KR100807644B1

KR100807644B1 - 체외수정 수정란 및 체세포 복제 수정란의 동시 이식에의한 돼지 생산 방법

Info

Publication number: KR100807644B1
Application number: KR1020070026707A
Authority: KR
Inventors: 박창식; 김명철; 진동일; 이영주
Original assignee: 충남대학교산학협력단
Priority date: 2007-03-19
Filing date: 2007-03-19
Publication date: 2008-02-28
Also published as: WO2008114902A1

Abstract

본 발명은 (A) 도축 돼지의 미성숙 난자를 채취하여 배양하는 단계; (B) a) (A)단계에서 준비된 성숙난자와 액상정액의 체외수정에 의한 수정란 및 b) (A)단계에서 준비된 성숙난자를 탈핵하고 공여 체세포를 탈핵 난자에 이식하는 것에 의한 체세포 이식 수정란을 준비하여 각각 배양하는 단계; (C) (B) 단계에서 준비된 체외수정에 의한 수정란과 체세포 이식에 의한 수정란을 동시에 한 마리의 대리모에 이식하는 단계;를 포함하는 돼지의 생산방법에 관한 것이다.

본 발명의 체외수정된 수정란과 체세포 복제에 의한 수정란을 동시 이식하는 돼지 생산 방법은, 일반적으로 착상이 잘 되지 않는 체세포 복제 수정란의 착상을 도와 복제돼지의 생산 효율을 증가시킨다. 또한, 체외수정에 의한 수정란의 체외 배양 기간을 대폭 단축하고 적은 수의 수정란으로부터도 정상 분만이 가능하고, 체외수정된 수정란과 체세포 복제 수정란 유래의 자돈을 동시에 생산할 수 있다.

돼지, 인공 수정, 체외 수정, 체세포 복제, 수정란, 액상정액

Description

체외수정 수정란 및 체세포 복제 수정란의 동시 이식에 의한 돼지 생산 방법{Piglet production method by simultaneous transfer of embryos formed by in vitro fertilization and nuclear transfer}

도 1은 돼지의 난소 중 미성숙 난자의 체외성숙 시 사용된 난포막을 보여주는 사진.

도 2는 본 발명의 방법에 의해 생성된 체외수정 유래 돼지(A 및 B)와 체세포 복제 유래 돼지(C)의 사진.

본 발명은 수정란 이식에 의한 돼지의 생산에 관한 것으로, 보다 상세하게는 돼지 미성숙 난자를 체외 성숙한 후 체외수정한 수정란과 체세포의 핵을 이식한 수정란을 동시에 이식하는 것에 의한 돼지의 생산 방법에 관한 것이다.

오늘날까지 돼지의 번식학적 측면에서의 개량은 주로 우수한 수퇘지를 이용한 인공수정에 의존하여 왔으나, 인공수정만으로는 돼지 개량의 한계점에 와있다. 따라서 우수한 암퇘지를 이용한 돼지 개량에 눈을 돌리게 되었고, 이러한 필요성에 의하여 개발된 기술이 수정란 이식(embryo transfer)이다. 수정란 이식은 돼지의 유전적 개량뿐만 아니라, 성비조절, 일란성 단태생산, 핵이식, 외래유전자의 도입, 배아의 초기발생과 유전자 발현의 기전 구명, 질병의 조절 등의 연구에도 크게 기여할 수 있다는 측면에서 중요시 되고 있다.

포유동물의 수정란 이식을 최초로 성공한 사람은 영국의 Heape(1890, Proc. Roy. Soc. 48: 457)로서 그는 순종 앙고라 토끼의 수정란을 벨지안종 암토끼에 이식하여 앙고라종 자토를 생산하는데 성공하였다. 돼지의 수정란 이식은 Kvansnickii(1951, Interbreed ova transplantation. Sovetsk, Zootech. 1: 36)에 의하여 최초로 성공하였으며, 오늘날 대부분의 실험실에서 많이 사용되고 있는 수정란의 회수와 이식방법이 1960년대 Hancock과 Hovell (1962, J. Reprod. Fert. 4: 195), Dziuk 등 (1964, J. Anim. Sci. 23: 37), 그리고 Vincent 등 (1964, J. Anim. Sci. 23: 1084)에 의하여 개발된 이래 주로 실험실 내에서의 연구에 한정되어 왔다.

