DE69110287T2

DE69110287T2 - Verfahren zur bestimmung von bakteriellen gramnegativen lipopolysacchariden in biologischen flüssigkeiten.

Info

Publication number: DE69110287T2
Application number: DE69110287T
Authority: DE
Inventors: Eric Hansen; Jussi Mertsola; Robert Munford
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 1990-07-13
Filing date: 1991-07-10
Publication date: 1996-02-08
Anticipated expiration: 2011-07-11
Also published as: JPH05508714A; WO1992001228A1; DE69110287D1; EP0539497B1; CA2084083A1; US5198339A; US5356778A; ATE123576T1; EP0539497A1; AU8297191A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von bakteriellern Endotoxin in einer biologischen Flüssigkeit oder in einer Flüssigkeit, die klinisch oder pharmazeutisch verwendet werden soll, und zwar unter Verwendung van Antikörpern, die eine Kreuzreaktion mit einem breiten Spektrum von gramnegativen Bakterien zeigen, wobei sie als Lipopolysaccharid-Einfangmittel wirken. Insbesondere stellt das Verfahren einen empfindlichen Assay bereit, der maßgeschneidert werden kann, um das Endotoxin von ausgewählten gramnegativen Bakterien nachzuweisen.

Liste der Abkürzungen

Haemophilus influenzae Typ b Hib
Lipooligosaccharid LOS
Polymyxin B PMB
Immunolimulus IML
chromogener Limulus-Amöbozyt-Assay CLAL
Limulus-Amöbozyt-Lysat LAL
Lipopolysaccharid LPS
monoclonale Antikörper MAbs
Festphasen-Enzymimmunoassay ELISA
äußere Membranvesikel OMV
Natriumdodecylsulfat SDS
Polyacrylamidgel-Elektrophorese PAGE
pyrogenfrei pf
Immunglobulin G IgG
phosphatgepufferte Kochsalzlösung PBS
Tween 20 Tw
Rinderserumalbumin BSA
Cerebrospinalflüssigkeit CSF
koloniebildende Einheiten CFU
mit Levinthal-Base angereicherte Hirn-Herz- Infusionsbrühe BHIs

