in totipotente
Zellen reprogrammiert werden. Dies schafft die Fähigkeit zur Beurteilung eines
Phänotyps
eines existierenden Schweins und zur leichten anschließenden Etablierung
einer totipotenten Zelllinie zur Klonierung dieses Tiers.
-
Zusätzlich ermöglichen
totipotente Zellen die Etablierung von Zelllinien aus nahezu jedem
Zelltyp. Dieses Reprogrammierungsverfahren wurde zuvor beschrieben.
Diese totipotenten Zelllinien bieten eine nahezu unlimitierte Quelle
an Donorzellen für
Klonierungstechniken mittels nukleärem Transfer. Außerdem schafft
dieses Merkmal den Vorteil der Erhöhung der Klonierungseffizienz
aufgrund geringerer Differenzierungsraten dieser Zellen gegenüber den bestehenden
Zelllinien, die zur Klonierung verwendet werden. Zum Beispiel können embryonale
Stammzellen multiple Kolonien von Zellen enthalten, die nicht totipotent
sind. Zelllinien können
einen hohen Prozentsatz an totipotenten Zellen enthalten.
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Außerdem erhöhen die
Verfahren und Techniken zur Erzeugung totipotenter Zellen, die totipotenten
klonierten Embryos und die klonierten Tiere der Erfindung die Klonierungseffizienz.
Diese erhöhte Effizienz
erfüllt
einen lange gehegten Bedarf im Stand der Technik.
-
I. Totipotente Schweinezellen
-
A. Erzeugung totipotenter
Zellen
-
Totipotente
Zellen können
aus nahezu jedem Typ an Vorläuferzelle
erzeugt werden. Die folgenden Typen an Vorläuferzellen werden beschrieben,
wobei die Vorläuferzellen
selbst keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellen: (1) Embryos,
die aus der Vereinigung von zwei Gameten in vitro oder in vivo entstehen;
(2) embryonale Stammzellen (ES-Zellen), die
aus kultivierten embryonalen Zellen entstehen (z.B. Präblastocystenzellen
und Zellen der inneren Zellmasse); (3) kultivierte und nicht-kultivierte
Zellen der inneren Zellmasse, die aus Embryos isoliert werden; (4)
kultivierte und nicht-kultivierte Präblastocystenzellen; (5) kultivierte
und nicht-kultivierte fötale Zellen;
(6) kultivierte und nicht-kultivierte primordiale Keimzellen; (7)
kultivierte embryonale Keimzellen (EG-Zellen), so wie diese hier
definiert werden; (8) kultivierte und nicht-kultivierte aus einem
Tier isolierte Zellen; (9) kultivierte und nicht-kultivierte Kumuluszellen;
(10) kultivierte und nicht-kultivierte amniotische Zellen; (11)
kultivierte und nicht-kultivierte fötale Fibroblastenzellen; (12)
kultivierte und nicht-kultivierte
Zellen der Keimleiste; (13) kultivierte und nicht-kultivierte differenzierte
Zellen; und (14) kultivierte und nicht-kultivierte nicht-differenzierte
Zellen oder undifferenzierte Zellen.
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Totipotente
Zellen, die keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellen, werden
vorzugsweise aus den hier spezifizierten Vorläuferzellen generiert. Zellen,
die von einem Schwein abstammen, können aus nahezu jedem Gewebetyp
isoliert werden. Zum Beispiel kann einem Schwein eine Ohrstanzung
entnommen werden, die Zellen aus dieser Probe können dissoziiert werden, und
die dissoziierten Zellen können
anschließend
mit Hilfe von Zellkulturtechniken, die Durchschnittsfachleuten bekannt
sind, in vitro kultiviert werden. Beispiele für Materialien und Verfahren
für die
Kultivierung von primären
Zellkulturen in totipotente Zellen werden exemplarisch in den anschließenden Ausführungsbeispielen
beschrieben.
-
Im
Stand der Technik existiert eine Vielzahl von Verfahren zur Kultivierung
von Zellen. Siehe z.B. Culture of animal cells: a manual of basic
technique (2. Auflage), Freshney, Copyright 1987, Alan R. Liss, Inc.,
New York. Insbesondere können
Zellen, die Varläuferzellen
für totipotente
Zellen sind, sowie totipotente Zellen selbst auf Feeder-Schichten
angezogen werden. Beispiele für
Feeder-Schichten
sind Durchschnittsfachleuten bekannt und können aus einer Vielzahl unterschiedlicher
Zellen entstehen, die in vitro kultiviert werden. Siehe z.B. die
anschließend
beschriebene exemplarische Ausführungsform
sowie Strelchenko, 1996, Theriogenology 45: 130–141; Piedrahita et al., 1990,
Theriogenology 34: 879–901; Piedrahita
et al., 1998, Biol. Reprod. 58: 1321–1329; und Shim et al., 1997,
Theriogenology 47: 245. Vorläuferzellen
für totipotente
Zellen sowie die totipotenten Zellen selbst brauchen jedoch nicht
auf Feeder-Schichten
angezogen werden.
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Eine
bevorzugte Zellkulturbedingung für
diese Vorläuferzellen
ist ein Zellkulturmedium, das eine signifikante Menge an Glukose
enthält,
und zwar in einer hier spezifizierten Menge. Die Zellkulturbedingung
kann ein Kohlehydrat enthalten, das sich von Glukose unterscheidet,
und kann ferner multiple Typen an Kohlehydraten und komplexen Kohlehydraten enthalten.
Eine Vielzahl von Kohlehydraten ist Durchschnittsfachleuten bekannt.
Siehe z.B. die Kataloge von Sigma und DIFCO.
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Bevorzugte
Zellkulturbedingungen betreffen ferner Zellkulturmedien, die ein
oder mehr Antibiotika enthalten. Geeignete Antibiotika für die Verwendung in
Zellkulturmedien sind im Stand der Technik bekannt. Siehe z.B. Culture
of Animal Cells: a manual of basic techniques (3. Auflage), 1994,
Freshney (Hrsg.), Wiley-Liss, Inc.: Cells: a laboratory manual (Vol.
1), 1998), Spector, Goldman, Leinwand (Hrsg.), Cold Spring Harbor
Laboratory Press: und Animal Cells: culture and media, 1994, Darling & Morgan, John
Wiley and Sons, Ltd.
-
Ein
weiteres Beispiel einer Zellkulturbedingung ist ein Zellkulturmedium,
das einen oder mehrere Rezeptorliganden enthält. Beispiele für Rezeptorliganden
sind Durchschnittsfachleuten bekannt. Cytokine und/oder Wachstumsfaktoren
sind bevorzugte Rezeptorliganden der Erfindung. Siehe z.B. R&D Systems Katalog,
614 McKinley Place N. E., Minneapolis, MN 55413. In exemplarischen
Ausführungsformen
können
verschiedene Mengen an humanem rekombinantem Leukämie Inhibitorfaktor
(hrLIF) und basischem bovinem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF)
zum Kulturmedium gegeben werden, um die Vorläuferzellen in totipotente Zellen
zu reprogrammieren. Variierende Konzentrationen dieser beiden Cytokine
können
zum Kulturmedium gegeben werden, vorzugsweise Konzentrationen von
1–1000 ng/ml,
bevorzugter Konzentrationen zwischen 10–500 ng/ml, und am meisten
bevorzugt etwa 1.00 ng/ml. Exogene lösliche und membranassoziierte Formen
des Steel-Faktors sind für
die Umwandlung der Vorläuferzellen
in totipotente Zellen nicht erforderlich.
-
Diese
Beispiele sind als nicht einschränkend zu
verstehen, und ein beliebiges Cytokin oder eine Kombination von
Cytokinen kann zu den hier in den exemplarischen Ausführungsformen
beschriebenen hinzugefügt
oder entfernt werden. Bevorzugte Cytokine für die Generierung totipotente
Zellen können aus
der Gruppe ausgewählt
werden, die aus Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), Leukämie Inhibitorfaktor
(LIF), Cardiotrophin 1 (CT-1), ciliärem neurotrophee Faktor (CNTF),
Stammzellfaktor (SCF), Oncostatin M (OSM) und jedem Mitglied der
Interleukin (IL)-Familie einschließlich IL-6, IL-11 und IL-12 besteht.
-
Weitere
Cytokine und andere Moleküle
außer
Cytokinen können
zu dem in den anschließend beschriebenen
exemplarischen Ausführungsformen beschriebenen
Cocktail aus Rezeptorliganden zugegeben oder aus diesem entfernt
werden, um totipotente Zellen aus einer beliebigen der im vorangegangenen
Absatz beschriebenen Zellen zu erzeugen. Bezüglich jeder der Bedingungen
zur Generierung totipotenter Zellen kann von den hier beschriebenen Bedingungen
abgewichen werden. Die Fähigkeit
dieser modifizierten Bedingungen, totipotente Zellen zu generieren,
kann mit Hilfe von Verfahren überwacht werden,
die im nachfolgenden Abschnitt "Identifikation
totipotenter Zellen" beschrieben
werden.
-
B. Identifikation totipotenter
Zellen
-
Totipotente
Zellen können
auf eine Vielzahl von Arten identifiziert werden. Beispiele für Untersuchungen
zur Totipotenz von Zellen umfassen:
- (1) Identifizieren
eines Markers, der spezifisch für totipotente
Zellen ist;
- (2) Durchführen
von einem oder mehr nukleären Transferzyklen
mit einer Zelle (wie anschließend beschrieben)
und Entwickeln des resultierenden Embryos in ein Tier.
-
Marker
können
verwendet werden, um totipotente Zellen von nicht-totipotenten Zellen
zu unterscheiden. Die Marker können
aus der Gruppe niedermolekularer Marker, makromolekulare Marker,
Zelloberflächenmarker
und intrazellulärer
Marker ausgewählt
werden. Beispiele für
Marker, die zur Identifizierung totipotenter Zellen geeignet sind,
können
aus der Gruppe ausgewählt
werden, die aus alkalischer Phosphatase, Cytokeratin, Vimentin,
Laminin und c-kit besteht. Diese Marker sind Durchschnittsfachleuten
bekannt, und diese Beispiele sind als nicht einschränkend zu
verstehen.
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Einige
dieser Marker wurden bezüglich
kultivierter boviner Zellen untersucht, die als totipotent identifiziert
wurden. Wie zuvor angemerkt, können
totipotente Schweinezellen gemäß der Erfindung
keine nennenswerte Färbung
für alkalische
Phosphatase zeigen. Daher sind die Zellen der Erfindung von pluripotenten
Zellen zu unterscheiden, die in den zuvor zitierten Publikationen
diskutiert wurden. Es sollte angemerkt werden, dass einige der oben
angegebenen exemplarischen Marker nicht spezifisch für totipotente
Zellen sein könnten,
da einige dieser Marker in pluripotenten Zellen sowie in totipotenten
Zellen vorliegen könnten.
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Es
werden Marker beschrieben, die spezifisch für totipotente Zellen sind,
und die Durchschnittsfachleuten bekannt sind. Marker für Totipotenz,
die im Stand der Technik nicht eindeutig definiert sind, können mit
Hilfe von Verfahren zur Aufklärung
totipotenter Zellmarker, wie Differential Display und genomische
Verfahren, bestimmt werden. Totipotente Zellen können ebenfalls identifiziert
werden, indem die Zellen eine Analyse des Nukleinsäuresequenzgehalts
unterworfen werden (z.B. Hybridisierungstechniken mit Nukleinsäuresonden).