그러나 최근 생체내 (in vivo)에서 성숙된 난자를 체외수정시켜 정상자돈을 생산한 결과가 Cheng(1985, In vitro fertilization of farm animal oocytes. Ph. D. Thesis. Council for Nation Academic Awards), Yoshida(1987, Jpn. J. Vet. Sci. 49: 711; 1989, Jpn. J. Anim. Reprod. 35: 34), Nagai 등(1988, J. Reprod. Fert. 84: 585)에 의하여, 생체외 (in vitro)에서 성숙시킨 난자를 체외수정시켜 정상자돈을 생산한 결과가 Mattioli 등(1989, Theriogenology 31: 1201)에 의해서 보고됨으로써 돼지 수정란 이식 기술의 실용화 가능성을 나타내었다. 우리나라에서는 이 등(1988, 한국축산학회지 30(7): 403)이 5두의 공란돈으로부터 67개의 수정란을 회수한 후 5두의 수란돈에 이식하여 18두의 자돈을 생산함으로써 돼지 수정란 이식의 역사가 시작되었다.

Kikuchi 등(2002, Biology of Reproduction 66:1033)은 체외에서 성숙시킨 돼지 난자를 체외수정 시킨 후 5일과 6일동안 체외배양 시키고 배양 후 발달한 양질의 배반포만을 선별하여 3마리의 대리모에 각각 50개의 배반포를 이식한 결과 총 19마리의 자돈을 생산하였다. 또한 Suzuki 등(2006, Theriogenology 65:374)은 우태아혈청을 첨가한 배지에서 체외성숙시킨 난자를 체외수정시켜 6일간 배양시킨 후 생산된 배반포를 두 마리의 대리모에 이식하여 7마리의 자돈을 생산하였다. 그러나, 기존의 보고들은 많은 수의 배반포를 얻기 위하여 많은 난자를 준비해야 하고, 수정란을 5-6일간 배양한 후 이식하여야 하는 번거로움이 있다.

핵이식 기법(nuclear transfer)은 우수한 유전형질 또는 목적하는 형질전환 개체의 세포핵을 탈핵(enucleation)된 난자에 이식하여 유전적으로 동일한 개체를 생산하는 방법으로 체세포 복제라고도 한다. 실험동물을 이용한 기초연구를 바탕으로 근래에는 산업동물을 중심으로 한 우량가축의 대량생산과 의약학 분야에의 이용을 목표로 활발하게 진행되고 있다. 이러한 노력의 결과로 면양의 복제생산(Wilmut 등, 1997, Nature 385:810)을 처음으로 성공한 이래, 마우스 및 소 등(Wakayama 등, 1998, Nature 394:369; Kato 등, 1998, Science 282:2095)에서도 성공예가 속출하고 있으며, 최근에는 가장 까다롭기로 알려져 있던 돼지에서의 체세포 복제동물 생산에 성공 (PPL Therapeutics, 2000)하는 성과를 달성하게 되었다.

최근 이식외과술의 발전으로 심장, 신장, 간 등 장기이식에 의한 생명 연장이 확대되고 있으나, 그 특성 상 장기의 공급원이 인간에 한정되어 있기 때문에 수요에 비해 공급이 절대적으로 부족한 상태이다. 따라서, 장기 공급원의 확보를 위한 동물의 장기의 이용 가능성이 제기되면서 그 중요성이 부각되고 있으며, 그 중에서도 생리 구조 및 형태학적 측면에서 인간과 가장 유사한 동물인 돼지가 장기이식 대체동물이 될 수 있음이 시사 되어왔다. 이에 장기 제공용 대체동물의 생산과 함께, 알츠하이머, 파킨슨씨병, 당뇨병 등의 만성질병의 치료수단으로 해당 장기나 조직의 특정 세포를 이식하는 세포 이식치료법(cell theraphy)이 주목을 받고 있다. 여기에, 공급이 용이한 돼지 등 가축의 난자를 수핵란으로 이용하여 인간의 체세포를 이식하는 핵이식기술(cross-species nuclear transplantation)을 적용하여 복제수정란을 작성, 이식 전 단계까지 발육 후 배아세포와 같은 기간세포를 수립, 분화시키게 되면 목적으로 하는 세포를 직접 대량 생산할 수 있다.

이와 같이 가축번식학적 측면이나 의학적 활용면에서 매우 유용한 핵이식 기법을 이용하여 복제돼지를 생산한 보고가 있다 (Park 등, 2001, Animal Biotechnology 12:173; Lai 등 2002, Science 295:1089). 돼지의 임신은 임신 12일경 4개 이상의 수정란이 착상하였을 시 감지되는데(Polge 등, 1966, Reproduction & Fertility 12:395), 핵이식 기법 유래의 수정란은 정상 배반포 발 생율이 낮으므로 수정란 이식 시 다수의 수정란을 이식하여야 하는 문제가 있다. 또한 핵이식 후 정상적인 배반포 발생율이 낮고 그로 인한 임신율이 매우 낮아 자돈 생산율이 극히 떨어지는 실정이다 (Lai 등, 2003, Reproductive Biology and Endocrinology 1:82).

