-
Die
vorliegende Erfindung betrifft einen Lactobacillusstamm, der wertvolle
pharmazeutische Eigenschaften aufweist. Die Erfindung betrifft auch
eine pharmazeutische Zusammensetzung und Produkte für die persönliche Pflege,
welche diesen Stamm umfassen, und ferner die Verwendung des Stamms
zur Verhinderung von urogenitalen Infektionen.
-
Technischer
Hintergrund
-
(Die
Offenbarung aller in der folgenden Beschreibung zitierten Dokumente
wird durch Bezugnahme inkorporiert.)
-
Die übliche Bakterienflora
im Urogenitalbereich wird von einem komplexen Ökosystem aufgebaut, das mehr
als 50 unterschiedliche Bakterienspezies umfaßt (Hill et al., Scand. J.
Urol. Nephrol. 1984; 86 (Suppl.): 23-29). Die normale Flora wird
durch Bakterien dominiert, die zur Gattung Lactobacillus (LB) gehören, wobei es
sich um gram-positive Stäbchen
handelt, die an die Umgebung in der Vagina einer fruchtbaren Frau
adaptiert sind. Diese Bakterien tragen auch zu dem spezifischen
Milieu und dem ökologischen
Gleichgewicht in der Vagina bei.
-
Abgesehen
von dem komplexen Wechselwirkungsmuster der vielfältigen Bakterienflora
der Vagina und des Rests des urogenitalen Bereichs, ist es notwendig, Änderungen
der physikalischen Bedingungen zu berücksichtigen, die das Bakterienwachstum
und Adhäsionseigenschaften
beeinflussen können.
Einige LVS-Stämme
inhibieren das Wachstum von möglicherweise
pathogenen Bakterien durch verschiedene Mechanismen. Der Metabolismus
der LB führt
zur Bildung von organischen Säuren,
vor allem Milchsäure
und Essigsäure,
welche zu dem geringen pH der Vaginalflüssigkeit beitragen, der für manche
andere Spezies ungünstig
ist. LB können
auch lösliche
Substanzen produzieren, die das Wachstum von potentiell pathogenen Bakterien
und Hefen direkt inhibieren. Sie können ferner Wasserstoffperoxid
produzieren, der für
Bakterien toxisch ist, denen es an dem Enzym Katalase fehlt, beispielsweise
gram-negativen anaeroben Stäbchen
und Enterobacteriacae. Diese inhibierenden Eigenschaften können erheblich
zwischen den einzelnen LB-Stämmen variieren
(Hooton et al., JAMA 1990; 265: 64-69).
-
Die
Schwäche
des natürlichen
Verteidigungssystems gibt potentiell pathogenen Mikroorganismen
die Möglichkeit,
klinische Infektionen zu verursachen, beispielsweise in Verbindung
mit Medikation, schlechter persönlicher
Pflege oder Verschiebungen in der Mikroflora der Haut oder der Schleimmembrane.
Die normale Flora der Vagina wird durch LB dominiert und der umgebende
pH ist weniger als 4,5. Hefen und Enterobakterien sind selten oder
fehlen vollständig
(Redondo-Lopez et
al., Rev. Inf. Dis. 1987; 12: 856-872). Verschiebungen der vaginalen
Bakterienflora kann man in Verbindung mit unterschiedlichen pathogenen
Bedingungen finden. Bei Frauen, die an wiederaufbrechenden Harntraktinfektionen
leiden, kommt es zu einer erhöhten
Menge an Enterobakterien in der Vagina und der Harnröhrenöffnung,
und diese weisen ferner eine an Lactobacilli abgereicherte Harnflora
auf (Marrie et al., J. Clin. Microbiol. 1976; 8: 67-72). Es ist
auch bekannt, daß die
Häufigkeit von
Infektionen in Verbindung mit der Antibiotikabehandlung von anderen
Infektionen zunimmt (Stamey, Rev. Inf. Dis. 1987: 9 (Suppl. 2):
195-208; Reid et al., Curr. Opin. Inf. Dis. 1991: 4: 37-41). Darüber hinaus
wurde gezeigt, daß Kinder,
die eine Vorgeschichte mit häufigen
Episoden von Antibiotikabehandlungen hinter sich haben, dafür empfänglicher
sind, Harntraktinfektionen einzufangen (Märild et al., Ped. Inf. Dis.