Nukleinsäureproben
aus totipotenten Zellen und Nukleinsäureproben aus nicht-totipotenten
Zellen können
auf bestimmte Nukleinsäuresequenzen
gescreent werden. Falls Proben aus nicht-totipotenten Zellen eine Nukleinsäuresequenz
fehlt, die in totipotenten Zellen vorliegt, dann könnte diese
Nukleinsäuresequenz
ein Marker zur Unterscheidung totipotenter Zellen von nicht-totipotenten
Zellen sein. Falls in ähnlicher
Weise Proben aus nicht-totipotenten Zellen eine Nukleinsäuresequenz
aufweisen, welche totipotenten Zellen fehlt, könnte diese Nukleinsäuresequenz
ein Marker zur Unterscheidung totipotenter Zellen von nicht-totipotenten
Zellen sein. Ähnliche
Verfahren können durch
Verwendung analytischer Polypeptidtechniken (z.B. PAGE, SDS-PAGE,
Verfahren, die Antikörper umfassen,
und HPLC-Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind) Polypeptidmarker
aufklären.
-
Ein
bevorzugter Test für
Zelltotipotenz ist die Bestimmung, ob Zellen zu totipotenten Embryos
und eventuell klonierten Tieren führen. Dieser Test repräsentiert
einen definitiven Test für
zelluläre
Totipotenz. Ein Beispiel für
solch einen Test umfasst die folgenden Schritte: (1) Verwenden einer
potentiell totipotenten Zelle für
einen nukleären
Transfer mit einer entkernten Oocyte; (2) Ermöglichen, dass sich das resultierende
Cybrid entwickelt; (3) Separieren eines Embryos, der sich aus dem
Cybrid entwickelt hat, in einzelne Zellen und Unterwerfen einer
oder mehrere der einzelnen Zellen unter eine zweite Runde eines nukleären Transfers;
(4) Ermöglichen,
dass sich das resultierende Cybrid aus Schritt (3) in ein Embryo entwickelt;
(5) Implantieren des Embryos aus Schritt (2) oder (4) in eine Uterusumgebung;
und (6) Ermöglichen,
dass sich der Embryo entwickelt. Falls sich der daraus resultierende
Fötus nach
den ersten drei Monaten der Schwangerschaft entwickelt, dann sind. die
anfangs für
den nukleären
Transfer verwendeten Zellen höchstwahrscheinlich
totipotente Zellen. Falls die für
den nukleären
Transfer verwendeten Zellen sich in ein lebendgeborenes kloniertes
Tier entwickeln, dann sind die Zellen definitiv totipotent. Beispiele
für die
in diesem exemplarischen Test verwendeten Verfahren (z.B. Entkernen
von Oocyten und nukleärer
Transfer) werden vollständig
im Stand der Technik sowie in den anschließend definierten exemplarischen
Ausführungsformen
beschrieben.
-
Bei
Verwendung der Untersuchungen zur Identifizierung totipotenter Zellen
können
die hier beschriebenen Materialien und Verfahren von einem Durchschnittsfachmann
modifiziert werden, um totipotente Zellen aus einer beliebigen Vorläuferzelle
zu erzeugen.
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C. Identifizieren totipotenter
Zellen, die permanente Zellen darstellen
-
Die
Materialien und Methoden, die oben beschrieben wurden (z.B. das
Kultivieren der Zellen mit Cytokinen), können nicht-permanente Zellen in permanente Zellen
umwandeln. Im Stand der Technik existieren weitere Verfahren zur
Generierung permanenter Zelllinien aus primären Zellen und zur Identifizierung
permanenter Zellen. Zum Beispiel kann die Manipulation der Aktivität von Telomerase
in den Zellen diese Zellen immortalisieren. Siehe z.B. das U.S. Patent
Nr. 5,645,986 mit dem Titel "Therapy
and Diagnosis of Conditions Related to Telomere Length and/or Telomerase
Activity", West
et al., erteilt am 8. July 1997.
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Permanente
Zellen können
identifiziert werden, indem eine Anzahl von Zeitpunkten bestimmt wird,
zu denen die kultivierten Zellen eine Zellteilung durchlaufen und
sich in ihren Zellzahlen verdoppeln, bevor die Zellen absterben.
Wie oben diskutiert, können
sich die Zellen über
10-mal, 20-mal, 30-mal, 40-mal, 50-mal und 60-mal verdoppeln, bevor
die Zellen absterben. Materialien und Verfahren zur Messung des
Absterbens von Zellen wurden oben gelehrt.
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Weiterhin
können
permanente Zellen durch Detektion der Gegenwart und/oder des Fehlens
niedermolekularer und makromolekularer Marker identifiziert werden,
welche spezifisch für
permanente Zellen sind. Die Gegenwart oder das Fehlen der Existenz
eines Markers kann ein Zeichen für
Zellimortalisierung sein. Weiterhin kann ein Phänomen, das mit einem Marker
assoziiert ist, ein Anzeichen von Immortalität sein: Falls z.B. der Marker
ein Enzym ist, kann ein Anzeichen der Gegenwart des Enzyms und/oder
ein bestimmtes Niveau an katalytischer Aktivität dieses Enzyms ein geeignetes
Anzeichen sein, dass eine bestimmte Zelle permanent ist.
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Niedermolekulare
Marker umfassen spezifische Nukleoside, lipidassoziierte Sialinsäure, Polyamine
und Pseudouridin.
-
Makromolekulare
Marker können
in mehrere Klassen eingeteilt werden einschließlich Nukleinsäurepolymere,
Peptide, Polypeptide, Proteine, Enzyme, Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktorrezeptoren, Hormone,
Hormonrezeptoren, Onkogene, Onkogenprodukte und spezifische Glykoproteine.
Makromolekulare Marker könnenn
aus der Gruppe ausgewählt werden,
die aus extrazellulären
Proteinen, membranassoziierten Proteinen und/oder intrazellulären Proteinen
besteht, welche membranassoziiert oder löslich sein können. Ein
solcher Marker für
permanente Zellen ist z.B. Telomerase oder ihre assoziierte Aktivität. Siehe
das U.S. Patent 5,645,986, supra. Weitere Beispiele für Marker,
die spezifisch für
permanente Zellen sind, können
aus der nachfolgenden Liste ausgewählt werden. Diese Beispiele
sind nicht einschränkend,
und die Erfindung betrifft jegliche Marker, die spezifisch für permanente
Zellen sind, und die im Stand der Technik bekannt sind.
- 1) Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und sein Rezeptor (EGF-R)
- 2) Transformierender Wachstumsfaktor-alpha (TGF-alpha) und sein
Rezeptor
- 3) c-erbB2 Rezeptor-Tyrosinkinase (HER2 Produkt)
- 4) Hyaluronanrezeptor (möglicherweise
CD44, ein integrales Membranglykoprotein)
- 5) Carcinoembryonales Antigen (CEA)-Familie von Tumormarkern
(z.B. T1, ein glykosyliertes Protein)
- 6) Telomerase, ein Ribonukleoprotein, das die Telomerlänge in permanenten
Zellen aufrechterhält
- 7) Phosphotasen: plazentale akalische Phosphotase (PLAP), alkalische
Phosphotase aus Keimzellen, saure prostale Phosphotase (PAS)
- 8) Cathepsin D (katalysiert die Degradation von Laminin)
- 9) Ornithindecarboxylase (ODC) (katalysiert den umsatzlimitierenden
Schritt in der Polyaminsynthese)
- 10) Beta-Glukuronidase
- 11) Alpha-6-Integrin
- 12) Keratin K8
- 13) Onkogenprodukte: ras Onkogene (K-ras, Ha-ras, p21), v-src,
c-myc
- 14) Cyclin D1, Cyclin A und Retinoblastoma Genprotein (Rb)
- 15) Veränderungen
in der p53 Expression oder p53 Mutationen
- 16) Überexpression
des heterogenen Ribonukleoproteins A2 (hnRNP-A2)
- 17) L-Plastin
- 18) Gangliosidfukosyl-GM1
- 19) Mob-1 Expression (mob-1) (Homologie zu proinflammatorischen
Cytokinen)
-
Zusätzlich zu
den im Stand der Technik bekannten Markern für Zellpermanenz können Marker für Zellpermanenz
mit Hilfe anderer Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind,
identifiziert werden. Zum Beispiel können Zellpermanenzmarker durch Analyse
spezifischer Moleküle
(z.B. Nukleinsäuremoleküle und Polypeptidmoleküle) identifiziert
werden, die einzigartig für
spezifische permanente Zelltypen sind.
-
II. Transgene totipotente
Schweinezellen
-
Für die Umwandlung
totipotenter Schweinezellen in transgene Zellen, die gleichzeitig
totipotent sind, können
Materialien und Verfahren verwendet werden, die für Fachleute
einfach verfügbar
sind. Sobald die nukleäre
DNA in den totipotenten Zellen der Erfindung modifiziert ist, können die
Embryos und die Tiere, die aus diesen Zellen entstehen, ebenfalls
die modifizierte nukleäre
DNA umfassen. Daher können Materialien
und Verfahren, die für
Durchschnittsfachleute einfach verfügbar sind, auf totipotente
Zellen angewandt werden, um transgene Tiere und kimere Tiere zu
erzeugen. Siehe z.B. EPO 264 166 mit dem Titel "Transgenic Animals Secreting Desired
Proteins Into Milk";
WO 94/19935 mit dem Titel "Isolation
of Components of Interest From Milk"; WO 93/22432 mit dem Titel "Method for Identifying
Transgenic Preimplantation Embryos"; WO 95/17085 mit dem Titel "Transgenic Production
of Antibodies in Milk";
Hammer et al., 1985, Nature 315: 680–685; Miller et al., 1986,
J. Endocrinology 120: 481–488;
Williams et al., 1992, J. Ani. Sci. 74: 2207–2111; Piedrahita et al., 1998,
Biol. Reprod. 58: 1321–1329;
Piedrahita et al., 1997, J. Reprod. Fert. (suppl.) 52: 245–254; und
Nottle et al., 1997, J. Reprod. Fert. (suppl.) 52: 245–254.
-
Verfahren
zur Generierung transgener Zellen umfassen typischerweise die Schritte:
(1) Konstruieren eines geeigneten DNA Konstrukts, das zur Insertion
einer spezifischen DNA Sequenz in das nukleäre Genom einer Zelle zweckdienlich
ist; (2) Transfizieren des DNA Konstrukts in die Zellen; (3) Ermöglichen,
dass eine Zufallsinsertion und/oder homologe Rekombination erfolgt.
Die aus diesem Verfahren resultierende Modifikation kann die Insertion
eines geeigneten DNA Konstrukts (geeignete DNA Konstrukte) in das
Zielgenom sein, die Deletion von DNA aus dem Zielgenom und/oder
die Mutation des Zielgenoms.
-
DNA
Konstrukte können
ein Gen von Interesse sowie eine Vielzahl von Elementen umfassen,
einschließlich
regulatorischer Promotoren, Insulatoren, Enhancern und Repressoren
sowie Elemente für
die ribosomale Bindung an die RNA, die von diesem DNA Konstrukt
transkribiert wird. DNA Konstrukte können ebenfalls Ribozyme und
Antisense DNA und/oder RNA kodieren, wie zuvor hierin identifiziert. Diese
Beispiele sind Durchschnittsfachleuten bekannt und sind als nicht
einschränkend
zu verstehen.
-
Aufgrund
der effektiven rekombinanten DNA Techniken, die in Verbindung mit
DNA Sequenzen für regulatorische
Elemente zur Verfügung
stehen, und der einfachen Verfügbarkeit
von Genen in Datenbanken und im kommerziellen Bereich kann ein Durchschnittsfachmann
einfach ein DNA Konstrukt generieren, das zur Etablierung transgener
Zellen mit Hilfe der hier beschriebenen Materialien und Verfahren geeignet
ist.
