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Gebiet der
Erfindung
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Diese
Erfindung bezieht sich auf ein Massenspektrometer, und sie bezieht
sich insbesondere auf eine stoßinduzierte
Dissoziation (CID) in einem Tandem-Massenspektrometer oder in einer
Ionenführung.
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Hintergrund
der Erfindung
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Multipol-Spektrometer
nur auf Hochfrequenz-(HF-)Basis, insbesondere Quadrupol-Spektrometer, werden
in der Massenspektrometrie und Nuklearphysik aufgrund ihrer Fähigkeit,
Ionen mit nur minimalen Verlusten zu transportieren, häufig verwendet.
Während
eines solchen Ionentransports ändern
sich die Anfangspositionen und die Geschwindigkeiten des Ions, aber
das durch den Ionenstrahl besetzte Gesamtphasenraumvolumen bleibt
konstant (siehe Dawson, Quadrupole mass spectrometry and its applications).
Wird aber ein Puffergas in die Ionenführung eingeleitet, so erfolgt
ein dissipativer Vorgang aufgrund der Ion-Molekül-Kollisionen, und dadurch
wird es für
einen Ionenstrahl möglich,
auf die Quadrupol-Achse fokussiert zu werden, nachdem die Ausgangsgeschwindigkeiten
gesenkt worden sind.
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Stoß-Quadrupol-
oder andere Multipol-Vorrichtungen wurden als Ionenführung verwendet,
wobei sie eine Schnittfläche
zwischen einer Ionenquelle und einem Massenspektrometer bereitstellen,
oder alternativ dazu als Stoßzelle
für Versuche
auf Basis der stoßinduzierten
Dissoziation (CID). Als einfache Schnittfläche reduziert die Stoßdämpfung die
Raum- und Geschwindigkeitsverteilungen der Ionen, die aus der Ionenquelle
austreten, wodurch die Qualität
des Strahls verbessert wird. Für
CID-Versuche treten
Primärionen
mit relativ großen
Geschwindigkeiten in den Multipol ein und stoßen mit den Molekülen des Puffergases
zusammen, so dass eine stoßinduzierte Dissoziation
stattfindet. Der Multipol hilft dabei, sowohl die Primärionen als
auch die Fragment-Ionen, die aus der stoßinduzierten Dissoziation resultieren, nahe
zur Achse zu halten und sie für
eine weitere Analyse zum Austritt zu führen. Kollisio nen innerhalb des
Multipol-Spektrometers dienen wiederum dazu, die Raum- und Geschwindigkeitsverteilung
des Ionenstrahls zu reduzieren.
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Die
Ionenbewegung in einem perfekten Quadrupol-Feld wird durch die Gleichung
nach Mathieu (siehe Dawson, wie zuvor zitiert) gesteuert; Ionen
oszillieren um die Quadrupol-Achse mit einer passenden Grundfrequenz,
die durch ihre m/z und Quadrupol-Parameter bestimmt wird und von
der Ionenposition und -geschwindigkeit unabhängig ist. Fällt die Frequenz einer periodischen
Kraft, die auf die Ionen einwirkt, mit der Grundfrequenz der Ionen
zusammen, so erfolgt eine Resonanzanregung. Eine ähnliche
Resonanzanregung wird allgemein in der Quadrupol-Ionenfalle oder
in Ionen-Zyklotron-Resonanzmassenspektrometern verwendet (R.E. March,
R.J. Huges, Quadrupole storage mass spectrometry, John Wiley & Sons (1989)).
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Diese
Merkmale von Spektrometern wurden auf viele Arten und Weisen angewendet.
Somit ist in der amerikanischen Provisional Application Nr. 60/046.926,
eingereicht am 16. Mail 1997, ein Hochdruck-MS-MS-System offenbart.
Dies zielte darauf ab, Verbesserungen für eine herkömmliche Anordnung eines Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometers
bereitzustellen, wobei zwei Präzisions-Quadrupol-Massenspektrometer,
die durch einen nur-HF-Quadrupol, der als Gasstoßzelle betrieben wird, getrennt
sind, verwendet werden. Das erste Massenspektrometer wird verwendet,
um ein spezifisches Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) eines Ions auszuwählen und
die ausgewählten
Ionen in den nur-HF-Quadrupol oder in die Stoßzelle zu übertragen. In der nur-HF-Quadrupol-Stoßzelle werden
einige oder alle Mutterionen durch Kollisionen mit dem Hintergrundgas,
gewöhnlich
Argon oder Stickstoff, bei einem Druck von bis zu einigen Millitorr
fragmentiert. Die Fragment-Ionen werden daraufhin gemeinsam mit
anderen unfragmentierten Mutterionen in den zweiten Präzisions-Quadrupol übertragen,
der in einem massenauflösenden
Modus betrieben wird. Gewöhnlich
ist der massenauflösende
Modus dieses zweiten Spektrometers so eingestellt, dass er einen spezifizierten
Massenbereich scannt, oder er ist so eingestellt, dass er die ausgewählten Ionenfragmente
mittels Peak-Hopping überträgt, d.h.
er wird schnell so eingestellt, dass in Sequenz spezifische m/z-Verhältnisse
für Ionen
ausgewählt
werden. Die durch dieses Spektrometer übertragenen Ionen werden von einem
Ionendetektor detektiert. Ein Problem in Zusammenhang mit dieser
herkömmlichen
Anordnung besteht darin, dass von den zwei massenauflösenden Quadrupole
gefordert wird, in einem Hochvakuumbereich (weniger als 10–5 Torr)
zu arbeiten, während
die Zwischen-Stoßzelle
bei einem Druck von bis zu einigen Millitorr arbeitet. Diese frühere Erfindung zielte
darauf ab, die Vorrichtung zu vereinfachen und die Erfordernis für getrennte
nur-HF- und auflösende Spektrometer
bei der Eingabe in die Vorrichtung zu eliminieren. Stattdessen ist
ein einzelner Quadrupol bereitgestellt, der im HF-Modus arbeitet,
um als Hochpassfilter zu wirken. Zusätzlich dazu ist dieser Quadrupol
mit einem Wechselstromfeld versehen, das als ein "gefiltertes Störfeld" identifiziert werden kann,
das eine Aussparung im Frequenzbereich, welcher der Masse eines
Ions von Interesse entspricht, enthält. Diese Aussparung kann bewegt
werden, um die erwünschten
Ionen auszuwählen
und zu trennen.
