DE69829567T2

DE69829567T2 - Angiotensinderivate

Info

Publication number: DE69829567T2
Application number: DE69829567T
Authority: DE
Inventors: Francis James Congleton GLOVER; Arthur Wilmslow RUSHTON; John Phillip Congleton MORGAN; Clinton Stephen Stockport YOUNG
Original assignee: Proteus Molecular Design Ltd
Current assignee: Protherics Medicines Development Ltd
Priority date: 1997-06-24
Filing date: 1998-06-23
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2018-06-24
Also published as: DE69829567D1; CA2294996C; AU748903B2; EP1001978B1; JP4850321B2; US20090105150A1; EP1001978A1; JP2002507886A; WO1998058952A1; NZ501832A; DK1001978T3; AU8120398A; AR014884A1; ATE292143T1; PT1001978E; ES2241147T3; EP1486505A1; CA2294996A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Derivate des Säugetierpeptidhormons Angiotensin I und immuntherapeutische Verwendungen davon, insbesondere für die Therapie und Prophylaxe von Zuständen, die mit dem Renin-aktivierten Agiotensinsystem verbunden sind.
Angiotensin-Peptide sind an der Kontrolle des arteriellen Drucks in Säugetieren beteiligt. Sie werden in verschiedenen Formen im Körper als Resultat einer biochemischen Kaskade gebildet, die als das Renin-Angiotensinsystem (RAS) bekannt ist, die durch Renin initiiert wird, das als Ergebnis eines Abfalls des arteriellen Drucks gebildet wird. Im RAS, nachstehend schematisch dargestellt, wird Renin als Folge eines Abfalls des arteriellen Blutdrucks aus gespeichertem Pro-Renin von den Nieren ausgeschüttet, und es wirkt enzymatisch auf Angiotensinogen, um Angiotensin I zu bilden, welches ein Dekapeptid mit der Sequenz Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu ist. Zwei Aminosäuren des C-Terminus bzw. C-Endes von Angiotensin I werden schnell durch das Angiotensinkonvertierende Enzym (ACE) gespalten, welches im Endothel der Lungen vorhanden ist, gewöhnlich innerhalb von 1–2 Sekunden, um das Oktapeptid Angiotensin II zu bilden, das die Sequenz Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe hat.
Angiotensin I ist innerhalb des Körpers sehr kurzlebig und hat geringe gefäßverengende Aktivität. Nur deshalb hat es unwesentliche Auswirkung auf das Kreislaufsystem. Angiotensin II jedoch ist ein vasoaktives Peptid, welches sowohl auf das Kreislaufsystem, als auch auf das endokrine System eine tiefgreifende Auswirkung hat. Erhöhte Level bzw. Spiegel von RAS-aktiviertem Angiotensin II verursachen eine Gefäßverengung und Nierenretention von Salz und Wasser, was beides zu einem erhöhten arteriellen Druck (Bluthochdruck) beiträgt, welcher zu einem kardiovaskulären Schaden führen kann. Angiotensin II ist mit einer Anzahl anderer Krankheitszustände in Zusammenhang gebracht worden, einschließlich kongestivem Herzversagen. Bluthochdruck ist ein Hauptrisikofaktor für Herzinfarkte und Schlaganfälle, und kongestives Herzversagen ist die Krankheit mit der größten Sterblichkeit innerhalb einiger Jahre nach Ausbruch. Es besteht ein Bedürfnis nach effektiven Therapien, um diese und andere Krankheiten zu bekämpfen, die mit dem Renin-Angiotensinsystem verknüpft sind.
Die Verwendung von Angiotensin I bzw. dessen Desaspartat-Äquivalents bei der Behandlung von Herzproblemen ist in der WO 96/37213 beschrieben.
Die derzeitige Behandlung dieser Krankheiten umfasst ein Eingreifen in das RAS-System unter Verwendung von kleinen organischen Molekülen. Eine Vorgehensweise versucht ACE mit Inhibitoren wie Lisinopril, Captopril und Enalapril zu hemmen, Substanzen, die nun in der Behandlung von Bluthochdruck etabliert sind. Diese Medikamente waren jedoch nicht völlig erfolgreich. Es scheint, dass die Hemmung von ACE nur partiell ist. Darüber hinaus könnte auch die Biotransformation von anderen metabolisch aktiven Peptiden, einschließlich Bradykinin, gehemmt werden, weil es ACE an Substratspezifität fehlt, was unerwünscht ist. Darüber hinaus müssen diese Medikamente regelmäßig eingenommen werden, oft über lange Zeiträume, z. B. für den Großteil des erwachsenen Lebens. Ein hauptsächlicher Nachteil dieser Medikamente sind jedoch deren unerwünschte Nebenwirkungen, einschließlich trockenem Husten und hypotensiver Wirkung bei erster Dosis mit Schwindel und möglicher Ohnmacht. Da blutdrucksenkende Therapien beständig über einen langen Zeitraum durchgeführt werden müssen, z. B. für bis zu 30 Jahre und manchmal sogar länger, können diese ungünstigen Nebenwirkungen zu einem Verlust der Compliance des Patienten führen, insbesondere bei fehlendem kurzfristigen klinischen Nutzen bei einem hauptsächlich asymptomatischen Zustand, was die Nützlichkeit dieses therapeutischen Ansatzes ernsthaft einschränkt.
Eine neuere therapeutische Vorgehensweise bezieht Medikamente ein, die Angiotensin-Rezeptorantagonisten sind, die dazu bestimmt sind, die Aktivität von Angiotensin II zu blockieren. Beispiele sind Losartan und Valsartan. Die Wirkstoffe, die bisher entwickelt wurden, scheinen nur für den AT₁-Angiotensinrezeptor spezifisch zu sein; sie blockieren deshalb die dominanten gefäßverengenden Wirkungen von Angiotensin II und werden besser vertragen, aber sie beeinflussen nicht andere Wirkungen der Angiotensinhormone. Die Erfahrung mit AT₁-Rezeptorantagonisten zeigt, dass, während sie von vergleichbarer Wirksamkeit gegenüber ACE-Inhibitoren sind, eine geringe Compliance des Patienten ein Problem bleibt. Folglich besteht ein Bedarf an verbesserten Therapien von Krankheiten, die mit dem RAS verknüpft sind.
Ein möglicher Ansatz zur Behandlung oder Vorbeugung von Krankheiten oder Funktionsstörungen, die mit der Aktivität eines Hormons zusammenhängen, ist die Wirkungen des Hormons im Patienten durch eine Immuntherapie zu neutralisieren, d. h. den Patienten gegen das Hormon zu immunisieren, so dass die Aktivität des Hormons durch spezifische Anti-Hormon-Antikörper neutralisiert wird. Solche Antikörper können als passive Immunisierung exogen verabreicht werden, oder sie können in sitze durch aktive Immunisierung unter Verwendung von einem Immunogen erzeugt werden, das auf dem Hormon basiert.
Wir haben nun neue Derivate von Angiotensin entwickelt, welche wirksame Immunogene sind, und welche in einem immuntherapeutischen Ansatz genutzt werden können, um Zustände zu bekämpfen, die mit erhöhten Leveln bzw. Spiegeln von Angiotensin II verknüpft sind, das durch RAS gebildet wurde.
