DE69833798T2

DE69833798T2 - Trialkyl-blockierung-vereinfachte polymerische medikamentenvorstufen von aminogruppen enthaltenden bioaktiven substanzen

Info

Publication number: DE69833798T2
Application number: DE69833798T
Authority: DE
Inventors: B. Richard Somerset GREENWALD; E. Yun Piscataway CHOE; Annapurna South Glastonbury PENDRI
Original assignee: Enzon Inc
Current assignee: Enzon Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1997-12-30
Filing date: 1998-12-29
Publication date: 2007-02-22
Anticipated expiration: 2018-12-30
Also published as: JP2010235624A; EP1041995A4; US6303569B1; AU2021299A; CA2309954C; CA2309954A1; EP1041995A1; WO1999033483A1; DK1041995T3; DE69833798D1; ATE319469T1; US5965119A; EP1041995B1; JP2001527049A; JP4728478B2; ES2260859T3

Description

FACHGEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft Doppelprodrugs. Insbesondere betrifft die Erfindung Doppelprodrugs auf Polymer-Basis mit umkehrbaren Bindungen unter Beteiligung von Amino- oder Hydroxyeinheiten von chemischen Verbindungen und biologisch aktive Materialien wie Enzymen, Proteinen und dergleichen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Im Laufe der Jahre wurden etliche Verfahren zum Verabreichen von biologisch wirksamen Materialien an Säuger vorgeschlagen. Viele Medikamente sind als wasserlösliche Salze erhältlich und können relativ leicht in pharmazeutischen Formulierungen eingeschlossen werden. Probleme treten auf, wenn das gewünschte Medikament entweder in wässrigem Fluids unlöslich ist oder in vivo schnell abgebaut wird. Zum Beispiel sind Alkaloide häufig besonders schwer anzulösen.
Bei einem Weg zum Anlösen von Medikamenten handelt es sich darum, sie als Teil einer löslichen Prodrug einzuschließen. Prodrugs schließen chemische Derivate einer biologisch aktiven Ausgangsverbindung ein, die beim Verabreichen letztendlich die Ausgangsverbindung in vivo freisetzt. Prodrugs ermöglichen es dem Fachmann, den Einsatz und/oder die Dauer der Wirkung eines Mittels in vivo zu modifizieren und können den Transport, die Verteilung oder Löslichkeit eines Arzneimittels im Körper modifizieren. Weiterhin reduzieren Prodrug-Formulierungen häufig die Toxizität und/oder bewältigen auf andere Weise Schwierigkeiten, die beim Verabreichen von Arzneimitteln anzutreffen sind. Typische Beispiele für Prodrugs schließen organische Phosphate oder Ester von Alkoholen oder Thioalkoholen ein. Siehe Remingtons's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Osol, Herausgeber (1980), wobei die Offenbarung davon hier unter Bezugnahme eingebracht ist.
Prodrugs sind häufig biologische inerte oder im Wesentlichen inaktive Formen der Ausgangs- oder aktiven Verbindung. Die Freisetzungsgeschwindigkeit des aktiven Arzneimittels, d.h. die Hydrolysegeschwindigkeit wird von etlichen Faktoren, jedoch insbesondere vom Typ der Bindungsverknüpfung des Ausgangsarzneimittels an dem Modifikationsmittel beeinflusst. Es ist darauf zu achten, dass die Herstellung von Prodrugs vermieden wird, die durch die Niere oder das retikuläre endotheliale System usw. eliminiert werden, bevor eine ausreichende Hydrolysemenge der Ausgangsverbindung erfolgt. Durch Einbringen eines Polymers als Teil des Prodrugsystems kann man die Kreislaufhalbwertszeit des Arzneimittels erhöhen.
Obwohl sich das vorstehend erwähnte Konzept von Abgabesystemen auf Prodrug-Basis in vielen Fällen als nützlich erwies, gibt es nichtsdestotrotz Situationen, in welchen Alternativen erwünscht sind. Zum Beispiel betonten Bundgaard in „The Double Prodrug Concept and Its Applications" in Advanced Drug Delievery Reviews, 3 (1989) 39-65, (wobei der Inhalt davon hier unter Bezugnahme eingebracht ist), dass es in vielen Fällen schwierig ist, eine Prodrug zu erhalten, die die maßgebende Kombination von angemessener Stabilität in vitro und hoher Empfänglichkeit zum Erneuern des Ausgangsarzneimittels in vivo aufweist. Wie von Bundgaart betont, beinhaltet ein viel versprechendes Mittel zum Bewältigen einiger der früher angetroffenen Unzulänglichkeiten die Verwendung der Kaskadenlatenz oder von „Vorprodrugs". In derartigen Systemen beinhaltet die hydrolytische Reaktionssequenz einen ersten Schritt, bei welchem es sich gewöhnlich um eine enzymatische Spaltung handelt, und einen zweiten Schritt, der eine nicht enzymatische Hydrolyse beinhaltet, die nur erfolgt, nachdem der erste Schritt stattgefunden hat. Die Verwendung von Transportsystemen auf Polymer-Basis als Teil der Kaskadenlaz-Technologie wurde nicht offenbart.
Die mit der Herstellung von Prodrugs von aminhaltigen Arzneimitteln verbundenen Probleme wurden jüngst von Shan, D. et al. in „Prodrug Strategies Based on Intramolecular Cyclization Reactions" J. Pharm. Sci. Juli 1997, Band 86 Nr.7, 765-767 (wobei die Inhalte davon hier unter Bezugnahme eingebracht sind) hervorgebracht. Zum Vermeiden der relativen Stabilität der Amidbindung offenbaren die Autoren Prodrugs, die verschiedene Einheiten einbringen, die sich zum Freisetzen des Ausgangsarzneimittels intramolekularen Cyclisierungsreaktionen unterziehen können. Die die Cyclisierungsreaktionen initiierenden chemischen und biologischen Auslösemechanismen hängen von denjenigen ab, die zum Freisetzen des ursprünglichen Arzneimittels über Hydrolyse der Amidbindung erforderlich sind. Wiederum sind Systeme offenbart, die nicht auf Polymer-Basis vorliegen.
Es wird angenommen, dass trotz der erörterten Arbeiten auf diesem Gebiet von Doppelprodrugs einige spezifische Probleme nicht ausreichend behandelt wurden. Zum Beispiel behandelt die vorher erörterte Technik nicht die Löslichkeitsprobleme von vielen Ausgangsverbindungen. Zudem wurde auch nicht das Problem des Ausbaus einer ausreichenden Erhöhung der Kreislaushaltwertszeit der Prodrug ausreichend entwickelt. Folglich besteht fortlaufend Bedarf nach der Bereitstellung von zusätzlichen Technologien zum Bilden von Prodrugs, die für das Doppelprodrug-Konzept von Nutzen wären. Zum Beispiel wäre es vorteilhaft, dem Fachmann alternative Techniken für die Transportträgeranlagerung bereitzustellen, sodass die biologische Wirkung reguliert wird. Weiterhin wäre es erwünscht, zusätzliche Techniken bereitzustellen, um mit der Beteiligung von Aminoresten und/oder Hydroxyresten von Ausgangsverbindungen verbundene Probleme zu behandeln und folglich eine übermäßig schnelle oder langsame Hydrolyse der Transportform der Ausgangsverbindung bei physiologischem pH-Wert zu vermeiden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung geht die vorstehend beschriebenen Unzulänglichkeiten an. In einem Aspekt der Erfindung sind Verbindungen der Formel (I) bereitgestellt:
wobei: B H, OH, OSiR₁₃, ein Rest einer aminhaltigen Zieleinheit oder ein Rest einer hydroxyhaltigen Einheit ist;
L₁ eine bifunktionelle Verbindungseinheit wie
ist;
L₂ eine bifunktionelle Verbindungseinheit wie
ist;
ist;
Y_1-2 unabhängig O oder S sind;
M X oder Q ist; wobei X eine elektronenziehende Gruppe ist;
Q eine Einheit ist, die ein freies Elektronenpaar enthält, das drei bis sechs Atome von C(=Y₂) entfernt liegt;
R₁, R₂, und R₄ unabhängig eines von C_1-6 Alkylen, verzweigten C_3-12-Alkylen, C_3-8-Cycloalkylen, substituierten C_1-6-Alkylen, substituierten C_3-8-Cycloalkylen, Arylen, substituierten Arylen, Aralkylen, C_1-6-Heteroalkylen, substituierten C_1-6 Heteroalkylen, C_1-6-Alkoxy, Phenoxy und C_1-6-Heteroalkoxy sind;
R₇, R₈, R₉, R₁₀ und R₁₃ unabhängig Wasserstoff oder ein Vertreter der R₁, R₂, und R₄ definierenden Gruppe sind;
A eine Einheit ist, die beim Einschluss in die Formel (I) einen mehrfach substituierten aromatischen Kohlenwasserstoff oder eine mehrfach substituierte heterocyclische Gruppe bildet;
(m) null oder eins ist;
(n) null oder eine positive ganze Zahl ist;
(p) null, eins oder zwei ist;
(q) drei oder vier ist; und
R₁₁ ein Polymerrest wie ein wasserlösliches Polyalkylenoxid ist.
In bestimmten bevorzugten Aspekten ist Ar ein dialkylsubstituiertes Phenyl wie in Dimethylphenyl und/oder ist B eine Abgangsgruppe wie N-Hydroxybenzotriazolyl, N-Hydroxyphtalimidyl, Halogen, p-Nitrophenoxy, Imidazolyl, N-Hydroxysuccinimidyl, Thiazolidylthion oder andere aktivierende Gruppen. In einer anderen Ausführungsform ist B ein Rest einer beliebigen aminhaltigen oder hydroxyhaltigen Verbindung, für welche eines oder mehrere der verbesserten wässrigen Löslichkeit, verminderten Antigenität, Prodrug- und/oder kontrollierten Freisetzungsabgabe erwünscht ist. Zum Beispiel kann B ein Rest eines Enzyms, Proteins oder einer organischen Verbindung wie von Daunorubicin, Doxorubicin, p-Aminoanilinsenf, Camptothecin, Paclitaxel, AraC usw sein.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung soll der Begriff „Rest" so zu verstehen sein, dass er denjenigen Teil einer biologisch aktiven Verbindung bedeutet, der nach dessen Unterziehen einer Reaktion unterzogen, in welcher der Prodrug-Trägerteil durch Modifikation einer Hydroxy- oder Aminogruppe angelagert wurde, zurückbleibt.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung soll der Begriff „Alkyl" so zu verstehen sein, dass er radkettige, verzweigte, substituierte C_1-12-Alkyle, einschließlich -Alkoxy, C_3-8-Cycloalkyle, oder substituierte Cycloalkyle usw. einschließt.
Die Doppelprodrugs der vorliegenden Erfindung sind folglich einzigartige Abgabesysteme. Vorzugsweise wird zuerst durch Hydrolyse oder Esteraseaktivität der polymere Teil freigesetzt und unterzieht sich die erhaltene „zweite Prodrug"- Einheit als zweites einer Cyclisierungsreaktion zum Erneuern der amin- oder hydroxyhaltigen Ausgangs- (d.h. bioaktiven) Verbindung in vivo.
Bei einigen der Hauptvorteile von Doppelprodrug-Verbindungen der vorliegenden Erfindung handelt es sich darum, dass sie amin- oder hydroxyhaltige Verbindungen anlösen und deren Haltwertszeit verglichen mit den nativen oder auch „zweiten" Prodrug-Gegenstücken verlängern können. Der polymere Teil kann den Ausgangsverbindungen auch eine die Antigenität reduzierende Wirkung verleihen. Ein anderer Vorteil der Systeme der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass die Bindung zwischen dem Polymerteil und der wie vorstehend beschriebenen „zweiten Prodrug"-Verbindung zum Hydrolysieren oder sonstigen Spalten mit einer Geschwindigkeit, die es der Verbindung ermöglicht, ihre verbesserte Löslichkeit und Kreislaufhaltwertszeit beizubehalten, bestimmt ist. Das native Arzneimittel wird jedoch zu diesem Punkt nicht freigesetzt. Nur dann, wenn sich die „zweite" Prodrug der relativ schnellen Trialkylsperrlactonisierungsreaktion unterzogen hat, wird das gewünschte native oder Ausgangsmolekül freigesetzt. Es ist leicht ersichtlich, dass diese Vorgehensweise mit Doppelprodrugs der vorliegenden Erfindung einzigartige und unerwartete Eigenschaften bietet, die die Kreislaufhaltwertszeit und Löslichkeit von nativen oder unmodifizierten Molekülen verbessern.
Verfahren zur Herstellung und die Verwendung der hier beschriebenen Verbindung und Konjugate sind ebenfalls bereitgestellt.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1-2 veranschaulichen schematisch zwei Verfahren zum Bilden von Doppelprodrugs der vorliegenden Erfindung.
Die 3-16 veranschaulichen die Reaktionsschemata, die mit den Beispielen verbunden sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
A. FORMEL (I)
In einem Aspekt der Verbindung sind Verbindungen der Formel (I) bereitgestellt:
wobei: B H, OH, OSiR₁₃, ein Rest einer aminhaltigen Zieleinheit oder ein Rest einer hydroxyhaltigen Einheit ist;
L₁ eine bifunktionelle Verbindungseinheit wie
ist;
L₂ eine bifunktionelle Verbindungseinheit wie
ist;
ist;
Y_1-2 unabhängig O oder S sind;
M X oder Q ist; wobei X eine elektronenziehende Gruppe ist;
Q eine Einheit ist, die ein freies Elektronenpaar enthält, das drei bis sechs Atome von C(=Y₂) entfernt liegt; R₁, R₂, und R₄ unabhängig eines von C_1-6-Alkylen, verzweigten C_3-12-Alkylen, C_3-8-Cycloalkylen, substituierten C_1-6-Alkylen, substituierten C_3-8-Cycloalkylen, Arylen, substituierten Arylen, Aralkylen, C_1-6-Heteroalkylen, substituierten C_1-6-Heteroalkylen, C_1-6-Alkoxy, Phenoxy und C_1-6-Heteroalkoxy sind;
R₇, R₈, R₉, R₁₀ und R₁₃ unabhängig eines von Wasserstoff, C_1-6-Alkylen, verzweigten C_3-12-Alkylen, C_3-8-Cycloalkylen, subtituierten C_1-6-Alkylen, substituierten C_3-8-Cycloalkylen, Arylen, substituierten Arylen, Aralkylen, C_1-6-Heteroalkylen, substituierten C_1-6-Heteroalkylen, C_1-6-Alkoxy, Phenoxy und C_1-6-Heteroalkoxy;
Ar eine Einheit ist, die beim Einschluss in die Formel (I) einen mehrfach substituierten aromatischen Kohlenwasserstoff oder eine mehrfach substituierte heterocyclische Gruppe bildet;
(m) null oder eins ist;
(n) null oder eine positive ganze Zahl ist;
(p) null, eins oder zwei ist;
(q) drei oder vier ist; und
R₁₁ ein Polymerrest ist.
B. BESCHREIBUNG DER Ar-EINHEIT
