DE69920693T2

DE69920693T2 - Verfahren zur herstellung von immunoglobulinen zur intravenösen verabreichung und anderen immunoglobulin-produkten

Info

Publication number: DE69920693T2
Application number: DE69920693T
Authority: DE
Inventors: Inga Laursen; Boerge Teisner
Original assignee: Statens Serum Institut SSI
Current assignee: CSL Behring AG
Priority date: 1998-06-09
Filing date: 1999-06-09
Publication date: 2005-11-03
Anticipated expiration: 2019-06-10
Also published as: EP2270044B1; TR200100303T2; DE69920693D1; KR100501263B1; SK18662000A3; CZ297199B6; PL196770B1; HU228076B1; JP2011102314A; CA2330170A1; BR9911131A; NZ509135A; CN1311797A; EP1084147A1; SK288128B6; RU2001101454A; IL140155A; PL344671A1; CZ20004534A3; EP2272870B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Reinigen von Immunglobulin G (IgG) aus einer rohen Plasmaproteinfraktion. Die Erfindung betrifft auch ein Immunglobulinprodukt und die Verwendung eines solchen Immunglobulinprodukts für medizinische Zwecke.
Hintergrund der Erfindung
Normales menschliches Immunglobulin (HNI) zur Verwendung zur Verhütung und Behandlung einer Anzahl infektiöser Krankheiten wurde in den späten 40er Jahren eingeführt. HNI, das durch eine Fraktionierungsmethode mit kaltem Ethanol hergestellt wurde gemäß Cohn & Oncley (E. Cohn et al. (1946), J. Am. Chem. Soc., 68, 459–475), (Oncley et al. (1949), J. Am. Chem. Soc., 71, 541–550) und anschließend auch durch die Modifikation von Kistler und Nitschmann (P. Kistler und N.S. Nitschmann (1952), Vox Sang, 7, 414–424) erwies sich sowohl als effizient als auch sicher gegen eine Übertragung einer Virusinfektion, wenn es subcutan oder intramuskulär verabreicht wurde.
Der angeborene oder erworbene vollständige oder teilweise Mangel an Immunglobulin (primäres bzw. sekundäres Immunmangelsyndrom) manifestiert sich durch häufige einfache und schwere Infektionen, insbesondere bakterieller Art. Die Verhütung solcher Infektionen wurde bisher erreicht durch wiederholte intramuskuläre oder subcutane Injektionen großer Mengen an HNI bis zu mehrere Male pro Woche als lebenslange Behandlung, was sehr schmerzhaft ist, wenn das Medikament intramuskulär gegeben wird.
In den frühen 60er Jahren wurde daher die Verabreichung von HNI auf dem intravenösen Weg versucht. Versuche zeigten, dass etwa 5% der gesunden Freiwilligen und etwa 95% der Patienten mit einem Immunglobulinmangel sofort Gegenreaktionen entwickelten, die von Dyspnoe bis Kreislaufschock variierten und so schwerer Art waren, dass die intravenöse Verabreichung von HNI aufgegeben wurde.
Es stellte sich heraus, dass der Grund für die oben erwähnten Gegenreaktionen Aggregate von Immunglobulinen waren, die neben anderen Effekten das Komplementsystem stark aktivierten. Dies zeigte sich insbesondere bei Patienten, denen Immunglobuline fehlten. Besonders schwere Nebenwirkungen anaphylaktischer Art waren bei Patienten zu sehen, die Antikörper gegen IgA entwickelten. Demzufolge wurden Methoden entwi ckelt, bei denen Aggregatbildung vermieden wurde und/oder diese Aggregate während des Herstellungsverfahrens entfernt wurden, und vor etwa 20 Jahren wurde die erste Generation eines Immunglobulins für intravenöse Verabreichung (IVIG) getestet und als geeignet befunden.
Der ursprüngliche Zweck von IVIG war es, infektiöse Episoden bei Patienten mit einem angeborenen oder erworbenen vollständigen oder teilweisen Mangel an Immunglobulinen zu lindern und die Unannehmlichkeiten im Zusammenhang mit der Verabreichung von HNI auszuräumen. Ein weiterer Vorteil von IVIG ist es, dass große Dosen an Immunglobulin innerhalb kurzer Zeit gegeben werden können und es dadurch möglich wird, sehr schnell ausreichend hohe Blutkonzentrationen zu erhalten. Besonders wenn schwere bakterielle Infektionen behandelt werden, ist es wichtig, an den Infektionsstellen schnell hohe Konzentrationen zu etablieren.
In den letzten Jahren hat sich IVIG weiterhin als wirksam bei anderen schweren Krankheiten erwiesen, deren Behandlung ansonsten schwierig sein kann, z.B. Blutungen, die durch das Verschwinden der Blutplättchen auf immunologischer Basis verursacht werden, idiopathische Thrombozytopenie (ITP), bei einigen seltenen Krankheiten, wie Kawasaki-Syndrom und einer Anzahl von Autoimmunkrankheiten, wie Polyradiculitis (Guillain-Barré-Syndrom). Andere Krankheiten, deren Behandlung bis zum heutigen Tag schwierig ist, werden derzeit klinischen Versuchen mit IVIG unterzogen. Der Wirkungsmechanismus dieser Krankheiten wurde nur teilweise geklärt. Es wird angenommen, dass sich die Wirkung auf so genannte immunmodulierende Eigenschaften von IgG bezieht, z.B. eine Blockierung von Fcγ-Rezeptoren an phagozytischen Zellen, einen erhöhten Metabolismus von IgG, eine Herabregulierung der Produktion von Cytokinen und Interferenz mit einem angenommenen Netzwerk aus Idiotypen/Antiidiotypen, das insbesondere relevant ist für die Neutralisierung einer Autoimmunreaktivität.
Die erste Generation von IVIG wurde hergestellt durch Pepsinspaltung des Ausgangsmaterials (Cohn-Fraktion II), wobei der Zweck der Spaltung die Entfernung von Immunglobulinaggregaten ist. Säulenchromatographiestufen waren in diesem Prozess nicht enthalten. Das Produkt musste gefriergetrocknet werden, um es über einen vernünftigen Zeitraum stabil zu halten und es wurde direkt vor Verwendung gelöst.
Das Ausgangsmaterial für IVIG war HNI, das sich im Hinblick auf die Übertragung von Viren als sicher erwiesen hatte, wenn es für die intramuskuläre Injektion verwendet wurde. Somit wurde IVIG als sicher betrachtet. Nach mehreren Jahren der klinischen Verwendung wurde jedoch überraschenderweise gezeigt, dass IVIG-Produkte von einigen Herstellern eine Übertragung von Hepatitis-C-Virusinfektion verursachen. Studien, um das Schicksal von Viren während der Herstellung von HNI zu beleuchten, zeigten, dass die Entfernung von Virus in dem Fraktionierungsverfahren von Plasma zu HNI mäßig ist. Die Sicherheit von HNI für die intramuskuläre Verwendung beruht wahrscheinlich auf der Tatsache, dass es schützende Immunglobuline enthält. In Kombination mit dem mäßigen Volumen, das injiziert wird, und dem intramuskulären Verabreichungsweg können diese schützenden Immunglobuline Viren in Plasma neutralisieren und nicht-infektiös machen. Besonders wenn große Dosen an Immunglobulin intravenös gegeben werden, können Virusinfektionen auftreten, wie in den frühen 90er Jahren gezeigt. Es wurde daher erkannt, dass die Produktionsprozesse eine oder mehrere wohl definierte Virusinaktivierungs- und/oder Entfernungsstufen aufweisen sollten.
Eine zweite Generation von IVIG basierend auf ungespaltenen und unmodifizierten Immunglobulinmolekülen mit geringer antikomplementärer Aktivität und hoher Stabilität wurde Mitte der 80er Jahre eingeführt, aber immer noch in Form eines gefriergetrockneten Produktes. Dieses IVIG wurde mithilfe mehrerer Chromatographiestufen gereinigt. Produkte dieser Art dominieren derzeit den Markt für IVIG. Die erste und zweite Generation von IVIG erscheint daher in Form gefriergetrockneter Pulver, die direkt vor der Verwendung gelöst werden.
Die Auflösung von gefriergetrocknetem IVIG ist langsam (bis zu 30 Minuten für ein Gläschen). Mehrere Anteile müssen oft für einen Patienten gelöst werden. Da es für die Verwender von hoher Priorität ist, ein IVIG in zur Verwendung fertiger Lösung zu haben, wurden flüssige Produkte auf dem Markt eingeführt. Weiterhin gibt es noch einen Bedarf für die Verbesserung des Produktionsverfahrens, um hoch gereinigte stabile und voll native IVIG-Präparate mit hoher klinischer Wirksamkeit und weniger negativen Wirkstoffreaktionen zu erhalten. Ein weiterentwickeltes und verbessertes Verfahren zur Reinigung von IgG aus rohem Plasma oder einer Plasmaproteinfraktion für ein virussicheres flüssiges IVIG-Produkt ist daher erforderlich. Schließlich sollte das Verfahren so ausgebildet sein, dass es für eine Produktion in großem Maßstab verwendet werden kann.
Das in der vorliegenden Anmeldung beschriebene Reinigungsverfahren führt zu einem flüssigen Immunglobulinprodukt für die intravenöse Verabreichung, das als hoch gereinigte voll native biologisch aktive doppelt virusinaktivierte und stabile neue Generation von IVIG gekennzeichnet werden kann, das kein oberflächenaktives Polyethylenglycol (PEG) oder Albumin als Stabilisator enthält.
DE 4118912C1 offenbart ein Verfahren zur Reinigung von monoklonalen IgG-Molekülen, die aus Hybridomazellen erhalten wurden. Dieses Verfahren weist die Stufen (b) oder (d), wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, nicht auf und das IgG-Produkt enthält keine polyklonalen IgG aller Unterklassen IgG₁, IgG₂, IgG₃ und IgG₄, die für die Behandlung z.B. von Immunmangel- und Autoimmunkrankheiten geeignet sind, wie es das IgG-Produkt der vorliegenden Erfindung ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Reinigungsverfahren und ein verbessertes flüssiges Immunglobulinprodukt, das unter anderem intravenös verabreicht werden kann.
Ein Immunglobulinprodukt, das mit der Methode der vorliegenden Erfindung erhalten wird, könnte als IVIG der dritten Generation bezeichnet werden. Das Verfahren ist durch die folgenden Bedingungen zur Fraktionierung gekennzeichnet: Pepsinspaltung wird vermieden, Aggregate und Teilchen werden durch Ausfällung entfernt (eine Prozessstufe, die validiert ist als Virusentfernungsstufe), eine weitere Reinigung wird erreicht durch säulenchromatographische Ionenaustauschmethoden, S/D-Behandlung wird eingeführt als virusinaktivierende Stufe und das Präparat wird als flüssiges Produkt formuliert.
Aufgrund der verbesserten Reinheit des mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Immunglobulinproduktes im Vergleich zu Produkten des Standes der Technik ist die Zugabe von Stabilisatoren, wie nichtionischen Detergenzien, PEG oder Albumin nicht notwendig, um eine Aggregation von IgG während der Lagerung des IVIG als flüssiges Produkt zu vermeiden. Das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche Produkt hat eine höhere Qualität als Produkte des Standes der Technik und liefert verbesserte klinische Wirkungen und unerwünschte negative Wirkungen sind tatsächlich nicht vorhanden.
Detaillierte Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Immunglobulin G (IgG) aus einer rohen immunglobulinhaltigen Plasmaproteinfraktion, wobei das Verfahren die Stufen aufweist:

a) Herstellen einer wässrigen Suspension der Rohimmunglobulin enthaltenden Plasmaproteinfraktion;
b) Hinzufügen eines wasserlöslichen, im Wesentlichen nicht-denaturierenden Proteinausfällungsmittels zu der Suspension aus Schritt (a) in einer Menge, die hinreichend ist, um das Ausfällen eines hohen Anteils von Nicht-Immunglobulin-G-Proteinen, aggregierten Immunglobulinen und Partikeln, einschließlich potenziell infektiöser Partikel wie Viruspartikel zu bewirken, ohne eine wesentliche Ausfällung von monomerem Immunglobulin G zu bewirken, wobei eine Mischung aus einem festen Niederschlag und einem flüssigen Überstand gebildet wird;
c) Gewinnen eines gereinegten bzw. geklärten, Immunglobulin G enthaltenden Überstandes aus der Mischung von Schritt (b);
d) Aussetzen des geklärten, Immunglobulin G enthaltenden Überstandes aus Schritt (c) einem Anionenaustauscherharz und nachfolgend einem Kationenaustauscherharz, wobei das Anionenaustauscherharz das Kationenaustauscherharz in Reihe verbunden sind und wobei der Puffer, der für die Anionenaustauschchromatographie und die Kationenaustauschchromatographie verwendet wird, der gleiche Puffer ist, und der pH-Wert des Puffers geringer als 6,0 ist.
e) Auswaschen von Proteinkontaminanten und dem Proteinfällungsmittel von dem Kationenaustauscherharz von Schritt (d) mit einem Puffer, der einen pH-Wert und eine Ionenstärke besitzt, die hinreichend dafür sind, die Kontaminanten von dem Harz zu entfernen, ohne eine erhebliche Elution von Immunglobulin G zu bewirken;
f) Eluieren von Immunglobulin G von dem Kationenaustauscherharz von Schritt (e) mit einem im Wesentlichen nicht-denaturierenden Puffer, der einen pH-Wert und eine Ionenstärke besitzt, die hinreichend dafür sind, eine effiziente Elution des Immunglobulin G zu bewirken, wodurch ein Immunglobulin G enthaltendes Eluat gewonnen wird;
g) Durchführen einer Dia-/Ultrafiltration mit dem das Immunglobulin G enthaltenden Eluat aus Schritt (f), um das Eluat zu konzentrieren und/oder zu dialysieren und ggf. Hinzufügen eines stabilisierenden Agens;
h) Hinzufügen einer viruziden Menge eines Virus-inaktivierenden Mittels zu der Immunglobulin G enthaltenden, dia-/ultrafiltrierten und ggf. stabilisierten Fraktion aus Schritt (g), was eine im Wesentlichen virussichere, Immunglobulin G enthaltende Lösung ergibt.