Insbesondere wurden Derivate von Angiotensin entwickelt, bei denen ein oder mehrere Angiotensin-Peptide an einen Binderteil gekoppelt sind, z. B. eine Peptidsequenz, welcher eine Anlagerung des Angiotensin-Peptids an einen immunologischen Träger, wie z. B. ein Protein oder Polypeptid, vereinfacht, um ein immunogenes Konjugat zu bilden, welches in einem immunisierten Wirt Antikörper induzieren kann, die an Angiotensin binden und dessen Wirkungen neutralisieren. Diese induzierten Antikörper umfassen solche, die auch an die Vorläufer-Form Angiotensinogen binden können und, auf diese Weise wird eine Spaltung durch Renin zu Angiotensin I verhindert, wodurch eine zusätzliche Blockade des Systems geschaffen wird. Dies könnte insbesondere relevant sein, um die Effekte der Modulation der negativen Rückkopplungseffekte von Angiotensin II auf die Reninproduktion und Freisetzung von Angiotensin I zu reduzieren.
Die Herstellung von Peptidkonjugaten ist bekannt: WO 93/08842 beschreibt Hämoglobinkonjugate und Peeters et al. beschreibt in J. Immunol. Methods 120: 133–143 (1989) die Herstellung von immunogenen Peptid-Trägerkonjugaten.
Zum Einen stellt die vorliegende Erfindung demnach die Verwendung eines immunogenen Angiotensin-Konjugats bereit, das Konsistenz A1 mindestens ein Angiotensin I Peptid umfasst, das über einen Peptid-Träger-bindenden Teil an einen Träger gekoppelt ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei Bekämpfung von Krankheiten, die mit dem Renin-Angiotensinsystem verknüpft sind.
Solche Krankheiten umfassen kongestive Herzinsuffizienz und Bluthochdruck, wie z. B. systemischen Bluthochdruck, und andere Krankheiten, bei denen das Renin-Angiotensinsystem zu der Pathophysiologie davon beiträgt sowie Krankheiten, bei denen das Renin-Angiotensinsystem erhöhte Werte an Aktivität zeigt.
Diese Angiotensin-Konjugate können genutzt werden, um einen Patienten gegen das Hormon Angiotensin II und/oder dessen Polypeptid-Vorläufer Angiotensin I und/oder Angiotensinogen zu immunisieren, so dass die Aktivität des Hormons durch bestimmte Antihormon- oder Antipolypeptid-Antikörper neutralisiert wird.
Das Angiotensin I Peptid umfasst in geeigneter Weise ein Dekapeptid der Formel Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu.
Der Peptid-Träger-bindende Teil dient als ein Mittel, durch welches das Angiotensin-Peptid an einen immunologischen Träger gebunden werden kann, welcher im Allgemeinen ein Protein oder Polypeptid sein wird, und damit vorzugsweise einen Aminosäurerest beinhaltet, der eine reaktive Seitenkette hat, über welche das Angiotensinderivat leicht an den Träger unter Verwendung von Standardkopplungstechniken gebunden werden kann. Vorteilhafterweise kann eine solche Seitenkette eine freie Hydroxyl-, Carboxyl- oder Thiolgruppe enthalten. Solch eine Aminosäure kann so in geeigneter Weise einen Cystein-, Tyrosin-, Asparaginsäure- oder Glutaminsäurerest oder ein Derivat davon sein, wie z. B. N-Acetyl Cystein.
Es zeigte sich, dass die Angiotensin-Träger-bindenden Teile die Bindung an einen immunologischen Träger verbessert haben, um Antikörper zu induzieren, die immuntherapeutisch genutzt werden können und diese Angiotensin-Träger-bindenden Teile haben in dieser Hinsicht Vorteile gegenüber dem nativen Peptid.
Der Träger-bindende Teil kann die Form einer Peptiderweiterung an dem N- oder C-Terminus eines Angiotensin-Peptids annehmen, oder ein Peptidpendant von oder zwischen einem Kettensegment zwischen zwei oder mehreren Angiotensin-Resten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Konjugate Konjugate eines Trägers und einer Verbindung der Formel
N-Acetyl-Cys-Ala-Angiotensin I
N-Acetyl-Cys-(Ala)₄-Angiotensin I
N-Acetyl-Cys(Gly)₆-Angiotensin I
N-Acetyl-Cys-Gly-Ala-Gly-Ala-Angiotensin I
N-Acetyl-Cys-(A)
N-Acetyl-Cys-Gly-(A)
wobei A Angiotensin I ist.
Obwohl die Peptidanaloga der Erfindung bei Prüfung durch computergestützte Energieminimierungs-Modellierung im Allgemeinen als zu klein betrachtet werden um allein optimal immunogen zu sein, wurde herausgefunden, dass, wenn sie über einen Trägerbindenden Teil an einen Träger gekoppelt sind, diese Peptidanaloga eine starke schützende Immunantwort bzw. -reaktion auslösen. Sie sind somit besonders für eine Verwendung in der Immuntherapie gegen Zustände geeignet, die mit RAS verknüpft sind. Ohne durch die Theorie gebunden sein zu wollen, glaubt man, dass das Binden der Peptide an den Träger durch den Trägerbindenden Teil in solchen Analoga resultiert, die im Wesentlichen die gleiche Konformation wie die nativen Angiotensin-Peptide haben.
Die neuen Derivate gemäß der Erfindung können durch Nutzung einer Reihe von Standardtechniken generiert werden, einschließlich, für Peptide, der Merrifield Festphasen-Methode bei der Aminosäuren schrittweise an ein wachsendes Polypeptid hinzugefügt werden, welches an eine feste Matrix gebunden ist, wie beschrieben in R. B. Merrifield, Fed. Proc. Amer. Soc. Biol. (1962). 21, 412 und R. B. Merrifield, Jour. Amer. Chem. Soc. (1963), 85, 2149 und konventioneller FMOC-Chemie. Falls gewünscht, können reaktive Seitenkettengruppen der Aminosäuren in der wachsenden Kette während der Kettensynthese geschützt werden. Verzweigte Strukturen können durch ähnliche Techniken hergestellt werden.
Wo die neuen Derivate lineare Peptide sind, können diese ebenfalls durch rekombinante DNA-Expression unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden, wie beispielsweise von Sambrook et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, 1989, beschrieben ist.
Der Angiotensin-Träger-bindende Teil, wie es für andere kleine Moleküle der Fall ist, kann von unzureichender Größe sein, um die Bildung von Antikörpern allein anzuregen, und es kann somit nötig sein, ihn an einen makromolekularen Träger zu konjugieren, um die Antikörperproduktion und eine schützende Immunantwort bzw. -reaktion anzuregen.
Die Bindung an den Träger kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren geschehen, z. B, durch Behandlung mit heterobifunktional verbindenden Agenzien. Wo die Bindung über ein terminales Cystein (oder N-Acetyl-Cystein) erfolgt, kann das verbindende Agens m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulphosuccinamid-Ester sein; wobei in diesem Fall Maleimid eine oder mehrere Lysin-Seitenketten im Peptidträger modifiziert und sich eine Thioether-Bindung am terminalen Cysteinrest bildet. Andere, dem Fachmann bekannte, verknüpfende Reagenzien, z. B. Carbodiimid-Kopplung, können auch verwendet werden.