-
Transfektionstechniken
sind Durchschnittsfachleuten bekannt, und die Materialien und Verfahren
zur Durchführung
einer Transfektion von DNA Konstrukten in Zellen sind kommerziell
verfügbar. Materialien,
die zur Transfektion von Zellen mit DNA Konstrukten verwendet werden
können,
sind z.B. lipophile Verbindungen, wie etwa LipofektinTM,
SuperfektTM, LipoTAXITM und
CLONfectinTM. Spezielle lipophile Verbindungen
können
induziert werden, um Liposomen zur Vermittlung einer Transfektion
des DNA Konstrukts in die Zellen zu bilden. Weiterhin können auf
Kationen basierende Transfektionsagenzien, die im Stand der Technik
bekannt sind, zur Transfektion von Zellen mit Nukleinsäuremolekülen verwendet werden
(z.B. Calciumphosphatpräzipitation).
Ferner können
im Stand der Technik bekannte Elektroporationsverfahren verwendet
werden, um Nukleinsäuremoleküle in Zellen
zu translozieren. Weiterhin können
Verfahren mittels Partikelbeschuss (particle bombardment techniques),
die im Stand der Technik bekannt sind, zur Einführung exogener DNA in Zellen verwendet
werden. Zielsequenzen eines DNA Konstrukts können in spezifische Regionen
des nukleären
Genoms durch rationales Design des DNA Konstrukts inseriert werden.
Diese Designtechniken und Verfahren sind Durchschnittsfachleuten
bekannt. Siehe das U.S. Patent 5,633,067, "Method of Producing a Transgenic Bovine
or Transgenic Bovine Embryo",
DeBoer et al., erteilt am 27. Mai 1997; das U.S. Patent 5,612,205, "Homologues Recombination
in Mammalian Cells",
Kay et al., erteilt am 18. März 1997;
und die PCT Publikation WO 93/22432, "Method for Identifying Transgenic Pre-Implantation
Embryos". Sobald
die gewünschte
DNA Sequenz in das nukleäre
Genom einer Zelle inseriert ist, kann die Lokalisation der Insertionsregion
sowie die Frequenz, mit der die gewünschte DNA Sequenz in das nukeäre Genom
inseriert ist, mit Hilfe Fachleuten bekannter Verfahren identifiziert
werden.
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Sobald
ein Transgen oder Transgene in das nukeäre Genom der totipotenten Zelle
inseriert sind, kann diese Zelle als nukleärer Donor zur Klonierung eines
transgenen Tiers verwendet werden. Eine detailliertere Beschreibung
transgener Tiere wird anschließend
dargelegt.
-
A. Erkrankungen und Parasiten
-
Gewünschte DNA-Sequenzen
können
in eine nukleäre
DNA einer Zelle inseriert werden, um die Widerstandsfähigkeit
eines klonierten transgenen Tiers gegenüber speziellen Parasiten, Erkrankungen und
infektiösen
Agenzien zu erhöhen.
Beispiele für Parasiten
umfassen Würmer,
Fliegen, Zecken und Flöhe.
Beispiele für
infektiöse
Agentien umfassen Bakterien, Pilze und Viren. Beispiele für Erkrankungen
umfassen atrophe Rhinitis, Cholera, Leptospirose, Pseudorabien und
Brucellose. Diese Beispiele sind nicht einschränkend, und die Erfindung betrifft jede
Erkrankung oder jeden Parasiten oder jedes infektiöse Agenz,
das im Stand der Technik bekannt ist. Siehe z.B. Hagan & Bruners Infectious
Diesases of Domestic Animals (7. Auflag), Gillespie & Timoney, Copyright
1981, Cornell University Press, Ithaca NY.
-
Ein
Transgen kann Resistenz gegenüber
einem speziellen Parasiten oder einer Erkrankung durch vollständiges Aufheben
oder partielles Mildern der Symptome der Erkrankung oder des parasitären Zustands
verleihen oder durch Erzeugung eines Proteins, das den Parasiten
oder die Erkrankung kontrolliert.
-
B. Elemente von DNA Konstrukten
und die Erzeugung von DNA Konstrukten
-
Abhängig von
der Art des Wirts kann eine Vielzahl transkriptioneller und translationeller
regulatorische Sequenzen verwendet werden. Die transkriptionellen
und translationellen regulatorischen Signale können aus viralen Quellen stammen,
wie z.B. Adenovirus, boviner Papillomavirus, Cytomegalovirus, Simianvirus
und dergleichen, wobei die regulatorischen Signale mit einer bestimmten
Gensequenz assoziiert sind, welche Potential für hohe Expressionsniveaus besitzt.
Alternativ können
Promotoren von Säugetierexpressionsprodukten
verwendet werden, wie z.B. Actin, Casein, Alpha-Lactalbumin, Uroplakin,
Kollagen, Myosin. und dergleichen. Transkriptionelle regulatorische
Signale können
ausgewählt
werden, welche die Repression oder Aktivierung ermöglichen,
sodass die Expression eines Genprodukts moduliert werden kann. Von
Interesse sind regulatorische Signale, die durch externe Faktoren, wie
z.B. Chemikalien oder Arzneimittel, reprimiert oder initiert werden
können.
Diese Beispiele sind nicht einschränkend, und die Erfindung betrifft
beliebige regulatorische Elemente. Weitere Beispiele regulatorischer
Elemente werden hier beschrieben.
-
C. Beispiele für bevorzugte
rekombinante Proteine
-
Eine
Vielzahl von Proteinen und Polypeptiden kann von einem Gen kodiert
werden, das innerhalb eines DNA Konstrukts enthalten ist, welches
zur Erzeugung transgener Zellen geeignet ist. Diese Proteine oder
Palypeptide umfassen Hormone, Wachstumsfaktoren, Enzyme, Gerinnungsfaktoren,
Apolipoproteine, Rezeptoren, Arzneimittel, Pharmaceutika, Bioceutika,
Nutraceutika, Onkogene, Tumorantigene, Turnorsupressoren, Cytokine,
virale Antigene, parasitäre
Antigene, bakterielle Antigene und chemisch synthetisierte Polymere
und Biopolymere, die biosynthetisiert und/oder durch chemische,
zelluläre und/oder
enzymatische Verfahren modifiziert wurden. Spezifische Beispiele
für diese
Verbindungen umfassen Proinsulin, Insulin, Wachstumshormon, Androgenrezeptoren,
insulin-ähnlicher
Wachstumsfaktor I, insulin-ähnlicher
Wachstumsfaktor II, Insulinwachstumsfaktor-Bindeproteine, epidermaler Wachstumsfaktor,
TGF-α, TGF-β, dermaler
Wachstumsfaktor (PDGF), Angiogenesefaktoren (z.B. saurer Fibroblastenwachstumsfaktor,
basischer Fibroblastenwachstumsfaktor und Angiogenin), Angiogeneseinhibitoren
(z.B. Endostatin und Angiostatin) Matrixproteine (Typ IV Kollagen,
Typ VII Kollagen, Laminin), Onkogene (ras, fos, myc, erb, src, sis,
jun), E6 oder E7 transformierende Sequenz, p53 Protein, Cytokinrezeptor,
IL-1, IL-6, IL-8, IL-2, α-, β-, oder γ-IFN, GMCSF,
GCSF, virales Capsidprotein und Proteine von viralen, bakteriellen
und parasitären
Organsimen. Weitere spezifische Proteine oder Polypeptide, die exprimiert
werden können,
umfassen: Phenylalaninhydroxylase, α-1-Antitrypsin, Cholesterin-7α-Hydroxylase, trunkiertes
Apolipoprotein B, Lipoproteinlipase, Apolipoprotein E, Apolipoprotein
A1, LDL Rezeptor, Scavanger Receptor für oxidierte Lipoproteine, molekulare
Varianten von jedem davon, VEGF und Kombinationen davon. Weitere
Beispiele sind monoklonale Antikörper,
Antkörperfragmente, Gerinnungsfaktoren,
Apolipoproteine, Arzneimittel, Tumorantigene, virale Antigene, parasitäre Antigene, monoklonale
Antikörper
und bakterielle Antigene. Ein Fachmann wird einfach erkennen, dass
diese Proteine zu einer Vielzahl von Proteinklassen gehören, und dass
andere Proteine innerhalb dieser Klassen oder außerhalb dieser Klassen ebenfalls
verwendet werden können.
Dies sind nur Beispiele und in keiner Weise als einschränkend zu
verstehen.
-
Es
sollte ebenfalls angemerkt werden, dass das genetische Material,
das aus den DNA Konstrukten in die Zellen eingebracht wird, umfasst:
(1) Nukleinsäuresequenzen,
die normalerweise in den Zielzellen nicht vorliegen; (2) Nukleinsäuremoleküle, die normalerweise
in den Zielzellen vorliegen, nicht aber in physiologisch signifikanten
Niveaus exprimiert werden; (3) Nukleinsäuresequenzen, die normalerweise
in Zielzellen vorliegen, und normalerweise in physiologisch gewünschten
Niveaus exprimiert werden; (4) weitere Nukleinsäuresequenzen, die zur Expression
in Zielzellen modifiziert werden können; und (5) beliebige Kombinationen
davon.
-
Zusätzlich können DNA
Konstrukte in nukleäre
DNA von Zellen inkorporiert werden, wobei die inkorporierte DNA
in Ribonukleinsäuremoleküle transkribiert
werden kann, welche andere RNA Moleküle in spezifischen Regionen
spalten können.
Ribonukleinsäuremoleküle, die
RNA Moleküle
spalten können, werden
im Stand der Technik als Ribozyme bezeichnet. Ribozyme sind selbst
RNA Moleküle.
Ribozyme können
diskrete Regionen in einem RNA Molekül binden und im Anschluss eine
Region innerhalb dieser Bindungsregion oder angrenzend an die Bindungsregion
spezifisch spalten. Ribozymverfahren können dadurch die Menge an Polypeptid
vermindern, die von zuvor intakten messenger RNA-Molekülen translatiert
wird.
-
Weiterhin
können
DNA Konstrukte in nukleäre
DNA von Zellen inkorporiert werden und nach Transkription eine RNA
erzeugen, die sowohl spezifische RNA- als auch DNA-Sequenzen binden
kann. Die Nukleinsäuresequenzen
können
in Antisense-Verfahren
verwendet werden, die an die messenger RNA (mRNA) binden und die
Translation dieser messenger RNAs blockieren. Antisense-Verfahren können dadurch
die Synthese bestimmter Polypeptide in Zellen blockieren oder partiell
blockieren.
-
III. Nukleärer Transfer
-
Nukleäre Transfer
(NT)-Verfahren unter Verwendung nicht-totipotenter Zellen sind Durchschnittsfachleuten
bekannt. Siehe z.B. das U.S. Patent Nr. 4,664,097, "Nuclear Transplantation
in the Mammalian Embryo by Microsurgey and Cell Fusion", erteilt am 12.
Mai 1987, McGrath & Solter;
das U.S. Patent 4,999,384 (Prather et al.); und das U.S. Patent
5,057,420 (Massey et al.). Exemplarische Ausführungsformen definieren ein
NT-Verfahren, das eine effiziente Produktion totipotenter Schweineembryos
bereitstellen kann.
-
A. Nukläre Donoren
-
Totipotente
Zellen können
als nukläre
Donoren in einem NT-Verfahren zur Generierung eines klonierten Embryos
verwendet werden. Wie oben beschrieben, können totipotente Zellen aus
nahezu jedem Zelltyp generiert werden. Für NT-Techniken kann eine Donorzelle aus einer
wachsenden Zellmasse separiert werden, aus einer primären Zellkultur
isoliert werden oder aus einer Zelllinie isoliert werden. Die gesamte
Zelle kann in den perivitellinen Raum einer Empfängeroocyte gegeben werden oder kann
direkt durch Ansaugen des nukleären
Donors in eine Nadel, Platzieren der Nadel in der Empfängeroocyte,
Freisetzen des nuklären
Donors und Entfernen der Nadel ohne signifikante Zerstörung der
Plasmamembran der Oocyte in die Empfängeroocyte injiziert werden.
