DE69738637T2 - LEPTIN RECEPTOR DB, RECEPTOR-CODING NUCLEIC ACIDS AND APPLICATIONS THEREOF - Google Patents

LEPTIN RECEPTOR DB, RECEPTOR-CODING NUCLEIC ACIDS AND APPLICATIONS THEREOF Download PDF

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Abstract

The present invention relates to identification of a receptor for a satiety factor, which is involved in body weight homeostasis. Mutations in this receptor are associated with obese phenotypes. In particular, the present invention relates to identification and characterization of the receptor for leptin, including a naturally occurring soluble form of the receptor that is expected to modulate leptin activity, in particular to agonize leptin activity. The invention further relates to the nucleic acids encoding the receptor, and to methods for using the receptor, e.g., to identify leptin analogs, therapeutically, such as in gene therapy or in soluble form as an agonist or antagonist of leptin activity, or diagnostically.

Description

Die Forschung, welche zur vorliegenden Erfindung führte, wurde teilweise durch Fördermittel der National Institutes of Health, RO1 DK41096-07 unterstützt. Folglich hat die Regierung der Vereinigten Staaten bestimmte Rechte an der Erfindung.The Research leading to the present invention has been partially accomplished funding of the National Institutes of Health, RO1 DK41096-07. consequently The United States Government has certain rights in the United States Invention.

GEBIET DER ERFINDUNGFIELD OF THE INVENTION

Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifikation eines Rezeptors für einen Sättigungsfaktor, welcher an der Körpergewichtshomeostase beteiligt ist. Mutationen in diesem Rezeptor sind mit fettleibigen Phänotypen verbunden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Identifikation und Charakterisierung des Rezeptors für Leptin, einschließlich einer natürlich vorkommenden löslichen Form des Rezeptors, von welcher erwartet wird, dass sie die Leptinaktivität moduliert, insbesondere um die Leptinaktivität zu fördern. Die Erfindung betrifft weiterhin die Nukleinsäuren, welche den Rezeptor kodieren, und Verfahren zur Verwendung des Rezeptors z. B., um die Leptin-Analoga zu identifizieren, therapeutisch oder diagnostisch.The The present invention relates to the identification of a receptor for one Saturation factor which at the body weight homeostasis is involved. Mutations in this receptor are obese phenotypes connected. In particular, the present invention relates to identification and characterization of the receptor for leptin, including one Naturally occurring soluble Form of the receptor that is expected to modulate leptin activity, especially to promote leptin activity. The invention relates continue the nucleic acids, which encode the receptor, and methods of using the receptor z. B. to identify the leptin analogs, therapeutically or diagnostically.

HINTERGRUND DER ERFINDUNGBACKGROUND OF THE INVENTION

Fettleibigkeit, als ein Überschuss an Körperfett im Vergleich zu magerer Körpermasse definiert, ist mit wichtigen physiologischen und medizinischen Krankheiten verbunden, wobei letztere Bluthochdruck, erhöhte Blutfettwerte und Typ II- oder nicht Insulin abhängigen Diabetes mellitus (NIDDM) einschließen. Es gibt 6–10 Milionen Personen mit NIDDM in den Vereinigten Staaten, einschließlich von 18% der Bevölkerung bzw. Population mit einem Alter von 65 Jahren [Harris et al., Int. J. Obes., 11: 275–283 (1987)]. Ungefähr 45% der Männer und 70% der Frauen mit NIDDM sind fettleibig, und ihr Diabetes wird erheblich durch Gewichtsreduktion verbessert oder beseitigt [Harris, Diabetes Care, 14(3): 639–648 (1991)]. Wie unten beschrieben, sind sowohl Fettleibigkeit, als auch NIDDM stark erblich.Obesity, as a surplus to body fat in comparison to lean body mass Defined is with important physiological and medical diseases the latter being associated with hypertension, increased blood lipid levels and type II or not insulin dependent Include diabetes mellitus (NIDDM). There are 6-10 million Persons with NIDDM in the United States, including 18% of the population or population of 65 years of age [Harris et al., Int. J. Obes., 11: 275-283 (1987)]. Approximately 45% of men and 70% of women with NIDDM are obese, and their diabetes will significantly improved or eliminated by weight reduction [Harris, Diabetes Care, 14 (3): 639-648 (1991)]. As described below, both obesity, as are also NIDDM highly hereditary.

Die Assimilation, Lagerung und Verwendung von Nährstoffenergie stellt ein komplexes homeostatisches System dar, welches zentral für das Überleben der Metazoen ist. Für landlebende Säugetiere ist die Lagerung von großen Mengen metabolischen Brennstoffs als Triglyceride im Fettgewebe entscheidend für ein Überleben von Zeiträumen des Nahrungsmangels. Das Erfordernis, eine festgelegte Menge von Energiespeichern ohne dauerhafte Änderungen in der Größe und der Form des Organismus aufrecht zu erhalten, erfordert das Erreichen eines Gleichgewichts zwischen der Energieaufnahme und dem Verbrauch.The Assimilation, storage and use of nutrient energy poses a complex homeostatic system that is central to the survival of the metazoans. For land-based mammals is the storage of large Quantities of metabolic fuel as triglycerides in adipose tissue crucial for a survival of periods of nutritional deficiency. The requirement of a fixed amount of Energy stores without permanent changes in size and the To maintain the organism's form requires achievement a balance between energy intake and consumption.

Der Grad der Adiposität einer Person ist in einem großen Ausmaß genetisch bestimmt. Eine Untersuchung der Übereinstimmungsraten des Körpergewichts und der Adiposität unter mono- und dizygoten Zwillingen oder Adoptivkindern und ihren biologischen Eltern hat nahegelegt, dass die Erblichkeit der Fettleibigkeit (0,4–0,8) die von vielen anderen Eigenschaften übersteigt, von welchen gängigerweise angenommen wurde, dass sie eine erhebliche genetische Komponente aufweisen, wie Schizophrenie, Alkoholismus und Arteriosklerose [Stunkard et al., N. Engl. J. Med., 322: 1483–1487 (1990)]. Es wurde ebenfalls von familiären Ähnlichkeiten in den Geschwindigkeiten des Energieverbrauchs berichtet [Bogardus et al., Diabetes, 35: 1–5 (1986)]. Eine genetische Analyse von geographisch begrenzten Populationen hat nahegelegt, dass eine relativ kleine Anzahl von Genen für 30–50% der Varianz der Körperzusammensetzung verantwortlich sein kann [Moll et al., Am. J. Hum. Genet., 49: 1243–1255 1991)].Of the Degree of adiposity a person is in a big one Extent of genetic certainly. An examination of the compliance rates of body weight and adiposity among mono- and dizygoten twins or adoptive children and their biological parents has suggested that the heredity of obesity (0.4-0.8) the of many other properties, of which most commonly It has been assumed that they have a significant genetic component such as schizophrenia, alcoholism and arteriosclerosis [Stunkard et al., N. Engl. J. Med., 322: 1483-1487 (1990)]. It was too of family similarities in the rates of energy consumption [Bogardus et al., Diabetes, 35: 1-5 (1986)]. A genetic analysis of geographically limited populations has suggested that a relatively small number of genes account for 30-50% of Variance of body composition may be responsible [Moll et al., Am. J. Hum. Genet., 49: 1243-1255 1991)].

Nagetiermodelle für Fettleibigkeit schließen sieben eindeutige Einzelgenmutationen ein. Die am intensivsten untersuchten Maus-Fettleibkeitsmutationen sind die ob-(Fettleibkeit) und db-(Diabetes) Gene. Wenn sie mit dem Hintergrund derselben genetischen Linie vorliegen, führen ob und db zu nicht unterscheidbaren me tabolischen und Verhaltensphänotypen, was nahe legt, dass diese Gene im selben physiologischen Stoffwechselweg wriken können [Coleman et al., Diabetologia, 14: 141–148 (1978)]. Mäuse, welche für beide Mutationen homozygot sind, sind hyperphag und hypometabolisch, was zu einem fettleibigen Phänotyp führt, welcher im Alter von einem Monat erkennbar wird. Das Gewicht dieser Tiere scheint sich bei 60–70 g zu stabilisieren (verglichen mit 30–35 g in Kontrollmäusen). ob- und db-Tiere zeigen eine Unzahl von anderen hormonalen und metabolischen Veränderungen, die es schwierig gemacht haben, den Primärdefekt zu identifizieren, welcher der Mutation zuzuschreiben ist [Brav et al., Am. J. Clin. Nutr., 50: 891–902 (1989)]. Wie unten. erwähnt, führte die Identifizierung des OB-Gens zum Verstehen eines molekularen Elements.rodent models for obesity shut down seven unique single gene mutations. The most intensively studied Mouse obesity mutations are ob- (obesity) and db- (diabetes) Genes. If they are in the background of the same genetic lineage, to lead ob and db to indistinguishable me tabolic and behavioral phenotypes, which suggests that these genes are in the same physiological pathway can wrics [Coleman et al., Diabetologia, 14: 141-148 (1978)]. Mice, which for both Mutations are homozygous, hyperphagic and hypometabolic to an obese phenotype leads, which becomes recognizable at the age of one month. The weight of this Animals seems at 60-70 to stabilize (compared to 30-35 g in control mice). if- and db animals show a myriad of other hormonal and metabolic changes, which have made it difficult to identify the primary defect which attributed to the mutation [Brav et al., Am. J. Clin. Nutr., 50: 891-902 (1989)]. As below. mentioned, led the Identification of the OB gene to understand a molecular element.

Jedes der Nagetier-Fettleibigkeitsmodelle wird durch Änderungen im Kohlenhydratmetabolismus begleitet, welche jenen im Typ II-Diabetes des Menschen ähneln. In einigen Fällen hängt die Schwere des Diabetes teilweise vom Hintergrund-Mäusestamm ab [Leiter, Endocrinology, 124: 912–922 (1989)]. Sowohl für ob, als auch db entwickeln kongenische C57BL/Ks-Mäuse einen schweren Diabetes mit ultimativer β-Zellnekrose und Atrophie der Langerhans'schen Inseln, was zu einer relativen Insulinopenie führt. Umgekehrt entwickeln kongenische C57BL/6J-ob- und -db-Mäuse einen vorübergehenden insulinresistenten Diabetes, welcher schließlich durch eine β-Zell-Hypertrophie kompensiert wird, was dem humanen Typ II-Diabetes ähnelt.Each of the rodent obesity models is accompanied by changes in carbohydrate metabolism similar to those in human type II diabetes. In some cases, the severity of the diabetes depends in part on the background mouse strain [Leiter, Endocrinology, 124: 912-922 (1989)]. Both for ob, As well as db, congenic C57BL / Ks mice develop severe diabetes with ultimate β-cell necrosis and atherosclerosis of islets of Langerhans, resulting in relative insulinopenia. Conversely, congenic C57BL / 6J ob and db mice develop transient insulin-resistant diabetes, which is eventually compensated by β-cell hypertrophy, which is similar to human type II diabetes.

Der Phänotyp der ob- und db-Mäuse ähnelt der menschlichen Fettleibigkeit in anderer Hinsicht als die Entwicklung des Diabetes – die mutierten Mäuse fressen mehr und verbrauchen weniger Energie, als es magere Kontrollen tun (wie es fettleibige Menschen tun). Dieser Phänotyp ist ebenfalls recht ähnlich zu jenem, welcher bei Tieren mit Läsionen des ventromedialen Hypothalamus beobachtet wird, was nahe legt, dass beide Mutationen mit der Fähigkeit interferieren können, Ernährungsinformation innerhalb des zentralen Nervensystems richtig zu integrieren oder darauf zu antworten. Eine Unterstützung dieser Hypothese kommt aus den Ergebnissen von Parabiose-Experimenten [Coleman, Diabetologia, 9: 294–298 (1973)], welche nahe legen, dass ob-Mäuse einen Mangel eines zirkulierenden Sättigungsfaktors aufweisen, und dass db-Mäuse resistent gegen die Wirkungen des ob-Faktors sind (möglicherweise aufgrund eines ob-Rezeptordefekts). Diese Experimente haben zu der Schlussfolgerung geführt, dass die Fettleibigkeit sich in diesen mutierten Mäusen aus verschiedenen Defekten in einer afferenten Schleife und/oder einem integrativen Zentrum des postulierten Rückkopplungsmechanismus ergeben kann, welcher die Körperzusammensetzung kontrolliert.Of the phenotype the ob and db mice are similar human obesity in other ways than development of diabetes - the mutant mice eat more and consume less energy than lean controls do (as do obese people). This phenotype is also quite similar to that which in animals with lesions of the ventromedial hypothalamus, suggesting that that both mutations with the ability can interfere nutritional information to integrate properly within the central nervous system or to answer it. A support for this hypothesis comes from the results of parabiose experiments [Coleman, Diabetologia, 9: 294-298 (1973)], which suggest that ob mice have a lack of circulating saturation factor, and that db mice are resistant to the effects of the ob-factor (possibly due to an ob receptor defect). These experiments have become the Conclusion led Obesity in these mutant mice is different Defects in an afferent loop and / or an integrative Center of the postulated feedback mechanism which can give the body composition controlled.

Unter Verwendung molekularer und klassischer genetischer Marker wurden die ob- und db-Gene jeweils für das proximale Chromosom 6 und das Mittelchromosom 4 kartiert [Bahary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 8642–8646 (1990), Friedman et al., Genomics, 11: 1054–1062 (1991)]. In beiden Fällen liegen die Mutationen in Regionen des Mäusegenoms, welche syntenisch zum Menschen sind, was nahe legt, dass, wenn es menschliche Homologe von ob und db gibt, sie wahrscheinlich jeweils auf den menschlichen Chromosomen 7q und 1p liegen. Defekte im db-Gen können zu Fettleibigkeit in anderen Säugetierarten führen: in genetischen Kreuzungen zwischen Zucker-fa/fa-Ratten und Brown Norway +/+-Ratten wird die fa-Mutation (Rattenchromosom 5) durch dieselben Loci flankiert, welche db in der Maus flankieren [Truett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7806–7809 (1991)].Under Use of molecular and classical genetic markers were the ob and db genes for each the proximal chromosome 6 and the middle chromosome 4 are mapped [Bahary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 8642-8646 (1990), Friedman et al. Genomics, 11: 1054-1062 (1991)]. In both cases the mutations are located in regions of the mouse genome, which are syntenic to humans are what suggests that if there are human homologues from ob and db there, they probably each on the human Chromosomes 7q and 1p are located. Defects in the db gene can cause Obesity in other mammalian species to lead: in genetic crosses between Zucker fa / fa rats and Brown Norway + / + - rats the fa mutation (rat chromosome 5) is flanked by the same loci, which flank db in the mouse [Truett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7806-7809 (1991)].

Ein Hauptfortschritt beim Verstehen der molekularen Grundlage der Fettleibigkeit fand mit dem Klonieren des ob-Gens statt. Das Mäuse-Fettleibigkeits-(ob)-Gen kodiert einen aus Fettgewebe abgeleiteten Signalfaktor für die Körpergewichtshomeostase [Zhang et al., Nature, 372: 425 (1994), U.S. Patentanmeldung Nr. 08/292,345, eingereicht am 17. August 1994, U.S. Patentanmeldung Nr. 08/483,211, eingereicht am 7. Juni 1995, internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 96/05309 , veröffentlicht am 22. Februar 1996]. Mehrere aktuelle Studien haben gezeigt, dass rekombinantes OB-Protein (Leptin), welches aus Escherichia coli gereinigt wurde, die mit Fettleibigkeit verwandten Phänotypen in ob/ob-Mäusen korrigieren kann, wenn es exogen verabreicht wird [Campfield et al., Science, 269: 546 (1995); Tartaglia et al. (Cell, 83: 1263, 1995) offenbart einen Leptinrezeptor. Die WO 97/25424 , die WO 97/25425 und die WO 97/19952 offenbaren jeweils einen löslichen Leptinrezeptor.A major advance in understanding the molecular basis of obesity has been with the cloning of the ob gene. The mouse obesity (ob) gene encodes a fatty tissue-derived body weight homeostasis signal factor [Zhang et al., Nature, 372: 425 (1994), US Patent Application No. 08 / 292,345, filed August 17, 1994, US Patent Application No. 08 / 483,211, filed June 7, 1995, International Patent Publication No. Hei. WO 96/05309 , published on February 22, 1996]. Several recent studies have shown that recombinant OB protein (leptin) purified from Escherichia coli can correct obesity-related phenotypes in ob / ob mice when administered exogenously [Campfield et al., Science, 269 : 546 (1995); Tartaglia et al. (Cell, 83: 1263, 1995) discloses a leptin receptor. The WO 97/25424 , the WO 97/25425 and the WO 97/19952 each reveal a soluble leptin receptor.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNGSUMMARY OF THE INVENTION

Die vorliegende Erfindung ist auf ein lösliches Leptinrezeptor-(OB-R)-Polypeptid gerichtet, wie es in den Ansprüchen definiert ist. Die Erfindung ist ebenfalls auf ein Derivat des beanspruchten Leptinrezeptors gerichtet, welches an einen chemischen Rest angeheftet ist. Die Erfindung ist ebenfalls auf eine isolierte Nukleinsäure gerichtet, welche den beanspruchten Leptinrezeptor kodiert.The The present invention is directed to a soluble leptin receptor (OB-R) polypeptide directed, as stated in the claims is defined. The invention is also a derivative of the claimed Leptinrezeptors directed, which attached to a chemical residue is. The invention is also directed to an isolated nucleic acid, which encodes the claimed leptin receptor.

Die Erfindung ist ebenfalls auf eine isolierte Nukleinsäure gerichtet, welche bei Expression ein lösliches Leptinrezeptor-Polypeptid kodiert, welches die Fähigkeit aufweist, Leptin zu binden, welche:

  • a) ein DNA-Molekül nach SEQ ID NR: 9,
  • b) die komplementäre Sequenz des in (a) definierten DNA-Moleküls,
  • c) ein DNA-Molekül, das bei Expression das Polypeptid kodiert, das von einem beliebigen der vorstehenden DNA-Moleküle kodiert wird, ist.
The invention is also directed to an isolated nucleic acid which when expressed encodes a soluble leptin receptor polypeptide having the ability to bind leptin which:
  • a) a DNA molecule according to SEQ ID NO: 9,
  • b) the complementary sequence of the DNA molecule defined in (a),
  • c) a DNA molecule which upon expression encodes the polypeptide encoded by any of the above DNA molecules.

Die Erfindung ist ebenfalls auf einen Vektor, welcher eine solche DNA umfasst, gerichtet.The The invention is also directed to a vector comprising such a DNA includes, directed.

Die Erfindung ist ebenfalls auf einen einzelligen Wirt gerichtet, welcher mit einem solchen DNA-Molekül oder Vektor transformiert oder transfiziert wurde.The The invention is also directed to a unicellular host which with such a DNA molecule or vector was transformed or transfected.

Die Erfindung ist ebenfalls auf ein Verfahren zum Herstellen eines Leptinrezeptor-Polypeptids gerichtet, umfassend:

  • a) das Kultivieren der oben erwähnten transformierten oder transfizierten Zelle unter Bedingungen, welche die Expression des Leptinrezeptor-Polypeptids bewirken, und
  • b) das Gewinnen des exprimierten Polypeptids.
The invention is also directed to a method for producing a leptin receptor polypeptide comprising:
  • a) culturing the above-mentioned transformed or transfected cell under conditions which cause the expression of the leptin receptor polypeptide, and
  • b) recovering the expressed polypeptide.

Die Erfindung ist ebenfalls auf einen Antikörper gerichtet, welcher spezifisch für den beanspruchten Leptinrezeptor ist.The The invention is also directed to an antibody which is specific for the claimed leptin receptor is.

Die Erfindung ist ebenfalls auf eine immortale Zelllinie gerichtet, welche einen monoklonalen Antikörper herstellt, der spezifisch für den beanspruchten Leptinrezeptor ist.The Invention is also directed to an immortal cell line, which is a monoclonal antibody which is specific for the claimed leptin receptor is.

Die Erfindung ist ebenfalls auf ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gerichtet, welcher spezifisch für den beanspruchten löslichen Leptinrezeptor ist, umfassend:

  • a) das Immunisieren eines Wirtstieres mit dem beanspruchten Leptinrezeptor, dem ein Adjuvans beigemischt ist und/oder der an ein Trägerprotein gekoppelt ist, und
  • b) das Erhalten des Antikörpers aus dem immunisierten Wirtstier.
The invention is also directed to a method of producing an antibody specific for the claimed soluble leptin receptor comprising:
  • a) immunizing a host animal with the claimed leptin receptor, which is admixed with an adjuvant and / or which is coupled to a carrier protein, and
  • b) obtaining the antibody from the immunized host animal.

Die Erfindung ist ebenfalls auf ein Verfahren zum Messen des Vorhandenseins des beanspruchten löslichen Leptinrezeptors in einer Probe gerichtet, umfassend:

  • a) das Inkontaktbringen einer Probe, von der vermutet wird, dass sie einen Leptinrezeptor enthält, mit einem Antikörper, der spezifisch an den beanspruchten löslichen Leptinrezeptor bindet, wobei der Antikörper optional an einen Festphasenträger gebunden ist, unter Bedingungen, welche die Bildung eines Reaktionskomplexes, umfassend den Antikörper und den Leptinrezeptor, erlauben, und
  • b) das Nachweisen der Bildung von Reaktionskomplexen, umfassend den Antikörper und den Leptinrezeptor, in der Probe,
wobei der Nachweis der Bildung von Reaktionskomplexen das Vorhandensein von Leptinrezeptor in der Probe anzeigt.The invention is also directed to a method for measuring the presence of the claimed soluble leptin receptor in a sample comprising:
  • a) contacting a sample suspected of containing a leptin receptor with an antibody which specifically binds to the claimed soluble leptin receptor, which antibody is optionally bound to a solid phase support, under conditions involving the formation of a reaction complex, comprising the antibody and the leptin receptor, and
  • b) detecting the formation of reaction complexes comprising the antibody and the leptin receptor in the sample,
wherein the detection of the formation of reaction complexes indicates the presence of leptin receptor in the sample.

Die Erfindung ist ebenfalls auf eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in der Medizin gerichtet, welche den beanspruchten löslichen Leptinrezeptor und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.The Invention is also to a pharmaceutical composition for use in medicine which claimed the soluble Leptinrezeptor and a pharmaceutically acceptable carrier.

Die Erfindung ist ebenfalls auf die Verwendung des beanspruchten löslichen Leptinrezeptors in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Fettleibigkeit in einem Individuum gerichtet.The Invention is also directed to the use of the claimed soluble Leptin receptor in the manufacture of a drug for treatment of obesity in an individual.

Die Erfindung ist ebenfalls auf ein Kit gerichtet, welches die oben erwähnte pharmazeutische Zusammensetzung und eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Diabetes, Bluthochdruck und erhöhtem Cholesterinspiegel umfasst.The The invention is also directed to a kit comprising the above mentioned pharmaceutical composition and a pharmaceutical composition for the treatment of diabetes, hypertension and high cholesterol includes.

Die Erfindung ist ebenfalls auf eine die körperliche Erscheinung verbessernde kosmetische Zusammensetzung zur Reduktion des Körpergewichts eines Individuums gerichtet, welche den beanspruchten löslichen Leptinrezeptor und einen verträglichen Träger umfasst.The Invention is also a physical appearance improving cosmetic composition for reducing the body weight of an individual directed, which the claimed soluble leptin receptor and a tolerable carrier includes.

Die Erfindung ist ebenfalls auf ein Verfahren zur kosmetischen Behandlung zur Verbesserung der körperlichen Erscheinung gerichtet, welches das Verabreichen einer Zusammensetzung, umfassend den beanspruchten löslichen Leptinrezeptor und einen verträglichen Träger, an ein Individuum umfasst.The The invention is also directed to a method of cosmetic treatment to improve the physical Which relates to administering a composition, comprising the claimed soluble Leptin receptor and a tolerable Carrier, to an individual.

Aspekte und Ausführungsformen der folgenden Beschreibung, welche nicht spezifisch die beanspruchte Erfindung betreffen, sind nur zur Darstellung und zum Vergleich eingeschlossen.aspects and embodiments the following description, which did not specifically claim that Relate invention are only for illustration and comparison locked in.

Es werden hier ebenfalls ein Leptinrezeptor(OB-R)-Polypeptid, Nukleinsäuren, welche ein solches Polypeptid kodieren, nicht kodierende Nukleinsäuren, welche die kodierenden Sequenzen des Gens flankieren, Oligonukleotide, welche mit solchen Nukleinsäuren hybridisieren, Antikörper gegen das Polypeptid und diagnosti sche, therapeutische und kosmetische Zusammensetzungen und Verfahren zum Verwenden des Polypeptids, der Nukleinsäuren oder der Antikörper oder Kombinationen davon offenbart.It Here, too, a leptin receptor (OB-R) polypeptide, nucleic acids, which encode such a polypeptide, non-coding nucleic acids which flanking the coding sequences of the gene, oligonucleotides, which with such nucleic acids hybridize, antibodies against the polypeptide and diagnostic, therapeutic and cosmetic Compositions and methods for using the polypeptide, nucleic acids or the antibody or combinations thereof disclosed.

Daher wird der Leptinrezeptor (hier ebenfalls OB-Rezeptor oder OB-R genannt) in einem ersten Aspekt dieser Offenbarung durch spezifisches Binden an Leptin unter physiologischen Bedingungen, eine Expression in hohen Mengen in Zellen des Hypothalamus und eine Expression in niedrigeren Mengen im Fettgewebe, den Hoden, dem Herz und dem Gehirn und durch Aufweisen einer Sequenzähnlichkeit mit gp130-Cytokinrezeptoren gekennzeichnet.Thus, in a first aspect of this disclosure, the leptin receptor (also referred to herein as OB receptor or OB-R) is specifically bound to leptin under physiological conditions, high level expression in cells of the hypothalamus, and lower level expression in adipose tissue Testes, the heart and the brain and by having a sequence similarity with gp130-Cy labeled tokin receptors.

In spezifischen Beispielen, infra, wird der Leptinrezeptor aus der Gruppe, bestehend aus OB-Ra (SEQ ID NR: 2), OB-Rb (SEQ ID NR: 4), OB-Rc (SEQ ID NR: 6), OB-Rd (SEQ ID NR: 8) und OB-Re (SEQ ID NR: 10) oder Allelvarianten davon, ausgewählt. Alternativ kann der Leptinrezeptor eine Sequenz aufweisen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
dem N-Terminus, welcher OB-Ra bis Lys889 entspricht, und dem C-Terminus, welcher einem C-Terminus entspricht, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus OB-Rb, OB-Rc und OB-Rd nach Lys889,
dem N-Terminus, welcher OB-Rb oder OB-Rc bis Lys889 entspricht, und dem C-Terminus, welcher OB-Ra oder OB-Rd nach Lys889 entspricht,
dem N-Terminus, welcher OB-Rd bis Lys889 entspricht, und dem C-Terminus, welcher OB-Ra, OB-Rb oder OB-Rc entspricht,
dem N-Terminus, welcher OB-R von Pro664 bis Lys889 entspricht, und dem C-Terminus, welcher OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc und OB-Rd entspricht, und
dem N-Terminus, welcher OB-R von Met733 bis Lys889 entspricht, und dem C-Terminus, welcher OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc und OB-Rd entspricht, und
dem N-Terminus, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus OB-Ra, OB-Rb, OB-Rd und OB-R von Pro664 bis His796 und OB-Re von His796,
dem N-Terminus, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus OB-Ra, OB-Rb, OB-Rd und OB-R von Met733 bis His796 und OB-Re von His796 oder Allelvarianten davon.In specific examples, infra, the leptin receptor is selected from the group consisting of OB-Ra (SEQ ID NO: 2), OB-Rb (SEQ ID NO: 4), OB-Rc (SEQ ID NO: 6), OB- Rd (SEQ ID NO: 8) and OB-Re (SEQ ID NO: 10) or allelic variants thereof. Alternatively, the leptin receptor may have a sequence selected from the group consisting of:
the N-terminus corresponding to OB-Ra to Lys 889 and the C-terminus corresponding to a C-terminus selected from the group consisting of OB-Rb, OB-Rc and OB-Rd according to Lys 889 ,
the N-terminus corresponding to OB-Rb or OB-Rc to Lys 889 and the C-terminus corresponding to OB-Ra or OB-Rd according to Lys 889 ,
the N-terminus corresponding to OB-Rd to Lys 889 and the C-terminus corresponding to OB-Ra, OB-Rb or OB-Rc,
the N-terminus corresponding to OB-R from Pro 664 to Lys 889 and the C-terminus corresponding to OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc and OB-Rd, and
the N-terminus corresponding to OB-R from Met 733 to Lys 889 and the C-terminus corresponding to OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc and OB-Rd, and
the N-terminus selected from the group consisting of OB-Ra, OB-Rb, OB-Rd and OB-R from Pro 664 to His 796 and OB-Re from His 796 ,
the N-terminus selected from the group consisting of OB-Ra, OB-Rb, OB-Rd and OB-R from Met 733 to His 796 and OB-Re from His 796 or allelic variants thereof.

In einer anderen Ausführungsform kann der Leptinrezeptor eine N-terminale Sequenz aufweisen, welche aus der Gruppe, bestehend aus den
Aminosäureresten 1–889,
Aminosäureresten 23–889,
Aminosäureresten 28–889,
Aminosäureresten 133–889,
Aminosäureresten 733–889,
Aminosäureresten 1–796,
Aminosäureresten 23–796,
Aminosäureresten 28–796,
Aminosäureresten 133–796, und
Aminosäureresten 733–796,
ausgewählt ist, und eine C-terminale Sequenz, welche aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14 und SEQ ID NR: 15 ausgewählt ist, wobei die Nummerierung auf der Aminosäuresequenz des vollständig transkribierten Mäuse-Leptinrezeptors, einschließlich des Signalpeptids, oder Allelvarianten davon basiert.In another embodiment, the leptin receptor may have an N-terminal sequence selected from the group consisting of
Amino acid residues 1-889,
Amino acid residues 23-889,
Amino acid residues 28-889,
Amino acid residues 133-889,
Amino acid residues 733-889,
Amino acid residues 1-796,
Amino acid residues 23-796,
Amino acid residues 28-796,
Amino acid residues 133-796, and
Amino acid residues 733-796,
is selected, and a C-terminal sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15, wherein the numbering is based on the amino acid sequence of the fully transcribed mouse leptin receptor, including the signal peptide, or allelic variants thereof.

In einer spezifischen Ausführungsform ist der Leptinrezeptor ein löslicher Rezeptor. Ein solcher löslicher Rezeptor kann aus der Gruppe ausgewählt sein, bestehend aus OB-Re, einer N-terminalen Sequenz, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus OB-Ra, OB-Rb, OB-Rd und OB-R von Pro664 bis His796, und einer C-terminalen Sequenz, welche OB-Re von His796 und OB-R von Met733 bis His796 ist, und einer C-terminalen Sequenz, welche OB-Re von His796 ist, einer N-terminalen Sequenz, welche ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den
Aminosäureresten 1–796,
Aminosäureresten 23–796,
Aminosäureresten 28–796,
Aminosäureresten 133–796, und
Aminosäureresten 733–796, und
einer C-terminalen Sequenz, welche SEQ ID NR: 15 ist, wobei die Nummerierung auf der Aminosäuresequenz des vollständig transkribierten Mäuse-Leptinrezeptors, einschließlich des Signalpeptids, oder Allelvarianten davon basiert. In einer spezifischen Ausführungsform wird löslicher OB-R in einem rekombinanten Baculovirus-Expressionssystem hergestellt.In a specific embodiment, the leptin receptor is a soluble receptor. Such a soluble receptor may be selected from the group consisting of OB-Re, an N-terminal sequence selected from the group consisting of OB-Ra, OB-Rb, OB-Rd and OB-R of Pro 664 to His 796 , and a C-terminal sequence which is OB-Re of His 796 and OB-R of Met 733 to His 796 , and a C-terminal sequence which is OB-Re of His 796 , an N-terminal one Sequence which is selected from the group consisting of the
Amino acid residues 1-796,
Amino acid residues 23-796,
Amino acid residues 28-796,
Amino acid residues 133-796, and
Amino acid residues 733-796, and
a C-terminal sequence which is SEQ ID NO: 15, wherein the numbering is based on the amino acid sequence of the fully transcribed mouse leptin receptor, including the signal peptide, or allelic variants thereof. In a specific embodiment, soluble OB-R is produced in a recombinant baculovirus expression system.

Die voranstehenden Ausführungsformen schließen jene ein, in welchen der N-Terminus oder der C-Terminus oder beide nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste einschließen, wie heterogene Signalpeptide oder Spaltstellenreste von Signalpeptiden. Zum Beispiel werden hier in spezifischen Ausführungsformen die folgenden löslichen Formen von OB-R offenbart:
Asp-Pro-Ile28 → Phe-Tyr-Ile-His796-Gly-Met-Cys-Thr-Val-Leu-Phe-Met-Asp805 (SEQ ID NR: 15)
Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Tyr420 (SEQ ID NR: 77) → Pro641,
Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Ser118 (SEQ ID NR: 78) → Pro641,
Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Leu123 (SEQ ID NR: 79) → Val331.The above embodiments include those in which the N-terminus or the C-terminus or both include non-naturally occurring amino acid residues, such as heterogeneous signal peptides or cleavage site residues of signal peptides. For example, in specific embodiments, the following soluble forms of OB-R are disclosed herein:
Asp-Pro-Ile28 → Phe-Tyr-Ile-His796-Gly-Met-Cys-Thr-Val-Leu-Phe-Met-Asp805 (SEQ ID NO: 15)
Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Tyr420 (SEQ ID NO: 77) → Pro641,
Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Ser118 (SEQ ID NO: 78) → Pro641,
Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Leu123 (SEQ ID NO: 79) → Val331.

Die vorliegende Offenbarung umfasst weiterhin verschiedene Mutationen und Substitutionen. Zum Beispiel kann der entsprechende Rest in einer anderen Art (z. B. Mensch) durch hoch divergente Aminosäurereste aus einer Art (z. B. Maus) substituiert werden, um einen biologisch oder funktionell aktiven Leptinrezeptor oder ein Fragment davon zu erhalten. Alternativ können bestimmte Struktur- oder mögliche Strukturreste mit Resten substituiert werden, welche die Neigung zur Strukturbildung erhöhen oder vermindern. In einer spezifischen Ausführungsform, infra, können Cystein-Reste oder Cystein-Paare mit Serin (oder einem anderen vergleichbaren Aminosäurerest, wie Threonin, Methionin, Alanin, usw.) substituiert werden, um Disulfidbindungen zu entfernen. In einer spezifischen Ausführungsform, infra, werden ein oder mehrere von Cys 188 und 193, 471 und 602, 471 und 526 und 602 und 611 zu Ser mutiert, wodurch ein Protein erhalten wird, welches keine Disulfide bildet. Solche Substitutionen können die Bildung von falschen Disulfidvernetzungen während der Expression in einem gentechnisch veränderten System verhindern und werden ebenfalls für eine Kristallisation bevorzugt.The The present disclosure further includes various mutations and substitutions. For example, the corresponding remainder in another species (eg human) by highly divergent amino acid residues from a species (eg mouse) to be a biological or functionally active leptin receptor or a fragment thereof to obtain. Alternatively you can certain structural or potential Structural residues are substituted with residues representing the slope to increase structure formation or diminish. In a specific embodiment, infra, cysteine residues may be present or cysteine pairs with serine (or another comparable Amino acid residue, such as threonine, methionine, alanine, etc.) to disulfide bonds to remove. In a specific embodiment, infra, become one or more of Cys 188 and 193, 471 and 602, 471 and 526 and 602 and 611 mutated to Ser, yielding a protein which does not form disulfides. Such substitutions can be the formation of wrong ones Disulfide crosslinks during prevent expression in a genetically engineered system and are also for a crystallization is preferred.