Jeder dem Fachmann für solche Zwecke bekannte Träger kann verwendet werden, einschließlich dem gereinigten Proteinderivat von Tuberkulin, Tetanustoxoid, Diphterietoxoid, Keyhole limpet-Hämocyanin oder Derivate davon.
Wo der Angiotensin-Träger-bindende Teil ein lineares Peptid ist und der Träger ein Protein oder Polypeptid ist, kann das gesamte Peptidkonjugat auch durch rekombinante DNA-Methoden hergestellt werden, wobei ein Nukleinsäuremolekül, welches das konjugierte Molekül kodiert, in einer entsprechenden Wirtszelle exprimiert wird.
Die Angiotensinkonjugate der Erfindung können in einem immuntherapeutischen Ansatz zur Bekämpfung von Krankheiten, die mit normalen oder erhöhten Leveln von RAS-Aktivität und/oder Angiotensin-Peptiden assoziiert sind, benutzt werden und stellen ein verglichen mit derzeit verfügbaren Verfahren vorteilhaftes Verfahren dar. Die Compliance des Patienten sollte erhöht sein, da eine weniger häufige Dosierung als bei derzeitigen Therapien einbezogen ist, und unerwünschte Nebeneffekte werden vermieden.
Ferner stellt die Erfindung die Verwendung von einem Angiotensinkonjugat gemäß der Erfindung für die Modulation des Blutdrucks bereit.
Das Angiotensinkonjugat gemäß der Erfindung kann durch alle konventionellen Methoden bzw. Verfahren verabreicht werden, einschließlich parenteral (z. B. intraperitoneal, subkutan, intramuskulär, intradermal beispielsweise in Form von inerten Teilchen wie Goldpellets oder -kügelchen, an welche das Derivat adsorbiert ist, die auf Geschwindigkeiten beschleunigt werden können, die ausreichend sind, ihnen zu ermöglichen, die Haut einer Person zu durchdringen, oder intravenös), topisch (z. B. als eine Hautcreme), intra-artikulär, mukosal (z. B. oral, nasal, vaginal, rektal und über den intra-okularen Weg), oder durch intrapulmonale Verabreichung, z. B. mit Hilfe von Geräten, die dazu dienen, die Wirkstoffe direkt in die Lungen und das Bronchialsystem zu leiten, wie z. B. Inhalationsgeräte und Vernebler, und welche entsprechend üblichen pharmazeutischen Verfahren mit optional einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern oder Hilfsstoffen formuliert sind, wie z. B. die, die in Remingtons Pharmaceutical Sciences, ed. Gennaro, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA (1990), beschrieben sind.
Solche Zusammensetzungen sind in geeigneter Weise als Dosierungseinheit formuliert, z. B. für die mukosale, parenterale oder orale Verabreichung.
Effektive Behandlungstherapien oder prophylaktische Therapien, Formulierungen und Dosierungen werden zum großen Teil vom individuellen Patienten abhängen und können vom Arzt basierend auf den individuellen Umständen festgelegt werden.
Die Art der Formulierung wird von der Verabreichungsmethode abhängen. Zum Beispiel kann eine parenterale Verabreichung durch subkutane oder intramuskuläre Injektion mit einer sterilen wässrigen Suspension des konjugierten Analogons in PBS, Saline (Salzlösung) oder Wasser zum Injizieren erfolgen, optional zusammen mit einem oder mehreren immunologischen Adjuvantien, z. B. Aluminiumhydroxid, Saponin, Quil A, Muramyldipeptid, Mineral- oder Pflanzenöle, auf Vesikeln basierende Adjuvantien, nichtionische Block-Copolymere, oder DEAE-Dextran. Zusätzliche Komponenten wie Konservierungsstoffe können benutzt werden.
Die Dosis für eine Injektion kann im Bereich von 1–100 μg Peptidäquivalent liegen und die Häufigkeit der Verabreichung kann aufwärts von einmal alle drei oder sechs Monate bis zu einmal im Jahr oder einmal alle fünf Jahre sein.
Für eine orale Verabreichung können die konjugierten Derivate als Tabletten, Flüssigkeit, Kapseln etc. formuliert sein. Die Dosen reichen von 1–1000 μg Peptidäquivalent mit in Intervallen erfolgender Dosierung abhängig von der Bioverfügbarkeit des Produkts.
Die Erfindung wird nun in den folgenden, nicht einschränkenden Beispielen in weiteren Details mit Bezug auf die Zeichnungen beschrieben:
1 zeigt einen Graph, der Antikörpertiter +/– sem, n = 6 (Verdünnung entsprechend einem Anstieg der OD von 0,1) gegenüber der Zeit (Probentag) darstellt;
A = Kontrolle
B = Derivat 3 von Beispiel 2
C = Derivat 1 von Beispiel 2
D = Derivat 4 von Beispiel 2
E = Derivat 2 von Beispiel 2.
2 zeigt einen Graph, der eine Peakänderung im Blutdruck darstellt, die auf eine Verabreichung von A1 in Kontrollratten und in Ratten folgt, die mit einem Konjugat eines Analogons von A1 in Gruppen C und J von Beispiel 4 immunisiert sind.
3 zeigt Aufzeichnungen von durchschnittlichen Blutdruckänderungen als Antwort auf A1 in Tieren der Gruppen A und C von Beispiel 4.
4, 5 und 6 zeigen Balkendiagramme, die Antikörpertiter zeigen, die bezüglich A⁴⁵⁰ in einer ELISA-Untersuchung gemessen wurden, wobei in der Untersuchung in 4 Angiotensin I, in 5 Angiotensin II und in 6 Angiotensinogen verwendet wurde, wobei die ELISAs die Bindung von teilweise gereinigtem Rattenantiserum zeigen, welches gegen Vakzine erzeugt wurde, die Analoga von Angiotensinhormone enthalten.
7 und 8 zeigen Graphen, die Antikörpertiter gegenüber der Zeit (Probentag) für die folgenden Derivate darstellen
N-Acetyl-Cys-(Ala)₄-Angiotensin I
N-Acetyl-Cys(Gly)₆-Angiotensin I
Beispiel 1: Peptidgenerierung.
Peptide wurden durch die Fmoc-Strategie der Festphasen-Peptidsynthese mit einem Protein Technologies-Symphony Peptide Synthesiser synthetisiert. Das verwendete Resin war Tentagel S-NH2 mit einem Rinkamid-Linker. Die verwendeten Schutzgruppen der Seitenketten der Fmoc-Aminosäuren waren Trt für Cys His, Asn und Gln, tBu für Tyr Thr, Asp, Glu und Ser; Boc für Lys und das Indol-N von Trp, Pmc für Arg. Eine Aktivierung der Carboxylgruppen wurde durch Verwendung von TBTU/HOBt/DIPEA erreicht, alle Kopplungen wurden in DMF ausgeführt. Eine Entschützung der Fmoc-Gruppen wurde mit 20% Piperidin in DMF erreicht. Die Spaltung der Peptide vom Resin wurde mit 5% Anisol/5% Thioanisol/5% EDT/3% Wasser/2% TES in TFA für 1 Stunde ausgeführt. Die Peptide wurden durch RP-HPLC unter Verwendung von einer 40 mm × 210 mm Deltapak C18 radialen Kompressionssäule auf einer Waters Deltaprep 4000 gereinigt und durch MALDI-TOF auf einen Kratos Maldi 3 und durch AAA charakterisiert.
Für Dendrimere wird Fmoc Lys (Fmoc)-OH durch die oben aufgeführten Verfahren angefügt und gibt sowohl α als auch ε Aminogruppen für die Peptidelongation frei. Die Menge der verwendeten Fmoc-Aminosäuren muss entsprechend erhöht werden.