1990; 22: 43-47).
-
Bei
der bakteriellen Vaginosis verringert sich die LB-Menge und erhöht sich
der pH. Es gibt auch eine Dominanz von Bacterioides-Spezies, Gardnerella
vaginalis und Mobiluncus (Redondo-Lopez, siehe oben). Vaginisis,
die in Verbindung mit einer erhöhten
Enterobakterienmenge auftritt, ist oft ein greifbares Problem in Verbindung
mit einer Antibiotikabehandlung. Die übliche orale Verabreichung
von Penicillin führt
zu der Anreichung der Substanz in der Vaginalflüssigkeit (Sjöberg et
al., Obstet. Gynecol. 1990; 75: 18-21), gefolgt von einer Besiedlung
durch Enterobakterien und Hefe (Sjöberg et al., Gynecol. Obstet.
Invest. 1992; 33: 42-46). Untersuchungen bei Affen (Macaca fascicularis)
haben offenbart, daß die
vaginale Verabreichung von Amoxicillin die Fähigkeit der normalen Bakterienflora
verschlechtert, die Besiedlung von für den Harntrakt pathogenen
E. coli zu inhibieren (Herthelius et al., Infektion 1988; 16: 263-266).
-
Während der
Schwangerschaft kann die Zusammensetzung der Vaginalflora die Sterblichkeit
des Fötus
und Kinds beeinflussen. Das Auftreten von Gruppe B Streptococci
(GBS) in der Fäkal-
und Vaginalflora ist üblich
(bei bis zu 30 aller schwangeren Frauen). Diese Bakterien stellen
normalerweise keine Bedrohung für die
Gesundheit der Frau dar. GBS können
jedoch ernsthafte Infektionen beim neugeborenen Kind verursachen.
In diesen Fällen
werden die Bakterien vertikal von der Mutter zum Kind vor oder in
Verbindung mit der Geburt übertragen.
Andere Bakterien können
ebenfalls auf diese Weise übertragen
werden und Infektionen beim Kind verursachen. Ferner besteht eine
enge Verbindung zwischen bakterieller Vaginosis und Frühgeburt (Martius
et al., Arch. Gynecol. Obstet. 1990; 247: 1-13). Die Mechanismen
hinter diesen Phänomen
sind nicht bekannt. Es wurde gezeigt, daß eine Verschiebung der vaginalen
Flora in Richtung auf eine Dominanz von gram-negativen Spezies die
Menge des Enzyms Phospholipase A2 erhöht, was wiederum die Prostaglandinsynthese
ausgehend von Arachidonsäure
auslöst
(Bejar et al., Obstet. Gynecol. 1981; 57: 479-482). Die Vaginosisflora
produziert ferner große
Menge an Endotoxin (Sjöberg
et al., Obstet. Gynecol. 1991; 77: 265-266), welches die endogene
Prostaglandinsynthese induzieren kann (Romero et al., Obstet. Gynecol.
1989; 73: 31-34), die möglicherweise
durch Interleukine vermittelt wird.
-
Die
theoretisch positiven Eigenschaften von LB haben ihren Gebrauch
in kommerziellen Präparaten motiviert
mit der Absicht, die Vaginalflora zu ergänzen und zu kräftigen.
Der Erfolg war unterschiedlich und oft enthalten die verfügbare Präparate erhebliche
geringere LB-Zahlen als das, was angegeben wird. Einige Präparate waren
auch kontaminiert (Hughes et al., Obstet. Gynecol. 1990; 75(2):
244-248). Um die normale Bakterienflora im Urogenitalbereich durch
die Zugabe von LB zu ergänzen
und zu verbessern, ist es notwendig, den zu verwendenden Bakterienstamm
sorgfältig
auszuwählen.
Ein für
diesen Zweck geeigneter LB-Stamm sollte die folgenden Kriterien
erfüllen:
- 1. Der LB-Stamm sollte große Mengen an löslichen
Substanzen mit einer wachstumsinhibierenden Kapazität gegenüber Enterobakterien,
Streptokokken der Gruppe B, Staphylokokken und Hefe produzieren.