Stand der Technik

Sepsis ist ein potentiell tödlich endender klinischer Zustand, der gegenwärtig an Bedeutung gewinnt, und zwar möglicherweise aufgrund der höheren Lebenserwartung von immunbeeinträchtigten Patienten und der stärkeren Anwendung invasiver Techniken in der Medizin (1, 2). Es wird geschätzt daß das Auftreten dieser Erkrankung in den letzten 20 Jahren um das 10-fache zugenommen hat und daß die Anzahl der Fälle allein in den Vereinigten Staaten jährlich 100 000 bis 300 000 beträgt (3). 20 bis 40 % der Patienten mit einer Sepsis aufgrund gramnegativer Bakterien haben einen Schock, und von diesen sterben ungefähr 75 % (1). Bei Kindern ist Haemophilus inffluenzae Typ b (Hib) für etwa 40 % der Fälle eines septischen Schocks verantwortlich (4). Pseudomonas aeruginosa-Bakteriämie bei Patienten mit Neutropenie ist eine besonders virulente Form der Sepsis.
Eine spezielle Labordiagnose von gramnegativer Sepsis wird üblicherweise durch Kultivieren von Blutproben durchgeführt. Diese Verfahren sind jedoch vergleichsweise langsam und erfordern mehrere Stunden bis Tage, um ein bakterielles Wachstum nachzuweisen.
Man nimmt an, daß Endotoxin ein Schlüsselelement bei der Auslösung der Entzündungskaskade aufgrund von Infektionen mit gramnegativen Bakterien ist (5) Daher wird die quantitative Bestimmung dieser Moleküle in Blutproben von septischen Patienten als wichtig angesehen. Ein einfacher und vergleichsweise empfindlicher Weg zum Nachweis von Endotoxin beinhaltet den Limulus-Amöbozyt-Lysat-Assay (LAL-Assay) (6). Bei dem LAL- Assay bestehen jedoch mehrere Probleme, die seine Anwendbarkeit bei der Diagnose einer Sepsis begrenzen. Dieser Assay ist empfindlich für Spurenmengen von LPS-Verunreinigungen in Laborflüssigkeiten und Reagenzien, was dann zu falschen positiven Reaktionen führt. Darüber hinaus weist das Plasma von Patienten mehrere nicht-spezifische Aktivatoren und Inhibitoren der an der LAL-Reaktion beteiligten Enzyme auf. Schließlich beeinträchtigen die Farbe und die Trübung von normalem Plasma die hohe Empfindlichkeit einer kürzlich erfolgten Verfeinerung der LAL-Methode, die als CLAL-Assay bekannt ist. Beim letztgenannten Verfahren wird die Farbe gemessen, die durch Einwirkung von aktivierten Lysatenzymen auf ein synthetisches chromogenes Substrat erzeugt wird. Aufgrund dieser Probleme werden die Empfindlichkeit und die Spezifität der LAL- und CLAL-Assays als suboptimal für eine zuverlässige klinische Diagnose angesehen.
Die Grundstruktur von Lipopolysaccharid (LPS) beinhaltet drei vergleichsweise gut definierte Regionen und ist in allen gramnegativen Bakterien ähnlich. Diese Regionen sind eine O-spezifische Seitenkette, das Kernoligosaccharid und Lipid A. Die O-spezifische Region besteht aus wiederkehrenden Oligosaccharideinheiten mit jeweils 2 bis 6 Sacchariden. Der Kern liegt zwischen den O-spezifischen Seitenketten und Lipid A und ist ein verzweigendes Oligosaccharid mit repräsentativen zuckern, wie Glucose, N-Acetylglucosamin und Galactose. In der Kernregion in der Nähe zu Lipid A werden häufig Heptose und Ketodesoxyoctonat gefunden. Es gibt erhebliche strukturelle Variationen unter den gramnegativen Bakterien in der O-Kettenregion, jedoch nur geringe Variationen in der gesamten Kernregion, deren Struktur hochgradig konserviert in der inneren Kernregion in der Nähe zu Lipid A ist. Der im höchsten Maße konservierte Abschnitt des LPS-Moleküls ist Lipid A, ein phosphoryliertes Glucosamin-Disaccharid, mit dem langkettige Fettsäuren verknüpft sind.
Einige gramnegative Bakterien unter Einschluß von Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, N. gonorrhoeae und Bordetella pertussis synthetisieren einen anderen Typ von LPS-Molekül, der als Lipooligosaccharid (LOS) bezeichnet wird. LOS ist ähnlich zum LPS-Molekül, mit der Ausnahme, daß LOS kein O-Antigen aufweist, sondern aus Lipid A und Kernoligosaccharid besteht. LOS ist, wie LPS, ein Endotoxin.
Die allgemeine Struktur eines typischen Lipopolysaccharids eines gramnegativen Bakteriums, nämlich S. typhimurium, ist in Fig. 1 gezeigt.
Die Erkenntnis, daß die Kernregion von bakteriellen Lipopolysacchariden hochgradig konserviert ist, hat zur Suche nach Antikörpern geführt, die eine Kreuzreaktion mit dem Endotoxin einer gramnegativen Spezies zeigen. Einige monoclonale Antikörper, von denen eine starke Kreuzreaktivität behauptet wurde, sind erhalten worden, von denen z.B. mehrere gegen Lipid A gerichtet sind (7-9). Monoclonale Antikörper, die spezifisch an Escherichia coli-Stämme binden, sind durch Immunisierung von Mäusen mit bakteriellen Mutanten, denen die O-Seitenkette und ein Teil des Kernpolysaccharids fehlt, erhalten worden (10). Mindestens einige der monoclonalen Antikörper, über die berichtet wurde, weisen eine Kreuzreaktivität beim Nachweis von LPS auf, ungeachtet der Tatsache, daß in vielen Fällen die Kreuzreaktivität nicht in überzeugender Weise gezeigt wurde (1). Theoretisch sollten Antikörper gegen den LPS-Kern eines beliebigen oder höchstens einiger weniger gramnegativer Bakterien mit allen gramnegativen Bakterien mit der allgemeinen Kernstruktur von LPS, die in Fig. 1 gezeigt ist, in Wechselwirkung treten.
XMMEN-OE5 bildet einen monoclonalen Antikörper, der an Epitope auf LPS bindet, die mit dem Endotoxin-Kern-Glycolipid von gramnegativen Bakterien assoziiert sind (11). Die beschriebenen Antikörper weisen eine breite Kreuzreaktivität mit gramnegativen Bakterien verschiedener Gattungen auf und neutralisieren in wirksamer Weise Endotoxin. Mögliche Assays unter Verwendung dieser monoclonalen Antikörper sind vorgeschlagen worden, und zwar unter Einschluß der quantitativen Bestimmung von Endotoxin unter Verwendung von Standard-ELISA-Techniken, die dem Fachmann bekannt sind. Den Standardmethoden der Immundiagnose fehlt jedoch die hohe Empfindlichkeit des Limulus-Assay.
Die Fähigkeit des Amöbozyt-Lysats, das beim CLAL-Assay verwendet wird, mit dem Endotoxin gramnegativer Bakterien zu reagieren, ist genutzt worden, um einen Assay zum Nachweis von Lipopolysacchariden zu entwickeln. Endotoxin wird an ein Einfangmittel gebunden, das aus einem Amöbozyt-Lysat hergestellt wird (12). Das gebundene Endotoxin wird dann z.B. durch eine antigene Analyse nachgewiesen. Die Nachweisgrenze für Escherichia coli K235 LPS nach diesem Verfahren betrug 10 ng. Das Verfahren dieses Patents soll selektiv für Endotoxin gramnegativer Bakterien sein, es ist jedoch weitaus weniger empfindlich als der CLAL-Assay, mit dem Picogrammengen nachgewiesen werden können. Die allgemeine Anwendbarkeit des beanspruchten Verfahrens ist daher aufgrund seines Mangels an Empfindlichkeit begrenzt insbesondere bei klinischen Anwendungen, bei denen es wichtig ist, selbst sehr kleine Mengen an LPS oder sehr kleine Zahlen an Bakterien nachzuweisen. Darüber hinaus sind sehr geringe Nachweisgrenzen kritisch bei der Analyse von sterilen Lösungen für die Verwendung in vivo.
Daher besteht ein Bedarf an einem allgemeinen Verfahren zum Nachweis von bakteriellem Endotoxin, das rasch, spezifisch und empfindlich mindestens für Picogrammengen ist. Ein vielseitiger Assay, mit dem im Prinzip mehrere verschiedene gramnegative Pathogene nachgewiesen werden können, wäre besonders geeignet in klinischen Situationen, in denen die Einordnung des Mikroorganismus als gramnegatives Bakterium den speziellen Verlauf der Behandlung bestimmt.
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein empfindliches und selektives Verfahren zum Nachweis von bakteriellen Endotoxinen. Das Verfahren kombiniert die Verwendung von monoclonalen oder polyclonalen Antikörpern als Einfangmitteln und die bekannte Empfindlichkeit des chromogenen Limulus-Amöbozyt-Lysat-Nachweissystems.
Allgemein umfaßt der erfindungsgemäße Nachweis von bakteriellem Endotoxin die Stufen des Kontaktierens einer Probe, die im Verdacht steht, ein bakterielles Endotoxin zu enthalten, mit mindestens einem Antikörper, der zur Bindung eines derartigen bakteriellen Endotoxins imstande ist, wobei die Probe mit dem Antikörper unter Bedingungen in Kontakt gebracht wird, die hinsichtlich der Bindung des Antikörpers an das Endotoxin, das in der Probe vorhanden sein kann, wirksam sind. Anschließend wird das Antikörper-gebundene Endotoxin gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen, und das Endotoxin wird anschließend durch die Anwendung eines Amöbozyt-Lysats nachgewiesen.
Gemäß einer spezielleren Ausführungsform wird das Verfahren durch Anheften von Antikörpern der gewünschten Spezifität an eine feste Oberfläche, Inkubieren der Oberfläche mit einer Probe, die im Verdacht steht, Endotoxin zu enthalten, Waschen des matrixgebundenen Endotoxins, Zugabe von Limulus-Amöbozyt-Lysat zum gebundenen Endotoxin und Inkubieren und schließlich Zugabe eines Substrats des Lysats zur Bildung eines Produkts, das nachgewiesen werden kann, durchgeführt. Gemäß bevorzugter Ausführungsformen kann die Menge an Endotoxin gemessen werden, da die Menge an Produkt im allgemeinen proportional zur Menge an gebundenem Endotoxin ist.