Alternativ umfasst der Leptinrezeptor eine Transmembrandomäne und stellt ein integrales Membranprotein dar. In dieser Ausführungsform kann der Leptinrezeptor weiterhin ein JAK-Bindungsmotiv, ausgewählt aus "Box 1", "Box 2" und "Box 1" und "Box 2" umfassen, wobei das Motiv strangabwärts von der Transmembrandomäne liegt.alternative For example, the leptin receptor comprises a transmembrane domain and provides an integral Membrane protein. In this embodiment, the leptin receptor furthermore a JAK binding motif selected from "Box 1", "Box 2 "and" Box 1 "and" Box 2 ", wherein the subject downstream from the transmembrane domain lies.

In einer spezifischen Ausführungsform ist der Leptinrezeptor ein humaner Leptinrezeptor. In einer anderen spezifischen Ausführungsform, welche infra beispielhaft dargestellt wird, ist der Leptinrezeptor ein Mäuse-Leptinrezeptor. In einer weiteren spezifischen Ausführungsform ist der Leptinrezeptor ein humaner Leptinrezeptor, welcher eine divergente Aminosäurersubstitution von der entsprechenden Position des Mäuse-Leptinrezeptors umfasst. In einer anderen Ausführungsform ist der Leptinrezeptor ein humaner Leptinrezeptor, welcher konservative Aminosäureresubstitutionen umfasst. In einer spezifischen Ausführungsform werden konservative Aminosäuresubstitutionen aus einem Mäuse-Leptinrezeptor in einem humanen Leptinrezeptor vorgenommen. In noch einer anderen Ausführungsform werden konservative Aminosäuresubstitutionen vorgenommen, welche die Sekundärstruktur verstärken, z. B. die Neigung zur Bildung von α-Helices.In a specific embodiment the leptin receptor is a human leptin receptor. In another specific embodiment, which infra is exemplified is the leptin receptor a mouse leptin receptor. In another specific embodiment, the leptin receptor is a human leptin receptor which has a divergent amino acid substitution from the corresponding position of the mouse leptin receptor. In another embodiment the leptin receptor is a human leptin receptor, which conservative Aminosäureresubstitutionen includes. In a specific embodiment, conservative amino acid substitutions from a mouse leptin receptor in a human leptin receptor. In yet another embodiment become conservative amino acid substitutions made the secondary structure strengthen z. For example, the tendency to form α-helices.

Es wird ebenfalls ein antigenes Fragment des Leptinrezeptors offenbart. In einer spezifischen Ausführungsform wird das antigene Fragment aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33 und SEQ ID NR: 34, ausgewählt.It Also, an antigenic fragment of the leptin receptor is disclosed. In a specific embodiment the antigenic fragment is selected from the group consisting of SEQ ID NR: 32, SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34.

Die Offenbarung betrifft weiterhin ein Derivat der löslichen Form des Leptinrezeptors, welches an einen chemischen Rest angeheftet ist. Vorzugsweise stellt der chemische Rest ein wasserlösliches Polymer dar. Weiter bevorzugt ist das wasserlösliche Polymer Polyethylenglykol.The Disclosure further relates to a derivative of the soluble form of the leptin receptor, which is attached to a chemical radical. Preferably presents the chemical residue is a water-soluble one Polymer. More preferably, the water-soluble polymer is polyethylene glycol.

In einem anderen Aspekt wird eine isolierte Nukleinsäure offenbart, welche den Leptinrezeptor kodiert, insbesondere wie oben dargestellt wird. In spezifischen Beispielen, infra, wird cDNA offenbart, welche verschiedene Splice-Formen des Mäuse-Leptinrezeptors kodiert. Insbesondere werden Nukleinsäuren offenbart, welche Sequenzen aufweisen, die den SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 entsprechen oder komplementär dazu sind.In In another aspect, an isolated nucleic acid is disclosed, which encodes the leptin receptor, in particular as shown above becomes. In specific examples, infra, cDNA is disclosed which different splice forms of the mouse leptin receptor coded. In particular, nucleic acids are disclosed which sequences which correspond to SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 9 or complementary are to.

Insbesondere wird ein isoliertes DNA-Molekül offenbart, welches bei Expression ein Leptinrezeptor-Polypeptid kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einer Polypeptid kodierenden Sequenz eines DNA-Moleküls aus SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9,
einem DNA-Molekül, welches komplementär zu dem in (a) definierten DNA-Molekül ist,
einem DNA-Molekül, welches mit dem DNA-Molekül aus (a) oder (b) oder einem hybridisierbaren Fragment davon hybridisiert,
einem DNA-Molekül, welches mit einer Polymerase-Kettenreaktions-(PCR)-Sonde identifizierbar ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Sonde für Klon 7 (vorwärts gerichteter Primer SEQ ID NR: 42 und rückwärts gerichteter Primer SEQ ID NR: 43), einer Sonde für Klon 11 (vorwärts gerichteter Primer SEQ ID NR: 44 und rückwärts gerichteter Primer SEQ ID NR: 45) und sowohl Klon 7, als auch Klon 11, und
einem DNA-Molekül, welches bei Expression für das Polypeptid kodiert, das von einem beliebigen der vorstehenden DNA-Moleküle kodiert wird.In particular, there is disclosed an isolated DNA molecule which upon expression encodes a leptin receptor polypeptide selected from the group consisting of: a polypeptide coding sequence of a DNA molecule of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 9,
a DNA molecule which is complementary to the DNA molecule defined in (a),
a DNA molecule which hybridizes with the DNA molecule of (a) or (b) or a hybridizable fragment thereof,
a DNA molecule identifiable with a polymerase chain reaction (PCR) probe selected from the group consisting of a probe for clone 7 (forward primer SEQ ID NO: 42 and backward primer SEQ ID NO: 43 ), a probe for clone 11 (forward primer SEQ ID NO: 44 and backward primer SEQ ID NO: 45) and both clone 7, and clone 11, and
a DNA molecule which when expressed encodes the polypeptide encoded by any of the above DNA molecules.

Das DNA-Molekül stammt vorzugsweise aus dem Menschen. In spezifischen Beispielen, infra, stammt das DNA-Molekül aus der Maus. In spezifischen Ausführungsformen kodiert das DNA-Molekül bei Expression für ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Leptinrezeptor, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc, OB-Rd und OB-Re oder Allelvarianten davon, einem Leptinrezeptor, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
einem N-Terminus, welcher OB-Ra bis Lys889 entspricht, und einem C-Terminus, welcher einem C-Terminus entspricht, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus OB-Rb, OB-Rc und OB-Rd nach Lys889,
einem N-Terminus, welcher OB-Rb oder OB-Rc bis Lys889 entspricht, und einem C-Terminus, welcher OB-Ra oder OB-Rd nach Lys889 entspricht,
einem N-Terminus, welcher OB-Rd bis Lys889 entspricht, und einem C-Terminus, welcher OB-Ra, OB-Rb oder OB-Rc entspricht,
einem N-Terminus, welcher OB-R von Pro664 bis Lys889 entspricht, und einem C-Terminus, welcher OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc und OB-Rd entspricht, und
einem N-Terminus, welcher OB-R von Met733 bis Lys889 entspricht, und einem C-Terminus, welcher OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc und OB-Rd entspricht, und
einem N-Terminus, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus OB-Ra, OB-Rb, OB-Rd und OB-R von Pro664 bis His796 und OB-Re von His796,
einem N-Terminus, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus OB-Ra, OB-Rb, OB-Rd und OB-R von Met733 bis His796 und OB-Re von His796 oder Allelvarianten davon,
einem Leptinrezeptor, wobei die N-terminale Sequenz aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus den
Aminosäureresten 1–889,
Aminosäureresten 23–889,
Aminosäureresten 28–889,
Aminosäureresten 133–889,
Aminosäureresten 733–889,
Aminosäureresten 1–796,
Aminosäureresten 23–796,
Aminosäureresten 28–796,
Aminosäureresten 133–796, und
Aminosäureresten 733–796,
und die C-terminale Sequenz aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14 und SEQ ID NR: 15 (nach His796), wobei die Nummerierung auf der Aminosäuresequenz des vollständig transkribierten Mäuse-Leptinrezeptors, einschließlich des Signalpeptids, oder Allelvarianten davon basiert.The DNA molecule is preferably derived from humans. In specific examples, infra, the DNA molecule is from the mouse. In specific embodiments, the DNA molecule encodes upon expression for a polypeptide selected from the group consisting of a leptin receptor selected from the group consisting of OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc, OB-Rd and OB-Re or allelic variants thereof, a leptin receptor selected from Group consisting of:
an N-terminus corresponding to OB-Ra to Lys 889 and a C-terminus corresponding to a C-terminus selected from the group consisting of OB-Rb, OB-Rc and OB-Rd according to Lys 889 ,
an N-terminus corresponding to OB-Rb or OB-Rc to Lys 889 , and a C-terminus corresponding to OB-Ra or OB-Rd according to Lys 889 ,
an N-terminus corresponding to OB-Rd to Lys 889 and a C-terminus corresponding to OB-Ra, OB-Rb or OB-Rc,
an N-terminus corresponding to OB-R from Pro 664 to Lys 889 and a C-terminus corresponding to OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc and OB-Rd, and
an N-terminus corresponding to OB-R from Met 733 to Lys 889 and a C-terminus corresponding to OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc and OB-Rd, and
an N-terminus selected from the group consisting of OB-Ra, OB-Rb, OB-Rd and OB-R from Pro 664 to His 796 and OB-Re from His 796 ,
an N-terminus selected from the group consisting of OB-Ra, OB-Rb, OB-Rd and OB-R of Met 733 to His 796 and OB-Re of His 796 or allelic variants thereof,
a leptin receptor, wherein the N-terminal sequence is selected from the group consisting of
Amino acid residues 1-889,
Amino acid residues 23-889,
Amino acid residues 28-889,
Amino acid residues 133-889,
Amino acid residues 733-889,
Amino acid residues 1-796,
Amino acid residues 23-796,
Amino acid residues 28-796,
Amino acid residues 133-796, and
Amino acid residues 733-796,
and the C-terminal sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, and SEQ ID NO: 15 (after His796); Numbering based on the amino acid sequence of the fully transcribed mouse leptin receptor, including the signal peptide, or allelic variants thereof.

In einer weiteren Ausführungsform wird eine isolierte Nukleinsäure offenbart, insbesondere ein DNA-Molekül, welches bei Expression einen löslichen Leptinrezeptor kodiert, in welchem der N-Terminus oder C-Terminus oder beide nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste einschließen, wie heterogene Signalpeptide oder Spaltstellenreste für Signalpeptide. In spezifischen Ausführungsformen wird zum Beispiel DNA offenbart, welche die folgenden löslichen Formen von OB-R kodiert:
Asp-Pro-Ile28 → Phe-Tyr-Ile-His796-Gly-Met-Cys-Thr-Val-Leu-Phe-Met-Asp805 (SEQ ID NR: 15)
Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Tyr420 (SEQ ID NR: 77) → Pro641,
Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Ser118 (SEQ ID NR: 78) → Pro641,
Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Leu123 (SEQ ID NR: 79) → Val331.In another embodiment, an isolated nucleic acid is disclosed, particularly a DNA molecule which upon expression encodes a soluble leptin receptor in which the N-terminus or C-terminus or both include non-naturally occurring amino acid residues, such as heterogeneous signal peptides or cleavage site residues for signal peptides. In specific embodiments, for example, DNA encoding the following soluble forms of OB-R is disclosed:
Asp-Pro-Ile28 → Phe-Tyr-Ile-His796-Gly-Met-Cys-Thr-Val-Leu-Phe-Met-Asp805 (SEQ ID NO: 15)
Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Tyr420 (SEQ ID NO: 77) → Pro641,
Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Ser118 (SEQ ID NO: 78) → Pro641,
Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Leu123 (SEQ ID NO: 79) → Val331.

Die vorliegende Offenbarung umfasst weiterhin DNA, welche einen Leptinrezeptor kodiert, der die verschiedenen oben diskutierten Mutationen und Substitutionen aufweist. Zum Beispiel können Cystein-Reste oder Cystein-Paare mit Serin (oder Threonin, Methionin oder Alanin) substituiert werden, um Disulfidbindungen zu entfernen. In einer spezifischen Ausführungsform, infra, werden DNA-Moleküle offenbart, welche löslichen OB-R kodieren, in welchem ein oder mehrere aus Cys 188 und 193, 471 und 602, 471 und 526 und 602 und 611 zu Ser mutiert sind, wodurch ein Protein erhalten wird, welches keine Disulfide bildet.The The present disclosure further includes DNA encoding a leptin receptor encoding the various mutations discussed above and Substitutions. For example, cysteine residues or cysteine pairs be substituted with serine (or threonine, methionine or alanine), to remove disulfide bonds. In a specific embodiment, infra, become DNA molecules discloses which soluble Encode OB-R, in which one or more of Cys 188 and 193, 471 and 602, 471 and 526, and 602 and 611 are mutated to Ser a protein is obtained which does not form disulfides.

Diese Offenbarung umfasst weiterhin als eine Folge der oben beschriebenen kodierenden Nukleinsäuren ein Oligonukleotid, welches unter stringenten Bedingungen mit dem Nukleinsäuremolekül hybridisierbar ist, insbesondere dem DNA-Molekül, welches den Leptinrezeptor kodiert. In spezifischen Ausführungsformen, welche infra beispielhaft dargestellt werden, ist das Oligonukleotid ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR: 20, SEQ ID NR: 21, SEQ ID NR: 22, SEQ ID NR: 23, SEQ ID NR: 24, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 27, SEQ ID NR: 28, SEQ ID NR: 29, SEQ ID NR: 30, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 35, SEQ ID NR: 36, SEQ ID NR: 37, SEQ ID NR: 38, SEQ ID NR: 39, SEQ ID NR: 40, SEQ ID NR: 41, SEQ ID NR: 42, SEQ ID NR: 43, SEQ ID NR: 44, SEQ ID NR: 45, SEQ ID NR: 46, SEQ ID NR: 47, SEQ ID NR: 48, SEQ ID NR: 49, SEQ ID NR: 50, SEQ ID NR: 51, SEQ ID NR: 52, SEQ ID NR: 53 und SEQ ID NR: 54. Das Oligonukleotid kann markiert sein.These Disclosure further includes as a consequence of those described above encoding nucleic acids an oligonucleotide which under stringent conditions with the Nucleic acid molecule is hybridizable, in particular the DNA molecule which encodes the leptin receptor. In specific embodiments, which infra are exemplified, the oligonucleotide is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54. The oligonucleotide can be marked.

Zusätzlich zu der kodierenden DNA werden hier Vektoren offenbart, welche eine solche DNA umfassen. Ein hier offenbarter Vektor kann ein Klonierungsvektor sein, oder er kann ein Expressionsvektor sein, welcher die DNA, die den Leptinrezeptor kodiert, operabel verbunden mit einer Expressions-Kontrollsequenz umfasst. Normalerweise erstreckt sich diese Offenbarung auf einen einzelligen Wirt, welcher mit einem DNA-Molekül, einem Klonierungsvektor oder einem Expressionsvektor, wie hier offenbart, transformiert oder transfiziert ist. Ein solcher einzelliger Wirt kann aus der Gruppe ausgewählt sein, bestehend aus Bakterien, Hefe, Säugetierzellen, Pflanzenzellen und Insektenzellen in Gewebekultur. In spezifischen Ausführungsformen kann der Wirt aus der Gruppe, bestehend aus Pseudomonas-, Bacillus-, Streptomyces-, Saccharomyces-, Pichia-, Candida-, Hansenula-, Torulopsis-, CHO-, R1.1-, B-W-, LM-, COS 1-, COS 7-, BSC1-, BSC40-, BMT10- und Sf9-Zellen, ausgewählt sein.In addition to The coding DNA are here vectors disclosed which a include such DNA. A vector disclosed herein may be a cloning vector be, or it may be an expression vector containing the DNA, which encodes the leptin receptor, operably linked to an expression control sequence includes. Usually, this disclosure extends to one unicellular host associated with a DNA molecule, a cloning vector or an expression vector as disclosed herein or transfected. Such a unicellular host may be derived from the Group selected be composed of bacteria, yeast, mammalian cells, plant cells and insect cells in tissue culture. In specific embodiments the host may be selected from the group consisting of Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula, Torulopsis, CHO, R1.1, B-W, LM, COS1, COS7, BSC1, BSC40, BMT10 and Sf9 cells, selected be.

Diese Offenbarung betrifft weiterhin ein rekombinantes Verfahren zur Herstellung eines Leptinrezeptor-Polypeptids, welches das Kultivieren einer Wirtszelle, welche einen wie offenbarten Expressionsvektor umfasst, unter Bedingungen, welche die Expression des Leptinrezeptor-Polypeptids bewirken, und das Gewinnen des exprimierten Polypeptids umfasst.These The disclosure further relates to a recombinant process for the preparation a leptin receptor polypeptide which comprises cultivating a A host cell comprising an expression vector as disclosed, under conditions involving expression of the leptin receptor polypeptide and recovering the expressed polypeptide.

Es wird hier ebenfalls eine Antisense-Nukleinsäure, welche mit einer mRNA hybridisiert, die einen Leptinrezeptor kodiert, und ein Ribozym, welches eine mRNA spaltet, die ein Leptinrezeptor kodiert, offenbart.It Here is also an antisense nucleic acid, which with an mRNA hybridizes, which encodes a leptin receptor, and a ribozyme, which cleaves an mRNA encoding a leptin receptor.

In einer anderen Ausführungsform werden ein transgener Vektor, welcher ein DNA-Molekül umfasst, das einen Leptinrezeptor kodiert, oder ein wie hier offenbarter Expressionsvektor offenbart.In another embodiment become a transgenic vector comprising a DNA molecule, the encoding a leptin receptor, or an expression vector as disclosed herein disclosed.

In einem anderen Aspekt wird ein Antikörper offenbart, welcher spezifisch für einen Leptinrezeptor ist. Der Antikörper kann ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein. Solche Antikörper schließen Antikörper ein, welche gegen antigene Fragmente des Leptinrezeptors erzeugt wurden, einschließlich synthetischer Polypeptidfragmente aus ungefähr 10 bis 30 Aminosäureresten. In einer spezifischen Ausführungsform kann der Antikörper mit einer nachweisbaren Markierung markiert sein. Normalerweise erstreckt sich diese Offenbarung auf eine immortale Zelllinie, welche einen monoklonalen Antikörper herstellt.In In another aspect, an antibody is disclosed which is specific for one Leptinrezeptor is. The antibody may be a monoclonal or polyclonal antibody. Such antibodies include antibodies, which were generated against antigenic fragments of the leptin receptor, including synthetic polypeptide fragments of about 10 to 30 amino acid residues. In a specific embodiment can the antibody be marked with a detectable mark. Usually This disclosure extends to an immortal cell line which a monoclonal antibody manufactures.

In einer spezifischen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers offenbart, welcher spezifisch für einen Leptinrezeptor ist, umfassend: Immunisieren eines Wirtstiers mit dem Leptinrezeptor oder einem immunogenen Fragment davon, dem ein Adjuvans beigemischt ist, und Erhalten des Antikörpers aus dem immunisierten Wirtstier. In einer andren spezifischen Ausführungsform, welche infra beispielhaft dargestellt wird, umfasst das Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, welcher spezifisch für einen Leptinrezeptor ist, das Konjugieren eines Peptids mit einer Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33 und SEQ ID NR: 34 an ein Trägerprotein, das Immunisieren eines Wirtstiers mit dem Peptid-Trägerprotein-Konjugat aus Schritt (a), dem ein Adjuvans beigemischt wird, und das Erhalten des Antikörpers aus dem immunisierten Wirtstier.In a specific embodiment discloses a method for producing an antibody which is specific for one Leptinrezeptor is, comprising: immunizing a host animal with the leptin receptor or an immunogenic fragment thereof, the Adjuvant and receiving the antibody from the immunized Host animal. In another specific embodiment, which is shown by way of example The method for producing an antibody includes specific for a leptin receptor, conjugating a peptide to a Sequence, selected from the group consisting of SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34 to a carrier protein, immunizing a host animal with the peptide-carrier protein conjugate from step (a) to which an adjuvant is added and obtaining the antibody from the immunized host animal.

Zusammen mit den hier offenbarten Antikörpern wird ein Verfahren zum Messen des Vorhandenseins eines Leptinrezeptors in einer Probe offenbart, umfassend das Inkontaktbringen einer Probe, von der vermutet wird, dass sie einen Leptinrezeptor enthält, mit einem Antikörper, welcher spezifisch an den Leptinrezeptor unter Bedingungen bindet, welche die Bildung von Reaktionskomplexen, umfassend den Antikörper und den Leptinrezeptor, erlauben, und das Nachweisen der Bildung der Reaktionskomplexe, umfassend den Antikörper und den Leptinrezeptor in der Probe, wobei der Nachweis der Bildung von Reaktionskomplexen das Vorhandensein von Leptinrezeptor in der Probe anzeigt. In einer spezifischen Ausführungsform ist der Antikörper an einen Festphasenträger gebunden. Als eine Folge des Verfahrens zum Messen des Vorhandenseins des Leptinrezeptors in einer Probe wird eine in vitro Verfahren zum Bestimmen der Menge des Leptinrezeptors in einer biologischen Probe offenbart, umfassend das Nachweisen der Bildung von Reaktionskomplexen in einer biologischen Probe, wie beschrieben, und das Bestimmen der Menge der gebildeten Reaktionskomplexe, wobei die Menge der Reaktionskomplexe der Menge des Leptinrezeptors in der biologischen Probe entspricht. Diese Offenbarung betrifft weiterhin ein in vitro Verfahren zum Nachweisen oder Diagnostizieren des Vorhandenseins einer Krankheit, welche mit erhöhten oder verminderten Mengen des Leptinrezeptors in einem Individuum verbunden ist, umfassend das Bestimmen der Menge des Leptinrezeptors in einer biologischen Probe aus einem Individuum, wie beschrieben, und das Vergleichen der im Schritt (a) nachgewiesenen Menge mit einer Menge Leptinrezeptor, welche in normalen Individuen oder in dem Individuum zu einem früheren Zeitpunkt vorliegt/vorlag, wobei ein Anstieg der Menge des Leptinrezeptors verglichen mit normalen Mengen eine Krankheit anzeigt, welche mit erhöhten Mengen des Leptinrezeptors verbunden ist, und eine verminderte Menge des Leptinrezeptors verglichen mit normalen Mengen eine Krankheit anzeigt, welche mit verminderten Mengen des Leptinrezeptors verbunden ist.Together with the antibodies disclosed herein discloses a method for measuring the presence of a leptin receptor disclosed in a sample comprising contacting a sample, which is suspected to contain a leptin receptor an antibody, which specifically binds to the leptin receptor under conditions which involves the formation of reaction complexes comprising the antibody and allow the leptin receptor, and detecting the formation of the Reaction complexes comprising the antibody and the leptin receptor in the sample, demonstrating the formation of reaction complexes indicates the presence of leptin receptor in the sample. In a specific embodiment is the antibody to a solid phase support bound. As a consequence of the method for measuring the presence The leptin receptor in a sample becomes an in vitro method for determining the amount of leptin receptor in a biological A sample comprising detecting the formation of reaction complexes in a biological sample as described, and determining the amount of reaction complexes formed, the amount of Reaction complexes of the amount of leptin receptor in the biological Sample corresponds. This disclosure further relates to an in vitro Method for detecting or diagnosing the presence of a Disease, which increased with or decreased levels of the leptin receptor in an individual comprising determining the amount of the leptin receptor in a biological sample from an individual as described, and comparing the amount detected in step (a) with a lot of Leptinrezeptor, which in normal individuals or in the individual to an earlier one Time present / present, with an increase in the amount of leptin receptor compared with normal amounts indicates a disease with increased Levels of the leptin receptor is associated, and a decreased amount Leptinrezeptors compared to normal amounts of a disease indicating which is associated with decreased levels of the leptin receptor is.

Es wird hier ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung offenbart, welche einen löslichen Leptinrezeptor und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Alternativ kann eine pharmazeutische Zusammensetzung, wie hier offenbart, einen transgenen Vektor, z. B. einen viralen Vektor oder nackte DNA, zur Verabreichung an ein Individuum zur Gentherapie umfassen. Vorzugsweise ist ein solcher Vektor auf das Gehirn, weiter bevorzugt auf den Hypothalamus zielgerichtet. Es wird hier ebenfalls ein Verfahren zum Behandeln von Fettleibigkeit in einem Individuum offenbart, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung. Das Verfahren zur Behandlung kann weiterhin das Verabreichen einer Behandlung von Diabetes, Bluthochdruck und erhöhtem Cholesterinspiegel umfassen.It also disclosed herein is a pharmaceutical composition which is a soluble leptin receptor and a pharmaceutically acceptable carrier includes. Alternatively, a pharmaceutical composition, such as disclosed herein, a transgenic vector, e.g. A viral vector or naked DNA, for administration to an individual for gene therapy include. Preferably, such a vector is on the brain, on preferably targeted to the hypothalamus. It will be here too a method of treating obesity in an individual discloses administering a therapeutically effective Amount of pharmaceutical composition. The procedure for treatment can continue to administer a treatment for diabetes, hypertension and elevated Include cholesterol levels.

In einer anderen Ausführungsform wird eine die körperliche Erscheinung verbessernde kosmetische Zusammensetzung zur Reduktion des Körpergewichts eines Individuums offenbart, umfassend einen löslichen Leptinrezeptor und einen verträglichen Träger. Es wird ebenfalls ein Verfahren zum Verbessern der körperli chen Erscheinung eines Individuums offenbart, umfassend das Verabreichen der kosmetischen Zusammensetzung.In another embodiment becomes one of the physical Appearance improving cosmetic composition for reduction of body weight of an individual comprising a soluble leptin receptor and a tolerable Carrier. There is also a method for improving the body Appearance of an individual comprising administering the cosmetic composition.

Folglich ist es ein Hauptziel der vorliegenden Offenbarung, Modulatoren des Körpergewichts, wie hier definiert, in gereinigter Form bereitzustellen, welche bestimmte Eigenschaften und Aktivitäten aufweisen, die mit der Kontrolle und Variation der Adiposität und dem Fettgehalt von Säugetieren verbunden sind.consequently It is a principal object of the present disclosure to provide modulators of the invention Body weight, as defined herein to provide in purified form which have certain characteristics and activities associated with the Control and variation of adiposity and fat content of mammals are connected.

Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenbarung, Verfahren zum Nachweis und zur Messung der Modulatoren der Gewichtskontrolle, wie hier dargestellt, als ein Hilfsmittel der wirksamen Diagnose und der Überwachung von pathologischen Zuständen bereitzustellen, wobei die Variation in der Menge solcher Modulatoren eine charakterisierende Eigenschaft ist oder sein kann.It Another object of the present disclosure is to provide methods for Detection and measurement of modulators of weight control, as shown here, as an aid to effective diagnosis and surveillance of pathological conditions to provide the variation in the amount of such modulators is or may be a characterizing property.

Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenbarung, ein Verfahren und ein damit verbundenes Assaysystem zum Screenen von Substanzen, wie Arzneimitteln, Mitteln und desgleichen, bereitzustellen, welche möglicherweise entweder beim Nachahmen oder Inhibieren der Aktivität der Leptinbindung an seinen Rezeptor wirksam sind, z. B. Agonisten und Antagonisten der hier offenbarten Modulatoren in Säugetieren.It Yet another object of the present disclosure is a method and an associated assay system for screening substances, like medicines, remedies and the like, which provide possibly either mimicking or inhibiting the activity of leptin binding are effective at its receptor, for. As agonists and antagonists the modulators disclosed herein in mammals.

Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenbarung, ein Verfahren zur Behandlung von Säugetieren bereitzustellen, um das Körpergewicht und den Fettgehalt in Säugetieren zu kontrollieren und/oder bestimmte pathologische Zustände zu behandeln, bei denen ein abnormaler Abfall oder eine Erhöhung des Körpergewichts eine charakterisierende Eigenschaft darstellt.It Yet another object of the present disclosure is a method for the treatment of mammals to provide body weight and the fat content in mammals to control and / or treat certain pathological conditions, where an abnormal decrease or increase in body weight is a characterizing Feature represents.

Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenbarung, genetische Konstrukte zur Verwendung in genetisch therapeutischen Protokollen und/oder pharmazeutischen Zusammensetzungen für vergleichbare therapeutische Verfahren herzustellen, welche einen oder mehrere der Modulatoren, Bindungspartner oder Mittel um fassen oder auf ihnen basieren, welche ihre Herstellung kontrollieren können, oder welche ihre Aktivitäten nachahmen oder ihnen entgegenwirken.It is yet another object of the present disclosure, genetic Constructs for use in genetically therapeutic protocols and / or pharmaceutical compositions for comparable therapeutic To produce processes comprising one or more of the modulators, Binding partners or means based on or based on them which can control their production, or what their activities imitate or counteract them.

Andere Ziele und Vorteile werden dem Fachmann aus einem Überblick der folgenden Beschreibung deutlich werden, welche unter Bezugnahme auf die folgenden darstellenden Zeichnungen fortfährt.Other Goals and advantages will be clear to those skilled in the art the following description, which by reference continues on the following illustrative drawings.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGENBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Aspekte der Figuren, welche nicht spezifisch die beanspruchte Erfindung betreffen, sind nur zur Darstellung und zum Vergleich eingeschlossen.aspects those figures which are not specific to the claimed invention are included for illustration and comparison only.

1. Lokalisation des Leptinrezeptors in der Region des db-Gens. Die db-Mutation wurde in zwei Kreuzungen, welche insgesamt 750 Meiosen umfassten, aufgespalten. Eine genetische Karte wurde durch Genotypisierung der Nachkommen dieser Kreuzungen mit den in der Karte angegebenen Markern erstellt. Rekombinante Schlüsseltiere sind auf der Karte als Zahlen über der Linie angegeben. Ein "Chromsomen-Walk" wurde mit dem Mikrodissektionsklon D4Rck22 begonnen. Der "Walk" deckte 2,7 Megabasen ab und war aus YACs (fette Linien), BACs (kursiv) und P1-Bakteriophagen (Nummern) aufgebaut. Die Genotypisierung der rekombinanten Tiere mit zwei SSLP-Markern, D4Rck6 und D4Rck7, von den Enden dieser genomischen Klone lokalisierte das db-Gen auf das ungefähr 300 Kb große Intervall zwischen den Rekombinationsereignissen in den Tieren 324 und 1028. Dieses Intervall wurde von den BACs 242 und 43 abgedeckt. Southern-Blots und eine PCR zeigten, dass die 5'-Enden des Leptinrezeptors bei BAC 150A lagen und das 3'-Ende bei BAC 19, was darauf hinweist, dass das Gen in Richtung auf die Telomere transkribiert wird. 1 , Localization of the leptin receptor in the region of the db gene. The db mutation was split in two crosses, which included a total of 750 meioses. A genetic map was created by genotyping the progeny of these crosses with the markers indicated in the map. Recombinant key animals are indicated on the map as numbers above the line. A chromosomome walk was started with the microdissection clone D4Rck22. The "Walk" covered 2.7 megabases and consisted of YACs (bold lines), BACs (italics) and P1 bacteriophages (numbers). Genotyping the recombinant animals with two SSLP markers, D4Rck6 and D4Rck7, from the ends of these genomic clones localized the db gene to the approximately 300 Kb interval between the recombination events in animals 324 and 1028. This interval was reported by BACs 242 and 43 covered. Southern blots and PCR showed that the 5 'ends of the leptin receptor were at BAC 150A and the 3' end at BAC 19, indicating that the gene is being transcribed towards the telomeres.

2A–B. Verschiedene Spleißvarianten des Leptinrezeptors sind vorhanden. (A) Eine schematische Zeichnung des Leptinrezeptors mit möglichen Motiven für eine JAK-Bindung und -Signaltransduktion, "Box 1" und "Box 2" (schattierte Flächen). "TM" weist eine mögliche Transmembrandomäne aus. Insgesamt 8 cDNA-Klone wurden aus Mäusegehirn isoliert. Für diese cDNAs wurde gefunden, dass sie fünf verschiedenen Spleißvarianten des Leptinrezeptors entsprechen. (B) Sechs der Klone wiesen teilweise identische Sequenzen strangaufwärts von Lysin 889 des Leptinrezeptors (OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc und OB-Rd) auf, an welchem Punkt die vorausgesagten Proteine divergierten. Die vorausgesagten C-terminalen Aminosäuresequenzen dieser Klone sind gezeigt (jeweils SEQ ID NR: 11–14). OB-Ra, b, c und d sagen alle ein Box 1-Motiv voraus, OB-Rb sagt ebenfalls eine Peptidsequenz voraus, welche möglicherweise homolog zu Box 2 ist (unterstrichen). Zwei unabhängige cDNA-Klone waren identisch zum Leptinrezeptor strangaufwärts von Histidin 796, an welchem Punkt die Sequenzen divergierten (OB-Re) (SEQ ID NR: 15). Die Nukleotidsequenz sagt einen löslichen Rezeptor voraus. 2A -B. Various splice variants of the leptin receptor are present. (A) A schematic drawing of the leptin receptor with possible motifs for JAK binding and signal transduction, "Box 1" and "Box 2" (shaded areas). "TM" indicates a possible transmembrane domain. A total of 8 cDNA clones were isolated from mouse brain. These cDNAs were found to correspond to five different splice variants of the leptin receptor. (B) Six of the clones had partially identical sequences upstream of lysine 889 of the leptin receptor (OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc and OB-Rd), at which point the predicted proteins diverged. The predicted C-terminal amino acid sequences of these clones are shown (SEQ ID NOS: 11-14, respectively). OB-Ra, b, c and d all predict a Box 1 motif, OB-Rb also predicts a peptide sequence possibly homologous to Box 2 (underlined). Two independent cDNA clones were identical to the leptin receptor upstream of histidine 796, at which point the sequences diverged (OB-Re) (SEQ ID NO: 15). The nucleotide sequence predicts a soluble receptor.

3A–C. Die db-Mutation führt zu einem abnormalen RNA-Spleißing und einer Umwandlung der Spleißvariante OB-Rb zu OB-Ra. (A) RT-PCR-Produkte von C57BL/Ks db/db- und Wildtyp-Mäusen wurden unter Verwendung eines für OB-Rb-RNA spezifischen Primerpaares (F1 und R3) amplifiziert. Eine Elektrophorese ergab, dass das amplifizierte Fragment von diesen db-Mäusen größer war, als von den Wildtyp-Tieren. Die PCR-Produkte der genomischen DNA, welche den OB-Rb-Spleißakzeptor an Pro890 abdeckten, waren von identischer Größe in C57 BL/Ks db/db-Mäusen und Kontrollen aus dem gleichen Wurf. (B) Die Primer F2 und R wurden verwendet, um die genomische DNA zu amplifizieren. Der F2-Primer wurde nach der Verwendung einer Vectorette-PCR und BAC 242 ausgewählt, um die Sequenz der genomischen DNA strangaufwärts des Spleißakzeptors an P890 zu erhalten. (C) Lokalisierung der Primer für die RT-PCR und die genomische PCR-Amplifikation. 3A -C. The db mutation leads to abnormal RNA splicing and a transformation of the splice variant OB-Rb to OB-Ra. (A) RT-PCR products from C57BL / Ks db / db and wild type mice were amplified using a specific OB-Rb RNA primer pair (F1 and R 3). Electrophoresis revealed that the amplified fragment from these db mice was larger than from the wild-type animals. Genomic DNA PCR products covering the OB-Rb splice acceptor on Pro 890 were of identical size in C57BL / Ks db / db mice and controls from the same litter. (B) Primers F2 and R were used to amplify the genomic DNA. The F2 primer was selected after use of a Vectorette PCR and BAC 242 to obtain the sequence of genomic DNA upstream of the splice acceptor on P 890 . (C) Localization of primers for RT-PCR and genomic PCR amplification.