Rinkamid-Linker: p-[(R,S-[1-(9H-Fluoren-9-yl)-Methoxyformamidol]-2,4-Dimethoxy-benzyl]-Phenoxyessigsäure
Fmoc: 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
Trt: Trityl, Triphenylmethyl
tBu: Tertiärbutyl
Boc: Tertiärbutyloxycarbonyl
Pmc: 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl
TBTU: 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-Tetramethyluronium-Tetrafluoroborat
HOBt: N-Hydroxybenzotriazol
DIPEA: Diisopropylethylamin
DMF: N,N Dimethylformamid
EDT: Ethanedithiol
TES: Triethylsilan
TFA: Trifluoroessigsäure
RP-HPLC: Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit umgekehrten Phasen
MALDI-TOF: Matrix-unterstützte Laserdesorptions-Ionisierung – Lauf zeit
AAA: Aminosäureanalyse
Fmoc-Lys: (Fmoc)-OH = α, ε Di-9-Fluorenylmethoxycarbonyllysin

Die folgenden Peptide wurden auf diese Art synthetisiert:

(1) Angiotensin I-gly-cys Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu Gly-Cys

(2) Angiotensin II-gly-cys Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-Gly-Cys

(3) N-Acetyl-Cys-Gly-Angiotensin I N-Acetyl-Cys-Gly-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu

(4) N-Acetyl-Cys-Gly-Angiotensin II N-Acetyl-Cys-Gly-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe

(2) und (4) sind vergleichende Beispiele
Beispiel 2: Konjugationsverfahren
Zu einer Tetanustoxoid-Lösung in Phosphat-gepufferter Salzlösung bzw. Saline (PBS), wird ein 60 molarer Überschuss von S-MBS, m-Maleimidbenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimid-Ester, zugegeben und für zwei Stunden bei 4°C in einem verschlossenen Fläschchen gerührt.
Überschüssiger S-MBS-Quervernetzer wird durch Chromatographie (Gelausschluss, PD-10, G-25 Sephadexsäule) in PBS entfernt. Der aktivierte Tetanustoxoid-Peak wird gesammelt, auf freie Maleimidgruppen getestet und wie unten benutzt.
Die entstehende Trägerproteinlösung wird mit N₂ gereinigt und ein 12 molarer Überschuss von Angiotensinderivat-Peptid wird zugegeben. Die entstehende Lösung wird für 4 Stunden bei 20°C in einem verschlossenen Behälter gerührt.
Das Konjugat wird von freiem Peptid durch Gelausschluss-Chromotographie wie oben bereinigt. Ein abschließender Test auf Verlust von freien Maleimidgruppen wird mit einer Probe des Gemischs durchgeführt, um zu überprüfen, dass alle verfügbaren Stellen konjugiert sind.
Das finale Konjugat wird auf eine Arbeitskonzentration verdünnt und wie gewünscht formuliert.
Die Struktur von S-MBS quervernetztem Konjugat mit einem linearen C-terminal erweitertem Angiotensin-Peptidderivat (z. B. Derivate (1) und (2) aus Beispiel 1) ist nachstehend gezeigt:
Nach diesem Verfahren wurden die Angiotensinderivate (1) bis (4) aus Beispiel 1 individuell zu Aliquoten des Tetanustoxoid konjugiert.
Beispiel 3: Immunisierungsstudien
Die vier Angiotensinderivate aus Beispiel 1, die individuell zu Aliquoten des Tetanustoxoid, wie in Beispiel 2 beschrieben, konjugiert wurden, wurden durch Adsorption an 0,4% (w/v) Aluminiumhydroxidgel (Alhydrogel, Superfos s/a, Dänemark) in einem normalen salzhaltigen Träger (0,9% (w/v)) formuliert.
Alle Konjugate wurden als 10 μg/ml Peptidäquivalent-Lösung verwendet.
Männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden in 5 Behandlungsgruppen mit jeweils 6 Ratten pro Gruppe verwendet.