In Bezug auf Formel (I) ist ersichtlich, das die Ar-Einheit eine Einheit ist, die beim Einschluss in die Formel (I) einen mehrfach substituierten aromatischen Kohlenwasserstoff oder eine mehrfach substituierte heterocyclische Gruppe bildet. Ein Schlüsselmerkmal ist, dass die Ar-Einheit aromatischer Natur ist. Damit sie aromatisch ist, müssen die π-Elektronen im Allgemeinen sowohl über als unter der Ebene eines cyclischen Moleküls in einer „Wolke" aufgeteilt sein. Weiterhin muss die Anzahl an n-Elektronen die Hückle-Regel (4n+2) erfüllen. Folglich erkennt der Durchschnittsfachmann, dass unzählige Einheiten die aromatische Anforderung der Einheit der Formel (I) erfüllen und sie folglich zur Verwendung hier geeignet sind.
Bevorzugte aromatische Kohlenwasserstoffeinheiten schließen ohne Beschränkung Folgendes ein:
wobei J, O, S oder NR₁₄, E und Z unabhängig CR₁₄ oder NR₁₄ sind und R₁₄ ausgewählt ist aus derselben Gruppe wie diejenige, die R₉ in Formel (I) definiert, z.B. Wasserstoff, C_1-6-Alkylen usw. Isomere der fünf- und sechsgliedrigen Ringe sowie Benzo- und Dibenzosysteme und deren verwandten Congenere sind ebenfalls erwogen. Es ist dem Fachmann klar, dass die aromatischen Ringe wahlweise mit Heteroatomen wie O, S, NR₁₄ usw. substituiert sein können, sofern die Hückel-Regel befolgt wird. Weiterhin können die aromatischen oder heterocyclischen Strukturen wahlweise mit (einem) Halogen(en) und/oder Seitenketten, wie diejenigen, die üblicherweise auf dem Fachgebiet verständlich sind, substituiert sein. Wie nachstehend dargestellt, kann des jedoch durch alle für Ar-Einheiten der vorliegenden Erfindung geeigneten Strukturen ermöglicht werden, dass L₂- und R₂-Einheiten in derselben Ebene in einer ortho-Anordnung liegen:
wobei L₂ und R₂ wie vorstehend in Bezug auf Formel (I) definiert sind und R₃, R₅ und R₆ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der R₉ definierenden Gruppe oder einem Cyano, Nitro, Carboxyl, Acyl, substituierten Acyl, Carboxyalkyl.
In bevorzugten Aspekten der vorliegenden Erfindung ist R₂ ein C_1-6-Alkyl. Stärker bevorzugt ist R₂ Methyl. Weiterhin sind R₁ und R₄ vorzugsweise Alkyl, z.B. Methyl. Y_1-2 sind vorzugsweise O, und (p) ist vorzugsweise eins.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung schließen substituierte Alkyle Carboxyalkyle, Aminoalkyle, Dialkylaminos, Hydroxyalkyle und Mercaptoalkyle ein; schließen substituierte Cycloakyle Einheiten wie 4-Chlorcyclohexyl ein; schließen Aryle Einheiten wie Naphtyl ein; schießen substituierte Aryle Einheiten wie 3-Bromphenyl ein; schließen Aralkyle Einheiten wie Toluyl ein; schließen Heteroalkyle Einheiten wie Ethylthiophen ein; schließen substituierte Heteroalkyle Einheiten wie 3-Methoxythiophen ein; schließt Alkoxy Einheiten wie Methoxy ein; und schließt Phenoxy Einheiten wie 3-Nitrophenoxy ein. Halogen soll derart zu verstehen sein, dass es Fluor, Chlor, Iod und Brom einschließt.
C. VERBINDUNGSEINHEITEN L₁ UND L₂
Wie vorstehend dargestellt schließt die Erfindung bifunktionelle Verbindungseinheiten L₁ und L₂ ein, wobei L₁ zum Verbinden von R₁₁ und C(=Y₂) dient und L₂ die Ar-Einheit und B verbindet. In bevorzugten Ausführungsformen schließt L₁ die Einheit (M) ein, die entweder eine elektronenziehende Gruppe (hier als X bezeichnet) oder eine Einheit, die ein freies Elektronenpaar enthält, das drei bis sechs Atome von der C(=Y₂) entfernt liegt, (hier als Q bezeichnet) ist. L₁ und L₂ können auch bifunktionelle Einheiten wie C_1-6-Alkyle, verzweigte C_3-12-Alkyle, C_3-8-Cycloalkyle usw. einschließen.
D. DER DOPPELPRODRUG-VERBINDUNGSTEIL
Die erste labile Bindung des Doppelprodrugsystems, die das L₁ mit
verbindet, ist zum Hydrolysieren über eine durch Esterase katalysierte Hydrolyse in vivo mit einer eine ausrechende Menge der „zweiten Prodrug"-Verbindung in einer geeigneten Zeitdauer nach Verabreichung erzeugenden Geschwindigkeit ausgewählt. Der Begriff „ausreichende Mengen" zum Zwecke der vorliegenden Erfindung soll eine Menge bedeuten, die sich zum Freisetzen der nativen Verbindung und zum Erzielen einer gewünschten Wirkung später einer ausreichenden Trialkylsperrlactonisierung in vivo unterziehen kann. Falls als Teil von L₁ vorliegend, ist (n) vorzugsweise 1 oder 2.
1. Die elektronenziehende Gruppe X
In denjenigen Aspekten der Formel (I), in welchen L₁ M einschließt, kann die Einheit eine elektronenziehende Gruppe, hier als X bezeichnet, sein. Insbesondere kann X Einheiten wie O, NR₁₂,
S, SO und SO₂ sein, wobei Y₃ dieselbe wie diejenige, die für Y₁ definiert ist, und R₁₂ dieselbe wie diejenige, die für R₉ definiert ist, d.h. H, C_1-6-Alkyle usw., R₁₂ dieselbe wie diejenige, die für R₉ definiert ist, z.B. H, C_1-6-Alkyle, verzweigte Alkyle usw. ist. Vorzugsweise ist jedoch, wenn X NR₁₂ ist, R₁₂ H. Es ist bevorzugt das X entweder O oder NR₁₂ ist.
2. O-Teil der Verbindungsgruppe
In einer anderen Ausführungsform, wenn L₁ Q einschließt, bei welchem es sich um eine Einheit handelt, die ein freies Elektronenpaar enthält, das drei bis sechs Atome von der C(=Y₂)-Einheit entfernt liegt, ist das Polymer R₁₁ vorzugsweise über ein Heteroatom wie Sauerstoff an Q angelagert. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das freie Elektronenpaar fünf Atome von diesem Sauerstoff entfernt. Q kann ausgewählt sein aus der nicht beschränkenden Liste von C_2-4-Alkylen, oder C_3-8-Cycloalkylen, Arylen oder Aralkylgruppen, die mit einem Vertreter der Gruppe, bestehend aus O, S und NR₁₂ substituiert sind. Das freie Elektronenpaar kann irgendwo entlang der Q-Einheit vorliegen, sofern der definierte Abstand zwischen dem freien Elektronenpaar und dem Sauerstoff beibehalten wird.
In diesen Ausführungsformen ist R₁₁ über NR₁₂, O oder S an Q angelagert. Folglich unterstützt Q die Hydrolyse der Prodrug-Verbindung durch anchimere Unterstützung, da das freie Elektronenpaar durch Hydrolyse, vorzugsweise der Esterbindung, ein drei bis sechs gliedriges, jedoch vorzugsweise fünf gliedriges Ringnebenprodukt erzeugen kann.
Q kann auch ausgewählt sein aus der Gruppe, bestehend aus C_2-4-Alkylen, Cycloalkylen, Arylen, Aralkylgruppen, die mit einem Vertreter der Gruppe, bestehend aus NH, O, S, -CH₂-C(=O)-NH- und ortho-substituierten Phenylen wie
substituiert sind.
3. Arzneimittelerzeugung durch Hydrolyse der Prodrug
Die Prodrug-Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind derart aufgebaut, dass t_1/2 der Hydrolyse < t_1/2 der Eliminierung in Plasma ist.
Die in den Verbindungen eingeschlossenen Bindungen weisen Hydrolysegeschwindigkeiten im Plasma des zu behandelten Säugers auf, die schnell genug sind, um es zu ermöglichen, dass ausreichende Mengen der Ausgangsverbindun gen, d.h. der amino- oder hydroxyhaltigen bioaktiven Verbindung vor der Eliminierung freigesetzt werden. Einige bevorzugte Verbindungen der vorliegenden Erfindung, d.h. diejenigen in welchen (n) 1 ist, weisen eine t_1/2 für die Hydrolyse im Plasma im Bereich von etwa 5 Minuten bis etwa 12 Stunden auf. Vorzugsweise weisen die Zusammensetzungen eine Plasma-t_1/2-Hydrolyse im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 8 Stunden und besonders bevorzugt von etwa 1 bis etwa 6 Stunden auf.
4. Lactonisierung und Wiederherstellung des nativen Arzneimittels
Nach Stattfinden der ersten Esterhydrolyse der Doppelprodrug in vivo, gewöhnlich über Esteraseaktivität oder pH-abgemäßigter Aktivität oder Cyclisierungsreaktion, wird der Polymerrest abgespalten und bleibt die erhaltene zweite Prodrug-Einheit übrig. Die einzelne Prodrug-Einheit unterzieht sich dann zur Herstellung der gewünschten nativen oder Ausgangsverbindung in vivo einer weiteren unabhängigen Lactonisierungsreaktion. Diese spontane Reaktion erfolgt nach den die Geschwindigkeit steuernden ersten Hydrolyseschritt und wird durch einfache Protonenentfernung der aromatischen Zwischenverbindung initiiert, die eine Lactonisierungsreaktion und Freisetzung des Ausgangsmoleküls verursacht. Die Reaktion ist nachstehend dargestellt.
Die Freisetzung einer hydroxyhaltigen Ausgangsverbindung würde in ähnlicher Weise erfolgen.
E. IM WESENTLICHEN NICHT ANTIGENE POLYMERE
Die „Doppelprodrug"-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung schließen ein wasserlösliches Polymer, R₁₁, ein. In bevorzugten Aspekten der Erfindung schließt R₁₁ eine Abschlussgruppe A ein, bei welcher es sich um Wasserstoff, C_1-6-Alkyleinheiten, Carboxyalkyl, Dialkylacyl Harzstoffalkyle oder eine Verbindung der nachstehend dargestellten Formel (II), die ein Bis-System bildet, handeln kann:
wobei B¹ derselbe Rest wie B oder ein anderer Vertreter der für B definierten Gruppe ist und die übrigen Variablen wie vorstehend in Bezug auf Formel (I) dargelegt sind.
Geeignete Beispiele für derartige Polymere schließen Polyalkylenoxide wie Polyethylenglycole ein, die ebenfalls vorzugsweise im Wesentlichen nicht-antigen sind. Die allgemeine Formel für PEG und dessen Derivate, d.h. A'-O-(CH₂CH₂O)_x-(CH₂)_a-A, wobei (x) den Polymerisationsgrad (d.h. 10-2.300) oder eine Anzahl an Wiederholungseinheiten in der Polymerkette darstellt und vom Molekulargewicht des Polymers unabhängig ist; (n) Null oder eine positive ganze Zahl ist; A eine wie hier definierte Abschlussgruppe, d.h. eine -H-, Amino-, Carboxy-, Halogen-, C_1-6-Alkylgruppe oder eine andere aktivierende Gruppe ist und A' derselbe Rest wie A oder eine andere A-Einheit ist. Auch nützlich sind Polypropylenglycole, verzweigte PEG-Derivate wie diejenigen, die im allgemein erteilten U.S.-Patent Nr. 5,643,575 beschrieben sind, „Sternen-PEGs" und mehrarmige PEGs wie diejenigen, die im Katalog „Polyethylenglycol Derivatives 1997-1998" von Shearwater Polymers, Inc., wobei die Offenbarung davon hier jeweils unter Bezugnahme eingebracht ist. Es ist klar, dass das wasserlösliche Polymer hier zum Anlagern an die Bindung über M, X oder Q funktionalisiert ist. Als Beispiel des PEG-Teils der Prodrug können die folgenden nicht beschränkenden Verbindungen genannt werden: -C(=Y)-(CH₂)_n-O-(CH₂CH₂O)_x-A, -C(=Y)-Y- (CH₂)_n-O-(CH₂CH₂O)_x-A und -C(=Y)-NR₁₂-(CH₂)_n-O-(CH₂CH₂O)_x-A, wobei Y, O oder S und R₁₂ ist, (n) und (x) wie vorstehend definiert sind.
In vielen Aspekten der Erfindung sind Polyethylenglycole (PEG's), monoaktivierte C_1-4-Alkyl-terminierte PAO's wie Monomethyl-terminierte Polyethylenglycole (mPEG's) bevorzugt.
Zum Bereitstellen der gewünschten hydrolysierbaren Bindung können Mono- oder Disäure-aktivierte Polymere wie PEG-Säuren oder PEG-Disäuren sowie Mono- oder Di-PEG-Amino- und Mono- oder Di-PEG-Diole verwendet werden. Geeignete PAO-Säuren können synthetisiert werden, indem zuerst PEG-OH zu einem Ethylester umgewandelt wird und danach eine Verseifung folgt. Siehe auch Gehrhardt, H., et al. Polymer Bulletin 18:487 (1987) und Vernoese, F.M., et al., J. Controlled Release 10; 145 (1989). In einer anderen Ausführungsform kann die PAO-Säure durch Umwandeln von mPEG-OH zu einem t-Butylester, gefolgt von Säurespaltung synthetisiert werden. Siehe z.B. das allgemein erteilte U.S. Patent Nr. 5,605,976. Die Offenbarung von jedem von Vorstehendem ist hier unter Bezugnahme eingebracht.
Obwohl das Zahlenmittel des Molekulargewichts der PAOs und PEGs beträchtlich variieren kann, werden für die Zwecke der vorliegenden Erfindung gewöhnlich Polymere im Bereich von etwa 2.000 bis etwa 100.000 ausgewählt. Molekulargewichte von etwa 5.000 bis etwa 50.000 sind bevorzugt und von 5.000 bis etwa 40.000 besonders bevorzugt. Das Zahlenmittel des Molekulargewichts des zum Einschluss in die „Doppelprodrug" ausgewählten Polymers muss ausreichend sein, damit ein ausreichender Kreislauf der „Doppelprodrug" vor der Hydrolyse der Verbindungsgruppe bereitgestellt wird. In den vorstehend bereitgestellten Bereichen sind in einigen Aspekten für chemotherapeutische und organische Einheiten Polymere mit Molekulargewichtsbereichen von mindestens 20.000 bevorzugt.
Im Falle von einigen Nukleophilen wie bestimmten Proteinen, Enzymen und dergleichen sind Polymere mit einem Molekulargewichtsbereich von etwa 2.000 bis etwa 20.000 bevorzugt.
Die hier eingeschlossenen polymeren Substanzen sind vorzugsweise bei Raumtemperatur wasserlöslich. Eine nicht beschränkende Liste für derartige Polymere schließen Polymeralkylenoxidhomopolymere wie Polyethylenglycol (PEG) oder Polypropylenglycole, polyoxyethylenierte Polyole, Copolymere davon und Blockcopolymere davon ein, mit der Maßgabe, dass die Wasserlöslichkeit der Blockcopolymere beibehalten wird.
Als Alternative für Polymere auf PAO-Basis können nicht-antigene Materialien wie Dextran, Polyvinylalkohole, Polymere auf Kohlenhydratbasis, Polyaminosäuren, Hydroxypropylmethacrylamid (HPMA) und Copolymere davon usw. und dergleichen wirksam verwendet werden, wenn derselbe wie hier für die PAOs wie PEG beschriebene Aktivierungstyp eingesetzt wird. Der Fachmann erkennt, dass die vorstehende Liste nur der Veranschaulichung dient, und dass alle polymeren Materialien mit den hier beschriebenen Qualitäten zu erwägen sind. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet „wirksam nicht-antigen", dass alle polymeren Materialien, die auf dem Fachgebiet als nicht toxisch und eine merkliche Immunantwort in Säugern nicht auslösend verstanden werden.
F. SYNTHESE DES TRANSPORTSYSTEMS DER POLYMEREN DOPPELPRODRUG
Die Doppelprodrugs der vorliegenden Erfindung können auf mindestens zwei Weisen hergestellt werden. Eine Technik die schematisch in 1 dargestellt ist, schließt folgendes ein:

a. Bereitstellen einer Zwischenverbindung (III)

₂

b. Behandeln der Zwischenverbindung (III) mit einer starken Säure wie TFA (Trifluoressigsäure) oder einer anderen Trihalogenessigsäure, HCl, Schwefelsäure usw. oder katalytische Hydrierung zum Entfernen der Schutzgruppe; und
c. Umsetzen der in Schritt b. erhaltenen ungeschützten Zwischenverbindung (III) mit einer Einheit, die mit L₁ wie einem aktivierten Polymer d.h. mit einem Polymer mit einer reaktiven funktionellen Gruppe (in 1 als R₁₅ bezeichnet) z.B. p-Nitrophenyl oder Succinimidylcarbonat, Carbonylimidazol, Thiazolidnylthion oder dergleichen reagieren kann, und einer optionalen Abstandhaltergruppe, CR₉R₁₀, unter Bildung einer aktivierten Doppelprodrug-Transportform der Formel (IV):
wobei B₂ eine Abgangsgruppe wie OH ist und alle anderen Variablen wie vorstehend in Bezug auf die Formel (I) dargelegt sind; und wahlweise
d. Anlagern eines aminhaltigen oder hydroxyhaltigen Verbindungsrests z.B. des zu transportierenden Arzneimittels, an die Verbindung (IV) durch Ersetzen von B₂ in einer Reaktion mit einer amin- oder hydroxyhaltigen Verbindung, siehe 1.

Ähnliche Techniken werden eingesetzt, wenn andere aromatische Einheiten als Ausgangsmaterialien verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform, wie in 2 mit einer aminahltigen Verbindung für veranschaulichende Zwecke dargestellt, kann die Doppelprodrug durch Folgendes hergestellt werden:

a. Anlagern einer aminhaltigen oder hydroxyhaltigen Verbindung an die Zwischenverbindungen (III);
b. Entfernen der Schutzgruppe; und
c. Umsetzen der ungeschützten Zwischenverbindung mit einem aktivierten Polymer unter Bildung der Doppelprodrug.