4A–D. RNA aus dem Hypothalamus von Wildtyp-Mäusen. Die RT-PCR-Produkte des Hypothalamus für die C-terminale kodierende Region von (A) OB-Ra, (B) OB-Re, (C) OB-Rd und (D) OB-Re waren von normaler Größe in db-Mäusen. Die über die Spleiß-Verbindung reichende DNA-Sequenz war in jedem dieser RT-PCR-Produkte normal. Dies weist darauf hin, dass der Spleißdonor an Lys889 Wildtyp ist. 4A -D. RNA from the hypothalamus of wild-type mice. The RT-PCR products of the hypothalamus for the C-terminal coding region of (A) OB-Ra, (B) OB-Re, (C) OB-Rd and (D) OB-Re were of normal size in db- mice. The splice junction DNA sequence was normal in each of these RT-PCR products. This indicates that the splice donor on Lys 889 is wild-type.

5A–C. Identifikation von Spleißmutationen in db-Mäusen. (A) Eine DNA-Sequenzierung identifizierte eine 106 bp lange Insertion in der mutierten OB-Rb-RNA an der Spleiß-Verbindung zwischen Lys889 und Pro890 (SEQ ID NR: 16). Die Sequenz der Insertion war identisch mit den ersten 106 bp des C-terminalen Exons von OB-RA. Die Insertion sagt ein unreifes Stopcodon voraus und ändert die Aminosäuresequenz von OB-Rb (SEQ ID NR: 17) zu OB-Ra. (B, C) Die angenommene genomische Organisation der OB-Ra- und OB-Rb-3'-Enden sind gezeigt. Eine DNA-Sequenzierung des OB-Ra-Exons aus den C57 BL/K9 db/db-Mäusen (SEQ ID NR: 18) und den Kontrollen aus dem gleichen Wurf (SEQ ID NR: 19) ergab eine G zu T-Mutation 106 Basenpaare nach dem Spleißakzeptor an R890. Diese Mutation führt zu dem Erscheinen einer Konsensus-Spleißdonorstelle, AGGTAAA, welche zur Insertion von 106 bp des C-terminalen Exons von OB-Ra in das von OB-Rb führt. 5A -C. Identification of splice mutations in db mice. (A) DNA sequencing identified a 106 bp insertion into the mutated OB-Rb RNA at the splice junction between Lys 889 and Pro 890 (SEQ ID NO: 16). The sequence of the insertion was identical to the first 106 bp of the C-terminal exon of OB-RA. The insertion predicts an immature stop codon and alters the amino acid sequence of OB-Rb (SEQ ID NO: 17) to OB-Ra. (B, C) The assumed genomic organization of the OB-Ra and OB-Rb-3 'ends are shown. DNA sequencing of the OB-Ra exon from the C57 BL / K 9 db / db mice (SEQ ID NO: 18) and controls from the same litter (SEQ ID NO: 19) gave a G to T mutation 106 base pairs after the splice acceptor on R 890 . This mutation results in the appearance of a consensus splice donor site, AGGTAAA, which results in the insertion of 106 bp of the C-terminal exon from OB-Ra to that of OB-Rb.

6A–F. Gewebeverteilung des alternativ gespleißten Leptinrezeptors. Eine RT-PCR wurde von den angegebenen Gewebequellen durchgeführt. In jedem Fall wurde ein Primer aus einer Region mit einer gemeinsamen Nukleotidsequenz in Kombination mit einem Primer, welcher spezifisch für das alternativ gespleißte Exon war, verwendet, Aktin-mRNA diente als Kontrolle. (B) Gehirn, (H) Hypothalamus, (L) Leber, (H) Herz, (K) Niere, (S) Milz, (T) Hoden, (F) Fettgewebe, (S) Milz. 6A -F. Tissue distribution of the alternatively spliced leptin receptor. RT-PCR was performed from the indicated tissue sources. In each case, a primer from a region having a common nucleotide sequence in combination with a primer specific for the alternatively spliced exon was used, actin mRNA served as a control. (B) brain, (H) hypothalamus, (L) liver, (H) heart, (K) kidney, (S) spleen, (T) testis, (F) adipose tissue, (S) spleen.

7. Die NIH-Corpulent-Ratten-(cp/cp)-Mutation. Eine DNA-Sequenz von Lepr von fettleibigen NIH facp/facp und mageren Ratten ist gezeigt. Die cDNA wurde aus RNA synthetisiert, die aus dem Gehirn von fettleibigen cp/cp-Ratten und mageren Geschwistern des gleichen Wurfs isoliert wurde. Die PCR-Produkte wurden gelgereinigt und mit den oben erwähnten Primern auf einem Sequenzierautomaten sequenziert. Die cp/cp-Ratte wies eine Basenänderung von T → A an Nukleotid 2289 auf, die zu einem Stopcodon an Tyr763 führte. 7 , The NIH corpulent rat (cp / cp) mutation. A DNA sequence of Lepr from obese NIH fa cp / fa cp and lean rats is shown. The cDNA was synthesized from RNA isolated from the brain of obese cp / cp rats and lean siblings of the same litter. The PCR products were gel purified and sequenced with the above-mentioned primers on a sequencer. The cp / cp rat had a base change of T → A at nucleotide 2289, which resulted in a stop codon at Tyr763.

8. PCR von Lepr von Wildtyp- und db3J/db3J-Mäusen. Sowohl cDNA, als auch genomische DNA aus der extrazellulären Region von Lepr wurde unter Verwendung von DNA von 129 db3J/db3J- und Wildtyp-Mäusen PCR amplifiziert. In beiden Fällen war das PCR-Produkt in den mutierten Mäusen kürzer. Alle Primer sind aus der OB-R kodierenden Region, außer 3JR2, welcher intronisch ist, so dass das amplifizierte Produkt aus der genomischen DNA auf einem Agarosegel getrennt werden kann. 8th , PCR of Lepr from wild-type and db 3J / db 3J mice. Both cDNA and genomic DNA from the extracellular region of Lepr were PCR amplified using DNA from 129 db 3J / db 3J and wild-type mice. In both cases, the PCR product was shorter in the mutant mice. All primers are from the OB-R coding region, except 3JR2, which is intronic so that the amplified product can be separated from the genomic DNA on an agarose gel.

9. Das PCR-Produkt von db3J/db3J-Mäusen wurde sequenziert. Eine Deletion von 17 bp wurde in dieser Mutante identifiziert. Dieselbe Deletion wurde sowohl in der genomischen DNA, als auch in der cDNA identifiziert. 9 , The PCR product of db 3J / db 3J mice was sequenced. A deletion of 17 bp was reported in this mutant identified. The same deletion was identified in both the genomic DNA and the cDNA.

10. Schema der Leptinrezeptor-Mutationen. Das vorausgesagte Protein von jedem der Lepr-Allele ist gezeigt. Die Nummern am Ende von jedem Rezeptor stellen den Aminosäurerest am Carboxylterminus dar. Die kurze gerade Linie am Ende des db3J/db3J-Diagramms stellt die 11 zusätzlichen Reste dar, welche der Aminosäure 625 folgen, welche durch eine Leserahmenverschiebung verursacht werden. 10 , Scheme of leptin receptor mutations. The predicted protein of each of the Lepr alleles is shown. The numbers at the end of each receptor represent the amino acid residue at the carboxyl terminus. The short straight line at the end of the db 3J / db 3J diagram represents the 11 additional residues following amino acid 625, which are caused by frame shift.

11. PCR-Primer und Strategien zur Amplifikation von OB-Re und OB-Re-Mutanten. Die Pfeile stellen PCR-Primer dar (Tabelle 2, infra), welche mit Nummern markiert sind, alle 1°-PCR-Reaktionen wurden mit einer OB-Re-cDNA-Matrize durchgeführt, alle 2°-PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von Gemischen gleicher Mengen der entsprechenden 1°-PCR-Produkte als Matrize durchgeführt. 11 , PCR primers and strategies for amplification of OB-Re and OB-Re mutants. The arrows represent PCR primers (Table 2, infra) labeled with numbers, all 1 ° PCR reactions were performed with an OB-Re cDNA template, all 2 ° PCR reactions were performed using Mixtures of equal amounts of the corresponding 1 ° -PCR products performed as a template.

12. Schema des Leptinbindungs-Experiments. Das Schema zeigt eine kompetitive Hemmung von rekombinantem OB-Re, welcher an Leptin-SEPHAROSE bindet, mit einem freien Leptin. 12 , Scheme of the leptin binding experiment. The scheme shows a competitive inhibition of recombinant OB-Re which binds to leptin-SEPHAROSE with a free leptin.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNGDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Aspekte und Ausführungsformen der folgenden detaillierten Beschreibung, welche nicht spezifisch die beanspruchte Erfindung betreffen, sind nur zur Darstellung und zum Vergleich eingeschlossen.aspects and embodiments the following detailed description, which is not specific relate to the claimed invention, are only for illustration and included for comparison.

Die vorliegende Offenbarung betrifft die Aufklärung und Entdeckung eines Proteins, welches hier OB-Rezeptor (OB-R) oder Leptinrezeptor genannt wird, von Nukleinsäuren, welche das Protein kodieren, einschließlich des OB-R-Gens (hier auch DB genannt – es sollte erwähnt werden, dass, wenn nur Großbuchstaben verwendet werden, ein natürliches Protein oder Gen bezeichnet wird, alle Kleinbuchstaben ein mutiertes Protein oder Gen bezeichnen, kursive Buchstaben ein Gen oder ein Nukleinsäuremolekül anzeigen und normale Buchstaben ein Protein oder ein Polypeptid anzeigen), einschließlich degenerierter Variationen davon, z. B., welche optimale Codons zur Expression in einem bestimmten Expressionssystem einschließen, wobei das Protein die Fähigkeit zeigt, an der Kontrolle des Säugetier-Körpergewichts teilzunehmen. Insbesondere zeigt das Protein die Fähigkeit, Leptin zu binden. In einer spezifischen Ausführungsform vermittelt das Protein eine Signaltransduktion bei der Bindung an Leptin.The present disclosure relates to the elucidation and discovery of a protein, which is called OB receptor (OB-R) or leptin receptor, of nucleic acids, which encode the protein, including the OB-R gene (here as well Called DB - it should be mentioned be that if only capital letters used, a natural Protein or gene is called, all lowercase letters a mutated protein or gene, italics indicate a gene or a nucleic acid molecule and normal letters indicate a protein or polypeptide), including degenerate variations thereof, e.g. For example, which optimal codons for Include expression in a particular expression system, wherein the protein the ability shows to participate in the control of mammalian body weight. In particular, the protein shows the ability to bind leptin. In a specific embodiment the protein mediates signal transduction during binding Leptin.

Der OB-Rezeptor, so wie hier offenbart, kann drei wichtige strukturelle Domänen enthalten: eine extrazelluläre (oder extracytoplasmatische) Domäne, eine Transmembrandomäne und eine cytoplasmatische Domäne. Von der extrazellulären Domäne wird angenommen, dass sie Leptin, Leptin-Proteinkomplexe (wie Leptin, welches an einen löslichen Leptinrezeptor gebunden ist) bindet, und möglicherweise andere Proteine oder Liganden binden kann. In der Tat bindet die extracytoplasmatische Domäne, so wie hier gezeigt, Leptin mit sehr hoher Affinität und schließt zwei Leptin-Bindungsstellen ein. In einer spezifischen Ausführungsform umfasst ein Rezeptor, so wie hier offenbart, nur eine extrazelluläre Domäne, d. h. es ist ein löslicher Rezeptor. Die Transmembrandomäne umfasst einen Abschnitt von stark nicht polaren Aminosäureresten, welcher in der hydrophoben Region der Zellmembran liegt. In dieser Hinsicht hat der Begriff Transmembrandomäne seine gebräuchliche Bedeutung in der Molekular- und Zellbiologie. Schließlich kann die cytoplasmatische Domäne eines OB-Rezeptors, so wie hier offennbart, keine, eine oder zwei JAK-bindende Konsensussequenzen enthalten, welche "Box 1" und "Box 2" genannt werden. Für einen Rezeptor, welcher "Box 1" und "Box 2" aufweist, wird angenommen, dass er kompetent für eine Signaltransduktion über den JAK-Stat-Weg beim Binden eines Liganden, z. B. Leptin, ist.Of the OB receptor, as disclosed herein, can have three important structural domains included: an extracellular (or extracytoplasmic) domain, a transmembrane domain and a cytoplasmic domain. From the extracellular domain It is assumed that they contain leptin, leptin-protein complexes (such as leptin, which to a soluble Leptin receptor is bound), and possibly other proteins or Can bind ligands. In fact, the extracytoplasmic binds Domain, as shown here, leptin with very high affinity and closes two Leptin binding sites. In a specific embodiment a receptor as disclosed herein, only one extracellular domain, i. H. it is a soluble one Receptor. The transmembrane domain comprises a section of highly non-polar amino acid residues, which lies in the hydrophobic region of the cell membrane. In this The term transmembrane domain has its usual meaning Importance in molecular and cell biology. Finally, can the cytoplasmic domain of an OB receptor, as here revealed, none, one or two Contain JAK-binding consensus sequences called "Box 1" and "Box 2". For one Receptor, which "box 1 "and" Box 2 ", it is assumed that he is competent for a signal transduction over the JAK-Stat pathway in binding a ligand, e.g. As leptin, is.

Weiterhin wurde identifiziert, dass das Protein mehrere Spleißformen aufweist. In einem Aspekt führen die Spleiß-Variationen zu einer Divergenz der C-terminalen Sequenzen. Daher kann das Protein in einer sezernierten Form gefunden werden, von der angenommen wird, dass sie die Leptinaktivität fördert, es kann als ein integraler Membranrezeptor gefunden werden, welcher den Leptintransfer über die Blut-Hirn-Schranke unterstützen kann, dem aber Domänen fehlen, welche an der Signaltransduktion beteiligt sind, und es kann als ein integraler Membranrezeptor gefunden werden, welcher Domänen enthält, die an der Signaltransduktion beteiligt sind. In einem anderen Aspekt führen die Spleißvariationen zu einer Divergenz der N-terminalen Polypeptidsequenz.Farther it was identified that the protein has multiple splice forms having. In one aspect, the lead Splice variations to a divergence of the C-terminal sequences. Therefore, the protein can be found in a secreted form, which is believed to be that they have the leptin activity promotes, it can be found as an integral membrane receptor, which the leptin transfer over support the blood-brain barrier but with domains missing, which are involved in the signal transduction, and it can be found as an integral membrane receptor which domains contains involved in signal transduction. In another aspect to lead the splice variations to a divergence of the N-terminal polypeptide sequence.

Die betrachteten Nukleinsäuren stellen die kodierenden Sequenzen dar, welche dem tierischen, insbesondere dem Mäuse- und humanen OB-R-Polypeptid entsprechen, von welchem durch Vermitteln (oder das Versagen zu vermitteln) der Signaltransduktion beim Binden von Leptin angenommen wird, dass es eine wichtige Rolle bei der Regulation des Körpergewichts und der Adiposität spielt. Die hier dargestellten Daten weisen darauf hin, dass eine Spleißvariante des Polypeptidprodukts einer Nukleinsäure, so wie hier offenbart, durch die Zellen sezerniert werden kann, welche es exprimieren, oder es kann als ein integrales Membranprotein exprimiert werden. In beiden Fällen wirkt das Polypeptid als ein Leptinrezeptor durch das Binden an Leptin. Zusätzliche experimentelle Daten legen nahe, dass die natürlich vorkommende Spleißform des OB-R-Polypeptids sehr wirksam beim Behandeln von Fettleibigkeit in Mäusen ist, welche eine Mutation des ob-Gens tragen.The nucleic acids under consideration constitute the coding sequences corresponding to the animal, in particular the mouse and human OB-R polypeptide, of which, by mediating (or failing to mediate) the signal transduction upon binding of leptin, it is believed to be an important Role in the regulation of body weight and adiposity plays. The data shown here have suggests that a splice variant of the polypeptide product of a nucleic acid as disclosed herein can be secreted by the cells expressing it, or it can be expressed as an integral membrane protein. In both cases, the polypeptide acts as a leptin receptor by binding to leptin. Additional experimental data suggest that the naturally occurring splice form of the OB-R polypeptide is very effective in treating obesity in mice bearing a mutation of the ob gene.

Zusätzlich zeigen die Beispiele hier, dass mRNA, welche das OB-R-Polypeptid kodiert, welches hier alternativ "Leptinrezeptor" genannt wird, im Hypothalamus, den Hoden und den Fettzellen exprimiert wird. Die Daten zeigen ebenfalls eine Expression des Proteins im Plexus Choroideus.Additionally show the examples here that mRNA encoding the OB-R polypeptide which is alternatively called "leptin receptor" here, in Hypothalamus, the testes and fat cells is expressed. The data also show an expression of the protein in the choroid plexus.

In einem weiteren Aspekt ist das OB-R-Polypeptid einer Art eng verwandt (homolog) mit dem OB-R einer anderen Art. Insbesondere ist das humane OB-R-Polypeptid hoch homolog zu dem Mäuse-OB-R-Polypeptid. Diese Beobachtung stimmt mit den Daten überein, welche zeigen, dass humanes Leptin in Mäusen aktiv ist: wenn das Hormon zwischen den Arten aktiv ist, würde man ebenfalls einen hohen Grad der Ähnlichkeit oder Homologie zwischen den Rezeptoren von verschiedenen Arten erwarten.In In another aspect, the OB-R polypeptide of one species is closely related (homologous) with the OB-R of a different kind. In particular, this is humane OB-R polypeptide highly homologous to the mouse OB-R polypeptide. This observation is consistent with the data showing that human leptin in mice is active: if the hormone is active between the species, one would also a high degree of similarity or Expect homology between the receptors of different species.

In seinem ersten Aspekt ist die vorliegende Offenbarung auf die Identifikation von Materialien gerichtet, welche als Modulatoren des Säugetier-Körpergewichts wirken. Insbesondere betrifft diese Offenbarung die Isolierung, Reinigung und Sequenzierung bestimmter Nukleinsäuren, welche dem OB-R-Gen (hier und in der Literatur. alternativ als DB bezeichnet) oder seiner kodierenden Region sowohl in Mäusen, als auch in Menschen entsprechen, sowie der entsprechenden Polypeptide, welche durch diese Nukleinsäuren exprimiert werden. Diese Offenbarung umfasst daher die Entdeckung von Nukleinsäuren, welche die Nukleotidsequenzen aufweisen, die in den SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 und 9 dargelegt sind, und die degenerierten Varianten, Allele und Fragmente davon, welche alle die Aktivität besitzen, das Körpergewicht und die Adiposität zu modulieren. Die Entsprechung der vorliegenden Nukleinsäuren mit dem OB-R-Gen weist auf ihren erheblichen Einfluss auf Zustände, wie Fettleibigkeit, sowie andere Krankheiten und Fehlfunktionen, in denen Abnormalitäten im Körpergewicht einen beitragenden Faktor darstellen, hin. Diese Offenbarung erstreckt sich auf die Proteine, welche durch die hier offenbarten Nukleinsäuren exprimiert werden, und insbesondere auf jene Proteine, welche in den SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 und 10 dargelegt sind, sowie auf die konservierten Varianten und aktiven Fragmente.In In its first aspect, the present disclosure is based on identification directed by materials that act as modulators of mammalian body weight Act. In particular, this disclosure relates to insulation, Purification and sequencing of certain nucleic acids encoding the OB-R gene (here and in the literature. alternatively referred to as DB) or his coding region in both mice, as well as in humans, as well as the corresponding polypeptides, which by these nucleic acids are expressed. This disclosure therefore includes discovery of nucleic acids, which have the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 and 9, and the degenerate variants, alleles and fragments thereof, all of which have activity, body weight and the adiposity to modulate. The correspondence of the present nucleic acids with The OB-R gene indicates its significant impact on conditions such as Obesity, as well as other diseases and malfunctions, in which abnormalities in body weight contributing factor. This disclosure extends refers to the proteins expressed by the nucleic acids disclosed herein and, in particular, those proteins which are described in SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 and 10, as well as the conserved ones Variants and active fragments.

Von besonderem Interesse sind verschiedene Spleißvarianten von OB-R, z. B. wie durch OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc, OB-Rd und OB-Re dargestellt. Die vorliegende Offenbarung nimmt ebenfalls andere OB-R-Spleißvarianten vorweg.From Of particular interest are various splice variants of OB-R, e.g. B. as represented by OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc, OB-Rd and OB-Re. The The present disclosure also takes other OB-R splice variants anticipated.

Daher betrifft in spezifischen Ausführungsformen der Begriff OB-R Spleißvarianten wie folgt (die Aminosäuren-Nummerierung entspricht der Nummerierung, die für Mäuse-OB-R angewendet wurde [Tartaglia et al., Cell, 83: 1263 (1995)], welche hier angewendet wurde):
ein N-Terminus, welcher OB-Ra bis Lys889 entspricht, und ein C-Terminus, welcher einem C-Terminus entspricht, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus OB-Rb, OB-Rc und OB-Rd nach Lys889,
ein N-Terminus, welcher OB-Rb oder OB-Rc bis Lys889 entspricht, und ein C-Terminus, welcher OB-Ra oder OB-Rd nach Lys889 entspricht,
ein N-Terminus, welcher OB-Rd bis Lys889 entspricht, und ein C-Terminus, welcher OB-Ra, OB-Rb oder OB-Rc entspricht,
ein N-Terminus, welcher OB-R von Pro664 bis Lys889 entspricht, und ein C-Terminus, welcher OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc und OB-Rd entspricht,
ein N-Terminus, welcher OB-R von Met733 bis Lys889 entspricht, und ein C-Terminus, welcher OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc und OB-Rd entspricht,
ein N-Terminus, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus OB-Ra, OB-Rb, OB-Rd und OB-R von Pro664 bis His796 und OB-Re von His796, und
ein N-Terminus, welcher OB-R von Met733 bis His796 entspricht, und OB-Re von His796.Therefore, in specific embodiments, the term OB-R refers to splice variants as follows (the amino acid numbering corresponds to the numbering used for mouse OB-R [Tartaglia et al., Cell, 83: 1263 (1995)], which is applied here has been):
an N-terminus corresponding to OB-Ra to Lys 889 and a C-terminus corresponding to a C-terminus selected from the group consisting of OB-Rb, OB-Rc and OB-Rd according to Lys 889 ,
an N-terminus corresponding to OB-Rb or OB-Rc to Lys 889 , and a C-terminus corresponding to OB-Ra or OB-Rd to Lys 889 ,
an N-terminus corresponding to OB-Rd to Lys 889 and a C-terminus corresponding to OB-Ra, OB-Rb or OB-Rc,
an N-terminus corresponding to OB-R from Pro 664 to Lys 889 , and a C-terminus corresponding to OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc and OB-Rd,
an N-terminus corresponding to OB-R from Met 733 to Lys 889 , and a C-terminus corresponding to OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc and OB-Rd,
an N-terminus selected from the group consisting of OB-Ra, OB-Rb, OB-Rd and OB-R from Pro 664 to His 796 and OB-Re from His 796 , and
an N-terminus corresponding to OB-R from Met 733 to His 796 , and OB-Re from His 796 .

Verschiedene Formen des OB-R, welche als Agonisten (z. B. die natürlich vorkommende, sezernierte Form des OB-R) oder Antagonisten (z. B. eine verkürzte Form des OB-R, welche nur Leptin bindet) wirken können, können in pharmazeutischen Zusammensetzungen mit einem geeigneten Träger und in einer Stärke, welche wirksam zur Verabreichung durch verschiedene Hilfsmittel an einen Patienten ist, welcher abnormale Fluktuationen im Körpergewicht oder der Adiposität durchmacht, entweder alleine oder als Teil eines nachteiligen medizinischen Zu stands, wie Krebs oder AIDS, zur Behandlung davon hergestellt werden. Eine Vielzahl von Verabreichungstechniken kann verwendet werden, unter ihnen orale Verabreichung, nasal und andere Formen der transmukosalen Verabreichung, parenterale Techniken, wie subkutane, intravenöse und intraperitoneale Injektionen, Katheterisierungen und desgleichen. Geeignete Mengen der löslichen OB-R-Moleküle können variieren und sollten insbesondere auf den Empfehlungen und der Verschreibung eines qualifizierten Arztes oder Tierarztes basieren.Various forms of OB-R, which may act as agonists (eg, the naturally occurring, secreted form of OB-R) or antagonists (eg, a truncated form of OB-R that binds only leptin) may act in pharmaceutical compositions with a suitable carrier and in a strength effective for administration by various adjuvants to a patient undergoing abnormal fluctuations in body weight or adiposity, either alone or as part of an adverse medical condition such as cancer or AIDS, for the treatment thereof. A variety of administration techniques can be used, including oral administration, nasal and other forms of transmucosal administration, parenteral techniques such as subcutaneous, intravenous and intraperitoneal injections, catheterizations, and the like. Suitable amounts of the soluble OB-R molecules may, inter alia and should be based, in particular, on the recommendations and prescriptions of a qualified doctor or veterinarian.

Gemäß dem oben Genannten kann ein Assaysystem zum Screenen möglicher Arzneimittel, welche wirksam sind, um die Aktivität von Leptin nachzuahmen oder ihr entgegenzuwirken, hergestellt werden. Das zukünftige Arzneimittel kann mit einer löslichen Form des OB-R in Kontakt gebracht werden oder kann alternativ mit Zellen verwendet werden, welche eine Rezeptorform von OB-R exprimieren, um zu bestimmen, ob es an OB-R bindet oder ihn aktiviert (oder ihm entgegenwirkt). Zum Beispiel kann in einem Expressions-Assaysystem die Kultur untersucht werden, um irgendwelche Änderungen in der Aktivität der Zellen zu beobachten, entweder aufgrund des Hinzufügens des zukünftigen Arzneimittels alleine oder aufgrund der Wirkung von hinzugefügten Mengen des bekannten Gewichtsmodulators Leptin.According to the above That is, an assay system can be used to screen for potential drugs that are effective are to the activity be imitated or counteracted by leptin. The future Medicines can be soluble Form of OB-R can be contacted or alternatively with Cells expressing a receptor form of OB-R, to determine if it binds to OB-R or activates it (or it counteracts). For example, in an expression assay system The culture will be examined to detect any changes in the activity of the cells to watch, either because of the addition of the future Drug alone or due to the effect of added amounts the known weight modulator leptin.

Wie zuvor festgestellt hat die molekulare Klonierung des hier beschriebenen OB-R-Gens zur Identifikation einer Klasse von Materialien geführt, welche auf der molekularen Ebene wirken, um das Säugetier-Körpergewicht zu modulieren. Die Entdeckung der wie hier offenbarten Modulatoren hat wichtige Folgen für die Diagnose und Behandlung von Ernährungsstörungen, einschließlich von, aber nicht beschränkt auf, Fettleibigkeit, Gewichtsverlust, welcher mit Krebs verbunden ist, und der Behandlung von Krankheiten, die mit Fettleibigkeit verbunden sind, wie Bluthochdruck, Herzkrankheit und Typ II-Diabetes. Zusätzlich gibt es mögliche landwirtschaftliche Verwendungen für das Genprodukt in Fällen, in denen gewünscht werden könnte, das Körpergewicht von Tieren zu modulieren. Die Diskussion, die mit spezifischer Bezugnahme auf das OB-R-Gen folgt, hat allgemeine Anwendbarkeit auf die Klasse der Modulatoren, welche einen Teil der vorliegenden Offen barung umfassen, und es sollte ihr daher eine solche Breite und ein Umfang der Interpretation gewährt werden.As previously noted the molecular cloning of the one described here OB-R gene for identification a class of materials, which act at the molecular level to mammalian body weight to modulate. The discovery of the modulators disclosed herein has important consequences for the diagnosis and treatment of nutritional disorders, including, but not limited on, obesity, weight loss, which is associated with cancer is, and the treatment of diseases associated with obesity such as high blood pressure, heart disease and type II diabetes. additionally is there any possible agricultural Uses for the gene product in cases where desired could be the body weight of animals. The discussion, with specific reference following the OB-R gene has general applicability to the class the modulators which form part of the present disclosure therefore, it should have such a breadth and scope granted the interpretation become.

In einer bestimmten Ausführungsform kann die funktionelle Aktivität des OB-R-Polypeptids transgen überprüft werden. Das OB-R-Gen kann in Komplementationsstudien verwendet werden, welche transgene Mäuse einsetzen. Transgene Vektoren, einschließlich viraler Vektoren, oder Kosmid-Klone (oder Phagen-Klone), welche dem Wildtyp-Locus des Kandidatengens entsprechen, können unter Verwendung des isolierten OB-R-Gens konstruiert werden. Kosmide können unter Verwendung veröffentlichter Verfahren in transgene Mäuse eingeführt werden [Jaenisch, Science, 240: 1468–1474 (1988)]. Die Konstrukte werden in befruchtete Eier eingeführt, welche aus einer untereinander durchgeführten Kreuzung (engl.: intercross) zwischen F1-Nachkommen eines C57BL/6J db/db X DBA intercross abgeleitet wurden. Der Genotyp an den db-Loci in transgenen Kosmid-Tieren kann durch Typisieren von Tieren mit eng verbundenen RFLPs oder Mikrosatelliten bestimmt werden, welche die Mutation flankieren und welche zwischen den Vorläuferstämmen polymorph sind. Eine Komplementation wird gezeigt werden, wenn ein bestimmtes Konstrukt ein genetisch fettleibiges F2-Tier (wie durch die RFLP-Analyse gezeigt) mager und nicht diabetisch macht. Unter diesen Umständen wird ein endgültiger Beleg der Komplementation erfordern, dass das db/db-Tier, welches das Transgen trägt, mit den db/db-Ovartransplantaten gepaart wird. In dieser Kreuzung werden alle N2-Tiere, welche das Transgen nicht tragen, fettleibig und insulinresistent/diabetisch sein, während jene, welche das Transgen tragen, mager sein werden und normale Glucose- und Insulinkonzentrationen im Plasma aufweisen werden. In einem genetischen Sinn wirkt das Transgen als eine Suppressormutation.In a particular embodiment can the functional activity of the OB-R polypeptide be tested transgenically. The OB-R gene can be used in complementation studies which transgenic mice deploy. Transgenic vectors, including viral vectors, or Cosmid clones (or phage clones), which correspond to the wild-type locus of the candidate gene can be found under Use of the isolated OB-R gene can be constructed. cosmids can using published Method in transgenic mice introduced [Jaenisch, Science, 240: 1468-1474 (1988)]. The constructs are introduced into fertilized eggs, which are made from one another conducted Intercross between F1 offspring of a C57BL / 6J db / db X DBA intercross were derived. The genotype at the db loci in transgenic cosmid animals can be characterized by typing animals with tightly linked RFLPs or Microsatellites are flanked, which flank the mutation and which polymorphic between the precursor strains are. A complementation will be shown if a particular Construct a genetically obese F2 animal (as determined by the RFLP analysis shown) makes lean and not diabetic. In these circumstances will a definitive one Evidence of complementation requires that the db / db animal, which wearing the transgene, paired with the db / db ovarian transplants. In this junction All N2 animals that do not carry the transgene become obese and insulin resistant / diabetic while those expressing the transgene carry, be lean and normal glucose and insulin concentrations in the plasma. In a genetic sense, that works Transgenic as a suppressor mutation.

Alternativ können OB-R-Gene durch Überprüfen ihrer phänotypischen Wirkungen getestet werden, wenn sie in Antisense-Orientierung in Wildtyp-Tieren exprimiert werden. In diesem Ansatz wird die Expression des Wildtyp-Allels unterdrückt, was zu einem mutierten Phänotyp führt. Die RNA-RNA-Doppelhelixbildung (antisensesense) verhindert eine normale Handhabung der mRNA, was zu einer teilweisen oder vollständigen Beseitigung der Wildtyp-Genwirkung führt. Diese Technik wurde verwendet, um die TK-Synthese in Gewebekultur zu inhibieren, und um Phänotypen der Krüppel-Mutation in Drosophila und die Shiverer-Mutation in Mäusen herzustellen [Izant et al., Cell, 36: 1007–1015 (1984), Green et al., Annu. Rev. Biochem., 55: 569–597 (1986), Katsuki, et al., Science, 241: 593–595 (1988)]. Ein wichtiger Vorteil dieses Ansatzes ist, dass nur ein kleiner Abschnitt des Gens für eine wirksame Inhibition der Expression der gesamten verwandten mRNA exprimiert zu werden braucht. Das Antisense-Transgen wird unter die Kontrolle seines eigenen Promotors oder eines anderen Promotors gebracht, welcher in dem richtigen Zelltyp exprimiert wird, und wird strangaufwärts von der SV40-polyA-Stelle platziert. Dieses Transgen kann verwendet werden, um transgene Mäuse zu erzeugen. Transgene Mäuse können ebenfalls gepaarte Ovartransplantate sein, um zu testen, ob ob-Heterozygote sensibler auf die Wirkungen des Antisense-Konstrukts sind.alternative can OB-R genes by checking their phenotypic Effects are tested when used in antisense orientation Wild-type animals. In this approach, the expression of the Wild-type alleles suppressed, what a mutated phenotype leads. The RNA-RNA double helix formation (antisense) prevents one normal handling of mRNA, resulting in partial or complete elimination the wild type gene effect leads. This technique has been used to increase TK synthesis in tissue culture inhibit, and phenotypes the cripple mutation in Drosophila and the Shiverer mutation in mice [Izant et al., Cell, 36: 1007-1015 (1984), Green et al., Annu. Rev. Biochem., 55: 569-597 (1986), Katsuki, et al., Science, 241: 593-595 (1988)]. An important advantage of this approach is that only one small section of the gene for an effective inhibition of the expression of the entire related mRNA needs to be expressed. The antisense transgene gets under the control of its own promoter or other promoter which is expressed in the correct cell type, and gets upstream placed by the SV40 polyA site. This transgene can be used become transgenic mice to create. Transgenic mice can also be paired ovarian transplants to test whether ob-heterozygotes more sensitive to the effects of the antisense construct.

Langfristig ist das OB-R-Genprodukt (das OB-R-Polypeptid oder -Protein) zum Identifizieren kleiner Molekülagonisten und -antagonisten geeignet, welche seine Aktivität beeinflussen.long-term is the OB-R gene product (the OB-R polypeptide or protein) Identify small molecule agonists and antagonists which affect its activity.

Verschiedene Begriffe, welche innerhalb dieser Spezifikation verwendet werden, sollen die hier, zum Beispiel unten, dargelegten Definitionen aufweisen.Various terms used within this specification are intended to be hereby incorporated by reference Example below, have set out definitions.