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 체외수정 및 체세포 복제된 수정란의 동시 이식에 의해 복제 돼지의 정상 분만율을 높일 수 있는 돼지의 생산 방법을 제공하고자 하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 체외수정에 의한 돼지의 생산에 있어서, 수정란의 배양 기간을 대폭 단축하고 적은 수의 난자로부터 정상 분만율을 향상시킨 돼지의 생산 방법을 제공하는 것이다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 돼지 생산방법은 (A) 도축 돼지의 미성숙 난자를 채취하여 배양하는 단계; (B) a) (A)단계에서 준비된 성숙난자와 액상정액의 체외수정에 의한 수정란 및 b) (A)단계에서 준비된 성숙난자를 탈핵하고 공여 체세포를 탈핵 난자에 이식하는 것에 의한 체세포 이식 수정란을 준비하여 각각 배양하는 단계; (C) (B) 단계에서 준비된 체외수정에 의한 수정란과 체세포 이식에 의한 수정란을 동시에 한 마리의 대리모에 이식하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 미성숙 난자의 체외 배양은 체외수정 및 체세포 복제의 성공에 가장 기본 적인 단계로서, 당분야에서 공지의 방법에 의해 이루어 질 수 있다. 그러나, 체외 성숙의 효율을 높이기 위해서는 난포막(follicle shells)을 첨가한 배지에서 36~48시간 이루어 지는 것이 바람직하다. 돼지 미성숙 난자는 보통 체외배양 후 36시간 이후에는 핵 성숙이 이루어져 난자의 핵은 제 2감수분열 중기(metaphase II)에 이르러서 정자의 자극 (체외수정)전까지 휴지하게 되므로 최소 36시간이상 배양하여야 한다. 그러나, 난자의 성숙이 완전해 지기 위해서는 세포질 성숙도 필요하므로 일반적으로 체외성숙 배양은 44~48시간 정도인 것이 가장 바람직하다. 48시간 이후의 휴지기 성숙 난자는 정자의 자극이 없으면, 스스로 퇴화되어 정상적인 수정이 이루어지지 않는다.

난포막은 돼지 미성숙 난자의 세포질 성숙을 향상시키고(Mattioli 등, 1989, Theriogenology 31:1201), 미성숙 난자내 cyclic adenosine monophosphate (cAMP) 농도와 glutathione 농도를 증가시켜 체외수정 후 초기 배아 발달을 촉진시킨다(Abeydeera 등, 1998, Biol Reprod 58:213)고 알려져 있다. 따라서 Abeydeera 등(Biol Reprod 58:213, 1998)은 난포로부터 주사기로 난포액을 채취하고, 현미경하에서 난포액에 포함되어 있는 난포막 조각 (follicle shell piece)을 실험자가 주관적으로 선택한 후 세척하여 미성숙 난자의 체외 배양 시 첨가하여 이용하였다. 그러나 이는 처리과정의 번거로움으로 인하여 실용화 되지 못하였다. 본 발명에서는 도축장에서 수집된 난소에서 4-6 mm 직경의 난포막을 수술용 가위로 잘라, 성숙배지에 넣고 돼지 미성숙 난자와 배양시켰다. 실시예에서 구체적인 데이터를 도시하지는 않았으나, 난포막이 첨가된 성숙배지에서 체외성숙시킨 난자를 체외수정시키고, CO₂ 배양기에서 7일간 배양한 후 그 발달율을 조사한 결과 난포막을 첨가하지 않았을 때보다 최고 약 175%의 증가율을 나타내어 난포막의 첨가가 수정란의 배반포 발달에 현저한 효과가 있음을 알 수 있었다.

상기 (A)단계에서 체외 성숙된 난자를 이용하여 체외수정 및 체세포 이식에 의한 수정란을 각각 준비하였다.

체외수정은 액상정액을 사용하여 통상의 방법에 의해 이루어 질 수 있으며, 보다 바람직하게는 본 발명의 실시예에 사용된 4℃ 보존 액상 정액을 사용하는 것이 좋다. 본 발명의 4℃ 보존 액상 정액은 조성물 100ml 수용액 당 락토오스 하이드레이트(lactose hydrate) 10~15g, 난황 15~25ml 및 N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine) 0.01~0.1g을 포함하는 4℃ 보존용 인공수정용 돼지정액 희석액을 사용하여 제조된 것으로서, 본 실시예에는 자세한 데이터를 기재하지 않았으나 4℃에서 5일간 보관한 후에도 정자의 운동성, 정상침체율 및 생존능이 우수하여 돼지의 수태율 및 산자수를 높일 수 있을 것으로 기대된다.