i) Aussetzen der Immunglobulin G enthaltenden Lösung von Schritt (h) einem Anionenaustauscherharz und nachfolgend einem Kationenaustauscherharz;
j) Waschen des Kationenaustauscherharzes aus Schritt (i) mit einem Puffer, der einen pH-Wert und eine Ionenstärke besitzt, die hinreichend dafür sind, die Proteinkontaminationen und das Virus-inaktivierende Mittel von dem Harz auszuwaschen, ohne eine erhebliche Elution von Immunglobulin G zu bewirken;
k) Eluieren von Immunglobulin G von dem Kationenaustauscherharz aus Schritt (j) mit einem im Wesentlichen nicht-denaturierenden Puffer, der einen pH-Wert und eine Ionenstärke besitzt, die hinreichend dafür sind, eine effiziente Elution des Immunglobulin G zu bewirken, wodurch ein Immunglobulin G enthaltendes Eluat gewonnen wird; und
l) Unterwerfen des Immunglobulin G enthaltenden Eluates aus Schritt (k) einer Dia-/Ultrafiltration, um die Ionenstärke zu verringern und Immunglobulin G aus der Lösung zu konzentrieren, und Einstellen der Osmolalität durch Hinzufügen eines Saccharids.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Immunglobulinprodukt, das mit dem Verfahren erhalten wurde und die Verwendung des Produktes für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Säugetiers mit PID (Primary Immune Deficiency, Primäre Immunschwäche), SID (Secondary Immune Deficiency, Sekundäre Immunschwäche), ITP (idiopathische Thrombocytopenie), Polyradiculitis, periphere Polyneuropathien, Kawasaki-Krankheit, Polymyositis, schweren chronischen Autoimmunkrankheiten, chronischer entzündlicher Entmarkungspolyneuropathie (CIDP), multifokaler motorischer Neuropathie, Multipler Sklerose, Myasthenia Gravis, Pseudomyasthenie, Optikusneuritis, Epilepsie, Abortus habitualis, primärem Antiphospholipidsyndrom, rheumatoider Arthritis bzw. Poly arthritis, systemischem Lupus erythematodes, systemischer Sklerodermie, Vaskulitis, Wegener-Granulomatose, Sjögren-Syndrom, juveniler Polyarthritis, Autoimmunneutropenie, autoimmunhaemolytischer Anaemie, Neutropenie, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Zöliakie-Krankheit, Asthma, septischem Schocksyndrom, chronischem Ermüdungssyndrom, Psoriasis, toxischem Schocksyndrom, Diabetes, Sinuitis, dilatierter Kardiomyopathie, Endokarditis, Atherosklerose, und von Erwachsenen mit AIDS und Bakterieninfektionen.
Das Ausgangsmaterial des vorliegenden Reinigungsverfahrens ist eine immunglobulinhaltige rohe Plasmaproteinfraktion. Das Ausgangsmaterial für das Reinigungsverfahren kann normales menschliches Plasma sein oder kann von Spendern mit hohen Titern an spezifischen Antikörpern stammen, z.B. Hyperimmunplasma. In der vorliegenden Beschreibung soll der Ausdruck "immunglobulinhaltige Plasmafraktion" alle möglichen Ausgangsmaterialien für das vorliegende Verfahren einschließen, z.B. kryopräzipitatfreies Plasma oder kryopräzipitatfreies Plasma, aus dem verschiedene Plasmaproteine, wie Faktor IX und Antithrombin, entfernt worden sind, verschiedene Cohn-Fraktionen und Fraktionen, die durch Ausfällungsverfahren mit PEG (Polson et al. (1964), Biochem. Biophys. Acta, 82, 463–475; Polson und Ruiz-Bravo (1972), Vox Sang, 23, 107–118) oder mit Ammoniumsulfat erhalten wurden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Plasmaproteinfraktion Cohn-Fraktion II und III, aber es können auch Cohn-Fraktion II oder die Cohn-Fraktionen I, II und III verwendet werden. Die verschiedenen Cohn-Fraktionen werden bevorzugt aus Plasma hergestellt mit einer Standard-Cohn-Fraktionierungsmethode, im Wesentlichen wie von Kistler-Nitschmann modifiziert. Zusätzlich zu Immunglobulinen enthalten die Cohn-Fraktionen z.B. Fibrinogen, α-Globuline und β-Globuline einschließlich verschiedener Lipoproteine, die bevorzugt während des nachfolgenden Reinigungsverfahrens entfernt werden sollten. Eine Filterhilfe kann oder kann nicht vorhanden sein abhängig von der Isolierungsmethode, die verwendet wird, um die Cohn-Fraktionen zu erhalten (z.B. Zentrifugation oder Filtration).
Die erste Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens beinhaltet das Herstellen einer wässrigen Suspension aus einer immunglobulinhaltigen Plasmaproteinfraktion, wobei die IgG-Konzentration in der Suspension so ausreichend hoch ist, dass während der nachfolgenden Ausfällungsstufe ein Hauptanteil der Nicht-IgG-Proteine, insbesondere solche mit höherem Molekulargewicht, der aggregierten Immunglobuline und anderer aggregierter Proteine ebenso wie potenziell infektiöser Teilchen ausfallen ohne eine wesentliche Ausfällung von monomerem IgG. Dies wird allgemein erreicht, wenn die Konzentration des IgG in der gepufferten und filtrierten Suspension mindestens etwa 4 g/l vor Zugabe des Ausfällmittels ist. Es sollte in Betracht gezogen werden, dass der Einfluss der Proteinkonzentration ebenso wie der pH-Wert und die Temperatur der Suspension auf die Ausfällung von dem ausgewählten Ausfällmittel abhängen.
Es ist bevorzugt, dass die Plasmaproteinfraktion in Wasser und/oder Puffer bei einer im Wesentlichen nicht denaturierenden Temperatur und einem im Wesentlichen nicht denaturierenden pH-Wert suspendiert wird. Der Ausdruck "im Wesentlichen nicht denaturierend" bedeutet, dass der Zustand, auf den sich der Ausdruck bezieht, keinen wesentlichen irreversiblen Verlust der funktionellen Aktivität von IgG-Molekülen verursacht, z.B. den Verlust der Antigenbindungsaktivität und/oder den Verlust der biologischen Fc-Funktion (siehe Beispiel 2).
Vorteilhafterweise wird die Plasmaproteinfraktion in Wasser suspendiert, das mit mindestens einem nicht denaturierenden Puffersystem angesäuert ist, bei Volumina, die das 6- bis 9-fache, bevorzugt 7- bis 8-fache der Plasmaproteinfraktion sind. Der pH-Wert der immunglobulinhaltigen Suspension wird bevorzugt auf einem Wert von unter 6 gehalten, z.B. in dem Bereich von 4,0 bis 6,0, bevorzugt 5,1 bis 5,7, am meisten bevorzugt etwa 5,4, um die optimale Löslichkeit des Immunglobulins und die optimale Wirkung der nachfolgenden PEG-Ausfällungsstufe sicherzustellen. Jeder geeignete saure Puffer kann verwendet werden, aber das Puffersystem enthält bevorzugt mindestens einen der folgenden Puffer und Säuren: Natriumphosphat, Natriumacetat, Essigsäure, HCl. Personen mit Fachwissen auf diesem Gebiet erkennen, dass zahlreiche andere Puffer verwendet werden können.
Die Immunglobulinsuspension wird bevorzugt auf einer kalten Temperatur gehalten, unter anderem um eine erhebliche Proteindenaturierung zu verhindern und die Proteaseaktivität zu minimieren. Die Immunglobulinsuspension und Wasser ebenso wie zugegebenes Puffersystem haben bevorzugt die gleiche Temperatur in einem Bereich von 0 bis 12°C, bevorzugt 0 bis 8°C, am meisten bevorzugt 1 bis 4°C.
Die Suspension einer mit Ethanol ausgefällten Paste enthält relativ große Mengen an aggregiertem Proteinmaterial. Gegebenenfalls wird die immunglobulinhaltige Suspension filtiert, um z.B. große Aggregate, Filterhilfe, falls vorhanden, und restliche nicht aufgelöste Paste zu entfernen. Die Filtration wird bevorzugt mithilfe von Tiefenfiltern durchgeführt, z.B. C150 AF, AF 2000 oder AF 1000 (Schenk), 30LA (Cuno) oder ähnlichen Filtern. Die Entfernung von Aggregaten, Filterhilfe, falls vorhanden, und restlichem nicht aufgelösten Proteinmaterial könnte auch durch Zentrifugation durchgeführt werden.
Mindestens ein wasserlösliches im Wesentlichen nicht denaturierendes Proteinausfällungsmittel wird der immunglobulinhaltigen filtrierten Suspension in einer solchen Menge zugegeben, die ausreicht, um die Ausfällung eines hohen Anteils an Proteinen mit hohem Molekulargewicht, Lipoproteinen, aggregierten Proteinen und darunter aggregierten Immunglobulinen zu verursachen. Anderes teilchenförmiges Material, wie potenziell infektiöse Teilchen, z.B. Viruspartikel, werden auch ausgefällt, ohne eine wesentliche Ausfällung von monomerem IgG zu verursachen. Der Ausdruck "infektiöse Teilchen" bzw. "infektiöse Partikel" im vorliegenden Zusammenhang beinhaltet z.B. Viruspartikel (z.B. Hepatitis-Viren, HIV1 und HIV2) und Bakterien. Im Wesentlichen nicht denaturierende wasserlösliche Proteinausfällungsmittel sind auf dem Gebiet der Proteinreinigung wohl bekannt. Solche Ausfällungsmittel werden für die Proteinfraktionierung verwendet, was zu einer teilweisen Reinigung von Proteinen aus Suspensionen führt. Geeignete Proteinausfällungsmittel zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren schließen verschiedene Molekulargewichtsformen von PEG, Caprylsäure und Ammoniumsulfat ein. Der Fachmann auf diesem Gebiet erkennt, dass verschiedene andere nicht denaturierende wasserlösliche Ausfällmittel als alternative Mittel zum Ausfällen verwendet werden können. Der Ausdruck "Zugabe eines Proteinausfällungsmittel" und Varianten dieses Ausdrucks deuten auf die Zugabe eines oder mehrerer Arten von Proteinausfällungsmitteln hin.
Ein bevorzugtes Ausfällungsmittel ist das organische Mittel PEG, insbesondere PEG in einem Molekulargewichtsbereich von 3.000 bis 8.000 Da, z.B. PEG 3350, PEG 4000, PEG 5000 und insbesondere PEG 6000 (die Zahlen dieser spezifischen PEG-Verbindungen bedeuten ihr mittleres Molekulargewicht). Der Vorteil der Verwendung von PEG als Ausfällmittel ist es, dass PEG nichtionisch ist und proteinstabilisierende Eigenschaften hat, z.B. ist PEG in geringer Konzentration wohl bekannt als Stabilisator von IVIG-Produkten. Die Ausfällungsstufe dient auch als Virusentfernungsstufe. PEG konzentriert und fällt Viren unabhängig von ihrer Art, Größe und Oberflächenschicht aus.
Eine gegebene Menge an Proteinausfällungsmittel wird der filtrierten Suspension zugegeben, um den Hauptanteil an Proteinen mit hohem Molekulargewicht und aggregierten Proteinen und Teilchen auszufällen, ohne eine wesentliche Ausfällung von monomerem IgG, das eine klare Überstandslösung bildet. Das Proteinausfällungsmittel kann als festes Pulver oder als konzentrierte Lösung zugeben werden.
Für PEG als Ausfällmittel trifft als allgemeine Regel zu, dass, je höher das Molekulargewicht der Verbindung ist, desto geringer die Konzentration an PEG ist, die notwendig ist, um das Protein zum Ausfällen zu bringen. Wenn PEG 3350, PEG 4000 oder bevorzugt PEG 6000 verwendet wird, liegt die Konzentration des Ausfällmittels in der filtrierten Sus pension vorteilhafterweise in einem Bereich von 3 bis 15 Gew.-%, z.B. 4 bis 10% (wie etwa 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%), wobei 6% am meisten bevorzugt ist. In der Ausfällstufe wird das Ausfällverfahren fortschreiten gelassen, bis mindestens ein Gleichgewicht zwischen fester und flüssiger Phase erreicht ist, z.B. gewöhnlich mindestens 2 Stunden, z.B. etwa 2 bis etwa 12 Stunden, bevorzugt etwa 4 Stunden. Während der Ausfällung wird die Suspension bevorzugt auf geringer Temperatur gehalten (z.B. weniger als etwa 12°C, z.B. weniger als etwa 10°C, bevorzugt zwischen 2 und 8°C). Die am besten geeignete Temperatur hängt von der Art des Proteinausfällmittels ab.
Nach Vervollständigung der Proteinausfällung wird ein geklärter Überstand, der fast ausschließlich IgG in monomerer Form enthält, aus der Mischung der von festem Niederschlag und flüssigem Überstand, der bei der Ausfällung entsteht, gewonnen. Die Gewinnung kann mit üblichen Techniken zur Abtrennung von flüssiger von fester Phase, z.B. Zentrifugation und/oder Filtration, durchgeführt werden. Bevorzugt wird eine Durchflusszentrifuge (z.B. Westfalia) mit 1000 bis 5000 g Kraft verwendet.
