DE69836634T2

DE69836634T2 - Chlamydia trachomatis spezifische peptide und deren anwendung im nachweisverfahren

Info

Publication number: DE69836634T2
Application number: DE69836634T
Authority: DE
Inventors: Bella Ohana
Original assignee: Savyon Diagnostics Ltd
Current assignee: Savyon Diagnostics Ltd
Priority date: 1997-06-19
Filing date: 1998-06-15
Publication date: 2007-09-27
Anticipated expiration: 2018-06-16
Also published as: US6699678B1; EP0991662B1; IL121115A; IL121115A0; AU7786198A; DE69836634D1; JP2002510326A; EP0991662A1; ATE348107T1; WO1999000414A1

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren und Kit zum Diagnostizieren von Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) in Menschen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein neues Gemisch von Peptiden, die von dem Hauptprotein der äußeren Membran („major outer membrane protein", MOMP) hergeleitet sind und die zusammen in der Lage sind, nur mit Antikörpern zu reagieren, die für ein beliebiges der Serovare von C. trachomatis spezifisch sind, und wobei somit das Gemisch von Peptiden besonders gut zum Identifizieren von C. trachomatis-Infektionen in Menschen geeignet ist, indem sie spezifisch an Antikörper, sofern vorhanden, in einer Körperflüssigkeitsprobe binden, die von einem Individuum erhalten wurde, das getestet wird.
Grundlagen der Erfindung
Chlamydia ist ein gramnegatives obligat intrazelluläres Bakterium, das in Säuger- und Vogelarten akute und chronische Krankheiten verursacht. Die Gattung Chlamydia besteht aus vier Arten: C. trachomatis, C. pneumoniae, C. precorum und C. psittaci.
Die Art C. trachomatis ist in 15 Serovare unterteilt. Die Serovare A, B, Ba und C sind Erreger des Trachoms, einer Hauptursache der verhütbaren Blindheit, die in der Dritten Welt endemisch ist. Die Serovare L1 bis L3 sind die Erreger von Lymphogranuloma venereum. Die Serovare D bis K sind weltweit eine verbreitete Ursache von sexuell übertragenen Genitalinfektionen: Zervizitis, Endometritis/Salpingitis bei Frauen und Uretritis bei sowohl Männern als auch Frauen. Die Endometritis/Salpingitis kann zu einer Verklebung der Eileiter mit einem höheren Risiko für Extrauteringravidität und Infertilität führen. Die Genitalinfektion kann eine akute Infektion und eine persistierende Infektion, gelegentlich ohne jegliches klinisches Zeichen, verursachen. Im Allgemeinen können diese Infektionen behandelt werden, sobald sie diagnostiziert sind; ohne Behandlung können die Infektionen sich jedoch zu einer schweren chronischen Entzündung entwickeln, die zu Infertilität, Extrauteringravidität, induziertem Abort oder Frühge burt führt. Außerdem können die Kinder von infizierten Müttern während der Geburt selbst infiziert werden, wodurch es zu Konjunktivitis oder Pneumonie kommen kann.
Das serologische Testen, d.h. das Testen auf das Vorliegen (oder Nicht-Vorliegen) von Anti-C. trachomatis-Antikörpern in einem Individuum, ist inzwischen in zahlreichen Ländern ein etabliertes Verfahren, für das gezeigt wurde, dass es eine umfassende Lösung für den Nachweis einer C. trachomatis-Infektion bereitstellt. Bei vermuteten tief liegenden Infektionen wird durch eine Probennahme von Körperflüssigkeiten die Notwendigkeit für invasive Prozeduren reduziert, die für einen direkten Antigennachweis erforderlich sind. In Fällen mit Infektionen des unteren Genitaltrakts muss man Einschränkungen beim Probennehmen, wie Wirksamkeit eines Verfahrens zum Abnehmen eines Abstrichs, Schwierigkeiten bei der Handhabung der Proben und beim Transport abwägen. Und außerdem besteht das größte Problem darin, dass die meisten Chlamyidien-Infektionen asymptomatisch verlaufen. Deshalb kann es sein, dass eine Infektion lange Zeit persistiert, in den oberen Genitaltrakt aufsteigt, tiefe und chronische Infektionen verursacht und die Wahrscheinlichkeit von falsch-negativen Ergebnissen in Verfahren erhöht wird, die für einen direkten Antigennachweis konzipiert sind, d.h. Stichprobenentnahme („sampling") von Gewebe des unteren Genitaltrakts mit Anti-C. trachomatis-Antikörpern, oder anderen geeigneten Verfahren, mit denen das Vorliegen der Hauptantigene von C. trachomatis direkt nachgewiesen wird, wie des Hauptproteins der äußeren Membran (MOMP), das eine Chlamydien-Infektion anzeigt.
Heute ist ein serologisches Testen auf Chlamydia trachomatis durch den Nachweis verschiedener spezifischer Antikörper ein wirksames und sehr gut angenommenes mögliches Nachweisverfahren. In neuen und besser ausgearbeiteten Technologien werden die Immunmarker IgM, IgA und IgG eingesetzt, um das Vorliegen und das Stadium einer Infektion zu charakterisieren.
Der Nachweis von spezifischen IgM-Antikörpern zeigt akute Chlamydien-Infektionen an. Das Fehlen schließt jedoch nicht aus, dass eine Infektion vorhanden ist, und zwar insbesondere in rezidivierenden und chronischen Fällen. Der Nachweis von spezifischen IgA-Antikörpern ist nun als Hinweis auf eine aktive Chlamydien-Infektion anerkannt, wobei gezeigt wurde, dass es sich hierbei aufgrund der kürzeren Lebensdauer von IgA-Antikörpern, die nur so lange bestehen bleiben, wie eine antigene Stimulation vorliegt, um einen wichtigen Marker handelt. Außerdem ist der Nachweis von IgA-Antikörpern für eine Verlaufskontrolle nach einer Behandlung geeignet. Der Nachweis von IgG-Antikörpern ist ein Marker für eine Chlamydien-positive Immunantwort, und zwar für aktuelle, chronische oder vergangene Infektionen.
Serologische Kreuzreaktionen zwischen den drei verschiedenen Arten von Chlamydia treten in großem Ausmaß auf. Bei den meisten der serologischen diagnostischen Tests auf Chlamydia werden als Antigene entweder gereinigte Elementarkörper (Mikroimmunfluoreszenz-, MIF- und ELISA-Tests), Lipopolysaccharid, LPS, oder gereinigtes Hauptprotein der äußeren Membran, MOMP (ELISA-Tests), verwendet. Gattungs-spezifische Epitope liegen in allen vorstehenden Antigenen vor, weshalb eine geringe Artspezifität festgestellt wird. Außerdem ist ein großer Anteil der menschlichen Population weltweit schon mit C. pneumoniae in Kontakt gekommen (ohne klinische Zeichen), und die Prävalenz von Anti-Chlamydia-Antikörpern ist sehr hoch. Deshalb ist die Unterscheidung zwischen C. pneumoniae- und C. trachomatis-spezifischen Antikörpern bei Verwendung herkömmlicher serologischer Screeningtests (MIF, ELISA, EIA usw.) nicht sehr effektiv.
Stand der Technik
Verschiedene Veröffentlichungen wurden gemacht, in denen die Isolierung, Reinigung und Charakterisierung der Hauptproteine des Äußeren-Membran-Komplexes von C. trachomatis, einschließlich des vorstehend angesprochenen MOMP, und die Verwendung hiervon zum Erzeugen von Anti-C. trachomatis-Antikörpern und in Immuntests zum Nachweisen des Vorliegens von Anti-C. trachomatis-Antikörpern in Proben, die von Individuen erhalten wurden, von denen angenommen wurde, dass sie mit C. trachomatis infiziert waren, beschrieben wurden. Z.B. wird in US 5 318 892 und dem entsprechenden EP 0 456 524 die Verwendung des Äußeren-Membran-Komplexes von C. trachomatis, der aus mindestens drei Polypeptiden, einschließlich MOMP, besteht, zum Testen von Anti-C. trachomatis-Antikörpern offenbart. In US 4 427 782 wird das Isolieren und Charakterisieren des C. trachomatis-MOMP und seine Verwendung in Immuntests beschrieben. Jedoch werden in den vorstehend erwähnten veröffentlichten Patenten weder Nucleotid- oder Aminosäuresequenzen des MOMP-Polypeptids bereitgestellt, noch wird die Möglichkeit zur Verwendung von Peptiden, die von MOMP hergeleitet sind, für eine Immunisierung gegen eine C. trachomatis-Krankheit oder für die Verwendung in Immuntests zum Nachweisen von Anti-C. trachomatis-Antikörpern, die eine Infektion durch C. trachomatis anzeigen, offenbart. Auf dem Fachgebiet ist bekannt, dass große Proteine, wie MOMP, weniger wirksam sind als kleinere antigene Peptide, die hiervon hergeleitet sind, und zwar sowohl für eine Immunisierung gegen eine C. trachomatis-Infektion als auch zur Verwendung in Immuntests zum Nachweisen von Anti-C. trachomatis-Antikörpern. Weiterhin weist das vollständige MOMP-Protein, das aus C. trachomatis erhalten wurde, mehrere Epitope auf, die auch bei dem MOMP-Protein vorliegen, das aus den anderen vorstehend angegebenen Arten von Chlamydia erhalten wurde, woraus folgt, dass die Verwendung des vollständigen Proteins in Immuntests für einem spezifischen Nachweis von Anti-C. trachomatis-Antikörpern nicht zuverlässig ist, da die Möglichkeit einer Kreuzreaktivität zwischen den verschiedenen Chlamydia-Arten besteht, mit dem Ergebnis, dass es beim Erhalt von positiven Ergebnissen nicht ohne Weiteres möglich ist, festzustellen, ob die Antikörper für C. trachoma tis oder für die anderen Chlamydia-Arten spezifisch sind. Somit kann es hinsichtlich C. trachomatis zu falsch-positiven Ergebnissen kommen, und dies kann möglicherweise sogar zu einer falschen Diagnose des die Infektion verursachenden Erregers und anschließend zu einer falschen Behandlungsart der Infektion führen. Außerdem ist es oft schwierig, große Proteine, wie MOMP, herzustellen und zu reinigen, insbesondere wenn hohe Reinheitsgrade unbedingt erforderlich sind, wenn solche Proteine in diagnostischen Kits verwendet werden sollen, und ferner ist es häufig schwierig, solche großen Proteine in ein Kit einzubauen, z.B. ein auf ELISA basierendes Kit, in welchem das Antigen üblicherweise auf einem festen Träger immobilisiert ist.
In anderen Veröffentlichungen wurden die Clonierung und Sequenzierung des von C. trachomatis hergeleiteten MOMP, die Produktion eines rekombinanten C. trachomatis-MOMP-Polypeptids und seine Verwendung zum Induzieren von Anti-MOMP-Antikörpern sowie seine Verwendung in Immuntests zum Nachweisen von Anti-MOMP-Antikörpern, die für C. trachomatis spezifisch sind, beschrieben. Die vorstehend erwähnte Clonierung und Sequenzierung von MOMP wurden z.B. in EP 0 192 033 beschrieben, wobei in dieser Veröffentlichung auch die Produktion von verschiedenen monoclonalen Antikörpern beschrieben wird, die jeweils ein unterschiedliches spezifisches Epitop in MOMP erkennen. Jedoch hat auch ein solches rekombinantes MOMP-Polypeptid aus den vorstehend angegebenen Gründen immer noch die Nachteile, dass es hinsichtlich der Erkennung von Anti-MOMP-Antikörpern eine mögliche Kreuzreaktivität mit den MOMP-Proteinen aus den anderen C. trachomatis-Arten aufweist. Weiterhin ist auch für ein rekombinant erzeugtes MOMP ein signifikanter Einsatz von Geld und Zeit erforderlich, sowohl für seine Herstellung als auch für seine Reinigung, bevor es für die Verwendung in diagnostischen Tests oder als ein Impfstoff geeignet ist.