Ferner kann ein Nukleus (z.B. ein Karyoplast) aus einem nuklären Donor
isoliert werden und in den perivitellinen Raum einer Empfängeroocyte gegeben
werden oder kann z.B. direkt in eine Empfängeroocyte injiziert werden.
-
B. Empfängeroocyten
-
Eine
Empfängeroocyte
ist typischerweise eine Oocyte, aus der ein Teil ihre Ooplasmas
entfernt wurde, wobei das entfernte Ooplasma den Nukleos der Oocyte
umfasst. Verfahren zur Entkernung sind Durchschnittsfachleuten bekannt.
Siehe z.B. Nagashima et al., 1997, Mol. Reprod. Dev. 48: 339–343; Nagashima
et al., 1992, J. Reprod. Dev. 38: 37–78; Prather et al., 1989,
Biol. Reprod. 41: 414–418; Prather
et al., 1990, J. Exp. Zool. 255: 355–358; Saito et al., 1992, Assis.
Reprod. Tech. Andro. 259: 257–266;
und Terlow et al., 1992, Theriogenology 37: 309.
-
Oocyten
können
aus Eileitern und/oder Ovarien lebender Tiere mit Hilfe von Verfahren
zur oviductalen Oocytengewinnung oder zur transvaginalen Oocytengewinnung
isoliert werden, die im Stand der Technik bekannt und hier beschrieben
sind. Weiterhin können
Oocyten aus getöteten
Tieren isoliert werden. Zum Beispiel können Ovarien von Schlachthöfen erhalten
werden, und die Oocyten können
aus diesen Ovarien abgesaugt werden. Die Oocyten können ferner
aus den Ovarien kürzlich
getöteter
Tiere isoliert werden, oder wenn das Ovar eingefroren und/oder aufgetaut
wurde.
-
Oocyten
können
in einer Vielzahl von Medien maturiert werden, die Durchschnittsfachleuten
bekannt sind. Ein Beispiel für
solch ein Medium, das zur Maturierung von Oocyten geeignet ist,
wird in einer exemplarischer Ausführungsform dargestellt, die
anschließend
beschrieben wird. Oocyten können
in diesem Mediumtyp in einer Umgebung mit 5% CO2 bei 39°C erfolgreich
maturiert werden. Oocyten können kryokonserviert
und anschließend
aufgetaut werden, bevor die Oocyten in das Maturierungsmedium gegeben
werden. Verfahren zur Kryokonservierung von Zellen und Embryos sind
im Stand der Technik bekannt, wie hier diskutiert wurde.
-
Komponenten
eines Mediums zur Oocytenmaturierung können Moleküle umfassen, welche die Oocytenmaturierung
arretieren. Beispiele für
solche Komponenten sind 6-Dimethylaminopurin (DMAP) und Isobutylmethylxanthine
(IBMX). Es wurde berichtet, dass IBMX Oocyten reversibel arretiert,
aber dass die Effizienzen zur Arrestaufrechterhaltung eher gering
sind. Siehe z.B. Rose-Hellkant and Bavister, 1996, Mol. Reprod.
Develop. 44. 241–249.
Oocyten können
jedoch im Keimvesikelstadium mit relativ hoher Effizienz arretiert
werden, indem die Oocyten bei 31°C
in einer effektiven Konzentration an IBMX inkubiert werden. Vorzugsweise
werden die Oocyten die ganze Zeit inkubiert, während der Oocyten entnommen
werden. Geeignete IBMX Konzentrationen zur Oocytenmaturierung liegen
zwischen 0.01 mM und 20 mM IBMX, vorzugsweise 0.05 mM bis 10 mM
IBMX, noch bevorzugter etwa 0.1 mM IBMX bis etwa 0.5 mM IBMX, und
am meisten bevorzugt 0.1 mM IBMX bis 0.5 mM IBMX.
-
Eine
nukleäre
Donorzelle und eine Empfängeroocyte
können
aus der gleichen Spezies oder aus unterschiedlichen Spezies entstehen.
Beispielsweise kann eine totipotente Schweinezelle in eine entkernte Schweineoocyte
inseriert werden. Alternativ kann eine totipotente Wildschweinzelle
in eine Oocyte eines Hausschweins injiziert werden. Eine beliebige Kombination
aus nukleären
Donor und Empfängeroocyte
kann von der Erfindung vorgesehen werden. Vorzugsweise stammen der
nukleäre
Donor und die Empfängeroocyte
aus der gleichen Spezies. NT-Verfahren zwischen unterschiedlichen
Spezies können verwendet
werden, um klonierte Tiere zu erzeugen, die gefährdet oder ausgestorben sind.
-
Oocyten
können
durch elektrische und/oder nicht-elektrische
Mittel vor, während
und/oder nach Einführen
eines nukleären
Donors in eine Empfängeroocyte
aktiviert werden. Zum Beispiel kann eine Oocyte in ein Medium gegeben
werden, das eine oder mehr Komponenten enthält, welche für die nicht-elektrische Aktivierung
vor der Fusion mit einem nukleären
Donor geeignet sind. Ferner kann ein Cybrid in ein Medium gegeben
werden, das eine oder mehr Komponenten enthält, die zur nicht-elektrischen
Aktivierung geeignet sind. Aktivierungsverfahren werden im Anschluss
detaillierter diskutiert.
-
C. Injektion/Fusion
-
Ein
nukleärer
Donor kann in eine Oocyte mit Hilfe einer Vielzahl von Materialien
und Methoden transloziert werden, die Durchschnittsfachleuten bekannt
sind. In einem Beispiel kann ein nukleärer Donor direkt in eine Empfängeroocyte
injiziert werden. Diese direkte Injektion kann durch vorsichtiges
Aufziehen eines nukleären
Donors in eine Nadel, Durchstechen einer Empfängeroocyte mit dieser Nadel, Freisetzen
des nukleären
Donors in die Oocyte und Entfernen der Nadel aus der Oocyte ohne
signifikante Zerstörung
ihrer Membran erreicht werden. Geeignete Nadeln können aus
Glaskapillarröhrchen
hergestellt werden, wie im Stand der Technik und insbesondere in
den hier durch Bezugnahme eingeschlossenen Publikationen definiert.
-
In
einem weiteren Beispiel können
mindestens ein Teil der Plasmamembran eines nukleären Donors
und einer Empfängeroocyte
durch Verwendung Fachleuten bekannter Techniken miteinander fusioniert
werden. Siehe Willadsen, 1986, Nature 320: 63–65. Typischerweise können Lipidmembranen
durch elektrische und chemische Mittel miteinander fusioniert werden,
wie zuvor und in weiteren hierin durch Bezugnahme eingeschlossenen
Publikationen definiert.
-
Beispiele
für nicht-elektrische
Mittel der Zellfusion umfassen die Inkubation von Cybriden in Lösungen,
die Polyethylenglycol (PEG) und/oder Sendai Virus umfassen. Für eine Zellfusion
können
PEG Moleküle
mit einem weiten Bereich an Molekulargewichten verwendet werden.
-
Verfahren
zur Fusion, die hier nicht explizit diskutiert werden, können ohne übermäßiges Experimentieren
bestimmt werden. Beispielsweise können Modifikationen von Zellfusionsverfahren
hinsichtlich ihrer Effizienz überwacht
werden, indem das Ausmaß der
Zellfusion unter dem Mikroskop beobachtet wird. Der erhaltene Embryo
kann anschließend
kloniert und als ein totipotenter Embryo mit Hilfe der gleichen Verfahren
identifiziert werden, wie sie zuvor hier zur Identifizierung totipotenter
Zellen beschrieben wurden, die Untersuchungen auf selektierbare
Marker und/oder Untersuchungen zur Entwicklung eines Tiers umfassen.
-
D. Aktivierung
-
Verfahren
zur Aktivierung von Oocyten und Cybriden sind Durchschnittsfachleuten
bekannt. Siehe das U.S. Patent 5,496,720, "Parthenogenic Oocyte Activation", Susko-Parrish et
al., erteilt am 5. März 1996.
-
Sowohl
elektrische als auch nicht-elektrische Verfahren können zur
Aktivierung von Zellen verwendet werden (z.B. von Oocyten und Cybriden).
Obwohl die Verwendung eines nicht-elektrischen Mittels zur Aktivierung
nicht immer notwendig ist, kann eine nicht-elektrische Aktivierung
das Entwicklungspotential von Cybriden erhöhen, insbesondere wenn junge Oocyten
als Empfänger
verwendet werden.
-
Beispiele
für elektrische
Verfahren zur Aktivierung von Zellen sind im Stand der Technik bekannt.
Siehe WO 98/16630, veröffentlicht
am 23. April 1998, Piedraheidra and Blazerr, und die U.S. Patente
4,994,384 und 5,057,420. Nicht- elektrische Mittel
zur Aktivierung von Zellen können
jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren umfassen, das die
Wahrscheinlichkeit einer Zellteilung erhöht. Beispiele für nicht-elektrische
Mittel zur Aktivierung eines nukleären Donors und/oder Rezipienten
können
erreicht werden durch Einbringen der Zellen in Ethanol, Inositoltriphosphat
(IP3), Ca2+ Ionophore
und Proteinkinaseinhibitoren, wie z.B. 6-Dimethylaminopurin, Temperaturveränderung,
Proteinsyntheseinhibitoren (z.B. Cycloheximid), Phorbolesther, wie
z.B. Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA), mechanische Verfahren,
Thapsigargin und Spermafaktoren. Spermafaktoren können eine
beliebige Komponente eines Spermiums umfassen, welche die Wahrscheinlichkeit
einer Zellteilung erhöht.
Weitere nicht-elektrische Verfahren zur Aktivierung umfassen das
Unterwerfen der Zelle oder der Zellen unter einen Kälteschock
und/oder mechanischen Stress.
-
Beispiele
für bevorzugte
Proteinkinaseinhibitoren sind Proteinkinase A-, G- und C-Inhibitoren,
wie z.B. 6-Dimethylaminpurin
(DMAP), Staurosporin, 2-Aminopurin, und Sphingosin. Tyrosinkinaseinhibitoren
können
ebenfalls verwendet werden, um Zellen zu aktivieren.
-
Materialien
und Verfahren für
eine Aktivierung, die hier nicht explizit diskutiert werden, können durch
Modifizieren der spezifischen Bedingungen identifiziert werden,
welche hier sowie in den im U.S. Patent Nr. 5,496,720 beschriebenen
exemplarischen Protokolle definiert sind.
-
Die
Aktivierungseffizienz und -totipotenz, die aus jedweden Modifikationen
der Aktivierungsverfahren resultieren, können durch die Methoden identifiziert
werden, die zuvor im Abschnitt mit dem Titel "Identifikation totipotenter Zellen" beschrieben wurden.
Verfahren zur Identifikation totipotenter Embryos können eine
oder mehr Untersuchungen umfassen, wie z.B. (a) Identifizieren spezifischer
Marker für totipotente
Zellen in Embryos, und (b) durch Bestimmen, ob die Embryos totipotent
sind, indem sie sich in ein Tier entwickeln können.
-
F. Manipulation von Embryos,
die aus einem nukleären
Transfer resultieren
-
Ein
Embryo, das aus einem NT-Verfahren resultiert, kann auf eine Vielzahl
von Arten manipuliert werden. Es werden klonierte Embryos beschrieben, die
aus mindestens einem NT-Verfahren
entstehen. Beispielhafte Ausführungsformen
der Erfindung zeigen, dass zwei oder mehr NT-Verfahren die Effizienz bei
der Produktion totipotenter Embryos erhöhen können. Beispielhafte Ausführungsformen
zeigen, dass das Inkorporieren von zwei oder mehr NT-Techniken in
Verfahren zur Erzeugung klonierter totipotenter Embryos die plazentale
Entwicklung erhöhen kann.