체세포 이식에 의한 수정란 생산 역시 당분야에서 공지의 기술을 이용하여 용이하게 실시될 수 있으며, 특정 방법에 한정되는 것은 아니다.

체외수정 수정란 및 체세포 이식 수정란은 16~36시간 각각 체외배양한 후 대리모에 이식한다. 통상 체외수정에 의해 돼지를 생산하는 경우, 체외수정 수정란을 체외에서 5~6일간 배양한 후 양질의 배반포만을 선별하여 수정란을 이식하는 데 반하여, 본 발명에서는 체외수정된 수정란의 경우에도 16~36시간만 체외배양한 후 수정란을 이식하여도 되는 이점이 있다.

체외에서 16~36시간 각각 배양된 체외수정에 의한 수정란과 체세포 이식에 의한 수정란을 개복수술에 의해 1두의 대리모에 동시에 이식한다. 이식에 사용되는 수정란의 총 개수는 150~250개인 것이 바람직하다.

일반적으로 체외에서 성숙된 난자를 이용하여 체외수정과 체세포 복제를 한 후 그 수정란을 7일간 배양하였을 시 배반포 발생율은 약 20% 전후이다. 그러나 실제 수정란 이식 시 착상되는 배반포의 착상율이 2% 내외로 극히 낮은 것을 고려한다면, 수정란을 1일 배양한 후 이식할 경우 성공적인 수태를 위해서는 이론적으로 최소한 250개의 수정란을 이식하여야 한다. 한편 배반포를 이식할 경우에는 수정란을 5-7일간 배양한 후 양질의 배반포만을 선별하여 50개 이상을 주입하여야 한다.

본 발명의 실시예에서 생산된 체세포 복제 수정란만을 역시 실시예와 동일한 수술 방법에 의해 이식하여 복제 돼지의 생산을 시도하였을 경우, 아래 표 1과 같 이 11번의 시도에도 불구하고 임신이 되지 않았다. 상기 시험은 2005년 7월 15일부터 2006년 6월 2일에 걸쳐 실시되었다. 이는 통상 체세포 복제 수정란의 임신율이 극히 낮은 것과 일치되는 결과이다. 그러나 체세포 복제 유래 수정란 100개를 1일 배양된 체외수정 유래 수정란 100개와 동시에 이식한 결과 단 한번의 시도로 임신이 되어 3마리의 자돈이 정상적으로 생산되었다.

체외수정에 사용된 정액 및 체세포 이식에 이용된 체세포의 DNA와 비교한 결과 2마리는 체외수정 수정란 유래의 자돈이며, 1마리는 체세포 복제 수정란 유래의 자돈임을 확인할 수 있었다. 자돈의 생시 체중은 각각 1.2, 2.0 (체외수정 유래), 1.2 (체세포 복제 유래) Kg의 정상체중이었다.

체세포 복제에 의한 돼지의 정상 분만율이 매우 낮음에도 불구하고 단 한번의 시도에 의해 2두의 체외수정 유래의 자돈과 1두의 체세포 복제 자돈이 정상분만된 것은 체외수정 유래의 수정란이 일반적으로 착상이 잘 되지 않는 체세포 복제 수정란의 착상에 유리한 효과를 준 것으로 사료된다. 또한, 체외수정에 의한 수정란을 배반포 형성 전에 단지 100개만 이식하였음에도 체외수정 유래의 자돈이 2마리가 생산 된 것 역시 체세포 이식 수정란의 동시 이식이 체외 수정 유래의 수정란에 대해서 역시 수태율 및 정상분만율을 높이는 데 상호 시너지 효과를 준 것을 의미한다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적인 목적일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. 돼지 미성숙 난자의 수집 및 체외성숙

도축장에서 도살 직후 미경산돈의 난소들을 적출하고 30-35^oC의 0.9% 생리식염수에 담아 실험실로 운반하였다. 난포액과 난구세포(cumulus cell)가 부착된 미성숙 난자를 10 ml 주사기에 18게이지 바늘을 장착하여 2-6 mm 직경의 난포로부터 흡입하여 채취하였다.