Das Anheften von Antikörpern an eine feste Oberfläche wird allgemein für die Immobilisierung genutzt und oftmals durch einfaches Beschichten einer harten Oberfläche mit den Antikörpern erzielt. Die Antikörper können an eine beliebige feste Oberfläche angeheftet werden, an der sie haften. Gemaß üblicher Praxis werden die Antikörper an die Kunststoffoberfläche der Vertiefungen von Mikrotiterplatten adsorbiert, die Adsorption kann jedoch an eine beliebige geeignete Oberfläche erfolgen. Es ist wichtig, nicht beschichtete Stellen zu blockieren, um eine unspezifische Bindung von störenden Substanzen aus der Probe zu verhindern. Dies erfolgt normalerweise mit Proteinen, z.B. Albumin, es können jedoch auch andere Oberflächenblockierungsmittel, die den Assay nicht stören, verwendet werden.
Überschüssige Blockierungsmittel werden von der Oberfläche nach Reaktion mit nicht-spezifischen Bindungsstellen weggewaschen. Bei der Waschlösung handelt es sich üblicherweise um pyrogenfreie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (pf-PBS) mit einem Gehalt an Tween 20. Es ist wahrscheinlich, daß das Vorhandensein von Detergens die Wirksamkeit des Waschens erhöht. Es ist darauf hinzuweisen, daß bei Verwendung von Amöbozyt-Lysat als Einfangmittel das Waschen der Oberflache mit oberflächenaktiven Stoffen, wie Polyoxyethylensorbitanmonolaurat oder Desoxycholat, zu hohen Werten an unspezifischer Bindung an das immobilisierte Lysat führte (12); dieses System unterscheidet sich jedoch vom System der vorliegenden Erfindung, da das immobilisierte Lysat zum Einfangen und nicht zum Nachweis verwendet wird. Es ist möglich, daß Detergentien die Antikörpereinfangbindung beeinflussen, im Hinblick auf die hohe Empfindlichkeit ist es jedoch unwahrscheinlich, daß schädliche Wirkungen auftreten.
Die Erfinder haben festgestellt, daß die Beschaffenheit des Antikörpers (z.B. der Grad der Kreuzreaktivität, die Bindungsaffinität und dergl.) die Breite oder Enge des Nachweises spezifischer Endotoxine bestimmen. Es können zwar beliebige kreuzreaktive Antikörper als Einfangmittel für bakterielles Endotoxin verwendet werden, es ist jedoch bevorzugt, eine begrenzte Anzahl an monoclonalen Antikörpern zu verwenden, die gegen die hochgradig konservierte Region des Endotoxinkernglycolipids beim Nachweis von Lipopolysaccharid (LPS) und Lipooligosaccharid (LOS), die in einem weiten Bereich von gramnegativen Bakterien gefunden werden, gerichtet sind. Dies umfaßt intakte Bakterien sowie Vesikel oder Bläschen, die auf Bakterien verbreitet oder exponiert sind und an die die Einfangantikörper binden können. Beispiele für Endotoxin aus Bakterien, das nachgewiesen werden kann, umfassen, ohne Beschränkung hierauf, Escherichia, Bordetella, Branhamella, Salmonella, Haemophilus, Klebsiella, Proteus, Enterobacter, Pseudomonas, Pasteurella, Acinetobacter, Chlamydia und Neisseria und allgemein beliebige Bakterien, deren LPS zur Bindung an die ausgewählten Antikörper imstande ist. Ein bevorzugter Antikörper ist gegen das O-Antigen von Salmonella typhi gerichtet.
Der Fachmann erkennt, daß der Zweck der Antikörper darin besteht, als Einfangmittel zu wirken, indem selektiv Endotoxin, eine toxische Komponente der Membran gramnegativer Bakterien, gebunden wird. Es gibt daher mehrere Möglichkeiten der Wahl der Antikörper. Zum Beispiel kann eine Oberfläche mit Antikörpern beschichtet werden, die spezifisch gegen das Kernoligosaccharid distal zu Lipid A in beliebigen Spezies von gramnegativen Bakterien gerichtet sind. Die Spezifität beim Einfangen ist dann gegen ein Bakterium oder eine begrenzte Gruppe von Bakterien, abhängig von der Kreuzreaktivität, gerichtet. Andererseits ist zu erwarten, daß Antikörper, die gegen Epitope benachbart zu Lipid A oder gegen Lipid A selbst gerichtet sind, eine breite Kreuzreaktivität gegenüber praktisch allen Klassen gramnegativer Bakterien zeigen.
Die Auswahl der monoclonalen Antikörper, die als Einfangmittel verwendet werden sollen, ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung, der ihre Vielseitigkeit zeigt. Um z.B. einen Bereich bakterieller Endotoxine aus mehreren Spezies nachzuweisen, kann man Antikörper gegen Lipid A oder die Lipid A/KDO-Region von LPS wählen, da diese Kernregion hochgradig konserviert unter gramnegativen Bakterien ist. Einige Versuche mögen erforderlich sein, um eine optimale Gruppe von MAb zu erhalten, es gibt jedoch mehrere Druckschriften mit ausführlichen Verfahren für die Herstellung von Antikörpern mit guter Kreuzreaktivität (7, 13, 14, 16). Mindestens zwei Clone, von denen festgestellt wurde, daß sie monoclonale Antikörper stabil absondern, sind als Hybridome XMMEN-OE5 und XMMEN-LY1 verfügbar und bei der American Type Culture Collection unter den Hinterlegungsnummern HB9081 und HB9082 hinterlegt (11). Die von diesen Zellinien hergestellten monoclonalen Antikörper zeigen eine breite Kreuzreaktivität gegen gramnegative Bakterien und können als Einfangmittel zum Nachweis von bakteriellem Endotoxin verwendet werden.
Antikörper können auch durch experimentelle Techniken entwickelt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Insbesondere können geeignete Antikörper von Hybridomen ausgewählt werden, die durch Immunisierung und Hybridomfusion erhalten wurden, und zwar unter Beteiligung mehrerer Spezies von rauhen Mutanten von gramnegativen Bakterien. Rauhe Mutanten können aus Wildtypkolonien auf der Basis ihres Erscheinungsbildes ausgewählt werden, das im Gegensatz zum glatten Erscheinungsbild der Wildtypkolonien steht. Das rauhe Erscheinungsbild ist das Ergebnis der Deletion des O-Antigens. Als Ergebnis der Deletion werden Anteile des Kerns stärker exponiert, was die breitere Selektion von Antikörpern, die gegen Epitope in den exponierten Regionen gerichtet sind, ermöglicht. Die am stärksten bevorzugten monoclonalen Antikörper sind spezifisch für Lipid A oder vielleicht alternativ für ein kleineres Fragment von Lipid A.
Um den Nachweis eines breiten Bereiches von bakteriellem Endotoxin sicherzustellen, wird eine Gruppe von 3 bis 4 monoclonalen Antikörpern ausgewählt, und zwar vorzugsweise von Antikörpern, die gegen die Heptose/KDO-Regionen des Kerns gerichtet sind. Diese Region ist benachbart zu Lipid A und umfaßt mehrere ungewöhnliche 2-Ketozucker, insbesondere 3- Desoxy-D-manno-octulosonsäure (KDO). Ausgewählte Antikörper umfassen MAbs 4-7B5 (7), 8A1 (9), 7G (16), A6 (H4C5) (15), 8-2C1 (7) oder HA-1A (21) Der breit kreuzreaktive monoclonale Antikörper, der von der Hybridomzellinie XMMEN-OES (ATCC-Hinterlegungsnummer HB9081) gebildet wird, kann ebenfalls als Einfangmittel dienen, und zwar entweder in Kombination mit weiteren Antikörpern, oder, abhängig vom Grad der erforderlichen Kreuzreaktivität, selbst (11).
Die Probe, in der bakterielles LOS oder LPS nachgewiesen werden soll, ist üblicherweise eine Körperflüssigkeit, wie Plasma, Serum, Cerebrospinalflüssigkeit, Urin, Speichel, Urethralabsonderungen, Sputum oder dergl., wobei es sich jeweils um Flüssigkeiten handelt, die entweder normalerweise steril sind oder nicht den fraglichen Organismus enthalten. Das Verfahren ist jedoch von allgemeiner Anwendbarkeit und kann herangezogen werden, um eine Endotoxinverunreinigung in sterilen Zubereitungen nachzuweisen, und in Flüssigkeiten, die klinisch oder pharmazeutisch verwendet werden sollen, oder die in Nahrungsmittelprodukten verwendet werden sollen.
Proben, die auf Endotoxin untersucht werden sollen, müssen möglicherweise verdünnt werden, und zwar üblicherweise mit pyrogenfreiem Verdünnungsmittel, vorzugsweise phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Die Verdünnung hängt von der Art der Probe und der Menge an vorhandenem Endotoxin ab. Auf jeden Fall wird die Probe vor der Inkubation mit dem immobilisierten Einfangantikörper einer Wärmebehandlung, vorzugsweise bei 75ºC für etwa 12 Minuten, unterworfen, um Materialien zu inaktivieren, die später den chromogenen Limulus-Assay beeinträchtigen würden. Ein Erwärmen kann auch das Exponieren der Bindungsstellen gegenüber dem Einfangmittel erleichtern.
Sobald die Probe für die Analyse vorbereitet ist, wird sie mit dem Einfangantikörper oder den Einfangantikörpern inkubiert. Wenn Vertiefungen von Mikrotiterplatten verwendet werden, dann besteht dies einfach in der Zugabe einer abgemessenen Menge der Probe zu den Vertiefungen und dem Inkubieren für eine ausreichende Zeit, damit eine Bindung auftritt, und zwar üblicherweise etwa 1 Stunde Inkubation bei 37ºC. Es können andere Inkubationszeiten gewählt werden, wenn dies abhängig von der Spezies des nachzuweisenden Endotoxins erforderlich ist. Die Inkubation kann auch bei Raumtemperatur erfolgen, wobei jedoch längere Zeiten erforderlich sein können, damit eine Bindung eintritt.