Gegebenenfalls wird der gewonnene, geklärte IgG-haltige Überstand tieffiltriert, um größere Teilchen und Aggregate zu entfernen. Gegebenenfalls wird anschließend eine Sterilfiltration durchgeführt unter Verwendung eines üblichen Sterilisationsfilters (z.B. ein 0,22 μm-Filter von Millipore oder Sartorius), der z.B. Bakterien aus der Lösung entfernt.
Der geklärte und gegebenenfalls filtrierte IgG-haltige Überstand wird mindestens einer Stufe, z.B. zwei Stufen, aber gegebenenfalls mehr Stufen einer Anionen- und Kationenaustauschchromatographie unterzogen, um einen wesentlichen Anteil von verbleibenden Nicht-IgG-Kontaminanten zu entfernen, z.B. IgA, Albumin ebenso wie Aggregate. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der geklärte und gegebenenfalls filtrierte IgG-haltige Überstand auf ein Anionenaustauschharz aufgebracht und anschließend auf ein Kationenaustauschharz, die in zwei Säulen in geeigneten Dimensionen gepackt sind.
Wenn die Ionenaustauschchromatographiestufen zur Reinigung von IgG durchgeführt werden, ist es bevorzugt, dass die Bedingungen, z.B. pH-Wert und Ionenstärke, so ausgewählt werden, dass ein Hauptanteil der Kontaminanten (z.B. Nicht-IgG-Proteine, wie IgA, Transferin, Albumin und Aggregate) in der aufgebrachten Lösung an das Anionenaustauschharz binden, wohingegen im Wesentlichen kein IgG an dem Anionenaustauschharz adsorbiert. Im Hinblick auf die nachfolgende Kationenaustauschchromatographie führen die bevorzugten ausgewählten Bedingungen zu einer Bindung von im Wesentlichen allen IgG-Molekülen, die in der Lösung vorhanden sind, die auf das Kationenaustauschharz aufgetragen wurde. Proteinkontaminanten adsorbieren nicht an dem Anionenaustauschharz und das Ausfällmittel wird beim nachfolgenden Waschen des Kationenaustauschharzes entfernt.
Bei dem vorliegenden Verfahren sind Anionenaustauschharz und Kationenaustauschharz in Reihe geschaltet. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Ausdruck "in Reihe geschaltet" bzw. "in Reihe verbunden", wenn er im Zusammenhang mit den Ionenaustauschharzen verwendet wird, dass die Proteine, die durch das Ionenaustauschharz geleitet werden, direkt auf das Kationenaustauschharz gebracht werden ohne Veränderung von Puffer oder anderen Bedingungen.
Aus verschiedenen Gründen ist es vorteilhaft, dass die Ionenaustausch- und Kationenaustauschchromatographie in einer Stufe durchgeführt wird unter Verwendung von in Serie geschalteten Chromatographiesäulen statt zwei unabhängigen Chromatographiestufen, z.B. mit unterschiedlichen Pufferzusammensetzungen. Die Verwendung von zwei in Serie geschalteten Chromatographiesäulen macht den Betrieb praktischer, z.B. gibt es keine Notwendigkeit für eine zwischengeschaltete Stufe zur Sammlung der IgG-haltigen Fraktion zwischen den zwei Ionenaustauschchromatographiemethoden, oder möglicherweise eine Einstellung von pH-Wert und Ionenstärke. Außerdem wird der Pufferstrom auf beide Säulen gleichzeitig aufgebracht und die zwei Säulen werden mit dem gleichen Puffer equilibriert. Es wird jedoch in Betracht gezogen, dass es auch möglich ist, die Chromatographiestufe in zwei Stufen durchzuführen, d.h. Anionenaustauschharz und Kationenaustauschharz nicht in Reihe zu schalten. Die Durchführung der Chromatographie in zwei Stufen wäre jedoch, wie oben erwähnt, aufwändiger im Vergleich dazu, die Ionenaustauschharze in Reihe zu schalten.
Derzeit wird angenommen, dass der hohe Reinheitsgrad, der hohe Gehalt an IgG-Monomeren und -Dimeren und der geringe Anteil an IgA in dem IVIG-Produkt der Erfindung teilweise auf der Verwendung von zwei in Reihe geschalteten Chromatographiesäulen beruhen.
Wie es dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist, können Ionenaustauscher auf verschiedenen Materialien im Hinblick auf die Matrix ebenso wie auf die gebundenen geladenen Gruppen basieren. Z.B. können die folgenden Matrizes verwendet werden, in denen die erwähnten Materialien mehr oder weniger vernetzt sein können: Auf Agarose basierend (wie Sepharose CL-6B^®, Sepharose Fast Flow^® und Sepharose High Performance^®), auf Cellulose basierend (wie DEAE Sephacel^®), auf Dextran basierend (wie Sephadex^®), auf Siliciumdioxid basierend und auf synthetischem Polymer basierend. Für das Anionenaustauschharz können die geladenen Gruppen, die kovalent an die Matrix gebunden sind, z.B. Diethylaminoethyl (DEAE), quaternäres Aminoethyl (QAE) und/oder quaternäres Ammonium (Q) sein. Für das Kationenaustauschharz können die geladenen Gruppen, die kovalent an die Matrix gebunden sind, z.B. Carboxymethyl (CM), Sulfopropyl (SP) und/oder Methylsulfonat (S) sein. In einer bevorzugten Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens ist das angewendete Anionenaustauschharz DEAE Sepharose Fast Flow^®, aber andere Anionenaustauscher können verwendet werden. Ein bevorzugtes Kationenaustauschharz ist CM Sepharose Fast Flow^®, aber andere Kationenaustauscher können verwendet werden.
Das geeignete Volumen an Harz, das verwendet wird, wenn es in eine Ionenaustauschchromatographiesäule gepackt ist, wird durch die Dimensionen der Säule widergespiegelt, d.h. den Durchmesser der Säule und die Höhe des Harzes und variiert abhängig z.B. von der Menge an IgG in der aufgetragenen Lösung und der Bindungskapazität des verwendeten Harzes.
Vor Durchführung einer Ionenaustauschchromatographie wird das Ionenaustauschharz bevorzugt mit einem Puffer equilibriert, der zulässt, dass das Harz seine Gegenionen bindet. Bevorzugt werden Anionen- und Kationenaustauschharze mit dem gleichen Puffer equilibriert, da dies das Verfahren erleichtert, da nur ein Puffer hergestellt und verwendet werden muss.
Wenn z.B. das ausgewählte Anionenaustauschharz DEAE Sepharose FF^® ist und das Kationenaustauschharz CM Sepharose FF^® ist und die Säulen in Reihe geschaltet sind, dann werden die Säulen vorteilhafterweise beide mit einem nicht denaturierenden sauren Puffer mit etwa dem gleichen pH-Wert und der gleichen Ionenstärke wie der aufzutragenden IgG-Lösung equilibriert. Jeder aus einer Anzahl von Puffern ist geeignet für die Equilibrierung der Ionenaustauschsäulen, z.B. Natriumacetat, Natriumphosphat, Tris-(hydroxymethyl)aminomethan. Fachleute erkennen, dass zahlreiche andere Puffer für die Equilibrierung verwendet werden können, solange pH-Wert und Leitfähigkeit etwa gleich sind wie für die aufgetragene IgG-Lösung. Ein bevorzugter Puffer für die Equilibrierung der Anionenaustauschsäule und der Kationenaustauschsäule, wenn sie in Reihe geschaltet sind, ist ein Natriumacetatpuffer mit einer Natriumacetatkonzentration in einem Bereich von 5 bis 25 mM, z.B. in einem Bereich von 10 bis 20 mM, bevorzugt etwa 15 mM. Es ist bevorzugt, dass der pH-Wert des Natriumacetatpuffers, der für die Equilibrierung verwendet wird, in einem Bereich von 5,0 bis 6,0 liegt, z.B. in einem Bereich von 5,4 bis 5,9, bevorzugt etwa 5,7. Die Leitfähigkeit liegt in einem Bereich von 1,0 bis 1,4 mS/cm, bevorzugt etwa 1,2 mS/cm. Geeignete Acetatpuffer können aus Natriumacetattrihydrat und Eisessig hergestellt werden.
Vor der Beladung des geklärten und gegebenenfalls filtrierten IgG-haltigen Überstands auf die Ionenaustauschsäulen werden Pufferkonzentration und pH-Wert des Überstands bevorzugt, falls notwendig, auf Werte eingestellt, die im Wesentlichen der Konzentration und dem pH-Wert des angewendeten Equilibrierungspuffers äquivalent sind.
Nach Beladen des IgG-haltigen Überstands auf die Säulen in Reihe werden die Säulen bevorzugt mit einem Säulenvolumen eines Waschpuffers gewaschen (Anfangswaschung), um sicherzustellen, dass die IgG-haltige Lösung quantitativ von der Anionenaustauschsäule auf die Kationenaustauschsäule übertragen wurde. Anschließend werden Anionenaustausch- und Kationenaustauschsäulen getrennt und die Kationenaustauschsäule wird gewaschen, um Proteinkontaminanten aus dem Harz zu entfernen mit einem Puffer mit einem pH-Wert und einer Ionenstärke, die ausreichend sind, um im Wesentlichen alle Kontaminanten von dem Kationenaustauschharz zu eluieren, ohne eine wesentliche Elution von IgG zu verursachen.
Das Anfangswaschen wird vorteilhafterweise durchgeführt, indem der Equilibrierungspuffer verwendet wird, obwohl andere Puffer mit ähnlicher Konzentration und ähnlichem pH-Wert für das Waschen verwendet werden können. Es ist bevorzugt, dass ein Acetatpuffer für das Auswaschen der Kontaminanten von dem Kationenaustauschharz verwendet wird. Der pH-Wert des Puffers könnte 5,0 bis 6,0 sein, z.B. in einem Bereich von 5,2 bis 5,8, z.B. etwa 5,4.
Die Elution des IgG von dem Kationenaustauschharz wird mit einem im Wesentlichen nicht denaturierenden Puffer mit einem pH-Wert und einer Ionenstärke durchgeführt, die ausreichen, um eine effiziente Elution des IgG zu verursachen, wodurch ein IgG-haltiges Eluat gewonnen wird. In diesem Zusammenhang bedeutet effiziente Elution, dass mindestens 75%, z.B, mindestens 80%, wie mindestens 85% der auf Anionen- und Kationenaustauschharze in Reihe geladenen IgG-Proteine von dem Kationenaustauschharz eluiert werden. Die Elution wird vorteilhafterweise als Gradientenelutionsstufe durchgeführt. In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist der bevorzugte Puffer, der verwendet wird, Natriumacetat mit einem pH-Wert im Bereich von 5,0 bis 6,0, wie 5,2 bis 5,8, bevorzugt etwa 5,4 und einer Konzentration in einem Bereich von 5 bis 40 mM, wie in einem Bereich von 10 bis 25 mM, bevorzugt etwa 15 mM.
Es ist bevorzugt, dass die Salzkonzentration des eluierenden Puffers ausreichend hoch ist, um das IgG von dem Harz zu verdrängen. Es wird jedoch angenommen, dass ein Anstieg des pH-Werts und eine geringere Salzkonzentration verwendet werden können, um das IgG von dem Harz zu eluieren. In einer bevorzugten Ausführungsform des vorlie genden Verfahrens wird die Elution als kontinuierliche Salzgradientenelution mit einer Natriumchloridkonzentration im Bereich von 50 bis 500 mM, bevorzugt etwa 125 mM bis etwa 350 mM Natriumchlorid durchgeführt.
Die Elution kann auch durch Stufengradientenelution durchgeführt werden. Es wird angenommen, dass die Elution auch als konstante Salzelution durchgeführt werden könnte, bei der der Elutionspuffer, der auf die Kationenaustauschsäule aufgetragen wird, nur eine einzige Salzkonzentration hat, im Gegensatz zur Gradientenelution. Wenn eine konstante Salzelution durchgeführt wird, kann die Konzentration des Salzes vorteilhafterweise in einem Bereich von etwa 350 mM bis etwa 500 mM Natriumchlorid liegen. Der Vorteil der Gradientenelution im Vergleich zu der konstanten Salzelution besteht darin, dass die Elution mit einem Salzgradienten wirksamer ist, aber ein weiterer Vorteil besteht darin, dass das Eluat eine geringere Ionenstärke hat, was vorteilhaft ist, da eine hohe Ionenstärke für die Stabilität von IgG kritisch ist. Der Elutionspuffer kann weiterhin ein Protein stabilisierendes Mittel, wie eines der unten erwähnten, enthalten. Verschiedene andere geeignete Puffersysteme können zum Eluieren des IgG verwendet werden, wie der Fachmann auf diesem Gebiet erkennen kann.
Bevorzugt wird mindestens ein Protein stabilisierendes Mittel für die IgG-Fraktion direkt nach oder während der Elution angewendet, Protein stabilisierende Mittel sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt und schließen z.B. verschiedene Zuckeralkohole und Saccharide (z.B. Sorbit, Mannose, Glucose, Trehalose, Maltose), Proteine (wie Albumin), Aminosäuren 8wie Lysin, Glycin) und organische Mittel (wie PEG) ein. Vorteilhafterweise kann der ausgewählte Zwischenstabilisator einer sein, der aus der IgG-haltigen Lösung in den nachfolgenden Stufen entfernt werden kann.
Die geeignete Konzentration des Protein stabilisierenden Mittels in der IgG-haltigen Lösung hängt von dem spezifischen angewendeten Mittel ab. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das stabilisierende Mittel Sorbit, bevorzugt mit einer Endkonzentration im Bereich von 2 bis 15% (G/V) Sorbit, z.B. etwa 2,5%.