- 2. Der LB-Stamm sollte dazu in der Lage sein, auf die Haut und
die Schleimhautoberflächen
des Urogenitalbereichs übertragen
zu werden.
- 3. Der LB-Stamm sollte in der Lage sein, an den Epitheloberflächen im
Urogenitalbereich zu haften.
- 4. Der LB-Stamm sollte in der Lage sein, eine Lagerung über einen
längeren
Zeitraum auszuhalten, und es muß möglich sein,
den Stamm in unterschiedlichen Präparatarten zu induzieren.
- 5. Der LB-Stamm sollte in der Lage sein, seine Lebensfähigkeit
und Eigenschaften in einem Artikel oder einem Präparat beim Gebrauch aufrechtzuerhalten.
- 6. Der LB-Stamm sollte nicht gegenüber spermiziden Präparaten,
die Nonoxynol-9 enthalten, empfindlich sein.
- 7. Der LB-Stamm sollte aus dem Urogenitaltrakt einer Frau isoliert
sein.
- 8. Der LB-Stamm sollte die Existenz der menschlichen urogenitalen
LB-Flora erlauben.
-
Daher
besteht ein Bedarf nach Stämmen,
welche diese Anforderungen erfüllen.
-
Zusammenfassung
der Erfindung
-
Ein
neuer Lactobacillus plantarum-Stamm, der als LB931 bezeichnet wird,
wurde isoliert, der die oben angeführten Anforderungen erfüllt. Der
Stamm wurde bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen, Braunschweig,
Deutschland hinterlegt. Ihm wurde die Zugangsnummer DSM11918 zugeteilt.
Dementsprechend kann man LB931 zur Behandlung und/oder zum Vorbeugen
von Urogenitalinfektionen verwenden. LB931 kann vorteilhafterweise
in pharmazeutischen Zusammensetzungen und in Produkten für die persönliche Pflege,
wie Windeln und Damenbinden, enthalten sein.
-
Definitionen
-
Wie
hier offenbart, bezieht sich der Ausdruck "LB" auf
Bakterien der Gattung Lactobacillus.
-
Wie
hier offenbart, bezieht sich der Ausdruck "Urogenitalbereich" auf das Perineum (Damm), die Harnröhre und
die Vagina.
-
Wie
hier offenbart, bezieht sich der Ausdruck "absorbierender Gegenstand" auf Produkte, die
sich dazu eignen, Körperflüssigkeit
zu absorbieren, wie Blut oder Urin. Beispiele für solche Artikel sind Produkte
für die
weibliche Hygiene, Inkontinenzschutz und Windeln.
-
Wie
hier offenbart, bezieht sich der Ausdruck "GBS" auf
Streptokokkus der Gruppe B.
-
Wie
hier offenbart, bezieht sich der Ausdruck "Milchsäurebakterien" auf Bakterien, die
Milchsäure
produzieren, wie Bakterien, die zu den Gattungen Lactobacillus und
Lactococcus gehören.
-
Mit
dem Ausdruck "cfu" sind koloniebildende
Einheiten ("colony-forming
units") gemeint.
-
Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Stamm von Lactobacillus
plantarum, der als LB931 (DSM11918) bezeichnet wird. Dieser Bakterienstamm
ist wertvoll zum Verhindern und/oder Behandeln von urogenitalen
Infektionen, da er das Wachstum einer großen Zahl von pathogenen Mikroorganismen
inhibiert. Der Stamm ist haltbar und überlebt leicht lange Lagerungsperioden
bei Raumtemperatur. Dementsprechend zeigen LB931-haltige Produkte
eine lange Lagerbeständigkeit.
Der Stamm kann leicht auf die menschliche Haut und das vaginale
Epithel übertragen
werden. LB931 ist resistent gegenüber therapeutischen Konzentrationen
mancher antibiotischer Substanzen und spermaziden Verbindungen.
-
Die
Inhibierungseigenschaften von LB931 sind untersucht worden. Beispiele
für Bakterienspezies,
die erfolgreich inhibiert wurden, sind Escherichia, Klebsiella,
Proteus, Staphylococcus und Streptokokkus der Gruppe B. LB931 ist
daher beim Verhindern und/oder Behandeln von Infektionen von Nutzen,
die durch diese Mikroorganismen verursacht werden.