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Es
wurden auch andere ältere
Vorschläge gefunden,
so z.B. im US-Patent Nr. 5.420.425 (Bier et al. und abgetreten an
Finnigan Corporation). Dieses bezieht sich auf ein Ionenfallen-Massenspektrometer zum
Analysieren von Ionen, welches Elektroden aufweist, die so geformt
sind, dass sie ein vergrößertes, von
Ionen besetztes Volumen fördern.
Ein Quadrupol-Feld ist bereitgestellt, um Ionen innerhalb eines vorbestimmten
Bereichs von Masse-Ladungs-Verhältnissen
einzufangen. Danach wird das Quadrupol-Feld verändert, so dass die eingefangenen
Ionen mit den spezifischen Massen instabil werden und die Einfangkammer
in einer Richtung orthogonal auf die Mittelachse der Kammer verlassen.
Die Ionen, die aus dem Spektrometer austreten, werden detektiert, um
ein Signal bereitzustellen, das ihre Masse-Ladungs-Verhältnisse
anzeigt. Ein Verfahren, das in diesem Patent beschrieben ist, besteht
darin, die Ionen innerhalb eines vorbestimmten Bereichs des Masse-Ladungs-Verhältnisses
in die Kammer einzuführen
und im Anschluss daran das Feld zu verändern, um nur einige Ionen
für eine
weitere Manipulation auszuwählen.
Das Quadrupol-Feld wird daraufhin so eingestellt, dass es fähig ist,
die Produkt-Ionen der restlichen Ionen einzufangen, und die restlichen Ionen
werden daraufhin dissoziiert oder mit einem neutralen Gas zur Reaktion
gebracht, um diese Produkt-Ionen auszubilden. Im Anschluss daran
wird das Quadrupol-Feld erneut geändert, um für die De tektion Ionen zu entfernen,
deren Masse-Ladungs-Verhältnisse
innerhalb des erwünschten
Bereichs liegen, woraufhin diese Ionen dann detektiert werden.
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Die
erste obig erklärte
Technik ist komplex und erfordert eine Reihe von einzelnen Quadrupolen oder
dergleichen, und es muss auch möglich
sein, die Ionen sequentiell durch die verschiedenen Quadrupol-Abschnitte
zu bewegen. Die im Finnigan-Patent beschriebene Technik ist komplex
und erfordert eine Reihe von Schritten. Auch bezieht sie sich auf Ionenfallen
und nicht auf einen durchfluss-Quadrupol. Demgemäß ist es erwünscht, eine
Technik bereitzustellen, welche es in einer Vorrichtung leicht ermöglicht,
Ionen eines ausgewählten
Masse-Ladungs-Verhältnisses
einer stoßinduzierten
Dissoziation (CID) oder Fragmentation zu unterziehen, so dass die
Fragmente für
eine nachfolgende Analyse weitertransportiert werden können. Es
ist erwünscht, dies
in einer einzelnen Vorrichtung bereitzustellen, da die Bewegung
von Ionen von einer Vorrichtung zu einer anderen Vorrichtung unweigerlich
zu gewissen Verlusten führt. Ähnlich funktionieren
die Techniken nach dem Finnigan-Patent mit Puls-Ionenquellen, aber
Versuche, diese für
einen kontinuierlichen Ionenstrom zu verwenden, so z.B. von einer
Elektrospray-Ionenquelle, werden zu Ineffizienz führen. Auf diesem
Gebiet werden Spektrometer häufig
verwendet, um kleine Proben zu analysieren, und oftmals ist eine
hohe Effizienz erforderlich, wenn eine verlässliche Ablesung oder Messung
erhalten werden soll.
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Ein
weiterer Vorschlag ist in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung
0529558 an den Abtretungsempfänger
der vorliegenden Erfindung vorhanden. Sie offenbart ein Multipol-Eintrittssystem für Ionenfallen.
Sie schlagen beide die Möglichkeit des
Ausstoßes
unerwünschter
Ionen mittels resonanten Ausstoßes
sowie auch das ausreichende Anregen von Ionen durch die Anregung
ihrer niedrigsten oder anderer resonanten Frequenzen vor, um eine stoßinduzierte
Dissoziation hervorzurufen.
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Zusammenfassung
der vorliegenden Erfindung
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Gemäß einem
ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Analysieren
einer Substanz bereitgestellt, wobei das Verfahren dabei die folgenden
Schritte umfasst:
- (1) das Ionisieren der Substanz,
um einen Ionenstrom zu erzeugen;
- (2) das Zuführen
des Ionenstroms zu einer Quadrupol-Ionenführung;
- (3) das Bereitstellen eines Puffergases in der Ionenführung;
- (4) das Anlegen eines Hochfrequenzfeldes durch die Quadrupol-Ionenführung, um
die erwünschten Ionen
in einer stabilen Bahn durch die Ionenführung zu halten;
- (5) das Anlegen einer periodischen Veränderung an die Ionenführung, zusätzlich zum
im Schritt (4) angelegten Hochfrequenzfeld, um eine Resonanzanregung
der Ionen mit einem ausgewählten m/z-Verhältnis zu
bewirken, wodurch die ausgewählten
Ionen erhöhte
kinetische Energien erreichen, was in einer verstärkten stoßinduzierten Dissoziation
mit dem Puffergas resultiert;
- (6) das Anlegen zumindest eines zusätzlichen Anregungsfeldes im
Quadrupol, wobei das zusätzliche
Anregungsfeld so ausgewählt
ist, dass eine Resonanzanregung eines zusätzlich ausgewählten Mutterions
und eines Fragment-Ions hervorgerufen wird; und
- (7) das Analysieren des Ionenspektrums nach der Fragmentierung.