Zusätzlich
kann die Erhöhung
der Zahl an NT-Zyklen, die in einem Prozess zur Erzeugung totipotenter
Embryos involviert sind, einen notwendigen Faktor zur Umwandlung
nicht-totipotenter Zellen in totipotente Zellen darstellen. Ein
Effekt des Inkorporierens von zwei oder mehr NT-Zyklen nach der
Totipotenz des resultierenden Embryos ist ein überraschendes Ergebnis, das
zuvor im Stand der Technik nicht identifiziert oder untersucht wurde.
-
Das
Inkorporieren von zwei oder mehr NT-Zyklen in Verfahren zur Klonierung
totipotenter Embryos kann weitere Vorteile bereitstellen. Das Inkorporieren
multipler NT-Verfahren
in Techniken zur Etablierung klonierter totipotenter Embryos stellt
ein Verfahren zur Multiplikation der Anzahl klonierter totipotenter
Embryos bereit.
-
Wenn
multiple NT-Verfahren für
die Bildung eines klonierten totipotenten Embryos verwendet werden,
können
Oocyten, die für
eine beliebige Zeitspanne maturiert wurden, als Rezipienten im ersten, zweiten
oder einem anschließenden
NT-Verfahren verwendet werden. Falls z.B. ein erster NT und im Anschluss
ein zweiter NT durchgeführt
werden, kann der erste NT eine Oocyte, die etwa 53 Stunden maturiert
wurde, als Rezipienten verwenden, und der zweite NT kann eine Oocyte,
die weniger als etwa 53 Stunden maturiert wurde, als Rezipienten verwenden.
Alternativ kann der erste NT eine Oocyte, die etwa 53 Stunden maturiert
wurde als Rezipienten verwenden, und der zweite NT kann eine Oocyte,
die mehr als etwa 53 Stunden maturiert wurde, als Rezipienten für eine Zweizyklus
NT-System (regime) verwenden. Zusätzlich können beide NT-Zyklen Oocyten
als Rezipienten verwenden, die etwa 53 Stunden maturiert wurden,
beide NT-Zyklen können
Oocyten als Rezipienten verwenden, die weniger als etwa 53 Stunden
maturiert wurden, und beide NT-Zyklen können Oocyten als Rezipienten
in einem Zweizyklus NT-System verwenden, die mehr als etwa 53 Stunden
maturiert wurden.
-
Für NT-Verfahren,
die zwei oder mehr NT-Zyklen inkorporieren, können einer oder mehr der NT-Zyklen
einem Aktivierungsschritt vorangehen, von einem Aktivierungsschritt
gefolgt werden und/oder simultan mit einem Aktivierungsschritt durchgeführt werden.
Wie zuvor definiert, kann ein Aktivierungsschritt durch elektrische
und/oder nicht-elektrische
Mittel, wie hier definiert, erreicht werden. Anschließend dargestellte
beispielhafte Ausführungsformen
beschreiben NT-Verfahren, die einen Aktivierungsschritt nach einem
NT-Zyklus inkorporieren. Ein Aktivierungsschritt kann jedoch auch zur
gleichen Zeit wie ein NT-Zyklus durchgeführt werden (zum Beispiel simultan
mit dem NT-Zyklus) und/oder ein Aktivierungsschritt kann vor einem NT-Zyklus
durchgeführt
werden. Klonierte totipotente Embryos, die aus einem NT-Zyklus resultieren,
können
(1) disgaggregiert werden oder (2) es kann ermöglicht werden, dass sie sich
weiter entwickeln.
-
Falls
die Embryos disaggregiert werden, können die disaggregrierten vom
Embryo abstammenden Zellen verwendet werden, um kultivierte Zellen
zu etablieren. Ein beliebiger Typus einer embryonalen Zelle kann
verwendet werden, um kultivierte Zellen zu etablieren. Diese kultivierten
Zellen werden in der wissenschaftlichen Literatur manchmal als embryonale
Stammzellen oder als embryonale stammzell-ähnliche Zellen bezeichnet.
Die embryonalen Stammzellen können
von frühen
Embryos, Morulae und Embryos im Blastozystenstadium abstammen. Durchschnittsfachleuten
sind multiple Verfahren zur Erzeugung kultivierter embryonaler Zellen
bekannt. Diese Methoden werden in spezifischen Referenzen aufgezählt.
-
Falls
den Embryos ermöglicht
wird, sich in utero in einen Fötus
zu entwickeln, können
die Zellen, die aus dem sich entwickelnden Fötus isoliert werden, zur Etablierung
kultivierter Zellen verwendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen
können primordiale
Keimzellen, Zellen der Keimleiste und fötale Fibroblastenzellen aus
solch einem Fötus
isoliert werden. Kultivierte Zellen, die eine bestimmte Morphologie
aufweisen, die hierin beschrieben wird, können als embryonale Keimzellen
(EG-Zellen) bezeichnet werden. Diese kultivierten Zellen können mit
Hilfe von Kultivierungsverfahren etabliert werden, die Durchschnittsfachleuten
bekannt sind. Solche Verfahren werden hier aufgezählt und
diskutiert.
-
Klonierte
totipotente Embryos, die aus einem NT resultieren, können ferner
durch Kryokonservierung und/oder Auftauen der Embryos manipuliert werden.
Siehe zum Beispiel Nagashima et al., 1989, Japanese J. Anim. Reprod.
35: 130–134
und Feng et al., 1991, Theriogenelogy 35: 199. Weitere Verfahren zur
Manipulation eines Embryos umfassen Verfahren zur in vitro Kultur,
zur Durchführung
eines Embryotransfers in einen maternalen Rezipienten, zur Disaggregation
von Blastomeren für
NT-Verfahren, zur Disaggregation von Blastomeren oder Zellen der
inneren Zellmasse zur Etablierung von Zelllinien zur Verwendung
in NT-Verfahren, Verfahren zum Embryosplitting, Verfahren zur Embryoaggregation,
Verfahren zur Embryovermehrung und Verfahren zur Biopsieentnahme
von Embryos. Die beispielhaften Manipulationsverfahren sind als
nicht einschränkend
zu verstehen, und die Erfindung betrifft beliebige Verfahren zur
Embryomanipulation, welche Durchschnittsfachleuten bekannt sind.
-
IV. Entwicklung klonierter
Embryos
-
A. Identifizierung totipotenter
Embryos
-
Totipotente
Embryos können
mit Hilfe von Verfahren identifiziert werden, die im Abschnitt "Identifikation totipotenter
Zellen" beschrieben
sind. Einzelne Zellen können
isoliert und ähnlichen
Untersuchungen unterworfen werden. Die Untersuchungen betreffen
zum Beispiel die Identifikation der Gegenwart oder des Fehlens von
Markern. Ein totipotenter Embryo kann ferner identifiziert werden,
indem einem Embryo ermöglicht
wird, sich zu entwickeln, bis er die ersten drei Monate der Schwangerschaft durchlaufen
hat, oder sich vorzugsweise in ein lebendgeborenes Tier zu entwickeln.
Verfahren zur Identifizierung von Markern für Totipotenz werden ebenfalls
hier beschrieben.
-
B. Kultur von Embryos
In Vitro
-
Die
hier diskutierten Klonierungsverfahren stellen den Vorteil der Kultur
von Zellen und Embryos in vitro vor der Implantation in einen weiblichen
Empfänger
bereit. Verfahren zur Kultur von Embryos in vitro sind im Stand
der Technik bekannt. Siehe zum Beispiel Nagashima et al., 1997,
Mol. Reprod. Dev. 48: 339–343
Petters & Wells,
1993, J. Reprod. Fert. (Suppl) 48: 61–73; Reed et al., 1992, Theriogenelogy 37:
95–109;
und Dobrinsky et al., 1996, Biol. Reprod. 55: 1069–1074. Zusätzlich werden
anschließend
exemplarische Ausführungsformen
für Medien
beschrieben, die zur Kultur klonierter Embryos in vitro geeignet
sind. Schichten aus Feeder-Zellen können oder können nicht zur Kultur klonierter
Embryos verwendet werden. Feeder-Zellen wurden oben und werden in
den anschließenden
exemplarischen Ausführungsformen
beschrieben.
-
C. Entwicklung von Embryos
In Utero
-
Klonierte
Embryos können
nach den NT-Verfahren und den Prozessen zur in vitro Kultur der
Embryos in einer artifiziellen oder natürlichen Uterusumgebung kultiviert
werden. Beispiele für
artifizielle Entwicklungsumgebungen wurden bereitgestellt und sind
Fachleuten bekannt. Die Komponenten der artifiziellen Umgebung können modifiziert
werden, zum Beispiel durch Verändern
der Menge einer Komponente oder von Komponenten und durch Beobachtung
der Wachstumsrate eines Embryos.
-
Verfahren
zum Implantieren von Embryos in den Uterus eines Tieres sind ebenfalls
im Stand der Technik bekannt, wie zuvor diskutiert. Vorzugsweise ist
das Entwicklungsstadium des Embryos (der Embryos) mit dem Östrus-Zyklus
des Tieres korreliert.
-
Embryos
aus einer Spezies können
in die Uterusumgebung eines Tieres einer Spezies eingebracht werden.
Es wurde zum Beispiel im Stand der Technik gezeigt, dass bovine
Embryos sich in den Ovidukten von Schafen entwickeln können. Stice & Keefer, 1993, "Multiple generational
bovine embryo cloning," Biology
of Reproduction 48: 715–719.
Die Erfindung betrifft eine beliebige Kombination eines Schweineembryos
in einer Uterusumgebung eines beliebigen anderen Huftieres. Ein
System zur in utero Entwicklung zwischen unterschiedlichen Spezies (cross-species
in utero development regime) kann eine effiziente Erzeugung klonierter
Tiere einer bedrohten Spezies ermöglichen. Zum Beispiel kann sich
ein Wildschweinembryo im. Uterus eines Hausschweins entwickeln.
-
Sobald
ein Embryo in den Uterus eines Empfängerweibchens eingebracht ist,
kann sich der Embryo vollständig
entwickeln. Alternativ kann es einem Embryo ermöglicht werden, sich im Uterus
zu entwickeln, und anschließend
kann er zu einer gewählten Zeit
entfernt werden. Chirurgische Verfahren zur Entfernung von Föten aus
den Uteri vor der Geburt sind im Stand der Technik bekannt.
-
V. Klonierte Schweine
-
Wie
zuvor beschrieben, schafft die Erfindung Vorteile bezüglich der
Fähigkeit,
einen Phänotyp
eines Tieres vor der Klonierung dieses Tieres zu beurteilen. Multiple
Produkte können
aus einem klonierten Tier isoliert werden. Zum Beispiel können Samen aus
einem klonierten Schwein, wie zum Beispiel einem domestizierten
Wildschwein, isoliert werden. Die Samen können kryokonserviert werden.
Die Samen können
ebenfalls in geschlechtsspezifische Spermafraktionen separiert werden.
Siehe die U.S. Patente 5,439,362, 5,346,990 und 5,021,244 mit dem
Titel "Sex-associated
Membrane Proteins and Methods for Increasing the Probability that
Offspring Will be of a Desired Sex," Spaulding, erteilt am 8. August 1995,
13. September 1994 bzw. 4. Juni 1991. Verfahren zur Entnahme von
Samenflüssigkeit
sind Fachleuten bekannt, wie zuvor beschrieben.