Der Begriff "Körpergewichtsmodulator", "Modulator", "Modulatoren" und irgendwelche Varianten, welche nicht spezifisch ausgeführt sind, können hier austauschbar verwendet werden und betreffen, wie sie innerhalb der vorliegenden Anmeldung und den Ansprüchen verwendet werden, in einem Fall sowohl Nukleotide, als auch proteinartiges Material, wobei letzteres sowohl einzelne als auch mehrere Proteine einschließt. Spezifischer erstrecken sich die zuvor erwähnten Begriffe auf die Nukleotide und die DNA, welche die hier beschriebenen Sequenzen aufweist und in den SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 und 9 dargestellt sind. Ebenso sind die Proteine, welche die hier beschriebenen Aminosäure-Sequenzdaten aufweisen und in den SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 und 10 dargestellt werden, ebenso eingeschlos sen, wie es das Aktivitätsprofil ist, welches bezüglich aller Materialien, sowohl hier, als auch in den Ansprüchen, dargestellt ist.Of the Term "body weight modulator", "modulator", "modulators" and any Variants which are not specifically designed can be used interchangeably here be and apply as they are within the present application and the claims used, in one case both nucleotides, and proteinaceous Material, the latter including both single and multiple proteins includes. More specifically, the aforementioned terms extend to the nucleotides and the DNA having the sequences described herein, and in SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7 and 9 are shown. Likewise are the proteins containing the amino acid sequence data described herein and represented by SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8 and 10, also included, as is the Activity Profile, which is related to all materials, both here and in the claims is shown.

Eine spezifische Bindung an Leptin bedeutet, dass Leptin ein Ligand für OB-R ist, da dieser Begriff verwendet wird, um die Liganden-Rezeptor-Bindung zu beschreiben. Im Allgemeinen wird eine solche Bindung eine Affinität aufweisen, die durch eine Assoziationskonstante von größer als 1 × 107M–1, vorzugsweise größer als 1 × 108M–1 und weiter bevorzugt größer als 1 × 109M–1 dargestellt ist. Die genaue Assoziationskonstante kann jedoch variieren.Specific binding to leptin means that leptin is a ligand for OB-R, as this term is used to describe ligand-receptor binding. In general, such a bond will have an affinity represented by an association constant greater than 1 x 10 7 M -1 , preferably greater than 1 x 10 8 M -1, and more preferably greater than 1 x 10 9 M -1 . The exact association constant, however, may vary.

Eine Homologie mit gp130 betrifft die Konservierung von Resten, insbesondere von Cysteinresten, Motiven und anderen wichtigen Resten. Der Begriff "gp130" wird hier verwendet, um im Allgemeinen die Klasse 1-Cytokinrezeptor-Familie zu bezeichnen, insbesondere den Interleukin-6(IL-6)-Rezeptor, den Granulozytenkolonie-stimulierenden Faktor(G-CSF)-Rezeptor, den ziliären neurotrophen Faktor(CNTF)-Rezeptor und den Leukämie inhibierenden Faktor(LIF)-Rezeptor.A Homology with gp130 relates to the preservation of residues, in particular of cysteine residues, motifs and other important residues. The term "gp130" is used here to generally refer to the class 1 cytokine receptor family, in particular the interleukin-6 (IL-6) receptor, the granulocyte colony-stimulating Factor (G-CSF) receptor, the ciliary neurotrophic factor (CNTF) receptor and the leukemia inhibitory factor (LIF) receptor.

Zusätzlich werden Nukleotide, welche eine im Wesentlichen äquivalente oder veränderte Aktivität zeigen, ebenso eingeschlossen, einschließlich von im Wesentlichen ähnlichen Analoga und allelischen Variationen. Ebenso werden Proteine, welche eine im Wesentlichen äquivalente oder veränderte Aktivität zeigen, einschließlich von Proteinen, welche absichtlich modifiziert wurden, wie zum Beispiel durch stellengerichtete Mutagenese oder unbeabsichtigt durch Mutationen in Wirten, welche die Modulatoren herstellen, ebenso eingeschlossen.In addition will be Nucleotides which exhibit substantially equivalent or altered activity, also included, including essentially similar ones Analogues and allelic variations. Likewise, proteins are used a substantially equivalent one or changed activity show including of proteins that have been deliberately modified, such as by site-directed mutagenesis or unintentionally by mutations in hosts making the modulators also included.

Der Begriff "Allelvarianten" betrifft das entsprechende Gen in verschiedenen Individuen, das Punktmutationen aufweisen kann. Zum Beispiel stellen die verschiedenen ob-Mutationen Allelvarianten von OB-R dar.Of the Term "allelic variants" refers to the corresponding Gene in different individuals that may have point mutations. For example, the different ob mutations represent allelic variants from OB-R.

Der Begriff "homolog" oder "Homologa" in all seinen grammatikalischen Formen schließt spezifisch das entsprechende Gen oder Protein aus einer anderen Art ein. In einer spezifischen Ausführungsform ist ein Homolog des Mäuse-OB-R humaner OB-R. Der Begriff kann ebenfalls Gene oder Proteine einschließen, welche mutiert oder verändert sind, z. B. durch Substitution von Aminosäurerest-Varianten von einer Art in das Polypeptid einer anderen, um einem analogen Gen oder Protein zu entsprechen, als ob es von einer anderen Art ist. Wie es im Stand der Technik gut bekannt ist, können homologe Gene einfach durch Sequenzähnlichkeit, Hybridisierung mit Sonden, welche spezifisch für das Gen in einer anderen Art sind, Nachweis durch eine PCR-Analyse unter Verwendung von Primern für eine andere Art oder durch Kartieren auf eine syntenische Lage auf dem Chromosom identifiziert werden, um nur einige solcher Verfahren zu erwähnen. Eine Proteinhomologie kann durch Antikörper-Kreuzreaktivität, ein ähnliches Protease-Spaltprofil, vergleichbare/s Molekulargewicht und isoelektrische Punkte und eine ähnliche Sekundär- oder Tertiärstruktur nachgewiesen werden, um einige der gut bekannten Tests für homologe Proteine zu erwähnen.Of the Term "homologue" or "homologue" in all its grammatical Shapes close specifically, the corresponding gene or protein from another Kind of one. In a specific embodiment, a homolog is of the mouse OB-R human OB-R. The term may also include genes or proteins which mutated or changed are, for. By substitution of amino acid residue variants of one Type into the polypeptide of another, to an analogous gene or Protein to suit, as if it is of a different kind. As As is well known in the art, homologous genes can be simple by sequence similarity, hybridization with probes specific for the gene is in a different species, detection by a PCR analysis using primers for another way or by mapping to a syntenic location The chromosome can be identified to only a few such procedures to mention. A protein homology may be due to antibody cross-reactivity, a similar Protease gap profile, comparable molecular weight and isoelectric Points and a similar secondary or tertiary structure be proved to be some of the well-known tests for homologues To mention proteins.

Der Begriff "im Wesentlichen ähnlich", so wie hier in Bezug auf Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen verwendet, bedeutet mindestens 50% Sequenzähnlichkeit, vorzugsweise mindestens 60% Sequenzähnlichkeit, weiter bevorzugt mindestens 70% Sequenzähnlichkeit, noch weiter bevorzugt mindestens 80% Sequenzähnlichkeit und am meisten bevorzugt mindestens 90% Sequenzähnlichkeit.Of the Term "substantially similar", as here in Reference to nucleic acid or amino acid sequences used, means at least 50% sequence similarity, preferably at least 60% sequence similarity, more preferably at least 70% sequence similarity, even more preferred at least 80% sequence similarity and most preferably at least 90% sequence similarity.

Der Begriff "Gen", so wie hier verwendet, betrifft eine Nukleinsäure, wie DNA, welche bei Expression für ein Protein kodiert. Wenn es nicht anders angegeben ist, kann Gen mRNA, cDNA oder genomische DNA einschließen.Of the Term "gene" as used herein relates to a nucleic acid, like DNA, which when expressed for encodes a protein. Unless otherwise stated, Gen mRNA, cDNA or genomic DNA.

Eine Zusammensetzung, welche "A" umfasst (wobei "A" ein einzelnes Protein, DNA-Molekül, ein Vektor, eine rekombinante Wirtszelle, usw. ist), ist im Wesentlichen frei von "B" (wobei "B" ein oder mehrere kontaminierende Proteine, DNA-Moleküle, Vektoren, usw. umfasst, aber racemische Formen von A ausschließt), wenn mindestens 75 Gew.-% der Proteine, DNA, Vektoren (abhängig von der Kategorie der Spezies, zu welcher A und B gehören) in der Zusammensetzung "A" sind. Vorzugsweise umfasst "A" mindestens ungefähr 90 Gew.-% der A + B- Spezies in der Zusammensetzung, am meisten bevorzugt mindestens ungefähr 99 Gew.-%. Es ist ebenfalls bevorzugt, dass eine Zusammensetzung, welche im Wesentlichen frei von einer Kontamination ist, nur eine einzelne Molekulargewichtsspezies enthält, welche die Aktivität oder die Eigenschaft der Spezies von Interesse aufweist.A composition comprising "A" (where "A" is a single protein, DNA molecule, vector, recombinant host cell, etc.) is substantially free of "B" (where "B" is one or more contaminating Proteins, DNA molecules, vectors, etc., but excludes racemic forms of A) when at least 75% by weight of the proteins, DNA, vectors (depending on the category of species, to wel cher A and B) are in the composition "A". Preferably, "A" comprises at least about 90% by weight of the A + B species in the composition, most preferably at least about 99% by weight. It is also preferred that a composition that is substantially free of contamination contains only a single molecular weight species that has the activity or property of the species of interest.

Ei "BAC" ist ein künstliches bakterielles Chromosom (für engl.: bacterial artificial chromsome), "STS" betrifft eine sequenzmarkierte Stelle (für engl.: sequence tagged site), ein "YAC" ist ein künstliches Hefechromosom (für engl.: yeast artificial chromsome). Andere Begriffe haben die Standardbedeutungen welche gewöhnlich im Stand der Technik vorgesehen sind.Egg "BAC" is an artificial one bacterial chromosome (for English: bacterial artificial chromsome), "STS" concerns a sequence labeled site (for Sequence tagged site), a "YAC" is an artificial one Yeast chromosome (for English: yeast artificial chromsome). Other terms have the standard meanings which usually are provided in the prior art.

Die OB-R-PolypeptideThe OB-R polypeptides

Die Begriffe "Protein", was das natürlich vorkommende Polypeptid betrifft, und "Polypeptid" werden hier bezüglich des OB-R-Genprodukts und Varianten davon austauschbar verwendet. Insbesondere betrifft OB-R irgendwelche der Spleißformen des OB-R(DB)-Genprodukts, wie das Produkt mit zwei JAK-Bindungsboxen in der cytoplasmatischen Domäne, das Produkt mit nur einer JAK-Bindungsbox in der cytoplasmatischen Domäne, das Produkt ohne Boxen und das sezernierte (lösliche) Produkt, ist aber nicht darauf beschränkt. Der Begriff OB-R betrifft ebenfalls verschiedene Spleißformen mit divergenten N-terminalen Aminosäuresequenzen.The Terms "protein", which is the naturally occurring Polypeptide, and "polypeptide" are referred to herein with respect to OB-R gene product and variants thereof used interchangeably. Especially OB-R refers to any of the splice forms of the OB-R (DB) gene product, like the product with two JAK binding boxes in the cytoplasmic Domain, the product with only one JAK binding box in the cytoplasmic Domain, the product without boxes and the secreted (soluble) product, but is not limited to this. The term OB-R also refers to various splice forms with divergent N-terminal amino acid sequences.

Der Begriff OB-R umfasst spezifisch verschiedene Spleißformen des Polypeptids, einschließlich der Folgenden, aber nicht darauf beschränkt: Spleißform Eigenschaften Spezifische Ausführungsform OB-Ra Transmembranprotein mit einer "Box 1", aber ohne "Box 2", von welchem erwartet wird, dass es Leptin bindet, aber nicht direkt die Signaltransduktion über JAKs vermittelt. Aufgebaut aus einer extrazellulären Domäne und einer verkürzten cytoplasmatischen Domäne. Der N-Terminus divergiert von der veröffentlichten OB-R-Sequenz strangaufwärts von Cys88. SEQ ID NR: 2 OB-Rb Transmembranprotein, von welchen erwartet wird, dass es einen Leptin-Signalweg im Hypothalamus und anderen Zellen vermittelt, es enthält eine größere cytoplasmatische Domäne, welche sowohl eine "Box 1"-, als auch eine "Box 2"-Stelle enthält. Der N-terminale Abschnitt scheint verkürzt zu sein und divergiert von der veröffentlichten OB-R-Sequenz strangaufwärts von Pro664 SEQ ID NR: 4 OB-Rc Entspricht OB-Rb mit einem Tripeptidrest C-terminal zu Lys889, eher als der längeren Sequenz, keine "Box 2"-Stelle. SEQ ID NR: 6 OB-Rd Entspricht dem veröffentlichten OB-R mit einer unterschiedlichen elf Aminosäuren langen Sequenz C-terminal von Lys889. SEQ ID NR: 8 OB-Re Löslicher/sezernierter Rezeptor mit einer Leptin-Bindungsdomäne. Ihm fehlt eine Transmembran- oder cytoplasmatische Domäne, aber er umfasst eine große extrazelluläre Domäne. Entspricht dem veröffentlichten OB-R bis His796, wo er divergiert. SEQ ID NR: 10 The term OB-R specifically includes various splice forms of the polypeptide, including, but not limited to, the following: splice properties Specific embodiment OB-Ra Transmembrane protein with a "Box 1" but without "Box 2", which is expected to bind leptin but does not directly mediate signal transduction via JAKs. Built from an extracellular domain and a truncated cytoplasmic domain. The N-terminus diverges from the published OB-R sequence upstream of Cys 88 . SEQ ID NO: 2 OB-Rb Transmembrane protein, which is expected to mediate a leptin signaling pathway in the hypothalamus and other cells, contains a larger cytoplasmic domain containing both a "Box 1" and a "Box 2" site. The N-terminal portion appears to be truncated and diverges from the published OB-R sequence upstream of Pro 664 SEQ ID NO: 4 OB-Rc Corresponds to OB-Rb with a tripeptide residue C-terminal to Lys 889 , rather than the longer sequence, no "box 2" site. SEQ ID NO: 6 OB-Rd Corresponds to the published OB-R with a different eleven amino acid sequence C-terminal from Lys 889 . SEQ ID NO: 8 OB-Re Soluble / secreted receptor with a leptin-binding domain. It lacks a transmembrane or cytoplasmic domain, but it does include a large extracellular domain. Corresponds to the published OB-R to His 796 , where it diverges. SEQ ID NO: 10

Der Begriff OB-R umfasst spezifisch Spleißvarianten, welche verschiedene Elemente aus den oben erwähnten Varianten einschließen, z. B., wie oben beschrieben.Of the Term OB-R specifically includes splice variants which are different Elements from the above mentioned Include variants, z. B., as described above.

Insbesondere ist die vorliegende Offenbarung auf OB-R gerichtet, bei dem die N-terminale Signalsequenz gespalten ist. In einer Ausführungsform sind die Aminosäurereste 1–22 abgespalten. In einer anderen Ausführungsform sind die Aminosäurereste 1–27 abgespalten.Especially For example, the present disclosure is directed to OB-R, in which the N-terminal signal sequence is split. In one embodiment are the amino acid residues Split off 1-22. In another embodiment are the amino acid residues Split off 1-27.

Wie oben erwähnt schließen in spezifischen Ausführungsformen die Polypeptide, wie sie hier offenbart werden, jene ein, welche die Aminosäuresequenzen aufweisen, die hier dargelegt sind, z. B. die SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 und 10. Der Begriff schließt weiterhin Polypeptide ein, welche mit konservativen Aminosäuresubstitutionen modifiziert sind, sowie biologisch aktive Fragmente, Analoga und Derivate davon. In noch einer anderen Ausführungsform schließt der Begriff Polypeptide ein, in welchem ein oder mehrere Cystein-Rest/e oder Cystein-Paar/e mit Serin oder einem ähnlichen polaren oder neutralen Aminosäurerest, wie, aber nicht nötigerweise beschränkt auf, Threonin, Methionin oder Alanin ersetzt ist/sind.As mentioned above shut down in specific embodiments the polypeptides as disclosed herein include those which the amino acid sequences which are set forth herein, e.g. Example, the SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 and 10. The term concludes Furthermore, polypeptides containing conservative amino acid substitutions modified as well as biologically active fragments, analogs and Derivatives thereof. In yet another embodiment, the term excludes Polypeptides in which one or more cysteine residues / s or cysteine pairs / e with serine or a similar one polar or neutral amino acid residue, like, but not necessarily limited on, threonine, methionine or alanine is / are replaced.

Der Begriff "biologisch aktiv" wird hier verwendet, um eine spezifische Wirkung des Polypeptids zu betreffen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die spezifische Bindung, z. B. an Leptin, einen Anti-OB-R-Antikörper oder ein anderes Erkennungsmolekül, die Aktivierung von Signaltransduktionswegen auf einer molekularen Ebene und/oder die Induktion (oder Inhibition durch Antagonisten) von physiologischen Wirkungen, welche durch das native Leptin in vivo vermittelt werden. OB-R-Polypeptide, einschließlich von Fragmenten, Analoga und Derivaten können synthetisch hergestellt werden, z. B. unter Verwendung der gut bekannten Techniken der Festphasen- oder Lösungsphasen-Peptidsynthese. Vorzugsweise werden synthetische Festphasentechniken eingesetzt. Alternativ können OB-R-Polypeptide, wie hier offenbart, unter Verwendung gut bekannter gentechnischer Techniken, wie infra beschrieben, hergestellt werden. In noch einer anderen Ausführungsform kann die lösliche Form des OB-R-Polypeptids gereinigt werden, z. B. durch eine Immunaffinitätsreinigung, aus einer biologischen Flüssigkeit, wie, aber nicht beschränkt auf, Plasma, Serum oder Urin, vorzugsweise humanes Plasma, Serum oder Urin und weiter bevorzugt von einem Individuum, welches das Polypeptid überexprimiert.Of the Term "biological Active "will be here used to affect a specific effect of the polypeptide, including, but not limited on the specific binding, z. To leptin, an anti-OB-R antibody or another recognition molecule, the activation of signal transduction pathways on a molecular Level and / or induction (or inhibition by antagonists) of physiological effects caused by the native leptin in be mediated in vivo. OB-R polypeptides, including Fragments, analogs and derivatives can be produced synthetically be, for. Using the well-known techniques of solid phase or solution phase peptide synthesis. Preferably, synthetic solid phase techniques are used. Alternatively you can OB-R polypeptides, as disclosed herein, using well-known genetic engineering Techniques as described infra. In one more another embodiment can the soluble Be purified form of the OB-R polypeptide, z. By immunoaffinity purification, from a biological fluid, like, but not limited on, plasma, serum or urine, preferably human plasma, serum or urine and more preferably from an individual carrying the Polypeptide overexpressed.

Die Struktur des OB-R-Polypeptids, vorzugsweise des humanen OB-R-Polypeptids kann durch verschiedene Verfahren, welche im Stand der Technik bekannt sind, analysiert werden. Die Proteinsequenz kann durch eine Hydrophilizitätsanalyse charakterisiert werden (z. B. Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3824 (1981)]. Ein Hydrophilizitätsprofil kann verwendet werden, um die hydrophoben und hydrophilen Regionen des OB-R-Polypeptids zu identifizieren, welche Regionen, die im Inneren des gefalteten Polypeptids verborgen sind, die Transmembrandomäne und Regionen, welche auf der Außenseite des Polypeptids zugänglich sind, anzeigen können. Zusätzlich kann ebenfalls eine Sekundärstrukturanalyse (z. B. Chou et al., Biochem., 13: 222 (1974)] durchgeführt werden, um Regionen des OB-R-Polypeptids zu identifizieren, welche spezifische Sekundärstrukturen annehmen. Eine Manipulation der vorhergesagten oder bestimmten Struktur, einschließlich der Sekundärstrukturvorhersage, kann unter Verwendung von Computer-Softwareprogrammen erreicht werden, welche im Stand der Technik verfügbar sind.The Structure of the OB-R polypeptide, preferably the human OB-R polypeptide by various methods known in the art are to be analyzed. The protein sequence can be analyzed by a hydrophilicity analysis (for example, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3824 (1981)]. A hydrophilicity profile can be used around the hydrophobic and hydrophilic regions of the OB-R polypeptide to identify which regions are inside the folded one Polypeptide, the transmembrane domain and regions which are on the outside the polypeptide are accessible, can show. additionally can also do a secondary structure analysis (e.g., Chou et al., Biochem., 13: 222 (1974)], to identify regions of the OB-R polypeptide which have specific secondary structures accept. A manipulation of the predicted or particular structure, including the secondary structure prediction, can be achieved using computer software programs which is available in the prior art are.

Durch Bereitstellen einer häufigen Quelle des rekombinanten OB-R-Polypeptids ermöglicht die vorliegende Offenbarung eine quantitative strukturelle Bestimmung des Polypeptids. Insbesondere wird ausreichend Material für eine kernmagnetische Resonanz(NMR)-, Infrarot(IR)-, Raman- und Ultraviolett(UV)-, insbesondere eine zirkulare Dichroismus(CD)-, spektroskopische Analyse bereitgestellt. Insbesondere eine NMR stellt eine sehr leistungsstarke Strukturanalyse von Molekülen in Lösung bereit, was ihrer nativen Umgebung stärker näher kommt [Marion et al., Biochim. Biophys. Res. Comm. 113: 967–974 (1983), Bar et al., J. Magn. Reson., 65: 355–360 (1985), Kimura et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 77: 1681–1685 (1980)]. Andere Verfahren der Strukturanalyse können ebenfalls eingesetzt werden. Diese schließen Röntgenkristallographie ein, sind aber nicht darauf beschränkt [Engstom, Biochem. Exp. Biol., 11: 7–13 (1974)]. In einem bevorzugten Aspekt wird entweder eine lösliche Form oder eine membranbindende Form von OB-R mit Leptin kokristallisiert, um strukturelle Information über beide Moleküle bereitzustellen. In einem weiter bevorzugten Ausführungsform wird OB-R oder lösliches OB-R, welchem eine oder mehrere Cystein-Vernetzung/en fehlt/en, verwendet, um Kristalle oder Kokristalle mit Leptin zu bilden.By Provide a frequent Source of the recombinant OB-R polypeptide enables the present disclosure a quantitative structural determination of the polypeptide. Especially will be enough material for nuclear magnetic resonance (NMR), infrared (IR), Raman and ultraviolet (UV), in particular a circular dichroism (CD), spectroscopic analysis provided. In particular, an NMR represents a very powerful Structure analysis of molecules in solution which is closer to their native environment [Marion et al., Biochim. Biophys. Res. Comm. 113: 967-974 (1983), Bar et al., J. Magn. Reson., 65: 355-360 (1985), Kimura et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 77: 1681-1685 (1980)]. Other procedures the structural analysis can also be used. These include x-ray crystallography but not limited to that [Engstom, Biochem. Exp. Biol., 11: 7-13 (1974)]. In a preferred Aspect becomes either a soluble one Form or a membrane-binding form of OB-R cocrystallized with leptin to structural information about both molecules provide. In a further preferred embodiment OB-R or soluble OB-R lacking one or more cysteine crosslinks used to form crystals or cocrystals with leptin.

In noch einer weiteren Ausführungsform kann ein Analogon des OB-R-Polypeptids getestet werden, um zu bestimmen, ob es mit einem Antikörper, welcher spezifisch für das native OB-R-Polypeptid oder spezifisch für Fragmente davon ist, kreuzreagiert. Der Grad der Kreuzreaktivität stellt Information über strukturelle Homologie oder Ähnlichkeit der Proteine bereit, oder über die Zugänglichkeit von Regionen, welche Abschnitten des Polypeptids entsprechen, die verwendet wurden, um Fragment spezifische Antikörper zu erzeugen.In yet another embodiment For example, an OB-R polypeptide analog can be tested to determine whether it is with an antibody, which specific for the native OB-R polypeptide or specific for fragments thereof is cross-reacted. The degree of cross-reactivity provides information structural homology or similarity the proteins ready, or over the accessibility of regions corresponding to portions of the polypeptide, the were used to generate fragment-specific antibodies.

Fragmente des OB-R-PolypeptidsFragments of the OB-R polypeptide

In einer besonderen Ausführungsform umfasst die vorliegende Offenbarung, dass natürlich vorkommende Fragmente oder verkürzte Formen des OB-R-Polypeptids wichtig sein können. Wie oben erwähnt wurde, wurde eine große Anzahl von Spleißformen von OB-R gefunden. Daher umfasst die vorliegende Offenbarung eine natürlich vorkommende lösliche Form des OB-R, sowie integrale Membranformen, welche 0, 1 oder 2 JAK-Box-Konsensusstellen aufweisen. Zusätzlich zu den natürlich vorkommenden Spleißisoformen des Polypeptids sieht die vorliegende Offenbarung weiterhin rekombinant modifizierte Isoformen vor, z. B. durch Deletion von einer oder mehreren der cytoplasmatischen Domäne, der cytoplasmatischen Konsensusdomäne von der Transmembrandomäne bis zu Lysin 889, der Box 1 oder Box 2 oder von beiden Regionen, der cytoplasmatischen Domäne C-terminal von Lysin 889, der Transmembrandomäne, der Liganden-Bindungsdomäne, der extracytoplasmatischen Domäne oder Abschnitten davon.In a particular embodiment, the present disclosure encompasses that naturally occurring fragments or truncated forms of the OB-R polypeptide may be important. As mentioned above, a large number of splice forms of OB-R were found. Therefore, the present disclosure includes a naturally occurring soluble form of OB-R, as well as integral membrane forms which are 0, 1 or Have 2 JAK box consensus locations. In addition to the naturally occurring splice forms of the polypeptide, the present disclosure further contemplates recombinantly modified isoforms, e.g. By deletion of one or more of the cytoplasmic domain, the cytoplasmic consensus domain from the transmembrane domain to lysine 889, Box 1 or Box 2 or from both regions, the cytoplasmic domain C-terminal of lysine 889, the transmembrane domain, the ligand Binding domain, the extracytoplasmic domain or portions thereof.

Die vorliegende Offenbarung umfasst spezifisch lösliche verkürzte Formen von OB-R, welchen eine Transmembrandomäne und eine cytoplasmatische Domäne fehlen. In einer spezifischen Ausführungsform ist das OB-R-Fragment OB-Re. In noch weiteren Ausführungsformen entspricht ein OB-R-Fragment, wie hier offenbart, dem N-terminalen Abschnitt von OB-Re, welcher Leptin bindet, z. B. OB-R von ungefähr Leu123 bis ungefähr Val331, dem C-terminalen Abschnitt von OB-Re, welcher Leptin bindet, z. B. OB-R von ungefähr Tyr420 bis ungefähr Pro641, einem Protein, welches den N- und C-terminalen Abschnitt von OB-Re aufweist, welcher Leptin mit sehr hoher Affinität bindet, z. B. OB-R von ungefähr Ser118 oder Leu123 bis ungefähr Pro641.The Present disclosure includes specifically soluble truncated forms of OB-R which a transmembrane domain and a cytoplasmic domain absence. In a specific embodiment, the OB-R fragment is OB-Re. In still further embodiments corresponds to an OB-R fragment as disclosed herein, the N-terminal Section of OB-Re which binds leptin, e.g. B. OB-R of approximately Leu123 until about Val331, the C-terminal portion of OB-Re which binds leptin, e.g. B. OB-R from about Tyr420 until about Pro641, a protein that contains the N- and C-terminal section OB-Re, which binds leptin with very high affinity, z. B. OB-R of about Ser118 or Leu123 to about Pro641.

OB-R-PolypeptidchimärenOB-R Polypeptidchimären

Eine oder mehrere der Spleißformen der cytoplasmatischen Domäne können in einem chimären Konstrukt mit einer anderen Liganden bindenden Domäne verwendet werden, um eine Leptinbindung künstlich zu signalisieren [z. B. Capon et al., U.S. Patent Nr. 5,359,064 , erteilt am 25. Oktober 1994, Sanchez et al., J. Exp. Med., 178, 1049 (1993), Burkhardt et al., Mol. Cell. Biol., 14: 1095, Internationale Patentpublikationen WO 96/23814 , WO 96/23881 und WO 96/24671 , Kotenko et al., J. Biol. Chem. 271: 17174 (1996)]. In einer anderen Ausführungsform kann die extracytoplasmatische (Leptin bindende) Domäne mit einer unterschiedlichen cytoplasmatischen Signaltransduktionsdomäne verbunden werden oder alternativ mit einer Glykosyl-Phospatidylinositol-Linkerdomäne, um eine Aktivierung der Zellen über gp130 bereitzustellen.One or more of the cytoplasmic domain splice forms can be used in a chimeric construct with a different ligand binding domain to artificially signal a leptin linkage [e.g. Capon et al., U.S. Patent No. 5,359,064 , issued October 25, 1994, Sanchez et al., J. Exp. Med., 178, 1049 (1993), Burkhardt et al., Mol. Cell. Biol., 14: 1095, International Patent Publications WO 96/23814 . WO 96/23881 and WO 96/24671 Kotenko et al., J. Biol. Chem. 271: 17174 (1996)]. In another embodiment, the extracytoplasmic (leptin-binding) domain may be linked to a different cytoplasmic signal transduction domain or alternatively to a glycosyl-phosphatidylinositol linker domain to provide activation of the cells via gp130.

Analoge des OB-R-PolypeptidsAnalogs of the OB-R polypeptide

Die vorliegende Offenbarung umfasst spezifisch eine Präparation von Analoge des OB-R-Polypeptids, welche dadurch gekennzeichnet sind, dass sie zu einer biologischen Aktivität des OB-R-Polypeptids in der Lage sind, z. B. zum Binden an Leptin oder an einen Anti-OB-R-Antikörper. In einer Ausführungsform fördert das Analogon die OB-R-Aktivität. Vorzugsweise ist ein OB-R-Agonist wirksamer als das native Protein. Zum Beispiel kann ein OB-R-Agonistenanalogon mit größerer Affinität an Leptin binden, was das Signal verstärkt. Ein solches Analogon kann insbesondere für eine Gentherapie gewünscht sein, wo eine erhöhte Signaltransduktionswirksamkeit irgendeinen Mangel in der Menge der Rezeptorexpression kompensieren kann. In einer anderen Ausführungsform wirkt das Analogon der OB-R- Aktivität entgegen. Zum Beispiel kann ein OB-R-Analogon, welches an Leptin bindet und die Leptinbindung an einen signaltransduktionskompetenten OB-R inhibiert, kompetitiv die Bindung von nativem OB an den Rezeptor inhibieren, was die Leptinaktivität in vivo vermindert. Ein solches OB-R-Antagonistenanalogon ist vorzugsweise eine lösliche Form des OB-R.The The present disclosure specifically includes a preparation analogues of the OB-R polypeptide characterized are that they are capable of biological activity of the OB-R polypeptide are, for. For binding to leptin or to an anti-OB-R antibody. In an embodiment promotes that Analogously, the OB-R activity. Preferably, an OB-R agonist is more potent than the native protein. For example, an OB-R agonist analogue with greater affinity for leptin bind, which amplifies the signal. One such analog may be particularly desirable for gene therapy where an increased Signal transduction efficacy any deficiency in the amount of Can compensate for receptor expression. In another embodiment the analogue counteracts the OB-R activity. For example, an OB-R analog which binds to leptin and inhibits leptin binding to a signal transduction-competent OB-R, competitively inhibit the binding of native OB to the receptor, what the leptin activity diminished in vivo. Such an OB-R antagonist analog is preferred a soluble one Shape of the OB-R.

In einer Ausführungsform ist ein Analogon des OB-R-Polypeptids das OB-R-Polypeptid, welches durch Substitution von Aminosäuren an Positionen des Polypeptids verändert ist, welche nicht essenziell für die Struktur oder Funktion sind. Da erwartet wird, dass das humane OB-R-Polypeptid in der Maus biologisch aktiv ist, wird zum Beispiel eine Substitution von divergenten Aminosäureresten in der humanen Sequenz, verglichen mit der Mäuse-Aminosäuresequenz wahrscheinlich geeignete Analoga des OB-R-Polypeptids ergeben. Zum Beispiel könnten die folgenden Reste im humanen OB-R [die Nummerierung der humanen OB-R-Aminosäuren verwendet die Nummerierungskonvention, welche in Tartaglia et al., Cell, 83: 1263 (1995) angewendet wird] mit einem divergenten Mäuserest substituiert werden, welcher an dieser Position gefunden wird, oder mit einer nicht konservativen Aminosäuresubstitution, wie eine oder mehrere von: Phe für Ser36, Asp für Tyr44, Ser für Leu49, Pro für Ser54, Leu für Ser60, Ala für His63, Ala für Thr66, Ala für Pro70, Ile für Thr77, Tyr für His78, Pro für Ser80, Gly für Arg92, Gly für Asp96, Thr für Ala103 oder Ile106, Ser für Leu118, Gly für Asp124, Thr für Lys138, Pro für Ser146, Asp für Val164, Leu für Gln177, Asp für Gly179, Gly für Glu192, Deletion für Cys193, His für Leu197, Ser für Ile221, Leu für Asn233, Leu für Ser273, Deletion für Thr278, Ala für Asp285, Glu für Lys286, Ser für Gly310, Arg für Met370, Ile für Ser379, Ser für Phe394 Ala für Glu417, Gly für Glu459, Ser für Ile476, Thr für Ile482, Thr für Ile551, His für Tyr586, Lys für Ile648, Ala für Ser686, His für Cys687, Thr für Ile759, Ile für Asn776, Asp für Gly781, Gly für Glu782, Gly für Ser827, Ala für Asp832, Arg für Pro892, Thr für Glu893, Asp für Thr894 oder Leu für Glu896.In one embodiment, an analog of the OB-R polypeptide is the OB-R polypeptide that is altered by substitution of amino acids at positions of the polypeptide that are not essential to the structure or function. For example, since the human OB-R polypeptide is expected to be biologically active in the mouse, substitution of divergent amino acid residues in the human sequence, as compared to the mouse amino acid sequence, will likely give appropriate analogues of the OB-R polypeptide. For example, the following residues in human OB-R [numbering of human OB-R amino acids using the numbering convention used in Tartaglia et al., Cell, 83: 1263 (1995)] could be substituted with a divergent mouse test, which is found at this position, or with a non-conservative amino acid substitution, such as one or more of: Phe for Ser 36 , Asp for Tyr 44 , Ser for Leu 49 , Pro for Ser 54 , Leu for Ser 60 , Ala for His 63 , Ala for Thr 66 , Ala for Pro 70 , Ile for Thr 77 , Tyr for His 78 , Pro for Ser 80 , Gly for Arg 92 , Gly for Asp 96 , Thr for Ala 103 or Ile 106 , Ser for Leu 118 , Gly for Asp 124 , Thr for Lys 138 , Pro for Ser 146 , Asp for Val 164 , Leu for Gln 177 , Asp for Gly 179 , Gly for Glu 192 , deletion for Cys 193 , His for Leu 197 , Ser for Ile 221 , Leu for Asn 233, Leu for Ser 273, deletion of Thr 278, Ala for Asp 285, Glu for Lys 286, Ser for Gly 310 Arg f r Met 370, Ile for Ser 379, Ser for Phe 394 Ala for Glu 417, Gly for Glu 459, Ser for Ile 476, Thr for Ile 482, Thr for Ile 551, His Tyr 586, Lys to Ile 648, Ala for Ser 686 , His for Cys 687 , Thr for Ile 759 , Ile for Asn 776 , Asp for Gly 781 , Gly for Glu 782 , Gly for Ser 827 , Ala for Asp 832 , Arg for Pro 892 , Thr for Glu 893 , Asp for Thr 894 or Leu for Glu 896 .