Die Behandlungsgruppen erhielten:

Vehiculum, sterile Salzlösung bzw.	Saline 0,5 ml/Ratte
N-Acetyl-Cys-Gly-Angiotensin I Derivat immuntherapeutisch	5μg Peptidäquivalent/Ratte in 0,5 ml Vehiculum
Angiotensin I-Gly-Cys Derivat immuntherapeutisch	5 μg Peptidäquivalent/Ratte in 0,5 ml Vehiculum
N-Acetyl-Cys-Gly-Angiotensin II Derivat immuntherapeutisch	5 μg Peptidäquivalent/Ratte in 0,5 ml Vehiculum
Angiotensin II-Gly-Cys Derivat immuntherapeutisch	5 μg Peptidäquivalent/Ratte

Die gewählte Verabreichung erfolgte subkutan und jede Ratte erhielt während des Verlaufs der Studie 3 separate Dosen des angegebenen Testprodukts.
Das Körpergewicht jeder Ratte wird während des experimentellen Ablaufs einmal pro Woche festgehalten.
Experimenteller Ablauf
In dieser anfänglichen Untersuchung wurde die Körpertemperatur jeder Ratte als Teil der allgemeinen physiologischen Beobachtung der Tiere festgehalten.
Am Tag 1 und anschließend an den Tagen 22 und 43 erhielten die Ratten eine einzelne subkutane Dosis des Trägers oder der Testprodukte. 24 Stunden nach jeder Verabreichung (Tage 2, 23 und 44) und an weiteren Tagen, die in Tabelle 1 spezifiziert sind, wurde anschließend eine venöse Blutprobe (0,5 ml) genommen, während die Ratte festgehalten wurde.
Jede Probe des venösen Blutes wurde in einem Glasröhrchen gesammelt, eisgekühlt und zum Gerinnen stehengelassen, dann zentrifugiert, um innerhalb von 45 Minuten nach Entnahme der Probe Serum zu gewinnen. Serumproben wurden sobald wie möglich bei ungefähr –20°C eingefroren.
Tabelle 1: Zeitplan des Studienablaufs
Jede Serumprobe wurde durch Enzyme Linked ImmunoSorbant Assay (ELISA) auf die Generierung einer Antikörperantwort bzw. -reaktion durch die Behandlung mittels Titration von Anti-Angiotensin-Peptidantikörpern getestet, die in den Seren vorhanden sind.
Dieser Test wurde wie folgt durchgeführt:
Beschichte die 96 -well uniwell Mikrotiterplatten mit 50 μl Detektionssubstrat, z. B. Angiotensin II-Gly-Cys-BSA (10 μg Peptidäquivalent/Vertiefung) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Gebe zur gleichen Zeit 50 μl PBS in separate Vertiefungen als Substrat-Blindprobe.
Wasche die Platten dreimal mit 200 μl Phosphat-gepufferter Salzlösung bzw. Saline (PBS)/0,1% Tween 20.
Füge 200 μl/Vertiefung 3% (w/v) Milchpulver (Marvel) in PBS hinzu und lasse es 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen, um eine nicht-spezifische Antikörperbindung zu blockieren.
Wasche die Platten dreimal mit 200 μl PBS/0,1% Tween 20.
Verdünne die Serumproben mit PBS zu einer geeigneten Verdünnung. Typische Verdünnungen können wie folgt sein:

i) 1/100–5 μl Rattenserum + 495 μl PBS
ii) 1/1000–20 μl (i) + 180 μl PBS
iii) 1/2000–10 μl (i) + 190 μl PBS
iv) 1/5000–4 μl (i) + 196 μl PBS

Lade die entsprechenden verdünnten Seren (50 μl) in entsprechende Vertiefungen und inkubiere bei 20°C für 1 Stunde, um eine Substrat-Antikörperbindung zu ermöglichen.
Wasche die Platten dreimal mit 200 μl PBS/0,1% Tween 20.
Verdünne Kaninchen Anti-Ratten IgG Peroxidase-Konjugat 1:5000 in PBS, d. h. 1 μl IgG Peroxidase + 5 mls PBS. Dieses bindet an die Rattenserum-Antikörper und erlaubt eine Antikörperdetektion.
Füge 50 μl der verdünnten IgG Peroxidase zu den entsprechenden Vertiefungen hinzu und lasse es für 45 Minuten bei Raumtemperatur stehen.
Wasche die Platten dreimal mit 200 μl PBS.
Gebe ein Aliquot von 250 μl des Peroxidasesubstrats 3,3¹, 5,5¹, -Tetramethylbenzidin (TMB) zu 25 ml 0,1 M Natriumacetatpuffer pH 5,5 mit 4 μl 30% Hydrogenperoxid.
Gebe 100 μl des vorbereiteten TMB-Substrats zu den entsprechenden Vertiefungen, einschließlich der Blindprobenvertiefungen. Eine farbbildende Reaktion entsteht, wo eine Antikörper-Substratbindung stattgefunden hat. Lasse den Ansatz für 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen, beende dann die Reaktion durch Zugabe von 50 μl 10% Schwefelsäure zu jeder Vertiefung.
Die Platten wurden hinsichtlich der Lichtabsorption bei 405 nm studiert, die durch die Reaktion des Peroxidaseenzyms mit dem TMB-Substrat generiert wurde, und welche proportional zu der Menge der primären (Anti-Angiotensin) Antikörperbindung ist. Die Ergebnisse für die vier Konjugatformulierungsproben der Derivate (1) bis (4) von Beispiel 1 sind in 1 gezeigt.
1 zeigt einen Zeitverlauf des durchschnittlichen Antikörpertiters (+/– Sem, n = 6) auf der y-Achse zu verschiedenen Probenzeiten, gemessen in Tagen auf der x-Achse. Der Titer ist die durch SAS bestimmte Verdünnung von für eine Änderung der OD um 0,1 gegenüber den Grundlinienleveln in dem ELISA-Test benötigtem Serum.
Die Änderungen in den Antikörperleveln gegenüber Angiotensin-Peptiden kann über die Zeit festgestellt werden und ist nachstehend zusammengefasst:
(A) ist die Kontrolle; (D) und (E) sind vergleichend.
Parallel zu den Daten der Antikörpertiter wurden alle Tiere als allgemeine Bewertung von toxischen oder schädlichen Wirkungen auf grobe physiologische Veränderungen in Körpertemperatur, Gewicht und allgemeiner Erscheinung untersucht.
Keine nachteiligen Wirkungen wurden für irgendeine der vier Angiotensinimmunokonjugat-Behandlungsgruppen verzeichnet, was zeigt, dass die Behandlungen ohne schädliche physiologische Wirkungen in den Tieren bei der Generierung von Anti-Angiotensin-Antikörpern wirksam sind.
Beispiel 4: Wirkungen einer aktiven Immunisierung gegen Angiotensin-Peptide auf die blutdrucksteigernden Effekte von exogenem Angiotensin I (AI) in Ratten bei Bewusstsein
In diesem Experiment wurden bestimmte Analoga von Angiotensin I (AI) und Angiotensin II (AII) an Trägerproteine konjugiert, die gute Immunogene sind, um das Potential einer aktiven Immunisierung mit Angiotensin-Analoga zu demonstrieren. Diese Immunkonjugate wurden mit Adjuvantien versehen und es wurde gezeigt, dass in immunisierten Ratten eine starke Anti-Angiotensin-Immunantwort generiert wurde.
Die immunisierten Ratten wurden in Hinblick auf eine Inhibierung der blutdrucksteigernden Antwort auf exogenes AI untersucht.
Materialien und Methoden
Angiotensin-immuntherapeutische Vakzinherstellung
Die in dieser Studie benutzen Angiotensin-Analoga waren:
AI-Analog ist: N-Acetyl-Cystein-Glycin-Angiotensin I
AII-Analog ist: N-Acetyl-Cystein-Glycin-Angiotensin II (vergleichend)
Die Analoga von AI und AII wurden unter Verwendung eines Symphony Peptide Synthesiser (Anachem) hergestellt.
Die Konjugationsträgerproteine, Tetanustoxoid (TT) (Chiron Behring, GmbH), Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH) (Biosyn, GmbH) und nicht-toxisches rekombinantes Diphterietoxin (DT) (Chiron Behring, GmbH) wurden unter Verwendung eines geeigneten bivalenten Linkers aktiviert. Das „aktivierte" Trägerprotein wurde von überschüssigem Quervernetzungsreagens durch Größenausschluss-Chromatographie abgetrennt.