-
Wie
zuvor angemerkt, stellt die vorliegende Erfindung auch eine Vielzahl
von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Verfügung, die sich vorzugsweise
für die
topische Verabreichung eignen, und die LB931 zusammen mit pharmazeutisch
oder physiologisch annehmbaren Trägern, Vehikeln und/oder Verdünnungsmitteln
umfassen. Im allgemeinen sollten solche Träger nicht-toxisch für den Einnehmenden
bei den eingesetzten Dosen und Konzentrationen sein. Normalerweise
beinhaltet die Herstellung solcher Zusammensetzungen die Kombination
des therapeutischen Mittels mit Puffern, Verdickungsmitteln aus
gelbildenden Mitteln, wie Glycerin, Polyethylenglycol etc.. Antioxidationsmittel,
wie Ascorbinsäure,
niedermolekulargewichtige (weniger als etwa 10 Reste) Polypeptide,
Proteine, Kohlenhydrate einschließlich von Glucose, Saccharose
und Dextrinen, und andere Stabilisatoren und Vehikel können enthalten
sein. Mögliche
pharmazeutische Zusammensetzungen sind Salben, Cremes, flüssige Lösungen,
Zäpfchen
oder Kapseln.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft auch absorbierende Gegenstände, die
LB931 umfassen. Ein solcher Gegenstand kann eine durchlässige äußere Lage,
die in engem Kontakt mit der Haut des Trägers sein soll, eine vorzugsweise
flüssigkeitsundurchlässige Rücklage,
die beim Gebrauch vom Träger
entfernt liegen soll, und eine zwischen der äußeren Lage und der Rücklage angeordnete
absorbierende Struktur umfassen. In manchen Fällen kann eine zusätzliche
Lage, beispielsweise in der Form einer Watte oder eines ähnlichen
Materials, zwischen der äußeren Lage
und der absorbierenden Struktur plaziert sein. Man kann die antagonistische Eigenschaften
aufweisenden Mikroorganismen in unterschiedlichen Teilen des absorbierenden
Gegenstands anordnen, beispielsweise in der äußeren Lage, in der absorbierenden
Struktur des absorbierenden Gegenstands, zwischen zwei Schichten
des absorbierenden Gegenstands, in einem lockeren Einlageprodukt
in dem absorbierenden Gegenstand oder auf andere Weise.
-
Die
vorliegende Erfindung wird nun anhand der beigefügten Figuren näher beschrieben,
in denen:
-
1 ein
Diagramm ist, das die Stabilität
von gefriergetrockneten LB931 bei Raumtemperatur (+22°C) und bei
+6°C zeigt;
-
2 ein
Diagramm ist, das die Stabilität
von LB931 zeigt, mit denen ein absorbierender Gegenstand imprägniert wurde;
-
3 und 4 die
Menge an LB931 zeigen, die auf die Harnleiteröffnung und die perineale Haut
bei jungen Mädchen übertragen
wurde, nach der Verwendung einer LB931 umfassenden Slipeinlage.
-
Die
vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele beschrieben.
-
Beispiel 1: Isolierung
und Typisierung von Lactobacillus plantarum, Stamm LB931
-
Gesunden
Frauen wurden Bakterienproben entnommen. Aus diesen Proben isolierte
man Bakterienstämme,
und diese Stämme
wurden auf der Grundlage ihrer Fähigkeit,
das Wachstum von Enterobakterien zu inhibieren, gescreent (Daten
nicht gezeigt). Der beste Stamm, der aus einer gesunden schwangeren
Frau isoliert wurde, wurde als Lactobacillus plantarum gemäß dem Testkit
API 50 CH (API systems, BioMerieux, FR) klassifiziert und als LB931
bezeichnet. Der Stamm wurde ferner durch DNA-Analyse mit SDS-page
bei BCCM/LMG (Belgien) als Lactobacillus plantarum-pentosus-paraplantarum
typifiziert.
-
Beispiel 2: Inhibierungsfähigkeit
des Stamms LB931
-
Der
Zweck dieses Experiments war es, die Fähigkeit des Stamms LB931, das
Wachstum von anderen Bakterien zu inhibieren, zu verdeutlichen.