Gegebenenfalls erfolgt die Messung von Endotoxin durch Zugabe eines Mittels, das zum Nachweis der Protease imstande ist, deren Freisetzung durch das Vorhandensein von Endotoxin stimuliert wird. Amöbozyt-Lysat enthält Faktoren, die in Gegenwart von Endotoxin eine Kaskade initiieren, die unter anderem Serinproteasen freisetzt. Die am stärksten bevorzugte Quelle des Lysats ist das Blut von Limulus polyphemus, es können jedoch auch weitere Organismen, z.B. Tachypleus tridentatus, Tachypleus gigas oder Carcinoscorpius rotundicauda, verwendet werden. Die Zugabe eines Proteasesubstrats, üblicherweise einer chromogenen Verbindung, zu der Lysatprobe, die Endotoxin erhält, erlaubt die Spaltung des Substrats und die Freisetzung eines Chromophors, das spektrophotometrisch nachgewiesen werden kann. Die Menge an aktivierter Protease ist proportional zur Menge an Endotoxin, das an den monoclonalen Einfangantikörper gebunden ist, und daher ist die Rate der Farbbildung proportional zur Menge an Endotoxin, die in der Probe vorhanden ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem chromogenen Substrat um N-Benzoyl-Val-Arg-p-nitroanilid, wobei die Freisetzung der C-terminalen chromogenen Gruppe bei 410 nm gemessen wird. Andere Chromogene, z.B. Tetramethylbenzidin, oder verschiedene p-Nitroanilidsubstrate, können verwendet werden. Eine quantitative Bestimmung kann auch unter Verwendung von Markierungen und anderen Nachweismitteln unter Einschluß fluoreszierender oder isotoper Markierungen oder der Initiation von Sekundärreaktionen erzielt werden, solange die Umsetzung proportional zur Protease, die durch das Endotoxin aktiviert wurde, ist. Eine Eichkurve kann unter Verwendung eines gereinigten Endotoxins oder vorzugsweise des US-Standard-Endotoxins als Standard aufgestellt werden.
In einem speziellen Beispiel für die Erfindung wird der spezifische Nachweis von Haemophilus influenzae Typ b-Endotoxin in biologischen Flüssigkeiten gezeigt. Der monoclonale Eingangantikörper ist an eine feste Oberfläche, typischerweise an Vertiefungen von Kunststoffmikrotiterplatten, gebunden, die dann vorzugsweise mit einem Protein, üblicherweise Rinderserumalbumin, fötalem Kälberserum oder dergl., blockiert wird. In der Probe vorhandenes Hib-LOS-Endotoxin wird an den Einfangantikörper gebunden und nicht an die nicht-exponierte Oberfläche. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Einfangmittel zwei monoclonale Antikörper, wobei einer gegen ein Epitop in der Oligosaccharidregion eines ersten Endotoxins gerichtet ist und der andere gegen ein Epitop in der Oligosaccharidregion eines zweiten Endotoxins gerichtet ist. Beim Nachweis von Hib-Endotoxin wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ein erster Antikörper eingesetzt, der Endotoxin von einem ersten Stamm, wie Hib LOS DL26, erkennt, und ein zweiter Antikörper, der Endotoxin von einem zweiten Stamm, wie Hib LOS DL42, erkennt. Bevorzugte Beispiele umfassen die monoclonalen Antikörper 12D9 bzw. 4C4 (ATCC-Hinterlegungsnummer HB10462 bzw. HB10461). Beide sind Immunglobuline vom Typ IgG3. Es kann auch ein einzelnes Einfangmittel verwendet werden, dann werden jedoch nicht alle Stämme von Haemophilus influenza Typ b nachgewiesen.
Nach Kontaktieren der Probe mit dem an die feste Oberfläche gebundenen monoclonalen Antikörper wird gebundenes LOS gewaschen, um vorhandene nicht-bindende Substanzen zu entfernen, und zwar vorzugsweise mit pf-PBS mit einem Gehalt an einem Detergens wie Tween 20. In einer nachfolgenden Stufe wird das oberflächengebundene LOS mit einem Amöbozyt-Lysat, vorzugsweise Limulus-Amöbozyt-Lysat, inkubiert. Die Inkubation wird üblicherweise bei 37ºC durchgeführt, wobei die Aktivierung eines Proteasesystems aus dem Lysat durch gebundenes Endotoxin ermöglicht wird. In einer abschließenden Stufe wird ein chromogenes Substrat zugegeben, und die optische Dichte der Probe wird nach Stehen bei Raumtemperatur, vorzugsweise für 30 Minuten, abgelesen. Die optische Dichte kann mit einem Spektrophotometer, wie einem ELISA-Lesegerät, abgelesen werden. Standards können zusammen mit der Probe untersucht werden, und daraus kann die Konzentration an Endotoxin in der Probe bestimmt werden.
Es ist ferner gezeigt worden, daß die vorliegende Erfindung angewandt werden kann, um eine rasche und endgültige Diagnose von Ulcus molle, dessen verursachendes Agens Haemophilus ducreyi ist, bereitzustellen. Durch die Verwendung eines monoclonalen Antikörpers, der spezifisch für LOS von H. ducreyi ist, in dem speziellen erfindungsgemäßen Liinulus-Amöbozyt-Lysat-Assay konnte eine geringe Zahl von 50 cfu an H. ducreyi, die in vitro gezüchtet und in Kochsalzlösung resuspendiert wurden, nachgewiesen werden. Außerdem konnte die geringe Zahl von 500 cfu in abgesaugtem Material aus einem Kaninchenmodell von Ulcus molle nachgewiesen werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist einfach und rasch. Tests können im allgemeinen innerhalb von 3 Stunden nach der Probenvorbereitung abgeschlossen werden. Typischerweise wird die Probe mit einem Einfangantikörper für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert, gewaschen, etwa 20 Minuten bei Raumtemperatur mit Amöbozyt-Lysat inkubiert und ferner bei Raumtemperatur nach Zugabe von chromogenem Substrat inkubiert. Die Messungen können also innerhalb von 3 Stunden Inkubieren der Probe in Vertiefungen von Mikrotiterplatten, die mit Einfangantikörper beschichtet sind, durchgeführt werden.
Die Erfinder haben die Spezifität der Erfindung durch Hib-LOS- Nachweis gezeigt es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß weitere Pathogene von klinischer Bedeutung ohne weiteres unter Verwendung geeigneter Antikörper nachgewiesen werden können. Zum Beispiel kann das Verfahren ohne weiteres auf den spezifischen Nachweis von Pseudomonas aeruginosa und Pseudomonas maltophilia durch Einsatz des monoclonalen Antikörpers XMMPS-605, der von der Hybridomzellinie mit der ATCC-Hinterlegungsnummer H88909 gebildet wird, angepaßt werden (11). Die Entwicklung weiterer spezifischer Diagnoseverfahren ist nur durch die Verfügbarkeit des Einfangantikörpers oder der Einfangantikörper, die erforderlich sind, beschränkt und nicht durch die allgemeine Anwendbarkeit des Verfahrens.
Es wird in Betracht gezogen, daß ein oder mehrere Reagenssätze für die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens nützlich sind. Derartige Reagenssätze enthalten getrennte Behälter, die monoclonale Antikörper umfassen, die für den Nachweis aller oder einer begrenzten Auswahl von bakteriellen Endotoxinen geeignet sind. Außerdem werden Behälter, die ein Amöbozyt-Lysat und ein chromogenes Substrat umfassen, bereitgestellt, um die Freisetzung von Lysat-Protease nachzuweisen, wobei alle Materialien vorzugsweise in lyophilisierter Form bereitgestellt werden. In einem speziellen Reagenssatz zum Nachweis von bakteriellem Endotoxin wird der monoclonale Antikörper der Hybridomzellinie XMMEN-OE5 allein oder in Kombination mit einem oder mehreren der monoclonalen Antikörper 4-7B5, 8A1, A6 und 8-2Cl bereitgestellt. Für den Nachweis von Haemophilus influenzae Typ b werden MAb 404 und MAb 12D9 bereitgestellt.
Fig. 1 zeigt die Struktur von S. typhimurium-Lipopolysaccharid, das ähnlich zu Lipopolysacchariden anderer gramnegativer Bakterien ist. Ra, Rb, Rc, Rd1 und Re bezeichnen die Strukturen von LPS-Molekülen, die von verschiedenen Mutanten von Salmonella synthetisiert werden.
Fig. 2 zeigt den Nachweis von Hib DL42 LOS in PBS ( ) und in Plasma-PBS (1:3 verdünnt) ( ) sowie von Hib DL42-Bakterien in Plasma-PBS (1:3 verdünnt) ( ) durch den Immunolimulus-Assay. Offene Symbole bezeichnen den nicht-spezifischen Hintergrund. Die Ergebnisse sind Mittelwerte von zwei Vertiefungen.
Fig. 3 zeigt das Ausmaß von Hib DL42- ( ) und DL301-Bakteriämien ( ) und Konzentrationen von Hib LOS in Plasmaproben von Rattenbabies, wobei der Nachweis durch den Immunolimulus-Assay verfolgte (r = 0,845, p < 0,001). Offene Symbole stellen nicht-infizierte Tiere dar und sind nur auf der linken Seite der x-Achse vorhanden.
Fig. 4 zeigt das Ausmaß von Hib DL42- ( ) und DL301-Bakteriämien ( ) und Konzentrationen von Hib LOS in Plasmaproben, wobei der Nachweis durch den CLAL-Assay erfolgte (r = 0,787, p < 0,001). Offene Symbole stellen nicht infizierte Rattenbabies dar und sind nur auf der linken Seite der x-Achse vorhanden.
Wie vorstehend erörtert wurde, ist die Erfindung ein empfindlicher und rascher Assay, der so ausgelegt werden kann, daß Endotoxin gramnegativer Bakterien nachgewiesen wird, oder der modifiziert werden kann, so daß spezifische Spezies von bakteriellem Endotoxin nachgewiesen werden können. Insbesondere eignet sich das Verfahren zum Nachweis von sehr geringen Konzentrationen an Endotoxin.
Die Erfinder haben Antikörper als Basis der Selektivität ihres Verfahrens verwendet und mit der bereits bekannten Reaktion mit Amöbozyt- Lysat kombiniert, um einen Assay bereitzustellen, der hochgradig empfindlich ist. Die Antikörper sind vorzugsweise monoclonale Antikörper, die gegen bestimmte Regionen des Endotoxinkerns von LPS/LOS gerichtet sind. Als ein Beispiel für die Ausführung des Verfahrens betreffen die folgenden Einzelheiten speziell den Nachweis von Haemophilus influenzae Typ b-Endotoxin (Hib LOS); analoge Betrachtungen gelten jedoch auch für den Nachweis anderer Spezies, wobei einer oder mehrere verschiedene Antikörper verwendet werden. Ein umfassendes Verfahren zum Nachweis von Endotoxinen gramnegativer Bakterien erfordert z.B. bis zu mehreren monoclonalen Antikörpern, die gegen Regionen an oder nahe dem Endotoxin- Lipid A-Kern gerichtet sind. Bei einem Verfahren zum Nachweis von Pseudoinonas aeruginosa kann der monoclonale Antikörper XMMPS-605 (ATCC- Hinterlegungsnummer HB8909 (11)) verwendet werden.