Die folgenden Konjugate wurden hergestellt

Probengruppe	Konjugat
A	Salz-Kontrolle
B	AII-Analogon, TT-Trägerprotein
C	AI-Analogon, TT-Trägerprotein
D	AII-Analogon, DT-Trägerprotein
E	AII-Analogon, KLH-Trägerprotein
F	AII-Analogon, TT-Trägerprotein
G	gleiches Gemisch aus AI- und AII-Analoga, TT-Trägerprotein
H	AII-Analogon, TT-Trägerprotein
J	AI-Analogon, TT-Trägerprotein
K	AII-Analogon, TT-Trägerprotein
L	AI-Analogon, TT-Trägerprotein

Schlüssel:

AI/AII Peptidanaloga von Angiotensinhormonen
TT Tetanustoxoid
DT nicht-toxisches rekombinantes Diphterietoxin
KLH Keyhole Limpet Haemocyanin

Ein Überschuss der AI- und/oder AII-Analoga wurde mit den aktivierten Trägerproteinen gemischt und zum Reagieren stehengelassen, danach wurden die AI-/AII-Trägerproteinkonjugate von dem verbleibenden freien Analogon durch Größenausschluss-Chromatographie abgetrennt.
Die Konjugate wurden durch Filtration über einen 0,2 μm Filter (Millipore) sterilisiert und mit Adjuvans und Salz-Vehiculum formuliert, um das geeignete Vakzin für eine Verabreichung zu erhalten.
Alhydrogel^® (Superfos S.A.) war das gewählte Aluminiumhydroxidgel-Adjuvans für diese Studie und 0,9% Salzlösung (Flowfusor^®, Fresenius) war der Vakzinträger.
Tabelle 2 zeigt die Konjugatformulierungen, die an jede der Behandlungsgruppen verabreicht wurden. Die Konjugate wurden mit Aluminiumhydroxid-Adjuvans formuliert, anders als das Konjugat der Gruppe F, welches mit DEAE (Diethylaminoethyl)-Dextran-Adjuvans formuliert wurde.
Immunisierung und AI Verabreichung bzw. Eingabe
Männliche Sprague-Dawley-Ratten (anfänglich 200–250 g: Harlan Olac: n = 6 für alle Gruppen) wurden mit Salzlösung bzw. Saline oder immuntherapeutischen Vakzinen an den Tagen, die in Tabelle 2 angegeben sind, injiziert (0,5 ml, sc.).
Am Tag 61 wurden unter Natriummethohexiton-Anästhesie (40–60 mg kg^–1 i. p., ergänzt wie benötigt) Katheder in die distale abdominale Aorta (über die ventrale Schwanzarterie) und die rechte Halsvene implantiert. Am folgenden Tag wurde den Ratten bei Bewusstsein ansteigende Bolusdosen (0,1 ml) von AI (3–60 pmol pro Ratte) i. v. gegeben, während der durchschnittliche systemische arterielle Blutdruck und die Herzfrequenz aufgezeichnet wurden. Am Ende des Experiments wurde den Tieren Natriumpentobarbiton (100 mg) i. v. gegeben, und eine Blutprobe wurde durch Herzpunktur für die Messung von Anti-Angiotensin-Antikörpern durch ELISA genommen.
Angiotensinanalog-Antikörper-ELISA
Die Vertiefungen der ELISA-Platte (Anachem) wurden mit 10 μg Peptidäquivalenten von entweder AI oder AII beschichtet, welche an Rinderserumalbumin (BSA) als Träger konjugiert waren.
Die beschichteten Vertiefungen wurden mit PBS (0,2% w/v)/Tween (Sigma) gewaschen und mit 3% Marvel blockiert, bevor verdünnte Seren von den vakzinierten Ratten in deren entsprechenden Vertiefungen inkubiert wurden. Die Seren waren in PBS (Sigma) über einen Bereich von 2.500–20.000fach verdünnt worden.
Immobilisierte Antikörper wurden in den Vertiefungen unter Verwendung eines Kaninchen Anti-Ratten IgG/Meerrettichperoxidase-Konjugats detektiert und unter Verwendung von 3,3'-5,5'-Tetramethylbenzidin mit H₂O₂ (Sigma) enthüllt. Die Reaktion wurde nach 15 Minuten bei 22°C durch die Zugabe von 10% (v/v) H₂SO₄ (Sigma) beendet.
Die gebildete Farbe wurde durch Absorption bei 450 nm unter Verwendung eines Packard Plattenlesegeräts bestimmt. Die resultierenden abgelesenen Messwerte der Absorption wurden durch ein statistisches Paket (SAS Institut 1997) analysiert, um den Titer zu bestimmen.
Statistische Analyse von Änderungen des Blutdrucks bei der AI-Eingabe (bzw. AI-Verabreichung)
Die maximale Änderung im durchschnittlichen Blutdruck und in der durchschnittlichen Herzfrequenz wurde gegenüber deren Werte unmittelbar vor der Eingabe bzw. Verabreichung für jedes Tier und jede Dosis der Eingabe errechnet. Unterschiede zwischen den behandelten Gruppen und nicht immunisierten Kontrollen wurden durch ANOVA unter Verwendung des Dunnett's Test bewertet.
Analyse der Dosiswirkung bzw. -reaktion
Der hauptsächliche Effekt der Immunisierung war, dass eine parallele Veränderung des Blutdruck-Dosiswirkung der Tiere gegenüber AI-Eingabe verursacht wurde. Um die Größe dieser Veränderung zu bestimmen, wurde ein logistisches Modell abgeleitet und an die Dosiswirkung angepasst:
wobei d die Dosis von AI ist, BP_max die maximale Änderung im Blutdruck ist, α ein Umrissparameter, und ED₅₀ die Dosis von AI ist, die eine halbmaximale Reaktion ergibt. Für jedes Tier wurden separate ED₅₀-Abschätzungen vorgenommen. Signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen und nicht immunisierten Kontrollen wurden durch ANOVA der log-transformierten ED₅₀-Werte unter Verwendung des Dunnett's multiplen Vergleichstests beurteilt.
Ergebnisse
Tabelle 3 fasst einige der Ergebnisse zusammen, die zeigen, dass eine aktive Immunisierung signifikante Veränderungen in der Blutdruck steigernden Dosiswirkung auf AI und deutliche Anstiege in den Antikörpertitern verursacht.
Deutliche Effekte auf den Blutdruck werden mit diesen Behandlungen demonstriert und die maximale Dosisveränderung (8,9fach gegenüber der Kontrolle) werden mit einem Konjugat beobachtet, das das AI-Analogen und Tetanustoxoid auf einem Alumiumhydroxid-Adjuvans enthält.
Tabelle 3 demonstriert auch die Beziehung zwischen dem Anti-Angiotensin-Antikörpertiter und der Reaktion. Im Allgemeinen ist zu sehen, dass eine breite Übereinstimmung zwischen dem durch die Behandlung induzierten Titer und der durchschnittlichen durch die Behandlung induzierten Dosisveränderung vorhanden ist, aber keine offensichtliche Dosiswirkung bzw. -reaktion zwischen Gruppen C und J ersichtlich ist.
2 und 3 illustrieren die Ergebnisse für Kontrollratten (Gruppe A) und Ratten, die mit einem Konjugat des AI-Analogons und Tetanustoxoid immunisiert sind, welches auf einem AlOH-Geladjuvans bei einer Peptidäquivalenzdosis von 5 μg (niedrig; Gruppe C) und 25 μg (hoch; Gruppe J) vorgelegt ist.
2 ist eine graphische Darstellung, die Blutdrucksteigernde Effekte von AI in Kontrollratten (Gruppe A) und Ratten, die mit AI-Analoga bei einer Dosis von 5 μg (niedrig, Gruppe C) oder 25 μg (hoch, Gruppe J) immunisiert sind, zeigt. Die y-Achse zeigt eine Peakänderung in BP (mm Hg) und die x-Achse zeigt die Angiotensin I Dosis (pmol/Ratte) in Tieren der Kontrolle, der Hochdosisgruppe J (25 μg) und der Niedrigdosisgruppe C (5 μg). Die Fehlerbalken zeigen ein Konfidenzintervall von im Durchschnitt 95%, basierend auf der zusammengefassten Standardabweichung (n = 6) innerhalb der Gruppe, was nur für die Kontrollgruppe gezeigt ist.
3 zeigt Aufzeichnungen von durchschnittlichen Änderungen des Blutdrucks als Wirkung von AI (3, 18 und 60 pmol Bolusdosis) in repräsentativen Tieren der Gruppe A (Kontrolle) und Gruppe C (5 μg Dosis).
Schlussfolgerung
Die Behandlung mit einem Konjugat, welches ein AI-Analogon und Tetanustoxoid auf einem Alumiumhydroxid-Adjuvans enthält, zeigt eine hochsignifikante Reduktion in der Blutdrucksteigernden Wirkung von exogenem AI.
Tabelle 3
Medianer AI-Bolus (pmol·Ratte^–1), um einen halbmaximalen Anstieg im durchschnittlichen Blutdruck (ED₅₀) zu erzielen und korrespondierende Anti-Angiotensin-Antikörpertiter in Kontrollratten (Gruppe A) und immunisierten Ratten (Gruppen B–L). Signifikanzwahrscheinlichkeiten angepasst für multiple Vergleiche durch die Dunnett's Methode.
Beispiel 5: Charakterisierung von in Beispiel 3 produzierten Antikörpern
Die in Beispiel 3 produzierten Antikörper wurden durch Affinitätschromatographie wie folgt angereichert:
Materialien

1 ml HiTrap Protein G-Affinitätssäule (Pharmacia Biotech: 17-0404-03)
Waschpuffer (WB) = PBS pH 7,2
Elutionspuffer (EB) = 0,1 M Glycin (HCL) pH 2,7
Neutralisationspuffer (NB) = 1 M Tris (HCL) pH 9
Aufbewahrungspuffer (SB) = 20% Ethanol (v/v)
1. Rattenseren der terminalen Ausblutungen, die einer Inokkulation mit jeweils TT-NAc-CG-Angiotensin I (5 ml), Angiotensin I-GC-TT (7 ml), TT-NAc-CG-Angiotensin II (6 ml) oder Angiotensin II-GC-TT (5 ml) folgten, wurden durch Zentrifugieren geklärt, durch einen 1 μm PTFE-Scheibenfilter gefiltert und dann gegen PBS pH 7,2 dialysiert. Jedes wurde dann separat wie folgt angereichert.
2. Die HiTrap-Säule wurde gewaschen und mit 5 ml WB ausbalanciert bzw. equilibriert.
3. Vorbereitete Seren (Punkt 1) wurden einmal durch die HiTrap-Säule passiert, das Abprodukt bzw. der Waste wurde gesammelt und bei –20°C gelagert.
4. Die HiTrap-Säule wurde mit 5 ml WB gewaschen, um alle verbleibenden überschüssigen Seren zu entfernen.
5. Immobilisierte Antikörper wurden unter Verwendung von 10 ml EB eluiert. Das Eluat wurde in 1 ml Fraktionen gesammelt, wobei jedes sofort mit 0,1 ml NB neutralisiert wurde.
6. Am Ende des Laufs wurde die HiTrap-Säule mit SB gewaschen und bei 4°C gelagert.