Nach der Elution von dem Kationenaustauschharz wird das Eluat bevorzugt entsalzt (z.B. dialysiert) und vorteilhafterweise eingeengt. Die Änderung von Puffer und Konzentration von IgG kann mit einem kombinierten Dia/Ultrafiltrationsverfahren durchgeführt werden. Der Ausdruck "Dia/Ultrafiltration" bedeutet, dass Dialyse und Konzentration durch Diafiltration bzw. Ultrafiltration in einer Stufe durchgeführt werden. Es wird angenommen, dass die Diafiltration und Ultrafiltration in zwei getrennten Stufen durchgeführt werden können. Um jedoch einen unnötigen Produktverlust zu vermeiden, ist es derzeit bevorzugt, Dialy se und Konzentration mit den Methoden der Diafiltration und Ultrafiltration in einer Stufe durchzuführen.
Die für die Dia/Ultrafiltration vorteilhafterweise angewendeten Membranen haben einen Nenngewichtsausschluss in einem Bereich von 10.000 bis 100.000 Da. Ein bevorzugter Membrantyp für das vorliegende Verfahren ist eine Polysulfonmembran mit einem Nenngewichtsausschluss von 30.000 Da, der von Millipore erhalten wird. Andere Ultrafiltrationsmembranen aus vergleichbarem Material und mit vergleichbarer Porosität können angewendet werden.
Das Ausmaß der Konzentration kann erheblich variieren. Die Lösung wird von etwa 10 g/l IgG bis etwa 100 g/l, bevorzugt etwa 50 g/l eingeengt. Nach dem Einengen bzw. der Konzentration wird das IgG-Konzentrat vorteilhafterweise gegen einen Puffer mit geringer Ionenstärke dialysiert. Außer Salzionen zu entfernen, entfernt diese Stufe auch Kontaminanten mit niedrigem Molekulargewicht aus der Lösung und liefert ein Mittel zum Pufferaustausch für die nächste Reinigungsstufe. Ein bevorzugter Puffer für die Diafiltration ist 15 mM Natriumacetat, pH 5,4, der 2,5% (G/V) Sorbit enthält. Der Austausch des Puffers wird fortgesetzt, bis die Leitfähigkeit der ultrafiltrierten Lösung auf einen Wert von weniger als etwa 1,5 mS/cm, bevorzugt weniger als etwa 1,3 mS/cm gesunken ist. Während der Dia/Ultrafiltration wird der pH-Wert bevorzugt in einem Bereich von 4,0 bis 6,0, bevorzugt 5,1 bis 5,7, am meisten bevorzugt auf etwa 5,4 gehalten.
Nach der Dia/Ultrafiltration wird die Konzentration des Protein stabilisierenden Mittels vorteilhafterweise in der Lösung, falls notwendig, auf eine optimale Endkonzentration eingestellt, die charakteristisch für das spezifische Protein stabilisierende Mittel ist, das angewendet wird. Wenn Sorbit verwendet wird, wird die Sorbitkonzentration bevorzugt auf etwa 10 Gew.-% eingestellt.
Es ist bevorzugt, dass die stabilisierte Lösung mit einem Filter mit einem Porendurchmesser in einem Bereich von 0,2 bis 1,0 μm, bevorzugter 0,45 μm filtriert wird, um Aggregate vor der nächsten Stufe zu entfernen. In dieser Stufe erscheint die IgG-haltige Lösung als klare Lösung mit einem geeigneten Volumen mit hoher Stabilität als Ergebnis der hohen Reinheit, der geringen Ionenstärke, des sauren pH-Werts, der relativ hohen Konzentration an IgG und des zugegebenen Stabilisators.
Bei dem Herstellungsverfahren des IVIG-Produktes werden derzeit mindestens zwei definierte und validierte Virusentfernungs- und Inaktivierungsstufen einbezogen, wobei diese Stufen bevorzugt die Ausfällung mit PEG als allgemeine Virusentfernungsstufe und eine S/D-Behandlung als Virus inaktivierende Stufe für Viren mit Lipidhüllen sind, Außer den stringenten Erfordernissen zur Virussicherheit des Ausgangsmaterials nach den internationalen Richtlinien und der wohl bekannten Virus reduzierenden Fähigkeit eines mehrstufigen Reinigungsverfahrens macht die Einschaltung von zwei unabhängigen Virusreduktionsstufen, die sowohl gegen umhüllte als auch nicht umhüllte Viren aktiv sind, das Arzneimittel der vorliegenden Erfindung im Wesentlichen virussicher.
Infektiöse Viren mit Lipidhülle, die noch in der IgG-haltigen Lösung vorhanden sein können, werden bevorzugt in dieser Stufe des Verfahrens inaktiviert durch Zugabe einer viruziden Menge eines Virus inaktivierenden Mittels zu der IgG-haltigen Lösung. Eine "viruzide Menge" eines Virus inaktivierenden Mittels soll eine Menge bezeichnen, die eine Lösung erzeugt, in der die Virusteilchen im Wesentlichen nicht infektiös gemacht werden und die damit zu einer "virussicheren IgG-haltigen Lösung" wird, wie es im Stand der Technik definiert ist. Eine solche "viruzide Menge" hängt ab von dem angewendeten Virus inaktivierenden Mittel ebenso wie von den Bedingungen, wie Inkubationszeit, pH-Wert, Temperatur, Lipidgehalt und Proteinkonzentration.
Der Ausdruck "Virus inaktivierendes Mittel" soll ein solches Mittel oder eine solche Methode bezeichnen, die verwendet werden können, um Viren mit einer Lipidhülle zu inaktivieren ebenso wie Viren ohne Lipidhülle. Der Ausdruck "Virus inaktivierendes Mittel" ist so zu verstehen, dass er sowohl eine Kombination solcher Mittel und/oder Methoden, wann immer dies geeignet ist, als auch nur eine Art eines solchen Mittels oder einer solchen Methode beinhaltet.
Bevorzugte Virus inaktivierende Mittel sind Detergenzien und/oder Lösungsmittel, am meisten bevorzugt Detergenz/Lösungsmittelmischungen. Es versteht sich, dass das Virus inaktivierende Mittel gegebenenfalls eine Mischung aus einem oder mehreren Detergenzien mit einem oder mehreren Lösungsmitteln ist. Lösungsmittel/Detergenz-(SID)-Behandlung wird häufig als Stufe zur Inaktivierung von Viren mit Lipidhülle verwendet (z.B. HIV1 und HIV2, Hepatitis Typ C und Nicht-A-B-C, HTLV 1 und 2, Herpes-Virusfamilie, einschließlich CMV und Epstein-Barr-Virus) in Blutprodukten. Eine große Vielzahl an Detergenzien und Lösungsmitteln kann für die Virusinaktivierung verwendet werden. Das Detergenz kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus nichtionischen und ionischen Detergenzien besteht und wird so ausgewählt, dass es im Wesentlichen nicht denaturierend ist. Bevorzugt wird ein nichtionisches Detergenz verwendet, da es die anschließende Eliminierung des Detergenz aus dem IgG-Präparat in der nachfolgenden Stufe erleichtert. Geeignete Detergenzien werden z.B. von Shanbrom et al. in U.S.-Patent Nr. 4 314 997 und U.S.-Patent Nr. 4 315 919 beschrieben. Bevorzugte Detergenzien sind solche, die unter den Markennamen Triton X-100 und Tween 80 vertrieben werden. Bevorzugte Lösungsmittel zur Verwendung in Virus inaktivierenden Agenzien sind Di- oder Trialkylphosphate, wie z.B. von Neurath und Horowitz in U.S.-Patent Nr. 4 764 369 beschrieben. Ein bevorzugtes Lösungsmittel ist Tri(n-butyl)phosphat (TNBP). Ein besonders bevorzugtes Virus inaktivierendes Mittel für die Durchführung der vorliegenden Erfindung ist eine Mischung aus TNBP und Tween 80, aber alternativ können andere Kombinationen verwendet werden. Die bevorzugte Mischung wurde in einem solchen Volumen zugegeben, dass die Konzentration an TNBP in der IgG-haltigen Lösung in einem Bereich von 0,2 bis 0,6 Gew.-%, bevorzugt bei einer Konzentration von etwa 0,3 Gew.-% liegt. Die Konzentration von Tween 80 in der IgG-haltigen Lösung liegt in einem Bereich von 0,8 bis 1,5 Gew.-%, bevorzugt bei einer Konzentration von etwa 1 Gew.-%.
Die Virusinaktivierungsstufe wird unter Bedingungen durchgeführt, die umhüllte Viren inaktivieren, was zu einer im Wesentlichen virussicheren IgG-haltigen Lösung führt. Im Allgemeinen schließen solche Bedingungen eine Temperatur von 4 bis 30°C, z.B. 19 bis 28°C, 23 bis 27°C, bevorzugt etwa 25°C, und eine Inkubationszeit ein, die sich als wirksam bei Validierungsstufen erwiesen hat. Allgemein ist eine Inkubationszeit von 1 bis 24 Stunden ausreichend, bevorzugt 4 bis 12 Stunden, wie z.B. etwa 6 Stunden, um eine ausreichende Virusinaktivierung sicherzustellen. Die geeigneten Bedingungen (Temperatur und Inkubationszeiten) hängen jedoch von dem angewendeten Virus inaktivierenden Mittel, dem pH-Wert und der Proteinkonzentration und dem Lipidgehalt der Lösung ab.
Es wird davon ausgegangen, dass auch andere Methoden zur Entfernung oder Inaktivierung von Viren angewendet werden können, um ein virussicheres Produkt herzustellen, z.B. die Zugabe von Methylenblau mit nachfolgender Inaktivierung durch Bestrahlung mit Ultraviolettlicht oder Nanofiltration.
Nach der Lösungsmittel/Detergenzbehandlung wird die Lösung vorteilhafterweise mit Puffer verdünnt. Gegebenenfalls wird die im Wesentlichen virussichere IgG-haltige Lösung filtriert, bevorzugt durch ein Tiefenfilter, wie vorher in einer früheren Stufe des vorliegenden Verfahrens beschrieben, und/oder durch ein Sterilfilter.
Nach der Virusinaktivierung und bevorzugt Filtration wird Ionenaustauschchromatographie durchgeführt, um das Virus inaktivierende Mittel und die Proteinkontaminanten zu entfernen. Diese Stufe wird bevorzugt durchgeführt, wie bereits für die vorherige Ionenaustauschchromatographiestufe des vorliegenden Verfahrens beschrieben, mit der Ausnahme, dass das Volumen des Anionenaustauschharzes etwa die Hälfte des Kationenaustauschharzes ist und dass das Waschen vor der Elution von IgG intensiver ist, wobei mindestens 6 Säulenvolumina Puffer verwendet werden. Zusätzlich ist in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung der Equilibrierungspufter Natriumacetat mit einer Konzentration im Bereich von etwa 5 bis 25 mM, bevorzugt 15 mM, und einem pH-Wert in einem Bereich von etwa 5,0 bis 5,8, bevorzugt 5,4. Wie vorher erwähnt, werden der Natriumacetatgehalt und der pH-Wert der IgG-haltigen Lösung bevorzugt auf die gleiche Konzentration und den gleichen pH-Wert eingestellt, wie der Equilibrierungspuffer. Zusätzlich wird in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ein Protein stabilisierendes Mittel, bevorzugt Maltose, dem gewonnenen Eluat zugegeben auf eine Endkonzentration im Bereich von 1 bis 5%, bevorzugt etwa 2,5 Gew.-%.
Die bevorzugte Methode, um das Virus inaktivierende Mittel zu entfernen, ist Ionenaustauschchromatographie. Andere Methoden, wie Ölextraktion und alternative chromatographische Methoden werden jedoch auch als geeignet in Betracht gezogen. Die geeignete Methode hängt von dem angewendeten Virus inaktivierenden Mittel ab. Die Entfernung von Lösungsmittel/Detergenz kann daher erreicht werden, indem das IgG an ein Harz gebunden wird und anschließend ein sorgfältiges Auswaschen des inaktivierenden Mittels mit Puffer erfolgt. Kationenaustauschchromatographie ist eine geeignete Methode. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird auch Anionenaustauschchromatographie zusätzlich zu der Kationenaustauschchromatographie durchgeführt, um Qualität und Gesamtreinheit des Endproduktes im vorliegenden Verfahren zu verbessern.
Nach der Ionenaustauschchromatographiestufe wird das IgG-haltige Eluat bevorzugt dialysiert und eingeengt; hierdurch wird der Gehalt an verbleibenden kleineren Proteinkomponenten wirksam vermindert. Vorteilhafterweise kann dies mit Dia/Ultrafiltration durchgeführt werden, wie vorher beschrieben. Der für die Diafiltration angewendete Puffer ist Natriumacetat, bevorzugt mit einer Konzentration von etwa 4 bis 10 mM, bevorzugt 7,5 mM bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 4,0 bis 6,0, bevorzugt etwa 5,1 bis 5,7, wie etwa 5,4. Alternativ können andere Puffer, wie Natriumphosphat oder Säuren für die Diafiltration verwendet werden. Die Diafiltration wird fortgesetzt, bis die Leitfähigkeit kleiner oder gleich 1 mS/cm ist. Gegebenenfalls wird die IgG-haltige Lösung weiterhin sterilfiltriert.
Falls erwünscht, wird die gereinigte IgG-haltige Lösung, die im Wesentlichen frei von Virus inaktivierendem Mittel ist, weiteren Behandlungen unterzogen zu dem Zweck, sie für die Formulierung als flüssiges Produkt geeignet zu machen, das z.B. intravenös, subcutan oder intramuskulär verwendet wird.
Von einem praktischen Standpunkt aus betrachtet, ist es bevorzugt, dass der Gehalt der flüssigen Formulierung an Immunglobulinprodukt der gleiche zur Lagerung wie zur Ver wendung ist. Die Endkonzentration von IgG in dem Produkt liegt bevorzugt in einem Bereich von 0,25 bis 20 Gew.-% (entsprechend 2,5 bis 200 g IgG/l), wie etwa 1 bis 20 Gew.-%, d.h. etwa 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%.