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Die
ausgewählten
Ionen werden vorzugsweise einer Resonanzanregung durch eines der
Verfahren unterzogen: Anlegen eines zusätzlichen Felds im Quadrupol,
entweder durch das Anlegen an den bestehenden Stabsatz oder durch
das Anlegen an zusätzlichen
Elektroden oder Stäben,
die für
diese Zweck bereitgestellt werden; Amplitudenmodulation des Hochfrequenzfelds,
das durch den Quadrupol angelegt ist; Frequenzmodulation des Hochfrequenzfelds,
das durch den Quadrupol angelegt ist; und periodische Variation
im Quadrupol-Radius, wobei die Resonanzanregung eine andere Frequenz
als jene Frequenz des Hochfrequenzfelds aufweist.
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Mit
einem Puffergas in einem Quadrupol gibt es eine Anregungsschwelle,
unterhalb welcher die gesamte während
einer Anregungsperiode erreichte Energie in Kollisionen verbraucht
wird. Somit reflektiert der Schwellenwert die Stoßeigenschaften
der angeregten Ionen, und auf diese Weise können der Querschnitt und die
Mobilität
der Ionen gemessen werden.
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Eine
Variante dieses ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung stellt
auch Verfahren zum Analysieren einer Substanz bereit, wobei das
Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
- (1)
das Ionisieren der Substanz, um einen Ionenstrom zu erzeugen;
- (2) das Zuführen
des Ionenstroms durch einen Massenanalysator, um ein Mutterion auszuwählen;
- (3) das Bereitstellen einer Quadrupol-Ionenführung und eines Puffergases
in der Ionenführung;
- (4) das Anlegen eines Hochfrequenzfeldes durch die Quadrupol-Ionenführung, um
die erwünschten Ionen
in einer stabilen Bahn durch die Ionenführung zu halten;
- (5) das Zuführen
der im Massenanalysator ausgewählten
Mutterionen zur Quadrupol-Ionenführung mit
ausreichender Energie, um eine stoßinduzierte Dissoziation mit
dem Puffergas und die Erzeugung von primären Fragment-Ionen zu bewirken;
- (6) das Anlegen einer periodischen Veränderung an die Ionenführung, zusätzlich zum
im Schritt (4) angelegten Hochfrequenzfeld, um eine Resonanzanregung
der primären
Fragment-Ionen mit einem ausgewählten
m/z-Verhältnis
zu bewirken, wodurch die ausgewählten
primären
Fragment-Ionen erhöhte
kinetische Energien erreichen, was in einer verstärkten stoßinduzierten Dissoziation
mit dem Puffergas resultiert, um sekundäre Fragment-Ionen zu erzeugen;
und
- (7) das Analysieren des Ionenspektrums nach der Fragmentierung.
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Gemäß einem
anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zum
Analysieren einer Substanz durch Resonanzanregung von ausgewählten Ionen
und selektive stoßinduzierte Dissoziation
bereitgestellt, wobei die Vorrichtung umfasst:
eine Ionenquelle
zum Erzeugen eines Ionenstroms;
eine erste Qudrupol-Ionenführung, um
den Ionenstrom aufzunehmen und die Massenselektion eines Mutterions
vorzunehmen;
eine zweite Quadrupol-Ionenführung zum Aufnehmen des Mutterionenstroms,
der mit einem Puffergas zur stoßinduzierten
Dissoziation zwischen den Mutterionen und dem Puffergas ausgestattet
ist, um primäre
Fragment-Ionen zu erzeugen;
Mittel zum Erzeugen eines Hochfrequenzsignals
in der zweiten Quadrupol-Ionenführung,
um Ionen durch die zweite Quadrupol-Ionenführung zu lenken, wobei das
Erzeugungsmittel mit der zweiten Quadrupol-Ionenführung verbunden
ist;
Mittel zum Erzeugen eines Anregungssignals, das mit der
zweiten Quadrupol-Ionenführung
verbunden ist, um eine Resonanzanregung von zumindest einem der
Mutterionen und den primären
Fragment-Ionen zu bewirken, wodurch eine stoßinduzierte Dissoziation zwischen
den Mutterionen und dem Puffergas herbeigeführt wird, wobei aus den Mutterionen
primäre
Fragment-Ionen und aus den primären
Fragment-Ionen sekundäre
Fragment-Ionen erzeugt werden; und
einen Endmassenanalysator,
der mit der zweiten Quadrupol-Ionenführung verbunden ist, um Mutter- und
Fragment-Ionen aufzunehmen und das Ionenspektrum zu analysieren.