In mehreren Veröffentlichungen wurden verschiedenen, von MOMP hergeleitete Peptide beschrieben, die als Impfstoffe und auch in Immunassays zum Nachweisen von Anti-MOMP-Antikörpern eingesetzt werden können. Solche Peptide konnten hergestellt werden, nachdem die vollständige Sequenz von MOMP aufgeklärt worden war und es hinsichtlich der Variation der Sequenz innerhalb der verschiedenen Serovare analysiert worden war. Z.B. wurde eine Analyse der verschiedenen Domänen des MOMP-Proteins von C. trachomatis beschrieben, und zwar die Tatsache, dass es in vier konstante (CDI bis IV) und vier variable (VDI bis IV) Domänen unterteilt ist (Yuan et al., Infect. Immun. 57: 1040–1049, 1989). Aufgrund solcher und ähnlicher Daten wurden Peptide entworfen, die im Allgemeinen Sequenzen aufwiesen, welche denjenigen Teilen oder Regionen von MOMP entsprachen, die am stärksten variabel waren und von denen man deshalb erwartete, dass sie auch am stärksten antigen waren. Das heißt, dass solche Peptide im Wesentlichen Epitope von MOMP darstellen, gegen die ohne Weiteres Antikörper hervorgebracht werden können, weshalb solche Peptide möglicherweise als Impf stoffe eingesetzt oder ohne Weiteres in diagnostischen Tests verwendet werden können, um das Vorliegen von Anti-MOMP-Antikörpern nachzuweisen. Z.B. wird in EP 0 348 725 ein Epitop-spezifisches Peptid beschrieben, das ein häufiges Epitop von C. trachomatis darstellt, welches für die Produktion von spezifischen Antikörpern gegen C. trachomatis-MOMP geeignet ist, und wobei das Peptid eine Sequenz aufweist, die von der MOMP-Sequenz zwischen den Aminosäureresten 262 und 320 hergeleitet ist. Außerdem wird in WO 94/06827 ein synthetisches Peptid beschrieben, das ein T-Zellen-Helferzellen-stimulierendes Epitop und ein B-Zellen-neutralisierende-Antikörper-stimulierendes Epitop umfasst, hergeleitet von dem C. trachomatis-MOMP. Dieses synthetische Peptid kann in Immuntests zum Nachweisen von Anti-C. trachomatis-MOMP-Antikörpern oder als ein Impfstoff eingesetzt werden. Während die vorstehend erwähnten Peptide eine wichtige Verbesserung gegenüber der Verwendung des vollständigen MOMP-Polypeptids hinsichtlich ihres Nutzens in diagnostischen Tests zum Nachweisen von C. trachomatis-Antikörpern oder ihrer Verwendbarkeit als Impfstoffe darstellen, haben solche Peptide immer noch den einen wichtigen Nachteil, nämlich definieren diese Peptide nicht immer ein Epitop, das allen vorstehend erwähnten Serovaren von C. trachomatis gemeinsam ist. Die Folge hieraus ist, dass, wenn solche Peptide zum Nachweisen von C. trachomatis-Antikörpern verwendet werden, sie nicht in allen Fällen in der Lage sind, Antikörper gegen alle verschiedenen Serovare von C. trachomatis nachzuweisen, und dass folglich in solchen diagnostischen Tests unter Verwendung solcher Peptide möglicherweise falsch-negative Ergebnisse erhalten werden, nämlich kann ein Individuum mit einem bestimmten Serovar von C. trachomatis infiziert worden sein, das in der Gegend häufig ist, wo dieses Individuum lebt, jedoch kann das Peptid, das in dem Test verwendet wird, eines sein, das dem spezifischen Epitop des spezifischen Serovars, mit dem das Individuum infiziert wurde, nicht vollständig entspricht, woraus folgt, dass die in diesem Individuum induzierten Antikörper nicht vollständig oder sogar gar nicht mit den Peptiden in dem diagnostischen Kit reagieren, wodurch dann ein falsch-negatives Ergebnis erhalten wird.
US 7 324 664 offenbart Nucleotid- und Aminosäuresequenzen der vier variablen Domänen des MOMP von C. trachomatis für die Verwendung in der Diagnose von Infektionen und zum Serotypisieren. Jedoch offenbart es keinerlei spezifischen Peptide, die gute Kandidaten sind. Qu et al. (Vaccine 1994, 12 (6): 557–564) offenbart ein synthetisches chimäres Peptid, das die variablen Segmente I und IV des MOMP von C. trachomatis darstellt. Das chimäre Peptid wird für die Impfung von Mäusen eingesetzt.
Somit wurde bisher kein C. trachomatis-MOMP-spezifisches Peptid oder Gemisch von Peptiden beschrieben, das für alle verschiedenen Serovare von C. trachomatis spezifisch ist und das in diagnostischen Tests zum Nachweisen von Anti-MOMP-Antikörpern, die gegen eines der C. trachomatis-Serovare induziert wurden, eingesetzt werden kann oder das als Impfstoffe verwendet werden kann, um Personen wirksam gegen alle verschiedenen Serovare von C. trachomatis zu immunisieren. Wie vorstehend erwähnt kommen C. trachomatis-Infektionen bei einer sehr großen Zahl von Personen weltweit vor, und somit bestand schon seit langem der Bedarf, die vorstehend erwähnten Nachteile nach dem Stand der Technik zu überwinden und ein Peptid oder ein Gemisch von Peptiden bereitzustellen, das in diagnostischen Tests zum Nachweisen von Anti-C. trachomatis-MOMP-Antikörpern, die in Individuen nach einer Infektion durch eines der Serovare von C. trachomatis induziert wurden, verwendet werden kann. Genauso bestand schon seit langem der Bedarf, ein Peptid oder ein Gemisch von Peptiden bereitzustellen, das bei Verabreichung an ein Individuum in der Lage ist, Anti-MOMP-Antikörper zu induzieren, die für eines der Serovare von C. trachomatis spezifisch sind, und auf diese Weise einen wirksamen Impfstoff gegen eine C. trachomatis-Infektion bereitzustellen.
Demgemäß besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung darin, ein Gemisch von Peptiden bereitzustellen, die von spezifischen Regionen innerhalb des MOMP-Proteins hergeleitet sind und die zusammen in der Lage sind, mit Antikörpern gegen das MOMP aus einem der Serovare von C. trachomatis zu interagieren. Ein solches Gemisch von Peptiden eignet sich besonders für diagnostische Tests zum Diagnostizieren des Vorliegens von für C. trachomatis spezifischen Anti-MOMP-Antikörpern, die aus den Körperflüssigkeiten eines Individuum erhalten wurden, und ist für alle der Serovare von C. trachomatis spezifisch, wobei solche diagnostischen Tests im Wesentlichen keine falsch-negativen Ergebnisse bereitstellen sollten. Und da das Gemisch von Peptiden gemäß der Erfindung so ausgewählt ist, dass es nur für das MOMP von C. trachomatis-Serovaren und nicht für ein MOMP aus einer beliebigen anderen Chlamydia-Art spezifisch ist, sollten genauso durch die Verwendung der Peptide in solchen diagnostischen Tests diese Tests so bereitgestellt werden, dass sie im Wesentlichen keine falsch-positiven Ergebnisse liefern.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein diagnostisches Kit zum Diagnostizieren des Vorliegens von Anti-C. trachomatis-MOMP-Antikörpern von einem beliebigen der C. trachomatis-Serovare in Körperflüssigkeiten bereitzustellen, wobei dieses diagnostische Kit unter Verwendung eines solchen Gemisches von Peptiden wie vorstehend erwähnt einen sehr zuverlässigen diagnostischen Test von Testproben bereitstellt, so dass es von sich aus im Wesentlichen keine falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnisse liefern kann. Dieses diagnostische Kit ist außerdem nur für Anti-C. trachomatis-MOMP-Antikörper hochspezifisch und geht keine Kreuzreaktivität mit Anti-MOMP-Antikörpern ein, die für die anderen Arten von Chlamydia spezifisch sind.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Diagnostizieren einer Chlamydia- oder C. trachomatis-Infektion durch Nachweisen von Anti-C. trachomatis-Antikörpern in der Körperflüssigkeit eines Individuums bereitzustellen, wobei als Testreagens das vorstehend erwähnte Gemisch von Peptiden eingesetzt wird.
Außerdem ist die Verwendung des vorstehenden Gemisches von Peptiden als Impfstoff beabsichtigt, um ein Individuum gegen eine C. trachomatis-Infektion durch ein beliebiges der Serovare von C. trachomatis zu immunisieren.
Der wie hier verwendete Begriff „Körperflüssigkeit" umfasst Flüssigkeiten, die innerhalb des Körpers entnommen wurden, wie Blut oder Lymphe, lokale Sekretionen, wie Tränen, Sperma, Urin, Schweiß, Sputum usw., Proben, die durch Waschen (z.B. Bronchiolarlavage) oder durch Abtupfen erhalten wurden, umfassend Zervixabstriche, und dergleichen.
Der wie hier verwendete Begriff „Peptid" umfasst Peptide, die durch chemische Synthese oder durch Spaltung, entweder durch chemische Mittel oder durch Verwendung von proteolytischen Enzymen eines größeren Peptids oder Proteins erhalten wurden.
In der folgenden genauen Beschreibung der Erfindung werden unter anderen Einzelheiten die Aminosäuresequenzen der verschiedenen Peptide, die das Gemisch von Peptiden gemäß der vorliegenden Erfindung ausmachen, bereitgestellt. Diese Sequenzen werden in Form des Ein-Buchstaben-Aminosäure-Codes angegeben. Im Folgenden findet sich als Erklärung der Schlüssel für diesen Ein-Buchstabe-Code.
Weiterhin wird für den Fachmann selbstverständlich sein, dass die Sequenzen der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung von der bekannten und veröffentlichten Aminosäuresequenz des MOMP von C. trachomatis hergeleitet wurden, die für alle verschiedenen C. trachomatis-Serovare aufgeklärt worden war. Z.B. stellt das vorstehend erwähnte EP 0 192 033 die vollständige Sequenz von MOMP bereit, das vorstehende EP 0 348 725 stellt die Sequenzen von verschiedenen MOMP-hergeleiteten Peptiden bereit, und das vorstehende WO 94/06827 stellt die Sequenzen von MOMP-hergeleiteten Peptiden aus den verschiedenen C. trachomatis-Serovaren bereit. In diesen Veröffentlichungen wird auch auf eine Reihe anderer Veröffentlichungen Bezug genommen, in denen die vollständigen Sequenzen von MOMP aus verschiedenen Serovaren veröffentlicht wurden.
Insbesondere werden die Natur des Hauptproteins der äußeren Membran und seine Beziehung zu den Biovaren und Serovaren von Chlamydia trachomatis diskutiert in Grayston und Wang (1975), J. Infect. Dis. 132: 87–105; Stephens et al. (1982), J. Immunol. 128: 1083–189; und Caldwell et al. (1981), Infect. Immun. 31: 1161–1176. Impfstoffstudien, die mit intakten Chlamydien-Elementarkörpern durchgeführt wurden, beschrieben Collier (1961), Lancet 1: 795–800; Wang et al. (1967), Amer. J. Ophtal. 63: 1615–1630; und Woolridge et al. (1967), Amer. J. Ophtal. 63: 1645–1653. Die Clonierung und Expression eines Gens, welches ein 74 000 Dalton Chlamydien-Antigen codiert, in E. coli wird von Stephens et al. (1983), Abstract Annual Meeting American Society of Microbiology, B29, S. 35, beschrieben. Wenman und Lovett (1982), Nature 296: 68–70, berichten über die Expression eines 19 000 Dalton Chlamydia trachomatis-Polypeptids. Nano et al. (1985), Infect. Immun. 45: 637–641, berichteten über die Sequenzierung der ersten 25 N-terminalen Aminosäuren des Hauptproteins der äußeren Membran und die Clonierung von mindestens einem bestimmten Teil des Gens. Stephens et al. beschrieben auch die Sequenzanalyse des Gens des Hauptproteins der äußeren Membran von Chlamydia trachomatis Serovar L₂, J. of Bacteriol., Bd. 168, Nr. 3 (1986); die molekulare Clonierung und Expression von Hauptprotein-Antigenen der äußeren Membran von Chlamydia trachomatis in Escherichia coli, Infection and Immunity, Bd. 47, Nr. 3, 713–718 (1985); eine artspezifische Domäne des Hauptproteins der äußeren Membran, Chlamydia) Infections, D. et al., Hrsg., Cambridge University Press, 110–113 (1986); die Diversität von Genen des Hauptproteins der äußeren Membran von Chlamydia trachomatis, J. Bact. 169: 3879–3885 (1987); und die hochauflösende Kartierung von Serovar-spezifischen und häufigen antigenen Determinanten des Hauptproteins der äußeren Membran von Chlamydia trachomatis, J. Exp. Med. 167: 817–831 (1988). US 4 118 469 offenbart ein spezifisches Chlamydia trachomatis-Antigen, das für die serologische Diagnose von Lymphogranuloma venereum eingesetzt werden kann. Pickett et al. (FEMS Microbiol. Lett. 42: 185, 1987), Zhang et al. (Nucleic Acids Res. 18: 1061, 1990) und Hamilton et al. (Nucleic Acids Res. 17: 8366, 1989) beschreiben die Sequenzierung von MOMP-Genen von verschiedenen Chlamydia trachomatis-Serovaren und ihre Charakterisierung durch vier symmetrisch mit Abstand vorliegende hypervariable Domänen (VDs), die von Regionen mit Aminosäurehomologie flankiert sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass es durch Modifizieren bestimmter spezifischer Peptide, die von den zweiten und vierten variablen Domänen des immundominanten MOMP-Proteins von C. trachomatis hergeleitet sind, und durch Herstellen eines Gemisches solcher Peptide möglich ist, ein Gemisch solcher Peptide zu erhalten, das hochspezifisch für Anti-MOMP-Antikörper ist, die für das MOMP von C. trachomatis spezifisch sind, und das keine Kreuzreaktivität mit Anti-MOMP-Antikörpern eingeht, die für das MOMP von anderen Chlamydia-Arten, wie C. pneumoniae oder C. psittaci, spezifisch sind. Weiterhin wurde gemäß der vorliegenden Erfindung gefunden, dass durch Verwendung eines solchen Gemisches von Peptiden in einem Kit für die Diagnose einer C. trachomatis-Krankheit ein Kit bereitgestellt wird, das eine sehr hohe Empfindlichkeit und eine sehr hohe Spezifität für IgA- oder IgG-Antikörper, die für C. trachomatis-MOMP spezifisch sind, aufweist, wenn sie in einer Körperflüssigkeits-Testprobe vorliegen, die mit diesem Kit getestet wird.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Gemisch von Peptiden bereit, die von den variablen Domänen des immundominanten Hauptproteins der äußeren Membran (MOMP) von Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) hergeleitet sind, wobei das Gemisch dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine Spezifität nur für C. trachomatis-Anti-MOMP-Antikörper aufweist und keine Kreuzreaktivität mit Anti-MOMP-Antikörpern von anderen Chlamydia-Arten eingeht, und wobei das Gemisch auch dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine Spezifität für Anti-MOMP-Antikörper von allen Serovaren von C. trachomatis aufweist, wobei das Gemisch von Peptiden etwa vier Peptide umfasst, die aus der Gruppe von Peptiden ausgewählt sind, die besteht aus:

(a) SEQ ID NO: 1, hierin auch als Peptid 4A bezeichnet, die die Aminosäuresequenz IFDTTLNPTIAGAGDVK aufweist;
(b) SEQ ID NO: 2, hierin auch als Peptid 4B bezeichnet, die die Aminosäuresequenz VDITTLNPTIAGCGSVAK aufweist;
(c) SEQ ID NO: 3, hierin auch als Peptid 4C bezeichnet, die die Aminosäuresequenz CVFDVTTLNPTIAGAGDVK aufweist;
(d) SEQ ID NO: 4, hierin auch als Peptid 4D bezeichnet, die die Aminosäuresequenz LAEAILDVTTLNPTITGKAVVSK aufweist; wobei alle der Peptide (a) bis (d) von der vierten variablen Domäne (VDIV) des MOMP hergeleitet sind;
(e) SEQ ID NO: 5, hierin auch als Peptid C.t. 2A bezeichnet, die die Aminosäuresequenz CDNENQSTVKTNSVPNMSLDQSK aufweist; wobei das Peptid (e) von der zweiten variablen Domäne (VDII) des MOMP hergeleitet ist;
(f) SEQ ID NO: 6, hierin auch als C.t. VDI bezeichnet, die die Aminosäuresequenz VAGLENDPTTNVARA aufweist;
(g) SEQ ID NO: 7, hierin auch als C.t. VDII bezeichnet, die die Aminosäuresequenz DNENNATVSDSKLVPNHMSDQS aufweist;
(h) SEQ ID NO: 8, hierin auch als C.t. VDIV bezeichnet, die die Aminosäuresequenz LDVTTNATIAGKGTVV aufweist;
(i) Analoga von einem beliebigen der Peptide (a) bis (h), wobei die Analoga im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Peptide (a) bis (h) besitzen, wobei die Analoga zwischen etwa 9 und etwa 35 Aminosäurereste aufweisen und sich von den Peptiden (a) bis (h) dadurch unterscheiden, dass sie eine oder mehrere Additionen, Deletionen oder Substitutionen besitzen, oder dadurch, dass sie Kombinationen des einen N-terminalen Teils des einen Peptids, das aus (a) bis (d) oder (h) ausgewählt ist, mit einem C-terminalen Teil eines anderen Peptids, das aus (a) bis (d) oder (h) ausgewählt ist, sind, so dass die vollständige Sequenz zu der VDIV-Sequenz homolog ist, oder dadurch, dass sie Kombinationen eines N-terminalen Teils des einen Peptids, das aus (e) oder (g) ausgewählt ist, mit einem C-terminalen Teil eines anderen Peptids, das aus (e) oder (g) ausgewählt ist, sind, so dass die vollständige Sequenz dann zu der VDII-Sequenz homolog ist.

Bevorzugte Gemische gemäß der Erfindung sind:
Ein Gemisch von Peptiden, wobei die Peptide Analoga von den Peptiden (a) bis (h) sind und wobei alle diese Analoga so ausgewählt sind, dass sie einer MOMP-VD-Sequenz von einer oder mehreren der Gruppen von Serovaren entsprechen.
Ein Gemisch von Peptiden wie vorstehend definiert, dadurch gekennzeichnet, dass das Gemisch eine Spezifität nur für ein einzelnes Serovar oder eine Gruppe von Serovaren von C. trachomatis aufweist.
Ein Gemisch von Peptiden, wobei das Gemisch dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine Spezifität für Anti-MOMP-Antikörper von allen Serovaren von C. trachomatis aufweist.
Bevorzugte Gemische von Peptiden gemäß der vorliegenden Erfindung, die eine Spezifität für Anti-MOMP-Antikörper von allen Serovaren von C. trachomatis aufweisen, sind:
Ein Gemisch von Peptiden wie vorstehend angegeben, das ein Gemisch von vier Peptiden (a), (b), (c) und (d) oder ein Gemisch von einem oder mehreren der Peptide (a) bis (d) mit einem oder mehreren Analoga von (a) bis (d) ist, wobei, wenn das Gemisch vier Peptide enthält, die aus einer der möglichen Kombinationen von (a) oder einem Analogon von (a) + (b) oder einem Analogon von (b) + (c) oder einem Analogon von (c) + (d) oder einem Analogon von (d) ausgewählt sind;
Ein Gemisch von Peptiden wie vorstehend angegeben, das ein Gemisch von vier Peptiden (a), (b), (c) und (e) oder ein Gemisch von einem oder mehreren der Peptide (a) bis (c) und (e) mit einem oder mehreren Analoga von (a) bis (c) und (e) ist, wobei, wenn die Peptide und die Analoga das Gemisch ausmachen, das Gemisch vier Peptide enthält, die aus einer der möglichen Kombinationen von (a) oder einem Analogon von (a) + (b) oder einem Analogon von (b) + (c) oder einem Analogon von (c) + (e) oder einem Analogon von (e) ausgewählt sind;
Ein Gemisch von Peptiden wie vorstehend angegeben, das ein Gemisch der Peptide (a), (b), (c) und (d) ist, wobei die Peptide in dem Gemisch in gleichen Mengen vorliegen;
Ein Gemisch von Peptiden wie vorstehend angegeben, das ein Gemisch der Peptide (a), (b), (c) und (e) ist, wobei die Peptide in dem Gemisch in gleichen Mengen vorliegen;
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem die Peptide bereit, die direkt oder indirekt (z.B. über Perlen und/oder Linker) an einen nachweisbaren Marker gebunden sind, wie z.B. eine radioaktive Markierung, ein Enzym, Avidin oder ein Derivat davon, Biotin, Digoxigenin, Gold, Liganden, Haptene, Metalle oder Metallverbindungen, die magnetische Eigenschaften haben, und dergleichen.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung ein Kit zum Diagnostizieren einer C. trachomatis-Infektion bereit, das ein beliebiges der vorstehenden Gemische von Peptiden und Anweisungen des Herstellers zur Verwendung des Kits umfasst.
Bevorzugte Kits gemäß der Erfindung sind aus RIA, EIA, ELISA, Immuno Competition Assays, laterale-Chromatographie-Assays und SeroRapid^® Assay ausgewählt.
Ein besonders bevorzugtes Kit gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Kit, das einen Enzyme Linked Immuno Assay (ELISA) durchführt, wobei das Kit das Gemisch von Peptiden, das auf einem festen Träger immobilisiert ist, und die Reagenzien zur Durchführung des ELISA umfasst.
Genauso ermöglicht die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines der vorstehenden Gemische von Peptiden für die Herstellung eines diagnostischen Kits zum Nachweisen einer C. trachomatis-Infektion.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Nachweisen einer C. trachomatis-Infektion in einem Individuum bereit, umfassend:

(a) Inkontaktbringen einer Körperflüssigkeitsprobe, die aus dem Individuum erhalten wurde, mit einem der vorstehenden Gemische von Peptiden unter geeigneten Testbedingungen; und
(b) Bestimmen des Ausmaßes einer Reaktion zwischen der Körperflüssigkeitsprobe und dem Gemisch von Peptiden.