흡입된 난포액을 37^oC 수조에 정치시키고, 가라앉은 침전물만을 0.1% polyvinyl alcohol(PVA)이 포함된 TL-HEPES-PVA(114 mM NaCl, 3.2 mM KCl, 2 mM NaHCO₃, 0.4 mM NaH₂PO₄, 0.27 mM glucose, 10 mM sodium lactate, 2 mM CaCl₂·2H₂O, 0.5 mM MgCl₂·6H₂O, 10 mM HEPES, 0.03 mM phenol red, 0.25 mM sodium pyruvate, 0.3% bovine serum albumin (BSA), 75 ㎍/ml penicillin G and 25 ㎍/ml gentamycin sulfate)에 취하여 미성숙 난자만을 골랐다. 미성숙 난자는 난구세포가 치밀하게 부착된 것만을 선택하여 TL-HEPES-PVA로 두 번 세척하고 하기 성숙배지로 다시 두 번 세척하였다. 체외성숙에는 tissue culture medium (TCM) 199 배양배지(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 기본 배지로 사용하였고, 여기에 26.19 mM NaHCO₃, 3.05 mM glucose, 0.91 mM sodium pyruvate, 75 ㎍/ml sodium penicillin G, 50 ㎍/ml streptomycin sulfate 그리고 0.1% PVA를 첨가하여 사용하였다. 미성숙 난자는 2 ml 체외성숙배지에 0.5 ㎍/ml luteinizing hormone (LH), 0.5 ㎍/ml follicular stimulating hormone (FSH), 10 ng/ml epidermal growth factor (EGF), 10% porcine follicular fluids (pFF), 0.57 mM cysteine, 2개의 난포막을 첨가한 것에 옮겨 38.5^oC, 5% CO₂의 항온기(incubator)에서 22시간 배양하고, 그 후 FSH와 LH를 제외한 성숙배지에서 추가로 22시간 배양하였다. 상기 난포막은 도축장에서 수집된 난소에서 도 1에 표시된 → 부분의 볼록한 부분을 수술용 가위로 4-6 mm 직경으로 잘라 성숙배지에 담가 3번 세척한 후 사용하였다.

2. 종모돈 원정액 채취와 액상정액의 제조

원정액(fresh semen)은 일주일에 1회 듀록 (Duroc) 종모돈으로부터 채취하였다. 사출된 농후정액(sperm rich fraction)은 85% 이상의 운동성과 정상첨체율 (normal acrosome)을 나타내는 것만을 이용하였다. 채취 후 2시간에 걸쳐 원정액의 온도를 서서히 실온으로 내렸다. 원정액을 15 ml 시험관(BD Falcon, USA)에 옮기고 실온에서 800×g, 10분간 원심분리하였다. 상층액은 깨끗이 버리고 남은 정자 (sperm)에 실온의 10 ml LEN(100 ml distilled water에 11.0 g lactose hydrate, 20 ml egg yolk, 0.05 g N-acetyl-D-glucosamine이 포함된 것) 희석액을 넣어 잘 섞고 최종 정자농도가 1.0×10⁹ sperm/ml가 되도록 하였다. 액상정액은 4^oC 냉장고에 넣어 5일간 보존하며 사용하였다.

3. 돼지 난자의 체외수정

1에서 44시간 성숙된 난자를 0.1% hyaluronidase가 첨가된 TL-HEPES-PVA에 옮겨 피펫팅(pipetting)하여 확장된 난구세포를 제거하였다. 난구세포가 제거된 난자를 TL-HEPES-PVA에 세척한 후, 실체 현미경하에서 난자내에 극체(polar body)가 방출된 것만을 선별하였다. 다시 TL-HEPES-PVA와 체외수정 배지로 각각 두 번 세척한 후 500 μl 체외수정 배지에 30-40개의 난자를 넣었다. 체외수정 배지로는 Tris-buffered medium(mTBM; 113.1 mM NaCl, 3.0 mM KCl, 10.0 mM CaCl₂, 20.0 mM Tris (hydroxymethyl aminomethane), 11.0 mM glucose, 5.0 mM sodium pyruvate, 1.0 mM caffeine, 75 μg/ml penicillin G, 50 μg/ml streptomycin, 0.57 mM cysteine and 1 mg/ml BSA 포함)을 사용하였으며 4-well multi dish(Nunc, Denmark)에 well당 500 μl씩 분주하고 mineral oil로 피복하여 38.5^oC, 5% CO₂의 항온기에서 4시간 이상 평형 시켜둔 것을 사용하였다.

체외수정을 위하여, 2에서 제조한 500 μl 액상정액을 취하여 실온의 TL-HEPES-PVA 5ml를 넣고 잘 섞은 후 800xg에서 3분간 원심분리하였다. 상층액만을 버린 뒤 TL-HEPES-PVA를 넣고 섞은 뒤 다시 원심분리하고 상층액을 버린 뒤 실온의 체외수정 배지 mTBM로 희석하여 잘 섞었다. 위에서 제조한 체외수정배지에 있는 난자에 정자의 농도가 1×10⁶sperm/ml가 되도록 넣은 뒤 38.5^oC, 5% CO₂의 항온기에서 6시간 동안 공배양하였다.