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Eine
Variante dieses zweiten Aspekts der vorliegenden Erfindung stellt
eine Vorrichtung zum Analysieren einer Substanz durch Resonanzanregung
von ausgewählten
Ionen und selektive stoßinduzierte
Dissoziation bereit, wobei die Vorrichtung umfasst:
eine Ionenquelle
zum Erzeugen eines Ionenstroms;
eine Quadrupol-Ionenführung zum
Aufnehmen des Mutterionenstroms, der mit einem Puffergas zur stoßinduzierten
Dissoziation zwischen den Ionen und dem Puffergas ausgestattet ist,
um Fragment-Ionen zu erzeugen;
Mittel zum Erzeugen eines Hochfrequenzsignals
in der Quadrupol-Ionenführung,
um Ionen durch die Quadrupol-Ionenführung zu lenken, wobei das
Erzeugungsmittel mit der Quadrupol-Ionenführung verbunden ist;
Mittel
zum Erzeugen eines Anregungssignals, das mit der Quadrupol-Ionenführung verbunden
ist, um eine Resonanzanregung von zumindest zwei verschiedenen Ionen
bei zwei verschiedenen Frequenzen zu bewirken, wodurch eine erhöhte stoßinduzierte
Dissoziation zwischen den ausgewählten
Ionen und dem Puffergas herbeigeführt wird, wobei Fragment-Ionen
erzeugt werden; und
einen Endmassenanalysator, der mit der
Quadrupol-Ionenführung
verbunden ist, um Ionen aufzunehmen und das Ionenspektrum zu analysieren.
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Während die
Verwendung einer Quadrupol-Vorrichtung in der vorliegenden Erfindung
bevorzugt wird, ist auch vorgesehen, dass die Erfindung auf eine
Vielzahl von Multipol-Instrumente angewendet werden kann, so etwa
eine Hexapol- oder Oktopol-Vorrichtung. In diesen Vorrichtungen
hängt die Säkularfrequenz
eines Ions von dessen Position ab, so dass die Massenauflösung und
die Selektivität nicht
so hoch sind. Für
einige Anwendungen kann aber die in anderen Multipol-Vorrichtungen
verfügbare
Selektivität
ausreichend sein, und somit können sowohl
das Verfahren als auch die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung
unter Verwendung einer Vielzahl von Multipol-Vorrichtungen implementiert
werden.
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Kurzbeschreibung
der Figuren
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Für ein besseres
Verständnis
der vorliegenden Erfindung und für
eine klarere Darstellung, wie diese ausgeführt wird, wird nunmehr anhand
von Beispielen Bezug auf die begleitenden Zeichnungen genommen,
worin:
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1 schematisch
eine erste Ausführungsform
einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden
Erfindung zeigt;
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2 schematisch
eine zweite Ausführungsform
einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung
zeigt;
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3a und 3b ein
Spektrum von Ionencounts über
Masse für
eine Probe in verschiedenen Maßstäben darstellen;
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4a und 4b ein
Spektrum derselben Probe wie für 3 nach der Fragmentation und ebenfalls
in verschiedenen Maßstäben darstellen;
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5 einen ähnlichen
Graphen wie 4a zeigt, das aber in einem
anderen Modus arbeitet; und
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6 das
Spektrum der 4a nach Subtraktion des Spektrums
der 3a zeigt.
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Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsformen
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1 zeigt
eine erste Ausführungsform
einer Vorrichtung, die im Allgemeinen mit der Bezugsziffer 10 bezeichnet
wird. Die Vorrichtung 10 umfasst eine ElektrosprayIonenquelle 12.
Eine Gasvorhangstufe 14 wird verwendet, um geladene Tröpfchen mithilfe
von heißem
trockenem Stickstoff 16 zu verdampfen. Eine erhitzte Kapillare 18 führt das
Gas-Ionen-Gemisch in eine Vakuumkammer 22 ein, die eine erste
Stufe einer Schnittstelle zwischen Atmosphärendruck und hohem Vakuum ist.
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Die
Kammer 22 wird durch die Leitung oder Verbindung 24 ausgepumpt,
so dass der Druck in der Kammer 22 gewöhnlich etwa 2,4 Torr beträgt. Eine Fokussierungselektrode 20 hilft,
die Ionen vom Puffergas zu trennen und diese Ionen zu einem Skimmer 28 hinzulenken.
Der Skimmer 28 trennt die erste Kammer 22 der
Schnittstelle von der zweiten Kammer 26. Eine Verbindung 30 ist
für die
nächste
Pumpe vorgesehen, und der Druck an dieser Stufe beträgt etwa
0,1 Torr. Die Quadrupol-Ionenführung 32 ist
in der Kammer 26 in bekannter Weise vorgesehen.
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Eine
dritte Stufe 36 der Schnittstelle ist von der zweiten Stufe
durch eine Wand 34 mit einer kleinen Öffnung darin, damit die Ionen
hindurchgehen können,
getrennt. Netzelektroden 37 fokussieren die Ionen zu einer
Eintrittsöffnung 40 eines
Flugzeitanalysators (TOF-Analysators).
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Innerhalb
der Kammer des TOF-Analysators ist eine Beschleunigungssäule 42 positioniert.
Diese besteht aus einer Anordnung von Elektroden. In bekannter Weise
füllen
die Ionen zuerst einen Anhäufungs-Extraktionsbereich
während
einer Anhäu fungsperiode,
in welcher keine Potentialdifferenz über die Elektroden am Boden
des TOF angelegt wird. Danach wird Spannung zur Bodenplatte gepulst,
um Ionen zu extrahieren oder sie in die Beschleunigungssäule zu treiben.
Der wiederholte Vorgang von Anhäufung-Extraktion
ermöglicht
die Analyse eines kontinuierlichen Ionenstrahls ohne dramatische
Verluste. Wie bei 44 angezeigt, treten Ionen nach der Beschleunigung
in die Haupt-TOF-Kammer 46 ein.
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Ein
Ionenspiegel 48, der aus einer Elektrodenanordnung besteht,
erzeugt ein Feld, um die Bewegung der Ionen, wie dies bei 50 dargestellt
ist, umzukehren, und dieser verbessert auch die Spektralqualität des TOF
aufgrund des so genannten "Zeitfokussierungseffekts". Die Ionen werden
beim Detektor 52 gesammelt, und ihre Flugzeit vom Boden
der Beschleunigungssäule 42 zu
dieser Ebene wird gemessen, um einen Messwert für das Masse-Ladungs-Verhältnis der
Ionen zu ergeben.