Ebenfalls durch die vorliegende Offenbarung eingeschlossen sind Analoga, welche konservative Aminosäuresubstitutionen umfassen. Zum Beispiel können eine oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz durch eine andere Amino säure mit einer ähnlichen Polarität, welche als ein funktionelles Äquivalent wirkt, substituiert werden, was zu einer stillen Veränderung führt. Substituenten für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz können aus anderen Mitgliedern der Klasse ausgewählt werden, zu welcher die Aminosäure gehört. Zum Beispiel schließen die nicht polaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin ein. Die polaren neutralen Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren schließen Asparaginsäure und Glutaminsäure ein. In einigen Fällen kann eine polare Aminosäure mit einer anderen substituiert werden, um die lokale Hydrophilizität zu erhalten, wahrscheinlicher wird eine Substitution benötigt, welche die Ladung erhält oder wenigstens nicht die entgegengesetzte Ladung einführt. Von solchen Veränderungen wird nicht erwartet, dass sie das sichtbare Molekulargewicht, wie durch eine Polyacrylamid-Gelelektrophose bestimmt, oder den isoelektrischen Punkt beeinflussen.Also included within the present disclosure are analogs comprising conservative amino acid substitutions. For example, one or more amino acid residues within the Se quency is substituted by another amino acid of similar polarity, which acts as a functional equivalent, resulting in a silent change. Substituents for an amino acid within the sequence can be selected from other members of the class to which the amino acid belongs. For example, the non-polar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan and methionine. The polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine. The positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine and histidine. The negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid. In some cases one polar amino acid may be substituted with another to preserve local hydrophilicity, more likely substitution will be needed which will receive the charge or at least not introduce the opposite charge. Such changes are not expected to affect the apparent molecular weight as determined by polyacrylamide gel electrophoresis or the isoelectric point.

In noch einer anderen Ausführungsform können Aminosäurereste mit Resten substituiert werden, um Analoga des OB-R-Polypeptids zu bilden, welche eine verstärkte Neigung zum Bilden von Sekundärstrukturen zeigen, oder welche stabilere Sekundärstrukturen bilden. Zum Beispiel würde eine α-Helix-Struktur bevorzugt werden, wenn Glu, Ala, Leu, His, Trp als Substituenten für Aminosäurereste eingeführt werden, die im nativen OB-Polypeptid gefunden werden. Vorzugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen eingesetzt, z. B. Substituieren von Asparaginsäure mit Glutaminsäure/n (Glu), Substituieren von Isoleucin/en mit Leucin, Substituieren von Glycin oder Valin oder irgendeiner divergenten Aminosäure (d. h. einer Aminosäure, welche nicht zwischen OB-R von verschiedenen Arten konserviert ist) mit Alanin (z. B. Serin an Position 273 des humanen OB-R-Polypeptids mit Alanin), Substituieren von Arginin oder Lysin mit Histidin und Substituieren von Tyrosin und/oder Phenylalanin mit Tryptophan. Erhöhen des Grads oder wichtiger der Stabilität der α-Helix-Struktur kann ein OB-R-Analogon mit größerer Aktivität, erhöhter Bindungsaffinität oder längerer Halbwertszeit ergeben.In yet another embodiment can amino acid residues be substituted with residues to analogues of the OB-R polypeptide to form, which one reinforced Show tendency to form secondary structures or which stable secondary structures form. For example, would an α-helical structure are preferred when Glu, Ala, Leu, His, Trp as substituents for amino acid residues introduced which are found in the native OB polypeptide. Preferably become conservative amino acid substitutions used, for. B. Substituting aspartic acid with glutamic acid (Glu), Substituting isoleucine / s with leucine, substituting glycine or valine or any divergent amino acid (i.e., an amino acid which is not between OB-R of different species is conserved) with alanine (e.g., serine at position 273 of the human OB-R polypeptide with alanine), substituting of arginine or lysine with histidine and substituting tyrosine and / or phenylalanine with tryptophan. Increasing the degree or more important stability the α-helix structure may be an OB-R analogue with greater activity, increased binding affinity or longer half-life result.

Ebenfalls eingeschlossen sind verkürzte OB-R-Polypeptid-Analoga, welche Struktur bildende, z. B. Helix bildende, Aminosäurereste umfassen, um die größere Neigung von Polypeptidfragmenten zu kompensieren, keine stabile Struktur auszubilden.Also included are shortened ones OB-R polypeptide analogs which are structure-forming, e.g. B. helix forming, amino acid residues include to the greater inclination of polypeptide fragments to compensate, no stable structure train.

In einer anderen Ausführungsform ist ein Analogon des OB-R-Polypeptids, vorzugsweise das humane OB-R-Polypeptid, eine verkürzte Form des Polypeptids. Zum Beispiel wurde bereits gezeigt, dass die Transmembrandomäne nicht essenziell ist, da eine natürlich vorkommende Isoform des Polypeptids durch eine cDNA kodiert wird, welche ein lösliches Protein exprimiert. Ähnlich kann es möglich sein, einige oder alle der divergenten Aminosäurereste in humanem OB-R (verglichen mit dem Mäuse-OB-R) zu deletieren. Zusätzlich umfasst diese Offenbarung das Bereitstellen eines OB-R-Analogons mit der minimalen Aminosäuresequenz, welche für eine biologische Aktivität nötig ist. Diese kann einfach bestimmt werden, z. B. durch Testen der Aktivität von Fragmenten des OB-R auf die Fähigkeit, an OB-R spezifische Antikörper zu binden, die Aktivität des nativen Leptins (durch kompetitive Bindung) zu inhibieren oder die Aktivität von nativem Leptin zu fördern.In another embodiment is an analogue of the OB-R polypeptide, preferably the human OB-R polypeptide, a shortened one Form of the polypeptide. For example, it has already been shown that the Transmembrane domain is not essential, since a naturally occurring isoform of the Polypeptide is encoded by a cDNA which is a soluble Protein expressed. Similar It may be possible be, some or all of the divergent amino acid residues in human OB-R (compared with the mouse OB-R) to delete. In addition includes this disclosure provides an OB-R analogue with the minimal amino acid sequence, which for one biological activity is necessary. This can be easily determined, for. By assaying the activity of fragments of the OB-R on the ability OB-R specific antibodies to bind the activity of native leptin (by competitive binding) or the activity of native leptin.

Die vorliegende Offenbarung umfasst spezifisch das Bereitstellen einer löslichen Spleißform von OB-R, von der angenommen wird, dass sie die Leptinaktivität fördert. Insbesondere wird angenommen, dass OB-Rd (wie es hier bezeichnet wird) Leptin bindet und die Leptinbindung an OB-Rb vereinfacht (von welchem angenommen wird, dass es kompetent für eine Signaltransduktion ist). Daher scheint sich in dieser Ausführungsform OB-R analog zu anderen Rezeptorsystemen zu verhalten [Kishimoto et al., Cell, 76: 253 (1994), Davis et al., Science, 260: 1805 (1993), Davis et al., Science, 259: 1736 (1993)].The The present disclosure specifically includes providing a soluble splice OB-R, which is believed to promote leptin activity. Especially It is assumed that OB-Rd (as referred to herein) is leptin binds and simplifies the leptin binding to OB-Rb (from which suppose Will that be competent for a signal transduction is). Therefore, in this embodiment, it seems Behave OB-R in the same way as other receptor systems [Kishimoto Cell et al., Cell, 76: 253 (1994), Davis et al., Science, 260: 1805 (1993), Davis et al., Science, 259: 1736 (1993)].

Es wird vom Fachmann erkannt werden, dass die voranstehenden Fragmentgrößen angenähert sind, und dass zusätzliche Aminosäuren, z. B. von eins bis ungefähr fünf, an jedem oder an beiden Enden der zitierten verkürzten Analoga oder in das/aus dem Innere/n des Polypeptids oder von Fragmenten davon eingeschlossen oder deletiert werden können.It will be appreciated by those skilled in the art that the foregoing fragment sizes are approximated, and that extra Amino acids, z. From one to about five, on at either or both ends of the cited truncated analogs or in the / the interior of the polypeptide or fragments thereof or can be deleted.

Analoga, wie Fragmente, können zum Beispiel durch Spaltung des OB-R hergestellt werden, z. B. mit Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, Papain, thrombolytischen Proteasen, Carboxypeptidase A, Proteinase K, usw. Andere Analoga, wie Muteine, können durch Standard-stellengerichtete Mutagenese von Gewichtsmodulator-Peptid kodierenden Sequenzen hergestellt werden.analogues, like fragments, can For example, be prepared by cleavage of the OB-R, z. With trypsin, Chymotrypsin, pepsin, papain, thrombolytic proteases, carboxypeptidase A, proteinase K, etc. Other analogues, such as muteins, can be activated by Standard site-directed mutagenesis of weight modulator peptide coding Sequences are produced.

Screening auf LeptinanalogaScreening for leptin analogues

Verschiedene Screeningtechniken sind im Stand der Technik zum Screenen auf Analoga von Polypeptiden bekannt. Verschiedene Chemikalien-Bibliotheken sind verfügbar. Folglich umfasst die vorliegende Offenbarung das Screenen solche Bibliotheken, z. B. Bibliotheken synthetischer Verbindungen, welche über die Jahre der Forschung erzeugt wurden, Bibliotheken natürlicher Verbindungen und kombinatorische Bibliotheken, wie sie detaillierter infra beschrieben werden, auf Analoga von Leptin. Diese Offenbarung umfasst das Screenen solcher Bibliotheken auf Verbindungen, die an OB-R binden, entweder in löslichen oder Transmembranformen. Vorzugsweise fördern solche Moleküle die Signaltransduktion durch OB-R oder wirken ihr entgegen. Daher umfasst die vorliegende Offenbarung Screens auf kleine Molekülliganden oder Ligandenanaloga und Imitatoren, sowie Screens auf natürliche Liganden, welche an aktivierten OB-Rezeptor in vivo binden und ihn fördern oder ihm entgegenwirken.Various screening techniques are known in the art for screening for analogs of polypep known tiden. Various chemical libraries are available. Thus, the present disclosure includes screening such libraries, e.g. B. Libraries of synthetic compounds generated over the years of research, libraries of natural compounds, and combinatorial libraries, as described in more detail below, for analogs of leptin. This disclosure encompasses the screening of such libraries for compounds that bind to OB-R, either in soluble or transmembrane forms. Preferably, such molecules promote or counteract signal transduction by OB-R. Thus, the present disclosure encompasses screens for small molecule ligands or ligand analogs and imitators, as well as screens for natural ligands that bind to and promote or counteract activated OB receptor in vivo.

Kenntnis der Primärsequenz des Rezeptors und die Ähnlichkeit dieser Sequenz mit Proteinen bekannter Funktion kann einen anfänglichen Hinweis auf die Agonisten oder Antagonisten des Proteins bereitstellen. Die Identifikation und das Screening von Antagonisten werden weiterhin durch Bestimmen struktureller Eigenschaften des Proteins vereinfacht, z. B. unter Verwendung von Röntgenkristallographie, Neutronenbeugung, kernmagnetischer Resonanzspektrometrie und an deren Techniken zur Strukturbestimmung. Diese Techniken stellen das vernünftige Design oder die Identifikation von Agonisten und Antagonisten bereit.knowledge the primary sequence of the receptor and the similarity This sequence with proteins of known function may have an initial To provide evidence of the agonist or antagonist of the protein. The Identification and screening of antagonists will continue simplified by determining structural properties of the protein, z. Using X-ray crystallography, Neutron diffraction, nuclear magnetic resonance spectrometry and their Techniques for structure determination. These techniques make the sensible design or the identification of agonists and antagonists.

Ein anderer Ansatz verwendet rekombinante Bakteriophagen, um große Bibliotheken herzustellen. Unter Verwendung des "Phagenverfahrens" [Scott et al., Science, 249: 386–390 (1990), Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6378–6382 (1990), Devlin et al., Science, 249: 404–406 (1990)] können sehr große Bibliotheken konstruiert werden (106–108 chemische Einheiten). Ein zweiter Ansatz verwendet hauptsächlich chemische Verfahren, von welchen das Geysen-Verfahren [Geysen et al., Molecular Immunology, 23: 709–715 (1986), Geysen et al., J. Immunologic Method, 102: 259–274 (1987)] und das derzeitige Verfahren von Fodor et al., Science, 251: 767–773 (1991) Beispiele darstellen. Andere Referenzen [Furka et al., 14. International Congress of Biochemistry, Volume 5, Abstract FR: 013 (1988), Furka, Int. J. Peptide Protein Res., 37: 487–493 (1991), Houghton ( U.S. Patent Nr. 4,631,211 , erteilt im Dezember 1986) und Rutter et al. ( U.S. Patent Nr. 5,010,175 , erteilt am 23. April 1991)] beschreiben Verfahren, um ein Gemisch aus Peptiden, welche als Agonisten oder Antagonisten getestet werden können, herzustellen.Another approach uses recombinant bacteriophages to make large libraries. Using the "phage method" [Scott et al., Science, 249: 386-390 (1990), Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6378-6382 (1990), Devlin et al., Science, 249: 404-406 (1990)], very large libraries can be constructed (10 6 -10 8 chemical units). A second approach uses mainly chemical methods, of which the Geysen method [Geysen et al., Molecular Immunology, 23: 709-715 (1986), Geysen et al., J. Immunologic Method, 102: 259-274 (1987)]. ] and the current method of Fodor et al., Science, 251: 767-773 (1991). Other references [Furka et al., 14th International Congress of Biochemistry, Volume 5, Abstract FR: 013 (1988), Furka, Int. J. Peptide Protein Res., 37: 487-493 (1991), Houghton ( U.S. Patent No. 4,631,211 , issued December, 1986) and Rutter et al. ( U.S. Patent No. 5,010,175 , issued April 23, 1991)] describe methods to prepare a mixture of peptides that can be tested as agonists or antagonists.

In einem anderen Aspekt können synthetische Bibliotheken [Needels et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 10700–10704 (1993), Lam et al., Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 92/00252 , Kocis et al., Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 94/28028 ] und desgleichen verwendet werden, um auf OB-Rezeptor-Liganden, wie hier offenbart, zu screenen.In another aspect, synthetic libraries [Needels et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 10700-10704 (1993), Lam et al., International Patent Publication No. WO 92/00252 , Kocis et al., International Patent Publication No. WO 94/28028 ] and the like can be used to screen for OB receptor ligands as disclosed herein.

Insbesondere können Assays für das Binden eines löslichen Liganden an Zellen, welche rekombinante Formen der OB-Rezeptor-Ligandenbindungsdomäne exprimieren, durchgeführt werden. Die löslichen Liganden können einfach als rekombinantes oder synthetisches Leptin-Polypeptid bereitgestellt werden.Especially can Assays for the binding of a soluble Ligands to cells expressing recombinant forms of the OB receptor ligand binding domain, carried out become. The soluble Ligands can simply provided as a recombinant or synthetic leptin polypeptide become.

Das Screening kann mit rekombinanten Zellen durchgeführt werden, welche den OB-Rezeptor exprimieren oder alternativ unter Verwendung von gereinigtem Re zeptorprotein, welches z. B. rekombinant hergestellt wurde, wie oben beschrieben. Zum Beispiel kann die Fähigkeit von markiertem, löslichem oder gelöstem OB-Rezeptor, welcher den Liganden-Bindungsabschnitt des Moleküls einschließt, einen Liganden zu binden, verwendet werden, um Bibliotheken zu screenen, wie in den voranstehenden Referenzen beschrieben wurde.The Screening can be performed with recombinant cells expressing the OB receptor or, alternatively, using purified receptor protein, which z. B. recombinant was prepared as described above. For example, the ability of marked, soluble or dissolved OB receptor, which includes the ligand-binding portion of the molecule, a Ligating ligands used to screen libraries, as described in the above references.

Derivate von OB-PolypeptidenDerivatives of OB Polypeptides

Im Allgemeinen kann eine lösliche Form des vorliegenden Polypeptids durch das Anheften von einem oder mehreren chemischen Resten an den Polypeptidrest derivatisiert werden. Die chemisch modifizierten Derivate können weiterhin für eine intraarterielle, intraperitoneale, intramuskuläre, subkutane, intravenöse, orale, nasale, rektale, buccale, sublinguale, pulmonale, topische, transdermale oder andere Wege der Verabreichung formuliert werden. Für eine chemische Modifikation von biologisch aktiven Proteinen wurde gefunden, dass sie unter bestimmten Umständen zusätzliche Vorteile bereitstellen, wie ein Erhöhen der Stabilität und Zirkulationszeit des therapeutischen Proteins und ein Vermindern der Immunogenizität [siehe das U.S. Patent Nr. 4,179,337 , Davis et al., erteilt am 18. Dezember 1979, für einen Überblick siehe Abuchowski et al., "Soluble Polymer-Enzyme Adducts", in Enzymes as Drugs, S. 367–383, Holcenberg und Roberts, Hrsg., Wiley-Interscience, New York, NY (1981)]. Ein Übersichtsartikel, welcher Proteinmodifikation und Fusionsproteine beschreibt, stellt Francis, Focus on Growth Factors, 3: 4–10 (1992) dar.In general, a soluble form of the subject polypeptide can be derivatized by attaching one or more chemical moieties to the polypeptide moiety. The chemically modified derivatives may be further formulated for intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intravenous, oral, nasal, rectal, buccal, sublingual, pulmonary, topical, transdermal or other routes of administration. Chemical modification of biologically active proteins has been found to provide additional benefits in certain circumstances, such as increasing the stability and circulation time of the therapeutic protein and reducing immunogenicity U.S. Patent No. 4,179,337 Davis et al., Issued December 18, 1979, for a review, see Abuchowski et al., "Soluble Polymer Enzyme Adducts," Enzymes as Drugs, pp. 367-383, Holcenberg, and Roberts, eds., Wiley " Interscience, New York, NY (1981)]. A review article describing protein modification and fusion proteins is provided by Francis, Focus on Growth Factors, 3: 4-10 (1992).

Chemische Reste zur DerivatisierungChemical residues for derivatization

Die chemischen Reste, welche zur Derivatisierung geeignet sind, können aus verschiedenen Polymeren, insbesondere wasserlöslichen Polymeren, ausgewählt werden. Das ausgewählte Polymer ist vorzugsweise wasserlöslich, so dass das Protein, an welches es angeheftet ist, in einer wässrigen Umgebung, wie einer physiologischen Umgebung, nicht präzipitiert. Apolare Polymere können jedoch ebenfalls verwendet werden, wenn eine bestimmte Anwendung von ihrer Verwen dung profitiert, z. B. in einer kontrollierten Freisetzungsmatrix, in welcher die Zugänglichkeit für Wasser beschränkt ist. Für eine therapeutische Verwendung der Endprodukt-Präparation wird das Polymer vorzugsweise pharmazeutisch verträglich sein. Der Fachmann wird in der Lage sein, das gewünschte Polymer, basierend auf solchen Überlegungen, ob das Polymer/Protein-Konjugat therapeutisch verwendet werden wird und wenn, die gewünschte Dosierung, Zirkulationszeit, Resistenz gegen Proteolyse und andere Überlegungen, auszuwählen. Für die vorliegenden Proteine und Peptide können diese unter Verwendung der hier bereitgestellten Assays nachgeprüft werden.The chemical residues which are suitable for derivatization may consist of various polymers, in particular water-soluble polymers are selected. The selected Polymer is preferably water-soluble, so that the protein to which it is attached, in an aqueous Environment, such as a physiological environment, not precipitated. Apolar polymers can however, also be used when a particular application benefits from their use, eg. In a controlled release matrix, in which the accessibility for water limited is. For a therapeutic use of the final product preparation is preferably the polymer pharmaceutically acceptable be. The person skilled in the art will be able to obtain the desired polymer, based on such considerations, whether the polymer / protein conjugate will be used therapeutically and if, the desired Dosage, circulation time, resistance to proteolysis and other considerations, select. For the Present proteins and peptides can use these the assays provided here are reviewed.

Polymermolekülepolymer molecules

Das wasserlösliche Polymer kann aus der Gruppe, bestehend aus zum Beispiel Polyethylenglykol, Copolymeren aus Ethylenglykol/Propylenglykol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Poly-1,3-Dioxolan, Poly-1,3,6-trioxan, Ethylen/Maleinsäureanhydrid-Copolymeren, Polyaminosäuren (entweder Homopolymere oder zufällige Copolymere) und Dextran oder Poly(n-vinylpyrrolidon)polyethylenglykol, Propylenglykolhomopolymeren, Polypropylenoxid/Ethylenoxid-Copolymeren, polyoxyethylierten Polyolen und Polyvinylalkohol, ausgewählt werden. Polyethylenglykolpropionaldehyd kann beim Herstellen aufgrund seiner Stabilität in Wasser Vorteile bereitstellen.The water-soluble Polymer may be selected from the group consisting of, for example, polyethylene glycol, Copolymers of ethylene glycol / propylene glycol, carboxymethyl cellulose, Dextran, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, poly-1,3-dioxolane, Poly-1,3,6-trioxane, ethylene / maleic anhydride copolymers, polyamino acids (either Homopolymers or random Copolymers) and dextran or poly (n-vinylpyrrolidone) polyethylene glycol, propylene glycol homopolymers, Polypropylene oxide / ethylene oxide copolymers, polyoxyethylated polyols and Polyvinyl alcohol, selected become. Polyethylene glycol propionaldehyde may be used in manufacture due to its stability Provide benefits in water.

Das Polymer kann irgendein Molekulargewicht aufweisen und kann verzweigt oder unverzweigt sein. Für Polyethylenglykol liegt das bevorzugte Molekulargewicht zwischen ungefähr 2 kDa und ungefähr 100 kDa (wobei der Begriff "ungefähr" darauf hinweist, dass in Präparationen von Polyethylenglykol einige Moleküle mehr, einige weniger wiegen werden, als das angegebene Molekulargewicht) zur Einfachheit in der Handhabung und bei der Herstellung. Andere Größen können verwendet werden, abhängig von dem gewünschten therapeutischen Profil (z. B. der Dauer der gewünschten retardierten Freisetzung, der Wirkungen, wenn irgendwelche vorhanden sind, auf die biologische Aktivität, der Einfachheit in der Handha bung, des Grades oder des Fehlens der Antigenizität und anderer bekannter Wirkungen des Polyethylenglykols auf ein therapeutisches Protein oder Analogon).The Polymer can have any molecular weight and can branch or unbranched. For Polyethylene glycol is the preferred molecular weight between approximately 2 kDa and about 100 kDa (where the term "approximately" indicates that in preparations of polyethylene glycol some more molecules, some weigh less as the indicated molecular weight) for simplicity handling and manufacturing. Other sizes can be used become dependent of the desired therapeutic Profile (eg the duration of the desired delayed release, the effects, if any are, on the biological activity, the simplicity in the handling, the degree or absence of antigenicity and other known effects of the polyethylene glycol on a therapeutic protein or analog).

Polymer/Protein-VerhältnisPolymer / protein ratio

Die Anzahl der Polypetid-Moleküle, welche an jedes Polymer angeheftet sind, kann variieren, und der Fachmann wird in der Lage sein, die Wirkung auf die Funktion festzustellen. Es kann monoderivatisiert werden, oder es kann eine di-, tri-, tetra- oder eine Kombination der Derivatisierung bereitgestellt werden, mit demselben oder verschiedenen chemischen Resten (z. B. Polymere, wie verschiedene Gewichte von Polyethylenglykolen). Das Verhältnis von Polymer-Molekülen zu Protein-(oder Peptid-)Molekülen wird variieren, wie ihre Konzentrationen im Reaktionsgemisch. Im Allgemeinen wird das optimale Verhältnis (im Sinne der Wirksamkeit der Reaktion, so dass es keinen Überschuss an nicht umgesetztem Protein oder Polymer gibt) durch Faktoren, wie dem gewünschten Grad der Derivatisierung (z. B. mono-, di-, tri-, usw.), dem Molekulargewicht des ausgewählten Polymers, ob das Polymer verzweigt oder unverzweigt ist und den Reaktionsbedingungen bestimmt.The Number of polypetide molecules, which are attached to each polymer may vary, and those skilled in the art will be able to determine the effect on the function. It can be mono-derivatized, or it can be a di-, tri-, tetra- or a combination of derivatization, with the same or different chemical radicals (eg polymers, such as different weights of polyethylene glycols). The ratio of Polymer molecules to protein (or peptide) molecules will vary as their concentrations in the reaction mixture. in the Generally, the optimal ratio (in terms of effectiveness of the Reaction, so there is no surplus of unreacted protein or polymer) by factors such as the desired one Degree of derivatization (eg, mono-, di-, tri-, etc.), the molecular weight of the selected Polymers, whether the polymer is branched or unbranched and the Reaction conditions determined.

Anheftung des chemischen Restes an das ProteinAttachment of the chemical residue to the protein

Die Polyethylenglykol-Moleküle (oder anderen chemischen Reste) sollten an das Protein unter Berücksichtigung von Wirkungen auf funktionelle oder antigene Domänen des Proteins angeheftet werden. Es gibt eine Anzahl von Anheftungsverfahren, welche dem Fachmann zur Verfügung stehen, z. B. die EP 0 401 384 (Koppeln von PEG an G-CSF). Siehe auch Malik et al., Exp. Hematol., 20: 1028–1035 (1992) (welche von der Pegylierung von GM-CSF unter Verwendung von Tresylchlorid berichtet). Zum Beispiel kann Polyethylenglykol kovalent über Aminosäurereste über eine reaktive Gruppe, wie eine freie Amino- oder Carboxylgruppe gebunden werden. Reaktive Gruppen sind jene, an welche ein aktiviertes Polyethylenglykol-Molekül gebunden werden kann. Die Aminosäurereste, welche eine freie Aminogruppe aufweisen, können Lysinreste und die N-terminalen Aminosäurereste einschließen, jene, welche eine freie Carboxylgruppe aufweisen, können Asparaginsäurereste, Glutaminsäurereste und den C-terminalen Aminosäurerest einschließen. Sulfhydrylgruppen können ebenfalls als reaktive Gruppe zur Anheftung des/der Polyethylenglykol-Moleküls/e verwendet werden. Bevorzugt für therapeutische Zwecke ist ein Anheften an eine Aminogruppe, wie ein Anheften an den N-Terminus oder eine Lysingruppe. Ein Anheften an Resten, welche wichtig für die Rezeptorbindung sind, sollte vermieden werden, wenn die Rezeptorbindung gewünscht ist.The polyethylene glycol molecules (or other chemical moieties) should be attached to the protein, taking into account effects on functional or antigenic domains of the protein. There are a number of attachment methods available to those skilled in the art, e.g. B. the EP 0 401 384 (Coupling PEG to G-CSF). See also Malik et al., Exp. Hematol., 20: 1028-1035 (1992) (which reports the pegylation of GM-CSF using tresyl chloride). For example, polyethylene glycol can be covalently linked via amino acid residues via a reactive group such as a free amino or carboxyl group. Reactive groups are those to which an activated polyethylene glycol molecule can be attached. The amino acid residues having a free amino group may include lysine residues and the N-terminal amino acid residues, those having a free carboxyl group may include aspartic acid residues, glutamic acid residues and the C-terminal amino acid residue. Sulfhydryl groups may also be used as a reactive group for attaching the polyethylene glycol molecule (s) the. Preferred for therapeutic purposes is attachment to an amino group, such as attachment to the N-terminus or a lysine group. Sticking to residues important for receptor binding should be avoided if receptor binding is desired.

N-terminal chemisch modifizierte ProteineN-terminal chemically modified proteins

Es können spezifisch N-terminal chemisch modifizierte Proteine gewünscht werden. Unter Verwendung von Polyethylenglykol als Darstellung der vorliegenden Zusammensetzungen kann aus einer Vielzahl von Polyethylenglykol-Molekülen (nach Molekulargewicht, Verzweigung, usw.), dem Verhältnis von Polyethylenglykol-Molekülen zu Protein-(oder Peptid-)Molekülen im Reaktionsgemisch, dem Typ der durchzuführenden Pegylierungsreaktion und dem Verfahren zum Erhalten des ausgewählten N-terminal pegylierten Proteins ausgewählt werden. Das Verfahren zum Erhalten der N-terminal pegylierten Präparation (d. h. das Trennen dieses Restes von anderen monopegylierten Resten, wenn nötig) kann durch eine Reinigung des N-terminal pegylierten Materials aus einer Population von pegylierten Proteinmolekülen stattfinden. Eine selektive N-terminale chemische Modifikation kann durch eine reduktive Alkylierung erreicht werden, welche eine differenzielle Reaktivität von verschiedenen Typen primärer Aminogruppen (Lysin gegenüber dem N-Terminus) ausnutzt, die zur Derivatisierung in einem bestimmten Protein zur Verfügung stehen. Unter den geeigneten Reaktionsbedingungen wird eine im Wesentlichen selektive Derivatisierung des Proteins am N-Terminus mit einem Carbonylgruppe enthaltenden Polymer erreicht. Zum Beispiel kann das Protein selektiv N-terminal durch Durchführen der Reaktion bei einem pH-Wert pegyliert werden, welcher es erlaubt, den Vorteil der pKs-Unterschiede zwischen den E-Aminogruppen der Lysinreste und dem der α-Aminogruppe des N-terminalen Restes des Proteins auszunutzen. Durch eine selektive Derivatisierung wird die Anhef tung eines wasserlöslichen Polymers an ein Protein kontrolliert: die Konjugation mit dem Polymer findet hauptsächlich am N-Terminus des Proteins statt, und es tritt keine erhebliche Modifikation von anderen reaktiven Gruppen, wie den Lysin-Aminogruppen der Seitenkette, auf. Bei einer Verwendung der reduktiven Alkylierung kann das wasserlösliche Polymer vom oben beschriebenen Typ sein und sollte ein einzelnes reaktives Aldehyd zum Koppeln an das Protein aufweisen. Polyethylenglykolpropionaldehyd, welches ein einzelnes reaktives Aldehyd enthält, kann verwendet werden.Specific N-terminal chemically modified proteins may be desired. Using polyethylene glycol as an illustration of the instant compositions, a variety of polyethylene glycol molecules (by molecular weight, branching, etc.), the ratio of polyethylene glycol molecules to protein (or peptide) molecules in the reaction mixture, can be the type of pegylation reaction to be performed and the method for obtaining the selected N-terminally pegylated protein. The method of obtaining the N-terminally pegylated preparation (ie, separating this residue from other monopegylated residues, if necessary) can be accomplished by purifying the N-terminally pegylated material from a population of pegylated protein molecules. Selective N-terminal chemical modification can be achieved by reductive alkylation, which exploits differential reactivity of various types of primary amino groups (lysine over the N-terminus) available for derivatization in a particular protein. Under the appropriate reaction conditions, substantially selective derivatization of the protein at the N-terminus with a carbonyl group-containing polymer is achieved. For example, the protein can be selectively pegylated N-terminal by performing the reaction at a pH which allows the benefit of the pK s differences between the E-amino groups of the lysine residues and the α-amino group of the N-terminal residue of the protein. Selective derivatization controls the attachment of a water-soluble polymer to a protein: conjugation with the polymer occurs predominantly at the N-terminus of the protein, and there is no significant modification of other reactive groups, such as the side-chain lysine amino groups. on. When using the reductive alkylation, the water-soluble polymer may be of the type described above and should have a single reactive aldehyde for coupling to the protein. Polyethylene glycol propionaldehyde containing a single reactive aldehyde can be used.

Nukleinsäuren, die mit OB-R-Polypeptid verbunden sindNucleic acids with OB-R polypeptide are connected

Wie oben erwähnt, ist die vorliegende Offenbarung auf Nukleinsäuren gerichtet, welche OB-R-Polypeptide kodieren, sowie auf damit verbundene genomische nicht kodierende Sequenzen 5', 3' und intronisch vom OB-R-Gen. Daher können gemäß der vorliegenden Offenbarung gängige Molekularbiologie-, Mikrobiologie- und rekombinante DNA-Techniken des Standes der Technik eingesetzt werden. Solche Techniken sind vollständig in der Literatur erklärt [siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989), Glover Hrsg., DNA Cloning: A Practical Approach, Band I und II, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. (1985), Gait Hrsg., Oligonucleotide Synthesis, Oxford University Press (1984), Harnes et al., Hrsg., Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag (1985), Harnes et al., Hrsg., Transcription and Translation, Oxford University Press (1984), Freshney, Hrsg., Animal Cell Culture, Oxford University Press (1986), Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press (1986), Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, Wiley, New York (1984)]. Von besonderer Bedeutung für die vorliegende Offenbarung sind Strategien zum Isolieren, Klonieren, Sequenzieren, Analysieren und Charakterisieren eines Gens oder einer Nukleinsäure, basierend auf den gut bekannten Techniken der Polymerase-Kettenreaktion (PCR).As mentioned above, For example, the present disclosure is directed to nucleic acids which are OB-R polypeptides encoding, as well as related genomic non-coding Sequences 5 ', 3' and intronically from OB-R gene. Therefore, you can according to the present Revelation common Molecular Biology, Microbiology and Recombinant DNA Techniques of State of the art can be used. Such techniques are completely in explained the literature [see, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989), Glover ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. (1985), Gait Eds., Oligonucleotide Synthesis, Oxford University Press (1984), Harnes et al., Eds., Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag (1985), Harnes et al., Eds., Transcription and Translation, Oxford University Press (1984), Freshney, eds., Animal Cell Culture, Oxford University Press (1986), Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press (1986), Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, Wiley, New York (1984)]. Of particular importance for the present disclosure are isolation, cloning, Sequencing, analyzing and characterizing a gene or a Nucleic acid, based on the well-known polymerase chain reaction techniques (PCR).

Ein "Replikon" ist irgendein genetisches Element (z. B. ein Plasmid, ein Chromosom, ein Virus), welches als eine autonome Einheit der DNA-Replikation in vivo wirkt, d. h. in der Lage zur Replikation unter seiner eigenen Kontrolle ist.A "replicon" is any genetic Element (eg, a plasmid, a chromosome, a virus), which is referred to as an autonomous unit of DNA replication acts in vivo, i. H. in capable of replication under its own control.

Ein "Vektor" ist ein Replikon, wie ein Plasmid, Phage oder Kosmid, an welches ein anderes DNA-Segment angeheftet sein kann, um die Replikation des angehefteten Segments zu bewirken.A "vector" is a replicon, such as a plasmid, phage or cosmid to which another DNA segment can be pinned to the replication of the attached segment to effect.

Eine "Kassette" betrifft ein DNA-Segment, welches in einen Vektor an spezifischen Restriktionsstellen inseriert werden kann. Das DNA-Segment kodiert ein Polypeptid von Interesse, und die Kassette und die Restriktionsstellen werden entworfen, um eine Insertion der Kassette im richtigen Leserahmen zur Transkription und Translation sicherzustellen.A "cassette" refers to a DNA segment, which inserts into a vector at specific restriction sites can be. The DNA segment encodes a polypeptide of interest, and the cassette and restriction sites are designed to an insertion of the cassette in the correct reading frame for transcription and To ensure translation.