6시간의 체외수정 후, 난자는 체외배양 배지인 NCSU-23 (108.73 mM NaCl, 4.78 mM KCl, 1.19 mM KH₂PO₄, 1.19 mM MgSO₄·7H₂O, 5.55 mM D-glucose, 1.00 mM glutamine, 7.00 mM Taurine, 5.00 mM hypotaurine, 25.07 mM NaHCO₃, 1.70 mM CaCl₂·2H₂O, 75 μg/ml penicillin G, 50 μg/ml streptomycin)에 배지에 50 μM 2-mercatoethanol, 0.17 mM sodium pyruvate, 2.73 mM sodium lactate를 첨가한 것에 옮기고, 16-36 h 배양시킨 뒤 수정란 이식을 하였다.

4. 체세포 복제

1에서 44시간 성숙된 난자를 0.1% hyaluronidase를 첨가한 TL-HEPES-PVA에 옮겨 피펫팅(pipetting)하여 확장된 난구세포를 제거하였다. 돼지 난자는 micromanipulator (Narishige, Japan)가 장착된 inverted microscope (Nikon, Japan)하에서 미세조작에 의하여 핵을 제거하고, 임신 35일의 돼지에서 적출해낸 태아에서 분리하여 배양된 태아섬유아세포 (fetal fibroblast)를 난자에 주입하였다.

서로 다른 세포에 대한 융합을 위하여 ECM 2001 electrocell manipulator (BTX Inc., San Diego, CA, USA)를 이용하여 1.2 kV/cm, 30 μs, 1 DC pulse로 전기적 자극을 주었다. 융합된 난자는 TCM-199배지에서 3시간 동안 배양하고 다시 NCSU23에 옮겨 16-36시간 배양한 후 수정란 이식에 사용하였다.

5. 수정란 이식 및 자돈 생산

돼지의 발정주기는 대개 20-22일(평균 21일)이며 발정지속시간, 즉 수퇘지 허용시간은 평균 48시간이다. 따라서 하루에 두 번 발정조사를 하여 발정 발견 시작부터 12-24시간 후 수정란 이식을 시술하였다.

수정란 이식을 위하여 대리모 암퇘지에 말레인산 아세프로마진(acepromazine maleate) 35 mg과 황산아트로핀(atropine sulfate) 2.5 mg을 이근부 피하주사하여 진정시키고, 30분 후 말레인산 아세프로마진 20 mg과 염산 케타민(ketamine hydrochloride) 1,200 mg을 귀정맥에 주사하여 전신마취하였다. 전신마취시킨 돼지를 앙와자세로 수술대에 보정하고, 수술부위를 세척, 제모, 소독한 후 최종유두에서 다음번 유두 사이를 정중선을 따라 15 cm 절개하였다. 피하지방을 절개부위에서 좌우로 둔성분리한 후 근육과 복막을 절개하고 자궁, 난관, 난소를 노출시킨 후 수정란 이식을 실시하였다.

1-4세포기의 수정란(체외수정된 수정란 100개와 체세포 복제된 수정란 100개, 즉 총 200개의 수정란을 함께 대리모 1두에 이식)을 내부직경 0.86 mm, 외부직경 1.27 mm의 비독성 수술용 폴리에틸렌 튜브(Intramedic, Clay Adams, USA)를 이용하여 난관심부에 이식하였다. 이식이 끝난 후 자궁, 난관, 난소를 원위치 시키고 복막, 근육, 피부의 순으로 봉합하였다.

수정란 이식 후 115일만인 2006년 9월 25일 정상상태의 자돈 3마리를 생산하였다.

6. DNA 친자감별

자돈, 대리모돈, 액상정액 및 공여세포의 DNA를 분석하여 체외수정 수정란 유래의 자돈인지 체세포 복제 수정란 유래의 자돈인지를 감별하였다. DNA 감별은 축산연구소 동물유전체과(National Livestock Research Institute, 경기도 수원시 권선구 오목천동 564)에 의뢰하여, 돼지 액상정액 DNA 시료, 3마리 돼지의 각 DNA 시료 및 공여세포의 DNA 시료에 대해 하기의 방법으로 13개의 microsatellite marker (MS)를 분석하였다.

1) DNA 추출

자돈 3마리, 대리모 1마리 각각의 귀를 1-2 cm 크기로 잘라 1.5 ml tube에 넣었다. 체외수정에 이용된 정액은 1 ml를 1.5 ml tube에 넣고 microcentrifuger (Bio-spin, Hanil, Korea)에서 10,000 rpm, 20 분간 원심분리하고 남아있는 pellet만을 준비하였다. 체세포 복제 시 이용한 체세포는 배양 중이던 체세포를 0.05% trypsin-EDTA(ethylenediamine tetra acetic acid)로 분리한 뒤 phosphate buffered saline (PBS)로 두 번 세척하여 준비하였다.