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Nunmehr
wird gemäß der vorliegenden
Erfindung die Quadrupol-Ionenführung 32 in
der zweiten Kammer betrieben, um eine stoßinduzierte Dissoziation der
Ionen von Interesse zu bewirken. In dieser Hinsicht weist die Quadrupol-Ionenführung unter vielen
anderen zur Verfügung
stehenden Multipol-Konstruktionen ein einzigartiges Merkmal auf.
Ionen mit stabilen Bahnen in einem perfekten Quadrupol-Feld oszillieren
um die Mittelachse des Quadrupols mit einer so genannten Grund-
oder Säkularfrequenz,
die durch ihr m/z-Verhältnis
und die Parameter des an den Quadrupol angelegten HF-Feldes bestimmt
wird. Die Grundfrequenz für
jedes Ion hängt von
den Ausgangskoordinaten und der Geschwindigkeit des Ions ab.
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Nun
haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung erkannt, dass, wenn
ein passendes zusätzliches
Feld, das bei einer Grundfrequenz ffund (oder
ihres Vielfachen) oszilliert, an die Quadrupol-Ionenführung 32 angelegt
wird, dieses Feld eine Resonanzanregung von Ionen mit dem bestimmten
m/z-Verhältnis
bewirken kann. Ein solches Feld ist wie folgt definiert: f = ffund ± n·fHF (n = 0, ±1, ±2 etc.) (1)
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Alternativ
dazu können
andere periodische Veränderungen
in den Quadrupol-Parametern, so etwa die HF-Amplitude, eine ähnliche
Resonanzanregung bereitstellen. Darüber hinaus wird erwartet, dass
eine Anregung bei einigen verschiedenen voreingestellten Frequenzen
dazu führt,
dass eine Reihe verschiedener Ionen mit verschiedenen m/z-Verhältnissen
angeregt werden.
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Als
Ergebnis einer solchen Anregung wird die mittlere Geschwindigkeit
der ausgewählten
Ionen erhöht.
Eine solche Resonanzanregung ist bekannt und wurde bereits für die Verwendung
in der Isotop-Trennung vorgeschlagen, indem das m/z eines Isotops
selektiv angeregt wird, damit es aus dem Quadrupol durch Auftreffen
auf die Stäbe
entfernt wird, wodurch wiederum der Ionenstrahl mit dem bevorzugten
Isotop angereichert wird (Dawson, Quadrupole mass spectrometry and
its application). Ähnliche
Verfahren zur Resonanzanregung wurden für die Ionendetektion und die
stoßinduzierte
Dissoziation in einer dreidimensionalen Quadrupol-Ionenfalle verwendet.
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In
einer 3D-Falle werden Ionen über
einen ausgewählten
Zeitraum gemeinsam verwendet, wodurch es möglich ist, sie anzuregen und
nach einer passenden Zeitspanne zu fragmentieren. In der vorliegenden
Erfindung werden die Ionen fragmentiert, wenn sie durch den Quadrupol
hindurchgehen, ohne dass sie dabei eingefangen werden. Da die Ionen
nur eine begrenzte Zeit im Quadrupol verbringen, wurde ursprünglich davon
ausgegangen, dass sie nicht über
ausreichend Zeit verfügen,
um angeregt und fragmentiert zu werden, bevor sie das Ende des Quadrupols
erreichen, ohne an die Stäbe
anzuschlagen. Auf ähnliche
Weise werden Ionenfallen bei einem Druck von etwa 1 Millitorr oder
weniger Helium betrieben, und dies zeigt nicht, ob die Ionen bei
einem Druck von 100 mTorr selektiv angeregt und dazu gebracht werden
können,
zu fragmentieren, da der höhere
Druck so wirkt, dass die radiale Ionenbewegung geschwächt wird.
Zusätzlich
dazu konnten die "Auflösung" (tatsächlich ein
Fenster von etwa 100 Dalton Breite, wie in 4a dargestellt),
der hohe Druck und die Fragmentationseffizienz bei diesem hohen
Druck nicht alle vom Stand der Technik abgeleitet werden.
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Auch
sind die Elektrodenkonfigurationen und Arbeitssysteme zwischen 3D-Ionenfalle
und Quadrupol-Ionenführung
unterschiedlich. Eine Ionenfalle ist ein Massenspektrometer vom
Speichertyp; dabei werden Ionen zuerst angehäuft, danach verarbeitet und
schließlich
detektiert. Ein 3D-Quadrupol-Feld in einer Ionenfalle wirkt in alle
drei Dimensionen und fokussiert Ionen zur Mitte der Falle hin. Eine
Quadrupol-Ionenführung
oder ein 2D-Quadrupol sind gewöhnlich
Durchflussvorrichtungen. Diese Vorrichtung stellt einen konstanten
Ionenstrom vom Eintritts- bis zum Austrittsende bereit. Ein 2D-Feld
wirkt in zwei Dimensionen orthogonal auf die Quadrupol-Achse und
fokussiert Ionen zur Achse des Quadrupols hin.
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Das
Finnigan-Patent ist im Bereich der 2D-Quadrupole eine Ausnahme.
Hier schlagen die Erfinder vor, es in einem Speichermodus zu verwenden,
wobei beide Enden durch die höheren
Gleichspannungen, die an die Elemente an den Enden des Haupt-Quadrupols
angelegt werden, geschlossen werden. Im Gegensatz dazu wird in der
vorliegenden Erfindung das Anregungsverfahren im Durchflussmodus
verwendet. Auch schlägt
das Finnigan-Patent die Verwendung des radialen Ausstoßes der
zu detektierenden Ionen vor. Das Patent schlägt die Resonanzanregung und
Extraktion durch einen Schlitz in einem Stab des Quadrupols vor,
was den in 3D-Ionenfallen implementierten Detektionsverfahren ähnlich ist.