LB931 wurde in MRS-Brühe
(Merck, DE) bei einer Temperatur von 37°C in 5 % CO2 über Nacht
kultiviert. Man gab 1 ml, der 108 Bakterien
enthielt, zu 25 ml geschmolzenem 2 %igem Agar in MRS-Brühe. Die
Mischung wurde in eine Petrischale gegossen, kongelieren gelassen
und wie zuvor beschrieben 24 Stunden inkubiert. Weitere 25 ml des
M17-Agars (Merck, DE) wurden auf die erste Schicht gegossen und
man ließ die
Platten 4 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Ähnliche Agarplatten ohne LB931
wurden ebenfalls hergestellt und als Kontrollplatten verwendet.
-
Die
Indikatorbakterien wurde getrennt in einem TY-Medium (Holm et al.,
APMIS 1967; 69, 264) bei 37°C
in Luft kultiviert. Die Kulturen wurden in eine Bertanischale mit
25 Abteilungen überführt, wobei
jede Abteilung 0,25 ml (106 Bakterien/ml)
hielt. Aus jeder dieser Schalen wurden die Bakterien überführt und
auf die Lactobacillus enthaltenden Agarplatten gestempelt unter
Verwendung von Steers Stahlstiftreplikator (Steers et al., J. Antibiot.
Chemother. 1979; 9, 307). Die Platten wurden bei 37°C über Nacht
inkubiert. Die Platten wurden gelesen und man stellte fest, ob a)
die Indikatorbakterien gewachsen waren; b) das Wachstum der Indikatorbakterien
inhibiert wurde oder c) es zu keinem Wachstum der Indikatorbakterien
gekommen war. Der pH einer jeden Platte wurden ebenfalls überwacht.
-
Die
Ergebnisse der Störtests
werden in Tabelle I gezeigt.
-
-
Die
Ergebnisse zeigen, daß Lactobacillus
plantarum, LB931, das Wachstum einer großen Zahl von Bakterienstämmen inhibiert
oder verhindert, während
andere Lactobacillusstämme
weitgehend unbeeinträchtigt
bleiben.
-
Beispiel 3: Die Überlebensfähigkeit
von LB931 in unterschiedlichen Präparaten
-
- a) In einer Suspension aus gleichen Teilen
Magermilch und 0,9 %iger NaCl aufgelöste LB931
LB931 wurde
in Magermilch aufgelöst,
die 0,9 % NaCl enthielt. Die aufgelösten Bakterien wurden dann
bei unterschiedlichen Temperaturen inkubiert. Die Menge der Bakterien
wurde kontinuierlich durch Zellzählung überwacht.
Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle II beschrieben. Tabelle
II Die Ergebnisse zeigen, daß LB931 in einer Mischung aus
Magermilch und NaCl über
einen Zeitraum von einem Monat bei +4°C stabil sind.
- b) Ein Magermilchpräparat
mit LB931 wurde nach Standardverfahren gefriergetrocknet. Das erhaltene
Pulver wurde in Petrischalen bei Raumtemperatur und bei +6°C gelagert.
Die Zahl der Bakterien wurde nach 7 bzw. 25 Tagen bestimmt. Die
Ergebnisse werden in Tabelle III beschrieben. Tabelle
III Die Zahl der Bakterien in dem gefriergetrockneten
Pulver wurde ebenfalls jede vierte Woche bis zur 68. Woche überwacht.
Diese Ergebnisse werden in 1 präsentiert.
Angesichts der Figur ist es offensichtlich, daß LB931 bei Raumtemperatur
und +6°C
22 Wochen stabil sind. Nach einem Jahr bei +6°C sind mehr als 105 cfu/mg
LB931 lebensfähig.
- c) Man testete die Fähigkeit
von LB931, in synthetischem Urin mit einem pH von 6,6 zu überleben.
Der synthetische Urin enthielt mono-, ein divalentes Kat- und Anionen
und ferner Harnstoff, und wurde nach den Spezifikationen in Geigy,
Scientific Tables, Bd. 2, B. Ausg. 1981, S. 53, hergestellt. Zu
dem sterilen synthetischen Urin gab man ein Nährmedium für Mikroorganismen. Das Nährmedium
wurde gemäß den Daten von
der Zusammensetzung der Hook- und FSA-Medien hergestellt. Zu 1 ml
synthetischem Urin gab man 103 LB931-Bakterien
und inkubierte die Proben 18 h bei 32°C. Nach der Inkubation betrug
die Bakterienzahl in der Probe > 105/ml. LB931 ist in der Lage, in synthetischem
Urin zu überleben
und zu wachsen.