Bevorzugte Körperflüssigkeitsproben sind Serum, Speichel, Tränenflüssigkeit, Urin, Sperma, Zervixabstriche, Bronchiolenlavage und Sputum.
Ein bevorzugtes Verfahren der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, welches das Durchführen eines diagnostischen Tests des ELISA-Typs umfasst, wobei das Gemisch von Peptiden auf einem festen Träger immobilisiert ist und dann unter geeigneten ELISA-Bedingungen mit der Körperflüssigkeitsprobe in Kontakt gebracht wird und wobei, wenn die Körperflüssigkeitsprobe für C. trachomatis-MOMP spezifische Antikörper enthält, eine nachweisbare positive Reaktion mit dem Gemisch von Peptiden vorhanden ist.
Bevorzugte Körperflüssigkeiten für die Diagnose sind Serum, Speichel, Urin und Tränenflüssigkeit. Serum ist besonders bevorzugt.
Außerdem ist die Verwendung der Peptide für eine Impfung beabsichtigt. Das Gemisch der Peptide kann eingesetzt werden, um eine Immunisierung gegen alle Stämme von C. trachomatis zu erreichen, während einzelne Peptide verwendet werden können, um eine Immunisierung gegen Gruppen von C. trachomatis-Serovaren, wie z.B. die Gruppe, die aus den Serovaren A bis C oder D bis K besteht, oder der verschiedenen L-Serovaren, zu erreichen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
In den folgenden Figuren wurde die Reaktivität der Seren gegenüber Anti-Chlamydia-Antikörpern (positive oder negative) durch Mikroimmunfluoreszenz, MIF, charakterisiert, sofern nicht anderes angegeben ist. Die 1 bis 4 sind Balkendiagramme der Ergebnisse, welche die Reaktivität von verschiedenen Testantigenen, d.h. Peptiden, die von MOMP von C. trachomatis (C.t.), C. pneumoniae (C.p.) und C. psittaci (CPIC), Elementarkörpern von C. trachomatis (MN) oder intaktem Chlamydia-Antigen (Int.C.t.) hergeleitet sind, gegenüber verschiedenen Testseren zeigen.
1 zeigt die Spezifität der Testantigene für Serum, das aus einem positiv identifizierten C. trachomatis-infizierten Individuum erhalten wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben. Leere Balken: negative Seren, gefüllte Balken: positive Seren.
2 zeigt die Spezifität der Testantigene für Serum, das aus einem positiv identifizierten C. pneumoniae-infizierten Individuum erhalten wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben. Leere Balken: negative Seren, gefüllte Balken: positive Seren.
3 zeigt die Spezifität der Testantigene oder der angegebenen Kombinationen davon für Serum, das aus einem positiv identifizierten C. trachomatis- und C. pneumoniae-infizierten Individuum erhalten wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben. Leere Balken: negative Seren, gefüllte Balken: positive Seren.
4 zeigt die relative Empfindlichkeit und Antigenität der Testantigene gegenüber Seren, die aus verschiedenen infizierten Individuen erhalten wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben. N: Zahl der getesteten Seren; A: Gesamtzahl von Seren, die durch MIF positiv identifiziert wurden; B: Gesamtzahl von Seren, die durch Peptidsystem positiv identifiziert wurden.
5 zeigt Balkendiagramme der Reaktivität von verschiedenen neuen Peptiden, die gemäß der vorliegenden Erfindung synthetisiert wurden, gegenüber drei verschiedenen Seren, die aus drei verschiedenen Individuen erhalten wurden, die positiv identifiziert wurden, dass sie mit C. trachomatis infiziert waren, wie in Beispiel 1 beschrieben. Leere Balken: negative Seren, gefüllte Balken: positive Seren; O.D.: optische Dichte.
6 zeigt Balkendiagramme der Reaktivität von verschiedenen neuen Peptiden, die gemäß der vorliegenden Erfindung synthetisiert wurden, gegenüber drei verschiedenen Seren, die aus drei verschiedenen Individuen erhalten wurden, die positiv identifiziert wurden, dass sie mit C. pneumoniae infiziert waren, wie in Beispiel 1 beschrieben. Leere Balken: negative Seren, gefüllte Balken: positive Seren; O.D.: optische Dichte.
7 zeigt Balkendiagramme der Reaktivität von verschiedenen neuen Peptiden, die gemäß der vorliegenden Erfindung synthetisiert wurden, gegenüber drei verschiedenen Seren, die aus drei verschiedenen Individuen erhalten wurden, die positiv identifiziert wurden, dass sie mit C. trachomatis und C. pneumoniae infiziert waren, wie in Beispiel 1 beschrieben. Leere Balken: negative Seren, gefüllte Balken: positive Seren; O.D.: optische Dichte.
8 zeigt ein Balkendiagramm des relativen diagnostischen Werts von jedem der neu synthetisierten Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung gegenüber Anti-MOMP-Antikörpern, die in Testseren vorliegen, wie in Beispiel 1 beschrieben. Leere Balken: C. trachomatis-positive Seren, gefüllte Balken: C.p.-positive Seren; %: prozentualer Anteil der gesamten positiven (durch MIF) Seren. C.t.: gesamte Positive (durch Peptidsystem) für C. trachomatis; C.p.: gesamte Positive (durch Peptidsystem) für C. pneumoniae.
9 zeigt ein Balkendiagramm der Ergebnisse, welche die Spezifität und Reaktivität von Gemischen von neuen Peptiden der Erfindung gegenüber Serum deutlich machen, das aus positiv infizierten Individuen erhalten wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben. C.t. mix: Gemisch von Peptiden, spezifisch für C. trachomatis; C.p. mix: Gemisch von Peptiden, spezifisch für C. pneumoniae; schraffierte Balken: C.t.-positives Serum; leere Balken: negatives Serum; gefüllte Balken: C.p.-Serum; O.D.: optische Dichte.
10 zeigt Balkendiagramme, welche die Empfindlichkeit und Spezifität des für C. trachomatis spezifischen Gemisches von neuen Peptiden, das in ELISA-Tests zum Nachweisen von Anti-MOMP-IgG- und IgA-Antikörpern, die für C. trachomatis-MOMP spezifisch sind, verwendet wurde, und den Vergleich dieses Tests mit einem MIF-Test erläutert, wie in Beispiel 2 beschrieben. N: Zahl von getesteten Seren; A: positive Seren; B: negative Seren; mit unterbrochenen Linien gefüllte Balken: Seren, die durch MIF als positiv charakterisiert wurden (kommerzielle Referenz); gefüllte Balken: Seren, die durch C. trachomatis-Peptidtest charakterisiert wurden.
11 zeigt ein Balkendiagramm, das die Empfindlichkeit und Spezifität des für C. trachomatis spezifischen Gemisches von neuen Peptiden, das in einem ELISA-Test zum Nachweisen von Anti-MOMP-IgA- und/oder IgG-Antikörpern, die für C. trachomatis-MOMP spezifisch sind, verwendet wurde, und den Vergleich dieses Tests mit einem Kulturtest erläutert, wie in Beispiel 2 beschrieben. N: Anzahl von getesteten Individuen: C: Kultur; Ziegelmuster-gefüllte Balken: Seren, die durch Kulturtest als positiv charakterisiert wurden; kreuzschraffierte Balken: Seren, die durch C. trachomatis- Peptidtest charakterisiert wurden; leere Balken: Seren, die durch MIF charakterisiert wurden.
12 zeigt ein Balkendiagramm, das die Spezifität und eines für C. trachomatis spezifischen Gemisches von neuen Peptiden (C.t. 4.A, 4C, 4B, 4D), das in einem ELISA-Test zum Nachweisen von Anti-MOMP-IgA- und/oder IgG-Antikörpern, die für C. trachomatis-MOMP spezifisch sind, verwendet wurde, und einen Vergleich dieses Tests mit einer Reihe verschiedener MIF-Tests, erläutert, wie in Beispiel 2 beschrieben. N: Zahl getesteter Seren; gefüllte Balken: Seren, die durch MIF-1-Test positiv getestet wurden; mit unterbrochenen Linien gefüllte Balken: Seren, die C. trachomatis-Peptidtest positiv getestet wurden; mit Doppellinie und unterbrochenen Linien gefüllter Balken: Seren, die durch SeroFIA-Test (Savyon) positiv getestet wurden; kreuzschraffierter Balken: Seren, die durch MIF-2-Test positiv getestet wurden.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Gemisch von Peptiden, die von den zweiten und vierten variablen Domänen des C. trachomatis-MOMP hergeleitet sind, und die Verwendung eines solchen Gemisches von Peptiden in diagnostischen Kits zum Nachweisen einer C. trachomatis-Infektion in einem Individuum, insbesondere durch Nachweisen des Vorliegens von Anti-C. trachomatis-MOMP-Antikörpern in Testserumproben. Das vorstehende Gemisch von Peptiden hat eine bisher nicht beschriebene hohe Spezifität für Anti-C. trachomatis-MOMP-Antikörper und auch ein im Wesentlichen vollständiges Fehlen einer Kreuzreaktivität mit Anti-MOMP-Antikörpern anderer Chlamydia-Arten gezeigt. Somit stellt die vorliegende Erfindung auch ein hochempfindliches und hochspezifisches Kit für die Diagnose einer C. trachomatis-Infektion bereit, wobei das Kit auf dem vorstehenden Gemisch von Peptiden basiert.
Bevorzugte Kits gemäß der vorliegenden Erfindung sind diejenigen, die auf der ELISA-Technologie basieren, wie sie nachstehend ausführlich beschrieben sind, und die die herkömmlichen ELISA-Reagenzien oder stärker bevorzugt verschiedene dieser Reagenzien enthalten, die verbessert wurden, so dass Kits mit einer sehr hohen Empfindlichkeit, langen Lagerbeständigkeit und einfachen Verwendung bereitgestellt werden.
Hinsichtlich der verschiedenen Peptide, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, wurde gezeigt, dass die fünf neu synthetisierten Peptide, die hier mit 4A, 4B, 4C, 4D und C.t. 2A bezeichnet sind, für den Nachweis von Anti-MOMP-Antikörpern, die für C. trachomatis spezifisch sind, in einer Serumprobe am stärksten bevorzugt sind. Diese Peptide sind für das Nachweisen der vorstehend erwähnten Antikörper des IgA- oder des IgG-Typs am besten geeignet. Die spezifischen Sequenzen dieser fünf neuen Peptide wurden vorstehend und nachstehend dargestellt. Für den Fachmann sollte es selbstverständlich sein, dass geeignete Analoga dieser neuen Pep tide ohne Weiteres durch derzeitige Standard-Peptidsyntheseverfahren und Apparaturen synthetisiert werden können. Die einzige Einschränkung für solche Analoga besteht darin, dass sie im Wesentlichen die gleiche Spezifität für Anti-C. trachomatis-MOMP-Antikörper und die gleiche im Wesentlichen fehlende Kreuzreaktivität mit Anti-MOMP-Antikörpern von anderen Chlamydia-Arten aufweisen. Alle solchen Analoga basieren hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz im Wesentlichen auf den neuen Peptiden, haben jedoch einen oder mehrere Aminosäurereste deletiert, substituiert oder angefügt. Wenn Aminosäurereste substituiert sind, sind solche Substitutionen, die gemeint sind, diejenigen, welche die Struktur oder biologische Aktivität des Peptids nicht signifikant verändern, z.B. werden basische Aminosäuren durch andere basische Aminosäuren, saure durch saure Aminosäuren und neutrale durch neutrale Aminosäuren ersetzt. Die Gesamtlänge des analogen Peptids liegt etwa zwischen 9 und 35 Aminosäuren. Wenn Aminosäurereste deletiert sind, gelten vorzugsweise die gleichen vorstehenden Einschränkungen bezüglich dessen, dass die vorstehenden biologisch aktiven Peptide erhalten werden, und wobei außerdem solche Deletionsanaloga immer noch zwischen etwa 17 und etwa 23 Aminosäurereste aufweisen (Deletionsanaloga haben üblicherweise ein Länge von nicht weniger als etwa 13 Aminosäureresten). Wenn weiterhin Aminosäurereste angefügt sind, gelten vorzugsweise die gleichen vorstehenden Einschränkungen bezüglich der vorstehenden biologischen Aktivität, und wobei solche Additionsanaloga üblicherweise immer noch zwischen etwa 17 und etwa 23 Aminosäurereste aufweisen (Additionsanaloga haben üblicherweise ein Länge von bis zu etwa 30 Aminosäuren).
Für die Herstellung der Peptide und der sie enthaltenden Kits gemäß der vorliegenden Erfindung wurden bekannte Standardverfahren der Peptidsynthese verwendet, und die Kits basieren im Allgemeinen auf solchen Kits zum Durchführen von Tests des ELISA-Typs und enthalten somit neben den Peptiden verschiedene andere Standard-ELISA-Reagenzien. Zusammen mit jedem solchen Kit der Erfindung werden genaue Anleitungen für die Durchführung des ELISA-Verfahrens und außerdem verschiedene Warnhinweise oder andere erforderliche Vorsichtsmaßnahmen bereitgestellt. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden außerdem verschiedene verbesserte Reagenzien zur Zugabe in die Kits wie vorstehend erwähnt und nachstehend ausführlich beschrieben bereitgestellt.
Selbstverständlich können die neuen Peptide und insbesondere die neuen Gemische davon gemäß der vorliegenden Erfindung in verschiedenen anderen Formen von diagnostischen Tests zum Nachweisen einer C. trachomatis-Infektion verwendet werden, wobei die Verwendung nicht nur auf Tests des ELISA-Typs beschränkt ist. Zahlreiche solche Tests wurden entwickelt, z.B. die MIF-Tests. Genauso können die Kits der vorliegenden Erfindung so entworfen werden, dass diagnostische Tests durch geführt werden, die auf diesen anderen Testverfahren beruhen, und sie sind somit nicht nur auf Kits zum Durchführen solcher ELISA-Tests beschränkt.
Die vorliegende Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen und den beigelegten Figuren noch ausführlicher beschrieben.
Beispiel 1
Entwicklung eines Gemisches von MOMP-hergeleiteten Peptiden, die für alle Serovare von C. trachomatis spezifisch sind und die keine Kreuzreaktivität mit MOMP aus anderen Chlamydia-Arten eingehen
Wie vorstehend erwähnt bestand ein Ziel der vorliegenden Erfindung darin, ein Peptid-basiertes diagnostisches Kit zu entwickeln, das serologisch zwischen den drei Chlamydia-Arten unterscheidet. Eine Reihe von Experimenten wurde durchgeführt, um den Peptid-basierten ELISA-Test zu optimieren und außerdem das Kit zu stabilisieren. Die Peptid-basierte ELISA-Technologie wird nachstehend noch ausführlicher beschrieben.
Der erste Schritt bei der Erforschung umfasste die Synthese von drei artspezifischen Chlamydia trachomatis- (nachstehend kurz auch als „C.t." bezeichnet) Peptiden und drei C. pneumoniae- (nachstehend kurz auch als „C.p." bezeichnet) artspezifischen Peptiden. Diese Peptide stammten aus den vier variablen Domänen (VDI bis VDIV) des immundominanten Hauptproteins der äußeren Membran (MOMP) von Chlamydia, wie für C. trachomatis-MOMP in dem vorstehenden Yuan et al., 1989, und für C. pneumoniae-MOMP in Melgosa et al., Infect. Immun. 59: 2195–2199, (1991), beschrieben.
Drei Peptide stammten aus dem C. trachomatis-MOMP-Protein und sind hier bezeichnet als:

A. SEQ ID NO: 6, hierin auch als C.t. VDI bezeichnet, die die Sequenz: VAGLENDPTTNVARA aufweist;
B. SEQ ID NO: 7, hierin auch als C.t. VDII bezeichnet, die die Sequenz: DNENNATVSDSKLVPNHMSDQS aufweist;
C. SEQ ID NO: 8, hierin auch als C.t. VDIV bezeichnet, die die Sequenz: LDVTTNATIAGKGTVV aufweist; Drei Peptide stammten aus dem MOMP-Protein von C. pneumoniae und sind hier bezeichnet als:
D. SEQ ID NO: 9, hierin auch als C.p. VDI bezeichnet, die die Sequenz: NYTTAVDRPN aufweist;
E. SEQ ID NO: 10, hierin auch als C.p. VDIII bezeichnet, die die Sequenz: AFPLPTDAGVATATGTKS aufweist;
F. SEQ ID NO: 11, hier auch als C.p. VDIV bezeichnet, die die Sequenz: SLLGNALSTTDSFSDFMQIV aufweist. Die Aminosäuren TA in Position 7 in der entsprechenden Sequenz der vorstehenden Veröffentlichung von Melgosa et al. wurden deletiert.