Dies bedeutet, dass der Strahl von extrahierten Ionen breite Raum-
und Geschwindigkeitsverteilungen zeigen wird. Somit ist es schwierig,
diesen Strahl zu managen, um ihn in eine andere Analysevorrichtung
einzuführen,
so z.B. TOF- oder ICR-Massenspektrometer, und um die beste Auflösung zu
erhalten, zu welcher letztere Vorrichtung fähig ist. In unserem Fall erfolgt
die Extraktion in axialer Richtung, wodurch sich ein Strahl mit
hoher Qualität
ergibt, der leicht in eine andere Vorrichtung eingeführt werden kann,
so z.B. den TOFMassenanalysator in 1.
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Hier
erreichen die angeregten Ionen hohe kinetische Energien, und eine
stoßinduzierte
Dissoziation ist eher wahrscheinlich. Resultierende fragmentierte
Ionen weisen gewöhnlich
m/z-Verhältnisse
auf, die sich von jenen der Mutterionen unterscheiden, so dass sie
der Resonanzanregung nicht unterliegen. Tatsächlich kühlen diese Fragment-Ionen ab
und werden auf die Achse des Quadrupols 32 fokussiert.
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Somit
ermöglicht
das Verfahren der vorliegenden Erfindung, dass Ionen für die Fragmentation durch
die geeignete Wahl der Anregungsfrequenz ausgewählt werden, d.h. die Ionen
werden auf der Basis ihrer m/z-Verhältnisse ausgewählt. Dies
verläuft
etwas analog zur Auswahl eines Ions in einem Stromauf-Quadrupol-Massenfilter
für die
Fragmentation in einer getrennten Stoßzelle. Hier werden die zwei
Schritte der Auswahl und der Kollision in einem einzigen Quadrupol
durchgeführt,
ohne dass dafür eine
andere Vorrichtung, abgesehen von der zusätzlichen Ausrüstung zur
Signalerzeugung oder zur Modulation, hinzugefügt wird. Als solche sollte
die Vorrichtung eine weit höhere
Empfindlichkeit bereitstellen können,
da es in den Schritten der Auswahl und den Zwischenschritten keine
Verluste gibt.
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Wie
zuvor angeführt,
kann jede geeignete Form der Anregung vorgesehen sein. Insbesondere gibt
es drei bevorzugte Anregungsmodi, die nachfolgend getrennt voneinander
beschrieben sind: ein Anregungssignal mit seiner eigenen Frequenz,
das zum Quadrupol-Feld addiert wird; eine Amplitudenmodulation des
Haupt-HF-Quadrupol-Felds
mit der Anregungsfrequenz; und die Phasen- oder Frequenzmodulation
des Haupt-HF-Signals für
den Quadrupol mit der Anregungsfrequenz. Die Bereitstellung dieses zusätzlichen
Anregungssignals kann einfach unter Verwendung bekannter Instrumente
erfolgen. Dies ist schematisch in 1 dargestellt,
worin 60 eine herkömmliche
Ausrüstung
für die
Bereitstellung von HF- und Gleichspannungs-Anregung an die Quadrupol-Ionenführung 32 bezeichnet
und worin 62 einen zusätzlichen
Schaltkreis oder eine Ausrüstung
zum Bereitstellen des zusätzlichen,
für die
vorliegende Erfindung erforderlichen Anregungssignals bezeichnet.
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Die
Addition eines Anregungssignals zum herkömmlichen Quadrupol-HF-Signal
ist durch die folgende Gleichung dargestellt: U(t) = UHF·sin(Ω·t) + UHFΔm·sin(ω·t), (2) worin
- U(t)
- = Quadrupol-Potential,
- UHF
- = Haupt-HF-Wellenamplitude,
- Ω
- = Haupt-HF-Frequenz,
- Δm
- = Anregungsfaktor,
- ω
- = Anregungsfrequenz.
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Alternativ
dazu ist für
die Amplitudenmodulation das an die Quadrupol-Ionenführung angelegte Signal
durch die folgende Gleichung dargestellt: U(t) = UHF·sin(Ω·t)·(1 + Δexc·sin(ω·t)), (3)worin Δexc =
Modulationsfaktor;
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Schließlich wird
für die
dritte Möglichkeit
die Frequenz- oder Phasenmodulation des HF-Anregungssignal durch
die folgende Gleichung dargestellt: U(t) = UHF·sin(Ω·t + Δexc·(Ω/ω)·sin(ω·t)). (4)
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Nun
wird ein Bezug auf die 3–6 hergestellt,
die Spektren darstellen, die unter Verwendung des Verfahrens der
vorliegenden Erfindung erhalten wurden. Ein Peptid, Substanz P,
wurde verwendet, um Ionen in der Vorrichtung der 1 zu
erzeugen. Im ersten Test betrug das HF-Potential 690 Volt bei einer
Frequenz von 1,93 MHz, wie dies durch die folgende Gleichung gegeben
ist: U(t) = 690<V>·sin(2·π·1930000·t<s>). (5)
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Die
Ergebnisse sind in 3 dargestellt.
Im Test wurden sowohl doppelt geladene als auch einfach geladene
Ionen beobachtet. Ein signifikanter Peak von doppelt geladenen Ionen
bei m/z = 674 m/z wurde beobachtet und mit 70 bezeichnet.
Dies ist im Detail in der Insert – 3b dargestellt,
welche, als Vergrößerung,
das Spektrum im Bereich von 600-800 m/z zeigt.