상기 준비된 샘플들에 대하여 500 μl DNA extraction buffer(50 nM Tris, 100 mM EDTA, 10% sodium dodecyl sulfate (SDS)) 및 10 mg/ml proteinase K(U302B, Promega, Madison, WI, USA) 50 μl를 각각 첨가하고 위 아래로 섞어 주었다. 55^oC의 수조에서 상기의 각 샘플들을 8-24시간 정도 배양하여 샘플들이 부옇게 되었는지 확인하고, 500 μl PCI(phenol : chloroform : isoamylalcohol = 25 : 24: 1, Cat. C9017, Bioneer, Korea)를 넣어 위아래로 섞어준 후 10,000 rpm, 10 분간 원심분리하였다. 원심분리된 상층액만을 취하여 tube에 넣고 동량의 CI(chloroform : isoamylalcohol = 24: 1 (v/v))를 넣고 위아래로 섞어준 후 10,000 rpm, 10 분간 원심분리하고 다시 상층액만 새 tube에 넣었다. 3 M sodium acetate(pH 6.0)를 상기 상등액의 1/10 만큼 넣고, 이 혼합의 두 배에 해당하는 100% 에탄올을 넣고 잘 섞어 주었다. 상기 혼합물을 실온에 5시간 이상 그대로 두어 침전물을 완전히 가라앉게 한 후 10,000 rpm, 10 분간 원심분리하였다. Clean bench에서 상층액은 버리고 pellet만 취하여 염을 제거하기 위하여 100 μl 70% ethanol을 넣고 잘 흔든 후 버리기 두 번, 100 μl 100% ethanol을 넣고 잘 흔든 후 버리기 한 번 실시하였다. 세척된 pellet을 실온에서 5-20분간 두어 완벽하게 말린 후 고체상태가 된 pellet을 20-50 μl 증류수를 사용하여 녹였다. 상기 수용액의 UV 흡광도를 UV/Visible spectrophotometer(Ultrospec 2100 pro, Amersham Biosciences, Cambridge, UK)를 사용하여 260파장에서 측정하여 optical density(OD)를 얻은 후 DNA의 농도를 계산하여 DNA 최종농도가 1 μg/μl가 되도록 하고 -20^oC에서 보관하여 사용하였다.

2) Genomic DNA 분리 및 농도측정

Genomic DNA는 F₂ 354두의 기준집단으로부터 0.5 M EDTA(pH8.0)가 1 ml 첨가된 tube에 전혈 10 ml을 채취한 후 Wizard genomic DNA purification kit (Promega Co., USA)를 이용하여 추출하였다. 채취된 전혈 10 ml에 30 ml의 cell lysis solution을 첨가한 후 실온에서 10분간 적혈구를 용혈시켰다. 용혈 후, 2,000xg에서 10분간 원심분리하여 백혈구만을 모은 후 pellet을 잘 현탁시키고 10 ml의 nuclei lysis solution에 용해시켰다. 상기 용액을 15분간 37^oC 진탕배양기에서 RNase A(20 μg/ml)로 처리한 뒤, 3.3 ml의 protein precipitation solution을 첨가하고 20초간 강하게 현탁시켰다. 상기 현탁액을 2,000xg에서 10분간 원심분리하여 정제하였고 isopropanol로 DNA를 침전시킨 다음 70% ethanol로 세척, 건조 후 약 50 μl의 Tirs-EDTA buffer (pH 8.0)에 녹여 PCR에 이용하였다.

3) 초위성체 표지인자

유전자형 분석에 사용한 LEPR(Leptin receptor)내에 존재하는 초위성체 표지인자는 Genbank에 등록되어 있는 염기서열정보(Accession No. AF184172)를 근거로 선발하였으며, (CA)n의 nucleotide 반복서열 형태를 가지고 있었다. PCR을 위한 primer는 forward primer 5'-aatggaaactcttcccagct-3'(서열번호 1)와 reverse primer 5'-cattcgaactgttcattgccat-3'(서열번호 2)을 각각 선발 합성하여 사용하였다.