- d) Man untersuchte die Fähigkeit
von LB931, auf einem absorbierenden Gegenstand (Slipeinlage) zu überleben.
Man gab eine Suspension von LB931 (150 μl) zu dem absorbierenden Gegenstand
und lagerte den Gegenstand danach in einer dichten Verpackung bis
zu 9 Monate lang. Die Ergebnisse werden in 2 gezeigt.
Eine große
Bakterienzahl überlebte
7 Monate.
- e) Schließlich
testete man die LB931 hinsichtlich ihrer Eigenschaften während einer
Wachstums- und Lagerperiode. Man kultivierte LB931 in MRS-Brühe und überführte alle
drei Tage über
einen Zeitraum von drei Monaten. Danach wurde die LB931 Anfangsprobe
und die letzte überführte Probe
im API-Test, PGFE- und Störtest
verglichen. Die beiden Proben waren in allen Tests identisch. Dies
zeigt, daß LB931
sehr stabil nach der Lagerung und mehreren Überführungen in einem Wachstumsmedium
ist.
-
Beispiel 4: Transfer von
LB931 auf die Haut des Perineums und die Harnleiteröffnung bei
Frauen
-
Um
den Transfer von LB931 auf das Perineum beim Tragen einer Slipeinlage
zu untersuchen, führte man
die folgende Untersuchung durch. Alle Testpersonen waren Frauen
im Alter von 12 bis 60 Jahren, und man führte die Tests zwischen den
Menstruationsperioden, soweit auftretend, durch. Die Testprodukte
wurden aus einer herkömmlichen
Slipeinlage hergestellt, die eine flüssigkeitsdurchlässige äußere Schicht,
eine flüssigkeitsundurchlässige Rückschicht
und dazwischen eine absorbierende Schicht mit 100-200 g/m2 durch chemischen Aufschluß hergestellten
Zellulosezellstoff umfaßte.
Man sprühte
eine Suspension von LB931-Bakterien auf die absorbierende Seite
des Testprodukts in einer Menge von 109 koloniebildenden
Einheiten pro Produkt.
-
Um
die Gegenwart der LB931 im Perineum der 13 Testpersonen zu bestimmen,
führte
man einen sogenannten Abstrichtest durch. Die Bakterien wurden gesammelt,
indem man einen sterilen Stab mit einer Baumwollspitze, den man
in eine sterile Natriumchloridlösung
getaucht hatte, über
einen definierten Hautbereich rieb. Man bestimmte das Auftreten
von LB931 und anderen LBs auf der Haut des Perineums und der Harnleiteröffnung.
Die Testpersonen wurde auf diese Weise untersucht, um eine Vergleichsprobe
zu erstellen. Dann trugen die Testpersonen die Slipeinlage 5 Stunden
lang am Morgen. Die Slipeinlage wurde entfernt und man bestimmte
erneut das Auftreten von hinzugefügten Milchsäurebakterien und natürlichen
Milchsäurebakterien
direkt nach dem Entfernen der Slipeinlage. Diese Probe wurde als
Probe 1 bezeichnet. Nach 4-5 weiteren Stunden wurde eine weitere
Probe genommen und als Probe 2 bezeichnet. Der Milchsäurebakterien-Typus
wurde mit Hilfe von Rogosa-Agar mit Vancomycin für LB931 und anaerob inkubierten
Rogosa-Agarplatten für
andere LBs identifiziert. Eine weitere Identifizierung wurde durch
API (BioMerieux, FR) und PFGE ("pulsed field
electrophoresis",
Elektrophorese mit gepulstem Feld) vorgenommen. Die Ergebnisse werden
in Tabelle IV gezeigt. LB931 konnte auf der Haut des Perineums oder
auf der Harnleiteröffnung
bei allen Frauen nach dem Gebrauch einer mit LB931 besprühten Slipeinlage
nachgewiesen werden.