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Der
zweite Test wurde mit demselben Peptid und mit demselben Basissignal
für das
HF-Feld durchgeführt.
Eine zusätzliche
Komponente wurde diesem Feld mit einem Potential von 9 Volt und
einer Frequenz von 231 kHz zugegeben, wobei das Gesamtsignal durch
die folgende Gleichung dargestellt ist: U(t) = 690<V>·sin(2·π·1930000·t<s>)
+ 9<V>·sin(2·π·231000·t(s)). (6)
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Wie
in 4a dargestellt ist, wurde herausgefunden, dass
die doppelt geladenen Ionen so angeregt wurden, dass energetische
Kollisionen mit dem Puffergas erfolgten, wodurch die Ionenfragmentation
bewirkt wurde. Das Puffergas war Stickstoff. Daraus resultierte,
dass es eine Senke im Spektrum von etwa 600 bis gerade über 700
m/z gibt, wie das am besten im Insert 4b dargestellt
ist, und es wurden auch intensive Peaks der Fragmente beobachtet.
Entsprechend ergaben die fragmentierten Ionen höhere Konzentrationen in anderen
Teilen des Spektrums.
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Tatsächlich wurde
herausgefunden, dass die besten Resultate erhalten werden können, wenn
die Anhäufung/Subtraktion
im Spektrum online erfolgt, d.h. Spektrum mit und ohne Anregung
werden abwechselnd aufgenommen. Dadurch haben langsame Variationen
in der Ionenintensität
keinen Einfluss auf die resultierenden subtrahierten Spektren.
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Um
den Effekt dieser Anregungsfragmentation besser darzustellen, zeigt 6 die
Spektren der 4a, wobei die Spektren der 3a subtrahiert sind. 6 wurde
mit Standardbenennung markiert, um die verschiedenen in diesem Spektrum
identifizierten Fragmente zu zeigen.
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5 zeigt
ein anderes alternatives Anregungssystem gemäß der Gleichung 2, d.h. Amplitudenmodulation.
Erneut wurden hier dieselbe Spannung und Frequenz für das Grund-HF-Signal
verwendet, wobei die Amplitude des Signals Sinus-Schwankungen bis
zu maximal 17% unterworfen war; erneut mit einer Frequenz von 231
kHz, wie durch die folgende Gleichung dargestellt: U(t) = 690<V>·sin(2·π·1930000·t<s>)
+ (1 + 0,17·sin(2·π·231000·t(s))). (7)
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Es
ist ersichtlich, dass das in 5 erhaltene Spektrum
jenem, das in 4a erhalten wurde, sehr ähnlich ist,
wenngleich mit geringer Variation und der Verteilung der verschiedenen
Fragmente. Die Senke im Spektrum ist bei 78 und Fragmente
bei 79 dargestellt. Es ist anzumerken, dass abhängig von
der zu untersuchenden Substanz und anderen Eigenschaften ein passendes
Anregungssystem ausgewählt werden
kann, um optimale Resultate zu ergeben.
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Es
wurde herausgefunden, dass der Anregungseffekt in Spektren nur dann
bemerkbar wird, wenn eine gewisse Höhe einer überlagerten Spannung erreicht
wird. Diese Schwelle wird durch den Ausgleich der Anregungsdissipationskräfte, gemittelt über die
Periode der Anregungsfrequenz, bestimmt. Daraus ergibt sich, dass
die Dissipationskräfte
gemessen werden können,
wodurch sich Werte für
die Ionenmobilität
und den Stoßquerschnitt
ergeben.
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Es
wird erwartet, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung, das
selektive CID bereitstellt, im Vergleich zu herkömmlicher Standard-Tandem-MS-MS
eine höhere
Empfindlichkeit ergibt. In einer Standard-MS-MS-Technik oder einem
solchen Versuch kann die Übertragung
von Ionen durch den das Mutterion auswählenden Massenfilter so gering wie
10 % sein, so dass nur ein kleiner Teil des möglich verfügbaren Ionenstrahls möglicherweise
Fragment-Ionen ergeben kann. Im Gegensatz dazu stehen mit der Technik
der vorliegenden Erfindung alle Mutterionen für eine Fragmentation zur Verfügung. Es
ist anzumerken, dass diese Arten der Analysetechnik oftmals in Situationen
verwendet werden, in welchen nur eine sehr kleine Menge einer Probe
zur Verfügung
steht. So sind z.B. in gewissen wissenschaftlichen oder biologischen
Studien nur sehr kleine Probenmengen verfügbar. Diese Art von Spektrometern
werden oftmals bei kriminalpolizeilichen Untersuchungen bezüglich Drogen,
Sprengstoffen und dergleichen eingesetzt, und erneut steht hier
oftmals nur eine Spur oder eine kleine Menge einer Probe zur Verfügung. Somit
ist es höchstgradig
erwünscht, über ein
Instrument mit einer hohen Empfindlichkeit zu verfügen.
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Ein
weiterer Vorteil besteht darin, dass für die Vorrichtung der vorliegenden
Erfindung nur ein Massenanalysator, entweder ein Quadrupol oder
eine Flugzeitvorrichtung, wobei Letzteres in 1 gezeigt ist,
anstelle der zwei oder mehr Massenanalysatoren erforderlich ist,
die für
Standard-MS-MS-Instrumente notwendig sind.
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Nunmehr
erfolgt ein Bezug auf 2, die eine alternative oder
zweite Ausführungsform
einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden
Erfindung zeigt, welche im Allgemeinen durch die Bezugsziffer 80 bezeichnet
ist. Diese Vorrichtung 80 weist eine Ionenquelle 82 sowie
einen ersten Massenanalysator oder ein Quadrupol 84 auf.
In bekannter Weise umfasst dies eine Eintritts-Skimmer-Platte 85 und
einen Quadrupol-Stabsatz 86.