Materialien und Methoden

Bakterienstämme und Züchtungsbedingungen.

Der Hib-Stamm DL42 ist ausführlich charakterisiert worden (17). Bei dem weiteren Hib-Stamm DL301, der in dieser Untersuchung verwendet wurde, handelt es sich um eine kürzlich erfolgte Isolierung von einem Kind mit Hib-Meningitis in Dallas. Diese beiden Stämme gehören zur antigenen Hib LOS-Gruppe 2, was durch ihre Reaktivität mit MAB 404 im Kolonieblot-Radioimmunoassay bestimmt wurde (17). Eingekapselte Escherichia coli K1 (77-436) und der Hib-Stamm DL26 der antigenen Hib LOS-Gruppe 1 (17) wurden für Kontrollversuche verwendet. Diese Stämme reagieren nicht mit MAB 404.
Hib-Stämme wurden in Hirn-Herz-Infusionsmedium (Difco Laboratories, Detroit, MI), angereichert mit Levinthal-Base (BHIs), gezüchtet, wie es zuvor beschrieben wurde (18). Escherichia coli K1 wurde in Hirn-Herz- Infusionsmedium ohne die Zugabe gezüchtet.

Endotoxine.

LOS vom Hib-Stamm DL42 wurde mittels der modifizierten Heißphenol-Wasser-Methode gereinigt (19). Gereinigtes LOS wurde in pyrogenfreier Kochsalzlösung (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) verdünnt und in einer Konzentration von 1 ug/ml bei -70ºC bis zur Verwendung als Standard in den Assays gelagert. Aus Escherichia coli 0111:B4 durch Reinigung erhaltenes LPS (Sigma Nr. L-33012) wurde von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, bezogen, und dies gilt auch für LPS aus Escherichia coli 0127:B8 (Sigma Nr. L-3137), Klebsiella pneumoniae (Sigma Nr. L-1770) und Pseudomonas aeruginosa (Sigma Nr. L-8643).

Monoclonale Antikörper (MAbs).

MAb 4C4 (ATCC-Hinterlegungsnummer HB10461), der gegen ein Epitop im Oligosaccharidabschnitt des LOS-Moleküls von Hib-Stämmen, die zur antigenen Hib LOS-Gruppe 2 gehören, gerichtet ist, ist bereits beschrieben worden. Dieser MAb reagiert mit LOS der Hib Stamme DL42 und DL301, und außerdem war er im Stande, 86 % der kürzlich untersuchten klinischen Hib-Isolierungen zu erkennen (17).

Weitere Materialien.

Sterile Polystyrol-ELISA-Platten wurden von Corning Laboratory Sciences, Houston, TX, bezogen. Alle Platten wurden vor der Verwendung als pyrogenfrei bestimmt. Jedes Fläschchen mit LAL (Pyrotell, Associates of Cape Code, Woods Hole, MA, als geeignet für die Verwendung beim CLAL-Assay bezeichnet) wurde mit 10 ml pf-Wasser rekonstituiert und in mehreren Portionen für weniger als 3 Monate bei -20ºC gelagert. Für den IML-Assay wurde das LAL mit 20 ml pf-Wasser verdünnt. N-Benzoyl-Val-Gly-Arg-p-nitroanilid-hydrochlorid (Sigma Nr. B-4758) wurde auf eine Konzentration von 0,7 mg/ml in pf-Wasser verdünnt und bei 4ºC bis zur Verwendung bei den Assays gelagert.

Statistische Analyse.

Der Pearson-Korrelationskoeffizient wurde herangezogen, um die Stärke der Beziehung zwischen den Ergebnissen der CLAL- und IML-Assays und dem Ausmaß der Bakteriämie bei den Tieren zu bewerten.
Die nachstehenden Beispiele sollen der Erläuterung spezieller Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dienen, und sie sollen nicht beschränkend im Sinne der Beschreibung aller möglichen Ausführungsformen sein. Der Fachmann auf diesem Gebiet erkennt, daß Modifizierungen, die zum Umfang der vorliegenden Erfindung gehören, im Hinblick auf die offenbarten Verfahren Anwendungen möglich sind.

Beispiel 1

Immunolimulus-Assay für Hib LOS unter Verwendung von gereinigten Hib LOS und Bakterien

Mikrotiterplatten wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit gereinigtem MAB 4C4, 1:500 verdünnt in 0,1 m Natriumcarbonatpuffer, pH-Wert: 0,6, beschichtet (20). Die Endmenge an Antikörper, die in der Vertiefung inkubiert wurde, betrug 800 ng. Die Vertiefungen der Mikrotiterplatte wurden dreimal mit pf-PBS mit einem Gehalt an 0,05 % (Vol./Vol.) Tween 20 (pF PBS-Tw) gewaschen und anschließend mit 1 % (Vol./Vol.) fötalem Kälberserum (20) in Carbonatpuffer für 1 Stunde bei 37ºC blockiert. Die Platten wurden dann erneut dreimal mit pf-PBS-Tw gewaschen. Plasma für die Verdünnung von gereinigten LOS-Proben wurde durch Blutentnahme durch Herzpunktion von 50 normalen Rattenbabies, Zentrifugieren und Vereinigen des Plasma, das nach der Natriumcitratmethode erhalten wurde, erhalten. Anteile des Plasmas wurden bei -70ºC gelagert und vor der Verwendung als Verdünnungsmittel 1:3 in pyrogenfreier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pf-PBS, pH-Wert: 7,4) verdünn.
Gereinigtes Hib DL42 LOS wurde in pf-PBS und in Plasma:PBS (1:3 verdünnt) verdünnt, und Hib-Bakterien wurden in Plasma:PBS (1:3 verdünnt) verdünnt. Gereinigte Eib LOS-Standards wurden in Konzentrationen von 0 bis 1000 pg/ml in der geeigneten Verdünnungsflüssigkeit hergestellt. Nach Wärmeinaktivierung bei 75ºC für 12 Minuten wurden 50 ul der Proben und der Standards in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Vertiefungen wurden 6 mal mit pf-PBS-Tw gewaschen und anschließend mit 50 ul LAL-Extrakt in pf-Wasser gefüllt. Nach 20- minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden 50 ul des chromogenen Substrats zugegeben, und die Platten wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die optische Dichte wurde dann unter Verwendung des ELISA- Lesegeräts gemessen, und die Konzentrationen an LOS in den Proben wurden aus den in jede Platte eingeschlossenen Standards erhalten.
Die Empfindlichkeitsgrenze (die Konzentration an LOS, die eine optische Dichte ergab, die den Mittelwert + 2 Standardabweichungen des Hintergrundes überstieg) betrug 2 pg/ml in pf-PBS und 10 pg/ml in verdünntem Plasma (Fig. 2). Die Empfindlichkeit für die IML-Methode beim Nachweis von LOS in verdünntem Plasma mit einem Gehalt an verschiedenen Zahlen von Hib-Organismen entsprach einer Konzentration von 300 CFU/ml.
Die Spezifität des IML-Assays basiert auf seiner Fähigkeit, nur diejenigen LOS-Moleküle nachzuweisen, die an die feste Phase durch die Mabs gebunden sind. Wie in Fig. 2 gezeigt ist, blieb der unspezifische Hintergrund (erhalten für Vertiefungen ohne MAB) während der Untersuchung von Plasmaproben durchwegs niedrig, wenn die Konzentration an LOS weniger als 1000 pg/ml betrug oder wenn die Konzentration an Bakterien weniger als 10&sup5; CFU/ml betrug. Bei höheren Konzentrationen an LOS oder Hib nahm der Hintergrund zu, und der IML-Assay verlor seine Antikörper-abhängige Spezifität, wobei er jedoch das Vorhandensein von Endotoxin nach einer Reaktion vom CLAL-Typ zeigte. Die spezifische Antikörperbindung konnte in diesen Fällen durch weitere Verdünnung der Proben gezeigt werden.