Es ist bekannt, dass eine hohe Proteinkonzentration zu einer höheren Stabilität von IgG führt. Andererseits bedeutet eine hohe IgG-Konzentration, dass die maximale Infusionsrate, wenn IgG intravenös dem Patienten verabreicht wird, ziemlich gering sein muss, da Transfusionsprobleme aufgrund des hohen osmotischen Drucks des Produktes vermieden werden müssen. Eine derzeit in der Europäischen Pharmakopöe (Ph. Eur.) empfohlene Konzentration für die intravenöse Verabreichung ist 5% (G/V). Andererseits ist ein ziemlich konzentriertes Produkt (z.B. 10% oder mehr) vorteilhaft für intramuskuläre oder subcutane Injektionen.
Obwohl nicht bevorzugt, ist es offensichtlich, dass die Produkte, die mit den verschiedenen Verfahrensstufen der Erfindung erhältlich sind, auch z.B. als gefriergetrocknete Produkte anstelle von flüssigen Präparaten verwendet werden können, obwohl dies weniger vorteilhaft ist verglichen mit der Verwendung der Immunglobulinprodukte als Instantflüssigformulierungen. Die letztere Ausführungsform wird detaillierter im Folgenden beschrieben.
Flüssige Immunglobulinprodukte sind am stabilsten bei einer Ionenstärke, die deutlich geringer ist als die von Plasma, d.h. die Leitfähigkeit ist bevorzugt kleiner als 1,0 mS/cm, bevorzugt etwa 0,8 mS/cm.
Der pH-Wert hat Einfluss auf die Stabilität von IgG und die Infusionsrate. Flüssige Immunglobulinprodukte sind am stabilsten unter sauren Bedingungen, d.h. unter dem isoelektrischen Punkt des IgGs, pH 6,4 bis 8,5. Je dichter der pH-Wert an dem physiologischen pH-Wert (7,1 bis 7,3) ist, eine desto höhere Infusionsrate kann angewendet werden. Als Folge der erforderlichen Stabilität liegt der pH-Wert des Immunglobulinproduktes der Erfindung bevorzugt in einem Bereich von 5,1 bis 5,7, z.B. zwischen 5,2 und 5,6, wie etwa 5,4.
Weiterhin kann das Immunglobulinprodukt Protein stabilisierende Mittel, wie vorher beschrieben, enthalten. Zusätzlich zu Zuckeralkoholen und Sacchariden (wie Sorbit, Mannose, Glucose, Trehalose, Maltose) können auch Proteine (wie Albumin), Aminosäuren (wie Lysin, Glycin) und organische Mittel (z.B. PEG und Tween 80) ebenso als Stabilisatoren verwendet werden. Die geeignete Konzentration des stabilisierenden Mittels in der IgG-haltigen Lösung hängt von dem spezifisch angewendeten Mittel ab, wie vorher beschrieben.
Die gereinigte IgG-Lösung wird, falls notwendig, so eingestellt, dass eine stabile und isotonische Lösung erhalten wird. Der Ausdruck "isotonische Lösung" soll bedeuten, dass die Lösung den gleichen osmotischen Druck hat wie Plasma. Wie oben erwähnt, ist die Ionenstärke in dem Immunglobulinprodukt der Erfindung als flüssigem Präparat deutlich geringer als in Plasma. Aus diesem Grund ist es bevorzugt, dass Mono- oder Disaccharide verwendet werden, um die Osmolalität der Lösung zu erhöhen, da dies die Ionenstärke nicht beeinflusst. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Maltose in einer solchen Konzentration zugegeben, dass sichergestellt ist, dass die Lösung isotonisch ist und gleichzeitig dient Maltose als Immunglobulin stabilisierendes Mittel. Dies wird bevorzugt durchgeführt durch Zugabe von Maltose auf eine Endkonzentration in einem Bereich von etwa 5 bis 15% (G/V), bevorzugt 10% (G/V); andere Saccharide, wie Mannose und Glucose können alternativ verwendet werden.
Die bevorzugten endgültigen Bedingungen für das Immunglobulinprodukt sind ein Kompromiss zwischen Stabilität und physiologisch annehmbaren Bedingungen im Hinblick z.B. auf pH-Wert, Ionenstärke und Tonizität. Weiterhin muss das Immunglobulinprodukt den Erfordernissen von Qualitätskontrolltests entsprechen, wie sie in der Monografie Nr. 918, Ph. Eur. 1997, angegeben sind.
Die Hauptvorteile des mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Produktes sind, dass dann, wenn es als flüssiges Präparat formuliert wird, das Produkt eine Kombination aus einem flüssigen verbrauchsfertigen Produkt ist, das gleichzeitig sehr stabil, hoch gereinigt ist, eine größtenteils normale Verteilung von IgG-Subklassen hat und einen extrem niedrigen IgA-Gehalt ebenso wie einen niedrigen IgM-Gehalt und seine Antikörperaktivität und biologische Aktivität bewahrt, was durch die Fc-Funktion gezeigt wird.
Außerdem enthält es im Wesentlichen keine Aggregate von Immunglobulinen und/oder anderen Plasmaproteinen, die als Polymere gemessen werden, größer als Dimere, und hat eine geringe antikomplementäre Aktivität und hat einen sehr hohen Gehalt an IgG-Monomeren und -Dimeren. Monomeres IgG bildet mindestens 90%, was als ideal angesehen wird. Aufgrund der hohen Stabilität ist es möglich, die Zugabe von anderen Stabilisatoren, wie Albumin, Glycin, Detergenz oder PEG zu vermeiden. Schließlich ist das Produkt virussicher, da das Verfahren wohl definierte und validierte Virusreduktionsstufen aufweist, deren Ziel es ist, sowohl mit Lipid umhüllte als auch nicht mit Lipid umhüllte Viren zu entfernen und/oder zu inaktivieren.
Das Ziel der Validierung einer Produktionsstufe als Virusreduktionsstufe ist es, Hinweise zu liefern, dass das Produktionsverfahren Viren effektiv inaktiviert/entfernt, von denen entweder bekannt ist, dass sie Ausgangsmaterialien kontaminieren oder die dies gegebenenfalls tun könnten. Validierungsuntersuchungen beinhalten die absichtliche Zugabe eines Virus vor den zu validierenden Produktionsstufen und das Messen des Ausmaßes der Entfernung/Inaktivierung nach der Produktionsstufe oder den Stufen. GMP-Einschränkungen verhindern die absichtliche Einführung irgendeines Virus in die Produktionseinheiten. Die Validierung sollte daher in einem getrennten Labor, das für virologische Arbeit ausgestattet ist, mit einer Version der Produktionsstufe in kleinerem Maßstab und von Personal mit virologischer Expertise zusammen mit Produktingenieuren durchgeführt werden. Die Menge an zu dem Ausgangsmaterial zugegebenen Virus für die Produktionsstufe, die validiert werden soll, sollte so hoch wie möglich sein, um die Kapazität der Produktionsstufe, Viren in entsprechender Art und Weise zu inaktivieren und zu entfernen, bestimmen zu können. Der Virusspike sollte jedoch so zugegeben werden, dass die Zusammensetzung des Produktionsmaterials sich nicht signifikant verändert. Bevorzugt ist das Volumen des Virusspikes kleiner gleich 10%.
Quantitative Infektivitätsassays sollten nach den Prinzipien von GLP durchgeführt werden und können Plaquebildung, Nachweis anderer cytopathischer Wirkungen, wie Synzytie oder Foci-Bildung, Endpunkttitration (z.B. TCID₅₀-Assays), Nachweis von Virusantigensynthese oder anderer Methoden beinhalten. Die Methode sollte eine passende Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit haben und sollte mit ausreichend Wiederholungen und Kontrollen durchgeführt werden, um eine ausreichende statistische Genauigkeit der Ergebnisse sicherzustellen.
Typischerweise wird eine Verfahrensstufe mit 6 log Virus beaufschlagt und, wenn eine Reduktion in der Größenordnung von 4 log oder mehr erreicht wird, ist dies ein Hinweis auf die klare Wirkung des jeweiligen untersuchten Testvirus. In gleicher Weise deutet eine Reduktion in der Größenordnung von 4,5 log, 5 log oder sogar 5,5 log auf eine eindeutige Wirkung mit dem jeweiligen Testvirus, der untersucht wird, und die Stufe kann als validierte Virusreduktionsstufe klassifiziert werden.
Die Virusvalidierungsuntersuchungen sollten mit Viren durchgeführt werden, die denen, die das Produkt kontaminieren könnten, so nahe wie möglich kommen sollten, und zweitens sollten sie einen möglichst breiten Bereich an physikalisch-chemischen Eigenschaften repräsentieren, um die Fähigkeit des Systems, Viren allgemein zu eliminieren, zu testen.
Die Virusvalidierungsuntersuchungen sollten gemäß der CPMP-Anmerkung zur Anleitung von Virusvalidierungsuntersuchungen durchgeführt werden: The Design, Contribution and Interpretation of Studies Validating the Inactivation and Removal of Viruses (CPMP/BWP/268/95) und Note for Guidance on Plasma Derived Medicinal Products (CPMP/BWP/269/95).
Die Validierungsuntersuchungen des vorliegenden Verfahrens sind in Beispiel 5 dargestellt.
Das erfindungsgemäße Produkt ist zu mehr als 95% rein, bevorzugt mehr als 98%. Der hohe Reinheitsgrad beruht unter anderem auf der Tatsache, dass das erfindungsgemäße Produkt durch mindestens eine, bevorzugt zwei, gegebenenfalls seriell verbundene Anionenkationenaustauschchromatographiestufen erfolgt. Es ist in diesem Zusammenhang bemerkenswert, dass es möglich ist, eine hohe Ausbeute zu erhalten trotz der Anzahl der Verfahrensstufen, die angewendet werden, im Produktionsmaßstab von mindestens 3,5 g IgG-Protein/kg frisch gefrorenem Plasma.
Die Vergleichsuntersuchungen, die durchgeführt wurden (Beispiel 2) haben gezeigt, dass das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche Immunglobulinprodukt ideale funktionelle Eigenschaften hat, wie z.B. hervorragende Antigenbindungsaktivitäten und eine hohe Fc-Funktion. Das derzeit bevorzugte von den vorliegenden Erfindern entwickelte Medikament ist eine 5 gew.-%ige Immunglobulinlösung. Stabilitätstests haben bisher eine Stabilität bei 4°C Lagerung über mehr als ein Jahr gezeigt, d.h. dass das Immunglobulinprodukt keine Aggregatbildung aufweist und keine Fragmentierung von Immunglobulin G, nicht die gewünschte biologische Aktivität verliert oder unerwünschte Aktivitäten sich erhöhen, z.B. antikomplementäre Aktivität und Präkallicreinaktivität, wenn in vitro gemessen wird.
Basierend auf der vorliegenden Erfindung ist es möglich, ein IgG-Produkt zu erhalten, das zu mehr als 95%, wie z.B. mindestens 96% oder mindestens 97%, z.B. mindestens 98%, bevorzugt mindestens 99%, bevorzugter mindestens 99,5% rein ist. Das IgG-Produkt sollte weniger als 6 mg IgA/l, z.B. so wenig wie 4 mg IgA/l, bevorzugt weniger als 3 mg IgA/l und noch bevorzugter weniger als 2 mg IgA/l enthalten.
Es sollte angemerkt werden, dass andere Produkte Stabilisatoren in Form von Detergenz, PEG oder Albumin enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Produkt der vorliegenden Erfindung keine Stabilisatoren, stattdessen wurde ein gut toleriertes Saccharid ausgewählt.
Das Produkt der vorliegenden Erfindung hat als eines seiner Merkmale einen sehr geringen Gehalt an Polymeren und Aggregaten. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Produkt der vorliegenden Erfindung weniger als 1,5% Polymere und Aggregate, wie z.B. weniger als 1 %, z.B. weniger als 0,5% oder weniger als 0,25% Polymere und Aggregate. Der Gehalt an IgG-Monomeren und -Dimeren ist mindestens 95%, wie mindestens 96% oder mindestens 97%, z.B. mindestens 98%, bevorzugt mindestens 98,5% oder 99%. Der Gehalt an monomerem IgG ist mindestens 90% im Produkt.
Versuche haben die klinische Wirkung des erfindungsgemäßen Produktes gezeigt im Vergleich zu registrierten IVIG-Produkten. Das Produkt wurde von den Patienten gut toleriert und die Umschlagszeit der Immunglobuline im Kreislauf wurde bestimmt als 4 Wochen. In den vorliegenden Versuchen wurde gezeigt, dass der immunmodulierende Effekt von IVIG, SSI überzeugend ist (Daten dargestellt in Beispiel 3).
Die Indikationen für IVIG sind primäre Hypo/Agammaglobulinämie was allgemeine variable Immunschwäche, Wiskott-Aldrich-Syndrom und schwere kombinierte Immunschwäche (SCID), sekundäre Hypo/Agammaglobulinämie bei Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) und multiplem Myelom, Kinder mit AIDS und bakteriellen Infektionen, akute und chronische idiopathische Thrombozytopenie (ITP), allogene Knochenmarktransplantation (BMT), Kawasaki-Krankheit und Guillan-Barre-Syndrom. Neurologie: chronisch-entzündliche demyelinierende Polyneuropathie (CIDP), multifokale motorische Neuropathie, Multiple Sklerose, Myasthenia gravis, Eaton-Lambert-Syndrom, Opticus neuritis, Epilepsie einschließt.
Gynäkologie: Abortus habitualis, primäres Antiphospholipid-Syndrom.
Rheumatologie: rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus erythematodes, systemische Skleroderma, Vaskulitis, Wegner-Granulomatose, Sjögren-Syndrom, juvenile Polyarthritis.