Diese wird bei einem so niedrigen Druck wie in einem herkömmlichen
Quadrupol-Massenfilter betrieben. Der Druck hier kann von 10–4 Torr
bis zu einem höheren
Vakuum variieren. Das ist abhängig
von den Betriebsparametern, hauptsächlich den Dimensionen, und
sie arbeitet nur, um Ionen mit einem m/z von erwünschtem Interesse auszuwählen. Diese
Ionen werden daraufhin in den zweiten Quadrupol geleitet, der im
Allgemeinen durch die Bezugsziffer 88 gekennzeichnet ist
und einen Stabsatz 89 aufweist. Danach wird diese Vorrichtung
wie der Quadrupol-Satz
oder die Führung 32 der ersten
Ausführungsform
bei einem erhöhten
Druck von z.B. 10–4 Torr bis 1 Torr betrieben,
was wiederum von den Betriebsparametern, hauptsächlich dabei den Dimensionen,
abhängig
ist. Ein Signal gemäß einer
der obigen Gleichungen wird angelegt, um die Anregung eines erwünschten
Ions, eine Fragmentation etc. zu bewirken. Die fragmentierten Ionen
werden danach zu einem Endmassenanalysator 90 geleitet,
der ein beliebiger geeigneter Analysator wie z.B. ein Quadrupol-
oder ein Flugzeitmassenspektrometer sein kann.
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Der
Vorteil dieser zweiten Ausführungsform liegt
darin, dass gewisse Ionen effektiv im ersten Massenanalysator 84 ausgefiltert
werden können, um
eine größere Selektivität zu erzielen.
Danach werden nur die erwünschten
Ionen im zweiten Quadrupol 88 angeregt. Es ist anzuerkennen,
dass die Selektivität
der Technik der vorliegenden Erfindung nicht perfekt ist und dass
diese zweite Technik das vorherige Entfernen von Ionen, welche ein
Signal stören
oder beeinträchtigen
könnten,
sicherstellt.
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Es
ist auch anzumerken, dass die vorliegende Erfindung angewendet werden
kann, um Standard-Dreifach-Quad- oder -Quadrupol-Flugzeitinstrumente
(Q-TOF oder QqTOF) zu MS-MS-MS- oder sogar MSn-Instrumenten
zu erweitern. Für MS-MS-MS
bedeutet dies, dass ein Mutterion in Q1 (der ersten MS-Auswahl)
auf normale Weise ausgewählt
wird, dass die Ionen beschleunigt und in das Puffergas Q2 bei Energien
vom Dutzenden eV eingeführt
werden, wobei die beschriebene Erfindung verwendet wird, um eines
der Fragmente in Q2 selektiv anzuregen, und das resultierende Spektrum
in Q3 (oder im letzten MS, das ein TOF sein könnte) analysiert wird. Die
obigen Subtraktionsverfahren könnten verwendet
werden, um die "Fragmente
vom Fragment" von
den Fragmenten des Ausgangs-Mutterions zu trennen. In jedem Fall
kann dies als MS-MS-MS bezeichnet werden, da dieses Verfahren ein
Fragmentspektrum eines Fragments bereitstellt. MS-MS-MS-MS führt diese
Idee noch weiter und liefert zwei Anregungen, wobei eine so abgestimmt
ist, dass sie das Fragment des Fragments fragmentiert, und die andere,
dass sie das "Fragment
des Fragments des Fragments fragmentiert" etc. Subtraktionsverfahren (d.h. Verfahren
mit aktivierter und deaktivierter Anregung) werden verwendet, um
zu dekonvulieren und zu analysieren, wie oben detailliert ausgeführt wurde.
Tatsächlich
ermöglicht
die vorliegende Erfindung die Durchführung einer Reihe von Schritten
in einem einzelnen Schritt, wofür
in einem herkömmlichen
Instrument zwei oder mehr MS-Schritte erforderlich wären. Dies
umgeht das Problem von multiplen Schritten sowie den Probenverlust
zwischen diesen Schritten.
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Es
ist anzumerken, dass verschiedene Modifikationen innerhalb des Schutzumfanges
und des Geistes der vorliegenden Erfindung möglich sind. Somit ist es möglich, während die
obigen Gleichungen eine einzelne zusätzliche Frequenz vorschlagen,
die an die Grundanregungsfrequenz angelegt wird, dass einige zusätzliche
Frequenzen für
die Anregung verwendet werden könnten.
Dies würde
ermöglichen, dass
eine Reihe verschiedener Ionen gleichzeitig angeregt werden kann.
Die zusätzlichen
Frequenzen können
entweder dazu verwendet werden, zusätzliche Mutterionen anzuregen
oder Fragment-Ionen anzuregen, von denen allgemein bekannt ist,
dass sie durch die Anregung erzeugt werden, die durch die erste
angelegte Frequenz entsteht. Anders gesagt bedeutet dies, dass die
erste Frequenz ausgewählt werden
kann, um die Anregung eines erwünschten Ions
zu bewirken. Unter der Annahme, dass dies gewisse Fragmente erzeugt,
z.B. die Fragmente 72, 73 oder 74 in 4a,
kann eine zweite zusätzliche
Frequenz gleichzeitig angelegt werden, die z.B. für die Fragmente 74 ausgewählt ist.
Dies ergibt dann wiederum sekundäre
Fragmente. Es ist anzumerken, dass dieser Verbindungseffekt so oft
wie erwünscht angewendet
werden kann, so dass man tatsächlich (MS)n in einem einzigen Stoß-Quadrupol ausführen kann.
Dies kann wiederum zu hohen Effizienzen führen, da unweigerlich die Ionenübermittlung
von einem Quadrupol zu einem anderen zu einem Verlust von Ionen
und einem Signalverlust führt.