4) PCR에 의한 DNA 증폭

PCR 반응액 조성은 PCR reaction buffer(10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂)와 2.5 mM dNTPs, 3 pmol fluorescent dye labeling primer paris, 10 ng의 template DNA, 0.5 U Tag DNA polymerase(Takara Shuzo Co., Shiga, Japan)와 ddH₂O를 사용하였으며 총 반응액은 10 μl로 하였다. PCR 반응에는 GeneAmp PCR System 9600(Perkin-Elmer Co., USA)를 사용하였고, PCR 조건은 94^oC에서 5분간 pre-denaturation 한 후 94^oC에서 30초(denaturation), 60^oC에서 40초(annealing), 72^oC에서 1분(extention)을 35 cycles 수행한 후 마지막으로 72^oC에서 10분간 최종 extention 과정을 수행하였다. PCR 증폭 산물은 증폭된 단편의 크기가 예상된 allele size 범위내에 존재하는지, PCR 조건의 적정성 여부를 확인하기 위하여 EtBr(ethidium bromide)이 포함된 2% agarose gel에 전기영동하고 UV 상에서 관찰하였다.

5) 유전자형 분석

PCR 산물을 적정량의 DI(deionized)수로 희석하고 DNA : formamide : size standard(Genescan-350 TAMRA)를 1 μl : 12 μl : 0.5 μl 비율로 혼합하여 95^oC이상에서 3분간 denaturation 한 후, ABI 310 Genetic Analyzer(Perkin-Elmer Co., USA)를 이용하여 분석하였다. GeneScan software version 2.1(Perkin-Elmer Co., USA)을 이용하여 PCR 산물인 DNA 절편의 양과 크기에 대한 자료를 모아 수집하였다. 전기영동시 Performance Optimized Polymer 4(POP4)(PE Applied Biosystems)와 10x Buffer(with EDTA)를 1x로 희석하여 사용하였고, run time은 22분으로 하였다. 유전자형은 Genotyper software version 2.5 (Perkin-Elmer Co., USA)를 이용하여 분석하였다.

6) DNA 분석결과

자돈 3마리와 체외수정에 이용한 정자, 체세포 복제 시 공여세포로 사용한 체세포의 DNA를 분석하여 비교한 결과, 하기 표 1에 기재된 것과 같이 자돈 2마리의 경우에는 수정에 이용한 정자와 마이크로 새털라이트 (microsatellites) 마커 12종에 대하여 거의 모두 일치하였으며, 자돈 1마리는 마이크로 새털라이트 (microsatellites) 마커 12종이 모두 일치하였다.

이로써, 돼지 1과 2(도 2의 A 및 B)는 체외수정에 의한 수정란 유래의 돼지임을 돼지 3(도 2의 C)은 체세포 복제에 의한 수정란 유래의 돼지임을 확인할 수 있었다.

이상과 같이 본 발명에 의하면 체외수정된 수정란과 체세포 복제에 의한 수정란을 동시 이식하는 것에 의해, 정상 분만율이 극히 낮은 복제돼지의 정상 분만을 가능하게 한다. 뿐만 아니라 체외수정에 의한 수정란의 체외 배양 기간을 대폭 단축하고 적은 수의 수정란으로부터도 정상 분만이 가능하고, 체외수정된 수정란과 체세포 복제 수정란 유래의 자돈을 동시에 생산할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

(A) 도축 돼지의 미성숙 난자를 채취하여 배양하는 단계;

(B) a) (A)단계에서 준비된 성숙난자와 액상정액의 체외수정에 의한 수정란 및 b) (A)단계에서 준비된 성숙난자를 탈핵하고 공여 체세포를 탈핵 난자에 이식하는 것에 의한 체세포 이식 수정란을 준비하여 각각 배양하는 단계; 및

(C) (B) 단계에서 준비된 체외수정에 의한 수정란과 체세포 이식에 의한 수정란을 동시에 한 마리의 대리모에 이식하는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지의 생산 방법.
제 1 항에 있어서,

(A) 단계의 미성숙 난자의 배양 배지는 4~6mm크기의 난포막을 2~6개 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지의 생산 방법.
제 1 항에 있어서,

(B) 단계의 체외수정에 의한 수정란은 조성물 100ml 수용액 당 락토오스 하이드레이트(lactose hydrate) 10~15g, 난황 15~25ml 및 N-아세틸-D-글루코사민(N- acetyl-D-glucosamine) 0.01~0.1g을 포함하는 4℃ 보존용 인공수정용 돼지정액 희석액을 사용하여 제조된 액상정액을 이용하여 제조된 것임을 특징으로 하는 돼지의 생산 방법.
제 1 항에 있어서,

체외수정 수정란 및 체세포 이식 수정란은 16~36시간 각각 체외배양한 후 대리모에 이식하는 것을 특징으로 하는 돼지의 생산 방법.
제 1 항에 있어서,

(C)단계의 이식에 사용되는 수정란의 총 개수는 150~250개인 것을 특징으로 하는 돼지의 생산 방법.