Obwohl in 2, dem Reaktionsschema für eine OH-haltige Verbindung, nicht veranschaulicht, würde das Reaktionsschema dennoch in der Weise von 2 verlaufen, in welcher eine Esterbindung zwischen dem Transportsystem und dem Arzneimittelrest gebildet wird.
Die Zwischenverbindung (III) kann unter Verwendung von organischen Standardsynthesetechniken hergestellt werden. Zum Beispiel können blockierte Dialkylphenylpropionsäurederivate wie 3-(2'-Boc-alanyl-4,4'-dimethylphenyl)-3,3-dimethylpropionsäure unter Verwendung eines Verfahrens, offenbart von Binghe Wang, et al. Synthesis of a Novel Esterase Sensitive Cyclic Prodrug System for Peptides That Utilizes a „Trimethyl Look" – Facilitated Lactonization Reaction, J. Org. Chem. 1997, 62, 1363), synthetisiert werden, wobei die Offenbarung davon hier unter Bezugnahme eingebracht ist. Alternative aromatische Ausgangsmaterialien sind dem Fachmann ohne übermäßige Versuchsführung klar.
Die Anlagerung der Ausgangsverbindung an die Zwischenverbindung (III) oder (IV) kann unter Verwendung von organischen Standardsynthesetechniken unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Kupplungsmitteln wie 1,3-Diisopropylcarbodiimid (DIPC), Dialkylcarbodiimide 2-Halogen-1-alkylpyridiniumhalogenide, 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid (EDC), Propanphosphonsäure cyclisches Anhydrid (PPACA) und Phenyldichlorphosphate durchgeführt werden. Alternativ dazu ist, wenn B eine gute Abgangsgruppe wie diejenigen, die unter G.1. aufgezählt sind, ist, ein Kupplungsmittel nicht nötig, und die Reaktion verläuft in Gegenwart einer Base.
Die Entfernung der Schutzgruppe wird in derselben Weise, wie im ersten Verfahren beschrieben, durchgeführt.
G. DIE ABGANGSGRUPPE ODER DER RESTTEIL „B"
1. Abgangsgruppen
In denjenigen Aspekten in welchen B eine Abgangsgruppe ist, schließen geeignete Abgangsgruppen ohne Beschränkungen Einheiten wie N-Hydroxybenzotriazolyl, Halogen, N-Hydroxyphthalimidyl, p-Nitrophenoxy, Imidazolyl, N-Hydroxysuccinimidyl; Thiazolidinylthion oder gute Abgangsgruppen, die dem Fachmann klar sind, ein.
Die Abgangsgruppen können nach Bildung des „Doppel"-Prodrug-Teils", z.B. des PEG-Teils an den L₂-Teil der Verbindung angelagert werden. Die hier verwendeten und beschriebenen Synthesereaktionen sind dem Fachmann ohne übermäßige Versuchsführung klar. Zum Zwecke der Veranschaulichung und ohne Beschränkung werden die aktivierten Formen des Doppelprodrug-Transportsystems im Allgemeinen durch Acylieren der aromatischen Hydroxys einer Verbindung der nachstehenden Formel (V) hergestellt:
wobei L₂ und B₂ wie vorstehend dargelegt sind, und anschließend Umsetzen der erhaltenen acylierten Verbindung mit einer aktivierenden Gruppe für die Kupplung an ein Ziel, z.B. Verbindungen wie 4-Nitrophenylchlorformiat, Disuccinimidylcarbonat (DSC), Carbonyldiimidazol, Thiazolidinthion usw. zum Bereitstellen des gewünschten Derivats.
Nachdem sie sich an Stelle befindet, ist die „aktivierte" Form der PEG-Prodrug zur Konjugation mit einer amin- oder hydroxyhaltigen Verbindung bereit. Einige bevorzugte aktivierte Transportformen sind nachstehend dargestellt:
2. Reste von aminhaltigen Verbindungen
In diesen Aspekten der Erfindung, z.B. nach Bilden des Prodrug-Transports, ist B ein Rest einer aminhaltigen Verbindung, wobei eine nicht beschränkende Liste derartiger geeigneter Verbindungen Reste von organischen Verbindungen, Enzyme, Proteine, Polypeptide usw. einschließen. Organische Verbindungen schließen ohne Beschränkung Einheiten wie Anthracyclin-Verbindungen, einschließlich Daunorubicin, Doxorubicin; p-Aminoanilinsenf, Ara-C (Cytosinarabinosid) und verwandte anti-Metabolit-Verbindungen, z.B. Gemcitabin usw. ein. In einer anderen Ausführungsform kann B ein Rest eines aminhaltigen kardiovaskulären Mittels, eines antineoplastischen Mittels, eines antiinfektiösen Mittels, eines Antipilzmittels wie Nystatin und Amphotericin B, eines Antiangsmittels, eines gastronintestinalen Mittels, eines das zentrale Nervensystem aktivierenden Mittels, eines Analgetikums, eines Fruchtbarkeitsmittels, eines Empfängnisverhütungsmittels, eines Antientzündungsmittels, eines steroiden Mittels, eines antiurecämischen Mittels, eines gefäßverdünnenden Mittels, eines gefäßkontraktierenden Mittels usw. sein.
Geeignete Proteine, Polypeptide, Enzyme, Peptide und dergleichen mit mindestens einer verfügbaren Aminogruppe zur Polymeranlagerung schließen Materialien, die physiologische oder pharmakologische Aktivitäten aufweisen, sowie diejenigen, die Reaktionen in organischen Lösungsmitteln katalysieren können, ein. Das einzige andere Erfordernis der aminhaltigen Materialien ist, dass sie zumindest einen gewissen Teil der Aktivität, die mit dem unmodifiziertem Protein, Enzym, Peptide usw. verbunden ist, beibehalten, nachdem der Prodrug-Transportteil hydrolysiert wurde.
Proteine, Polypeptide und Peptide von Interesse schließen Hämoglobin, Serumproteine wie Blutfaktoren, einschließlich die Faktoren VII, VIII und IX; Immunglobuline, Cytokine wie Interleukine, d.h. IL-1- bis IL-13,α-, β- und γ, und Konsensinterferone, Kolonie-stimulierende Faktoren, einschließlich Granulocytkolonie-stimulierende Faktoren, Plättchen-abgeleitete Wachstumsfaktoren und Phospholipase-aktivierendes Protein (PLAP) ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Andere Proteine von allgemeinem biologischem oder therapeutischen Interesse schließen Insulin, Pflanzenproteine wie Lectine und Rizine, Tumornekrosefaktoren und verwandte Proteine, Wachstumsfaktoren wie transformierende Wachstumsfaktoren wie TGFα's oder TGFβ's und epidermale Wachstumsfaktoren, Hormone, Somatomedine, Erythropoietin, pigmentäre Hormone, hypothalmische Freisetzungsfaktoren, antidiuretische Hormone, Prolactin, chorionisches Gonadotropin, Follikel-stimulierendes Hormon, Thyroid-stimulierendes Hormon, Gewebeplasminogenaktivator und dergleichen ein. Immunglobuline von Interesse schließen IgE, IgM, IgA, IgD und Fragmente davon ein.
Einige Proteine wie die Interleukine, Interferone oder Kolonie-stimulierende Faktoren liegen gewöhnlich infolge der Verwendung von rekombinanten Techniken auch in nicht glycosylierter Form vor. Die nicht glycosylierten Versionen befinden sich ebenfalls unter den Proteinen der vorliegenden Erfindung.
Enzyme von Interesse schließen kohlenhydraspezifische Enzyme, proteolytische Enzyme, Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerase und Ligasen ein. Ohne auf besondere Enzyme beschränkt zu sein, schließen Beispiele für Enzyme von Interesse Asparaginase, Arginase, Arginindeaminase, Adenosindeaminase, Superoxiddismutase, Endotoxinasen, Katalasen, Chymotrypsin, Lipasen, Uricasen, Adenosindiphosphatase, Tyrosinasen und Bilirubinoxidase ein. Kohlenhydratspezifische Enzyme von Interesse schließen Glucoseoxidasen, Glucodasen, Galactosidasen, Glucocerbrosidasen, Glucouronidasen usw. ein.
Ebenfalls eingeschlossen hier ist ein beliebiger Teil eines Polypeptids der in in vivo Bioaktivität zeigt. Dieser schließt Aminosäuresequenzen, Nukleinsäuren (DNA, RNA), Peptidnukleinsäuren (PNA), Antikörperfragmente, einkettige Bindungsproteine, ein, siehe z.B. U.S. Patent Nr. 4,946,778, wobei die Offenbarung davon hier unter Bezugnahme eingebracht ist, Bindungsmoleküle, einschließlich Fusionen von Antikörpern oder Fragmenten, polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper und katalytische Antikörper ein.
Die Proteine oder Teile davon können unter Verwendung von dem Fachgebiet bekannten Techniken wie Gewebekultur, Extraktion von tierischen Quellen oder durch rekombinante DNA-Methodiken hergestellt oder isoliert werden. Transgene Quellen der Proteine, Polypeptide, Aminosäuresequenzen und dergleichen sind ebenfalls erwogen. Derartige Materialien werden von transgenen Tieren, d.h. Mäusen, Schweinen, Kühen usw. erhalten, in welchen die Proteine in Milch, Blut oder Geweben exprimiert werden. Transgene Insekten und Baculovirusexpressionssysteme werden ebenfalls als Quellen erwogen. Darüber hinaus liegen auch mutante Versionen von Proteinen wie mutante Interferone im Umfang der Erfindung.
Andere Proteine von Interesse sind Allergenproteine wie Ambrosie, Antigen E, Honigbienenvenom, Milbenallergien und dergleichen. Vorstehendes dient als Veranschaulichung für die Proteine, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind. Es ist klar, dass diejenigen hier definierten Proteine, die nicht besonders erwähnt sind, jedoch eine verfügbare Aminogruppe aufweisen, ebenfalls im Umfang der vorliegenden Erfindung liegen sollen.
In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung ist die aminhaltige Verbindung eine biologisch aktive Verbindung, die zur medizinischen oder diagnostischen Verwendung bei der Behandlung von Tieren, z.B. Säugern, einschließlich Menschen für Zustände, für welche eine derartige Behandlung erwünscht ist, geeignet ist. Die vorstehende Liste dient der Veranschaulichung und stellt keine Beschränkung auf die Verbindungen, die modifiziert werden können, dar. Der Fachmann erkennt, dass andere derartige Verbindungen gleichermaßen ohne übermüßige Versuchsführung modifiziert werden können. Es sollte klar sein, dass diejenigen biologischen aktiven Materialien, die nicht besonders erwähnt sind, jedoch geeignete Aminogruppen aufweisen, ebenfalls im Umfang der vorliegenden Erfindung liegen sollen.
Die einzige Beschränkung für die aminhaltigen Molekültypen, die zum Einschluss hier geeignet sind, liegt darin, dass mindestens eine (primäre oder sekundäre) aminhaltige Position verfügbar ist, die mit einem Trägerteil reagieren und diesen binden kann, und kein wesentlicher Verlust an Bioaktivität vorliegt, nachdem das Doppelprodrugsystem die Ausgangsverbindung freigesetzt und wieder hergestellt hat.
3. Reste von hydroxyhaltigen Verbindungen
a. Camptothecin und verwandte Topoisomerase-I-Hemmstoffe
Camptothecin ist ein unlösliches cytotoxisches Alkaloid, das durch Bäume des Typs Camptotheca accuminata, die in China heimisch sind, und Bäume des Typs Nothapodytes foetida, die in Indien heimisch sind, hergestellt wird. Camptothecin und verwandte Verbindungen und Analoga sind als potentielle Antikrebs- oder Antitumormittel bekannt und es zeigte sich, dass sie diese Aktivitäten in vitro und in vivo aufweisen. Camptothecin und verwandte Verbindungen sind auch Kandidaten für die Umwandlung der Doppelprodrugs der vorliegenden Erfindung.
Camptothecin und bestimmte verwandte Analoga teilen sich die Struktur:
Aus dieser Kernstruktur wurden etliche bekannte Analoga hergestellt. Zum Beispiel kann der A-Ring in einer der beiden oder beiden 10- und 11-Position mit einem OH substituiert werden. Ein A-Ring kann auch in der 9-Position mit einem geradkettigen oder verzweigten C_1-30-Alkyl oder C_1-17-Alkoxy substituiert werden, das wahlweise durch ein Heteroatom d.h., O oder S an den Ring gebunden ist. Der B-Ring kann in der 7-Position mit einem geradkettigen oder verzweigten C_1-30- Alkyl oder substituiertem Alkyl, C_5-8-Cycloalkyl, C_1-30-Alkoxy, Phenylalkyl usw., Alkylcarbamat, Alkylcarbaziden, Phenylhydrazinderivaten, Amino, Aminoalkyl, Aralkyl, usw. substituiert sein. Andere Substitutionen sind in den C-, D- und E-Ringen möglich. Siehe z.B. die U.S. Patente Nr. 5,004,758; 4,943,579; RE 32,518, wobei der Inhalt davon hier unter Bezugnahme eingebracht ist. Derartige Derivate können ohne übermäßige Versuchsführung unter Verwendung von bekannten Synthesetechniken hergestellt werden. Bevorzugte Camptothecin-Derivate zur Verwendung hier schließen diejenigen ein, die eine 20-OH- oder eine andere OH-Einheit, die direkt mit aktivierten Formen des hier beschriebenen Polymer-Transportsystems oder an den Zwischenverbindungen der Verbindungseinheit reagieren kann, z.B. Iminodiessigsäure usw., einschließen, die dann an ein Polymer wie PEG angelagert werden. Ein Bezug auf Camptothecin-Analoga hier wurde zum Zwecke der Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung durchgeführt.
b. Taxane und Paclitaxel-Derivate
Bei einer Verbindungsklasse die in den Doppelprodrug-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind, handelt es sich um Taxane. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung schließt der Begriff „Taxan" alle Verbindungen in der Taxanfamilie der Terpene ein. Folglich liegen Taxol (Paclitaxel), 3'-substituierte Terts-butoxycarbonylamindeerivate (Tacotere) und dergleichen sowie andere Anlaloga, die unter Verwendung von organischen Standardtechniken leicht synthetisiert werden oder von handelsüblichen Quellen wie Sigma Chemical, St. Louis, Missouri, erhältlich sind, im Umfang der vorliegenden Erfindung. Repräsentative Taxane sind nachstehend dargestellt.
Es wurde gefunden, dass die Derivate wirksame Antikrebsmittel sind. Zahlreiche Studien weisen darauf hin, dass die Mittel Aktivität gegen etliche bösartige Tumore aufweisen. Bis heute war deren Verwendung unter anderem durch deren kurze Zufuhr, schlechte Wasserlöslichkeit und Überempfindlichkeit stark beschränkt. Es sollte klar sein, dass andere Taxane, einschließlich die in den allgemein erteilten U.S. Patenten Nr. 5,622,986 und 5,547,981 offenbarten 7-Arylcarbamate und 7-Carbazate ebenfalls in die Doppelprodrugs der vorliegenden Erfindung eingeschlossen werden können. Die Inhalte der vorstehenden U.S.-Patente sind hier unter Bezugnahme eingebracht. Die einzige Beschränkung für das Taxan ist, dass es sich einer Substitutionsreaktion auf Hydroxybasis wie an der 2'-Position unterziehen kann. Paclitaxel ist jedoch ein bevorzugtes Taxan.
c. Zusätzliche biologischaktive Einheiten
Zusätzlich zu den vorstehenden Molekülen können die Doppelprodrug-Formulierungen der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von vielen anderen Verbindungen hergestellt werden. Zum Beispiel können biologischaktive Verbindungen wie Gemcitabin
oder Etoposid
oder Antipilzmittel auf Triazol-Basis wie Fluconazol
oder Ciclopirox
verwendet werden.
Die für Doppelprodrug-Formen ausgewählten Ausgangsverbindungen müssen im Wesentlichen nicht wasserunlöslich sein, obwohl deren Doppelprodrugs auf Polymer-Basis der vorliegenden Erfindung zur Abgabe derartiger wasserunlöslicher Verbindungen besonders gut geeignet sind. Andere nützliche Ausgangsverbindungen schließen z.B. bestimmte biologisch aktive Proteine, Enzyme und Peptide mit niedrigem Molekulargewicht, einschließlich Peptidoglycane, sowie andere Antitumormittel; kardiovaskuläre Mittel wie Forskolin; Antineoplastika wie Combretastatin, Vinblastin, Doxurubicin, Ara-C, Maytansin usw.; Antiinfektionsmittel wie Vancomycin, Erythromycin usw.; Antipilzmittel wie Nystatin, Amphoteracin B, Triazole, Papulocandine, Pneumocandine, Echinocandine, Polyoxine, Nikkomycine, Pradimicine, Benanomicine usw., siehe „Antibiotics That Inhibit Fungal Cell Wall Development" Annu. Rev. Microbiol. 1994, 48:471-97, wobei die Inhalte davon hier unter Bezugnahme eingebracht sind; Antiangstmittel, gastrointestinale Mittel, das zentrale Nervensystem aktivierende Mittel, Analgetika, Fruchtbarkeits- oder Empfängnisverhütungsmittel, Antientzündungsmittel, steroide Mittel, antiurecämische Mittel, kardiovaskuläre Mittel, gefäßverdünnende Mittel, gefäßkontrahierende Mittel und dergleichen ein.
Es wird angemerkt, dass die zum Einbringen in die Doppelprodrug-Zusammensetzungen der Erfindung geeigneten Ausgangsverbindungen selbst Substanzen/Verbindungen sein können, die nach hydrolytischer Freisetzung von der angebundenen Zusammensetzung nicht aktiv sind, jedoch nach dem Unterziehen einem weiteren chemischen Verfahren/einer weiteren chemischen Reaktion aktiv werden. Zum Beispiel kann ein durch das Doppelprodrug-Transportsystem an den Blutstrom abgegebenes Antikrebsarzneimittel inaktiv bleiben, bis es in eine Krebs- oder Tumorzelle eintritt, worauf es durch die chemischen Vorgänge der Krebs- oder Tumorzelle, z.B. durch eine für die Zelle einzigartige enzymatische Reaktion aktiviert wird.
Nach Konjugation wird die verbliebene Amin- oder hydroxyhaltige Verbindung als Rest der unkonjugierten Verbindung bezeichnet.
4. Polymere Hybride
In einem anderen Aspekt der Erfindung sind Hybridtypen des hier beschriebenen polymeren Doppelprodrug-Systems bereitgestellt. Insbesondere schließt das Hybridsystem nicht nur das umkehrbare Doppelprodrug-System, sondern auch ein zweites polymeres System auf der Basis von beständigeren Bindungstypen ein. Die Hybride können durch mindestens zwei Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel kann das Doppelprodrug-Protein-Konjugat auf Trialkylsperr-Basis zuerst synthetisiert und dann unter Verwendung eines beliebigen auf dem Fachgebiet bekannten aktivierten Polymers wie Thiazolidinylthion oder Succinimidylcarbonat-aktiviertem PEG-yliert werden. Alternativ dazu kann die beständigere Konjugationsreaktion zuerst durchgeführt werden (d.h. die Ausgangsverbindung wird PEG-yliert) und können die erhaltenen Konjugate zum Bilden der hier beschriebenen Trialkylsperr-Doppelprodrug-Konjugate verwendet werden. Es ist klar, dass die Hybridsysteme für Proteine, Enzyme und dergleichen besser geeignet sind, in welchen mehrere Aminogruppen oder eine Kombination von Amino- oder Hydroxylgruppen zur Anlagerung für die polymere Prodrug verfügbar sind. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind „aktivierte Polymere" so zu verstehen, dass sie Polymere einschließen, die eine oder mehrere terminale Gruppen enthalten, die mit einer oder mehreren von α-Aminogruppen, ε-Aminogruppen, Histidinstickstoffen, Carboxygruppen, Sulfhydrylgruppen usw., die auf Enzymen, Proteinen usw. zu finden sind, sowie derartigen Gruppen, die auf synthetisch hergestellten organischen Verbindungen zu finden sind, reagieren können.
Die aktivierende terminale Einheit kann eine beliebige Gruppe sein, die die Konjugation der Polymere mit dem biologisch aktiven Material, d.h. dem Protein, En zym usw. erleichtert, entweder vor oder nachdem das Doppelprodrug-System der vorliegenden Erfindung synthetisiert wurde. Siehe z.B. das U.S.-Patent Nr. 4,179,337, wobei die Offenbarung davon hier unter Bezugnahme eingebracht ist. Derartige aktivierende Gruppen können eine Einheit sein, ausgewählt aus:

I. Funktionellen Gruppen, die mit einer Aminogruppe reagieren können, wie:
a) Carbonaten wie dem p-Nitrophenyl oder Succinimidyl; siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5,122,614, wobei die Offenbarung davon hier unter Bezugnahme eingebracht ist;
b) Carbonylimidazol;
c) Azlactonen, siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5,321,095, wobei die Offenbarung hier unter Bezugnahme eingebracht ist;
d) cyclischen Imidthionen, siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5,349,001, wobei die Offenbarung davon hier unter Bezugnahme eingebracht ist; oder
e) Isocyanaten oder Isothiodyanaten,
f) aktiven Estern wie N-Hydroxysuccinimidyl oder N-Hydroxybenzotriazolyl.
II. Funktionellen Gruppen, die mit Carbonsäuregruppen und reaktiven Gruppen reagieren können, wie
a) primären Aminen; oder
b) Hydrazid oder hydrazidfunktionellen Gruppen wie die Acylhydrazide, Carbazate, Semicarbamate, Thiocarbazate usw.
III. Funktionellen Gruppen, die mit Mercapto- oder Sulfhydrylgruppen reagieren können, wie Maleimide; siehe z.B. den Katalog „Polyethylene Glycol Derivatives 1997-1998" von Shearwater Polymers, wobei die Offenbarung davon hier unter Bezugnahme eingebracht ist;
IV. Funktionellen Gruppen, die mit Hydroxygruppen reagieren können, wie (Carbon)säuren oder Nucleophilen, die mit einem elektrophilen Zentrum reagieren können, wie Isocyanat, aktivierte Ester oder Carbonate, cyclische Imide, Thione usw..