Hämatologie: Autoimmunneutropenie, hämolytische Autoimmunanämie, Neutropenie.
Gastrointestinal: Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Zöliakie.
Andere: Asthma, septisches Schock-Syndrom, chronisches Ermüdungssyndrom, Psoriasis, toxisches Schock-Syndrom, Diabetes, Sinusitis, dilatierte Kardiomyopathie, Endocarditis, Atherosklerose, Erwachsene mit AIDS und bakteriellen Infektionen.
Neben den vorher erwähnten Indikationen zur Behandlung mit IVIG-Produkten werden verschiedene schwere Autoimmunkrankheiten, die allgemein auf corticosteroid- und immunsupprimierende Therapie ansprechen, als Zielzustände für eine Therapie mit dem Produkt der vorliegenden Erfindung angesehen. Zu diesen gehören verschiedene neurologische Krankheiten, wie Polyradiculitis und einige immunvermittelte periphere Polyneuropathien, aber auch einige chronisch entzündliche rheumatische und vaskuläre Zustände, wie systemische Vasculitis unter Beteiligung kleiner Gefäße, Polymyositis und andere.
Eine andere Art der Wirkung des Produkts der vorliegenden Erfindung kann die Eliminierung von infektiösen Antigenen bei chronischen Infektionen und ein Anstieg des IgG-Metabolismus sein.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert, die nicht als beschränkend anzusehen sind.
Beispiele
Beispiel 1
Verfahrensstufen zur Reinigung von Immunglobulin (mit Ausnahme von Stufe 5 werden alle Stufen bei 5 ± 3°C durchgeführt)
Stufe 1: Herstellung von Cohn-Fraktion-II- und -II-Paste
Cohn-Fraktion-II- und -III-Paste wird hergestellt aus menschlichem Plasma mit der Standard-Cohn-Fraktionierungsmethode (E. Cohn et al. (1946), J. Am. Chem. Soc. 459–475), im Wesentlichen, wie von Kistler-Nitschmann modifiziert (P. Kistler und H.S. Nitschmann (1952), Vox Sang 7, 414–424). Die Ethanolausfällung wird gestartet, nachdem das Kryopräzipitat entfernt wurde und, falls erwünscht, nach Adsorption bestimmter Plasmaproteine (wie Faktor IX und Antithrombin) z.B. an einem Ionenaustauschmaterial und/oder einer Heparin-Sepharose^®-Matrix.
Die genauen Bedingungen (pH-Wert, Ethanolkonzentration, Temperatur, Proteinkonzentration), um die Fraktion-II-III-Paste zu erhalten, erscheinen in der Figur auf Seite 266 bei J.R. Harns (Herausgeber), Blood Separation and Plasma Fractionation, Wiley-Liss, New York, 1991. Die Paste wird auf einer Filterpresse isoliert, indem eine Filterhilfe vor der Filtration zugegeben wird.
Stufe 2: Extraktion von Immunglobulinen aus Cohn-Fraktion-II-III-Paste:
Aus 140 kg Fraktion II + III-Paste einschließlich 30 kg Filterhilfe (Schenk, Deutschland) (entsprechend einem Ausgangsvolumen an Plasma von etwa 1150 kg) erfolgt die Extraktion, indem zuerst 525 kg 2,33 mM Natriumphosphat/Acetatpuffer, pH 4,0, unter langsamem Rühren etwa 1,5 Stunden lang zugegeben werden und anschließend aufeinander folgend zweimal 350 kg Wasser zur Injektion (WFI), wobei etwa 1,5 Stunden lang nach jeder Zugabe gerührt wird. Schließlich werden etwa 280 kg 21,5 mM Natriumphosphat/Acetat pH 7,0 zugegeben und dadurch der pH-Wert der Suspension auf 5,4 eingestellt.
Die Suspension wird durch ein Tiefenfilter (C-150AF, Schenk, Deutschland) filtriert. Das Filtrat enthält neben anderen Proteinen die Immunglobuline.
Stufe 3: Ausfällung von Proteinaggregaten und Entfernung von Virus mit PEG 6000
PEG 6000 (Merck, Deutschland) wird zu dem Filtrat von Stufe 2 auf eine Endkonzentration von 6 Gew.-% zugegeben. Nach 4-stündiger Ausfällung wird die PEG-Suspension bis zur Klarheit zentrifugiert in einer Durchflusszentrifuge (Westfalia BKA28, Deutschland) und tieffiltriert (50LA und 90LA, Cuno, Frankreich) und anschließend sterilfiltriert durch ein 0,22 um Filter (Durapore, Millipore, USA). Bei dem filtrierten PEG-Überstand wird durch Zugabe von einem Teil 0,45 M Natriumacetatpuffer, pH 5,7, zu 29 Teilen Überstand der pH-Wert eingestellt, so dass er 5,7 erreicht.
Stufe 4: Reinigung durch serielle Anionen- und Kationenaustauschchromatographie (I):
Zwei Chromatographiesäulen werden mit 56 I DEAE Sepharose FF^® (Pharmacia Biotech, Schweden) bzw. 56 I CM Sepharose FF^® (Pharmacia Biotech, Schweden) gepackt. Die Säulen werden in Reihe geschaltet, so dass die Flüssigkeit zuerst durch das DEAE-Sepharoseharz fließt und anschließend durch das CM-Sepharoseharz. Die Säulenharze werden mit 15 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,7, equilibriert. Dann wird die Lösung von Stufe 3 auf die zwei Säulen in Reihe aufgetragen.
Während der Ionenaustauschchromatographie binden die meisten kontaminierenden Proteine in der aufgebrachten Lösung an DEAE-Sepharoseharz. Während IgG ohne Bindung an das DEAE-Sepharoseharz durchläuft, bindet IgG an das CM-Sepharoseharz, wenn die Lösung hindurchwandert. Nach Aufbringen der Lösung und Waschen mit einem Säulenvolumen Equilibrierungspuffer wird die DEAE-Säule von der CM-Säule getrennt. Dann wird die CM-Säule mit 3 Säulenvolumina 15 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,4, gewaschen und dann das IgG eluiert mit einem NaCl-Gradienten von 125 mM bis 350 mM NaCl, 15 mM Natriumacetat, pH 5,4. Die eluierte IgG-Fraktion wird in Sorbit auf eine Endkonzentration von 2,5 Gew.-% gesammelt.
Stufe 5: Lösungsmittel/Detergenz-(S/D)-Behandlung der IgG-Fraktion
Die eluierte IgG-Fraktion wird eingeengt und durch Ultra/Diafiltration auf eine Konzentration von ungefähr 50 g IgG/l entsalzt. Die angewendete Membran ist eine Polysulfonmembran, Nenngewichtsausschluss 30 kDa (Millipore). Die Diafiltration wird gegen einen Puffer von 15 mM Natriumacetat, pH 5,4, der 2,5 Gew.-% Sorbit enthält, durchgeführt und fortgesetzt, bis die Leitfähigkeit kleiner als 1,4 mS/cm ist. Der IgG-Gehalt der Lösung wird spektrophotometrisch bestimmt, indem bei 280 nm (A₂₈₀) gemessen wird. Die Sorbitkonzentration wird auf 10 Gew.-% eingestellt und die Lösung durch ein 0,45 μm Filter (Pall Corporation, GB) filtriert. Tween 80 und TNBP werden dann auf eine Endkonzentration von 1 % bzw. 0,3 Gew.-% zugegeben für die anschließende S/D-Behandlung. Die S/D-Behandlung läuft für mindestens 6 Stunden bei 25°C weiter.
Stufe 6: Entfernung von S/D durch Ionenaustauschchromatographie (II)
Zwei in Reihe geschaltete Säulen, die mit 28 I DEAE bzw. 56 I CM-Sepharose FF gepackt sind, werden mit 15 mM Natriumacetat, pH 5,4, equilibriert. Die S/D-behandelte IgG-Fraktion aus Stufe 5 wird mit 5 Teilen 15 mM Acetatpuffer, pH 5,4, verdünnt, durch ein Tiefenfilter (Cuno 90 LA) filtriert und anschließend sterilfiltriert (Sartobran, Sartorius) und auf die zwei in Reihe geschalteten Säulen aufgetragen. Die Ionenaustauschchromatographie und die anschließende Elution der IgG von der CM-Säule werden im Wesentlichen, wie in Stufe 4 beschrieben, durchgeführt, außer dass die CM-Säule intensiv mit 6 Säulenvolumina Puffer gewaschen wird, um Mittel von der S/D-Behandlung zu entfernen. Die eluierte IgG-Fraktion wird in Maltose (Merck, Deutschland) auf eine Endkonzentration von 2,5 Gew.-% gesammelt.
Stufe 7: Endkonzentration und Formulierung von Immunglobulin für die intravenöse Anwendung
Die eluierte IgG-Fraktion von Stufe 6 wird einer Ultrafiltration und einem Entsalzen durch Diafiltration gegen 7,5 mM Natriumacetat, das 2,5 Gew.-% Maltose enthält, pH 5,4, auf eine Endleitfähigkeit von weniger als 1 mS/cm unterworfen. Die angewendete Membran ist eine Polysulfonmembran mit einem 100 kDa Nenngewichtausschluss, der es zulässt, dass Proteine mit kleinerem Molekulargewicht eliminiert werden. Die Endkonzentration von IgG wird auf 50 g/l eingestellt und die Maltose wird auf eine Endkonzentration von 10% (G/V) eingestellt. Das mit Maltose eingestellte fertige Präparat wird durch ein Sterilfilter (Sartopure GF 2, Sartorius) filtriert und aseptisch abgefüllt.
Beispiel 2
Ergebnisse einer analytischen Studie eines Produkts, das mit dem vorliegenden Verfahren erhalten wurde, im Vergleich zu anderen IVIG-Produkten
1: ohne Korrektur bezüglich HSA; 2: vom Hersteller angegeben; 3: bezüglich HSA-Peak korrigiert und 4: als Stabilisator verwendet.
Reinheit (Proteinzusammensetzung)
Die Reinheitserfordernisse der Pharmakopöe für ein IVIG-Präparat sind mindestens 95% IgG, d.h. nicht mehr als 5% kontaminierende Nicht-IgG-Proteine. Die Reinheit wird aus mehreren Gründen als von sehr großer Bedeutung angesehen. Von einem rationalen Standpunkt aus sollte nur das Protein, das die gewünschte Funktion trägt, vorhanden sein und andere kontaminierende Proteine könnten möglicherweise schädlich sein, z.B. unerwünschte negative Wirkungen verursachen und/oder die Stabilität des Produkts beeinflussen.
Die Reinheit kann z.B. mit einer elektrophoretischen Technik, wie im Detail in Ph. Eur. 1997, Seiten 964–965 beschrieben, analysiert werden, wobei Proteine in einem Celluloseacetatgel getrennt werden. Für praktische Zwecke wird jedoch ein Agarosegel verwendet. Nach der Elektrophorese wird das Gel filtriert, getrocknet und gefärbt. Proteinbanden werden hauptsächlich durch Scannen überwacht. Aus der obigen Tabelle ist zu sehen, dass das Produkt der Erfindung im Wesentlichen rein ist (99,8%).
Albumin
Der Albumingehalt wurde durch gekreuzte Immunelektrophorese analysiert, im Wesentlichen wie von C.B. Laurell (Anal. Biochem. (1965), 10, 358–361) beschrieben. 5 μl Produkt wurden analysiert gegen Antihumanalbumin-Antikörper (DAKO A/S, Dänemark, Nr. A0001 (1/100)). Aufgrund der hohen Reinheit war kein Albumin in dem analysierten Produkt der Erfindung nachweisbar.
Gehalt an IgG-Monomeren und -Dimeren
Der Gehalt an IgG-Monomeren und -Dimeren kann mit Gelpermeationschromatographie analysiert werden und von dem Chromatogramm durch Integration der Flächen des Monomer- und Dimer-Peaks überwacht werden, siehe Ph. Eur. Die Ergebnisse der verschiedenen Analysen sind in der Tabelle oben aufgeführt, woraus ersichtlich ist, dass die Summe der Monomer- und Dimerflächen 99,3% der Gesamtfläche des Chromatogramms (von diesen bildet das monomere IgG 92%) für das erfindungsgemäße Produkt bildet.
Gehalt an Polymeren und Aggregaten
Es ist bekannt, dass die Gegenwart von Polymeren und Aggregaten schwere Nebenwirkungen auslöst, häufig Influenza-artige Symptome. Wegen des sehr hohen Reinheitsgra des, der durch das ziemlich sanfte Herstellungsverfahren erreicht wird, ist das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche Immunglobulinprodukt im Wesentlichen frei von Polymeren und Aggregaten.
Polymere können mit Gelpermeationschromatographie analysiert werden und es wird angenommen, dass jeder Proteinpeak mit Retentionszeiten, die kürzer sind als die Retentionszeit für dimeres IgG, ein Polymer ist, wie in Ph. Eur. beschrieben.
Gemäß Ph. Eur. und anderen Richtlinien sollte der Gehalt an Proteinaggregaten bevorzugt kleiner als 3% sein. Das Produkt der vorliegenden Erfindung enthält keine messbaren Aggregate und es wird daher davon ausgegangen, dass es weniger als 0,1% Polymere und Aggregate enthält.
Antikomplementäre Aktivität (ACA) und Präkallikreinaktivator-Aktivität (PKA)
ACA und PKA werden gemessen, wie in Ph. Eur. beschrieben.
ACA sollte bevorzugt so gering wie möglich sein. Gemäß Ph. Eur. sollte der Komplementverbrauch kleiner oder gleich 50% sein. Der Komplementverbrauch der gemessenen Probe des erfindungsgemäßen Produkts ist etwa 30%, d.h. vergleichbar mit der von anderen analysierten Produkten. Es ist anzumerken, dass die Gegenwart von Albumin den Komplementverbrauch eher unterdrückt (Beobachtung des Erfinders).