-
-
Beispiel 5: Übertragung
von LB931 auf die Haut des Perineums und die Harnleiteröffnung bei
Mädchen
-
13
junge Mädchen
im Alter von 3 bis 12 Jahren beteiligten sich an dieser Studie.
Man erhielt Bakterienproben von der Haut des Perineums und der Harnleiteröffnung,
indem man zunächst
einen Baumwollstab in MRS-Brühe
tauchte und dann den Stab sanft auf der Haut oder Epitheloberfläche rieb.
Schließlich
wurde der Abstrich in ein Probenröhrchen getaucht, das MRS-Brühe enthielt.
Man erhielt die Proben nach dem folgenden Schema:
- Probe
0: Eine Vergleichsprobe wurde am Abend vor dem Beginn der Studie
mit den LB931-Bakterien erhalten. Abend, Tag 1; eine Slipeinlage
wird angelegt.
- Probe 1: Morgen, Tag 2. Eine neue Slipeinlage wird während des
Tages getragen.
- Probe 2: Eine Probe wird am Abend vor einem optionalen Bad und
vor dem Anlegen einer neuen Slipeinlage genommen. Abend, Tag 2;
- Probe 3: Gleiches Verfahren wie für Probe 1. Morgen, Tag 3;
- Probe 4: Gleiches Verfahren wie für Probe 2. Abend, Tag 3;
- Probe 5: Gleiches Verfahren wie für Probe 1. Morgen, Tag 4;
- Probe 6: Eine Probe wird am Abend vor einem optionalen Bad genommen.
Während
der Nacht wurde keine Slipeinlage getragen. Abend, Tag 4;
- Probe 7: Eine Probe wird am Morgens des Tags 5 genommen. Während des
Tags wurde keine Slipeinlage getragen.
- Probe 8: Die letzte Probe wird am Abend des Tags 5 genommen.
-
Die
Ergebnisse werden in 3 (Harnleiteröffnung)
und 4 (Perineumhaut) präsentiert. Die Ergebnisse zeigen,
daß LB931
von einem absorbierenden Gegenstand übertragen werden kann.
-
Beispiel 6: Empfindlichkeit
gegenüber
Antibiotika und spermaziden Mitteln
-
Man
bestimmte die MIC-Werte von Lactobacillus plantarum LB931 mit einem
E-Test (Brown et al., J. Antimicrob. Chemother. 991; 27: 185-190).
Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle V beschrieben.
-
-
Die
Empfindlichkeit gegenüber
antibiotischen Substanzen wurde ebenfalls mit dem SIR-System bestimmt.
In Tabelle VI bedeutet S empfindlich und R resistent.
-
-
LB931
ist gegenüber
einigen Antibiotika empfindlich, die üblicherweise für Infektionen
des Harntrakts verschrieben werden, aber LB931 ist auch beispielsweise
gegenüber
Nalidixinsäure
und Norfloxacin resistent. LB931 zeigt auch Resistenz gegenüber Vancomycin.
-
Ferner
führte
man MIC-Tests für
das spermazide Mittel Tergitol durch. LB931 wurde auf einem MRS-Agar
in 5 % CO2 bei 37°C 48 h lang kultiviert. Die
Bakterien wurden in 3 ml MRS-Brühe inokuliert
und 10 h unter den gleichen Bedingungen wie zuvor beschrieben inkubiert.
1,5 % der Kultur wurde erneut in 3 ml MRS-Brühe inokuliert und unter den
gleichen Bedingungen 18 h inkubiert. Man verdünnte NP-9 Tergitol (Sigma,
US), Charge 47F0002 in MRS-Brühe
mit einer Temperatur von 37°C
(reduzierte Viskosität)
zu einer Stammlösung
von 40 %. Mit dieser Stammlösung
stellte man 3 ml-Lösungen
der folgenden Konzentrationen her: 0 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 % und
40 %. Man gab 10 μl
Bakterienkultur zu jeder Lösung.
Die Vergleichsprobe wurde MRS-Agarplatten beigemischt und hinzugefügt. Man
ließ die
Platten in 5 % CO2 bei 37°C 48 h lang wachsen,
um die Zelldichte zu bestimmen. Der Rest der Lösungen wurde ohne Mischen in
5 % CO2 bei 37°C 18 h lang inkubiert. Man verdünnte je
30 % und 40 % NP-9 enthaltende Lösungen
in 37°C
MRS-Brühe
(reduzierte Viskosität).