Die aktivierende Einheit kann auch eine Abstandhaltereinheit einschließen, die sich in der Nähe des Polymers befindet. Die Abstandhaltereinheit kann ein bis zu 18 Kohlenstoffatomen enthaltendes Heteroalkyl, Alkoxy, Alkyl oder auch eine zusätzliche Polymerkette sein. Die Abstandhaltereinheiten können unter Verwendung von Standardsynthesetechniken addiert werden.
H. BEHANDLUNGSVERFAHREN
Die vorliegende Erfindung ermöglicht Behandlungsverfahren für verschiedene medizinische Zustände in Säugern. Die Verfahren schließen das Verabreichen einer wirksamen Menge einer wie hier beschriebenen Zusammensetzung der Erfindung wie einer Doppelprodrug von Doxorubicin an einen eine derartige Behandlung benötigenden Säuger ein. Die Prodrug-Zusammensetzungen sind unter anderem zum Behandeln von Erkrankungen nützlich, die denjenigen ähneln, die mit den Ausgangsverbindungen behandelt werden, z.B. Enzymersatztherapie, neoplastischer Erkrankung, Reduzieren eines Tumorleidens, Verhindern der Metastasenbildung von Neoplasmen und Verhindern des erneuten Auftretens von Tumor-/neoplastischem Wachstums in Säugern.
Die verabreichte Prodrug-Menge hängt von der Menge des darin eingeschlossenen Ausgangsmoleküls ab. Im Allgemeinen ist die in den Behandlungsverfahren verwendete Prodrug-Menge diejenige Menge, die in Säugern wirksam das gewünschte therapeutische Ergebnis erzielt. Natürlich variieren die Dosierungen der verschiedenen Prodrug-Verbindungen in gewissem Maße je nach Ausgangsverbindung, Geschwindigkeit der in vivo-Hydrolyse, Molekulargewicht des Polymers usw. Im Allgemeinen werden Doppelprodrug-Polymerderivate von Stickstoffsenfderivaten in Mengen im Bereich von etwa 5 bis etwa 500 mg/m² pro Tag verabreicht. Der vorstehende dargelegte Bereich dient der Veranschaulichung, und der Fachmann bestimmt die optimale Dosierung der ausgewählten Prodrug auf der Basis der klinischen Erfahrung und der Behandlungsindikation. Tatsächliche Dosierungen sind dem Fachmann ohne übermäßige Versuchsführung klar.
Die Prodrugs einschließenden Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in einem oder mehreren geeigneten Arzneimitteln zur Verabreichung an Säuger eingeschlossen sein. Die Arzneimittel können in Form einer gemäß auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellten Lösung, Suspension, Tablette, Kapsel oder dergleichen vorliegen. Es wird auch erwogen, dass die Verabreichung derartiger Zusammensetzungen je nach den Bedürfnissen des Fachmanns durch den oralen und/oder parenteralen Weg erfolgen kann. Eine Lösung und/oder Suspension der Zusammensetzung kann z.B. als Trägervehikulum für eine Injektion oder Infiltration der Zusammensetzung durch beliebige auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren, z.B. durch intravenöse, intramuskuläre, subdermale Injektion und dergleichen verwendet werden.
Eine derartige Verabreichung kann auch durch Infusion in einen Körperraum oder -hohlraum sowie durch Inhalation und/oder intranasale Wege erfolgen. Vorzugsweise jedoch werden die Prodrugs parenteral an dies benötigende Säuger verabreicht.
I. BEISPIELE
Die folgenden Beispiele dienen dem Bereitstellen eines weiteren Verständnisses der Erfindung, sollen jedoch in keinster Weise den wirksamen Umfang der Erfindung beschränken. Die in den Beispielen genannten unterstrichenen und fettgedruckten Zahlen entsprechen denjenigen, die in den Figuren dargestellt sind.
Beispiel 1
Verbindung 2: Trifluoressigsäuresalz des Alaninesters von 3-(2'-Hydroxy-4',6'-dimethylphenyl)-3,3-dimethylpropionnsäure
1 g (2,54 mmol) t-Boc-Alaninester von 3-(2'-Hydroxy-4',6'-dimethylphenyl)-3,3-dimethylpropionsäure, 1, (synthetisiert unter Verwendung des Verfahrens von J. Org. Chem. 1997, 62, 1363.) wurde in 20 ml TFA-CH₂Cl₂ (1:1 V/V) bei Raumtemperatur für eine Dauer von 2 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und Ether wurde dem Rückstand zugesetzt, um 2 auszufällen (0,6873 g, 67%).
¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃) δ 1,41 (3H, s, C(DH₃)₂), 1,42 (3H, s, C(CH₃)₂), 1,54 (3H, d, J=8,1 Hz, CHCH₃), 2,21 (3H, s, Ar-CH₃), 2,45 (3H, s, Ar.CH₃), 2,65 (2H, s, CH₂COOH), 4,36 (1H, d, J=8,1 Hz, CH-CH₃), 6,57 (1H, s, Ar-H), 6,81 (1H, s, Ar-H).
¹³C-NMR (67,80 MHz, CDCl₃) δ 15,27 (Ar-CH₃), 19,57 (Ar-CH₃), 24,66 CHCH₃), 30,92 (C(CH₃)₂), 38,28 (CH₂COOH), 47,32 (C(CH₃)₂), 48,45 (CHCH₃), 122,23, 132,30, 133,97, 135,61, 138,05, 149,10 (Ar), 169,50 (-COOAr), 172,50 (COOH).
Beispiel 2
Verbindung 4: Kupplung von 2 mit SC-PEG (5 kDa), 3
2 g (0,39 mmol) SC-PEG (5 kDa), 3, wurde dem Gemisch aus 175,8 mg (0,6 mmol) von 2 und 280 μl (1,5 mmol) von N,N-Diisopropylethylamin (DIPEA) in 40 ml wasserfreiem Dichlormethan (DCM) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt und das Produkt aus 80 ml 2-Propanol kristallisiert, um 1,86 g (93%) 4 als weißen Feststoff zu erhalten.
¹³C-NMR (67,80 MHz, CDCl₃) δ 16,01 (Ar-CH₃), 18,94 (Ar-CH₃), 24,07 (C(HCH₃), 30,11 (C(CH₃)₂), 30,20 (C(CH₃)₂), 37,49 (CH₂COOH), 46,04 (C(CH₃)₂), 49,11 (CHCH₃), 57,59 (OCH₃), 62,86-70,68 (PEG), 121,37, 131,04, 132,80, 134,54, 136,71, 148,62 (Ar), 154,80 (OC(=O)NH), 170,82 (-COOAr), 171,27 (COOH).
Beispiele 3
Verbindung 6: Kupplung von 4 mit Daunorubicin-Hydrochlorid, 5.
38,4 mg (0,2 mmol) 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC) wurde dem Gemisch aus 0,5 g (0,1 mmol) 4, 84,6 mg (0,15 mmol) Dauno rubicin-Hydrochlorid, 5,40,4 mg (0,4 mmol) N-Methylmorpholin (NMM) und 20,3 mg (0,2 mmol) 1-Hydroxybenzotriazolhydrat (HOBT) in 10 ml wasserfreiem DCM bei 0°C zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand aus 20 ml 2-Propanol umkristallisiert, um 0,44 g (88%) 6 zu erhalten. Ein UV-Test zeigte ein 0,7-Äquivalent (70% der Kupplungsausbeute) von 5.
¹³C-NMR (67,80 MHz, CDCl₃) δ 15,66, 15,81, 18,96, 23,56, 24,45, 29,96, 30,78, 30,84, 32,32, 33,65, 38,61, 44,13, 17,78, 49,45, 55,48, 57,73, 63,17-75,35 (PEG), 99,79, 109,81, 109,94, 117,75, 117,80, 118,37, 119,26, 121,45, 131,39, 133,02, 133,21, 133,92, 134,74, 134,78, 134,85, 135,04, 137,30, 148,88, 154,36, 155,17, 155,41, 159,84, 169,36, 171,81, 185,14, 185,33, 210,58.
Beispiel 4
Verbindung 8: Kupplung von 2 mit mPEG(5 kDa)-Thiazolidinthion, 7
0,5 g (0,1 mmol) mPEG (5 kDa) Thiazolidinthion wurden dem Gemisch aus 44 mg (0,15 mmol) 2 und 70 μl (0,4 mmol) DIPEA in 10 ml wasserfreiem DCM bei Raumtemperatur zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt und der Rückstand aus 2-Propanol umkristallisiert, um 0,44 g (88%) des Produkts als weißen Feststoff zu erhalten.
¹³C-NMR (67,80 MHz, CDCl₃) δ 16,22, 19,17, 24,29, 30,37, 37,71, 46,37, 47,29, 57,85, 67,40-72,38 (PEG), 121,58, 131,38, 134,85, 136,99, 148,75, 169,08, 170,53, 171,50.
Beispiel 5
Verbindung 9: Kupplung von 8 mit 5
39 mg (0,2 mmol) EDC werden dem Gemisch aus 0,5 g (0,1 mmol) 8, 85 mg (0,15 mmol) 5, 40 mg (0,4 mmol) NMM und 20 mg (0,2 mmol) HOBT in 10 ml wasserfreiem DCM bei 0°C zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und filtriert. Das Filtrat wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand aus 20 ml 2-Propanol umkristallisiert, um 0,45 g (90%) 9 zu erhalten.
Beispiel 6
Verbindung 11: Kupplung von 2 mit PEG(40 kDa)-Dithiazolidinthion, 10
1 g (0,025 mmol) PEG (40 kDa) Dithiazolidinthion, 10 wurde dem Gemisch aus 29 mg (0,099 mmol) 2 und 36,6 μl (0,20 mmol) DIPEA in 15 ml wasserfreiem DCM zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt und der Rückstand aus 2-Propanol umkristallisiert, um 0,8 g (80%) 11 als weißen Feststoff zu erhalten.
¹³C-NMR (67,80 MHz, CDCl₃) δ 16,90, 19,48, 24,45, 30,81, 38,34, 46,83, 47,87, 68,52-72,82 (PEG), 76,19, 77,83, 122,00, 131,77, 133,76, 135,40, 137,51, 149,46, 169,28, 170,88, 171,55.
Beispiel 7
Verbindung 12: Kupplung von 11 mit 5
94,5 mg (0,492 mmol) EDC wurden dem Gemisch aus 2,5 g (0,0615 mmol) 11 (40 kDa), 208 mg (0,3688 mmol) 5, 99,4 mg (0,984 mmol) NMM und 49,8 mg (0,369 mmol) HOBT in 50 ml wasserfreiem DCM bei 0°C zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand aus 2-Propanol (200 ml) umkristallisiert, um 2,3 g (92%) 12 zu erhalten. Ein UV-Test zeigte ein 1,9-Äquivalent (95% Kupplungsausbeute) von 5.
¹³C-NMR (67,80 MHz, CDCl₃) δ 16,14, 19,31, 23,55, 24,63, 28,80, 31,15, 32,78, 34,77, 39,23, 44,97, 48,12, 56,18, 66,80-75,95 (PEG), 100,14, 110,93, 118,68, 119,13, 121,81, 131,88, 133,86, 134,02, 135,03, 137,96, 149,56, 155,20, 160,73, 169,73, 170,22, 171,34, 186,05, 210,41.
Beispiel 8
Verbindung 14: Kupplung von 11 mit p-Amino(N,N-di-2-chlorethyl)anilin-Hydrochlorid, 13
37,8 mg (0,20 mmol) EDC wurden dem Gemisch aus 1,0 g (0,025 mmol) 4 (40kDa), 39,8 mg (0,15 mmol) p-Amino-(N,N-di-2-chlorethyl)anilin-Hydrochlorid 13 (synthetisiert unter Verwendung eines modifizierten Verfahrens von Edwards et al. Cytotoxic Compunds, Teil XVII, o-, m- und p-(Bis-2-chloroethylamino)phenol, p-[N-(2-Chloroethyl)methylamino]phenol, N,N-Bis-2- chloroethyl-p-phenylendiamine and N,N-Bis-2-chloroethyl-N'-methyl-p-phenylendiamine as Sources of Biologically Active Carbamates, JCS Perkin 1, 1973, 2397), 39,7 mg (0,39 mmol) NMM und 19,9 mg (0,15 mmol) HOBT in 20 ml wasserfreiem DCM bei 0°C zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand aus 2-Propanol (100 ml) umkristallisiert, um 2,8 g (80%) 14 zu erhalten. Ein UV-Test zeigte ein 1,5-Äquivalent (75% Kupplungsausbeute) des aromatischen Stickstoffsenfs.
¹³C-NMR (67,80 MHz, CDCl₃) δ 15,63, 19,35, 24,86, 30,99, 31,10, 39,12, 39,81, 47,99, 48,36, 52,84, 67,79-71,79 (PEG), 111,59, 130,97, 121,57, 129,04, 131,86, 133,83, 135,38, 137,93, 141,53, 149,12, 168,37, 170,25, 171,66.
Beispiel 9
Verbindung 15: Kupplung von 11 mit 2-Mercaptothiazolin
3 g (0,074 mmol) 11 wurden in 60 ml Toluol durch Destillation von 20 ml Toluol für eine Dauer von 2 Stunden azeotropiert. Die Lösung wurde auf 35°C abgekühlt, und 47 mg (0,37 mmol) Oxalylchlorid und 2 μl DMF wurden zugesetzt. Die Lösung wurde bei 35-40°C für eine Dauer von 4 Stunden gerührt, gefolgt von der Zugabe von 53 mg (0,44 mmol) 2-Mercaptothiozolin und 32 mg (0,44 mmol) DIPEA. Das Gemisch wurde über Nacht unter Rückfluss gekocht und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde aus 250 ml 2-Propanol umkristallisiert, um 15 (2,72 g, 90%) als weißen Feststoff zu erhalten.
¹³C-NMR (67,80 MHz, CDCl₃) δ 16,38, 19,28, 24,63, 27,54, 31,06, 31,15, 39,00, 47,37, 51,56, 55,32, 67,48-71,10 (PEG), 121,52, 131,43, 132,63, 134,86, 137,20, 148,79, 168,82, 170,90, 171,86, 200,58.
Beispiel 10
Verbindung 17: Kupplung von 11 oder 15 mit Doxorubicin-Hydrochlorid, 16