PKA, falls in wesentlichen Mengen vorhanden, ist wesentlich für eine blutdrucksenkende negative Wirkung des Produktes. Daher sollte die PKA bevorzugt so gering wie möglich sein in einem Immunglobulinprodukt. Gemäß Ph. Eur. sollte sie < 35 IU/ml sein, wenn sie gemessen wird, wie in Ph. Eur. ausgeführt. Die PKA des erfindungsgemäßen Produktes ebenso wie anderer Produkte, die analysiert wurden, ist kleiner als der Pegel der quantitativen Auswertung der Methode, d.h. unter 8,5 IE/ml.
Hämagglutinine
Die IgM-Fraktion der Plasmaimmunglobuline enthält Hämagglutinine, d.h. Antikörper gegen Blutgruppe A und Blutgruppe B. Die Gegenwart solcher Antikörper kann unerwünschte negative Wirkungen verursachen aufgrund einer möglichen hämolytischen Reaktion, wenn der Empfänger Blutgruppe A und/oder B hat.
Nach den Erfordernissen der Pharmakopöe muss der Gehalt an Hämagglutininen kleiner sein, als der, der eine Agglutination von A/B-Erythrozyten verursacht in einer Verdünnung von 1:64 des Immunglobulinprodukts. Alle analysierten Produkte erfüllen dieses Erfordernis.
Fc-Funktion
Aufrechterhaltene Antigenbindungsaktivitäten sind wesentlich für die biologischen Funktionen des IVIG. Dies trifft auch zu für die immunmodulierenden Aktivitäten. Andererseits ist eine aufrechterhaltene Fc-Funktion wesentlich für die Wirkung von IVIG auf verschiedene phagozytische Zellen und die Aktivierung des Komplementsystems. Die Fc-Funktion kann gezeigt werden unter Verwendung verschiedener Techniken, aber eine akzeptierte Methodik, die in Ph. Eur. beschrieben wird, misst das Komplement aktivierende Potenzial von Antikörpern bei der Herstellung gegen Rubella-Antigen. Die Aktivität wird verglichen mit der eines biologischen Referenzpräparats (BRP, Ph. Eur.) von Immunglobulinen, die auf 100% gesetzt wird. Das Produkt erfüllt den Test, wenn die relative Aktivität größer als 60% des Referenzpräparats ist. Es scheint, dass die Fc-Funktion des erfindungsgemäßen Produkts sehr gut konserviert ist, insbesondere im Vergleich zu anderen analysierten Flüssigprodukten, höchstwahrscheinlich aufgrund des sanften Reinigungsverfahrens.
Unterklassenverteilung
Die Verteilung von IgG-Unterklassen wird gemessen mit der Standardimmundiffusionsmethode von Mancini im Wesentlichen wie von A. Ingild (Scand. J. Immunol. (1983), 17, 41) beschrieben. Die Konzentrationen werden bestimmt unter Verwendung eines WHO-Referenzserums (67/97). Es ist erforderlich, dass die Unterklassenverteilung in dem Bereich von normalem menschlichen Plasma liegt mit mittleren Konzentrationen im Bereich von 3,7 bis 10,2 g IgG1/l Serum, 1,1 bis 5,9 g IgG2/l Serum, 0,15 bis 1,3 g IgG3/l Serum und 0,06 bis 1,9 g IgG4/l Serum (R. Djurup et al., Scand. J. Clin. Lab. Invest. 48, 77–83). Somit ist die Unterklassenverteilung aller Produkte annehmbar.
IgA-Gehalt
Es ist bekannt, dass die Gegenwart von IgA möglicherweise eine Sensibilisierung von IgA-defizienten Empfängern verursacht. Wenn ein IgA-defizienter Patient ein IgA-haltiges Immunglobulinpräparat erhält, kann IgA als Fremdantigen angesehen werden und das Ergebnis kann die Induktion von Antikörpern gegen IgA in dem Empfänger sein. Wenn das nächste Mal ein IgA-haltiges Präparat dem Patienten infundiert wird, kann eine anaphylaktische Reaktion hervorgerufen werden. Es ist daher wesentlich, dass ein Immunglobulinpräparat so wenig IgA wie möglich enthält. IgA in einem IVIG-Produkt kann unter Verwendung der ELISA-Technik überwacht werden, z.B. wenn ein polyklonales Anti-IgA verwendet wird, um IgA einzufangen und markiertes Anti-IgA verwendet wird zum Nachweis von gebundenem IgA. Standards werden erzeugt durch Verdünnungen eines Kalibrators (Nr. X908, DAKO A/S, Dänemark) mit einem deklarierten IgA-Gehalt.
Das Produkt des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens enthält weniger als 2 mg IgA/l, was ein beträchtlich geringerer IgA-Gehalt ist als der der anderen analysierten Flüssigprodukte. Die physikalisch-chemischen Ähnlichkeiten zwischen IgG und IgA machen es schwierig, diese Immunglobuline während eines Reinigungsverfahrens zu trennen. Die beiden Anionen/Kationenaustauschchromatographiestufen in dem Verfahren reduzieren den IgA-Gehalt jedoch auf einen sehr niedrigen Pegel.
IgM-Gehalt
IgM in einem Ig-Präparat kann überwacht werden unter Verwendung von ELISA-Technik, z.B. wenn polyklonales Anti-IgM verwendet wird, um IgM einzufangen und markiertes Anti-IgM verwendet wird zum Nachweis. Standards werden erzeugt durch Verdünnungen eines Kalibrators (Nr. X908, DAKO A/S, Dänemark) mit deklariertem IgM-Gehalt. Aus der Tabelle ist ersichtlich, dass der IgM-Gehalt des erfindungsgemäßen Produktes sehr gering ist und deutlich geringer als der des anderen flüssigen Produktes.
Tween 80, TNBP und PEG
Tween 80, TNBP und PEG werden mit Standardverfahren gemessen. Im Allgemeinen sollte der Gehalt an diesen Additiven so gering wie möglich sein.
pH-Wert
Der pH-Wert der analysierten flüssigen Produkte ist sauer, pH 5,6 bis 5,7, wohingegen die analysierten lyophilisierten Produkte nach Auflösung neutral sind, mit einem pH von 6,7.
Gesamtproteinkonzentration
Gemäß Ph. Eur. sollte die Proteinkonzentration mindestens 50 g/l ± 10% sein; alle Produkte erfüllen dieses Erfordernis. Die Proteinkonzentration wird mit der Methode von Kjeldahl gemessen.
Maltose- und Glucosestabilisatoren
Saccharide werden allgemein als Stabilisatoren für Immunglobulinprodukte verwendet, sie haben gute stabilisierende Eigenschaften und werden schnell ausgeschieden. Der Gehalt an Maltose, Saccharose und Glucose wird unter Verwendung eines kommerziellen Kits (Boehringer Mannheim, Deutschland) bestimmt mit Maltose als Bezugswert.
Es scheint, dass die beiden lyophilisierten Produkte, die mit Albumin bzw. Albumin ebenso wie PEG stabilisiert sind, auch einen Saccharidstabilisator in Konzentrationen von etwa 15 mg/ml bis 20 mg/ml enthalten. Das erfindungsgemäße Produkt und das andere flüssige Produkt sind sehr gleichartig stabilisiert, d.h. mit etwa 9%, 88 mg/ml und 92 mg/ml Maltose. Im Hinblick auf den Gehalt an Polymeren und Aggregaten als Parameter der Stabilität hat das Produkt der Erfindung eine höhere Stabilität als das andere analysierte Flüssigprodukt, obwohl die Formulierungen sehr ähnlich zu sein scheinen.
Beispiel 3
Ergebnisse von klinischen Versuchen
Die klinischen Untersuchungen des erfindungsgemäßen Produktes, das auch als IVIG, SSI bezeichnet wird, werden gemäß den ICH- und CPMP/388/95-Richtlinien ausgeführt.
Pharmokokinetik, Wirkung und Sicherheit wurden untersucht. Die klinischen Versuche schlossen bisher vier Gruppen von Patienten ein: Patienten mit primärem Immunschwächesyndrom (15 Patienten), sekundärem Immunschwächesyndrom (6 Patienten), idiopathischer thrombozytopenischer Purpura (15 Patienten) und Patienten mit chronisch entzündlicher demyelinierender Polyneuropathie (5 Patienten).
Patienten mit primärem Immunschwächesyndrom oder sekundärem Immunschwächesyndrom wurden mit 0,2 bis 0,4 g/kg in Intervallen von 2 bis 5 Wochen behandelt. Patienten mit idiopathischer thrombozytopenischer Purpura wurden mit 400 mg/kg/Tag 5 Tage lang oder mit 1000 mg/kg/Tag 2 Tage lang behandelt.
Als Sicherheitsmaßnahmen wurden Serumtransaminasen, Serumkreatinin und Virusmarker bei allen Patienten bestimmt. Bei 5 Patienten mit idiopathischer thrombozytopenischer Purpura wurden Viren-, Nieren- und Lebersicherheitsmarker insgesamt 24 Wochen lang verfolgt.
Pharmakokinetik
T_½ wurde bis 30,5 Tage (Mittel) gemessen. Dies stimmt überein mit den Ergebnissen anderer IVIG-Arzneimittel.
Wirkung
Für Patienten mit primärem und sekundärem Immunschwächesyndrom wurden Tage, die durch Krankheit verloren gingen, Tage mit Krankheitsaufenthalt, Tage mit Antibiotika, Tage mit Fieber und die Anzahl an Lungenentzündungen rückblickend über einen Zeitraum von 6 Monaten registriert, während dem die Patienten mit anderen registrierten IVIG-Medikamenten behandelt worden waren. In den folgenden 6 Monaten, während denen die Patienten mit Immunglobulin SSI, flüssig, behandelt wurden, wurden die gleichen Parameter registriert.
Die Schlussfolgerung ist, dass Immunglobulin SSI, flüssig, so wirksam ist wie andere IVIG-Zusammensetzungen im Hinblick auf die Prophylaxe/Verhütung von Infektionen bei Patienten mit primärem und sekundärem Immunschwächesyndrom.
Bei 80% aller Patienten mit idiopathischer thrombozytopenischer Purpura erhöhte sich die Anzahl der Blutplättchen von < 30 × 10⁹/l vor der Behandlung mit Immunglobulin SSI, flüssig auf ≥ 50 × 10⁹/l nach der Behandlung. Der Anstieg der Plättchenzahl und die Dauer der Remission bei dem einzelnen Patienten waren auf gleicher Höhe wie nach Verabreichung der gleichen Dosis anderer IVIG-Medikamente in den Fällen, in denen ein Vergleich möglich war. Ein Patient, der IVIG zum ersten Mal erhielt, war für den Testwirkstoff refraktär. Eine solche Reaktion gegen IVIG ist nicht selten und daher nicht überraschend. Details über den Anstieg der Plättchen und die Dauer des Anstiegs werden derzeit festgestellt.
Die Schlussfolgerung ist, dass Immunglobulin SSI, flüssig ebenso wirksam ist wie andere IVIG-Medikamente bei der Behandlung von Patienten mit chronischer idiopathischer thrombozytopenischer Purpura mit niedriger Thrombozytenzahl.
Nach Ansicht von Ärzten und Patienten, die unter chronisch entzündlicher demyelinierender Polyneuropathie leiden, zeigte IVIG, SSI eine identische Wirksamkeit wie IVIG, das vor dem Versuch verabreicht worden war. IVIG, SSI wurde von den Patienten genauso gut toleriert, wie andere IVIG-Produkte von Patienten toleriert wurden.
Sicherheit
Außer einem ernsten Nebenwirkungsereignis, einer Splenektomie, für die gemäß dem Untersucher keine Beziehung zu dem Testwirkstoff festzustellen war, wurden nur geringe Nebenwirkungen registriert. Diese Nebenwirkungen waren hauptsächlich Kopfweh, Fieber und Erbrechen. Bis jetzt gab es keine Berichte über anomale vitale Zeichen während Infusionen von IVIG, SSI. Es wurden keine viralen Serokonversionen registriert. Es gab keine Berichte über Nieren- oder Leberschäden oder Fälle von anaphylaktischem Schock.
Die klinischen Untersuchungen zeigen, dass Immunglobulin SSI, flüssig, gut toleriert wird. Die Häufigkeit von Nebenwirkungen, der Grad und die Art weichen nicht von Erfahrungen mit anderen IVIG-Medikamenten ab.
Beispiel 4
Ergebnisse aus Stabilitätsstudien mit IVIG flüssig
Um zu testen, ob das flüssige IVIG-Produkt mit der Zeit stabil ist, wurde eine Echtzeitstudie unter Echtbedingungen auf Stabilität durchgeführt. Insgesamt vier aufeinander folgende Chargen (250 ml jeder Probe) des IVIG-Produktes wurden in der Studie eingesetzt und zwischen 2 und 8°C mindestens 12 Monate lang gelagert. Proben aus den vier Chargen wurden zum Zeitpunkt 0, nach 6 Monaten Lagerung und nach 12 Monaten Lagerung analysiert. Die Ergebnisse der Untersuchung sind unten als Mittelwert von vier Chargen dargestellt.
Alle oben erwähnten Tests wurden gemäß Ph. Eur. und wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt.
Die Beobachtung, dass der Gehalt an Monomeren und Dimeren über einen Zeitraum von 12 Monaten konstant ist, deutet darauf hin, dass sich keine Polymere in der Probe bildeten. Die Gegenwart von Immunglobulinpolymeren ist unter anderem bekannt als Ursache für schwere negative Wirkungen, häufig influenzaartige Symptome. Wegen der sehr hohen Stabilität des Immunglobulinproduktes, das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich ist, ist das Produkt im Wesentlichen frei von Polymeren und Aggregaten, sogar nach einem längeren Lagerungszeitraum.