Beispiel 2

Immunolimulus-Assay für gereinigtes Hib LOS in Plasma

Gereinigtes Hib DL42 LOS und gereinigte LPS-Proben von vier verschiedenen gramnegativen Enterobakterien wurden in verschiedenen Konzentrationen zu Plasma von normalen Rattenbabies gegeben, und zwar 1:3 verdünnt in PBS, und anschließend 12 Minuten auf 75ºC erwärmt. Die Proben wurden mit dem Immunolimulus-Assay untersucht, wie es in Beispiel 1 ausführlich beschrieben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt und weisen auf einen hohen Grad an Spezifität für das IML-Assaysystem hin. Bei LPS-Konzentrationen von weniger oder gleich 10 ng/ml waren die Ergebnisse für die optische Dichte auf dem Niveau des Hintergrundes; bei höheren Konzentrationen zeigten die Ergebnisse nur unspezifische Reaktionen. Tabelle 1 Nachweis von Hib LOS durch den Immunolimulus-Assay in Plasmaproben von normalen Rattenbabies, die verschiedene Konzentrationen an LOS/LPS enthalten Konzentration an LOS/LPS im Plasma Stamm E. coli K. pneumoniae P. aeruginosa a Optische Dichte, die für mit MAb 4C4 beschichtete Vertiefungen erhalten wurde b Optische Dichte, die für Vertiefungen erhalten wurde, denen MAb 4C4 fehlte (Kontrolle für unspezifische Bindung) c Differenz zwischen den Vertiefungen A und B d Die Ergebnisse sind Mittelwerte für zwei Vertiefungen.

Beispiel 3

Immunolimulus-Assay für Hib LOS im Plasma von Ratten, die mit Hib infiziert sind

Funf Tage alte Rattenbabies wurden intranasal mit 1-3 x 10&sup8; koloniebildenden Einheiten (CFU) an Hib infiziert, wie es in (19) beschrieben ist. Für Kontrollversuche mit Escherichia coli K1 wurden Ratten durch intraperitoneale Überimpfung mit 100 oder 1000 CFU in 0,1 ml PBS infiziert. Blutkulturen wurden erhalten, indem 10 ul Blut aus der Schwanzvene zu verschiedenen Zeitpunkten (15 bis 48 Stunden) nach der bakteriellen Belastung entnommen wurden. Das Ausmaß der Bakteriämie wurde durch Ausstreichen der Blutproben auf BHIs-Agarplatten bestimmt. Unmittelbar nach der Blutentnahme aus der Schwanzvene wurde eine Herzpunktion bei denselben Tieren durchgeführt, die mit Ether betäubt wurden, und Blut wurde in Spritzen mit einem Gehalt an 3,8 % (Gew./Vol.) Natriumcitrat (0,05 ml Natriumcitrat/0,5 ml Blut) gesammelt. Das Blut wurde bei 5000 U/min in einer Eppendorf-Zentrifuge für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, und Plasma wurde in Polypropylenröhrchen mit Schraubverschluß überführt und bei -70ºC gelagert.
42 von 43 Ratten (98 %) mit einer Hib DL42- oder DL301-Bakteriämie, die durch Kultur nachgewiesen wurden, wiesen nachweisbare Konzentrationen an LOS in ihrem Plasma gemäß dem IML-Assay auf. Ferner bestand eine signifikante Korrelation (r = 0,845, p < 0,001) zwischen den gemessenen LOS-Konzentrationen und dem Ausmaß der Bakteriämie bei den Tieren. Keine der nicht-infizierten Ratten wies nachweisbares LOS in den Plasmaproben auf, während eine Blutprobe, die in der Kultur negativ war, von einer Ratte, die mit Hib DL42 belastet worden war, beim IML-Assay positiv war. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den IML-Ergebnissen, die für die beiden verschiedenen Hib-Stämme DL42 und DL301 erhalten wurden, wobei beide Stämme mit MAb 4C4 reagieren (Fig. 3).
Der CLAL-Assay war positiv bei 27 (63 %) der Hib-infizierten Ratten, und er war negativ bei all denjenigen, die keine nachweisbare Bakteriämie aufwiesen (Fig. 4). Es gab eine signifikante Korrelation zwischen den Endotoxin-Konzentrationen, die mit dem CLAL-Assay gemessen wurden, und dem Ausmaß der Bakteriämie (r = 0,787; p < 0,001); die Korrelation zwischen den IML- und CLAL-Ergebnissen war ebenfalls signifikant (r = 0,933, p < 0,001).

Beispiel 4

Immunolimulus-Assay für Hib LOS DL26 oder Escherichia coli im Plasma von Ratten, die mit diesen Bakterien infiziert wurden

Alle Ratten, die mit Hib DL26 (12 Tiere) oder mit Escherichia coli K1 (12 Tiere) infiziert worden waren, wiesen eine nachweisbare Bakteriämie auf, und 19 (91 %) von ihnen wiesen nachweisbare Konzentrationen an Endotoxin auf, wenn die Untersuchung gemäß CLAL erfolgte (Tabelle 2). Es waren jedoch alle negativ beim IML-Assay unter Verwendung von MAb 4C4; dieser spezielle MAb ist mit keinem dieser Stämme reaktiv (Tabelle 2). Sechs von neun mit Escnerichia coli KI-infizierten Ratten, die die höchsten Konzentrationen an Bakterien im Blut aufwiesen, zeigten nichtspezifische positive Ergebnisse im IML-Assay, die an die Befunde erinnern, die die Wirkungen von sehr hohen Konzentrationen an LPS auf den IML-Assay bei früheren in vitro-Versuchen betrafen (Tabelle 1). Wenn diese Plasmaproben erneut mit dem IML-Assay bei Verdünnungen von 1:10 und 1:100 untersucht wurden, dann ergaben alle diese Proben negative Ergebnisse im IML-Assay, was die spezifische Beschaffenheit des Assays bestätigt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 vorgelegt. Tabelle 2 Bakteriämie, die durch Blutkultur nachgewiesen wurde, und Indotoxämie, die durch chromogenen Limulus-Assay (CLAL-Assay) und durch Immunolimulus- Assay (INL-Assay) bei Rattenbabies, die mit Hib DL26 oder Escherichia coli K1 infiziert wurden, nachgewiesen wurde Escherichia coli K1 Ratte Nr. Bakteriämie (cfu/ml) a Drei Ratten starben vor der Blutentnahme