"Heterologe" DNA betrifft DNA, welche nicht natürlich in der Zelle oder in einer chromosomalen Stelle der Zelle vorliegt. Vorzugsweise schließt die heterologe DNA ein Gen ein, welches für die Zelle fremd ist."Heterologous" DNA refers to DNA, which is not natural in the cell or in a chromosomal location of the cell. Preferably closes the heterologous DNA is a gene foreign to the cell.

Eine Zelle wurde mit exogener oder heterologer DNA "transfiziert", wenn eine solche DNA in das Innere der Zelle eingeführt wurde. Eine Zelle wurde mit exogener oder heterologer DNA "transformiert", wenn die transfizierte DNA eine phänotypische Veränderung bewirkt. Vorzugsweise sollte die transformierende DNA in chromosomale DNA integriert (kovalent verbunden) werden, welche das Genom der Zelle bildet.A Cell has been "transfected" with exogenous or heterologous DNA, if such DNA enters the interior introduced into the cell has been. A cell was "transformed" with exogenous or heterologous DNA when transfected DNA a phenotypic change causes. Preferably, the transforming DNA should be in chromosomal Integrated (covalently linked) DNA, which is the genome of the Cell forms.

Ein "Klon" ist eine Population von Zellen, welche von einer Einzelzelle oder einem gemeinsamen Vorfahren durch Mitose abgeleitet wurde.A "clone" is a population of cells derived from a single cell or a common cell Ancestor was derived by mitosis.

Ein "Nukleinsäuremolekül" betrifft die polymere Phosphatesterform von Ribonukleosiden (Adenosin, Guanosin, Uridin oder Cytidin, "RNA-Moleküle") oder Desoxyribonukleosiden (Desoxyadenosin, Desoxyguanosin, Desoxythymidin oder Desoxycytidin, "DNA-Moleküle"), entweder in einzelsträngiger Form oder als dop pelsträngige Helix. Doppelsträngige DNA-DNA-, DNA-RNA- und RNA-RNA-Helices sind möglich. Der Begriff Nukleinsäuremolekül, und insbesondere DNA- oder RNA-Molekül, betrifft nur die Primär- und Sekundär-Struktur des Moleküls und beschränkt ihn nicht auf irgendwelche Tertiär- oder Quartärformen. Daher schließt dieser Begriff doppelsträngige DNA ein, welche inter alia in linearen oder zirkulären DNA-Molekülen (z. B. Restriktionsfragmenten), Plasmiden und Chromosomen gefunden wird. Beim Diskutieren der Struktur von bestimmten doppelsträngigen DNA-Molekülen können Sequenzen hier gemäß der normalen Konvention des Angebens nur der Sequenz in der 5'- zur 3'-Richtung entlang des nicht transkribierten Strangs der DNA (d. h. des Strangs mit einer Sequenz, die homolog zur mRNA ist) beschrieben werden. Ein "rekombinantes DNA-Molekül" ist ein DNA-Molekül, welches einer molekularbiologischen Manipulation unterzogen wurde.A "nucleic acid molecule" refers to the polymers Phosphate ester form of ribonucleosides (adenosine, guanosine, uridine or cytidine, "RNA molecules") or deoxyribonucleosides (Deoxyadenosine, deoxyguanosine, deoxythymidine or deoxycytidine, "DNA molecules"), either in single-stranded form or as double-stranded Helix. double DNA-DNA, DNA-RNA and RNA-RNA helices are possible. The term nucleic acid molecule, and in particular DNA or RNA molecule only the primary and secondary structure of the molecule and limited do not call him on any tertiary or Quaternary forms. Therefore, concludes this term double-stranded DNA, which inter alia in linear or circular DNA molecules (eg. Restriction fragments), plasmids and chromosomes. In discussing the structure of certain double-stranded DNA molecules, sequences may be used here according to the normal Convention of indicating only the sequence in the 5 'to 3' direction along the non-transcribed one Strand of the DNA (i.e., strand with a sequence homologous to mRNA). A "recombinant DNA molecule" is a DNA molecule which was subjected to a molecular biological manipulation.

Ein Nukleinsäuremolekül ist "hybridisierbar" mit einem anderen Nukleinsäuremolekül, wie einer cDNA, genomischen DNA oder RNA, wenn eine einzelsträngige Form des Nukleinsäuremoleküls sich an das andere Nukleinsäuremolekül unter den geeigneten Bedingungen der Temperatur und der Ionenstärke der Lösung anlagern kann (siehe Sambrook et al., 1989, supra). Die Bedingungen der Temperatur und der Ionenstärke bestimmen die "Stringenz" der Hybridisierung. Für ein vorläufiges Screenen auf homologe Nukleinsäuren können Hybridisierungsbedingungen niedriger Stringenz, welche einer Tm von 55°C entsprechen, verwendet werden, z. B. 5 × SSC, 0,1% SDS, 0,25% Milch und kein Formamid oder 30% Formamid, 5 × SSC, 0,5% SDS. Hybridisierungsbedingungen moderater Stringenz entsprechen einer höheren Tm, z. B. 40% Formamid mit 5 × oder 6 × SSC. Hybridisierungsbedingungen hoher Stringenz entsprechen der höchsten Tm, z. B. 50% Formamid, 5 × oder 6 SSC. Eine Hybridisierung erfordert, dass die zwei Nukleinsäuren komplementäre Sequenzen enthalten, obwohl, abhängig von der Stringenz der Hybridisierung Fehlpaarungen zwischen Basen möglich sind. Die geeignete Stringenz zum Hybridisieren von Nukleinsäuren hängt von der Länge der Nukleinsäuren und dem Grad der Komplementarität ab, Variablen, welche im Stand der Technik gut bekannt sind. Je größer der Grad der Ähnlichkeit oder Homologie zwischen zwei Nukleotidsequenzen ist, desto größer ist der Wert der Tm für Hybride der Nukleinsäuren, welche jene Sequenzen aufweisen. Die relative Stabilität (was einer höheren Tm entspricht) von Nukleinsäurehybridisierungen nimmt in der folgenden Reihenfolge ab: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Für Hybride mit mehr als 100 Nukleotiden Länge wurden Gleichungen zum Berechnen der Tm abgeleitet (siehe Sambrook et al., 1989, supra, 9.50–0.51). Für eine Hybridisierung mit kürzeren Nukleinsäuren, d. h. Oligonukleotiden, wird die Position der Fehlpaarungen wichtiger, und die Länge des Oligonukleotids bestimmt seine Spezifität (siehe Sambrook et al., 1989, supra, 11.7–11.8). Eine minimale Länge für eine hybridisierbare Nukleinsäure beträgt vorzugsweise mindestens ungefähr 10 Nukleotide, weiter bevorzugt mindestens ungefähr 15 Nukleotide, am meisten bevorzugt beträgt die Länge mindestens ungefähr 20 Nukleotide.A nucleic acid molecule is "hybridizable" with another nucleic acid molecule, such as a cDNA, genomic DNA or RNA, if a single-stranded form of the nucleic acid molecule can anneal to the other nucleic acid molecule under appropriate conditions of temperature and ionic strength of the solution (see Sambrook et al. , 1989, supra). The conditions of temperature and ionic strength determine the "stringency" of hybridization. For preliminary screening for homologous nucleic acids, low stringency hybridization conditions corresponding to a T m of 55 ° C may be used, e.g. 5x SSC, 0.1% SDS, 0.25% milk and no formamide or 30% formamide, 5x SSC, 0.5% SDS. Moderate stringency hybridization conditions correspond to a higher T m , e.g. 40% formamide with 5x or 6x SSC. High stringency hybridization conditions correspond to the highest T m , e.g. 50% formamide, 5x or 6 SSC. Hybridization requires that the two nucleic acids contain complementary sequences, although, depending on the stringency of hybridization, mismatches between bases are possible. The appropriate stringency for hybridizing nucleic acids depends on the length of the nucleic acids and the degree of complementarity, variables well known in the art. The greater the degree of similarity or homology between two nucleotide sequences, the greater the value of T m for hybrids of the nucleic acids having those sequences. The relative stability (which corresponds to a higher T m ) of nucleic acid hybridizations decreases in the following order: RNA: RNA, DNA: RNA, DNA: DNA. For hybrids greater than 100 nucleotides in length, equations were calculated for calculating T m (see Sambrook et al., 1989, supra, 9.50-0.51). For hybridization with shorter nucleic acids, ie oligonucleotides, the position of the mismatches becomes more important and the length of the oligonucleotide determines its specificity (see Sambrook et al., 1989, supra, 11.7-11.8). A minimum length for a hybridizable nucleic acid is preferably at least about 10 nucleotides, more preferably at least about 15 nucleotides, most preferably the length is at least about 20 nucleotides.

In einer spezifischen Ausführungsform betrifft der Begriff "Standard-Hybridisierungsbedingungen" eine Tm von 55°C unter Verwendung von oben dargelegten Bedingungen. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Tm 60°C, in einer weiter bevorzugten Ausführungsform beträgt die Tm 60°C.In a specific embodiment, the term "standard hybridization conditions" refers to a T m of 55 ° C using conditions set forth above. In a preferred embodiment, the T m is 60 ° C, in a further preferred embodiment the T m is 60 ° C.

Eine "homologe Rekombination" betrifft die Insertion einer fremden DNA-Sequenz eines Vektors in ein Chromosom. Vorzugsweise zielt der Vektor auf eine spezifische chromosomale Stelle für die homologe Rekombination ab. Für eine spezifische homologe Rekombination wird der Vektor ausreichend lange Regionen der Homologie zu Sequenzen des Chromosoms enthalten, um eine komplementäre Bindung und Aufnahme des Vektors in das Chromosom zu erlauben. Längere Regionen der Homologie und größere Grade der Sequenzähnlichkeit können die Wirksamkeit der homologen Rekombination erhöhen.A "homologous recombination" refers to the insertion a foreign DNA sequence of a vector into a chromosome. Preferably the vector targets a specific chromosomal site for the homologous Recombination off. For a specific homologous recombination will suffice for the vector contain long regions of homology to sequences of the chromosome, a complementary one Allow binding and uptake of the vector into the chromosome. Longer regions of homology and greater degrees the sequence similarity can increase the efficiency of homologous recombination.

Eine DNA "kodierende Sequenz" ist eine doppelsträngige DNA-Sequenz, welche in ein Polypeptid in einer Zelle in vitro oder in vivo transkribiert und translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen gebracht wird. Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden durch ein Startcodon am 5'(Amino)-Terminus und ein Translations-Stopcodon am 3'(Carboxyl)-Terminus bestimmt. Eine kodierende Sequenz kann prokaryotische Sequenzen, cDNA aus eukaryotischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen aus eukaryotischer (z. B. Säugetier-) DNA und sogar synthetische DNA-Sequenzen einschließen, ist aber nicht darauf beschränkt. Wenn die kodierende Sequenz für eine Expression in einer eukaryotischen Zelle vorgesehen ist, werden gewöhnlich ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptionsterminationssequenz 3' von der kodierenden Sequenz platziert.A DNA "coding sequence" is a double-stranded DNA sequence which is transcribed and translated into a polypeptide in a cell in vitro or in vivo when placed under the control of appropriate regulatory sequences. The boundaries of the coding sequence are determined by a start codon at the 5 '(amino) terminus and a translation stop codon at the 3' (carboxyl) terminus. A coding sequence may include prokaryotic sequences, cDNA from eukaryotic mRNA, genomic DNA sequences from eukaryotic (eg, mammalian) DNA, and even synthetic DNA sequences, but is not limited thereto. When the coding sequence is for expression in a eukaryotic cell, a polyadenylation signal and a transcription termination sequence are usually placed 3 'to the coding sequence.

Isolierung von OB-R kodierenden und flankierenden SequenzenIsolation of OB-R coding and flanking sequences

Die von der vorliegenden Offenbarung umfassten Nukleinsäuren schließen Nukleinsäuren ein, welche bei der Expression Peptide kodieren, wie jene, die in den SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 und 10 dargelegt sind. Folglich kann, obwohl spezifische DNA in Bezug auf das OB-R-Gen isoliert und sequenziert wurde, irgendeine Tierzelle möglicherweise als Nukleinsäurequelle für die molekulare Klonierung eines Gens dienen, welches das Polypeptid, wie hier offenbart, kodiert. Die DNA kann durch Standardverfahren, welche im Stand der Technik für klonierte DNA bekannt sind (z. B. eine DNA "Bibliothek"), durch chemische Synthese, durch cDNA-Klonierung oder durch die Klonierung von genomischer DNA oder von Fragmenten davon, aufgereinigt aus der gewünschten Zelle erhalten werden [siehe zum Beispiel Sambrook et al., 1989, supra, Glover, 1985, supra]. Aus genomischer DNA abgeleitete Klone können regulatorische und intronische DNA-Regionen zusätzlich zu den kodierenden Regionen enthalten, aus cDNA abgeleitete Klone werden keine Intronsequenzen enthalten. Was auch immer die Quelle ist, das Gen sollte molekular in einen geeigneten Vektor zur Vermehrung des Gens kloniert werden.The Nucleic acids encompassed by the present disclosure include nucleic acids, which code for expression peptides, such as those described in the SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 and 10 are set forth. Consequently, though isolated and sequenced specific DNA for the OB-R gene possibly, any animal cell as a nucleic acid source for the serve molecular cloning of a gene containing the polypeptide, as disclosed herein. The DNA can be isolated by standard methods, which cloned in the prior art DNA (eg a DNA "library"), by chemical synthesis, by cDNA cloning or by the cloning of genomic DNA or fragments thereof, purified from the desired Cell [see, for example, Sambrook et al., 1989, supra, Glover, 1985, supra]. Genomic DNA derived clones can regulatory and intronic DNA regions in addition to the coding regions cDNA-derived clones do not become intron sequences contain. Whatever the source is, the gene should be molecular be cloned into a suitable vector for propagation of the gene.

Beim molekularen Klonieren des Gens aus genomischer DNA kann die genomische DNA unter Verwendung von Primern amplifiziert werden, welche aus den cDNA-Sequenzen ausgewählt wurden. Alternativ werden DNA-Fragmente erzeugt, von denen einige das gewünschte Gen kodieren werden. Die DNA kann an spezifischen Stellen unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme gespalten werden. Es kann ebenfalls DNase in der Anwesenheit von Mangan verwendet werden, um die DNA zu fragmentieren, oder die DNA kann physikalisch geschert werden, zum Beispiel durch Ultraschallbehandlung. Die linearen DNA-Fragmente können anschließend gemäß der Größe durch Standardtechniken getrennt werden, einschließlich von, aber nicht beschränkt auf Agarose- und Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Säulenchromatographie.At the Molecular cloning of the gene from genomic DNA can be genomic DNA are amplified using primers consisting of the cDNA sequences selected were. Alternatively, DNA fragments are generated, some of which the wished Encode gene. The DNA can be absorbed at specific sites Use of various restriction enzymes are cleaved. It also DNase can be used in the presence of manganese, to fragment the DNA, or the DNA can be physically sheared be, for example, by ultrasound treatment. The linear DNA fragments can then be sized according to size Standard techniques are separated, including, but not limited to Agarose and polyacrylamide gel electrophoresis and column chromatography.

Sobald die DNA-Fragmente erzeugt sind, kann eine Identifikation des spezifischen DNA-Fragments, welches das gewünschte OB-R-Gen enthält, in einer Anzahl von Wegen erreicht werden. Wenn zum Beispiel eine Menge eines Abschnitts eines OB-R-Gens oder seine spezifische RNA oder ein Fragment davon verfügbar ist und gereinigt und markiert werden kann, können die erzeugten DNA-Fragmente durch eine Nukleinsäure-Hybridisierung mit einer markierten Sonde gescreent werden [Benton et al., Science, 196: 180 (1977), Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 3961 (1975)]. Die vorliegende Offenbarung stellt solche Nukleinsäuresonden bereit, welche einfach aus den spezifischen hier offenbarten Sequenzen hergestellt werden können, z. B. eine hybridisierbare Sonde mit einer Nukleotidsequenz, welche mindestens einem 10, vorzugsweise einem 15 und weiter bevorzugt mindestens einem 20 Nukleotid langen Fragment der Sequenzen entspricht, welche in den SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 und 9 dargestellt sind. Vorzugsweise wird ein Fragment ausgewählt, welches hoch spezifisch für die hier offenbarten Nukleinsäuren ist. Jene DNA-Fragmente mit einer erheblichen Sequenzähnlichkeit zu der Sonde, z. B. eine homologe DNA, werden hybridisieren. Wie oben erwähnt wurde, je größer der Grad der Sequenzähnlichkeit ist, desto stringenter sind die Hybridisierungsbedingungen, die verwendet werden können. In einer Ausführungsform werden Hybridisierungsbedingungen niedriger Stringenz verwendet, um eine homologe Leptinrezeptor-Nukleinsäure zu identifizieren. In einem bevorzugten Aspekt und wie hier experimentell gezeigt, wird jedoch eine Nukleinsäure, welche ein wie hier offenbartes Polypeptid kodiert, mit einer Nukleinsäure, welche eine Nukleotidsequenz, wie in (SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 und 9) dargestellt, oder ein hybridisierbares Fragment davon aufweist, unter Bedingungen moderater Stringenz hybridisieren, weiter bevorzugt wird sie unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisieren.As soon as The DNA fragments generated can be an identification of the specific DNA fragment containing the desired Contains OB-R gene, can be achieved in a number of ways. If for example a Amount of a portion of an OB-R gene or its specific RNA or a fragment thereof available is and can be purified and labeled, the generated DNA fragments by a nucleic acid hybridization screened with a labeled probe [Benton et al., Science, 196: 180 (1977), Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 3961 (1975)]. The present disclosure provides such nucleic acid probes ready, which simply from the specific sequences disclosed here can be produced z. B. a hybridizable probe with a nucleotide sequence, which at least one 10, preferably one 15 and more preferred at least a 20 nucleotide fragment of the sequences corresponding to which in SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7 and 9 are shown. Preferably if a fragment is selected which is highly specific for the nucleic acids disclosed herein is. Those DNA fragments with a significant sequence similarity to the probe, e.g. B. a homologous DNA will hybridize. As mentioned above the bigger the Degree of sequence similarity the more stringent are the hybridization conditions that can be used. In one embodiment use low stringency hybridization conditions, to identify a homologous leptin receptor nucleic acid. In one however, preferred aspect and experimentally shown here a nucleic acid, which encodes a polypeptide as disclosed herein with a nucleic acid which a nucleotide sequence as shown in (SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7 and 9), or a hybridizable fragment thereof under conditions hybridize to moderate stringency, more preferably it is below Hybridize conditions of high stringency.

In einer anderen spezifischen Ausführungsform kann die hier offenbarte DNA unter Verwendung von einer der PCR-Sonden identifiziert werden, welche durch Exon-Trapping und cDNA-Selektion erhalten wurden. Zum Beispiel können die Primerpaare, welche in Beispiel 3 beschrieben werden, verwendet werden, um eine DNA zu amplifizieren.In another specific embodiment For example, the DNA disclosed herein can be amplified using one of the PCR probes be identified by exon-trapping and cDNA selection were obtained. For example, you can the primer pairs described in Example 3 are used to amplify a DNA.

Vorzugsweise werden diese Primer DNA unter Bedingungen moderater bis hoher Stringenz amplifizieren, z. B. unter Verwendung einer Prähybridisierung bei 65°, unter Verwendung von Rapid-hyb-Puffer (Amersham Life Sciences), gefolgt von einer Hybridisierung für 6 Stunden bei 65°C, gefolgt vom Waschen zuerst mit 2 × SSC/0,1% SDS für 30 min bei Raumtemperatur (RT) und einem zweiten Waschschritt bei höherer Stringenz mit 0,3 × SSC/0,1% SDS, RT für 30 min. Wie vom Fachmann erkannt werden wird, ist die Stringenz des zweiten Waschschritts flexibel und hängt von der Länge der Sonde und dem Grad der Sequenzähnlichkeit von jeder Sonde ab. Da zum Beispiel die humanen und Mäuse-kodierenden Regionen zu ungefähr 78% homolog sind, können dieselben Hybridisierungsbedingungen mit einem zweiten Waschschritt mit niedrigerer Stringenz eingesetzt werden (z. B. zweimal mit 2 × SSC/0,1% SDS, RT). Wenn dies zu keinem Signal mit keinem Hintergrund führt, kann eine Hybridisierung bei einer niedrigeren Temperatur (niedrigeren Stringenz) versucht werden, z. B. 42°C. Wenn zu viel Hintergrund auftritt, kann die Stringenz des zweiten Waschschritts erhöht werden (z. B. 0,5 oder 0,3 × SSC, 0,1% SDS, RT). Gemäß dieser Offenbarung werden die oben erwähnten PCR-Sonden ein Nukleinsäuremolekül definieren, z. B. eine DNA, welche OB-R kodiert, aus humanen, sowie Mäuse-DNA-Bibliotheken unter ähnlichen Hybridisierungsbedingungen.Preferably, these primers will amplify DNA under conditions of moderate to high stringency, e.g. Using prehybridization at 65 °, using Rapid hyb buffer (Amersham Life Sciences), followed by hybridization for 6 hours at 65 ° C, followed by washing first with 2 x SSC / 0.1% SDS for 30 min at room temperature (RT) and a second wash at higher stringency with 0.3x SSC / 0.1% SDS, RT for 30 min. As will be appreciated by those skilled in the art, the stringency of the second washing step is flexible and depends on the length of the probe and the degree of sequence similarity from each probe. For example, since the human and mouse coding regions are approximately 78% homologous, the same hybridization conditions can be used with a second, lower stringency wash step (e.g., 2x with 2X SSC / 0.1% SDS, RT). If this results in no signal with no background, hybridization at a lower temperature (lower stringency) can be attempted, e.g. B. 42 ° C. If too much background occurs, the stringency of the second wash can be increased (eg, 0.5 or 0.3x SSC, 0.1% SDS, RT). According to this disclosure, the above-mentioned PCR probes will define a nucleic acid molecule, e.g. For example, a DNA encoding OB-R from human as well as murine DNA libraries under similar hybridization conditions.

Alternativ kann die Anwesenheit des Gens durch Assays nachgewiesen werden, welche auf den physikalischen, chemischen oder immunologischen Eigenschaften seines exprimierten Produkts beruhen. Zum Beispiel können cDNA-Klone oder DNA-Klone, welche die richtigen mRNAs Hybrid-selektieren, ausgewählt werden, welche ein Protein herstellen, das z. B. ähnliche oder identische elektrophoretische Wandereigenschaften, isoelektrisches Fokussierungsverhalten, proteolytische Spaltkarten, Leptinbindungsaktivität oder antigene Eigenschaften aufweist, wie sie für den vorliegenden OB-R bekannt sind. Zum Beispiel können wie hier offenbarte Antikörper einfach verwendet werden, um auf Homologa von OB-R aus anderen Quellen zu screenen. Proteine von Kandidatengenen werden vorzugsweise auf die Leptinbindung getestet.alternative the presence of the gene can be detected by assays, which on the physical, chemical or immunological properties based on its expressed product. For example, cDNA clones or DNA clones hybridising the correct mRNAs are selected, which produce a protein, the z. B. similar or identical electrophoretic migration properties, isoelectric focusing behavior, proteolytic gap maps, Leptin binding activity or antigenic properties as known for the present OB-R are. For example, you can as disclosed herein antibodies Simply used to refer to OB-R homologs from other sources to screen. Proteins of candidate genes are preferably obtained tested the leptin binding.

Ein Gen, welches ein Polypeptid, wie hier offenbart, kodiert, kann ebenfalls durch eine mRNA-Selektion identifiziert werden, d. h. durch eine Nukleinsäure-Hybridisierung, gefolgt von einer in vitro Translation. In diesem Verfahren werden Fragmente verwendet, um komplementäre mRNAs durch Hybridisierung zu isolieren. Solche DNA-Fragmente können verfügbare, gereinigte Modulator-DNA darstellen. Eine Immunpräzipitationsanalyse oder funktionelle Assays (z. B. Leptinbindungsaktivität) des in vitro Translationsprodukts der Produkte der isolierten mRNAs identifiziert die mRNA und daher die komplementären DNA-Fragmente, welche die gewünschten Sequenzen enthalten. Zusätzlich können spezifische mRNAs durch Adsorption von Polysomen, welche aus Zellen isoliert wurden, an immobilisierte Antikörper, welche spezifisch gegen ein Modulatorpeptid gerichtet sind, ausgewählt werden.One Gene encoding a polypeptide as disclosed herein may also be used be identified by mRNA selection, d. H. by a Nucleic acid hybridization followed from an in vitro translation. In this procedure, fragments become used to be complementary Isolate mRNAs by hybridization. Such DNA fragments may be available, purified Represent modulator DNA. An immunoprecipitation analysis or functional Assays (eg leptin binding activity) of the in vitro translation product the products of the isolated mRNAs identify the mRNA and therefore the complementary ones DNA fragments containing the desired Contain sequences. additionally can specific mRNAs by adsorption of polysomes derived from cells were isolated, immobilized antibodies which specifically against a modulator peptide are selected.

Eine radioaktiv markierte Modulatorpeptid-cDNA kann unter Verwendung der ausgewählten mRNA (aus den adsorbierten Polysomen) als Matrize synthetisiert werden. Die radioaktiv markierte mRNA oder cDNA kann anschließend als eine Sonde verwendet werden, um homologe Modulatorpeptid-DNA-Fragmente aus anderen genomischen DNA-Fragmenten zu identifizieren.A radiolabelled modulator peptide cDNA can be synthesized using the selected one mRNA (from the adsorbed polysomes) synthesized as a template become. The radioactively labeled mRNA or cDNA can then be referred to as a probe can be used to construct homologous modulator peptide DNA fragments from other genomic DNA fragments.

Wie oben erwähnt wurde, kann eine DNA-Sequenz, welche Gewichtsmodulator-Peptide, wie hier offenbart, kodiert, eher synthetisch hergestellt, als kloniert zu werden. Die DNA-Sequenz kann mit den geeigneten Codons für die OB-R-Aminosäuresequenzen entworfen werden. Im Allgemeinen wird man bevorzugte Codons für den beabsichtigten Wirt auswählen, wenn die Sequenz zur Expression verwendet werden wird. Die vollständige Sequenz kann aus überlappenden Oligo nukieotiden zusammengesetzt werden, welche durch Standardverfahren hergestellt wurden und zu einer volkständigen kodierenden Sequenz zusammengesetzt werden [siehe z. B. Edge, Nature, 292: 756 (1981), Nambair et al., Science, 223: 1299 (1984), Jay et al., J. Biol. Chem., 259: 6311 (1984)].As mentioned above can be a DNA sequence, which weight modulator peptides, as here discloses, encoded, more synthetically made, than cloned become. The DNA sequence can be tagged with the appropriate codons for the OB-R amino acid sequences be designed. In general, one will prefer codons for the intended Select host, when the sequence will be used for expression. The complete sequence can be overlapping Oligo nukieotiden be composed by standard methods and to a self-coding sequence be assembled [see, for. Edge, Nature, 292: 756 (1981), Nambair et al., Science, 223: 1299 (1984), Jay et al., J. Biol. Chem., 259: 6311 (1984)].

Synthetische DNA-Sequenzen, erlauben eine einfache Konstruktion von Genen, welche OB-R-Analoga exprimieren werden, wie oben beschrieben. Alternativ können DNA-kodierende Analoga durch stellengerichtete Mutagenese des nativen OB-R-Gens oder der cDNAs hergestellt werden, und Analoga können direkt unter Verwendung gängiger Polypeptidsynthese hergestellt werden.synthetic DNA sequences allow a simple construction of genes which OB-R analogs are expressed as described above. alternative can DNA-encoding analogues by site-directed mutagenesis of the native OB-R gene or cDNAs are prepared, and analogs can be found directly under Use more common Polypeptide synthesis can be produced.

Ein allgemeines Verfahren zur stellenspezifischen Aufnahme von unnatürlichen Aminosäuren in Proteine wird in Noren et al., Science, 244: 182–188 (1989) beschrieben. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um Analoga des OB-R-Polypeptids mit unnatürlichen Aminosäuren zu erzeugen.One general method for site-specific recording of unnatural amino acids in proteins is described in Noren et al., Science, 244: 182-188 (1989). described. This method can be used to analogues of the OB-R polypeptide with unnatural amino acids to create.

Aufgrund der Degeneriertheit kodierender Nukleotidsequenzen können andere DNA-Sequenzen, welche im Wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie ein OB-R-Gen kodieren, in der Ausführung der vorliegenden Offenbarung verwendet werden. Diese schließen allelische Gene, homologe Gene aus anderen Arten und Nukleotidsequenzen, welche alle oder Abschnitte der OB-R-Gene umfassen, welche durch die Substitution von verschiedenen Codons verändert sind, welche denselben Aminosäurerest innerhalb der Sequenz kodieren, wobei sie eine stille Veränderung hervorbringen, ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Ebenso schließen die hier offenbarten OB-R-Derivate jene ein, welche als primäre Aminosäuresequenz die Gesamtheit oder einen Teil der Aminosäuresequenz eines OB-R-Proteins enthalten, einschließlich veränderter Sequenzen, in welchen Reste innerhalb der Sequenz durch funktionell äquivalente Aminosäurereste substituiert werden, was zu einer konservativen Aminosäuresubstitution führt, wie oben in Verbindung mit den OB-R-Analoga beschrieben wurde, sind aber nicht darauf beschränkt.Due to the degeneracy of encoding nucleotide sequences, other DNA sequences which encode substantially the same amino acid sequence as an OB-R gene may be used in the practice of the present disclosure. These include allelic genes, homologous genes from other species, and nucleotide sequences that include all or portions of the OB-R genes that are altered by the substitution of different codons that encode the same amino acid residue within the sequence, producing a silent change, but are not limited to this. Also, the OB-R derivatives disclosed herein include those containing as a primary amino acid sequence all or part of the amino acid sequence of an OB-R protein, including altered sequences in which residues within the sequence are substituted by functionally equivalent amino acid residues leads to a conservative amino acid substitution as described above in connection with the OB-R analogs, but is not limited thereto.

Nicht kodierende NukleinsäurenNon-coding nucleic acids

Die vorliegende Offenbarung erstreckt sich auf die Herstellung von Antisense-Nukleotiden und Ribozymen, welche verwendet werden können, um mit der Expression der Proteine auf der translationalen Ebene zu interferieren. Dieser Ansatz verwendet Antisense-Nukleinsäure und Ribozyme, um die Translation einer spezifischen mRNA zu blockieren, entweder durch Maskieren der mRNA mit einer Antisense-Nukleinsäure oder durch Spalten derselben mit einem Ribozym.The present disclosure extends to the production of antisense nucleotides and ribozymes, which can be used to interact with the expression of proteins at the translational level interfere. This approach uses antisense nucleic acid and Ribozymes to block the translation of a specific mRNA, either by masking the mRNA with an antisense nucleic acid or by cleaving them with a ribozyme.

Antisense-Nukleinsäuren sind DNA- oder RNA-Moleküle, welche mindestens zu einem Abschnitt eines spezifischen mRNA-Moleküls komplementär sind [siehe Weintraub, Sci. Am., 262: 40–46 (1990), Marcus-Sekura, Anal. Biochem. 172: 289–295 (1988)]. In der Zelle hybridisieren sie mit dieser mRNA, wobei sie ein doppelsträngiges Molekül bilden. Die Zelle translatiert keine mRNA, welche in dieser doppelsträngigen Form komplex gebunden ist. Daher interferieren Antisense-Nukleinsäuren mit der Expression von mRNA in Protein. Oligomere von ungefähr 15 Nukleotiden und Moleküle, welche mit dem AUG-Initiationscodon hybridisieren, werden insbesondere wirksam sein, da sie einfach zu synthetisieren sind und wahrscheinlich weniger Probleme hervorbringen, als größere Moleküle, wenn sie in Gewichtsmodulator-Peptid herstellende Zellen eingeführt werden. Antisense-Verfahren wurden verwendet, um die Expression von vielen Genen in vitro zu inhibieren [Marcus-Sekura, 1988, supra, Harnbor et al., J. Exp. Med., 168: 1237–1245 (1988)].Antisense nucleic acids are DNA or RNA molecules, which are complementary to at least a portion of a specific mRNA molecule [see Weintraub, Sci. Am., 262: 40-46 (1990), Marcus-Sekura, Anal. Biochem. 172: 289-295 (1988)]. In the cell hybridize to this mRNA, forming a double-stranded molecule. The cell does not translate mRNA which is in this double-stranded form complex is bound. Therefore antisense nucleic acids interfere with the expression of mRNA in protein. Oligomers of about 15 nucleotides and molecules, which hybridize with the AUG initiation codon, in particular be effective as they are easy to synthesize and likely produce fewer problems than larger molecules when used in weight modulator peptide introduced producing cells become. Antisense methods were used to predict the expression of many genes in vitro [Marcus-Sekura, 1988, supra, Harnbor et al., J. Exp. Med., 168: 1237-1245 (1988)].

Ribozyme sind RNA-Moleküle, welche die Fähigkeit besitzen, andere einzelsträngige RNA-Moleküle spezifisch zu spalten, in einer Weise, die in etwa analog zu DNA-Restriktionsendonukleasen ist. Ribozyme wurden durch die Beobachtung entdeckt, dass bestimmte mRNAs die Fähigkeit aufweisen, ihre eigenen Introns herauszuschneiden. Durch Modifizieren der Nukleotidsequenz dieser RNAs waren Forscher in der Lage, Moleküle gentechnisch herzustellen, welche spezifische Nukleotidsequenzen in einem RNA-Molekül erkennen und es spalten [Cech, J. Am. Med. Assoc., 260: 3030–3034 (1988)]. Da Ribozyme sequenzspezifisch sind, werden nur mRNAs mit bestimmten Sequenzen inaktiviert.ribozymes are RNA molecules, which the ability own, other single-stranded Specific to RNA molecules in a manner analogous to DNA restriction endonucleases is. Ribozymes were discovered by the observation that certain mRNAs the ability have to cut out their own introns. By modifying In the nucleotide sequence of these RNAs, researchers were able to engineer molecules genetically which recognize specific nucleotide sequences in an RNA molecule and it breaks [Cech, J. Am. Med. Assoc., 260: 3030-3034 (1988)]. Because ribozymes are sequence specific, only mRNAs with certain sequences inactivated.

Forscher haben zwei Typen von Ribozymen identifiziert, den Tetrahymena-Typ und den "Hammerkopf"-Typ. Tetrahymena-Typ-Ribozyme erkennen Sequenzen mit vier Basen, während "Hammerkopf"-Typ Sequenzen mit elf bis achtzehn Basen erkennen. Je länger die Erkennungssequenz ist, desto wahrscheinlicher tritt sie ausschließlich in der Ziel-mRNA-Spezies auf. Daher sind Hammerkopf-Typ-Ribozyme gegenüber Tetrahymena-Typ-Ribozemen zum Inaktivieren einer spezifischen mRNA-Spezies vorzuziehen, und Erkennungssequenzen mit achtzehn Basen sind gegenüber kürzeren Erkennungssequenzen vorzuziehen.researcher have identified two types of ribozymes, the Tetrahymena type and the "hammerhead" type. Tetrahymena-type ribozymes recognize sequences with four bases, while "hammerhead" type sequences with eleven through eighteen Recognize bases. The longer the recognition sequence is the more likely it occurs exclusively in of the target mRNA species. Therefore, hammerhead-type ribozymes are resistant to Tetrahymena-type ribozymes to prefer to inactivate a specific mRNA species, and Eighteen base recognition sequences are against shorter recognition sequences preferable.