-
Ebenfalls
beschrieben werden Produkte, die einem klonierten Schwein entnommen
wurden. Die Produkte können
beliebige Körperfluide
oder Organe sein, die aus dem Tier isoliert wurden, oder beliebige Produkte,
die aus den Fluiden oder Organen isoliert wurden. Produkte, wie
zum Beispiel Fleisch, können aus
den klonierten Schweinen entnommen werden. Es ist ferner möglich, den
Phänotyp
eines Schweins zu bestimmen, das ein geschlechtsloses (neutered) Tier
ist, und anschließend
dieses Tier zu klonieren, sodass die klonierten Tiere eine funktionelle
Reproduktion aufweisen und zur Erzeugung von Samen verwendet werden
können.
Andere bevorzugte Ausführungsformen,
die keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellen, betreffen
solche Produkte wie Transplantatmaterialen, Sperma, Embryos, Oocyten, beliebige
Zelltypen und Nachkommen, die von klonierten Tieren der Erfindung
stammen.
-
Transplantatmaterialien,
die zuvor hier beschrieben wurden, können beliebiges zelluläres Material
betreffen, das aus einem Organismus entnommen und in einem anderen
Organismus eingepflanzt wurde. Medizinische Verfahren zur Entnahme zellulären Materials
aus einem Organismus und Transplantieren dieses Materials in einen
anderen Organismus sind Durchschnittsfachleuten bekannt. Beispiele
für bevorzugtes
zelluläres
Transplantatmaterial kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus zellulärem Material
von Leber, Lunge, Herz, Nerven, Gallenblase und Pankreas besteht.
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Wie
in einem vorangegangenen Abschnitt diskutiert, können transgene Tiere mit Hilfe
der Verfahren der Erfindung unter Verwendung transgener Techniken,
die Durchschnittsfachleuten bekannt sind, generiert werden. Vorzugsweise
können
klonierte transgene Schweine mit Hilfe dieser Verfahren erzeugt
werden. Diese klonierten transgenen Tiere können verändert (engineered) werden,
sodass sie resistent oder teilweise resistent gegenüber Krankheiten
und Parasiten sind, die endemisch für solche Tiere sind. Beispiele
für diese
Erkrankungen und Parasiten sind in einem vorangegangenen Abschnitt dargestellt.
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Außerdem können die
klonierten transgenen Tiere verändert
werden, sodass sie ein rekombinantes Produkt erzeugen. Beispiele
für rekombinante Produkte
sind in einem vorangegangenen Abschnitt dargelegt. Die Expression
dieser Produkte kann von bestimmten Zellen oder Regionen innerhalb
der klonierten transgenen Tiere gesteuert werden, indem ein geeignetes
Promotorelement und andere regulatorische Elemente selektiv verändert werden,
um dieses Ziel zu erreichen.
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Zum
Beispiel können
humane rekombinante Produkte im Urin von Kälbern durch operative Verknüpfung eines
Uroplankinpromotors mit der DNA Sequenz, die ein rekombinantes Produkt
kodiert, exprimiert werden. Alternativ sind Beispiele zur selektiven
Expression humaner rekombinanter Produkte in der Milch eines Rindes
Fachleuten bekannt.
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Sobald
das rekombinante Produkt oder die rekombinanten Produkte in einem
spezifischen Gewebe oder Fluid des klonierten transgenen Tiers exprimiert
wurden, kann das geeignete Gewebe oder Fluid mit Hilfe von im Stand
der Technik bekannten Verfahren entnommen werden. Die rekombinanten Produkte
können
aus dem Fluid oder Gewebe mit Hilfe von Standardreinigungsverfahren
gereinigt werden, die Durchschnittsfachleuten bekannt sind.
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BEISPIELE
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Die
nachfolgenden Beispiele sind nicht einschränkend und lediglich repräsentativ
für verschiedene
Aspekte und Merkmale der vorliegenden Erfindung.
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Beispiel 1: Herstellung
einer Feeder-Schicht
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Eine
Schicht aus fötalen
Fibroblasten-Feederzellen wurde aus Mäuseföten hergestellt, die vom Tag
10 bis 20 der Schwangerschaft stammten. Der Kopf, die Leber, das
Herz und der Verdauungstrakt wurden entfernt, und das verbliebene
Gewebe wurde gewaschen und bei 37°C
in 0.05% Trypsin und 0.53 mM EDTA (Gibca BRL Katalog Nr. 15400-096)
inkubiert. Sich ablösende
Zellen wurden in Gewebekulturschalen mit MEM-Alpha kultiviert, das
mit Penicillin, Streptomycin, 10% fötalem Kälberserum und 0.1 mM 2-Mercaptoethanol
supplementiert war. Die Kulturen aus Feeder-Zellen wurden über eine
Periode von zwei bis drei Wochen bei 37.4°C, 3.5% CO2 und befeuchteter
Luft etabliert. Vor der Verwendung als Feeder-Zellen wurden Mausfibroblasten
mit Mitomycin C (Calbiochem Katalog Nr. 47589) in einer Endkonzentration
von 10 μg/ml
für drei
Stunden vorbehandelt und fünfmal
mit PBS gewaschen, bevor präequilibriertes
Wachstumsmedium zugegeben wurde.
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Feeder-Zellen
können
aus Schweineföten etabliert
werden, wie anschließend
für die
Etablierung kultivierter fötaler
Schweinefibroblastenzellen beschrieben.
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Beispiel 2: Etablierung
kultivierter nukleärer
Donorzellen aus nicht-embryonalem Gewebe
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Ein
Vorteil der hier definierten Materialen und Methoden ist die Fähigkeit,
eine totipotente Zelle aus nahezu jedem Typ einer Vorläuferzelle
zu etablieren.
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1. Etablierung kultivierter
Zellen aus fötalem
Schweinegewebe
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Zellen
der Keimleiste wurden aus Schweineföten isoliert und mit proteolytischen
Enzymen (Pronase E oder Trypsin) dissoziiert. Zellen mit EG Zellmorphologie
bildeten sich direkt aus den verdauten Keimleisten, wuchsen aber
schneller, wenn sie auf Schichten aus Mausfeeder-Zellen etabliert
wurden (siehe Beispiel 1). Die Zugabe der Wachstumsfaktoren hrLIF
und bFGF zum Zellkulturmedium hatte nur einen geringen Effekt auf
die Etablierung und Proliferation der EG-Zellen. Die Proliferationsraten
der EG Zellen erhöhten
sich, wenn 17 mM D-Glucose
in das Kulturmedium gegeben wurde. Zellkulturmedien enthielten α-MEM, 10%
fötales
Rinderserum und 0.1 mM 2-Mercaptoethanol.
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Föten im Alter
von 33, 36, 47 und 54 Tagen wurden als Quelle für die Zellen der Keimleiste
verwendet. EG Zellen aus 33, 36 und 47 Tage alten Föten waren
schwieriger zu etablieren und wuchsen im allgemeinen langsamer.
Die EG Zellen wurden von anderen Zelltypen überwachsen, typischerweise
verlängerte
Zellen, die wie Fibroblasten aussahen, wenn die Zellkulturen aus
Zellen der Keimleiste etabliert wurden, welche aus 33, 36 und 47
Tage alten Föten isoliert
wurden. Im Gegensatz dazu wuchsen EG Zellen aus einem 54 Tage alten
Fötus relativ
schnell und bildeten innerhalb von ein bis zwei Wochen große Kolonien.
Die EG Zellen wurden physisch von anderen kompetierenden Zelltypen
isoliert und wurden bis zur Konfluenz als Monolayer aus anscheinend
einem Zelltyp mit typischer EG Zellmorphologie angezogen, einer
Morphologie, die hier beschrieben wird.
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2. Etablierung kultivierter
Schweinekumuluszellen
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Kumuluszellen
wurden aus Kumulus/Oozyten-Komplexen aus Schweinen isoliert, die
in vitro maturiert wurden. Die Kumukus/Oozyten-Komplexe wurden Ovarien
aus Schlachthäusern
entnommen und in einem Schweinematurierungsmedium (anschließend beschrieben)
maturiert. Die Kumuluszellen wurden aus dem Kumulus/Oozyten-Komplexen entfernt,
indem die Kumulus/Oozyten-Komplexe mit 500 μl TL HEPES in 15 ml Zentrifugenröllchen inkubiert
und die Inhalte der Röhrchen
unter Verwendung eines Vortex-Mischers gevortext wurden (3 Minuten bei
halber Geschwindigkeit vortexen).
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Eine
Zellsuspension, die aus den gevortexten Kumulus/Oozyten-Komplexen
resultiert, wurde in eine Petri-Schale
tranferiert, nachdem sie zweimal mit 10 ml TL HEPES gewaschen wurde.
Die Petri-Schale wurde unter ein Mikroskop gegeben, und die Oozyten
wurden mit einer kleinen Bohrungspipette (small bore pipette) manuell
aus der Zellsuspension entfernt.
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Sobald
die Oozyten aus der Zellsuspension entfernt wurden, wurden die verbliebenen
Kumuluszellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen gegeben. Das Röhrchen wurde
in eine Zentrifuge gestellt, um die Kumuluszellen zu pelletieren.
Die pelletierten Kumuluszellen wurden in 5 ml Kulturmedium resuspendiert,
das MEM-α,
10% fötales
Kälberserum
und 0.1 mM β-Mercaptoethanol
enthielt, und in einer Zelldichte von ungefähr 25.000 Zellen/ml in eine
60 mm Gewebekulturschale aliquotiert.
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Die
Kumuluszellen wurden mit Hilfe von Standardzellkulturverfahren kultiviert.
Die Zellkulturmedien wurden alle drei bis vier Tage gewechselt, und
die Kumuluszellen wurden passagiert, wenn sie konfluent waren.
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3. Etablierung kultivierter
amniotischer Schweinezellen
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Einem
schwangeren weiblichen Schwein wird mit Hilfe eines "guided needle"-Verfahrens amniotisches
Fluid entnommen. Das amniotische Fluid wird in ein chronisches 15
ml Röhrchen
transferiert und 10 Minuten bei 100 × g zentrifugiert. Die Flüssigkeit
des Überstandes
wird entfernt, wobei 1 ml Flüssigkeit
auf dem Zellpellet gelassen wird. Das Zellpellet wird in diesem
1 ml amniotischer Flüssigkeit
resuspendiert. 0.5 ml der amniotischen Zellprobe werden zu 4.5 ml
vollständigem
AmnioMax Medium (90 ml AmnioMax-C100 Basalmedium + 15 ml AmnioMax-C100
Supplement [Gibco BRL]) in eine T25 Zellkulturflasche gegeben und
in einem Inkubator bei einer Temperatur von 39°C und einer Atmosphäre mit 5%
CO2 gegeben.
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Amniotische
Zellen heften sich innerhalb von etwa vier Tagen an die Kulturflaschen
an. Amniotische Zellkulturen waren typischerweise innerhalb von
7 bis 14 Tagen 70% konfluent. Die Zellen werden durch Entfernen
des Zellkulturmediums aus den Flaschen und zweimaliges Waschen der
Zellen mit EBSS Medium oder PBS Medium (ohne Calcium oder Magnesium,
Gibco BRL) passagiert. Zu den Kulturflaschen werden 0.2 ml einer
Trypsin/EDTA-Lösung
(Gibco BRL) gegeben und bei 39°C
inkubiert, bis die Zellen sich von. den Oberflächen der Kulturflaschen ablösen. Nach
dem Ablösen
der Zellen von den Oberflächen
der Kulturflaschen wird Zellkulturmedium zu den Flaschen gegeben,
um das Trypsin zu inaktivieren, und die Zellen wurden in drei neue T25
Flaschen aufgeteilt.