Beispiel 5

Immunolimulus-Assay für den Nachweis von Haemophilus ducreyi

Der Immunolimulus-Assay wurde für den Nachweis von H. ducreyi, das hervorrufende Agens von Ulcus molle, angewandt. Um die Anwendbarkeit des Immunolimulus-Assay auf den Nachweis von H. ducreyi beispielhaft zu zeigen, wurde eine Untersuchung durchgeführt, bei der ein für H. ducreyi-LOS spezifischer monoclonaler Antikörper bei einem Assay im wesentlichen in der in Beispiel I dargelegten Weise eingesetzt wurde. Der in diesen Untersuchungen eingesetzte Antikörper gegen H. ducreyi-LOS wurde wie folgt hergestellt:
Zellhüllen des H. ducreyi-Stamms 35 000 wurden verwendet, um weibliche Balb/c-Mäuse zu immunisieren. Eine Menge von 50 bis 100 ug an Zellhüllprotein, suspendiert in 0,1 ml komplettem Freund-Adjuvans wurde intraperitoneal mehreren Mäusen injiziert. Ungefähr 4 Wochen später wurden zwei dieser Mäuse intravenöse Injektionen mit 50 ug dieser Zellhüllen gegeben, und anschließend wurden die Milzen für die Verwendung bei der Hybridomfusion entfernt. Die Hybridom-Zellinie 3E6, die einen monoclonalen IgG-Antikörper absondert, der reaktiv mit H. ducreyi LOS ist, wurde durch Absuchen von Hybridomkulturüberständen durch Western-Blot- Analyse gegen Zellhüllen und anschließend gegen mit Proteinase K behandelte Zellhüllen identifiziert. Es wurde festgestellt, daß dieser MAB (3E6) reaktiv mit jedem H. ducreyi-Stamm, der bis heute getestet wurde (mindestens 20 Stämme), war und daß er nicht reaktiv mit H. influenzae- Stämmen, mit Treponema pallidum oder mit zwei Neisseria gonorrhoeae- Stämmen bei der Kolonieblot-Radioimmunoassay-Analyse war.
Der Immunolimulus-Assay, der den für H. ducreyi-LOS spezifischen Antikörper 3E6 umfaßte, wurde zuerst auf den Nachweis von H. ducreyi angewandt, die in vitro gezüchtet und in pyrogenfreier PBS resuspendiert worden waren. Diese Probe wurde hergestellt, indem der H. ducreyi-Stamm 35 000 auf Schokoladeagarplatten über Nacht bei 33ºC in einem "Kerzenauslöscher" gezüchtet wurde. Die erhaltenen Kolonien wurden von der Oberfläche der Agarplatten abgeschabt und in pyrogenfreier PBS bei einer Konzentration von 10&sup8; cfu suspendiert. Nach Mischen durch kräftige Vortex-Behandlung wurde die Zellsuspension auf ungefähr 10&sup7; cfu pro ml in pyrogenfreier PBS verdünnt. Diese Suspension wurde dann 12 Minuten auf 75ºC erwärmt. Sodann wurde eine Verdünnungsreihe dieser erwärmten Zellsuspensionen unter Verwendung von pyrogenfreier PBS hergestellt, und Anteile von 50 ul dieser Verdünnungen wurden als Proben in dem Immunolimulus-System mit dem monoclonalen Antikörper 3E6 verwendet. Die Nachweisgrenze für H. ducreyi in diesem System betrug 50 cfu oder 10³ cfu pro ml.
Eine zweite Probe, die aus Läsionen erhalten wurde, die von H. ducreyi hervorgerufen wurden, wurde ebenfalls mit dem vorstehenden Immunolimulus-Assay untersucht. Bei dieser Untersuchung wurden H. ducreyi-Organismen in vivo in einem temperaturabhängigen Kaninchenmodell gezüchtet. Kurz gesagt wurden nekrotische Läsionen auf den Rücken von rasierten Kaninchen wie folgt entwickelt: Männliche weiße Neuseeland-Kaninchen (NZW-Kaninchen) (2,7 bis 3,2 kg) wurden im Handel bezogen und in Räumen mit einer kontrollierten Temperatur von 15 bis 17ºC gehalten. Vor der bakteriellen Überimpfung wurde das dorsale Haar jedes Kaninchens unter Verwendung einer Tierpflege-Schermaschine Modell A-5 (Oster Professional Products, Milwaukee, WI) rasiert. Anschließend wurden die Rücken der Kaninchen täglich rasiert.
Der H. ducreyi Stamm 35 000, der für die Überimpfung auf die Tiere verwendet wurde, wurde in "Kerzenauslöschern" bei 33ºC für 14 bis 16 Stunden gezüchtet. Die Bakterien wurden in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH-Wert: 7,2, unter Verwendung von sterilen Baumwolltupfern gewonnen, und die Zellen wurden zweimal mit PBS durch wiederholte Zentrifugation und Resuspension gewaschen. Zellsuspensionen, die variierende Zahlen an cfu an H. ducreyi enthielten, wurden in pyrogenfreier Kochsalzlösung hergestellt. Die H. ducreyi-Zellsuspensionen wurden intradermal in die rasierten Rücken der Kaninchen an doppelten Stellen bei einem Injektionsvolumen von 0,1 ml injiziert.
Die Kaninchen wurden in einem Temperatur-kontrolliertem Raum bei 15-17ºC gehalten, um ihre Hauttemperatur zu senken. Bei 15-17ºC gehaltene Tiere wiesen eine mittlere Oberflächenhauttemperatur 2ºC unter derjenigen von Tieren, die bei 23-25ºC gehalten wurden, auf. Nach etwa 2 bis 4 Tagen wurde festgestellt, daß sich Läsionen entwickelten. 2 bis 5 Tage nach der intradermalen Injektion wurde Material aus den erhaltenen Läsionen abgesaugt, und der Gehalt an lebensfähigen H. ducreyi-Organismen in jeder Probe wurde bestimmt. Bakterien wurden aus den Hautläsionen durch Injektion von 0,1 ml steriler, pyrogenfreier PBS in die Läsionsstelle mit einer "25-gauge"-Nadel und anschließendes Absaugen des injizierten Materials zurück in die Spritze gewonnen. Das aus jeder Läsion abgesaugte Material wurde auf ein Endvolumen von 1 ml unter Verwendung von pyrogenfreier PBS gebracht. Anschließend wurden Anteile von 50 ul plattiert, um den Gehalt an lebensfähigen H. ducreyi im abgesaugten Material zu bestimmen. Eine Verdünnung von 1:5 dieses Materials in pyrogenfreier PBS wurde hergestellt und 12 Minuten auf 75ºC erwärmt. Anschließend wurden 50 ul umfassende Proben dieser Suspensionen und weiterer Verdünnungen dieser Suspensionen bei dem Immunolimulus-Assay verwendet. Eine positive Reaktion in diesem Assay wurde mit Proben erhalten, die eine geringe Zahl von 200 cfu an lebensfähigen H. ducreyi pro ml enthielten.
Die vorstehenden Untersuchungen zeigen die Anwendbarkeit des Immunolimulus-Assays als raschem diagnostischem Test für Ulcus molle.