ELISA-Tests wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben, unter Verwendung von Platten durchgeführt, die wie folgt beschichtet waren:
1) Für Angiotensin I und II
Materialien:

Nunc Maxisorp ELISA-Platten (Life Technologies: 430341A)
Humanes Angiotensin I (Bachem: H-1680)
Humanes Angiotensin II (Bachem: H-1705)
0,1 M Karbonatpuffer, pH 9,8 (0,316 g Na₂CO₃ & 0,584 g NaHCO₃ pro 0,1 l)

Andere verwendete Materialien waren jene wie in dem ELISA-Verfahren, wie oben in Beispiel 3 genau beschrieben.

1. 100 μl von entweder Angiotensin I oder Angiotensin II, abhängig von dem spezifischen Bindungsereignis, welches zu messen ist (0,2 mg/ml 0,1 M Karbonatpuffer, pH 9,8), wurde zu einer geeigneten Anzahl von ELISA-Plattenvertiefungen zugegeben und für eine Stunde bei 22°C inkubiert.
2. Die ELISA-Platte wurde mit PBS/Tween gewaschen, mit Marvel blockiert und dann mit PBS/Tween erneut wie bei dem oben in Beispiel 3 beschriebenen ELISA-Verfahren gewaschen.
3. Die angereicherten Antikörper der Seren, welche zu Tetanustoxoid (TT)-Konjugate TT-NAc-CG-Ang I, Ang I-GC- TT, TT-NAc-CG-Ang II und Ang II-CG-TT bestimmt waren, wurden in die beschichteten Vertiefungen bei 2,5 μg/ml PBS pH 7,2 inkubiert (1 Stunde, 22°C).

Der ELISA wurde dann wie bei dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren abgeschlossen, die Absorption wurde jedoch bei 450 nm abgelesen.
2) Für Angiotensinogen:
Der ELISA für die Detektion von nativem Angiotensinogen (Sigma: A-2562) wurde mittels des Verfahrens von Beispiel 3 durchgeführt.
Die angereicherten Antikörper der Seren, die als Tetanustoxoid (TT)-Konjugate TT-NAc-CG-Rng I, Ang I-GC-TT, TT-NAc-CG-Ang II und Ang II-GC-TT bestimmt waren, wurden bei 0,5 μg/ml PBS pH 7,2 inkubiert (1 Stunde, 22°C).
Die Ergebnisse sind in den 4, 5 und 6 gezeigt, welche die Absorption zeigen, die mit ELISA-Platten abgelesen wurden, die mit Angiotensin I (4), Angiotensin II (5) und Angiotensinogen (6) beschichtet waren, und zeigen, dass Antikörper, die zu jedem der Angiotensinderivate bestimmt waren, die an TT konjugiert waren, d. h. TT-NAc-CG-Ang I, Ang I-GC-TT, TT-NAc-CG-Ang II und Ang II-GC-TT Angiotensin I, Angiotensin II und Angiotensinogen erkannten.
Beispiel 6: Generierung von weiteren Angiotensin-Derivaten und Immunisierungsstudien
Die folgenden Angiotensinderivat-Peptide 1–6 wurden gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 synthetisiert.
N-Acetyl-Cys-Ala-Angiotensin I (1) N-Acetyl-Cys-(Ala)₄-Angiotensin I (2) N-Acetyl-Cys(Gly)₆-Angiotensin I (3) N-Rcetyl-Cys-Gly-Ala-Gly-Ala-Angiotensin I (4)
Diese Peptide wurden mit Tetanustoxoid, wie in Beispiel 2 beschrieben, konjugiert und für Immunisierungsstudien unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Protokolls formuliert.
Die Antikörpertiter wurden unter Verwendung der ELISA-Technik, wie in Beispiel 4 beschrieben, gegen die im Immunogen verwendeten Peptide gemessen.
Die Ergebnisse sind in den 7 und 8 dargestellt, welche Graphen zeigen, die auf der y-Achse den Antikörpertiter als den Verdünnungsfaktor zur Erzeugung einer durch SAS^TM (Statistics Analysis System) designierte 0,1 OD-Einheit Änderung an verschiedenen Probentagen zeigen. Jeder gezeigte Datenpunkt repräsentiert den Durchschnitt von 5 Serumproben von 5 verschiedenen Tieren, wobei jedes doppelt getestet ist.
Es wurde gezeigt, dass alle Peptide bei der Generierung einer Anti-Angiotensin I Reaktion effektiv waren. Die Reaktionen variierten in Ausmaß und Dauer.
Deltapak, Deltaprep, Sephadex, Alhydrogel, Tween, Marvel, Flowfusor und Millipore sind registrierte Marken.

Claims

Die Verwendung eines immunogenen Angiotensin-Konjugats, das mindestens ein Angiotension-I-Peptid umfasst, das über einen Peptid-Träger-bindenden Teil an einen Träger gekoppelt ist, zur Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung bei Bekämpfung von Krankheiten, die mit dem Renin-Angiotensinsystem verknüpft sind.
Die Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Angiotensin-Peptid und der Peptid-Träger-bindende Teil zusammen die Sequenz Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Gly-Cys besitzen.
Die Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin der Trägerbindende Teil den Rest einer eine reaktive Seitenkette aufweisenden Aminosäure beinhaltet.
Die Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Träger-bindende Teil einer Peptiderweiterung an dem N- oder dem C-Ende eines Angiotensin-Peptids entspricht.
Die Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Träger-bindende Teil einer Peptiderweiterung an dem N-Ende eines Angiotensin-Peptids entspricht.
Die Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Träger ein Polypeptid ist.
Die Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Träger ausgewählt ist aus den gereinigten Proteinderivaten von Tuberculin, Tetanustoxoid, Diphtherietoxoid, Keyhole limpet haemocyanin oder aus Derivaten davon.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Konjugat eine kreuzreaktive Immunreaktion mit Angiotensin I, Angiotensin II, und/oder angiotensinogenen Molekülen auslöst.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Krankheit kongestive Herzinsuffizienz oder Bluthochdruck ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Modulation des Blutdrucks.