Alle Lösungen
wurden kräftig
gemischt, in sterilem 0,9 %igem NaCl verdünnt und zu MRS-Agarplatten
gegeben. Man inkubierte die Platten in 5 % CO2 bei
37°C über 48 h,
um die cfu/ml zu bestimmen.
-
Die
Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle VII beschrieben.
-
Die
inokulierte LB931-Menge betrug 1,0 × 107 cfu.
-
-
Die
Ergebnisse zeigen, daß LB931
in der Lage ist, in bis zu 50 %igem Tergitol NP-9 gut zu überleben.
-
Beispiel 7: Haftung von
LB931 an vaginalen Epithelzellen
-
a) Herstellung einer LB931-Suspension
-
Man
ließ LB931
auf MRS-Agar (5 % CO2, 37°C, 48 h)
wachsen. Die Kultur wurde zu 3 ml Brühe (5 % CO2,
37°C, 8
h) inokuliert. 2 % der resultierenden Kultur wurde erneut zu 10
ml MRS-Brühe
(5 % CO2, 37°C, 18 h) inokuliert. Die resultierende
Kultur wurde 8 min bei 20°C
und 2.000 Upm in einem Ausschwingrotor (820 × g) zentrifugiert. Das erhaltene
Zellpellet wurde in 5 ml Milchsäurepuffer
(10 mM Milchsäure,
pH 4,5, 0,15 M NaCl) gewaschen. Die Bakterien wurden in Milchsäurepuffer
verdünnt,
bis der OD500 etwa 1,0 (etwa 108 cfu/ml) betrug.
-
b) Gewinnung von vaginalen
Epithelzellen
-
Vaginale
Epithelzellen wurde mit einem sterilen Baumwollstab gesammelt und
die Zellen in 4 ml Milchsäurepuffer
oder PBS in einem kleinen Röhrchen überführt. Das
Röhrchen
wurde gemischt und der Baumwollstab entfernt. Man zentrifugierte
das Röhrchen
8 min bei 700 Upm und 20°C
in einem Jouan CR-12 Ausschwingrotor (≈ 100 × g) und wusch den erhaltenen
Pellet in 3 ml Milchsäurepuffer
oder PBS. Man zählte
die Zellen in einem Hematozytometer und stellte die Konzentration
auf 105-106 Zellen/ml
mit Milchsäurepuffer
oder PBS ein. 5 ml Zellen wurden auf einem Mikroskopgläschen zur
Kontrolle der Waschprozedur ausgebreitet (siehe unten).
-
c) Hafttests
-
0,5
ml LB931-Suspension und 0,5 ml Zellsuspension wurden kurz in einem
1,5 ml Eppendorf-Röhrchen
gemischt. Man stellte eine Kontrollprobe durch Mischen von 0,5 ml
Zellsuspension und 0,5 ml Puffer her. Die Röhrchen wurden bei 20°C und 2.000
Upm (≈ 720 × g) zentrifugiert
und danach 1 h bei 37°C
inkubiert. Nach der Inkubation zentrifugierte man die Röhrchen 8
min bei 20°C
und 700 Upm (≈ 90 × g). Die
Pellets wurden in 1 ml Milchsäurepuffer
oder PBS gewaschen. Schließlich
suspendierte man den Pellet in 400-500 μl Milchsäurepuffer oder PBS.
-
d) Analyse
-
Man
ließ 25 μl eines suspendierten
Pellets in der Luft auf einem Mikroskopgläschen trocknen, worauf man
fixierte und gram-färbte.
Aus jeder Probe wurden 50 Epithelzellen analysiert. Man zählte die
Zahl der an den Zellen haftenden LBS931 und teilte die Ergebnisse
in fünf
Gruppen ein (0-10, 11-30, 31-50, 51-100, >100 Bakterien/Zelle).
-
Die
Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle VIII beschrieben.
-
-
Die
Ergebnisse zeigen klar, daß LB931-Bakterien
gut an vaginalen Epithelzellen haften, unabhängig von dem Zeitpunkt der
Probennahme für
die Zellen.