Die vorstehenden Peptide und alle Peptide, die gemäß der vorliegenden Erfindung synthetisiert und verwendet wurden, wurden unter Verwendung von derzeit auf dem Fachgebiet bekannten Standard-Peptidsyntheseverfahren und Apparaturen synthetisiert. Die Peptide wurden durch HPLC analysiert und wiesen eine Reinheit von etwa 80 bis 90% auf, und sie wurden als stabile gefriergetrocknete Pulver formuliert.
Um zu bestimmen, ob diese Peptide spezifisch an Chlamydia-infizierte menschliche Seren binden können oder nicht, konzentrierte man sich bei der vorstehenden Analyse zuerst darauf, das Peptid-Diagnosesystem durch eine ELISA-Methodik zu eichen.
Es sollte beachtet werden, dass die vorstehend erwähnte ELISA-Methodik, die zum Eichen des Peptid-Diagnosesystems verwendet wurde, eine bekannte Standardmethodik ist, die dem Fachmann geläufig ist und in zahlreichen Artikeln, Patenten und Standardtexten nach dem Stand der Technik veröffentlicht wurde. Weitere Einzelheiten dieser Technologie, die für die vorliegende Erfindung relevant sind, werden in den folgenden Beispielen bereitgestellt, welche die Kits der vorliegenden Erfindung betreffen.
In einer weiteren Reihe von Experimenten wurden Chlamydia-spezifische menschliche Seren auf ihre Fähigkeit getestet, und zwar spezifisch die IgG-Antikörper in diesen Seren, spezifisch an Chlamydia-artspezifische Peptide zu binden, wobei das vorstehend beschriebene Peptid-basierte Diagnosesystem verwendet wurde. In diesen Experimenten wurde jede Reihe von Multiwell-Vertiefungen der Mikrotiterplatten (der feste Träger) mit einem unterschiedlichen Peptid beschichtet, und als Kontrolle wurde eine Reihe von Vertiefungen mit intaktem Chlamydia-Antigen, das von Dr. Cavenini, Abt. Mikrobiologie, Universität von Bologna, Italien, erhalten wurde, für bekannte Anti-Chlamydia-MOMP-Antikörper, beschichtet.
Die Ergebnisse dieser Studien sind in den 1 bis 4 dargestellt, die vorstehend kurz beschrieben sind.
In 1 sind die Bindungsmuster (dunkle Balken) eines typischen menschlichen Serums aus einem mit C. trachomatis infizierten Individuum zusammengefasst. Dieses Serum bindet spezifisch nur an das Peptid C.t. VDIV. Die Bindung wurde auch mit dem intakten C. trachomatis-Antigen (Int. C.t.) festgestellt. Eine geringe Hintergrund-Bindung (leere oder helle Balken) wurde festgestellt, wie sie in dem nicht-infizierten menschlichen Serum bestimmt wurde.
Im Fall von C. pneumoniae-infizierten menschlichen Seren, deren Ergebnisse in 2 zusammengefasst sind, bindet ein Teil der infizierten Seren spezifisch an das Peptid C.p. VDII, jedoch mit einem niedrigen Bindungsniveau, und ein Teil von ihnen bindet spezifisch an C.p. VDI (vgl. auch die Zusammenfassung in 4).
Da der Großteil der Bevölkerung eine frühere Infektion mit C. pneumoniae durchgemacht hat, konnten in diesem System auch Seren nachgewiesen werden, die spezifisch sowohl mit C. trachomatis-Peptid als auch mit C. pneumoniae-Peptid reagierten, wobei diese Ergebnisse in 3 zusammengefasst sind.
In 4 ist die Empfindlichkeit des Peptid-basierten Diagnosesystems und außerdem die Antigenität der getesteten Peptide zusammengefasst. Von 82 Chlamydia-infizierten menschlichen Seren, die entweder durch den vorstehenden ELISA-Test („SeroELISA Chlamydia") oder durch ein Standardverfahren der Mikroimmunfluoreszenz (MIF) getestet wurden, reagierten 29% nur mit C.t. VDIV-Peptid, 9,7% reagierten mit C.t. VDI- und/oder C.t. VDII-Peptiden. Die Gesamt-Empfindlichkeit des Peptidsystems betrug nur 57%.
Abschließend zeigen die vorstehenden Ergebnisse, dass das für C. trachomatis spezifische Hauptantigen das C.t. VDIV-Peptid ist, und das für C. trachomatis spezifische Nebenantigen ist das C.t. VDII-Peptid, während die Hauptantigene für C. pneumoniae C.p. VDI und VDII sind. In dem Peptid-basierten Diagnosesystem wurde ein Mangel an Empfindlichkeit festgestellt, da 43% der getesteten Seren durch dieses System nicht nachgewiesen wurden. Außerdem wurde eine niedrige Bindungsaktivität beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen somit auch die vorstehend erwähnten Nachteile der Peptide nach dem Stand der Technik und ihrer Verwendung in Immuntests zum Nachweisen von Anti-C. trachomatis-MOMP-Antikörpern. Deshalb wurde ein zweiter Satz von neuen modifizierten C. trachomatis-spezifischen Peptiden wie vorstehend unter Verwendung von Standard-Peptidsyntheseverfahren und Apparaturen synthetisiert. Diese Peptide wurden von C.t. VDIV-Sequenzen von verschiedenen C. trachomatis-Serovaren mit kleinen Modifikationen hergeleitet, wie nachstehend angegeben. Alle Peptide haben die C.t. VDIV-Core-Sequenz von C. trachomatis gemeinsam (in den folgenden Sequenzen in Kursivschrift markiert), jedoch ohne eine Kreuz-Homologie zu entweder C. pneumoniae oder C. psittaci (wie durch Vergleich dieser Peptidsequenzen mit den bekannten C. pneumoniae- und C. psittaci-Sequenzen festgestellt wurde):

1. SEQ ID NO: 1, IFDXTTLNPTIAGAGDVK – In diesem Peptid wurden entweder V (Serovare B, Ba) oder T (Serovare D, E, L1) in der Position deletiert, die als X markiert wurde. Dieses Peptid ist hier auch als C.t. 4A bezeichnet.
2. SEQ ID NO: 2, VDI TTLNPTIAGCGSVAK – K wurde am C-Terminus angefügt (stammte aus F- und G-Serovaren). Dieses Peptid ist hier auch als C.t. 4B bezeichnet.
3. SEQ ID NO: 3, CVFDVTTLNPTIAGAGDVK – An die Sequenz, die aus dem Serovar L2 stammte, wurde C am N-Terminus angefügt, und K wurde am C-Terminus angefügt. Dieses Peptid ist hier auch als C.t. 4C bezeichnet. Zusätzlich zu den vorstehenden drei neuen modifizierten Peptiden, die vom C.t. VDIV-Peptid hergeleitet sind, wurde noch ein viertes Peptid, das ein neues modifiziertes Peptid darstellt, synthetisiert, das eine vom C.t. VDII-Peptid hergeleitete Sequenz aufweist:
4. SEQ ID NO: 5, CDNENQSTVKTNSVPNMSLDQSK – Hergeleitet von der variablen Domäne II von Serovar E. C wurde am N-Terminus angefügt, und K wurde am C-Terminus angefügt. Dieses Peptid ist hier auch als C.t. 2A bezeichnet.

Die folgenden Peptide, die vom MOMP-Protein von C. pneumoniae hergeleitet sind, wurden entworfen, um die Kreuzreaktivität mit C. pneumoniae-spezifischen Sequenzen zu bestimmen und auch um einen C. pneumoniae-spezifischen Immuntest zu entwickeln:

1. SEQ ID NO: 12, CFSMGAKPTGSAAANYTTAVDRPNPAYNK – Hergeleitet von der variablen Domäne I. Dieses Peptid ist hier auch als C.p. 1A bezeichnet.
2. SEQ ID NO: 13, VKGTTVNANELPNVSLSNGK – Hergeleitet von der variablen Domäne II. Dieses Peptid ist hier auch als C.p. 2A bezeichnet.
3. SEQ ID NO: 14, LNLTAWNPSLLGNATALSTTDSFK – Hergeleitet von der variablen Domäne IV. Dieses Peptid ist hier auch als C.p. 4A bezeichnet.

In anschließenden Experimenten wurden die vorstehenden neuen Peptide und außerdem die vorstehend erwähnten, früher hergestellten Peptide unter Verwendung des gleichen Testverfahrens wie vorstehend angegeben getestet. Die getesteten Peptide waren:
C.t. 2A, C.t. 4A, C.t. 4B, C.t. 4C, C.p. 1A, C.p. 2A, C.p. 4A und C.p. VDIII.
In 5 sind die Ergebnisse der Bindung dieser Peptide an die aus drei verschiedenen C. trachomatis-infizierten Individuen erhaltenen Seren zusammengefasst. Wie aus 5 ersichtlich ist, reagiert jedes Serum mit unterschiedlichen C.t.-Peptid-Kombinationen, wobei jedes einzelne Balkendiagramm die Ergebnisse der Tests an dem aus einem anderen Individuum erhaltenen Serum darstellt, so dass das ersten Serum (oben) mit C.t. 4A und C.t. 4C reagiert, das zweite (Mitte) reagiert mit C.t. 4A, C.t. 4B und C.t. 4C, während das dritte (unten) nur eine gewisse Reaktivität mit C.t. 4B aufweist. In allen Fällen stellen die leeren Balken die Testreaktionen dar, in denen die Peptide mit Seren umgesetzt wurden, während die gefüllten (dunklen) Balken die Kontrollreaktionen darstellen, in denen zu den Peptiden Seren aus Individuen zugegeben wurden, bei denen bestätigt worden war (durch MIF), dass sie für eine Chlamydia-Infektion negativ waren. Weiterhin waren alle getesteten Seren offensichtlich sehr spezifisch und banden nicht an irgendwelche der C.p.-Peptide, d.h. alle getesteten Individuen wiesen nur Anti-C. trachomatis-Antikörper auf.
Ähnliche Ergebnisse wurden mit C. pneumoniae-spezifischen Seren festgestellt, die in 6 zusammengefasst sind. Wie eindeutig ersichtlich ist, reagieren die C. pneumoniae-Seren nur mit C. pneumoniae-Peptiden, nicht jedoch mit irgendeinem der C. trachomatis-Peptide.
In 7 sind die Bindungsmuster von drei verschiedenen menschlichen Seren zusammengefasst, die sowohl mit C. trachomatis als auch mit C. pneumoniae infiziert waren. Tatsächlich interagiert jedes Serum mit beiden C. trachomatis- und C. pneumoniae-Peptiden, jedoch mit anderen Peptidkombinationen, nämlich reagiert das erste (oben) mit C.t. 2A, C.t. 4A, C.t. 4B, C.t. 4C und C.p. 2A, das zweite (Mitte) reagiert mit C.t. 2A, C.t. 4A, C.t. 4C, C.p. 1A und C.p. 2A, und das dritte (unten) reagiert mit C.t. 4A, C.t. 4B, C.t. 4C, C.p. 1A, C.p. 2A und C.p. VDIII.
In einer andere Reihe von Experimenten wurde die Empfindlichkeit der verschiedenen vorstehenden C. trachomatis-Peptide an einer größeren Zahl von Seren getestet, die aus mehreren verschiedenen Individuen erhalten wurden, von denen bekannt war, dass sie mit C. trachomatis infiziert worden waren, da sie in Tests positiv getestet worden waren, in denen diese Seren mit C. trachomatis-Elementar-Antikörpern umgesetzt wurden, die MOMP als Hauptantigen enthielten. Die Empfindlichkeit des C. trachomatis-Peptids C.t. VDIV alleine im Vergleich zu den anderen C. trachomatis-VDIV-Peptiden, C.t. 4A, 4B und 4C, ist in Tabelle I zusammengefasst. Tabelle I
Aus diesen Daten geht hervor, dass von den 53 Seren, die auf C. trachomatis-Elementarkörper (EBs) positiv waren, nur 18 mit dem C.t. VDIV-Peptid positiv reagierten, während 48 mit mindestens einem der neuen C. trachomatis-Peptide C.t. 4A, C.t. 4B und C.t. 4C positiv reagierten. Interessanterweise reagierte keines der getesteten Seren nur mit dem C.t. VDIV-Peptid, d.h. alle Seren, die mit C.t. VDIV reagierten, reagierten auch mit mindesten einem der anderen Peptide, dies zeigt auch, dass C.t. VDIV im Vergleich zu den neuen Peptiden C.t. 4A, C.t. 4B und C.t. 4C kein einmaliges Epitop aufweist, das nicht in den neuen Peptiden enthalten ist.
Der diagnostische Wert jedes Peptids (C.t. 4A, C.t. 4B, C.t. 4C und C.t. 2A) wurde bestimmt, und die Ergebnisse hiervon sind in 8 zusammengefasst. Von 81 C. trachomatis-IgG-positiven menschlichen Seren, die durch den C. trachomatis-Peptid-basierten ELISA-Test getestet wurden, waren nur 22 für C.t. 2A positiv, 54 waren für C.t. 4A positiv, 62 waren für C.t. 4B positiv, und 65 waren für C.t. 4C positiv.
Da alle C. trachomatis-Peptide signifikant zu dem diagnostischen Wert beitragen, wurde auch die Reaktivität von C. trachomatis-spezifischen Seren auf ein Gemisch (1:1:1:1) der vorstehenden vier neuen C. trachomatis-Peptide und als Kontrolle auf die vier vorstehend angegebenen C. pneumoniae-Peptide getestet. Diese Ergebnisse sind in 9 zusammengefasst, woraus ersichtlich ist, dass das Gemisch der C.t.-Peptide eine sehr hohe spezifische Reaktivität nur für C. trachomatis-Seren aufweist, wobei jegliche Kreuzreaktivität mit C. pneumoniae-Seren insignifikant ist und im Wesentlichen nur auf Hintergrundniveaus liegt (negative Kontrolle: Seren aus Individuen, für die bestätigt wurde, dass sie für eine Chlamydia-Infektion negativ waren (durch MIF), die zum Peptidgemisch zugegeben wurden). Im Gegensatz hierzu weist das C.p.-Peptidgemisch eine geringere Reaktivität für C.p.-Seren und eine signifikante Kreuzreaktivität mit C.t.-Seren auf.
Wenn man die Literatur berücksichtigt, welche die verschiedenen Serovare von C. trachomatis betrifft, scheint es so zu sein, dass die drei neuen C. trachomatis-Peptide (4A, 4B und 4C) nur die B-Komplex-Serovare (Serovare B, D und E) und die Zwischenstufen-Komplex-Serovare (Serovare F und G) abdecken können. Jedoch liegt die Prävalenz von C-Komplex-Serovaren (Serovare C, H, I, J, K) in verschiedenen Ländern zwischen 10 und 20%. Deshalb wurde das folgende neue Peptid, das von einem Peptid von C-Komplex-Serovaren hergeleitet ist, unter Verwendung von Standard-Syntheseverfahren und Apparaturen wie vorstehend angegeben synthetisiert. Dieses Peptid stammt auch aus der C.t. VDIV-Region wie die neuen Peptide 4A, 4B und 4C.
Dieses neue Peptide ist:

5. SEQ ID NO: 4, LAEAILDVTTLNPTITGKXAVVSK – Dieses Peptid ist hier auch als 4D bezeichnet. Dieses Sequenz ist von dem Serovar K hergeleitet (ein C-Komplex-Serovar), G wurde in der Position, die als X markiert ist, deletiert, und K wurde am C-Terminus angefügt. Dieses Peptid besitzt auch die C.t. VDIV-Core-Sequenz TTLNPTIT, die vorstehend in Kursivschrift angeben ist.