Kupplung von 11 mit Doxorubicin, 16: Ein Gemisch aus 1,25 g (0,031 mmol) 11, 105 mg (0,18 mmol) Doxorubicin-HCl, 16, 50 mg (0,50 mmol) NMM, 25 mg (0,18 mmol) HOBT und 50 mg (0,25 mmol) EDC in 15 ml wasserfreiem DCM wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand aus 2-Propanol umkristallisiert, um 850 mg (68%) 17 zu erhalten. Ein UV-Test zeigte ein 1,64-Äquivalent (82% Kupplungsausbeute) von 16.
Kupplung von 15 mit 16: Ein Gemisch aus 0,25 g (0,006 mmol) 15, 40 mg (0,07 mmol) 16 und 25 mg (0,20 mmol) Dimethylaminopyridin (DMAP) in 10 ml wasserfreiem DCM wurde über Nacht unter Rückfluss gekocht. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand aus 2-Propanol umkristallisiert, um 0,23 mg (92%) 17 zu erhalten. Ein UV-Test zeigte ein 1,82-Äquivalent (91% Kupplungsausbeute) von 16.
¹³C-NMR (67,80 MHz, CDCl₃) δ 15,21, 15,83, 18,75, 24,39, 27,81, 30,60, 30,63, 32,27, 34,80, 38,71, 43,90, 46,71, 47,87, 55,48, 64,27, 66,05, 67,43-71,05 (PEG), 75,69, 99,38, 109,47, 117,46, 118,68, 118,92, 120,45, 127,10, 131,70, 133,17, 132,89, 133,45, 133,75, 134,50, 137,44, 148,88, 145,41, 154,81, 159,69, 169,16, 170,15, 170,98, 185,20, 212,40.
Beispiel 11
Verbindung 18: Kupplung von 8 mit N-Hydroxysuccinimid
2,5 g (0,47 mmol) 8 und 108 mg (0,94 mmol) N-Hydroxysuccinimid wurden in 40 ml wasserfreiem DCM bei 0°C gelöst. 114 mg (0,94 mmol) DMAP und 118 mg (0,94 mmol) DIPC wurden dem Gemisch zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand aus 2-Propanol umkristallisiert, um 2,1 mg (84%) 18 als weißen Feststoff zu erhalten.
¹³C-NMR (67,80 MHz, CDCl₃) δ 16,38, 19,46, 24,47, 24,75, 30,11, 30,36, 38,21, 43,66, 47,58, 58,12, 67,97-71,13 (PEG), 121,81, 131,80, 131,93, 135,68, 137,01, 148,89, 165,55, 169,34, 171,03.
Beispiel 12
Verbindung 20: Konjugation von 18 an (L)-Asparaginase
450 mg (0,083 mmol, 317 Äquiv.) PEG-Verbindungsgruppe, 18, werden zu 37,5 mg (416 μl, 0,00027 mmol) nativer (L)-Asparaginase, 19, in 3 ml Natriumphosphatpuffer (0,1 M, pH 7,8) unter sanftem Rühren zugesetzt. Die Lösung wird bei 30°C für eine Dauer von 30 Minuten gerührt. Eine GPC-Säule (Zorbax GF-450) wird zum Überwachen der PEG-Konjugation verwendet: Das PEG-Asp-Konjugat weist eine Retentionszeit von 8,5 Minuten auf. Am Ende der Reaktion (wie durch die Abwesenheit von nativem Enzym nachgewiesen) wurde das Gemisch mit 12 ml Formulierungspuffer (0,05 M Natriumphosphat, 0,85%ige Natriumchloridlösung, pH 7,3) verdünnt und mit einem Centriprep-Konzentrator (Amicon) mit einem Molekulargewichtsabschnitt von 50.000 Dalton zum Entfernen des nicht umgesetzten PEG diafiltriert. Die Diafiltration wird nach Bedarf bei 4°C fortgesetzt, bis durch Mischen einer gleichen Menge von Filtrat und 0,1 % PMA (Polymethacrylsäure in 0,1 M HCl) kein freies PEG mehr nachgewiesen wird.
Das Produkt 20 ist in basischer Pufferlösung für längere Zeitdauern nicht stabil, weshalb die Lösung lyophilisiert und 20 in einem Gefrierschrank (–20°C) aufbewahrt wird. Nach 15-tägiger Aufbewahrung auf diese Weise weist eine GPC-Analyse auf weniger als eine 0,8%ige Zersetzung hin. Die spezifische Aktivität von frisch hergestelltem 20 wird als 137 IU/mg (native Asparaginase = 217 IU/mg) befunden. Eine Proteinmodifikation von Asparaginase mit SS-PEG (eine beständige Verbindungsgruppe) unter Verwendung eines Verfahrens, entsprechend demjenigen, beschrieben in dem vorstehend erwähnten U.S. Patent Nr. 4,179,337, liefert eine ähnliche Aktivität von 120 IU/mg. Ein TNBS-Test wird zum Berechnen der prozentualen Modifikation des Proteins verwendet, und der Biuret-Test wird zum Überprüfen der Proteinkonzentration verwendet.
Beispiel 13
Hydrolysekinetiken von 20 in Rattenplasma und Puffer
Die Hydrolysegeschwindigkeit von 20 in Rattenplasma wird unter Verwendung einer GPC-Säule (Zorbax GF-450) gemessen, und es wird gefunden, dass es eine Halbwertszeit von < 2 Stunden aufweist. Die Halbwertszeit im Phosphatpuffer (pH 7,4) wird als >> 2 Stunden bestimmt.
Beispiel 14
Verbindung 20A: Eine Proteinhybrid-Konjugation von 20 mit SS-PEG (einer beständigen Verbindungsgruppe)
393 mg (0,073 mmol, 70 Äquiv.) 18 werden mit 150 mg (1,664 ml, 0,00106 mmol) nativer (L)-Asparaginase, 19, in 30 ml Natriumphosphatpuffer (0,1 M, pH 7,8) wie in Beispiel 14 beschrieben bei 30°C für eine Dauer von 15 Minuten umgesetzt, um eine Lösung von 20 bereitzustellen, gefolgt von der Zugabe von 1,272 g (0,245 mmol, 230 Äquiv.) SS-PEG. Die Reaktionslösung wird für eine weitere Dauer von 15 Minuten gerührt. Der pH-Wert des Reaktionsgemischs wird mit 0,5 M Natriumhydroxidlösung bei 7,8 gehalten. Das Reaktionsgemisch wird mit 30 ml sterilem Wasser verdünnt und unter Verwendung eines Centriprep-Konzentrators (Amicon) mit einem Molekulargewichtsabschnitt von 50.000 Dalton zum Entfernen von jeglichem nicht umgesetzten PEG diafiltriert. Die Diafiltration wird nach Bedarf bei 4°C fortgesetzt, bis durch Mischen einer gleichen Menge an Filtrat und 0,1 %igem PMA (Polymethacrylsäure in 0,1 M HCl) kein freies PEG mehr nachgewiesen wird. Eine GPC-Säule (Zorbax GF-450) wird verwendet, um den Reaktionsverlauf zu verfolgen. Die Endlösung von Produkt 20A wird lyophilisiert und in einem Gefrierschrank aufbewahrt.
Beispiel 15
Verbindung 20B: Demonstration der selektiven Entfernung von umkehrbarer PEG-Verbindungsgruppe von dem Hybrid, 20A – Erzeugung einer beständig modifizierten Asparaginase, 20B
100 mg mit Hybridverbindungsgruppe modifizierter Asparaginase, 20A, werden in 30 ml Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,8 gelöst und bei 30°C über Nacht gerührt. Diese Lösung wird mit 30 ml sterilem Wasser verdünnt und mit einem Centriprep-Konzentrator (Amicon) mit einem Molekulargewichtsabschnitt von 50.000 Dalton zum Entfernen des freien PEG, das durch die selektive Abspaltung der umkehrbaren PEG-Verbindungsgruppe 8 von dem Konjugat gebildet wurde, diafiltriert. Die Lösung enthält nun einzig SS-PEG-konjugierte Asparaginase, 20B. Folglich wird die umkehrbare Verbindungsgruppe hydrolysiert, indem nur das relativ beständig gebundene PEG, angelagert an Asparaginase, zurückbleibt.
Beispiel 16
Verbindung 22: t-Boc-Prolinester von 1-O-t-Butyldimethylsilyl-3-(2'-hydroxy-4',6'-dimethylphenyl)-3,3-dimethylpropanol, 21
392 mg (3,11 mmol) DIPC wurden einem Gemisch aus 0,5 g (1,55 mmol) 1-O-t-Butyldimethylsilyl-3-(2'-hydroxy-4',6'-dimethylphenyl)-3,3-dimethylpropanol, 21 (synthetisiert unter Verwendung des Verfahrens von R. T. Borchardt, et al. Amine Prodrugs Which Utilize Hydroxy Amide Lactonization. II. A Potential Esterase-Sensitive Amide Prodrug. Pharmaceu. Res. 1991, 8, 455), 568 mg (4,66 mmol) DMAP und 668 mg (3,11 mmol) t-Boc-Prolin-OH in 15 ml wasserfreiem DCM bei 0°C zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie über Silicagel (Ethylacetat-Hexan = 3:7, V/V) gereinigt, um 700 mg (87%) 22 zu erhalten.
¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃) δ 0,04, (s, 3H, CH₃-Si), 0,14 (s, 3H, CH₃-Si), 0,88 (s, 3H, CH₃-C), 0,92 (s, 3H, CH₃-C), 1,51 (s, 9H, Si(CH₃)₃), 1,55 (s, 9H, C(CH₃)₃), 20,00 (m, 2H, CH₂O), 2,07 (t, 2H CH₂CH₂CH₂ J=8,1 Hz), 2,25 (s, 3H, PhCH₂), 2,55 (s, 3H, PhCH₃), 3,53 (t, 2H, CH₂N, J=8,1 Hz), 4,57 (bs, 1H, COCHN), 6,65 (bs, 1H, PhH), 6,82 (s, 1H, PhH).
¹³C-NMR (67,80 MHz, CDCl₃) δ 18,23, 20,06, 25,14, 25,70, 25,98, 28,49, 32,00, 32,06, 39,51, 46,24, 46,62, 59,74, 60,93, 80,08, 122,73, 132,14, 134,56, 135,87, 138,30, 150,68, 171,84.
Beispiel 17
Verbindung 23: t-Boc-Prolinester von 3-(2'-hydroxy-4',6'-dimethylphenyl)-3,3-dimethylpropanol
Eine Lösung von 2,82 g (5,43 mmol) 23 in 10 ml Tetrahydrofuran, 10 ml H₂O und 30 ml Eisessig wurde bei Raumtemperatur für eine Dauer von 1 Stunde gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um ein Rohprodukt 23 als farbloses Öl zu erhalten, das ohne weitere Reinigung dem nächsten Schritt zugeführt wurde.
¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃) δ 0,01, 0,77, 0,84, 1,38, 1,40, 1,42, 1,93, 1,97, 2,01, 2,13, 2,38, 2,43, 3,47, 4,48, 6,50, 6,70.
¹³C-NMR (67,80 MHz, CDCl₃) δ -3,71, 19,95, 20,29, 23,19, 25,06, 25,20, 25,59, 28,44, 31,78, 32,04, 32,27, 33,21, 39,33, 42,96, 46,01, 46,53, 46,62, 59,62, 60,22, 64,95, 66,59, 80,44, 103,87, 122,59, 132,04, 132,27, 134,23, 135,79, 135,89, 138,14, 150,37, 150,55, 154,52, 171,86, 175,10.
Beispiel 18
Verbindung 24: Oxidation des t-Boc-Prolinester von 3-(2'hydroxy-4',6'-dimethylphenyl)-3,3-dimehtylpropanol, 23
Eine Lösung von 2,5 g (6,2 mmol) 23 in 125 ml wasserfreiem Methylenchlorid wurde einer Lösung von 2,88 g (13,4 mmol) Pyridiniumchlorchromat in 125 ml wasserfreiem DCM zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für die Dauer von 1 Stunde gerührt, gefolgt von Filtration durch Celite. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand durch Silicagelsäulenchromatographie (Ethylacetat/Hexan = 3:7, V/V) gereinigt. Das Produkt, der Aldehyd, wurde in 25 ml Aceton gelöst und einer Lösung von 1 g (6,3 mmol) KMnO₄ in 25 ml Aceton-H₂O (1:1, V/V) zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. 40 ml H₂O wurden zugesetzt, und das Aceton wurde vor der Filtration durch Celite im Vakuum entfernt. Die wässrige Lösung wurde mit 1N HCl auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt, gefolgt von der Extraktion mit Ethylacetat (30 ml × 2). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und Hexan wurde zum Ausfällen von 24 (550 mg, 21% aus 23) zugesetzt.
¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃) δ 1,41, 1,46, 1,50, 1,52, 1,61, 1,97, 2,21, 2,30, 2,33, 2,54, 2,85, 3,56, 4,56, 6,57, 6,79.
¹³C-NMR (67,80 MHz, CDCl₃) δ 20,09, 24,13, 25,17, 28,14, 28,56, 29,87, 31,40, 31,57, 39,12, 46,79, 47,40, 59,76, 80,86, 122,56, 132,43, 134,04, 136,27, 138,29, 150,21, 171,87.
Beispiel 19
Verbindung 25: Trifluoressigsäuresalz des Prolinesters von 3-(2'Hydroxy-4',6'-dimethylphenyl)-3,3-dimehtylpropionsäure
0,55 g (1,31 mmol) t-Boc-Prolinester von 3-(2'Hydroxy-4',6'-dimethylphenyl)-3,3-dimehtylpropionsäure, 24, wurden in 10 ml TFA-CH₂Cl₂ (1:1, V/V) bei Raumtemperatur für eine Dauer von 1 Stunde gerührt. Das Lösungsmittel wurde vollständig im Vakuum entfernt, um 25 als gelben schaumigen Feststoff (0,436 g, 77%) zu erhalten.
¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃) δ 1,53, 1,55, 2,03, 2,19, 2,48, 2,59, 2,76, 3,32, 4,61, 6,54, 6,85, 9,80.
¹³C-NMR (67,80 MHz, CDCl₃) δ 13,86, 23,73, 24,86, 28,27, 31,70, 31,92, 38,99, 46,43, 47,76, 60,33, 122,25, 133,08, 133,74, 136,65, 138,89, 149,30, 168,35.
Beispiel 20
Verbindung 26: Kupplung von 25 mit PEG (40 kDa)-Dithiazolidinthion, 10
52,6 mg (0,41 mmol) DIPEA wurden der Lösung von 65 mg (0,15 mmol) 25 und 1 g (0,025 mmol) 10 in 15 ml wasserfreiem DCM zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand aus 2-Propanol umkristallisiert, um 0,85 g (85%) 26 als weißen Feststoff zu erhalten.
¹³C-NMR (67,80 MHz, CDCl₃) δ 19,61, 24,39, 27,34, 30,72, 38,11, 45,86, 59,13, 68,40-71,45 (PEG), 122,18, 131,78, 133,40, 135,04, 137,18, 149,36, 168,65, 170,67, 171,18.