Die hier beschriebenen DNA-Sequenzen können daher verwendet werden, um Antisense-Moleküle gegen mRNAs für Gewichtsmodulator-Proteine und ihre Liganden und Ribozyme, welche diese spalten, herzustellen, wodurch die Expression des OB-R-Gens inhibiert wird und was zu einer erhöhten Gewichtszunahme und zur Adiposität führt.The Therefore, DNA sequences described herein can be used against antisense molecules against mRNAs for Weight modulator proteins and their ligands and ribozymes which these cleave to produce, thereby reducing the expression of the OB-R gene is inhibited and resulting in increased weight gain and adiposity leads.

In einer anderen Ausführungsform werden hier kurze Oligonukleotide, welche komplementär zu den kodierenden und komplementären Strängen der OB-R-Nukleinsäure oder zu nicht kodierenden Regionen des OB-R-Gens 5', 3' oder intern (intronisch) der kodierenden Region sind, offenbart. Solche Nukleinsäuren sind als Sonden geeignet, entweder als direkt markierte Oligonukleotid-Sonden oder als Primer für die Polymerase-Kettenreaktion zum Überprüfen der Anwesenheit von Mutationen im ob-r-Gen oder der Menge der Expression der OB-R-mRNA. Die nicht kodierenden Nukleinsäuren sind vorzugsweise aus dem humanen OB-R-Gen.In another embodiment Here are short oligonucleotides, which are complementary to the coding and complementary strands the OB-R nucleic acid or to non-coding regions of the OB-R gene 5 ', 3' or internal (intronic) of the coding region are disclosed. Such nucleic acids are suitable as probes, either as directly labeled oligonucleotide probes or as a primer for the polymerase chain reaction to check for the presence of mutations in the ob-r gene or the amount of expression of the OB-R mRNA. The non-coding nucleic acids are preferably from the human OB-R gene.

In einer spezifischen Ausführungsform stellen die nicht kodierenden Nukleinsäuren eine homologe Rekombination zur Integration eines amplifizierbaren Gens und/oder anderer regulatorischer Sequenzen in der Nähe des OB-R-Gens bereit, z. B. um größere Mengen der Expression des OB-R-Polypeptids bereitzustellen, oder um eine Mutation in den regulatorischen Sequenzen des ob-r-Gens zu überwinden, welche geeignete Mengen der Expression des OB-R-Polypeptids verhindert [siehe die internationale Patentveröffentlichung WO 91/06666 , veröffentlicht am 16. Mai 1991 von Skoultchi, internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 91/09955 , veröffentlicht am 11. Juli 1991 von Chappel, siehe ebenfalls die internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 90/14092 , veröffentlicht am 29. November 1990 von Kucherlapati und Campbell].In a specific embodiment, the noncoding nucleic acids provide homologous recombination for integration of an amplifiable gene and / or other regulatory sequences in the vicinity of the OB-R gene, e.g. To provide greater levels of expression of the OB-R polypeptide or to overcome a mutation in the regulatory sequences of the ob-r gene which prevents appropriate levels of expression of the OB-R polypeptide [see International Patent Publication WO 91/06666 , published May 16, 1991 by Skoultchi, International Patent Publication No. WO 91/09955 , published July 11, 1991 by Chappel. WO 90/14092 , published November 29, 1990 by Kucherlapati and Campbell].

Herstellung des OB-R-Polypeptids: Expression und SyntheseProduction of the OB-R polypeptide: Expression and synthesis

Transkriptionelle und translationelle Kontrollsequenzen sind regulatorische DNA-Sequenzen, wie Promotoren, Enhancer, Terminatoren und desgleichen, welche die Expression einer kodierenden Sequenz in einer Wirtszelle bewirken. In eukaryotischen Zellen sind Polyadenylierungssignale Kontrollsequenzen.transcriptional and translational control sequences are regulatory DNA sequences, such as promoters, Enhancers, terminators, and the like which express the expression of a effect coding sequence in a host cell. In eukaryotic Cells are polyadenylation signals control sequences.

Eine kodierende Sequenz steht "unter der Kontrolle" von transkriptionellen und translationellen Kontrollsequenzen in einer Zelle, wenn eine RNA-Polymerase die kodierende Sequenz in mRNA transkribiert, welche anschließend trans-RNA gespleißt und in das Protein translatiert wird, welches durch die kodierende Sequenz kodiert wird.A coding sequence is "under the control "of transcriptional and translational control sequences in one Cell, when an RNA polymerase transcribes the coding sequence into mRNA, which subsequently Spliced trans-RNA and translated into the protein expressed by the coding protein Sequence is encoded.

Eine "Signalsequenz" wird am Anfang der kodierenden Sequenz eines Proteins eingeschlossen, um auf der Oberfläche einer Zelle exprimiert zu werden. Diese Sequenz kodiert ein Signalpeptid, N-terminal zum reifen Polypeptid, welches die Wirtszelle steuert, das Polypeptid zu translozieren. Der Begriff "Translokations-Signalsequenz" wird hier ebenfalls verwendet, um diese Art der Signalsequenz zu bezeichnen. Translokations-Signalsequenzen können mit einer Vielzahl von Proteinen verbunden gefunden werden, welche nativ für Eukaryoten und Prokaryoten sind und häufig in beiden Typen von Organismen funktionsfähig sind. Gemäß der vorliegenden Offenbarung umfassen die Aminosäurereste 1–27 der Mäuse- und humanen OB-R-Polypeptide (siehe SEQ ID NR: 8, 10) das Signalpeptid. In einer anderen Ausführungsform umfassen die Aminosäurereste 1–22 das Signalpeptid [Tartaglia et al., Cell, 83: 1263 (1995)].A "signal sequence" is at the beginning of Encoding sequence of a protein included on the surface of a protein Cell to be expressed. This sequence encodes a signal peptide, N-terminal to the mature polypeptide that controls the host cell, to translocate the polypeptide. The term "translocation signal sequence" is also used herein to refer to these Designate type of signal sequence. Translocation signal sequences can can be found associated with a variety of proteins natively for Eukaryotes and prokaryotes are common in both types of organisms functioning are. According to the present Revelation includes the amino acid residues 1-27 of the mouse and human OB-R polypeptides (see SEQ ID NO: 8, 10) the signal peptide. In another embodiment include the amino acid residues 1-22 the Signal peptide [Tartaglia et al., Cell, 83: 1263 (1995)].

Eine DNA-Sequenz ist mit einer Expressions-Kontrollsequenz "operativ verbunden", wenn die Expressions-Kontrollsequenz die Transkription und Translation dieser DNA-Sequenz kontrolliert und reguliert. Der Begriff "operativ verbunden" schließt das Aufweisen eines geeigneten Startsignals (z. B. ATG) vor der DNA-Sequenz ein, die exprimiert werden soll, und das Beibehalten des richtigen Leserahmens, um eine Expression der DNA-Sequenz unter der Kontrolle der Expressions-Kontrollsequenz und eine Herstellung des gewünschten Produkts, welches durch die DNA-Sequenz kodiert wird, zu erlauben. Wenn ein Gen, von dem gewünscht wird, dass es in ein rekombinantes DNA-Molekül inseriert wird, kein geeignetes Startsignal enthält, kann ein solches Startsignal strangaufwärts (5') und im Leserahmen des Gens inseriert werden.A DNA sequence is "operably linked" to an expression control sequence when the expression control sequence controls the transcription and translation of this DNA sequence and regulated. The term "operational Connected "includes having a suitable start signal (eg ATG) before the DNA sequence, the is to be expressed, and maintaining the correct reading frame, to an expression of the DNA sequence under the control of the expression control sequence and a preparation of the desired Product which is encoded by the DNA sequence. If a gene of which desired is not suitable for being inserted into a recombinant DNA molecule Start signal contains, can such a start signal is inserted upstream (5 ') and in frame of the gene become.

Eine "Promotorsequenz" ist eine regulatorische DNA-Region, welche in der Lage zum Binden einer RNA-Polymerase in einer Zelle und zum Initiieren einer Transkription einer strangabwärts (3'-Richtung) gelegenen kodierenden Sequenz ist. Für Zwecke der Definition der vorliegenden Offenbarung ist die Promotorsequenz an ihrem 3'-Terminus durch die Transkriptions-Initiationsstelle begrenzt und erstreckt sich strangaufwärts (5'-Richtung), um die minimale Anzahl von Basen oder Elementen einzuschließen, welche nötig sind, um die Transkription in Mengen, welche über dem Hintergrund nachweisbar sind, zu initiieren. Innerhalb der Promotorsequenz werden eine Transkriptions-Initiationsstelle (einfach definiert zum Beispiel durch Kartierung mit Nuklease S1), sowie Protein-Bindungsdomänen (Konsensussequenzen), welche verantwortlich für das Binden von RNA-Polymerase sind, gefunden werden.A "promoter sequence" is a regulatory one DNA region capable of binding an RNA polymerase in a cell and initiate transcription of a downstream (3 'direction) located coding sequence. For Purpose of the definition of the present disclosure is the promoter sequence at its 3'-terminus bounded and extended by the transcription initiation site up the hill (5'-direction) to to include the minimum number of bases or elements which necessary, to transcription in amounts detectable over the background are to initiate. Within the promoter sequence will become a transcription initiation site (simply defined for example by mapping with nuclease S1), as well as protein binding domains (Consensus sequences) which are responsible for the binding of RNA polymerase, being found.

Eine andere Eigenschaft dieser Offenbarung ist die Expression der hier offenbarten DNA-Sequenzen. Wie es im Stand der Technik gut bekannt ist, können DNA-Sequenzen exprimiert werden, indem sie operativ mit einer Expressions-Kontrollsequenz in einem geeigneten Expressionsvektor verbunden werden, und indem dieser Expressionsvektor eingesetzt wird, um einen geeigneten einzelligen Wirt zu transformieren.A another feature of this disclosure is the expression of here disclosed DNA sequences. As is well known in the art is, can DNA sequences expressed by being operatively linked to an expression control sequence in a suitable Expression vector can be connected, and by this expression vector is used to transform a suitable unicellular host.

Ein solches operatives Verbinden einer DNA-Sequenz, wie hier offenbart mit einer Expressions-Kontrollsequenz schließt natürlich, wenn nicht bereits Teil der DNA-Sequenz, das Bereitstellen eines Initiationscodons, ATG, im richtigen Leserahmen strangaufwärts von der DNA-Sequenz ein.One such operatively linking a DNA sequence as disclosed herein with an expression control sequence, of course, if not already part of it the DNA sequence, providing an initiation codon, ATG, in the correct reading frame upstream from the DNA sequence.

Eine weite Vielzahl von Wirt/Expressionsvektor-Kombinationen kann beim Exprimieren der hier offenbarten DNA-Sequenzen eingesetzt werden. Geeignete Expressionsvektoren können zum Beispiel aus Segmenten chromosomaler, nicht chromosomaler und synthetischer DNA-Sequenzen bestehen. Geeignete Vektoren schließen Derivate von SV40 und bekannte bakterielle Plasmide ein, z. B. E. coli-Plasmide, col E1, pCR1, pBR322, pMB9, pUC oder pUC-Plasmidderivate, z. B. pGEX-Vektoren, pET-Vektoren, pmal-c, pFLAG, usw. und ihre Derivate, Plasmide, wie RP4, Pagen-DNAs, z. B. die vielen Derivate von Phage λ, wie NM989 und andere Phagen-DNA, z. B. M13- und filamentöse einzelsträngige Phagen-DNA, Hefe-Plasmide, wie das 2μ-Plasmid oder Derivate davon, Vektoren, die in eukaryotischen Zellen geeignet sind, wie Vektoren, die in Insekten- oder Säugetierzellen geeignet sind, Vektoren, die von Kombinationen aus Plasmiden und Phagen-DNAs abgeleitet sind, wie Plasmide, die modifiziert wurden, um Phagen-DNA oder andere Expressions-Kontrollsequenzen einzusetzen, und desgleichen.A Wide variety of host / expression vector combinations can be found in the Expressing the DNA sequences disclosed herein. Suitable expression vectors can for example, from segments chromosomal, non-chromosomal and consist of synthetic DNA sequences. Suitable vectors include derivatives of SV40 and known bacterial plasmids, e.g. B. E. coli plasmids, col E1, pCR1, pBR322, pMB9, pUC or pUC plasmid derivatives, e.g. B. pGEX vectors, pET vectors, pmal-c, pFLAG, etc., and their derivatives, Plasmids such as RP4, page DNAs, e.g. B. the many derivatives of phage λ, such as NM989 and other phage DNA, e.g. B. M13 and filamentous single-stranded phage DNA, Yeast plasmids, like the 2μ plasmid or derivatives thereof, vectors useful in eukaryotic cells are such as vectors that are useful in insect or mammalian cells, Vectors derived from combinations of plasmids and phage DNAs, such as plasmids that have been modified to phage DNA or others Use expression control sequences, and the like.

Irgendeine aus der breiten Vielzahl der Expressions-Kontrollsequenzen – Sequenzen, welche die Expression einer DNA-Sequenz, die operativ mit ihr verbunden ist, kontrollieren – kann in diesen Vektoren verwendet werden, um die hier offenbarten DNA-Sequenzen zu exprimieren. Solche geeigneten Expressions-Kontrollsequenzen schließen zum Beispiel die frühen oder späten Promotoren von SV40, CMV, Vaccinia, Polyoma oder Adenovirus, das lac-System, das trp-System, das TAC-System, das TRC-System, das LTR-System, die Haupt-Operator- und -Promotor-Regionen des Phagen λ, die Kontrollregionen des fd-Hüllproteins, den Promotor für die 3-Phosphoglyceratkinase oder andere glykolytische Enzyme, die Promotoren der sauren Phosphatase (z. B. Pho5), den AOX 1-Promotor von methylotropher Hefe, die Promotoren des α-Mating-Faktors der Hefe und andere Sequenzen ein, von welchem bekannt ist, dass sie die Expression von Genen prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen oder ihrer Viren und verschiedene Kombinationen davon kontrollieren.any from the wide variety of expression control sequences - sequences, which involves the expression of a DNA sequence that is operatively linked to it is, can control - can used in these vectors to the DNA sequences disclosed herein to express. Such suitable expression control sequences include Example the early ones or late Promoters of SV40, CMV, vaccinia, polyoma or adenovirus, the lac system, the trp system, the tac system, the trc system, the LTR system, the major phage λ operator and promoter regions, the control regions of the fd coat protein, the Promoter for the 3-phosphoglycerate kinase or other glycolytic enzymes, the promoters the acid phosphatase (eg Pho5), the AOX 1 promoter of methylotrophic Yeast, the promoters of the α-mating factor yeast and other sequences known to be they express the expression of prokaryotic or eukaryotic genes Control cells or their viruses and various combinations of them.

Eine breite Vielzahl von einzelligen Wirtszellen ist ebenfalls beim Exprimieren der hier offenbarten DNA-Sequenzen geeignet. Die Wirte können gut bekannte eukaryotische und prokaryotische Wirte einschließen, wie Stämme von E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, Pilze, wie Hefen (Saccharomyces und methylotrophe Hefe, wie Pichia, Candida, Hansenula und Torulopsis) und Tierzellen, wie CHO-, R1.1-, B-W- und LM-Zellen, afrikanische grüne Meerkatzen-Nierenzellen (z. B. COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 und BMT10), Insektenzellen (z. B. Sf9) und humane Zellen und Pflanzenzellen in Gewebekultur. Insbesondere bevorzugt ist eine Expression in Baculovirus mit einem Insekten-Signalpeptid, welches das OB-R-Signalpeptid ersetzt, zum Beispiel im Vektor pMelBac (Invitrogen, Katalog Nr. V1950-20).A wide variety of unicellular host cells are also expressed the DNA sequences disclosed herein are suitable. The hosts are good include known eukaryotic and prokaryotic hosts, such as strains of E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, fungi, such as yeasts (Saccharomyces and methylotrophic yeast, such as Pichia, Candida, Hansenula and torulopsis) and animal cells, such as CHO, R1.1, B-W and LM cells, African green Meerkat kidney cells (eg COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 and BMT10), insect cells (eg Sf9) and human cells and plant cells in tissue culture. Particularly preferred is expression in baculovirus with a Insect signal peptide replacing the OB-R signal peptide, for example in the vector pMelBac (Invitrogen, catalog no. V1950-20).

Es wird verstanden werden, dass nicht alle Vektoren, Expressions-Kontrollsequenzen und Wirte gleich gut funktionieren werden, um die hier offenbarten DNA-Sequenzen zu exprimieren. Weder werden alle Wirte gleich gut mit demselben Expressionssystem funktionieren. Der Fachmann wird jedoch in der Lage sein, die richtigen Vektoren, Expressions-Kontrollsequenzen und Wirte ohne überflüssiges Experimentieren auszuwählen, um die gewünschte Expression zu erreichen, ohne vom Schutzumfang dieser Offenbarung abzuweichen. Zum Beispiel muss beim Auswählen eines Vektors der Wirt berücksichtigt werden, da der Vektor in ihm funktionieren muss. Die Kopienanzahl des Vektors, die Fähigkeit, die Kopienzahl zu kontrollieren und die Expression von irgendwelchen anderen Proteinen, welche durch den Vektor kodiert werden, wie antibiotische Marker, werden ebenfalls berücksichtigt werden.It will be understood that not all vectors, expression control sequences and hosts will work equally well to those disclosed here Express DNA sequences. Neither will all hosts be equally good work with the same expression system. The specialist will however, be able to find the correct vectors, expression control sequences and hosts without unnecessary experimentation select to the desired Expression without departing from the scope of this disclosure departing. For example, when selecting a vector, the host must considered because the vector has to work in it. The number of copies of the vector, the ability to control the copy number and the expression of any other proteins encoded by the vector, such as antibiotic Markers are also considered become.

Beim Auswählen einer Expressions-Kontrollsequenz wird normalerweise eine Vielzahl von Faktoren berücksichtigt. Diese schließen zum Beispiel die relative Stärke des Systems, seine Kontrollierbarkeit und seine Kompatibilität mit der bestimmten DNA-Sequenz oder dem Gen, welche/s exprimiert werden soll, insbesondere bezüglich möglicher Sekundärstrukturen, ein. Geeignete einzellige Wirte werden unter Berücksichtigung von z. B. ihrer Kompatibilität mit dem gewählten Vektor, ihren Sekretionseigenschaften, ihrer Fähigkeit, Proteine richtig zu falten und ihren Fermentationserfordernissen, sowie der Toxizität des durch die zu exprimierenden DNA-Sequenzen kodierten Produkts für den Wirt und die Einfachheit der Reinigung der Expressionsprodukte ausgewählt werden.At the Choose an expression control sequence will usually be a variety taken into account by factors. Close this for example, the relative strength of the system, its controllability and its compatibility with the certain DNA sequence or gene expressed should, especially regarding potential Secondary structures one. Suitable unicellular hosts are taking into account z. B. her compatibility with the chosen one Vector, its secretory properties, its ability to properly access proteins and their fermentation requirements, as well as the toxicity of the the DNA sequences to be expressed encoded product for the host and the ease of purification of the expression products can be selected.

Unter Berücksichtigung dieser und anderer Faktoren wird der Fachmann in der Lage sein, eine Vielzahl von Vektor/Expressions-Kontrollsequenz/Wirt-Kombinationen zu konstruieren, welche die hier offenbarten DNA-Sequenzen bei Fermentation oder in einer Tierkultur im großen Maßstab zu exprimieren.Under consideration these and other factors, the skilled person will be able to a variety of vector / expression control sequence / host combinations construct the DNA sequences disclosed herein on fermentation or in a big animal culture scale to express.

In einer spezifischen Ausführungsform kann ein OB-R-Fusionsprotein exprimiert werden. Ein OB-R-Fusionsprotein umfasst mindestens einen funktionell aktiven Abschnitt eines nicht OB-R-Proteins, welches über eine Peptidbindung mit mindestens einem funktionell aktiven Abschnitt eines OB-Polypeptids verbunden ist. Die nicht OB-R-Sequenzen können amino- oder carboxylterminal zu den OB-R-Sequenzen liegen. Zum Beispiel wird beim Herstellen "künstlicher" Rezeptoren das Verbinden der OB-R-kodierten, kodierenden Domäne für den Leptin-Bindungs-(extracytoplasmatischen)-Abschnitt an der 5'-Position ein Protein ergeben, welches Leptin bindet und einige andere Wirkungen basierend auf der Aktivität des nicht OB-R-Proteins vermittelt. Umgekehrt wird ein Verbinden eines unterschiedlichen Proteins (wie eines Wachstumsfaktors, Cytokins oder einer kodierenden Domäne einer Hormonrezeptor-Bindung) 5' mit einer cytoplasmatischen kodierenden OB-R-Domäne (welche "Box 1" und "Box 2" enthält) eine Aktivierung über OB-R beim Binden eines anderen Liganden als Leptin erlauben. In einer anderen Ausführungsform kann ein chimäres Konstrukt einfach die Expression von OB-R unterstützen. In einer spezifischen Ausführungsform, infra, werden OB-Re und Fragmente davon mit einem N-terminalen Melittin-Signalpeptid exprimiert.In a specific embodiment For example, an OB-R fusion protein can be expressed. An OB-R fusion protein does not include at least one functionally active portion of one OB-R protein, which over a peptide bond with at least one functionally active portion an OB polypeptide. The non-OB-R sequences can be amino- or carboxyl terminal to the OB-R sequences. For example, will in making "artificial" receptors connecting the OB-R encoded coding domain for the leptin-binding (extracytoplasmic) segment at the 5'-position produce a protein that binds leptin and some other effects based on the activity of the non-OB-R protein mediated. Conversely, a connection is made a different protein (such as a growth factor, cytokine or a coding domain a hormone receptor binding) 5 'with a cytoplasmic coding OB-R domain (which contains "Box 1" and "Box 2") activation via OB-R when binding a ligand other than leptin. In a another embodiment can be a chimera Construct simply to support the expression of OB-R. In a specific embodiment, infra, OB-Re and fragments thereof are linked to an N-terminal melittin signal peptide expressed.

In einem anderen Aspekt kann der pGEX-Vektor [Smith et al., Gene 67: 31–40 (1988)] verwendet werden. Dieser Vektor fusioniert die Schistosoma japonicum-Glutathion-S-Transferase-cDNA mit der Sequenz von Interesse. Bakterielle Proteine werden geerntet, und rekombinante Proteine können schnell auf einer reduzierten Glutathion-Affinitätssäule gereinigt werden. Der GST-Träger kann nachfolgend von den Fusionsproteinen durch Spaltung mit stellenspezifischen Proteasen gespalten werden. Nach der Spaltung können der Träger und das ungespaltene Fusionsprotein durch Absorption an Glutathionagarose entfernt werden. Schwierigkeiten mit dem System treten manchmal auf, wenn das kodierte Protein in wässrigen Lösungen unlöslich ist.In another aspect, the pGEX vector [Smith et al., Gene 67: 31-40 (1988)] can be used. This vector fuses the Schistosoma japonicum glutathione S-transferase cDNA with the sequence of interest. Bacterial proteins are harvested, and recombinant proteins can be rapidly absorbed on a re purified glutathione affinity column. The GST carrier can subsequently be cleaved from the fusion proteins by cleavage with site-specific proteases. After cleavage, the carrier and the uncleaved fusion protein can be removed by absorption on glutathione agarose. Difficulties with the system sometimes occur when the encoded protein is insoluble in aqueous solutions.

Eine Expression von rekombinanten Proteinen in bakteriellen Systemen kann zu einer falschen Faltung des exprimierten Proteins führen, was eine Rückfaltung erfordert. Das rekombinante Protein kann vor oder nach der Spaltung rückgefaltet werden, um eine funktionell aktives OB-Polypeptid zu bilden. Das OB-Polypeptid kann durch die Schritte des (i) Inkubierens des Proteins in einem denaturierenden Puffer, welcher ein Reduktionsmittel enthält, und anschließend (ii) des Inkubierens des Proteins in einem Puffer, welcher ein Oxidationsmittel enthält und vorzugsweise ebenfalls ein Protein-Stabilisierungsmittel oder ein chaotropisches Mittel oder beides enthält, rückgefaltet werden. Geeignete Redox (Reduktions/Oxidations)-Mittelpaare schließen reduziertes Glutathion/Glutathiondisulfid, Cystin/Cystein, Cystamin/Cysteamin und 2-Mercaptoethanol/2-Hydroxyethyldisulfid ein, sind aber nicht darauf beschränkt. In einem bestimmten Aspekt kann das Fusionsprotein in einem Denaturierungsmittel, wie Harnstoff, vor dem Wechsel in den Reduktionspuffer gelöst werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Protein ebenfalls gereinigt, z. B. durch Ionenaustausch- oder Ni-Chelatbildungs-Chromatographie, vor dem Wechsel in den Reduktionspuffer. Denaturierungsmittel schließen Harnstoff und Guanidin-HCl ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Das rekombinante Protein wird anschließend ungefähr mindestens 10-fach, weiter bevorzugt ungefähr 100-fach in einem Oxidationspuffer verdünnt, welcher ein Oxidationsmittel enthält, wie, aber nicht beschränkt auf 0,1 M Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 1 mM EDTA, 0,15 M NaCl, 0,3 M oxidiertes Glutathion. Das Fusionsprotein wird anschließend für ungefähr 1 bis ungefähr 24 Stunden, vorzugsweise ungefähr 2 bis ungefähr 16 Stunden bei Raumtemperatur im Oxidationspuffer inkubiert. Der Oxidationspuffer kann ein Protein-Stabilisierungsmittel umfassen, z. B. einen Zucker, einen Alkohol oder Ammoniumsulfat. Der Oxidationspuffer kann weiterhin ein chaotropes Mittel in niedriger Konzentration umfassen, um falsche intermolekulare Interaktionen zu destabilisieren und daher eine richtige Faltung zu fördern. Geeignete chaotrope Mittel schließen ein Detergens, ein Polyol, L-Arginin, Guanidin-HCl und Polyethylenglykol (PEG) ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Es ist wichtig, eine ausreichend niedrige Konzentration des chaotropen Mittels zu verwenden, um eine Denaturierung des Proteins zu vermeiden. Das rückgefaltete Protein kann mindestens ungefähr 10-fach, weiter bevorzugt in der Menge, in der es im Oxidationspuffer verdünnt wurde, konzentriert werden.A Expression of recombinant proteins in bacterial systems can lead to a wrong folding of the expressed protein, which a refolding requires. The recombinant protein may be before or after cleavage refolded to form a functionally active OB polypeptide. The OB polypeptide can be characterized by the steps of (i) incubating the protein in a denaturing buffer containing a reducing agent, and subsequently (ii) incubating the protein in a buffer which is an oxidizing agent contains and preferably also a protein stabilizer or a chaotropic agent or both, to be refolded. suitable Redox (reduction / oxidation) middle pairs close reduced Glutathione / glutathione disulfide, cystine / cysteine, cystamine / cysteamine and 2-mercaptoethanol / 2-hydroxyethyl disulfide, but are not limited to this. In one particular aspect, the fusion protein may be present in a denaturant, like urea, are dissolved in the reduction buffer before changing. In a preferred embodiment the protein is also purified, e.g. B. by ion exchange or Ni chelation chromatography, before changing to the reduction buffer. Denaturants include urea and guanidine HCl, but are not limited thereto. The recombinant protein is then further at least about 10-fold, more preferred approximately Diluted 100 times in an oxidation buffer containing an oxidizing agent contains like, but not limited to 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.15 M NaCl, 0.3 M oxidized Glutathione. The fusion protein is then incubated for about 1 to about 24 hours, preferably about 2 to about Incubated for 16 hours at room temperature in the oxidation buffer. Of the Oxidation buffer may comprise a protein stabilizer, z. As a sugar, an alcohol or ammonium sulfate. The oxidation buffer may further comprise a low concentration chaotropic agent, to destabilize false intermolecular interactions and therefore to promote proper folding. Suitable chaotropic agents include a detergent, a polyol, L-arginine, guanidine-HCl and polyethylene glycol (PEG) are but not limited to this. It is important to have a sufficiently low concentration of the chaotropic To use means to avoid denaturation of the protein. The refolded protein at least about 10-fold, more preferably in the amount in which it is in the oxidation buffer dilute was concentrated.

Alternativ umfasst diese Offenbarung eine periplasmatische Expression eines Proteins, wie hier offenbart.alternative For example, this disclosure includes periplasmic expression of a Protein, as disclosed here.

Bakterielle Fermentationsverfahren können ebenfalls zu einer rekombinanten Proteinpräparation führen, welche unverträgliche Mengen von Endotoxinen enthält. Daher umfasst diese Offenbarung die Entfernung solcher Endotoxine, z. B. durch die Verwendung Endotoxin spezifischer Antikörper oder anderer Endotoxin bindender Moleküle. Die Anwesenheit von Endotoxinen kann durch Standardtechniken bestimmt werden, wie durch den Einsatz von E-TOXATE-Reagenzien (Sigma, St. Louis, Missouri) oder mit Bioassays.bacterial Fermentation can also lead to a recombinant protein preparation, which incompatible amounts of endotoxins. Therefore, this disclosure includes the removal of such endotoxins, z. B. by the use of endotoxin-specific antibodies or other endotoxin binding molecules. The presence of endotoxins can be determined by standard techniques, such as by use from E-TOXATE reagents (Sigma, St. Louis, Missouri) or with bioassays.

Zusätzlich zu dem spezifischen Beispiel schlagen die vorliegenden Erfinder die Verwendung von Baculovirus-, Säugetier- und Hefe-Expressionssystemen vor, um das ob-Protein zu exprimieren. Zum Beispiel in Baculovirus-Expressionssystemen sowohl nicht Fusions-Transfervektoren, wie, aber nicht beschränkt auf, pVL941 (BamHI-Klonierungsstelle, Summers), pVL1393 (BamHI-, SmaI-, XbaI-, EcoRI-, NotI-, XmaIII-, BglII- und PstI-Klonierungsstelle, Invitrogen), pVL1392 (BglII-, PstI-, NotI-, XmaIII-, EcoRI-, XbaI-, SmaI- und BamHI-Klonierungsstelle, Summers und Invitrogen) und pBlueBacIII (BamHI-, BglII-, PstI-, NcoI- und HindIII-Klonierungsstelle, wobei blau/weiß Rekombinanten-Screening der möglich ist, Invitrogen), als auch Fusions-Transfervektoren, wie, aber nicht beschränkt auf, pAc700 (BamHI- und KpnI-Klonierungsstelle, wobei die BamHI-Erkennungsstelle mit dem Initiationscodon beginnt, Summers), pAc701 und pAc702 (dieselben wie pAc700 mit unterschiedlichen Leserahmen), pAc360 (BamHI-Klonierungsstelle 36 Basenpaare strangabwärts eines Polyhedrin-Initiationscodons, Invitrogen(195)) und pBlueBacHisA, B, C (drei verschiedene Leserahmen mit BamHI-, BglII-, PstI-, NcoI- und HindIII-Klonierungsstelle, einem N-terminalen Peptid für eine ProBond-Reinigung und blau/weiß Rekombinanten-Screening der Plaques, Invitrogen (220)). In einer spezifischen Ausführungsform, infra, wird der pMel Bac-Expressionsvektor (Invitrogen) eingesetzt.In addition to In the specific example, the present inventors propose the Use of baculovirus, mammalian and yeast expression systems to express the ob protein. For example, in baculovirus expression systems, both non-fusion transfer vectors, like, but not limited pVL941 (BamHI cloning site, Summers), pVL1393 (BamHI, SmaI, XbaI, EcoRI, NotI, XmaIII, BglII and PstI cloning site, Invitrogen), pVL1392 (BglII, PstI, NotI, XmaIII, EcoRI, XbaI, SmaI and BamHI cloning site, Summers and Invitrogen) and pBlueBacIII (BamHI, BglII, PstI, NcoI and HindIII cloning site, with blue / white recombinant screening the possible Invitrogen), as well as fusion transfer vectors, but not limited on, pAc700 (BamHI and KpnI cloning site, the BamHI recognition site starting with the initiation codon, Summers), pAc701 and pAc702 (the same like pAc700 with different reading frames), pAc360 (BamHI cloning site 36 base pairs downstream of one Polyhedrin initiation codons, Invitrogen (195)) and pBlueBacHisA, B, C (three different reading frames with BamHI, BglII, PstI, NcoI) and HindIII cloning site, an N-terminal peptide for ProBond purification and blue / white recombinant screening plaques, Invitrogen (220)). In a specific embodiment, infra, becomes the pMel Bac expression vector (Invitrogen) used.