In einer weiteren Reihe von Experimenten wurden die Peptide C.t. 2A, 4A, 4B, 4C und 4D auf Seren aus Patientinnen, die für eine in vitro-Fertilisation (IVF) vorgesehen waren, auf IgG-Reaktivität getestet. 27 solche Seren reagierten mit mindestens einem C. trachomatis-Peptid positiv. Von den 27 waren 20 für C.t. 4D positiv. Interessanterweise waren jedoch von diesen 20 Seren vier ausschließlich für C.t. 4D positiv. Weiterhin waren von den anderen 23 Seren (die nicht ausschließlich mit C.t. 4D reagierten) fünf ausschließlich für C.t. 4B positiv. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass diese zwei Peptide, C.t. 4B und C.t. 4D, erforderlich sind, um die Empfindlichkeit der neuen Peptide, insbesondere eines Gemisches davon, gegenüber Seren von allen C. trachomatis-Serovaren zu erhöhen. Diese Ergebnisse zeigen auch, dass diese zwei Peptide, C.t. 4B und C.t. 4D, möglicherweise auch Serovar-spezifische Epitope definieren. Diese Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II zusammengefasst. Tabelle II
Außerdem wurde die Empfindlichkeit von verschiedenen C. trachomatis-Gemischen getestet, die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefasst. MIX 1 bestand aus gleichen Mengen der Peptide C.t. 2A, 4A, 4B und 4C, während MIX 2 aus gleichen Mengen der Peptide C.t. 4A, 4B, 4C und 4D bestand. Wenn man die Ergebnisse von Immuntests unter Verwendung dieser zwei Gemische betrachtet, die in Tabelle III zusammengefasst sind, ist ersichtlich, dass MIX 2 die beste Empfindlichkeit für C. trachomatis-Antikörper (wie sie in den getesteten Seren vorliegen) besitzt. Tabelle III
Aufgrund dieser und anderer Untersuchungen (Ergebnisse nicht dargestellt) wurde beschlossen, dass MIX 2 das am stärksten bevorzugte Gemisch zur Verwendung in einem diagnostischen Kit sein wird. Ein solches Gemisch stellt die höchste Empfindlichkeit gegenüber Anti-C. trachomatis-Antikörpern (Anti-MOMP-Antikörpern), die in allen bisher getesteten Seren vorlagen, sowie die niedrigste (vernachlässigbar und nur gleich Hintergrundniveau) Kreuzreaktivität mit Antikörpern in Seren aus mit anderen Chlamydia-Arten positiv infizierten Individuen bereit.
Es sollte beachtet werden, dass experimentelle Ergebnisse hinsichtlich des neuen Peptids C.t. 4C (nicht dargestellt) zeigten, dass der Aminosäurerest C für seine Empfindlichkeit sehr wichtig war, wobei die Entfernung dieses C-Restes (oder die Synthese des Peptids ohne C am N-Terminus) eine Abnahme seiner Reaktivität gegenüber bestimmten Seren von etwa 55% bewirkte.
Beispiel 2
Bedingungen, welche die Stabilität von immobilisierten Peptiden für eine langfristige Lagerung erhöhen
Hinsichtlich der Verwendung des hier beschriebenen Peptidgemisches zum Entwickeln eines diagnostischen Kits ist es unbedingt erforderlich, die immobilisierten Peptide auf Stabilität zu testen, und zwar in der Form, z.B. von Peptid-beschichteten Mikrotiterplatten, wie sie als Komponenten eines Kits bereitgestellt werden sollen. Bei Verwendung von Schnell-Stabilitätstests, d.h. Lagern der immobilisierten Peptide bei 37°C, und Vergleichen der Testergebnisse mit den Ergebnissen, die von bei 4°C gelagerten Peptiden erhalten wurden, wurde gefunden, dass die Zusammensetzung des Puffers, der für die Blockierung nach Adsorption der Peptide verwendet wird, kritisch ist. Insbesondere sollte dieser Puffer, im Gegensatz zu dem ELISA-Verfahren nach dem Stand der Technik, kein Tween-20 enthalten. Außerdem wurde gefunden, dass die Zugabe von 1 bis 20% Saccharose, vorzugsweise 10% Saccharose, die Stabilität der Peptide für die Lagerung noch weiter steigert. Wie nachstehend genauer beschrieben zeigen die verschiedenen Peptide unterschiedliche Ausmaße an Instabilität, jedoch können alle Peptide stabil gelagert werden, wenn der Saccharose-enthaltende Blockierungspuffer verwendet wird. Wie für den Fachmann ersichtlich ist, wenn er berücksichtigt, dass verschiedene Peptide eingesetzt werden müssen, um eine Art-Spezifität zu erreichen, wie in Beispiel 1 ausführlich erläutert wird, ist eine solche Pufferformulierung sehr gut dafür geeignet, die auf Peptiden basierenden diagnostischen Kits zu entwickeln. Die Verwendung eines solche Puffers stabilisiert auch Peptide, die von anderen Sequenzen hergeleitet sind, wie nachstehend ausführlich beschrieben, nämlich die C. pneumoniae-MOMP VDI, VDII und VDIV. Die Verwendung eines solchen Puffers zum Durchführen eines Immuntests mit immobilisierten Peptiden ist der Gegenstand der Erfindung einer gleichzeitig anhängigen Anmeldung der gleichen Anmelder, IL 121116.
Um den Einfluss von Saccharose und Tween in der Blockierungslösung auf die Stabilität von verschiedenen Peptiden zu testen, wurden vier Peptide, die von C. trachomatis hergeleitet waren, und vier Peptide, die von C. pneumoniae hergeleitet waren, sowie ein Gemisch davon unabhängig voneinander getestet. Die Tests wurden durchgeführt, indem die immobilisierten Peptide bei 37°C drei bis zehn Tage inkubiert wurden und die Ergebnisse mit bei 4°C inkubierten Peptiden verglichen wurden. Die folgenden Tabellen zeigen auf der rechten Seite ELISA-Ergebnisse, die mit Peptiden erhalten wurden, welche bei den angegebenen Temperaturen und für die angegebenen Zeiten inkubiert wurden, während sie auf der linken Seite das Verhältnis der bei der 37°C-Inkubation erhaltenen Ergebnisse zu den bei der 4°C-Inkubation erhaltenen Ergebnissen wiedergeben. Ein Verhältnis von etwa 1 oder größer zeigt an, dass das Peptid stabil ist, wenn es bei 37°C inkubiert wird, während niedrigere Ergebnisse (< 0,9) eine Instabilität des immobilisierten Peptids anzeigen.
A) Ergebnisse, die unter Verwendung von C. trachomatis-Peptiden erhalten wurden
Die Tabellen 4 bis 15 zeigen die Ergebnisse von ELISA-Tests, die mit immobilisierten Peptiden durchgeführt wurden, welche für die angegebenen Zeiten und bei den angegebenen Temperaturen trocken gelagert wurden. Der Test wurde wie für Tabelle 2 beschrieben durchgeführt, wobei 10% Saccharose und/oder 0,05% Tween-20 zu dem Blockierungspuffer wie angegeben zugegeben wurden.
Alle getesteten C. trachomatis-Peptide waren im Wesentlichen stabil, wenn Saccharose-enthaltender Blockierungspuffer verwendet wurde (vgl. Tabellen 4, 7, 10, 13).
Wenn die Saccharose aus dem Blockierungspuffer weggelassen wurde, wurde eine signifikante Abnahme der Reaktivität gegenüber den meisten Seren für Peptid C.t. 4A und C.t. 4C (Tabellen 5 und 11), eine Abnahme gegenüber drei der Seren für C.t. 4B (Tabelle 8) und eine leichte Abnahme gegenüber vier Seren für C.t. 4D (Tabelle 14) festgestellt. Diese Daten zeigen deutlich, dass jedes Peptid mehrere Epitope präsentiert und dass die Reaktivität dieser Epitope gegenüber den Antiseren durch die La gerung der getrockneten immobilisierten Peptide unterschiedlich beeinflusst wird, dass jedoch alle Epitope aufrechterhalten werden können, wenn für die Blockierung ein Saccharose-enthaltender Puffer verwendet wird.
Wenn Saccharose aus der Blockierungslösung weggelassen wurde und Tween-20 zugegeben wurde (wie es in ELISA-Verfahren üblich ist), wurde die Stabilität von einigen der Peptide stark verringert, z.B. C.t. 4A (vergleiche Tabelle 6 mit Tabelle 5) und C.t. 4B (vergleiche Tabelle 9 mit Tabelle 8), während die anderen zwei Peptide weniger stark beeinträchtigt wurden, jedoch auch noch etwas niedrigere Reaktivitäten zeigten, wenn Tween-20 im Blockierungspuffer vorlag (vergleiche Tabelle 12 mit Tabelle 11 und Tabelle 15 mit Tabelle 14). Tabelle 4
(Fortsetzung)
Tabelle 5
Tabelle 6
Tabelle 7
(Fortsetzung)
Tabelle 8
Tabelle 9
Tabelle 10
(Fortsetzung)
Tabelle 11
Tabelle 12
Tabelle 13
(Fortsetzung)
Tabelle 14
Tabelle 15
B) Ergebnisse, die unter Verwendung von C. pneumoniae-Peptiden erhalten wurden
Um aufzuklären, ob das Vorliegen von Saccharose im Blockierungspuffer nur C. trachomatis-Peptide beeinträchtigt (alle getesteten Peptide stammten aus der VDIV-Region des MOMP-Proteins und waren deshalb in ihrer Sequenz homolog) oder auch einen Einfluss auf die Stabilität anderer Peptide hat, wurden verschiedene Peptide, die von der MOMP-Proteinsequenz von C. pneumoniae hergeleitet waren, auf Stabilität wie vorstehend für C. trachomatis-Peptide beschrieben getestet.
Wenn Saccharose im Blockierungspuffer vorlag, waren die Peptide C.p. VDIII, C.p. 1A im Wesentlichen stabil (vgl. die Tabellen 16 und 22). Auch ein Gemisch von Peptiden (C.p. 1A, C.p. 2A, C.p. VDIII, C.p. 4A) war stabil (Tabelle 19). Das Peptid C.p. 2A war unter diesen Bedingungen etwas weniger stabil, wie durch die Verhältnisse (37°C/4°C) im Bereich zwischen 0,8 und 0,9 bei vier der getesteten Seren gezeigt wird (Tabelle 25, M92, H171 + H226, H171, H247, nach zehn Tagen Lagerung).
Wenn Saccharose aus der Blockierungslösung weggelassen wurde, war jedoch die Stabilität der Reaktivität der Peptide gegenüber zwei Seren im Fall von C.p. VDIII (Tabelle 17), gegenüber fünf Seren im Fall des Peptidgemisches (Tabelle 20) und gegenüber vier Seren im Fall von C.p. 1A (Tabelle 23) reduziert. Die leichte Instabilität von Peptid C.p. 2A, die mit Saccharose-enthaltendem Puffer festgestellt wurde (Tabelle 25, Verhältnisse zwischen 0,8 und 0,9 für M92, H171 + H226, H171 und H156), war signifikant erhöht, wenn Saccharose aus dem Puffer weggelassen wurde (Tabelle 26, Verhältnisse zwischen 0,5 und 0,8 für die gleichen Seren).
Die Zugabe von Tween-20 zur Blockierungslösung, wie es bei ELISA nach dem Stand der Technik üblich ist, reduzierte die Stabilität der C. pneumoniae-Peptide noch weiter, wie für C.p. VDIII (vergleiche Tabelle 18 mit Tabelle 17) und das Peptidgemisch zu sehen ist (vergleiche Tabelle 21 mit Tabelle 20). Andererseits wurde die Stabilität von C.p. 1A durch das Vorliegen von Tween im Blockierungspuffer nicht beeinträchtigt (vergleiche Tabelle 24 mit Tabelle 23), während Tween sogar eine günstige Wirkung auf die Stabilität von C.p. 2A zu haben schien (vergleiche Tabelle 27 mit Tabelle 26, Seren M92 und H163). Jedoch war auch im Fall von C.p. 2A die Zugabe von Saccharose der Zugabe von Tween hinsichtlich einer erhöhten Stabilität überlegen (vergleiche z.B. die Seren M95 und H163 in den Tabellen 25 bis 27).
Zusammenfassend legen die vorstehenden Ergebnisse nahe, dass die hier verwendeten C. trachomatis- und C. pneumoniae-Peptide mehrere Epitope präsentieren, dass diese Epitope durch eine Lagerung ohne Saccharose und die Zugabe von Tween zur Blockierungslösung unabhängig voneinander beeinträchtigt werden. Weiterhin legen sie nahe, dass eine Lagerung ohne Saccharose möglicherweise zur Exposition oder Bildung von Epitopen führt, welche unspezifisch binden, wodurch hohe Hintergrundwerte erhalten werden und deshalb die Wahrscheinlichkeit zunimmt, in dem Test ein falsch-positives Ergebnis zu erhalten. In sehr seltenen Fällen kann es sein, dass die Zugabe von Tween-20 zur Stabilisierung eines spezifischen Epitops beiträgt, wie im Fall der Reaktivität von C.p. 2A gegenüber H163 (vergleiche die Tabellen 30 und 29). Alle diese Probleme werden gelöst, indem man Tween-20 weglässt und Saccharose zum Blockierungspuffer zugibt, dies steht im Gegensatz zu der herkömmlichen Übereinkunft bezüglich ELISA nach dem Stand der Technik. Dies wird unter Verwendung der verschiedensten Peptide gezeigt, die von unterschiedlichen Bereichen (VDI, VDII und VDIV) des MOMP von zwei verschiedenen Chlamydia-Stämmen hergeleitet sind. Deshalb haben die Peptide keine gemeinsame Struktur oder Sequenzhomologie, so dass es wahrscheinlich ist, dass die hier erhaltenen Ergebnisse für Peptide im Allgemeinen gültig sind. Tabelle 16
Tabelle 17
Tabelle 18
(Fortsetzung)
Tabelle 19
Tabelle 20
Tabelle 21
(Fortsetzung)
Tabelle 22
Tabelle 23
Tabelle 24
(Fortsetzung)
Tabelle 25
Tabelle 26
Tabelle 27
(Fortsetzung)
Beispiel 2
Entwickeln und Charakterisieren eines diagnostischen Kits das für C. trachomatis spezifisch ist
Die gemäß der vorliegenden Erfindung entwickelten diagnostischen Kits stellen wesentlich verbesserte Enzyme Linked Immunosorbent Assay-(ELISA-) Kits dar, die spezifisch für die Diagnose von C. trachomatis-spezifischen Infektionen entworfen wurden. Zwei Basiskits wurden entwickelt, die beide manipuliert werden können, indem verschiedene ihrer Bestandteile so verändert werden, dass sie den Bedürfnissen des Kunden entsprechen. Das eine Kit ist für die Bestimmung von spezifischen C. trachomatis-IgG-Antikörpern in menschlichen Seren vorgesehen, wobei dieses hier als das „IgG-Kit" bezeichnet wird. Das zweite Kit ist für die Bestimmung von spezifischen C. trachomatis-IgA-Antikörpern in menschlichen Seren vorgesehen, wobei dieses hier als das „IgA-Kit" bezeichnet wird. Im Allgemeinen weisen die vorstehenden Kits der Erfindung mindestens einige der folgenden Bestandteile auf:

(i) Eine C. trachomatis-Antigen-beschichtete Mikrotiterplatte mit einer Plattenabdeckung, üblicherweise des herkömmlichen Multiwell-Typs, der insgesamt 96 Vertiefungen pro Platte aufweist, die in Form von zwölf Säulen und acht Reihen angeordnet sind, d.h. acht Vertiefungen pro Säule für insgesamt 96 Vertiefungen. Zusammen mit solchen Platten werden zwölf entfernbare 8-Vertiefungs-Streifen bereitgestellt, die mit dem C. trachomatis-Antigen beschichtet sind. Das C. trachomatis-Antigen ist vorzugsweise ein Gemisch von neuen Peptiden wie im vorstehenden Beispiel 1 angegeben, wobei die am stärksten bevorzugten Gemische solche sind, die in Beispiel 1 als „MIX 1" und „MIX 2" bezeichnet sind. Somit liegt für jede Vertiefung der Mikrotiterplatte ein Streifen vor, der mit dem C. trachomatis-Peptidgemisch der Erfindung beschichtet ist.
(ii) Einen konzentrierten Waschpuffer, der üblicherweise ein konzentrierter PBS-Tween-Puffer des Standardtyps ist, der auf dem Fachgebiet bekannt ist.
(iii) Ein Serumverdünnungsmittel, üblicherweise in Form einer gebrauchsfertigen gefärbten Pufferlösung.
(iv) Ein Konjugatverdünnungsmittel, üblicherweise in Form einer gebrauchsfertigen gefärbten Pufferlösung.
(v) Eine negative Kontrolle, die üblicherweise ein C. trachomatis-IgG- oder IgA-negatives menschliches Serum in gebrauchsfertiger Form ist.
(vi) Eine positive Kontrolle, die üblicherweise ein C. trachomatis-IgG- oder IgA-positives menschliches Serum in einer gebrauchsfertigen Form ist.
(vii) Ein konzentriertes HRP-Konjugat, üblicherweise in Form von Meerrettich-Peroxidase (HRP), konjugiert an Anti-Mensch-IgG oder Anti-Mensch-IgA (gamma-Kette-spezifisch).
(viii) Ein konzentriertes TMB-Substrat, üblicherweise in Form von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) in Dimethylsulfoxid (DMSO) als Chromogen und Harnstoff-Wasserstoffperoxid als Substrat für die Peroxidase (HRP).
(ix) Eine Stopplösung, die üblicherweise 1 M H₂SO₄ in gebrauchsfertiger Form enthält.
(x) Genaue Anweisungen zur Verwendung, einschließlich von Warnhinweisen und Vorkehrungen.

Von den vorstehenden Bestandteilen sind diejenigen, die für die vorliegende Erfindung einmalig sind und somit für die Kits der Erfindung unbedingt erforderlich sind, die folgenden: (i) die mit einem C. trachomatis-Peptidgemisch beschichtete Mikrotiterplatte, und (x) die genauen Anweisungen zur Verwendung. Alle anderen Bestanteile (ii) bis (ix) können verbesserte oder modifizierte Vertreter wie nachstehend angegeben gemäß der Erfindung sein, oder sie können herkömmliche, im Handel verfügbare Äquivalente sein, die für ELISA nach dem Stand der Technik bekannt sind.
Unter Verwendung der vorstehenden Kits und neuen Gemischen von C. trachomatis-Peptiden sieht das grundlegende Testverfahren wie folgt aus:
(a) Testverfahren

1. Inkubation der Serumproben und Kontrollen: 1.1. Verdünnen jedes Patientenserums 1/21 mit dem Serumverdünnungsmittel (im Handel verfügbar und üblicherweise mit dem Kit geliefert; vgl. auch nachstehend). 1.2. Pipettieren von 50 μl aus der positiven Kontrolle, aus der negativen Kontrolle und aus dem 1/21 verdünnten Patientenserum (aus Schritt 1.1.) in getrennte Vertiefungen des Teststreifens (wie vorstehend angegeben ist jeder Streifen ein Antigen-beschichteter Streifen mit acht Vertiefungen, wobei zwölf solche Streifen pro Mikrotiterplatte möglich sind, wenn Platten mit 96 Vertiefungen verwendet werden). 1.3. Abdecken der Streifen (d.h. Abdecken der ganzen Platte mit der Plattenabdeckung) und Inkubieren für eine Stunde bei 37°C in einer angefeuchteten Umgebung. 1.4. Verwerten der flüssigen Bestandteile der Vertiefungen. 1.5. Waschschritt: Füllen jeder Vertiefung mit Waschpuffer und Verwerten der Flüssigkeit; sechsmaliges Wiederholen dieses Schrittes. 1.6. Trocknen der Streifen und ELISA-Platte, indem sie vorsichtig über sauberem saugendem Papier abgeklopft werden.
2. Inkubation mit Konjugat: 2.1. Verdünnen des konzentrierten (üblicherweise 300-fach konzentrierten) HRP-Konjugat-Anti-Mensch-IgG (1/300) mit Konjugatverdünnungsmittel. 2.2. Pipettieren von 50 μl des verdünnten Konjugats in jede Vertiefung. 2.3. Abdecken der Streifen und Inkubieren für eine Stunde bei 37°C in einer angefeuchteten Umgebung. 2.4. Verwerten des flüssigen Inhalts und Waschen wie in Schritt 1.5. beschrieben. 2.5. Trocknen der Streifen und ELISA-Platte, indem sie vorsichtig über sauberem saugendem Papier abgeklopft werden.
3. Inkubation mit TMB-Substrat: 3.1. Verdünnen des konzentrierten (üblicherweise 10-fach konzentrierten) TMB-Substrats 1/10 in DDW. Alternativ kann ein gebrauchsfertiges (RTU)-TMB-Substrat verwendet und der Verdünnungsschritt weggelassen werden. 3.2. Pipettieren von 100 μl des verdünnten TMB-Substrats in jede Vertiefung, Abdecken der Streifen und Inkubieren bei Raumtemperatur für nur zehn Minuten. Alternativ kann das RTU-TMB-Substrat verwendet und die Inkubation auf 15 Minuten verlängert werden. 3.3. Abstoppen der Reaktion durch Zufügen von 100 μl 1 M H₂SO₄ (Chromogen-Stopplösung) zu jeder Vertiefung. 3.4. Bestimmen der Absorption bei 450 nm und Aufzeichnen der Ergebnisse.

(b) Entwickeln von verbesserten serologischen diagnostischen Kits:
Im Folgenden wird die Entwicklung der verbesserten Kits skizziert:

1) Kits werden „benutzerfreundlicher" gemacht: a) Reduzieren der Zahl von Waschschritten. b) Zufügen verschiedener Farben zum Serumverdünnungsmittel und zum Konjugatverdünnungsmittel. c) Stabilisieren des Kits für eine längere Lagerbeständigkeit.
2) Klinische Tests der verbesserten Kits.