Über den Zeitraum wird kein Anstieg der ACA beobachtet, obwohl Chargen, die eine ziemlich hohe ACA zeigten, absichtlich in dieser Stabilitätsstudie eingeschlossen waren. Wenn ein Anstieg der ACA beobachtet wurde, könnte er darauf hindeuten, dass Aggregate während der Lagerung gebildet wurden. Somit bedeutet die konstante ACA über den Zeitraum, dass keine Aggregate gebildet wurden.
Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass keine Präkallikreinaktivatoraktivität während der Lagerung des Produktes entwickelt wurde, da die PKA-Aktivität nicht anstieg. Es ist jedoch anzumerken, dass die gemessenen Werte unter dem unteren Quantifizierungsgrad sind.
Das Maß der Fc-Funktion deutet darauf hin, dass die Gegenwart von intaktem funktionellen IgG während der Lagerung aufrechterhalten wurde. Somit sind keine Proteasen in den Proben vorhanden, da diese die Proteine abbauen würden und dadurch die Fc- Funktion senken würden. Eine Denaturierung von IgG-Molekülen hat auch nicht stattgefunden, da dies die Antigenbindungsaktivität senken würde.
Wie es dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt ist, kann es Unterschiede in der Stabilität der verschiedenen Unterklassen von IgG geben. Wie aus den vorliegenden Ergebnissen zu erkennen ist, blieben alle Unterklassen während der Lagerung erhalten, was darauf hindeutet, dass das Produkt stabil ist. Dies wird weiter gestützt durch die Erkenntnis, dass die Proteinzusammensetzung von IgG in den Proben mit annähernd der gleichen Gesamtproteinkonzentration über den Zeitraum fast unverändert ist, was darauf hindeutet, dass es insgesamt keinen Abbau von IgG gab. D.h. das Produkt der vorliegenden Erfindung ist stabil und kann mindestens 12 Monate bei 2 bis 8°C aufbewahrt werden ohne bemerkenswerte Veränderungen der Eigenschaften und hierdurch werden Wirksamkeit und Sicherheit gezeigt.
Beispiel 5
Validierte Virusreduktionsstufen beim vorliegenden Verfahren für IVIG
Virusentfernung durch eine Trennstufe
Ausfällung von Virus, der in der Immunglobulinlösung vorhanden ist, durch Polyethylenglycol
Virusvalidierungsuntersuchungen wurden durchgeführt unter Anwendung von zwei kleinen nicht umhüllten Viren und die folgenden Virusreduktionen wurden erhalten:
Entfernung von 6,3 log₁₀ Hepatitis-A-Virus (HAV)
Entfernung von 7,2 log₁₀ Polio-Virus
Virusvalidierungsstudien wurden durchgeführt unter Anwendung von zwei umhüllten Viren, wobei die folgenden Virusreduktionen erreicht wurden:
Entfernung von 7,6 log₁₀ HIV
Entfernung von 7,5 log₁₀ BVDV
Virusinaktivierung durch eine S/D-Behandlungsstufe
Die Behandlung der Immunglobulinlösung mit 1 % Tween 80 + 0,3% TNBP bei 25°C über ≥ 6 Stunden.
Virusvalidierungsuntersuchungen wurden durchgeführt unter Anwendung von vier umhüllten Viren, wobei die folgenden Virusreduktionen erhalten wurden:
Inaktivierung von 7,4 log₁₀ HIV
Inaktivierung von 5,3 log₁₀ Sindbis-Virus
Inaktivierung von 4,1 log₁₀ BVDV
Inaktivierung von 5,1 log₁₀ PRV
Insgesamt 8 Validierungsstudien wurden durchgeführt für zwei verschiedene Stufen des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die PEG-Ausfällungsstufe wurde validiert als Virusentfernungsstufe unter Anwendung von vier verschiedenen Viren, zwei kleinen nicht umhüllten Viren, HAV und Polio-Virus, und zwei umhüllten Viren, HIV und BVDV, als Modell für Hepatitis-C-Virus. Diese Untersuchungen zeigten, dass alle vier Viren effizient durch PEG-Ausfällung entfernt wurden. Die PEG-Ausfällungsstufe wird daher als wirksame Virusentfernungsstufe validiert. Die S/D-Behandlung wurde validiert unter Anwendung von vier verschiedenen umhüllten Viren. Aus den Daten der Validierungsstudien ist ersichtlich, dass die S/D-Behandlungsstufe wirksam alle vier Viren inaktiviert. Die S/D-Behandlungsstufe wird daher validiert als wirksame Virusinaktivierungsstufe. Beide Virusreduktionsstufen im IVIG-Verfahren, Entfernung durch PEG-Ausfällung und Inaktivierung durch S/D-Behandlung, wurden als effizient validiert, um jeweils vier verschiedene Viren zu entfernen und zu inaktivieren. Die kumulativen Reduktionsfaktoren für HIV und BVDV in dem Prozess sind 15 bzw. 11,6. Dadurch kann das Produkt des vorliegenden Verfahrens als virussicher angesehen werden.

Claims

Verfahren zum Aufreinigen von Immunglobulin G (IgG) aus einer Rohimmunglobulin enthaltenden Plasmaproteinfraktion, wobei das Verfahren die Schritte beinhaltet: a) Herstellen einer wässrigen Suspension der Rohimmunglobulin enthaltenden Plasmaproteinfraktion; b) Hinzufügen eines wasserlöslichen, im Wesentlichen nicht-denaturierenden Proteinausfällungsmittel zu der Suspension aus Schritt (a) in einer Menge, die hinreichend ist, um das Ausfällen eines hohen Anteils von nicht-Immunglobulin G-Proteinen, aggregierten Immunglobulinen und Partikeln, einschließlich potenziell infektiösen Partikeln wie Viruspartikeln zu bewirken, ohne eine wesentliche Ausfällung von monomerem Immunglobulin G zu bewirken, wobei eine Mischung aus einem festen Niederschlag und einem flüssigen Überstand gebildet wird; c) Gewinnen eines gereinigten, Immunglobulin G enthaltenden Überstandes aus der Mischung von Schritt (b); d) Aussetzen des gereinigten, Immunglobulin G enthaltenden Überstandes aus Schritt (c) einem Anionenaustauscherharz und nachfolgend einem Kationenaustauscherharz, wobei das Anionenaustauscherharz und das Kationenaustauscherharz in Reihe verbunden sind und wobei der Puffer, der für die Anionenaustauschchromatographie und die Kationenaustauschchromatographie verwendet wird, der gleiche Puffer ist, und der pH-Wert des genannten gleichen Puffers geringer als 6,0 ist. e) Auswaschen von Proteinkontaminanten und dem Proteinfällungsmittel von dem Kationenaustauscherharz von Schritt (d) mit einem Puffer, der einen pH-Wert und eine Ionenstärke besitzt, die hinreichend dafür sind, die Kontaminanten von dem Harz zu entfernen, ohne eine erhebliche Elution von Immunglobulin G zu bewirken; f) Eluieren von Immunglobulin G von dem Kationenaustauscherharz von Schritt (e) mit einem im Wesentlichen nicht-denaturierenden Puffer, der einen pH-Wert und eine Ionenstärke besitzt, die hinreichend dafür sind, effiziente Elution des Immunglobulin G zu bewirken, wodurch ein Immunglobulin G enthaltendes Eluat gewonnen wird; g) Durchführen einer Dia-/Ultrafiltration mit dem das Immunglobulin G enthaltenden Eluat aus Schritt (f), um das Eluat zu konzentrieren und/oder zu dialysieren und ggf. Hinzufügen eines stabilisierenden Agens; h) Hinzufügen einer viruziden Menge eines Virus-inaktivierenden Mittels zu der Immunglobulin G enthaltenden, dia-/ultrafiltrierten und ggf. stabilisierten Fraktion aus Schritt (g), was eine im Wesentlichen Virus-sichere, Immunglobulin G enthaltende Lösung ergibt; i) Aussetzen der Immunglobulin G enthaltenden Lösung von Schritt (h) einem Anionenaustauscherharz und nachfolgend einem Kationenaustauscherharz; j) Waschen des Kationenaustauscherharzes aus Schritt (i) mit einem Puffer, der einen pH-Wert und eine Ionenstärke besitzt, die hinreichend dafür sind, die Proteinkontaminationen und das Virus-inaktivierende Mittel von dem Harz auszuwaschen, ohne eine erhebliche Elution von Immunglobulin G zu bewirken; k) Eluieren von Immunglobulin G von dem Kationenaustauscherharz aus Schritt Q) mit einem im Wesentlichen nicht-denaturierenden Puffer, der einen pH-Wert und eine Ionenstärke besitzt, die hinreichend dafür sind, effiziente Elution des Immunglobulin G zu bewirken, wodurch ein Immunglobulin G enthaltendes Eluat gewonnen wird; und l) Unterwerfen des Immunglobulin G enthaltenden Eluates aus Schritt (k) einer Dia-/Ultrafiltration, um die Ionenstärke zu verringern und Immunglobulin G aus der Lösung zu konzentrieren, und Einstellen der Osmolalität durch Hinzufügen eines Saccharids.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Immunglobulin G enthaltende Plasmaproteinfraktion ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cohnfraktion II; Cohnfraktionen II und III; und Cohnfraktionen I, II und III.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Suspension in Schritt (a) auf einer Temperatur von 0°C bis 12°C gehalten wird und die Suspension in Schritt (a) auf einem pH-Wert unterhalb 6 gehalten wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Proteinfällungsmittel in Schritt (b) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenglycol (PEG), Caprylsäure und Ammoniumsulfat.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Proteinfällungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus PEG innerhalb des Molekulargewichtbereiches 3000-8000 Da, wie z.B. PEG 3350, PEG 4000, PEG 5000 und PEG 6000.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Anionenaustauscherharz und das Kationenaustauscherharz in Schritt (i) in Reihe verbunden sind.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der für die Anion-enaustauschchromatographie und die Kationenaustauschchromatographie verwendete Puffer der gleiche Puffer ist und der pH-Wert des genannten gleichen Puffers geringer als 6,0 ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Anionenaustauscherharz in Schritt (d) und/oder Schritt (i) Diethylaminoethylgruppen enthält und/oder das Kationenaustauscherharz in Schritt (d) und/oder Schritt (i) Carboxy methylgruppen enthält, wobei die Harze bevorzugt DEAE Sepharose FF® und CM Sepharose FF^® sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Puffer, der in den Schritten (b) bis (I) verwendet wird, ein Acetatpuffer, wie z.B. ein Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 5,0–6,0 und mit einer Molarität von 5–25 mM ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Virusinaktivierende Mittel in Schritt (h) eine Mischung von wenigstens einem nichtionischen oder ionischen Detergenz und wenigstens einem Lösungsmittel ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Virusinaktivierende Mittel in Schritt (h) eine Mischung von wenigstens einem im Wesentlichen nicht-denaturierenden Detergenz und wenigstens einem Tri(niederalkyl)phosphatlösungsmittel ist.
Immunglobulinerzeugnis, das erhältlich ist mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
Immunglobulinerzeugnis nach Anspruch 12 mit den folgenden Eigenschaften: a) eine Reinheit von mehr als 98%, b) ein Gehalt an IgG-Monomeren und -Dimeren von mehr als 98,5%, c) ein Gehalt an IgA von weniger als 4 mg IgA/I und d) ein Gehalt an IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4.
Immunglobulinerzeugnis nach Anspruch 13, das kein Detergenz, PEG oder Albumin als Stabilisator enthält.
Immunglobulinerzeugnis nach Anspruch 13 oder 14, das weniger als 3 mg/l IgA enthält.
Immunglobulinerzeugnis nach einem der Ansprüche 13 bis 15, das zwischen 55 und 65% IgG1, zwischen 30 und 40% IgG2, zwischen 2 und 5% IgG3 und zwischen 1 und 4% IgG4 enthält.
Immunglobulinerzeugnis nach einem der Ansprüche 13 bis 16, das weniger als 0,5% Polymere und Aggregate enthält.
Immunglobulinerzeugnis nach einem der Ansprüche 13 bis 17, das eine Flüssigkeit ist.
Immunglobulinerzeugnis nach einem der Ansprüche 13 bis 18 zur Verwendung im Bereich der Medizin.
Immunglobulinerzeugnis nach Anspruch 19 zur sofortigen intravenösen Verabreichung.
Verwendung eines Immunglobulinerzeugnisses nach einem der Ansprüche 13 bis 20 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines Säugers mit PID (Primary Immune Deficiency, Primäre Immunschwäche), SID (Secondary Immune Deficiency, Sekundäre Immunschwäche), ITP (idiopathische thrombocytopenische Purpura), Polyradiculitis, peripheren Polyneuropathien, Kawasaki-Krankheit, Polymyositis, schweren chronischen Autoimmunkrankheiten, chronischer entzündlicher Entmarkungspolyneuropathie (CIDP), multifokaler motorischer Neuropathie, Multipler Sklerose, Myasthenia Gravis, Pseudomyasthenie, Optikusneuritis, Epilepsie, Abortus habitualis, primärem Antiphospholipidsyndrom, rheumatoider Arthritis bzw. Polyarthritis, systemischem Lupus erythematodes, systemischer Sklerodermie, Vaskulitis, Wegener-Granulomatose, Sjögren-Syndrom, juveniler Polyarthritis, Autoimmunneutropenie, autoimmunhaemolytische Anaemie, Neutropenie, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Zöliakie, Asthma, septischem Schocksyndrom, chronischem Ermüdungssyndrom, Psoriasis, toxischem Schocksyndrom, Diabetes, Sinuitis, dilatierter Kardiomyopathie, Endokarditis, Atherosklerose, und von Erwachsenen mit AIDS und Bakterieninfektionen.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei der Säuger ein Mensch ist.