Beispiel 21
Verbindung 27: Kupplung von 26 mit 5
13,2 mg (0,07 mmol) EDC wurden dem Gemisch aus 0,35 g (0,01 mmol) 26, 29 mg (0,05 mmol) 5, 13,9 mg (0,14 mmol) NMM und 6,97 mg (0,05 mmol) HOBT in 20 ml wasserfreiem DCM bei 0°C zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand aus 2-Propanol (50 ml) umkristallisiert, um 0,35 g (84%) 27 zu erhalten. Ein UV-Test zeigte 2,0 Äquivalente (100% Kupplungsausbeute) von 5.
Beispiel 22
Verbindung 29
Verbindung 28 wurde unter Verwendung des in Beispiel 16 bereitgestellten Verfahrens hergestellt. So wurden 500 mg (1,55 mmol) 21, 587,6 mg (3,11 mmol) t-Boc-ß-Alanin-OH, 474 μl (3,11 mmol) DIPC und 568 mg (4,66 mmol) DMAP in 15 ml wasserfreiem DCM umgesetzt, um 580 mg (76%) 28 zu erhalten.
¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃) δ 0,00 (s, 6H, 2 × CH₃-Si), 087 (s, 6H, 2 × CH₃-C), 1,48 (s, 18H, C(CH₃)₃ und Si(CH₃)₃), 2,05 (t, 2H, CH₂C₂ J=5,4 Hz), 2,26 (s, 3H, PhCH₃), 2,54 (s, 3H, PhCH₃), 2,79 (t, 2H, CH₂C(=O), J=5,4 Hz), 3,50 (t, 4H, NHCH₂ und CH₂O, J=8,1 Hz), 5,01 (bs, 1H, NH), 6,58 (s, 1H, PhH), 6,84 (s, 1H, PhH).
¹³C-NMR (67,80 MHz, CDCl₃) δ 18,18, 20,11, 25,20, 25,88, 28,36, 31,78, 35,40, 36,00, 38,99, 45,94, 60,69, 79,35, 122,91, 132,38, 133,99, 135,92, 138,40, 149,46, 155,79, 171,73.
Verbindung 29 wird unter Verwendung desselben Verfahrens wie für die Umwandlung von 22 zu 27 beschrieben (Beispiele 17-21) hergestellt.
Beispiel 23
Verbindung 31
Verbindung 30 wurde unter Verwendung des in Beispiel 16 bereitgestellten Verfahrens hergestellt. Verbindung 21, 150 mg (0,47 mmol), 189,4 mg (0,93 mmol) t-Boc-α-Aminoisobuttersäure, 117,4 mg (0,93 mmol) DIPC und 113,7 mg 0,93 mmol) DMAP in 25 ml wasserfreiem DCM wurden umgesetzt, und nach Reinigung wurden 76 mg (32%) 30 erhalten.
¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃) δ 0,00 (s, 6H, 2 × CH₃-Si), 087 (s, 6H, 2 × CH₃-C), 1,48 (s, 18H, C(CH₃)₃ und Si(CH₃)₃), 1,70 (s, 6H, C(CH₃)₂), 2,06 (t, 2H, CH₂C, J=8,1 Hz) 2,19 (s, 3H, PhCH₃), 3,50 (t, 2H, CH₂O, J = 8,1 Hz), 5,19 (bs, 1H, NH), 6,70 (s, 1H, PhH), 6,81 (s, 1H, PhH).
¹³C-NMR (67,80 MHz, CDCl₃) δ 18,16, 50,13, 25,17, 25,33, 25,90, 28,33, 31,92, 32,04, 39,28, 45,08, 45,83, 56,44, 60,80, 61,61, 79,96, 116,65, 122,70, 126,74, 132,17, 134,12, 136,07, 138,04, 151,07, 154,70, 174,24.
Verbindung 30 wurde dem Verfahren der Beispiele 17-21 unterzogen, um Verbindung 31 zu erhalten.
Beispiel 24.
Verbindung 33: Kupplung von 8 mit Ara-C, 32
Eine Lösung von 300 mg (0,056 mmol) 8, 68,3 mg (0,28 mmol) Ara-C, 32 und 65 mg (0,34 mmol) EDC in 10 ml wasserfreiem Pyridin wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Ethylether wurde der Reaktionslösung zugesetzt, um das Rohprodukt auszufällen, das aus 2-Propanol umkristallisiert wurde, um 180 mg (53%) 33 zu erhalten.
¹³C-NMR (67,80 MHz, CDCl₃) δ 16,07, 19,85, 25,35, 31,56, 32,11, 39,00, 48,39, 49,40, 58,61, 61,51, 68,53-72,18 (PEG), 74,70, 85,43, 87,72, 95,36, 122,00, 132,30, 132,34, 133,32, 135,74, 138,27, 145,62, 149,35, 155,46, 161,74, 171,37, 172,04, 172,20.
Beispiel 25
Verbindung 34
Verbindung 34 kann aus 11, gekuppelt mit 32, oder aus 1, gekuppelt mit 32, gefolgt vom Abspalten der Schutzgruppen und Kuppeln mit 10 wie in den Beispielen 26-28 hergestellt werden.
Kupplung von 11 mit 32: Eine Lösung von 1 g (0,025 mmol) 11, 120 mg (0,50 mmol) 32 und 57 mg (0,30 mmol) EDC in 10 ml wasserfreiem Pyridin wurde bei Raumtemperatur für eine Dauer von 3 Tagen gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand aus IPA umkristallisiert, um 640 mg (64%) 34 zu erhalten. Ein UV-Test zeigte 1,67 Äquivalente (84%ige Kupplungsausbeute) von 32.
¹³C-NMR (67,80 MHz, CDCl₃) δ 14,87, 18,58, 24,54, 31,30, 31,36, 38,66, 47,68, 49,09, 61,12, 67,54-71,05 (PEG), 74,76, 85,19, 86,54, 94,69, 121,25, 131,85, 133,08, 134,73, 137,35, 144,94, 148,58, 154,39, 160,88, 170,96, 171,26, 172,38.
Beispiel 26
Verbindung 35: Kupplung von 1 mit 32
Ein Gemisch aus 700 mg (1,78 mmol) 1, 1,73 g (7,12 mmol) 32, 0,96 g (7,12 mmol) HOBT und 2,73 g (14,25 mmol) EDC in 50 ml wasserfreiem Pyridin wurden bei Raumtemperatur für eine Dauer von 2 Stunden gerührt, und anschießend wurde bei 40°C über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt und 50 ml DCM wurden zum Lösen des Gemischs verwendet, gefolgt vom Waschen mit Wasser (3 × 30 ml) und 0,1 N HCl (2 × 30 ml). Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, um das Rohprodukt zu erhalten, das durch Silicagelsäulenchromatogaphie (5 bis 10% Methanol in DCM) gereinigt wurde, um 638,8 mg (52%) 35 als weißen Feststoff zu erhalten.
¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃) δ 1,42, 1,55, 2,17, 2,26, 2,46, 2,79, 3,84, 3,91, 4,14, 4,33, 4,53, 5,49, 6,07, 6,17, 6,52, 6,76, 7,31, 7,67, 8,16, 8,62.
¹²C-NMR (67,80 MHz, CDCl₃) δ 17,77, 20,11, 25,36, 28,32, 31,51, 31,96, 39,57, 50,18, 50,45, 61,88, 74,50, 80,15, 85,90, 88,58, 96,25, 122,51, 132,82, 133,34, 136,73, 138,22, 146,57, 149,90, 155,65, 155,96, 162,08, 171,89, 174,06.
Beispiel 27
Verbindung 36: Schutzgruppenabspaltung von 35
Verbindung 35 (638,8 mg, 1,03 mmol) wurde in 6 ml wasserfreiem DCM, 6 ml und 4 ml TFA bei Raumtemperatur für eine Dauer von 2 Stunden gerührt. Ethylether wurde der Lösung zugesetzt, um das Rohprodukt auszufällen, das filtriert und mit Ether gewaschen wurde, um 36 als weißen Feststoff zu erhalten (534,5 mg, 82%).
¹H-NMR (270 mHz, DMSO-d₆) δ 1,52 (s, 3H, (CH₃)₂CH) 1,55 (s, 3H, (CH₃)₂CH), 1,62 (d, 1H, J=8,1 Hz, (CH₃)₂CH(, 2,22 (s, 3H, CH Ar), 2,57 (s, 3H, CH₃Ar), 2,97 (s, 2H, CH₂C(=O)), 3,41-4,27 (m, 5H, Ara-C's H-2'-H5'), 6,09 (d, 1H, J=5,4 Hz, Ara-C's H-1'), 6,67 (s, 1H, Ar-H), 6,90 (s, 1H,Ar-H), 7,12 (d, J=5,4 Hz, H-6)8,05 (d, J=8,1 Hz, H-5), 8,67 (bs, 1H, TFA).
¹³C-NMR (67,80 MHz, DMSO-d₆) δ 15,45, 19,67, 24,97, 31,05, 31,23, 38,56, 40,41, 48,53, 49,02, 61,02, 64,94, 74,64, 76,14, 85,74, 86,95, 94,32, 122,32, 132,41, 134,08, 135,67, 138,09, 146,71, 149,20, 154,50, 158,21, 158,72, 162,02, 169,68, 171,87.
Beispiel 28
Verbindung 34 durch Kuppeln von 10 mit 36
Eine Lösung von 778 mg (0,019 mmol) 10, 40 mg (0,077 mmol) 36 und 20 mg (0,15 mmol) DIPEA in 10 ml wasserfreiem DCM wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand aus 2-Propanol umkristallisiert, um 650 mg (84%ige Ausbeute) 34 als weißen Feststoff zu erhalten. Die NMR-Daten entsprachen dem Produkt von Beispiel 25.
Beispiel 29
Verbindung 38: Kupplung von 1 mit Gemcitabin, 37
Ein Gemisch aus 359 mg (0,91 mmol) 1, 960 mg (3,65 mmol) Gemcitabin, 492 mg (3,65 mmol) HOBT, 737 mg (7,29 mmol) NMM und 390 mg (2,04 mmol) EDC in 25 ml wasserfreiem Pyridin wurde bei Raumtemperatur für eine Dauer von 3 Tagen gerührt. Das Gemisch wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Säulenchromatographie (Ethylacetat) gereinigt, um 280 mg (48%) 38 zu erhalten.
¹H-NMR 270 MHz, CDCl₃) δ 1,26 (s, 3H), 1,28 (s, 3H), 1,41 (s, 3H), 1,52 (s, 3H), 1,55 (s, 3H), 2,19 (s, 3H), 2,53 (2, 3H), 2,91 (dd, 2H, J=29,7, 16,2 Hz), 3,96 (m, 2H), 4,50 (bs, 1H), 5,41 (bs, 1H), 6,21 (bs, 1H), 6,50 (s, 1H), 6,80 (s, 1H), 7,35 (d, 1H, J=5,4 Hz), 8,02 (d, 1H, J=8,1 Hz), 9,37 (bs, 1H).
¹³C-NMR (67,80 MHz, CDCl₃) δ 17,40, 20,16, 25,54, 26,89, 28,28, 29,68, 31,36, 31,93, 39,29, 50,05, 50,53, 59,57, 68,96, 80,68, 81,50, 97,50, 122,46, 132,92, 133,49, 136,66, 138,25, 144,97, 149,64, 155,75, 162,89, 172,04, 173,48.
Beispiel 30
Verbindung 39: Abspaltung der Schutzgruppen von 38
Verbindung 38 (280 mg, 0,44 mmol) wurde in 5 ml TFA und 5 ml wasserfreiem DCM bei Raumtemperatur für die Dauer von 1 Stunde gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und Ethylether wurde zugesetzt, um das Produkt auszufällen, das abfiltriert und mit Ethylether gewaschen wurde, um 250 mg (87%) 39 zu erhalten.
¹H-NMR 270 MHz, DMSO-d₆) δ 1,48 (d, 6H, J=8,1 Hz), 1,58 (d, 6H, J=5,4 Hz), 2,18 (s, 5H), 2,95 (s, 3H), 3,61-3,66 (m, 1H), 3,77-3,90 (m, 2H), 4,14 (m, 1H), 4,45 (m, 1H), 4,72 (m, 1H), 5,23 (bs, 1H), 6,16 (t, 1H, J=8,1 Hz), 6,34 (bs, 1H), 6,60 (s, 1H), 6,88 (s, 1H), 7,13 (d, 1H, J=8,1 Hz), 8,18 (d, 1H, J=8,1 Hz), 8,47 (bs, 3H).
¹³C-NMR (67,80 MHz, DMSO-d₆) δ 15,38, 19,63, 24,92, 30,99, 31,07, 31,15, 48,47, 49,12, 58,73, 68,35, 81,07, 95,81, 122,19, 132,41, 133,95, 135,65, 138,09, 144,75, 149,07, 154,14, 162,69, 169,65, 172,05.
Beispiel 31
Verbindung 40: Kupplung von 39 mit 10
Eine Lösung von 778 mg (0,019 mmol) 10, 50 mg (0,077 mmol) 39 und 20 mg (0,15 mmol) DIPEA in 10 ml wasserfreiem DCM wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und der Rückstand aus 2-Propanol umkristallisiert, um 40 zu erhalten.
Beispiel 32
Verbindung 42: Kupplung von 11 mit Melphalan, 41
Ein Gemisch aus 1,0 g (0,025 mmol) 11, 13,7 mg (0,10 mmol) p-Nitrophenol, 12,4 mg (0,10 mmol) DIPC und 12,0 mg (0,10 mmol) DMAP in 10 ml wasserfreiem DCM wurde bei 0°C bis Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Lösung wurde eingeengt, und Ethylether wurde zum Ausfällen eines Feststoffs verwendet, der ohne weitere Reinigung für den nächsten Schritt verwendet wurde. Der p-Nitrophenolester von 11 wurde mit 45 mg (0,15 mmol) Melphalan in Gegenwart von 51 mg (0,40 mmol) DIPEA in 10 ml wasserfreiem N,N-Dimethylformamid bei Raumtemperatur über Nacht umgesetzt. Ethylether wurde zugesetzt, um das Rohprodukt auszufällen, das aus 2-Propanol umkristallisiert wurde, um 700 mg (70%) Produkt zu erhalten.
¹³C-NMR (67,80 MHz, CDCl₃) δ 16,35, 16,70, 19,59, 20,64, 21,31, 24,67, 25,12, 31,04, 31,15, 36,02, 38,47, 39,12, 40,01, 47,18, 47,40, 48,35, 52,84, 60,62, 68,08-71,63 (PEG), 111,22, 125,57, 130,44, 131,67, 131,72, 133,82, 135,66, 135,90, 137,36, 143,80, 144,17, 149,02, 154,62, 168,34, 169,26, 168,25, 171,80, 171,52.
Beispiel 33.
Verbindung 46
Verbindung 44 wurde aus 2,5-Dimethylphenol, 43, unter Verwendung eines erörterten Verfahrens (L.A. Cohen, et al., J. Am. Chem. Soc., 1972, 94, 9158) hergestellt.
Verbindung 44 wird zu Verbindung 45 durch das zur Herstellung von Verbindung 1 wie in der Literaturangabe verwendete Verfahren umgewandelt. Verbindung 45 wird den Verfahren der Beispiele 29-31 unterzogen, um Verbindung 46 zu erhalten.
Die verschiedenen Veröffentlichungen, Patente, Patentanmeldungen und veröffentlichten Anmeldungen, die in dieser Anmeldung erwähnt sind, sind hier unter Bezugnahme eingebracht.
Während hier beschrieben wurde, was gegenwärtig als die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung betrachtet wird, erkennt der Fachmann, dass Änderungen und Modifikationen ohne Verlassen des Geists der Erfindung durchgeführt werden können. Es ist beabsichtigt, alle derartigen Änderungen und Modifikationen, wie sie in den tatsächlichen Umfang der Erfindung fallen, zu beanspruchen.