Um das vorstehende Ziel 1a) zu erreichen, nämlich die Zahl der Waschschritte von sechs auf drei zu reduzieren, wurden verschiedene Waschpuffer getestet und mit dem ursprünglichen Waschpuffer verglichen, der üblicherweise in ELISA verwendet wird, wobei es sich um einen PBS-basierten Puffer handelt. Diese Waschpuffer enthielten eine steigende Menge nicht-ionischer Detergenzien oder ionischer Detergenzien.
Ergebnisse: Der Waschpuffer, der nur drei Waschschritte möglich machte, war derjenige, der nicht-ionisches Detergens enthielt, wobei es sich um den vorstehend erwähnten PBS-Tween-Puffer handelte (vgl. Bestandteil Nr. (ii) in der vorstehenden Liste). Weiterhin wurde gefunden, dass dieser PBS-Tween-Puffer leicht in einer bevorzugten Konzentration von 20-fach konzentriert hergestellt werden konnte, wobei dieser 20-fach konzentrierte Waschpuffer einen Monat bei 37°C und elf Monate bei 4°C stabil war.
Um das vorstehend in 1b) angegebene Ziel zu erreichen, wurde das Folgende durchgeführt:
Die folgenden Farbstoffe wurden entweder zu dem Serumverdünnungsmittel oder zu dem Konjugatverdünnungsmittel zugegeben und getestet: Violett-Pulver, Evans-Blau-, Mokkabraun-Pulver und von den Lebensmittelfarbstoffen: „Blue Brilliant", „Yellow Sunset" und ihre Kombination (grüne Farbe).
Ergebnisse: Die Violett-, Evans-Blau- und Moccobraun-Farbstoffe störten den Test in gewisser Weise, indem sie entweder das Hintergrundsignal verstärkten und/oder das tatsächliche Testsignal abschwächten. Die einzigen Farbstoffe, die im Test eine gute Funktion zeigten, waren das Blue Brilliant, Yellow Sunset und ihre Kombination (grüne Farbe).
Außerdem sollte beachtet werden, dass die Farbstoffe Blue Brilliant und Yellow Sunset und ihre Kombination (grüne Farbe) einen Monat bei 37°C und ein Jahr bei 4°C stabil waren. Aufgrund dieser Ergebnisse wird in den bevorzugten Kits der Erfindung das Serumverdünnungsmittel mit blauem Farbstoff und das Konjugatverdünnungsmittel mit grünem Farbstoff bereitgestellt, wodurch eine optimale Unterscheidung zwischen den zwei Verdünnungsmitteln anhand der Farbe ermöglicht wird, und diese Farbstoffe gleichzeitig den Test nicht stören.
Bezüglich des vorstehenden Ziels 1c) wurde gefunden, dass das RTU-TMB-Substrat einen Monat bei 37°C und zwölf Monate bei 4°C stabil war. Dies ist auch bei anderen Reagenzien der Fall, die in dem verbesserten Kit eingesetzt werden, wie vorstehend erwähnt.
Um das vorstehende Ziel 5) zu erreichen, nämlich klinische Untersuchungen der IgG- und IgA-C. trachomatis-Kits, wurde das Folgende durchgeführt:
1) Vergleich der Empfindlichkeit und Spezifität von IgG- und IgA-Kits, verglichen mit MIF-MRL:
Um die Empfindlichkeit und Spezifität der IgG- und IgA-Kits zu ermitteln, wurden Seren aus nicht-infizierten Individuen (negative Seren) oder diejenigen, für die bereits bestimmt wurde, dass sie nur mit C. trachomatis positiv infiziert worden waren (positive Seren), gemäß dem vorstehenden Verfahren getestet, wobei das Testverfahren unter Verwendung der Kits durchgeführt wurde. Die Empfindlichkeit und Spezifität wurden im Vergleich zu den durch MIF-MRL erhaltenen Ergebnissen errechnet (einen im Handel verfügbaren Standard-Mikroimmunfluoreszenz-(MIF-) Testkit, das gemäß den Anweisungen des Herstellers und unter Verwendung der relevanten C. trachomatis-Antigene zum Nachweisen der IgG- und IgA-Antikörper in den Seren eingesetzt wurde).
Ergebnisse: Die IgG- und IgA-Kits sind in der Lage, sowohl IgG- als auch IgA-Spiegel in Seren aus C. trachomatis-infizierten Individuen, wie durch MIF-MRL bestimmt, nachzuweisen. Die Empfindlichkeit und Spezifität des Peptidtests sind hoch und betrugen 94% bzw. 90% für IgG und 95% bzw. 90% für IgA. Diese Ergebnisse sind in 10 zusammengefasst, in welcher die hellen Balken in den Balkendiagrammen die Ergebnisse darstellen, die mit dem kommerziellen MIF-Referenzkit erhalten wurden, und die dunklen Balken die Ergebnisse darstellen, die mit dem IgG-Kit (linke Darstellung) und mit dem IgA-Kit (rechte Darstellung) erhalten wurden.
Vergleich der Empfindlichkeit und Spezifität von IgG- und IgA-Kits, verglichen mit der Kultur
Menschliche Seren aus mit C. trachomatis infizierten Individuen, wie durch Kultur bestimmt wurde, wurden mit den IgG- und IgA-Kits auf C. trachomatis-IgG- und IgA-Antikörper getestet. Seren, die IgG-negativ waren, wurden außerdem durch einen anderen serologischen Test, MIF (wie vorstehend angegeben), getestet. Die Empfindlichkeit der IgG- und IgA-Kits wurde jeweils mit der Kultur verglichen.
Ergebnisse: Die Ergebnisse sind in 11 zusammengefasst, aus welcher ersichtlich ist, dass die Empfindlichkeit des C. trachomatis-Tests (dunkle Balken, 11) im Vergleich zur Kultur (schraffierter Balken in 11) 78% für IgG und 78% für IgA betrug. Fünf Prozent der Seren zeigten nur eine IgA-Reaktivität. Deshalb wurde die Gesamt-Empfindlichkeit der Kits auf 83% berechnet. 70% der Seren, die für IgG negativ waren (22% der gesamten Seren), waren auch beim MIF negativ (leerer Balken, 11).
(c) Spezifität des IgG-Kits, verglichen mit verschiedenen MIF-Tests
Die Spezifität des IgG-Kits wurde im Vergleich zu verschiedenen MIF-Tests (MIF1-, MIF2- und SeroFIA-Tests) bestimmt. Alle MIF-getesteten Seren waren C. trachomatis-negativ (C.t.^–), und ein Teil der Seren war auch C. pneumoniae-positiv (C.t./C.p.⁺). MIF1 und MIF2 sind Standard-MIF-Tests wie vorstehend angegeben, während SeroFIA ein neuer Mikroimmunfluoreszenztest für den Nachweis zur Unterscheidung von C. trachomatis, C. pneumoniae und C. psittaci ist.
Ergebnisse: Die Ergebnisse sind in 12 zusammengefasst, aus der ersichtlich ist, dass das IgG-Kit hochspezifisch ist und eine Spezifität von mindestens 90% zeigte (helle Balken in 12), wenn man es mit den verschiedenen MIF-Tests verglich (dunkle Balken und dunkle/schraffierte Balken in 12). Das IgG-Kit ging keine Kreuzreaktion mit C. pneumoniae-positiven Seren ein.
Aufgrund aller vorstehend erwähnten Ergebnisse, welche die Empfindlichkeit und Spezifität der IgG- und IgA-Kits der Erfindung betreffen, ist es bei Verwendung dieser Kits zum Testen von Serumproben vorteilhaft, beide Kits einzusetzen, nämlich jede Serumprobe den IgG- und IgA-Tests zu unterwerfen, und dann die Ergebnisse zu vergleichen. Auf diese Weise wird eine weitere Kontrolle hinsichtlich der Genauigkeit der Testergebnisse bereitgestellt, wodurch noch weiter sichergestellt wird, dass keine falsch-negativen und/oder falsch-positiven Ergebnisse erhalten werden. In der folgenden Tabelle 28 ist eine Anleitung zum Auswerten und Interpretieren der Ergebnisse skizziert, wenn Seren sowohl mit IgG-Kits als auch mit IgA-Kits getestet werden: Tabelle 28
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines Gemischs von Peptidsequenzen, die aus der Gruppe von (a) SEQ ID NO. 1, hierin auch als Peptid 4A bezeichnet, die die Aminosäuresequenz IFDTTLNPTIAGAGDVK aufweist; (b) SEQ ID NO. 2, hierin auch als Peptid 4B bezeichnet, die die Aminosäuresequenz VDITTLNPTIAGCGSVAK aufweist; (c) SEQ ID NO. 3, hierin auch als Peptid 4C bezeichnet, die die Aminosäuresequenz CVFDVTTLNPTIAGAGDVK aufweist; (d) SEQ ID NO. 4, hierin auch als Peptid 4D bezeichnet, die die Aminosäuresequenz LAEAILDVTTLNPTITGKAVVSK aufweist; (e) SEQ ID NO. 5, hierin auch als Peptid C.t2A bezeichnet, die die Aminosäuresequenz CDNENQSTVKTNSVPNMSLDQSK aufweist; oder Analoga derselben mit im Wesentlichen der gleichen biologischen Aktivität wie die Peptide ausgewählt sind, wobei Analoga Peptidsequenzen umfassen, in denen eine konservative Substitution, Deletion oder Addition durchgeführt wurde, bei der Herstellung eines Antigens zur Verwendung in einem Immunoassay, wobei das Antigen für C. trachomatis spezifisch ist und mit anderen Chlamydia-Arten keine Kreuzreaktion eingeht.
Gemisch von vier Peptiden gemäß der Definition in Anspruch 1 mit Spezifität für C. trachomatis und fehlender Kreuzreaktivität mit anderen Chlamydia-Arten, mit der Maßgabe, dass, wenn ein Analogon des Peptids 4C mit im Wesentlichen der gleichen biologischen Aktivität wie die Peptide in dem Gemisch vorhanden ist, das Analogon des Peptids 4C eine Addition, Substitution oder Deletion umfasst.
Gemisch von vier Peptiden gemäß der Definition in Anspruch 1 mit Spezifität für C. trachomatis und fehlender Kreuzreaktivität mit anderen Chlamydia-Arten, mit der Maßgabe, dass, wenn Analoga mit im Wesentlichen der gleichen biologischen Aktivität wie die Peptide in dem Gemisch vorhanden sind, die Analoga eine Addition, Substitution oder Deletion umfassen.
Gemisch von Peptidsequenzen gemäß der Definition in den Ansprüchen 1–3, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es Spezifität nur gegenüber C. trachomatis-Serovars aufweist und mit Antikörpern anderer Chlamydia-Arten keine Kreuzreaktion eingeht, wobei die Peptide aus (a) SEQ ID NO. 1, hierin auch als Peptid 4A bezeichnet, die die Aminosäuresequenz IFDTTLNPTIAGAGDVK aufweist; (b) SEQ ID NO. 2, hierin auch als Peptid 4B bezeichnet, die die Aminosäuresequenz VDITTLNPTIAGCGSVAK aufweist; (c) SEQ ID NO. 3, hierin auch als Peptid 4C bezeichnet, die die Aminosäuresequenz CVFDVTTLNPTIAGAGDVK aufweist; (d) SEQ ID NO. 4, hierin auch als Peptid 4D bezeichnet, die die Aminosäuresequenz LAEAILDVTTLNPTITGKAVVSK aufweist; (e) SEQ ID NO. 5, hierin auch als Peptid C.t2A bezeichnet, die die Aminosäuresequenz CDNENQSTVKTNSVPNMSLDQSK aufweist; oder Analoga derselben mit im Wesentlichen der gleichen biologischen Aktivität der Peptide ausgewählt sind, wobei Analoga Peptidsequenzen umfassen, in denen eine konservative Substitution, Deletion oder Addition durchgeführt wurde.
Gemisch von Peptiden nach Anspruch 4, das ein Gemisch der vier Peptide (a), (b), (c) und (d) oder ein Gemisch von einem oder mehreren der Peptide (a) – (d) mit einem oder mehreren Analoga von (a) – (d) mit im Wesentlichen der gleichen biologischen Aktivität der Peptide ist, wobei, wenn die Peptide und die Analoga das Gemisch bilden, das Gemisch vier Peptide enthält, die aus einer der möglichen Kombinationen von (a) oder einem Analogon von (a) + (b) oder einem Analogon von (b) + (c) oder einem Analogon von (c) + (d) oder einem Analogon von (d) ausgewählt sind.
Gemisch von Peptiden nach Anspruch 5, das ein Gemisch der vier Peptide (a), (b), (c) und (e) oder ein Gemisch von einem oder mehreren der Peptide (a) – (c) und (e) mit einem oder mehreren Analoga von (a) – (c) und (e) mit im Wesentlichen der gleichen biologischen Aktivität der Peptide ist, wobei, wenn die Peptide und die Analoga das Gemisch bilden, das Gemisch vier Peptide enthält, die aus einer der möglichen Kombinationen von (a) oder einem Analogon von (a) + (b) oder einem Analogon von (b) + (c) oder einem Analogon von (c) + (e) oder einem Analogon von (e) ausgewählt sind.
Gemisch von Peptiden nach einem der Ansprüche 4 bis 6, das ein Gemisch der Peptide (a), (b), (c) und (d) ist, wobei die Peptide in dem Gemisch in gleichen Mengen vorhanden sind.
Gemisch von Peptiden nach einem der Ansprüche 4 bis 6, das ein Gemisch der Peptide (a), (b), (c) und (e) ist, wobei die Peptide in dem Gemisch in gleichen Mengen vorhanden sind.
Kit zur Diagnose einer C. trachomatis-Infektion, das ein Gemisch von Peptiden nach einem der Ansprüche 2 bis 8 und Herstelleranweisungen zur Verwendung des Kits umfasst.
Kit zur Diagnose von C. trachomatis nach Anspruch 9, wobei das Kit aus RIA, EIA, ELISA, Immuno Competition Assays, Competition ELISA Assays, laterale-Chromatographie-Assays und dem SeroRapid^® Assay ausgewählt ist.
Kit nach Anspruch 10, wobei das Kit zur Durchführung eines Enzyme Linked Immunoassay (ELISA) oder eines Competition ELISA dient und das Kit das Gemisch von Peptiden, das auf einem festen Träger immobilisiert ist, und die Reagenzien zur Durchführung des ELISA umfasst.
Verwendung eines Gemischs von Peptiden nach einem der Ansprüche 2 bis 8 zur Herstellung eines Diagnosekits zur Detektion einer C. trachomatis-Infektion.
Gemisch von Peptiden gemäß einem der Ansprüche 2 bis 8 zur Verwendung bei der Herstellung eines Diagnosekits zur Detektion einer C. trachomatis-Infektion.
Verfahren zur Detektion einer C. trachomatis-Infektion bei einem Individuum, das umfasst: (a) Inkontaktbringen einer Körperflüssigkeitsprobe, die von dem Individuum erhalten wurde, mit einem Antigen gemäß der Definition in Anspruch 1 oder einem Gemisch von Peptiden nach einem der Ansprüche 2–8 unter geeigneten Assaybedingungen und (b) Bestimmen des Ausmaßes einer Reaktion zwischen der Körperflüssigkeitsprobe und dem Gemisch von Peptiden.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Verfahren die Durchführung eines diagnostischen Tests des ELISA-Typs umfasst, wobei das Gemisch von Peptiden auf einem festen Träger immobilisiert ist und dann unter geeigneten ELISA-Bedingungen mit der Körperflüssigkeitsprobe in Kontakt gebracht wird und wobei, wenn die Körperflüssigkeitsprobe für C. trachomatis MOMP spezifische Antikörper enthält, eine detektierbare positive Reaktion mit dem Gemisch von Peptiden vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Körperflüssigkeitsprobe aus Serum, Speichel, Tränenflüssigkeit, Urin, Samen, Cervixabstrichen, Bronchiolenlavage und Sputum ausgewählt ist.
Verwendung des Gemischs von Peptiden nach einem der Ansprüche 2 bis 8 bei einem Diagnoseverfahren nach Anspruch 14, 15 oder 16.
Kit nach den Ansprüchen 9, 10 oder 11, wobei das Kit zur Detektion des Vorhandenseins von IgA- und/oder IgG- und/oder IgM-Anti-MOMP-Antikörpern, die für C. trachomatis spezifisch sind, fähig ist, wenn die Antikörper in der Testkörperflüssigkeitsprobe, die getestet wird, vorhanden sind.
Konjugat eines Antigens gemäß der Definition in Anspruch 1 mit einem detektierbaren Marker.