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4. Etablierung kultivierter
fötaler
Schweinefibroblastenzellen
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Kultivierte
fötale
Schweinefibroblastenzellen wurden aus Schweineföten hergestellt, die vom Tag 33
bis 54 der Schwangerschaft stammten. Der Kopf, die Leber, das Herz
und der Verdauungstrakt wurden entfernt und das verbliebene Gewebe
gewaschen und bei 37°C
in 0.05% Trypsin und 0.53 mM EDTA (Gibco BRL Katalog Nr. 15400-096),
verdünnt
mit Ca2+- und Ma2+- freiem Dulbecco's PBS (Gibco BRL Katalog
Nr. 14190-151), inkubiert. Abgelöste
Zellen wurden in Gewebekulturschalen mit MEM-α (Gibco BRL Katalog Nr. 32561-037)
kultiviert, das mit Penicillin, Streptomyzin, 10% fötalem Rinderserum
(Hyclone Katalog Nr. SH300070.03) und 0.1 mM 2-Mercaptoethanol (Gibco
BRL Katalog Nr. 21985-023) supplementiert war. Fötale Schweinezellen wurden über einen
Zeitraum von zwei bis drei Wochen bei 37.4°C, 3.5% CO2 und
befeuchteter Luft etabliert.
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5. Etablierung kultivierter
Schweinefibroblastenzellen aus adulten Tieren
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Ein
erster Schritt zur Etablierung totipotenter Zellen aus Geweben ausgewachsener
Tiere ist die Etablierung einer Primärkultur aus isolierten Zellen. Obwohl
das nachfolgende Verfahren Proben aus einer Ohrstanzung betrifft,
kann dieses Verfahren auf Zellen angewendet werden, die aus einem
beliebigen Gewebetyp isoliert werden. Die nachfolgenden Schritte
werden vorzugsweise unter Verwendung steriler Verfahren durchgeführt.
- 1. Zweimaliges Waschen jeder Ohrprobe mit 2
ml Trypsin/EDTA-Lösung in
zwei getrennten 35 mm Petri-Schalen. Getrenntes Weiterverarbeiten
einer jeder Ohrprobe. Zerkleinern der Ohrprobe mit sterilen Scheren
und Skalpellen in 35 mm Petri-Schalen, die 2 ml einer Trypsin/EDTA-Lösung enthält. Die
zerkleinerten Stücke
sind vorzugsweise weniger als 1 mm im Durchmesser groß.
- 2. Inkubieren der zerkleinerten Ohrstücke in der Trypsin/EDTA-Lösung für 40 bis 50 Minuten in einem
37°C Inkubator
unter gelegentlichem Mischen. Die Trypsin/EDTA-Lösung wird anschließend im
Detail beschrieben. Die Schale kann mit einem dehnbaren Material,
wie z.B. Parafilm, umhüllt
sein, um eine CO2 Akkumulation zu verhindern.
- 3. Transfer der verdauten Ohrstücke in ein steriles 15 ml Röhrchen,
Waschen der Schale, aus der die verdauten Ohrstücke entnommen wurden, mit 2 ml
der Trypsin/EDTA-Lösung und
Transfer dieser Waschlösung
in das sterile Röhrchen.
- 4. Vortexen des Röhrchens
für zwei
Minuten bei hoher Geschwindigkeit.
- 5. Zugabe von 5 ml Zellkulturmedium (nachfolgend definiert),
um das Trypsin zu inaktivieren.
- 6. Zentrifugieren des 15 ml Röhrchens bei 280 × g für 10 Minuten.
- 7. Dekantieren des Überstandes
und Resuspendieren des Zellpellets in der verbliebenen Lösung durch
vorsichtiges Antippen der Seite des Röhrchens.
- 8. Zugabe von 2 ml Zellkulturmedium zum Röhrchen und anschließendes Zentrifugieren,
wie in Schritt 6 beschrieben.
- 9. Dekantieren des Überstands,
Resuspendieren des Pellets, wie in Schritt 7 beschrieben, und anschließende Zugabe
von 2 ml Medium.
- 10. Aufbewahren von zwei bis drei Stücken des Ohres für eine DNA
Analyse und Lagerung bei –80°C in einem
2 ml Röhrchen.
- 11. Transfer der resuspendierten Zellen in eine 35 mm Kulturschale
und Inkubation bei 37°C
in einer befeuchteten 5% CO2/95% Luftatmosphäre.
- 12. Medienwechsel alle zwei bis vier Tage.
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Eine
Trypsin/EDTA-Lösung
wurde durch Mischen einer Trypsin/EDTA-Lösung (Gibco BRL Katalog Nr.
15400-096) mit Ca2+-freier und Mg2+-freier Dulbecco's phosphat-gepufferter
Saline (PBS) (Gibco BRL Katalog Nr. 14190-151) hergestellt, sodass die
Lösung
0.05% Trypsin (w/v) und 0.53 mM EDTA enthielt. Die Lösung wurde
durch Filtration über
einen 0.2 μm
Filter sterilisiert.
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Ein
Zellkulturmedium wurde durch Mischen von essentiellem MEM-Alpha
Minimalmedium (Gibco BRL Katalog Nr. 32561-037), 10% fötalem Rinderserum
(Hyclone Nr. SH30070.03), 0.1 mM 2-Mercaptoethanol (Gibco BRL Katalog Nr.
21985-023), 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 0.25 μg/ml Amphotericin
B (Fungizone) hergestellt.
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Beispiel 3: Reprogrammieren
kultivierter Schweinezellen
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Falls
die mit Hilfe der in Beispiel 2 gelehrten Verfahren hergestellten
kultivierten Zellen nicht eindeutig totipotent sind, können die
Zellen mit Hilfe des nachfolgenden Verfahrens reprogrammiert werden.
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Eine
Suspension aus Zellen der Keinleiste (Endkonzentration 100.000 Zellen/ml)
wird in eine 35 mm Petrischale gegeben, die eine Feeder-Schicht aus
murinen primären
embryonalen Fibroblasten enthält.
Das Kulturmedium kann essentielles MEM-Alpha Minimalmedium (Gibco
BRL Katalog Nr. 32561-037), 10% fötales Rinderserum (Hyclon Katalog
Nr. SH30070.03), 0.1 mM 2-Mercaptoethanol (Gibco BRL Katalog Nr.
21985-023), 100 ng/ml humaner rekombinanter Leukämie Inhibitorfaktor (hrLIF;
R&D System Katalog
Nr. 250-L), 100 ng/ml boviner basischer Fiboblastenwachstumsfaktor
(bFGF; R&D System
Katalog Nr. 133-FB) bei 37.5°C
und 5% CO2 sein. Exogener Steel-Faktor (z.B.
membranassoziierter Steel-Faktor und löslicher Steel-Faktor) brauchen
nicht zum Kulturmedium zugegeben werden.
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Kulturmedium,
das mit 100 ng/ml hrLIF und 100 ng/ml bFGF supplementiert ist, wird
typischerweise mit Vorläuferzellen
für zehn
bis vierzehn Tage inkubiert. Alle zwei bis vier Tage wird das supplementierte
Medium mit frischem supplementiertem Medium ersetzt. Die EG Zellen
können
zu jeder Zeit in diesen Kultivierungsverfahren beobachtet werden.
Diese EG Zellen können
aus der Zellkultur isoliert und separat kultiviert werden, um homogenen
EG Zellkulturen zu etablieren.
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Um
die EG Zelllinien aufrechtzuerhalten, werden Zellpopulationen mit
hoher Dichte jede Woche in einer Verdünnungsrate von 1:4 bis 1:8
passagiert. Die Zellen werden durch Inkubieren mit einem 0.05 Trypsin/0.53
mM EDTA-Gemisch und Herstellen neuer Kulturen in frischem Wachstumsmedium
passagiert. Die wachstumsfördernde
Kapazität
von MEM-Alpha Medium für
totipotente Zellen kann durch Zugabe von Insulin-Transferin, Natriumselenit-Supplement,
1:100 verdünnt
(Sigma Katalog Nr. 11884), zum Zellkulturmedium erhöht werden.
Als eine Vorsichtsmaßnahme
gegen eine Mycoplasmenkontamination kann eine kurzfristige Kultivierung
mit Tylasintartrate (Sigma Katalog Nr. T3151) durchgeführt werden.
Vor den NT werden die Zellen mit Hilfe einer PCR, die mit DNA Primern
durchgeführt
wird, welche spezifisch für
Mycoplasmensequenzen sind (Stratagene Katalog Nr. 302007), auf die
Anwesenheit von Mycoplasmen untersucht.
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Beispiel 4: Oocyten Maturierung
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1. Absaugen und Entnahme
von Oocyten
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Schweineovarien
wurden bei 25°C
in ein Labor transportiert und sofort mit 0.9% Saline gewaschen.
Folikel zwischen 3 und 6 mm wurden mit Hilfe von Nadeln der Breite
18 (18 gauge needles) und 50 ml Röhrchen, die mit einem Vakuumsystem
verbunden waren, abgesaugt, wobei das Vakuum auf eine Flussrate
von 45 ml/min eingestellt wurde. Nach dem Absaugen ließ man die
Oocyten sich für
5 bis 10 Minuten absetzen. Folikelflüssigkeit (pFF) wurde abgesaugt
und für
die Verwendung in Maturierungssystemen aufbewahrt, falls dies benötigt wird.
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Die
Oocyten wurden durch Resuspendieren in 20 ml Hepes-PVA Medium und anschließendes Sichabsetzenlassen
der Oocyten gewaschen. Das Medium wurde entfernt, und der Waschschritt
wurde zwei weitere Male wiederholt. Hepes-PVA Medium enthält 114 mM
NaCl, 3 mM KCl, 2 mM CaCL2, 0.5 MgCL2, 2 mM NACO3, 0.3
mM NaH2PO4, 10 mM
HEPES, 12 mM Sorbitol, 0.2 mM Natriumpyruvat, 0.05 μl/ml Gentamycin,
0.07 g/l Penicillin G, 0.1 g/l Polyvinylalkohol und 2 ml/l Natriumlacat
und weist einen pH von 7.4 auf. Gewaschene Oocyten wurden im Anschluss
in ein Maturierungsmedium gegeben.
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2. In vitro Maturierung
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Die
Oocyten wurden dreimal in Maturierungsmedium gewaschen, und 50 Oocyten/Well
wurden 20 bis 22 Stunden in 0.5 ml Maturierungsmedium in 4 Well-Platten
transferiert, wobei das Maturierungsmedium Hormone enthielt. Zusätzlich wurden sechs
bis acht Stücke
der Folikelhülle
zu den Wells gegeben, obwohl die Zugabe der Hüllstücke optional ist. Es ist bekannt,
dass Stücke
der Folikelhülle
die cytoplasmatische Maturierung von Schweineembryos verbessern,
was eine Erhöhung
des Entwicklungspotentials der Oocyte zur Folge hat. Siehe z.B. Abeydeera
et al., 1998, Biol. Reprod. 58: 213–218.
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Das
Maturierungsmedium enthält
109 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM
MgSO4, 25 mM NaHCO3,
1 mM KH2PO4, 6 mM
Glucose, 1 mM Glutamin, 12 mM Sorbitol, 5 mg/l Insulin, 100 IU/l
Penicillin G und 50 mg/l Streptomycin und weist einen pH von 7.4
auf. Follikelflüssigkeit
(pFF) aus Schweinen kann in einer Konzentration von etwa 10% (Volumen pro
Volumen) zum Maturierungsmedium gegeben werden. Ferner kann β-Mercaptoethanol in
einer Konzentration von 50 μM
zum Maturierungsmedium gegeben werden. Zusätzlich kann Cystein in einer Endkonzentration
von 0.6 mM zum Maturierungsmedium gegeben werden. Maturierungsmedien
mit Hormonen enthielten 10 ng/ml epidermalen Wachstumsfaktor, 10
U/ml Chriones Pferde Gonadotropin, 10 U/ml humanes choriones Gonadotropin
und 1 mM db-cAMP.