Druckschriften

Die Literaturzitate innerhalb des Textes der vorliegenden Anmeldung werden hiermit durch Verweis zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht, sofern sie in der vorliegenden Anmeldung angewandte Methoden, Techniken und/oder Zusammensetzungen ergänzen, erläutern, lehren oder einen Hintergrund dafür bereitstellen.
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Claims

1. Verfahren zum Nachweis von bakteriellem Endotoxin in einer Probe, das die folgenden Stufen umfaßt:

(a) Kontaktieren einer Probe, die im Verdacht steht, ein bakterielles Endotoxin zu enthalten, mit mindestens einem Antikörper, der zur Bindung von derartigem bakteriellem Endotoxin imstande ist, wobei die Probe mit dem Antikörper unter Bedingungen in Kontakt gebracht wird, die wirksam hinsichtlich einer Bindung des Antikörpers an das Endotoxin, das möglicherweise in der Probe vorhanden ist, sind,

(b) Waschen des Antikörper-gebundenen Endotoxins zur Entfernung von Verunreinigungen; und

(c) Nachweis des Endotoxins mit einem Amöbozyt-Lysat.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Endotoxin durch folgende Maßnahmen nachgewiesen wird:

(a) Inkubieren des gewaschenen, Antikörper-gebundenen Endotoxins mit einem Amöbozyt-Lysat, um ein Proteasesystem des Lysats zu aktivieren;

(b) Zugabe eines Substrats für das Proteasesystems des Lysats zu dem Lysat; und

(c) Messung der Menge eines Produkts, das aus der Einwirkung des Proteasesystems auf das zugegebene Substrat gebildet wurde, wobei das Produkt proportional zur Konzentration des bakteriellen Endotoxins in der Probe ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Antikörper an eine feste Oberfläche gebunden ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Antikörper eine Bindungsaffinität für einen Bestandteil aufweist, der unter einem Kernglycolipid des bakteriellen Endotoxins, einem Epitop, das eine Region umfaßt die benachbart zu dem bakteriellen Endotoxin-Lipid A ist, einem Epitop, das Lipid A umfaßt, und einem Epitop, das eine Heptose und ein Ketodesoxyoctonat umfaßt, ausgewählt ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Antikörper um einen MAb handelt, der aus der Hybridomzellinie XMMEN-OE5 mit der ATCC- Hinterlegungsnummer HB9081 oder der Hybridomzellinie XMMEN-LY1 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB9082 erhalten wurde.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Antikörper ein Bindungsfragment davon umfaßt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das bakterielle Endotoxin ein Lipooligosaccharid oder ein Lipopolysaccharid eines gramnegativen Bakteriums ist, wobei das bakterielle Endotoxin vorzugsweise von einem gramnegativen Bakterium der Gattung Escherichia, Bordetella, Branhamelia, Salmonella, Haemophilus, Klebsiella, Proteus, Enterobacter, Pseudomonas, Pasteurella, Acinetobacter oder Neisseria stammt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Antikörper eine Bindungsaffinität für ein O-Antigen und vorzugsweise für das O-Antigen von Salmonella typhi aufweist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Amöbozyt-Lysat aus dem Blut von Tachypleus tridentatus, Tachypleus gigas, Carcinoscorpius rotundicauda oder Limulus polyphemus erhalten worden ist.

10. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Substrat, das zu der Reaktion gegeben wird, ein chromogenes Substrat umfaßt.

11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe Plasma, Serum, Cerebrospinalflüssigkeit oder Urin umfaßt.

12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe vor dem Kontaktieren mit dem Antikörper vorzugsweise auf eine Temperatur von etwa 75ºC erwärmt wird.

13. Verfahren zum Nachweis von Haemophilus influenzae Typ b-Lipooligosaccharid (Hib LOS) in einer Probe, die im Verdacht steht, derartiges LOS zu enthalten, das die folgenden Stufen umfaßt:

(a) Kontaktieren der Probe mit mindestens zwei Antikörpern, die gegen Hib LOS gerichtet sind, um die Bildung eines Immunkomplexes zwischen den Antikörpern und dem Hib LOS zu erleichtern;

(b) Waschen des Immunkomplexes;

(c) Inkubieren des gewaschenen Hib LOS mit Limulus-Amöbozyt- Lysat, um die Aktivierung eines Proteasesystems in dem Limulus-Lysat zu erleichtern; und

(d) Nachweis des Vorhandenseins von LOS durch Nachweis eines Produkts, das durch die Einwirkung des Proteasesystems auf ein Substrat gebildet wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Antikörper gegen das Lipid A-distale Außenkernoligosaccharid gerichtet ist.

15. Verfahren nach Anspruch 13, wobei es sich bei dem Antikörper um einen monoclonalen IgG3-Antikörper handelt, der gegen ein Epitop in der Oligosaccharidregion von Hib LOS DL26 oder Hib LOS DL42 gerichtet ist.

16. Verfahren zum Nachweis von Haemophilus ducreyi-LOS in einer Probe, die im Verdacht steht, derartiges LOS zu enthalten, das folgende Stufen umfaßt:

(a) Kontaktieren der Probe mit mindestens einem Antikörper, der gegen Haemophilus ducreyi-LOS gerichtet ist, um die Bildung eines Immunkomplexes zwischen dem Antikörper und dem LOS, das möglicherweise in der Probe vorhanden ist, zu erleichtern;

(b) Waschen des Immunkomplexes:

(c) Inkubieren des gewaschenen H. ducreyi mit Limulus-Amöbozyt- Lysat, um die Aktivierung eines Proteasesystems in dem Limulus-Lysat zu erleichtern; und

17. Reagenssatz, umfassend:

(a) einen Träger, kompartimentiert, um eingeschlossen darin mindestens zwei Behälter aufzunehmen;

(b) einen ersten Behälter, der in einem der Kompartimente angeordnet ist, wobei der erste Behälter mindestens einen Antikörper mit einer Bindungsaffinität für ein bakterielles Endotoxin umfaßt; und

(c) einen zweiten Behälter, der in einem anderen Kompartiment angeordnet ist, wobei der zweite Behälter ein Amöbozyt-Lysat oder ein chromogenes Substrat zum Nachweis der Freisetzung eines Proteasesystems durch bakterielles Endotoxin umfaßt,

und zwar zur Verwendung bei einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12.

18. Reagenssatz nach Anspruch 17, ferner dadurch definiert, daß er sowohl einen Behälter, der ein Amöbozyt-Lysat umfaßt, als auch einen Behälter, der ein chromogenes Substrat umfaßt, einschließt.

19. Reagenssatz nach Anspruch 17, wobei der Antikörper einen monoclonalen Antikörper umfaßt.

20. Reagenssatz nach Anspruch 17, wobei der Antikörper einen Antikörper umfaßt der ein Epitop eines Oligosaccharids benachbart zu Lipid A oder zu Lipid A innerhalb einer inneren Kernregion eines gramnegativen Bakteriums erkennt.

21. Reagenssatz, umfassend:

(b) einen ersten Behälter, der in einem Kompartiment angeordnet ist, wobei der erste Behälter zwei Antikörper umfaßt die spezifisch an Epitope von Haemophilus influenzae Typ b-Endotoxin binden; und

(c) einen zweiten Behälter, der in einem Kompartiment angeordnet ist, wobei der zweite Behälter ein Amöbozyt-Lysat oder ein chromogenes Substrat zum Nachweis der Proteasefreisetzung aus einem derartigen Lysat umfaßt,

und zwar zur Verwendung bei dem Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15.

22. Reagenssatz nach Anspruch 21, ferner dadurch definiert, daß er sowohl einen Behälter, der ein Amöbozyt-Lysat umfaßt als auch einen Behälter, der ein chromogenes Substrat umfaßt, einschließt.

23. Reagenssatz nach Anspruch 21, wobei der erste Behälter MAbs 4C4 und DL42 umfaßt.

24. Reagenssatz nach Anspruch 21, wobei eine oder mehrere Komponenten in lyophilisierter Form bereitgestellt werden.

25. Reagenssatz, umfassend:

(b) einen ersten Behälter, angeordnet in einem Kompartiment, wobei der erste Behälter mindestens einen Antikörper umfaßt, der spezifisch an ein Epitop von Haemophilus ducreyi-LOS bindet; und

(c) einen zweiten Behälter, angeordnet in einem Kompartiment, wobei der zweite Behälter ein Amöbozyt-Lysat oder ein chromogenes Substrat zum Nachweis der Proteasefreisetzung aus einem derartigen Lysat umfaßt;

und zwar zur Verwendung bei einem Verfahren gemäß Anspruch 16.

26. Reagenssatz nach Anspruch 25, ferner dadurch definiert, daß er sowohl einen Behälter, der ein Amöbozyt-Lysat umfaßt als auch einen Behälter, der ein chromogenes Substrat umfaßt, einschließt.

27. Reagenssatz nach Anspruch 25, wobei eine oder mehrere Komponenten in lyophilisierter Form bereitgestellt werden.