Claims

Verbindung, umfassend die Formel
wobei B H, OH, OSiR₁₃, ein Rest einer aminhaltigen Zieleinheit oder ein Rest einer hydroxyhaltigen Einheit ist; L₁ und L₂ bifunktionelle Verbindungseinheiten sind; Y₂ O oder S ist; R₂ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus C_1-6-Alkylen, verzweigten C_3-12-Alkylen, C_3-8-Cycloalkylen, substituierten C_1-6-Alkylen, substituierten C_3-8-Cycloalkylen, Arylen, substituierten Arylen, Aralkylen, C_1-6-Heteroalkylen, substituierten C_1-6-Heteroalkylen, C_1-6-Alkoxy, Phenoxy und C_1-6-Heteroalkoxy; R₉, R₁₀ und R₁₃ unabhängig eines von Wasserstoff, C_1-6-Alkylen, verzweigten C_3-12-Alkylen, C_3-8-Cycloalkylen, substituierten C_1-6-Alkylen, substituierten C_3-8-Cycloalkylen, Arylen, substituierten Arylen, Aralkylen, C_1-6-Heteroalkylen, substituierten C_1-6-Heteroalkylen, C_1-6-Alkoxy, Phenoxy und C_1-6-Heteroalkoxy sind; Ar eine Einheit ist, die, falls sie in der Formel (I) eingeschlossen ist, eine mehrfach substituierte aromatische Kohlenwasserstoff- oder eine mehrfach substituierte heterocyclische Gruppe bildet; (m) null oder eins ist; und R₁₁ ein Polymerrest ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei
wobei M X oder Q ist, wobei X eine elektronenziehende Gruppe ist; Q eine Einheit ist, die ein freies Elektronenpaar enthält, das drei bis sechs Atome von C(=Y₂) entfernt liegt; (n) null oder eine positive ganze Zahl ist; (q) drei oder vier ist; und R₇ und R₈ unabhängig ausgewählt sind aus der R₉ definierenden Gruppe.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei
wobei
Y₁ O oder S ist; (p) null, eins oder zwei ist; und R₁ und R₄ unabhängig ausgewählt sind aus der R₂ definierenden Gruppe.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei Ar ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
wobei J O, S oder NR₁₄ ist; E und Z unabhängig CR₁₄ oder NR₁₄ sind; und R₁₄ unabhängig ausgewählt ist aus der R₉ definierenden Gruppe.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei Ar
ist, wobei R₃, R₅ und R₆ unabhängig ausgewählt aus der R₉ definierenden Gruppe oder Cyano, Nitro, Carboxy, Acyl, substituiertes Acyl oder Carboxyalkyl sind.
Verbindung nach Anspruch 5, wobei R₂ und R₅ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus C_1-6-Alkylen.
Verbindung nach Anspruch 6, wobei R₂ und R₅ Methyl sind.
Verbindung nach Anspruch 5, wobei R₃ und R₅ Wasserstoff sind.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R₁₁ des Weiteren eine Abschlussgruppe A umfasst.
Verbindung nach Anspruch 9, wobei A ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, CO₂H, C_1-6-Alkyleinheiten, Dialkylacylharnstoffalkylen und
wobei B' dasselbe sie B oder ein anderer Vertreter der durch B definierten Gruppe ist.
Verbindung nach Anspruch 3, wobei R₁ und R₄ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus CH₃ und CH₂CH₃.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus O, NR₁₂, A, SO und SO₂, wobei R₁₂ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus C_1-6-Alkylen, verzweigten C_3-12-Alkylen, C_3-8-Cycloalkylen, substituierten C_1-6-Alkylen, substituierten C_3-8-Cycloalkylen, Arylen, substituierten Arylen, Aralkylen, C_1-6-Heteroalkylen und substituierten C_1-6-Heteroalkylen.
Verbindung nach Anspruch 12, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus O und NR₁₂.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei Q ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus C_2-4-Alkylen, Cycloalkylen, Arylen, Aralkylgruppen, substituiert mit einem Vertreter der Gruppe, bestehend aus NH, O, S, -CH₂-C(O)-NH-, und ortho-substituierten Phenylen.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei (n) eine ganze Zahl von l bis etwa 12 ist.
Verbindung nach Anspruch 15, wobei (n) 1 oder 2 ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei (m) 0 ist.
Verbindung nach Anspruch 3, wobei (p) eins ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei beide Y_1-2 O sind
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R₁₁ ein Polyalkylenoxid umfasst.
Verbindung nach Anspruch 20, wobei das Polyalkylenoxid Polyethylenglycol umfasst.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei der Polymerrest ein Molekulargewicht von etwa 2.000 bis etwa 100.000 aufweist.
Verbindung nach Anspruch 22, wobei der Polymerrest ein Molekulargewicht von etwa 2.000 bis etwa 40.000 aufweist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R₁₁ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -C(=Y)-(CH₂)_a-O-(CH₂CH₂₀)_x-A, -C(=Y)-Y-(CH₂)_a-O-(CH₂CH₂₀)_x-A und -C(=Y)-NR₁₂-(CH₂)_a-O-(CH₂CH₂₀)_x-A, wobei (a) null oder eine positive ganze Zahl ist; Y O oder S ist; A eine Abschlussgruppe ist; und (x) den Polymerisationsgrad darstellt.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei B eine Abgangsgruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus N-Hydroxybenzotriazolyl, Halogen, N-Hydroxyphthalimidyl, p-Nitrophenoxy, Imidazolyl, N-Hydroxysuccinimidyl, Thiazolylthion und einer säureaktivierenden Gruppe.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei B ein Rest eines Vertreters der Gruppe, bestehend aus Anthraeyclinen, Daunorubicin, Doxorubicin, P-Hydroxyanilinmustard, Ara-C, Cytosinarabinose und Gemcitabin, ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei B ein Rest aus einem Enzym, Protein, Peptid oder einer aminhaltigen Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus kardiovaskulären Mitteln, Antineoplastika, Antiinfektionsmitteln, Antipilzmitteln, Antiangsmitteln, gastrointestinalen Mitteln, das zentrale Nervensystem aktivierenden Mitteln, Analgetika, Fruchtbarkeitsmitteln, Verhütungsmitteln, Antientzündungsmitteln, Steroiden, Antiurecämischen Mitteln, Vasodilatoren und Vasokonstriktoren, ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei B ein zweites polymeres Transportsystem einschließt.
Verbindung nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

wobei R₃, R₅ und R₆ unabhängig ausgewählt sind aus der R₉ definierenden Gruppe, oder ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Cyano, Nitro, Carboxy, Acyl, substituiertem Acyl und Carboxyalkyl; n null oder eine positive ganze Zahl ist; p eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 3 ist; J O, S oder unabhängig ausgewählt aus der R₉ definierenden Gruppe ist; M X oder Q ist und X eine elektronenziehende Gruppe ist und Q eine Einheit ist, die ein freies Elektronenpaar enthält, das 3 bis 6 Atome von C(=Y₂) entfernt positioniert ist; G -C(Y₁)- oder CH₂ ist und Y₁ O oder S ist; R₁, R₄, R₇ und R₈ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, C_1-6-Alkylen, verzweigten C_3-12-Alkylen, C_3-8-Cycloalkylen, substituierten C_1-6-Alkylen, substituierten C_3-8-Cycloalkylen, Arylen, substituierten Arylen, Aralkylen, C_1-6-Heteroalkylen und substituierten C_1-6-Heteroalkylen; und PEG ein Polyethylenglycolrest ist.
Verfahren zur Herstellung einer Prodrugtransportform, umfassend: a. Bereitstellen einer Zwischenverbindung (III)
wobei M₂ eine abspaltbare oder reversible Schutzgruppe ist; L₁ und L₂ bifunktionelle Verbindungseinheiten sind; B₂ eine Abgangsgruppe ist; Y₂ O oder S ist; R₂ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus C_1-6-Alkylen, verzweigten C_3-12-Alkylen, C_3-8-Cycloalkylen, substituierten C_1-6-Alkylen, substituierten C_3-8-Cycloalkylen, Arylen, substituierten Arylen, Aralkylen, C_1-6-Heteroalkylen und substituierten C_1-6-Heteroalkylen; und Ar eine Einheit ist, die, falls sie in der Verbindung (III) eingeschlossen ist, eine mehrfach substituierte Kohlenwasserstoff- oder eine mehrfach substituierte heterocyclische Gruppe bildet; b. Behandeln der Zwischenverbindung (III) mit einer Säure oder katalytische Hydrierung zum Entfernen der Schutzgruppe; und c. Umsetzen der ungeschützten Zwischenverbindung (III) mit einer Einheit, die mit L₁ reagieren kann.
Verfahren nach Anspruch 30, des Weiteren umfassend den Schritt: d. Umsetzen der erhaltenen Verbindung von Schritt c) mit einer aminhaltigen oder hydroxyhaltigen Verbindung unter Bildung eines Konjugats.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Einheit, die mit L₁ reagieren kann, ein aktiviertes Polymer ist.
Verfahren zur Herstellung einer Prodrugtransportform, umfassend: a. Umsetzen einer Zwischenverbindung (III)
wobei M₂ eine abspaltbare oder umkehrbare Schutzgruppe ist; L₁ und L₂ bifunktionelle Verbindungseinheiten sind; B₂ eine Abgangsgruppe ist; Y₂ O oder S ist; R₂ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus C_1-6-Alkylen, verzweigten C_3-12-Alkylen, C_3-8-Cycloalkylen, substituierten C_1-6-Alkylen, substituierten C_3-8-Cycloalkylen, Arylen, substituierten Arylen, Aralkylen, C_1-6-Heteroalkylen und substituierten C_1-6-Heteroalkylen; und Ar eine Einheit ist, die, falls sie in der Verbindung (III) eingeschlossen ist, eine mehrfach substituierte Kohlenwasserstoff- oder eine mehrfach substituierte heterocyclische Gruppe bildet; mit einer aminhaltigen oder hydroxyhaltigen Verbindung unter Bildung einer zweiten Zwischenverbindung; b. Behandeln der zweiten Zwischenverbindung mit einer Säure oder katalytische Hydrierung zum Entfernen der Schutzgruppe; und c. Umsetzen der ungeschützten zweiten Zwischenverbindung mit einem aktivierten Polymer.
Prodrug zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung eines Säugers, wobei die Prodrug eine wie in Anspruch 1 definierte Verbindung ist, wobei B ein Rest aus einer aminhaltigen oder hydroxyhaltigen therapeutischen Einheit ist.