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Die
Oocyten und die Stücke
der Folikelhülle wurden
anschließend
in 0.5 ml frisches Maturierungsmedium transferiert und weitere 20–22 Stunden maturiert,
wobei die Maturierungsmedien keine Hormone oder db-cAMP enthielten.
Die Oocyten wurden insgesamt 40–44
Stunden bei 39°C
in einer 5% CO2 Atmosphäre
maturiert.
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Beispiel 5: Nukleärer Transfer
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Nach
42 bis 46 Stunden Maturierung wurden die Oocyten von den Kumuluszellen
durch Vortexen der maturierten Oocyten für ungefähr 2 Minuten entfernt. Nach
den Vortexen wurden die Oocyten hinsichtlich der Raten der Polarkörperbildung
untersucht. Die Raten der Polarkörperbildung
können durch visuelle
Detektion mit einem Stereomikroskop untersucht werden. Die visuelle
Evaluierung der Raten der Polarkörperbildung
kann durch Anfärben
der Oocyten in einem Medium mit 3 μg/ml Hoechst 33342 und 7.5 μg/ml Cytochalasin
B für etwa
20 Minuten erhöht
werden. Die Oocyten wurden anschließend mit einer Entkernungspipette
entfernt.
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NT-Verfahren
wurden durchgeführt,
nachdem die Oocyten entfernt waren. In jedem NT-Verfahren wurde
eine nukläre
Donorzelle angrenzend an eine Oocyte platziert, sodass je ein Teil
der Plasmamenbran jeder Zelle einander berührten und sodass der nukleäre Donor
an die Zona pellucida der Oocyte angrenzte. Als nukleäre Donoren
für die
NT-Verfahren wurden Schweine EG-Zellen, kultivierte Schweinezellen
aus der Keimleiste, kultivierte Schweinefiboblastenzellen und kultivierte
Schweine Kumuluszellen sowie Kumuluszellen verwendet, die nach 48 Stunden
Maturierung aus einem Kumulus/Oocyten-Komplex assoziiert wurden.
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Nachdem
ein nukleärer
Donor angrenzend an eine entkernte Oocyte platziert wurde, wurden
die beiden Zellen fusioniert. Drei Medien können für die Fusion der Zellen verwendet
werden: (1) 0.25 M Sorbitol, 0.1 mM CaOAc, 0.5 mM MgOAc und 0.1%
BSA; (2) 0.3 mM Mannitol, 0.1 mM MgSO4,
0.5 mM CaCL2 und 0.1% BSA; (3) 0.3 M Mannitol,
5% TL Hepes und 0.3% BSA; und (4) Zimmerman's Medium. Nach der Fusion wurden die
fusionierten Oocyten für
vier Stunden kultiviert, wobei die Kultur 109 mM NaCl, 5 mM KCl,
2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4,
25 mM NaHCO3, 1 mM KH2PO4, 6 mM Glucose, 1 mM Glutamin, 7 mM Taurin,
5 mM Hypotaurin, 0.4% BSA, 100 IU/l Penicillin G und 50 mg/l Streptomycin
enthielt und einen pH von 7.4 aufwies. Die fusionierten Oocyten
können ferner
in einem CR2 Medium kultiviert werden (CR1 Medium supplementiert
mit Aminosäuren),
wobei das letztere beschrieben ist im U.S. Patent Nr. 5,096,822, "Bovine embryo medium," Rosenkrans Jr. et
al., 3. November 1992.
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Beispiel 6: Aktivierung
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Nachdem
die fusionierten Oocyten nach der Fusion für 4 Stunden kultiviert wurden,
wurden sie in 10 μM
Ionomycin in ZI Lösung
(TL-Hepes Stammlösung
+ 1 mg/ml BSA) für
acht Minuten inkubiert und anschließend in Z30 Lösung (TL-Hepes
Stammlösung
+ 30 mg/ml BSA) für
5 Minuten gespült.
Die TL-Hepes Stammlösung
enthielt 114 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM NaHCO3,
0.3 mM NaH2PO4,
10 mM Hepes, 2 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 2 ml/l Natriumlactat und 1 ml/l Phenolrot
und wies einen pH von 7.4 auf.
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Die
Oocyten wurden dreimal mit TL-Hepes PVA gewaschen und anschließend in
einer 2 mM DMAP-Lösung
in CR2 Medium mit BSA für
vier Stunden bei 39°C
in einer 5% CO2 Atmosphäre inkubiert. Nach der Aktivierung
wurden die Oocyten dreimal mit TL-Hepes PVA gespült und in Medien zur Kultur
für Schweineembryos
gegeben.
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Beispiel 7: In vitro Kultur
aktivierter Oocyten und Embryos
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Nach
Entfernung der DMAP-Lösung
wurden die aktivierten Oocyten und Cybride dreimal in TL-Hepes DVA
gewaschen und vier Tage in eine Medium zur Kultur von Schweineembryos
gegeben. Das Medium zur Kultur von Embryos enthielt 109 mM NaCl,
5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4,
25 mM NaHCO3, 1 mM KH2PO4, 6 mM Glukose, 1 mM KH2PO4, 6 mM Glucose, 1 mM Glutamin, 12 mM Sorbitol,
5 mg/l Insulin, 100 IU/l Penicillin G und 50 mg/l Streptomycin und
wies einen pH von 7.4 auf. Aktivierte Oocyten und Cybride können ferner
in CR2 Medium kultiviert werden. Am Tag 4 werden die Embryos auf
Spaltung untersucht und anschließend drei weitere Tage in frisches
Embryokulturmedium transferiert, das mit 10% fötalem Kälberserum (v/v) supplementiert
ist. Am Tag 7 werden die Embryos hinsichtlich der Entwicklung von
Blastocysten evaluiert.
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Beispiel 8: Reklonierungsverfahren
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Ein
oder mehr optionale Reklonierungszyklen können zur Verbesserung der Totipotenz
nukleärer
Donorzellen durchgeführt
werden. In einem Reklonierungszyklus werden die Zellen aus dem ersten NT-Zyklus
entweder durch Pronase E (1–3
mg/ml in TL HEPES) oder mechanisch nach Behandlung mit Cytochalasin
B disaggregiert, wenn sich die Embryos im Morulastadium befinden.
Einzele Blastomere werden in den perivitellinen Raum einer entkernten
Oocyte (52–54
Stunden nach der Maturierung, wie im Beispiel 4 gelehrt) eingebracht.
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Ein
einzelner Blastomer wird mit der entkernten Oocyte mittels Elektrofusion
in einer 500 μm Kammer
mit einem elektrischen Puls von 105 Volt für 15 Sekunden in einer isotonischen
Sorbitollösung (0.25
M) bei 30°C
fusioniert. Es ist nicht notwendig, dass die fusionierte Oocyte
für die
Reklonierungszyklen einer chemischen Aktivierung unterworden wird.
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Nach
der Oocytenfusion werden die fusionierten Oocyten aus dem zweiten
NT-Zyklus in Embryokulturmedium unter befeuchteter Luft mit 5% CΟ2 bei
39°C kultiviert.
Solche Embryos können
in ein Empfängerweibchen
transferiert werden.
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Beispiel 9: Transfer von
Schweineembryos in einen maternalen Empfänger und Entwicklung eines
klonierten Schweins
-
Gonadotrophine
(PG600TM) werden in 10 junge weibliche Schweine
(gilts) injiziert, was etwa 2–5
Empfänger
zur Folge haben sollte, die 3–5
Tage nach der Behandlung Östrus
zeigen. Synchronisierte junge weibliche Schweine werden mit dem
Embryotransfer entweder am Tag 3 oder Tag 5 des Östrus verwendet. Embryos im
frühen
Stadium (< 8 Zellen) werden
am Tag 3 des Östrus
in die Empfänger
transferiert, und Embryos in einem späteren Stadium (> 8 Zellen) werden am
Tag 5 des Östrus
an weitere Empfänger
transferiert. Die Tiere werden anästhetisiert, es wird eine Öffnung des
mittleren Bauchbereichs (mid-ventral laparotomy) durchgeführt, und
der Fortpflanzungstrakt wird entfernt. Das Embryotransferverfahren besteht
aus dem Transfer 30 bis 50 Embryos im frühen Stadium, die in den Eileiter
eingebracht werden, oder aus dem Transfer von Embryos in einem späteren Stadium
(Embryos im Morula- oder Blastocystenstadium) in die Gebärmutterkappe
(uterine horn). Die Empfänger
werden hinsichtlich der Initiation der Schwangerschaft untersucht
und fortlaufend mittels wöchentlicher
Ultraschalluntersuchungen überwacht.
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Beispiel 10: Klonierung
transgener Schweine
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Transgene
Zellen, die zur Etablierung eines klonierten transgenen Schweins
geeignet sind, können
aus den Zellen hergestellt werden, die aus einem adulten Tier isoliert
wurden. 3 veranschaulicht Verfahren,
die zur Etablierung solcher transgener Zellen verwendet werden können. Obwohl
transgene Zellen aus nahezu jedem Zelltyp mit Hilfe der Lehren der
Erfindung etabliert werden können,
veranschaulicht 3 Verfahren zur Etablierung
transgener embryonaler Stammzellen und transgener totipotenter Zellen.
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Fibroblastenzellkulturen
können
aus Ohrstanzungen etabliert werden, welche einem Schwein entnommen
wurden, wie zuvor definiert. Zusätzlich können kultivierte
Fibroblastenzellen aus Schweineföten
etabliert werden. Einzelne Zellen können aus dieser Zellkultur
isoliert und als nukleäre
Donoren in einem nukleären
Transferverfahren verwendet werden. Ein einzelner nukleärer Transferzyklus
oder multiple nukleäre
Transferzyklen können
angewandt werden. Weitere optionale Schritte sind in den obigen Beispielen
definiert.
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Die
Zellen können
anschließend
mit einem DNA Konstrukt transfiziert werden. Die Zellen können in
vielen Stadien transfiziert werden, wie in 3 dargestellt.
Materialien und Verfahren zur Herstellung transgener Zellen werden
in den zuvor zitierten Publikationen definiert. Die totipotenten
Zellen der Erfindung können
mit einer DNA transfiziert werden, die (a) ein Antibiotika-Resistenzgen,
(b) eine DNA Sequenz, die ein Protein oder Proteine kodiert, und (c)
ein Promotorelement oder Promotorelemente umfasst. Die transfizierten
Zellen werden bezüglich
der transgenen Modifikation durch Selektion in einem Zellkulturmedium
selektiert, das ein Antibiotikum enthält. Die transgenen Zellen werden
anschließend
unter Verwendung von einem oder mehr Screeningverfahren bezüglich der
transgenen Modifikation gescreeent. Beispiele dieser Verfahren sind:
(1) Polymerasekettenreaktion, (2) Southern-Blotting, und (3) Fiber-FISH
Verfahren. Diese Verfahren sind Durchschnittsfachleuten bekannt.
Die letzteren beiden Verfahren können
verwendet werden, um die Kopienzahl einer inserierten Gensequenz
in der nukleären
DNA embryonaler Keimzellen zu bestimmen.
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Diese
Screening Verfahren können
auch bei transfizierten Zellen in einem beliebigen der in 3 angezeigten
Schritte angwandt werden. Klonierte transgene Tiere werden mit Hilfe
einer transgenen Zelle als nukleärer
Donor in einem NT-Prozess etabliert, wie in Beispiel 5 beschrieben.
Die fusionierten Oocyten, die durch ein solch ein Verfahren erzeugt werden,
werden zur Erzeugung eines klonierten transgenen Schweins den Verfahren
unterworfen, die in den Beispielen, 6, 7, 9 und optional 8 gelehrt
werden.