Säugetier-Expressionsvektoren, welche für die Verwendung in dieser Offenbarung vorgesehen sind, schließen Vektoren mit induzierbaren Promotoren, wie den Dihydrofolatreduktase-(DHFR)-Promotor, z. B. irgendeinen Expresionsvektor mit einem DHFR-Expressionsvektor oder einen DHFR/Methotrexat-Koamplifikationsvektor, wie pED (PstI-, SalI-, SbaI, SmaI- und EcoRI-Klonierungsstelle, wobei der Vektor sowohl das klonierte Gen, als auch DHFR exprimiert [siehe Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991)]) ein. Alternativ ein Glutaminsynthetase/Methioninsulfoximin-Koamplifikationsvektor, wie pEE14 (HindIII-, XbaI-, SmaI-, SbaI-, EcoRI- und BclI-Klonierungsstelle, in welcher der Vektor Glutaminsynthase und das klonierte Gen exprimiert, Celltech). In einer anderen Ausführungsform kann ein Vektor, welcher die episomale Expression unter Kontrolle des Epstein Barr Virus (EBV) steuert, verwendet werden, wie pREP4 (BamHI-, SfiI-, XhoI-, NotI-, NheI-, HindIII-, NheI-, PvuII- und KpnI-Klonierungsstelle, konstitutiver RSV-LTR-Promotor, selektierbarer Hygromycin-Marker, Invitrogen), pCEP4 (BamHI-, SfiI-, XhoI-, NotI-, NheI-, HindIII-, NheI-, PvuII- und KpnI-Klonierungsstelle, konstitutives hCMV Immediate Early-Gen, selektierbarer Hygromycin-Marker, Invitrogen), pMEP4 (KpnI-, PvuI-, NheI-, HindIII-, NotI-, XhoI-, SfiI-, BamHI-Klonierungsstelle, induzierbarer Metallothionein IIa-Genpromotor, selektierbarer Hygromycin-Marker, Invitrogen), pREP8 (BamHI-, XhoI-, NotI-, HindIII-, NheI- und KpnI-Klonierungsstelle, RSV-LTR-Promotor, selektierbarer Histidinolmarker, Invitrogen), pREP9 (KpnI-, NheI-, HindIII-, NotI-, XhoI-, SfiI- und BamHI-Klonierungsstelle, RSV-LTR-Promotor, selektierbarer G418-Marker, Invitrogen) und pEBVHis (RSV-LTR-Promotor, selektierbarer Hygromycin-Marker, N-terminales Peptid, welches über ProBond-Harz reinigbar ist und durch Enterokinase gespalten wird, Invitrogen). Selektierbare Säugetier-Expressionsvektoren zur Verwendung in dieser Offenbarung schließen pRc/CMV (HindIII-, BstXI-, NotI-, SbaI- und ApaI-Klonierungsstelle, G418-Selektion, Invitrogen), pRc/RSV (HindIII-, SpeI-, BstXI-, NotI-, XbaI-Klonierungsstelle, G418-Selektion, Invitrogen) und andere ein. Vaccinia Virus-Säugetier-Expressionsvektoren [siehe Kaufman, 1991, supra] zur Verwendung gemäß dieser Offenbarung schließen pSCI1 (SmaI-Klonierungsstelle, TK- und β-gal-Selektion), pMJ601 (SalI-, SmaI-, AflI-, NarI-, BspMII-, BamHI-, ApaI-, NheI-, SacII-, KpnI- und HindIII-Klonierungsstelle, TK- und β-gal-Selektion) und pTKgptF1S (EcoRI-, PstI-, SalI-, AccI-, HindII-, SbaI-, BamHI- und Hpa-Klonierungsstelle, TK- oder XPRT-Selektion) ein, sind aber nicht darauf beschränkt.Mammalian expression vectors contemplated for use in this disclosure include vectors with inducible promoters, such as the dihydrofolate reductase (DHFR) promoter, e.g. For example, any expression vector with a DHFR expression vector or a DHFR / methotrexate co-amplification vector such as pED (PstI, SalI, SbaI, SmaI and EcoRI cloning site, the vector expressing both the cloned gene and DHFR [see Kaufman , Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991)]) one. Alternatively, a glutamine synthetase / methionine sulfoximine co-amplification vector such as pEE14 (HindIII, XbaI, SmaI, SbaI, EcoRI and BclI cloning site in which the vector expresses glutamine synthase and the cloned gene, Celltech). In another embodiment, a vector which directs episomal expression under the control of Epstein Barr virus (EBV) may be used, such as pREP4 (BamHI, SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindIII, NheI, PvuII and KpnI cloning site, constitutive RSV LTR promoter, selectable hygromycin marker, Invitrogen), pCEP4 (BamHI, SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindIII, NheI, PvuII and KpnI). Cloning site, constitutive hCMV immediate early gene, hygromycin selectable marker, Invitrogen), pMEP4 (KpnI, PvuI, NheI, HindIII, NotI, XhoI, SfiI, BamHI cloning site, inducible metallothionein IIa gene promoter, hygromycin selectable marker, Invitrogen), pREP8 (BamHI, XhoI, NotI, HindIII, NheI and KpnI cloning site, RSV LTR promoter, selectable histidinol label, Invitrogen), pREP9 (KpnI, NheI, HindIII , NotI, XhoI, SfiI and BamHI cloning site, RSV LTR promoter, selectable G418 marker, Invitrogen) and pEBVHis (RSV LTR promoter, selectable hygromycin marker, N-terminal peptide which is purifiable via ProBond resin and cleaved by enterokinase, Invitrogen). Selectable mammalian expression vectors for use in this disclosure include pRc / CMV (HindIII, BstXI, NotI, SbaI and ApaI cloning site, G418 selection, Invitrogen), pRc / RSV (HindIII, SpeI, BstXI, NotI, XbaI cloning site, G418 selection, Invitrogen) and others. Vaccinia virus mammalian expression vectors [see Kaufman, 1991, supra] for use in this disclosure include pSCI1 (SmaI cloning site, TK and β-gal selection), pMJ601 (SalI, SmaI, AflI, NarI, BspMII, BamHI, ApaI, NheI, SacII, KpnI and HindIII cloning site, TK and β-gal selection) and pTKgptF1S (EcoRI, PstI, SalI, AccI, HindII, SbaI , BamHI and Hpa cloning site, TK or XPRT selection), but are not limited thereto.

Hefe-Expressionssysteme können ebenfalls gemäß dieser Offenbarung verwendet werden, um OB-Polypeptid zu exprimieren. Zum Beispiel kann der Nichffusions-pYES2-Vektor (XbaI-, SphI-, ShoI-, NotI-, GstXI-, EcoRI-, BstXI-, BamHI-, SacI-, KpnI- und HindIII-Klonierungsstelle, Invitrogen) oder der Fusions-pYESHisA, B, C (XbaI-, SphI-, ShoI-, NotI-, BstXI-, EcoRI-, BamHI-, SacI-, KpnI- und HindIII-Klonierungsstelle, N-terminales Peptid, welches mit ProBond-Harz gereinigt und mit Enterokinase gespalten wird, Invitrogen), um nur zwei zu erwähnen, eingesetzt werden.Yeast expression systems can also according to this Used to express OB polypeptide. To the An example is the pseudo-fusion pYES2 vector (XbaI, SphI, ShoI, NotI, GstXI, EcoRI, BstXI, BamHI, SacI, KpnI and HindIII cloning site, Invitrogen) or the fusion pYESHisA, B, C (XbaI, SphI, ShoI, NotI, BstXI, EcoRI, BamHI, SacI, KpnI and HindIII cloning site, N-terminal peptide purified with ProBond resin and with Enterokinase cleaved, Invitrogen), to mention only two become.

Es ist weiter beabsichtigt, das Körpergewichtsmodulator-Polypeptide und Analoga aus Nukleotidsequenzen hergestellt werden können, welche innerhalb des Schutzumfangs dieser Offenbarung abgeleitet wurden.It It is further contemplated that body weight modulator polypeptides and analogs can be prepared from nucleotide sequences which within the scope of this disclosure.

Zusätzlich zur rekombinanten Expression des OB-R-Polypeptids, sieht die vorliegende Offenbarung die Herstellung des OB-R-Polypeptids oder von Fragmenten davon unter Verwendung der gut bekannten und hochentwickelten Techniken der Festphasen-Peptidsynthese vor und ermöglicht diese vollständig. Die Offenbarung umfasst die Verwendung sowohl von gängigen Boc, als auch Fmoc, sowie anderen Schutzgruppen-Strategien zur Herstellung des OB-Polypeptids oder Fragmenten davon. Verschiedene Techniken zur Rückfaltung und zum Oxidieren der Cystein-Seitenketten, um eine Disulfidbindung zu bilden, sind ebenfalls im Stand der Technik gut bekannt.In addition to recombinant expression of the OB-R polypeptide, see the present Disclose the production of the OB-R polypeptide or fragments thereof using well-known and sophisticated techniques solid phase peptide synthesis and allows them to be completely The Disclosure includes the use of both common Boc, as well as Fmoc, as well as other protecting group strategies for producing the OB polypeptide or fragments thereof. Different techniques for refolding and oxidizing the cysteine side chains to form a disulfide bond are also well known in the art.

Antikörper gegen das OB-R-PolypeptidAntibody to the OB-R polypeptide

Gemäß dieser Offenbarung können das OB-R-Polypeptid, welches rekombinant oder durch chemische Synthese hergestellt wurde, und Fragmente oder Derivate oder Analoga davon, einschließlich von Fusionsproteinen, als Immunogen verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, welche das OB-R-Polypeptid erkennen. Solche Antikörper schließen polyklonale, monoklonale, chimäre, Einzelketten-, Fab-Fragmente und eine Fab-Expressionsbibliothek ein, sind aber nicht darauf beschränkt.According to this Revelation can the OB-R polypeptide which is recombinant or by chemical synthesis and fragments or derivatives or analogs thereof, including of fusion proteins, can be used as an immunogen to antibodies which recognize the OB-R polypeptide. Such antibodies include polyclonal, monoclonal, chimeric, Single chain, Fab fragments and a Fab expression library but are not limited to this.

Ein Molekül ist "antigen", wenn es in der Lage ist, spezifisch mit einem Antigen-Erkennungsmolekül des Immunsystems, wie einem Immunglobulin (Antikörper) oder einem T-Zell-Antigenrezeptor zu interagieren. Ein antigenes Polypeptid enthält mindestens ungefähr 5 und vorzugsweise mindestens ungefähr 10 Aminosäuren. Ein antigener Abschnitt eines Moleküls kann der Abschnitt sein, welcher immundominant für die Antikörper- oder T-Zellrezeptor-Erkennung ist, oder er kann ein Abschnitt sein, welcher verwendet wird, um einen Antikörper gegen das Molekül durch Konjugieren des antigenen Abschnitts an ein Trägermolekül zur Immunisierung zu erzeugen. Ein Molekül, welches antigen ist, braucht selber nicht immunogen zu sein, d. h. in der Lage, eine Immunantwort ohne einen Träger auszulösen.One molecule is "antigenic" when it is in the Location is specific with an antigen recognition molecule of the immune system, such as a Immunoglobulin (antibodies) or to interact with a T cell antigen receptor. An antigenic Contains polypeptide at least about 5 and preferably at least about 10 amino acids. One antigenic portion of a molecule may be the section which is immunodominant for antibody or T cell receptor recognition is, or it may be a section that is used to an antibody against the molecule by conjugating the antigenic portion to a carrier molecule for immunization to create. A molecule, which is antigen does not need to be immunogenic itself, i. H. able to trigger an immune response without a carrier.

Ein "Antikörper" ist irgendein Immunglobulin, einschließlich von Antikörpern und Fragmenten davon, welches ein spezifisches Epitop bindet. Der Begriff umfasst polyklonale, monoklonale und chimäre Antiköper, wobei die zuletzt erwähnten detaillierter in den U.S. Patenten Nr. 4,816,397 und 4,816,567 beschrieben werden, sowie Antigen bindende Abschnitte von Antikörpern, einschließlich von Fab, F(ab')2 und F(v) (einschließlich von Einzelketten-Antikörpern). Folglich umfasst der Begriff "Antikörpermolekül" in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen, so wie hier verwendet, sowohl ein intaktes Immunglobulin-Molekül, als auch einen immunologisch aktiven Abschnitt eines Immunglobulin-Moleküls, welches die Antikörper-Kombinationsstelle enthält. Eine "Antikörper-Kombinationsstelle" ist der strukturelle Abschnitt eines Antikörpermoleküls, welcher aus schwerer und leichter Kette der variablen und hypervariablen Regionen aufgebaut ist, welcher spezifisch das Antigen bindet.An "antibody" is any immunoglobulin, including antibodies and fragments thereof, that bind a specific epitope. The term includes polyclonal, monoclonal and chimeric antibodies, the latter mentioned in more detail in the U.S. Patent No. 4,816,397 and 4,816,567 and antigen-binding portions of antibodies, including Fab, F (ab ') 2 and F (v) (including single chain antibodies). Thus, the term "antibody molecule" in its various grammatical forms as used herein includes both an intact immunoglobulin molecule and an immunologically active portion of an immunoglobulin molecule containing the antibody combining site. An "antibody combining site" is the structural portion of an antibody molecule composed of heavy and light chain variable and hypervariable regions that specifically binds the antigen.

Beispielhafte Antikörpermoleküle sind intakte Immunglobulin-Moleküle, im Wesentlichen intakte Immunglobulin-Moleküle und jene Abschnitte eines Immunglobulin-Moleküls, welche das Paratop enthalten, einschließlich jener Abschnitte, welche im Stand der Technik als Fab, Fab', F(ab')2 und F(v) bekannt sind, wobei diese Abschnitte für die Verwendung in den hier beschriebenen therapeutischen Verfahren bevorzugt sind.Exemplary antibody molecules are intact immunoglobulin molecules, substantially intact immunoglobulin molecules and those portions of an immunoglobulin molecule containing the paratope, including those portions known in the art as Fab, Fab ', F (ab') 2 and F (v), which portions are preferred for use in the therapeutic methods described herein.

Fab- und F(ab')2-Abschnitte von Antikörpermolekülen werden durch die proteolytische Reaktion von jeweils Papain und Pepsin mit im Wesentlichen intakten Antikörpermolekülen durch Verfahren hergestellt, welche gut bekannt sind. Siehe zum Beispiel das U.S. Patent Nr. 4,342,566 an Theofilopolous et al. Fab'-Antikörpermolekül-Abschnitte sind ebenfalls gut bekannt und werden aus F(ab')2-Abschnitten hergestellt, gefolgt von einer Reduktion der Disulfidbindungen, welche die zwei schwere Ketten-Abschnitte verbinden, wie mit Mercaptoethanol, und gefolgt von einer Alkylierung des sich ergebenden Proteinmercaptans mit einem Reagens, wie Iodacetamid. Ein Antikörper, welcher intakte Antikörpermoleküle enthält, ist hier bevorzugt.Fab and F (ab ') 2 portions of antibody molecules are prepared by the proteolytic reaction of each of papain and pepsin with substantially intact antibody molecules by methods which are well known. See for example that U.S. Patent No. 4,342,566 to Theofilopolous et al. Fab 'antibody molecule portions are also well known and are prepared from F (ab') 2 portions, followed by reduction of the disulfide bonds joining the two heavy chain portions, as with mercaptoethanol, and followed by alkylation of the resulting protein mercaptan with a reagent such as iodoacetamide. An antibody containing intact antibody molecules is preferred herein.

Der Begriff "monoklonaler Antikörper" in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen betrifft einen Antikörper, welcher nur eine Art der Antikörper-Kombinationsstelle aufweist, welche in der Lage zur Immunreaktion mit einem bestimmten Antigen ist. Eine monoklonaler Antikörper zeigt daher typischerweise eine einzige Bindungsaffinität für irgendein Antigen mit welchem er immunreagiert. Ein monoklonaler Antikörper kann daher ein Antikörpermolekül enthalten, welches eine Vielzahl von Antikörper-Kombinationsstellen aufweist, wobei jede immunspezifisch für ein anderes Antigen ist, z. B. ein bispezifischer (chimärer) monoklonaler Antikörper.Of the Term "monoclonal Antibodies "in its various grammatical forms refers to an antibody which is only one kind the antibody combination site which is capable of immune reaction with a particular Antigen is. A monoclonal antibody therefore typically shows a single binding affinity for any one Antigen with which he immunoreacts. A monoclonal antibody can therefore contain an antibody molecule, which has a variety of antibody combining sites each being immunospecific for another antigen, z. B. a bispecific (chimeric) monoclonal antibody.

Der Begriff "Adjuvans" betrifft eine Verbindung oder ein Gemisch, welche/s die Immunantwort auf ein Antigen verstärkt. Ein Adjuvans kann als ein Gewebespeicher dienen, welcher das Antigen langsam freisetzt und ebenfalls als ein Lymphsystem-Aktivierungsmittel, welches die Immunantwort nicht spezifisch verstärkt [Hood et al., Immunology, S. 384, zweite Aufl., Benjamin/Cummings, Menlo Park, Kalifornien (1984)]. Häufig wird ein erstes Kontaktieren mit einem Antigen alleine in der Abwesenheit eines Adjuvans versagen, eine humorale oder zelluläre Immunantwort auszulösen. Adjuvantien schließen vollständiges Freund'sches Adjuvans, unvollständiges Freund'sches Adjuvans, Saponin, Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Öl- oder Kohlenwasserstoffemulsionen, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanine, Dinitrophenol und möglicherweise geeignete humane Adjuvantien, wie BCG (Bacille Clamette-Guerin) und Corynebacterium parvum ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Vorzugsweise ist das Adjuvans pharmazeutisch verträglich.Of the The term "adjuvant" refers to a compound or a mixture that enhances the immune response to an antigen. One Adjuvant can serve as a tissue store containing the antigen released slowly and also as a lymphatic system activator, which does not specifically enhance the immune response [Hood et al., Immunology, P. 384, second edition, Benjamin / Cummings, Menlo Park, California (1984)]. Frequently becomes a first contact with an antigen alone in the absence an adjuvant, a humoral or cellular immune response trigger. Close adjuvants complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, saponin, Mineral gels, such as aluminum hydroxide, surfactants, such as Lysolecithin, Pluronic polyols, polyanions, peptides, oil or Hydrocarbon emulsions, keyhole limpet hemocyanins, dinitrophenol and possibly suitable human adjuvants, such as BCG (Bacille Clamette-Guerin) and Corynebacterium parvum, but are not limited thereto. Preferably the adjuvant is pharmaceutically acceptable.

Verschiedene Verfahren, welche im Stand der Technik bekannt sind, können zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen das OB-R-Polypeptid oder ein Fragment, Derivat oder Analogon davon verwendet werden. Für die Herstellung des Antikörpers können verschiedene Wirtstiere durch Injektion mit dem OB-R-Polypeptid oder einem Derivat davon (z. B. einem Fragment oder Fusionsprotein) immunisiert werden, einschließlich von, aber nicht beschränkt auf Kaninchen, Mäuse, Ratten, Schafe, Ziegen, usw. In einer Ausführungsform kann das OB-R-Polypeptid oder Fragment davon an einen immunogenen Träger konjugiert werden, z. B. an bovines Serumalbumin (BSA) der Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH). Spezifische antigene OB-R-Fragmente (SEQ ID NR: 32, 33, 34) werden in Beispiel 2, infra, offenbart. In einer anderen Ausführungsform wird ein Antikörper gegen den C-terminalen Abschnitt der OB-Re-Form des OB-R erzeugt, z. B. ein Polypeptid, welches ungefähr den Aminosäureresten 420–461 der SEQ ID NR: 10 entspricht. Verschiedene Adjuvantien können verwendet werden, um die immunologische Antwort zu verstärken, abhängig vom Wirtstier, einschließlich von, aber nicht beschränkt auf Freund'sches (vollständig und unvollständig), Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanine, Dinitrophenol und möglicherweise geeignete humane Adjuvantien, wie BCG (Bacille Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum.Various Methods which are known in the art can be used for Preparation of polyclonal antibodies to the OB-R polypeptide or a fragment, derivative or analog thereof. For the Production of the antibody can various host animals by injection with the OB-R polypeptide or a Derivative thereof (eg, a fragment or fusion protein) be inclusive from, but not limited to on rabbits, mice, Rats, sheep, goats, etc. In one embodiment, the OB-R polypeptide or fragment of which to an immunogenic carrier be conjugated, for. To bovine serum albumin (BSA) of keyhole limpet hemocyanin (KLH). Specific antigenic OB-R fragments (SEQ ID NOS: 32, 33, 34) are described in Example 2, infra, disclosed. In another embodiment becomes an antibody generated against the C-terminal portion of the OB-Re form of the OB-R, z. A polypeptide which is approximately the amino acid residues 420-461 SEQ ID NO: 10 corresponds. Various adjuvants can be used to enhance the immunological response, depending on the host animal, including, but not limited on friend's (Completely and incomplete), Mineral gels, such as aluminum hydroxide, surfactants, such as Lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, Keyhole limpet Haemocyanins, Dinitrophenol and possibly suitable human adjuvants, such as BCG (Bacille Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum.

Für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern, welche gegen das OB-R-Polypeptid oder ein Fragment, Analogon oder Derivat davon gerichtet sind, kann irgendeine Technik, welche die Herstellung von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur bewirkt, verwendet werden. Diese schließen die Hybridom-Technik, welche ursprünglich von Kohler et al., Nature 256: 495–497 (1975) entwickelt wurde, sowie die Triom-Technik, die humane B-Zell-Hybridomtechnik [Kozbor et al., Immunology Today, 4: 72 (1983)] und die EBV-Hybridomtechnik, um humane monoklonale Antikörper herzustellen [Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, S. 77–96, Alan R. Liss, Inc. (1985)] ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Immortale, Antikörper herstellende Zelllinien können durch andere Techniken als Fusion erzeugt werden, wie direkte Transformation von B-Lymphozyten mit onkogener DNA oder Transfektion mit dem Epstein-Barr Virus [siehe z. B. M. Schreier et al., "Hybridoma Techniques" (1980), Hammerling et al., "Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas" (1981), Kennett et al., "Monoclonal Antibodies" (1980), siehe ebenfalls U.S. Patente Nr. 4,341,761 , 4,399,121 , 4,427,783 , 4,444,887 , 4,451,570 , 4,466,917 , 4,472,500 , 4,491,632 und 4,493,890 ].For the production of monoclonal antibodies directed against the OB-R polypeptide or a fragment, analog or derivative thereof, any technique involving the production of anti Body molecules caused by continuous cell lines in culture can be used. These include the hybridoma technique originally developed by Kohler et al., Nature 256: 495-497 (1975), and the trioma technique, the human B-cell hybridoma technique [Kozbor et al., Immunology Today, 4 : 72 (1983)] and the EBV hybridoma technique to produce human monoclonal antibodies [Cole et al., In Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc. (1985)] but not limited to that. Immortal antibody producing cell lines can be generated by techniques other than fusion, such as direct transformation of B lymphocytes with oncogenic DNA or transfection with the Epstein-Barr virus [see, e.g. BM Schreier et al., "Hybridoma Techniques" (1980), Hammerling et al., "Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas" (1981), Kennett et al., "Monoclonal Antibodies" (1980), also see U.S. Patent No. 4,341,761 . 4,399,121 . 4,427,783 . 4,444,887 . 4,451,570 . 4,466,917 . 4,472,500 . 4,491,632 and 4,493,890 ].

In einer zusätzlichen Ausführungsform dieser Offenbarung können monoklonale Antikörper in keimfreien Tieren hergestellt werden [die internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 89/12690 , veröffentlicht am 28. Dezember 1989]. Gemäß dieser Offenbarung können humane Antikörper verwendet werden und können durch Verwendung humaner Hybridome [Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 2026–2030 (1983)] oder durch Transformieren humaner B-Zellen mit dem EBV-Virus in vitro (Cole et al., 1985, supra) erhalten werden. In der Tat können gemäß dieser Offenbarung Techniken, welche für die Herstellung von "chimären Antikörpern" entwickelt wurden [Morrison et al., J. Bacteriol., 159–870 (1984), Neuberger et al., Nature, 312: 604–608 (1984), Takeda et al., Nature, 314: 452–454 (1985)] durch Spleißen der Gene aus einem Mäuse-Antikörpermolekül, welches spezifisch für ein ob-Polypeptid ist, zusammen mit Genen aus einem humanen Antikörpermolekül mit geeigneter biologischer Aktivität verwendet werden, solche Antikörper liegen im Schutzumfang dieser Offenbarung. Solche humanen oder humanisierten chimären Antikörper sind für die Verwendung in der Therapie von Humankrankheiten oder Störungen (infra beschrieben) bevorzugt, da die humanen oder humanisierten Antikörper selber viel weniger wahrscheinlich als xenogene Antikörper eine Immunantwort, insbesondere eine allergische Antwort, induzieren.In an additional embodiment of this disclosure, monoclonal antibodies can be produced in germ-free animals [International Patent Publication No. Hei. WO 89/12690 , published on December 28, 1989]. According to this disclosure, human antibodies can be used and can be obtained by using human hybridomas [Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 2026-2030 (1983)] or by transforming human B cells with the EBV virus in vitro (Cole et al., 1985, supra). In fact, according to this disclosure, techniques developed for the production of "chimeric antibodies" [Morrison et al., J. Bacteriol., 159-870 (1984), Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984), Takeda et al., Nature, 314: 452-454 (1985)] by splicing the genes from a murine antibody molecule specific for an ob polypeptide together with genes from a human antibody molecule having appropriate biological activity Such antibodies are within the scope of this disclosure. Such human or humanized chimeric antibodies are preferred for use in the therapy of human diseases or disorders (described infra), since the human or humanized antibodies themselves are much less likely to induce an immune response, especially an allergic response, than xenogeneic antibodies.

Gemäß dieser Offenbarung können Techniken, welche für die Herstellung von Einzelketten-Antikörpern beschrieben wurden ( U.S. Patente Nr. 5,476,786 und 5,132,405 an Huston, Patent Nr. 4,946,778 ) angewandt werden, um OB-R-Polypeptid spezifische Einzelketten-Antikörper herzustellen. Eine zusätzliche Ausführungsform dieser Offenbarung verwendet die für die Konstruktion von Fab-Expressionsbibliotheken beschriebenen Techniken [Huse et al., Science, 246: 1275–1281 (1989)], um eine schnelle und einfache Identifikation von monoklonalen Fab-Fragmenten mit der gewünschten Spezifität für ein ob-Polypeptid oder seine Derivate oder Analoga zu erlauben.According to this disclosure, techniques described for the production of single-chain antibodies ( U.S. Patent No. 5,476,786 and 5,132,405 to Huston, patent no. 4,946,778 ) to produce OB-R polypeptide specific single chain antibodies. An additional embodiment of this disclosure utilizes the techniques described for the construction of Fab expression libraries [Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989)] for rapid and easy identification of monoclonal Fab fragments having the desired specificity for to allow an ob polypeptide or its derivatives or analogs.

Antikörperfragmente, welche den Idiotyp des Antikörpermoleküls enthalten, können durch bekannte Techniken erzeugt werden. Zum Beispiel schließen solche Fragmente: das F(ab')2-Fragment, welches durch Pepsinspaltung des Antikörpermoleküls hergestellt werden kann, die Fab'-Fragmente, welche durch Reduzieren der Disulfidbrücken des F(ab')2-Fragments erzeugt werden können und die Fab-Fragmente, welche durch Behandeln des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel erzeugt werden können, ein, sind aber nicht darauf beschränkt.Antibody fragments containing the idiotype of the antibody molecule can be generated by known techniques. For example, such fragments include: the F (ab ') 2 fragment which can be produced by pepsin cleavage of the antibody molecule, the Fab' fragments which can be generated by reducing the disulfide bridges of the F (ab ') 2 fragment, and the Fab fragments which may be generated by treating the antibody molecule with papain and a reducing agent, but are not limited thereto.

Bei der Herstelllung von Antikörpern kann ein Screening auf den gewünschten Antikörper durch Techniken erreicht werden, welche im Stand der Technik bekannt sind, z. B. Radioimmunassay, ELISA (enzymgekoppelter Immunadsorptionsassay), "Sandwich"-Immunassays, immunradiometrische Assays, Geldiffusions-Präzipitin-Reaktionen, Immundiffusions-Assays, in situ Immunassays (zum Beispiel unter Verwendung von kolloidalen Gold,- Enzym- oder Radioisotop-Markierungen), Western Blots, Präzipiationsreaktionen, Agglutinationsassays (z. B. Gel-Agglutinationsassays, Hämagglutinationsassays), Komplement-Fixierungsassays, Immunfluoreszenz-Assays, Protein A-Assays und Immunelektrophorese-Assays, usw. In einer Ausführungsform wird die Antikörperbindung durch Nachweisen einer Markierung auf dem primären Antikörper nachgewiesen. In einer anderen Ausführungsform wird der primäre Antikörper durch Nachweisen des Bindens eines zweiten Antikörpers oder Reagens an den primären Antikörper nachgewiesen. In einer weiteren Ausführungsform ist der sekundäre Antikörper markiert. Viele Hilfsmittel sind im Stand der Technik zum Nachweisen einer Bindung in einem Immunassay bekannt und liegen innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Offenbarung. Zum Beispiel kann man, um Antikörper auszuwählen, welche ein spezifisches Epitop eines OB-Polypeptids erkennen, erzeugte Hybridome für ein Produkt, welches an ein OB-Polypeptid-Fragment, welches ein solches Epitop enthält, bindet, untersuchen. Zur Auswahl eines Antikörpers, welcher spezifisch für ein OB-Polypeptid aus einer bestimmten Art von Tier ist, kann auf der Grundlage der positiven Bindung mit OB-Polypeptid, welches von Zellen dieser Art von Tier exprimiert oder aus ihnen isoliert wurde, ausgewählt werden.at the production of antibodies Can be a screening on the desired antibody achieved by techniques known in the art are, for. Radioimmunoassay, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), sandwich immunoassays, immunoradiometric Assays, Geldiffusions-precipitin reactions, Immunodiffusion assays, in situ immunoassays (for example, under Use of colloidal gold, enzyme or radioisotope labels), Western Blots, precipitation reactions, Agglutination assays (eg gel agglutination assays, hemagglutination assays), Complement fixation assays, Immunofluorescence assays, protein A assays and immunoelectrophoresis assays, etc. In one embodiment becomes the antibody binding detected by detecting a label on the primary antibody. In a another embodiment becomes the primary one antibody by detecting the binding of a second antibody or reagent to the primary antibody. In a further embodiment is the secondary one antibody marked. Many aids are known in the art for detecting a Binding in an immunoassay known and are within the scope of the present disclosure. For example, one can choose to select antibodies recognize a specific epitope of an OB polypeptide Hybridomas for a product which is linked to an OB polypeptide fragment which is a Contains epitope, binds, investigate. To select an antibody specific for an OB polypeptide is from a particular type of animal, can be based on the positive binding with OB polypeptide derived from cells of this type selected from animal expressed or isolated from animal.

Die zuvor genannten Antikörper können in Verfahren verwendet werden, welche im Stand der Technik bezüglich der Lokalisation und Aktivität des OB-R-Polypeptids bekannt sind, z. B. für Western-Blots, zum Sichtbarmachen des OB-R-Polypeptids in situ, zum Messen der Mengen davon in geeigneten physiologischen Proben, zum Nachweisen der Expression von OB-R, usw.The aforementioned antibodies can be used in methods known in the art with respect to the location and activity of the OB-R polypeptide, e.g. For Western blots, visualizing the OB-R polypeptide in situ, measuring the amounts thereof in appropriate physiological samples, detecting the expression of OB-R, etc.

In einer spezifischen Ausführungsform können Antikörper, welche die Aktivität des OB-R-Polypeptids fördern oder ihr entgegenwirken, erzeugt werden. Solche Antikörper können unter Verwendung der infra beschriebenen Assays zum Identifizieren von Liganden getestet werden.In a specific embodiment can Antibody, which the activity of the OB-R polypeptide or counteract it. Such antibodies may be Use of the infra described assays to identify Ligands to be tested.

In einem besonderen Aspekt werden Antikörper durch Immunisieren von Kaninchen mit synthetischen Peptiden, welche durch die Proteinsequenz vorhergesagt wurden, oder mit rekombinanten Proteinen, welche unter Verwendung von bakteriellen Expressionsvektoren hergestellt wurden, entwickelt. Die Wahl der synthetischen Peptide wird nach einer sorgfältigen Analyse der vorhergesagten Proteinstruktur, wie oben beschrieben, durchgeführt. Insbesondere werden Peptidsequenzen zwischen möglichen Spaltstellen gewählt. Synthetische Peptide werden an einen Träger, wie KLH-Hämocyanin oder BSA unter Verwendung von Carbodiimid konjugiert und in Freund'schem Adjuvans verwendet, um Kaninchen zu immunisieren. Um das rekombinante Protein herzustellen, kann der pGEX-Vektor verwendet werden, um das Polypeptid zu exprimieren [Smith et al., 1988, supra]. Alternativ kann man nur hydrophile Domänen verwenden, um das Fusionsprotein zu erzeugen. Das exprimierte Protein wird in Menge hergestellt und verwendet werden, um Kaninchen in Freund'schem Adjuvans zu immunisieren.In In a particular aspect, antibodies are obtained by immunizing Rabbit with synthetic peptides, which through the protein sequence were predicted, or with recombinant proteins, which are under Use of bacterial expression vectors were made, developed. The choice of synthetic peptides will be after careful analysis of the predicted protein structure as described above. Especially Peptide sequences are chosen between possible cleavage sites. synthetic Peptides are attached to a carrier, like KLH-hemocyanin or BSA conjugated using carbodiimide and used in Freund's adjuvant, to immunize rabbits. To make the recombinant protein, For example, the pGEX vector can be used to express the polypeptide [Smith et al., 1988, supra]. Alternatively, one can only use hydrophilic domains use to generate the fusion protein. The expressed protein will be produced in quantity and used to rabbit in Freund's adjuvant to immunize.

In einer spezifischen Ausführungsform, infra, können Peptide, welche den Aminosäureresten 145–158, 465–484, 863–881 und 420–641 entsprechen (aus dem Mäuse-OB-R-Polypeptid, in irgendeiner der SEQ ID NR: 8, 10 dargestellt), durch eine Festphasen-Peptidsynthese oder durch Expression, gegebenenfalls an einen Träger, wie KLH, konjugiert, erzeugt werden und verwendet werden, um Kaninchen, Ratten, Ziegen, Hühner, usw. zu immunisieren.In a specific embodiment, infra, can Peptides corresponding to amino acid residues 145-158, 465-484, 863-881 and 420-641 correspond (from the mouse OB-R polypeptide, in any of SEQ ID NO: 8, 10) by solid phase peptide synthesis or by expression, optionally to a carrier, such as KLH, conjugated, produced and used to rabbit, Rats, goats, chickens, etc. to immunize.

In einer anderen spezifischen Ausführungsform wird rekombinantes OB-R-Polypeptid verwendet, um Hühner zu immunisieren, und die Hühner-Anti-OB-R-Antikörper werden aus dem Eidotter gewonnen, z. B. durch Affinitätsreinigung auf einer OB-R-Säule. Vorzugsweise werden Hühner, welche zur Immunisierung verwendet werden, unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen gehalten.In another specific embodiment becomes recombinant OB-R polypeptide used to chickens to immunize and become the chicken anti-OB-R antibody extracted from the egg yolk, z. By affinity purification on an OB-R column. Preferably become chickens, which are used for immunization under specific pathogen-free (SPF) conditions.

In noch einer anderen Ausführungsform wird rekombinantes OB-R-Polypeptid verwendet, um Kaninchen zu immunisieren, und die polyklonalen Antikörper werden vor der weiteren Verwendung immungereinigt. Die gereinigten Antikörper sind insbesondere für semiquantitative Assays geeignet, insbesondere zum Nachweisen der Anwesenheit der zirkulierenden (löslichen) Spleißform/en des OB-R-Polypeptids in Serum oder Plasma.In yet another embodiment recombinant OB-R polypeptide is used to immunize rabbits, and the polyclonal antibodies are immunopurified before further use. The cleaned ones antibody are in particular for semiquantitative assays suitable, in particular for the detection of Presence of circulating (soluble) splice form (s) of the OB-R polypeptide in serum or plasma.

Gruppen von monoklonalen Antikörpern, welche gegen Modulatorpeptide hergestellt wurden, können auf verschiedene Eigenschaften gescreent werden, d. h. Isotyp, Epitop, Affinität, usw. Von besonderem Interesse sind monoklonale Antikörper, welche die Aktivität des Modulatorpeptids neutralisieren. Solche Monoklonalen können einfach in Aktivitätsassays für die Gewichtsmodulatoren identifiziert werden. Antikörper mit hoher Affinität sind ebenfalls geeignet, wenn eine Immunaffinitätsreinigung von nativem oder rekombinantem Polypeptid gewünscht ist.groups of monoclonal antibodies, which have been prepared against modulator peptides can different properties are screened, d. H. Isotype, epitope, Affinity, etc. Of particular interest are monoclonal antibodies which the activity neutralize the modulator peptide. Such monoclonal can be easy in activity assays for the Weight modulators are identified. High affinity antibodies are also suitable if an immunoaffinity purification of native or recombinant polypeptide is desired.

Vorzugsweise ist der Anti-Modulator-Antikörper, welcher in den hier offenbarten diagnostischen und therapeutischen Verfahren verwendet wird, ein affinitätsgereinigter polyklonaler Antikörper. Weiter bevorzugt ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper (mAb). Zusätzlich ist es für die Anti-Modulator-Antikörpermoleküle, welche hier verwendet werden, vorzuziehen, dass sie in Form von Fab-, Fab'-F(ab')2- oder F(v)-Abschnitten der vollständigen Antikörpermoleküle vorliegen.Preferably, the anti-modulator antibody used in the diagnostic and therapeutic methods disclosed herein is an affinity-purified polyclonal antibody. More preferably, the antibody is a monoclonal antibody (mAb). In addition, it is preferable for the anti-modulator antibody molecules used herein to be in the form of Fab, Fab 'F (ab') 2 or F (v) portions of the whole antibody molecules.

Diagnostikdiagnostics

Die vorliegende Offenbarung betrifft ebenfalls eine Vielzahl von diagnostischen Anwendungen, einschließlich von Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit von Bedingungen und/oder Stimuli, welche Abnormalitäten im Körpergewicht oder der Adiposität beeinflussen, bezüglich ihrer Fähigkeit, die Aktivitäten auszulösen, welche durch die vorliegenden OB-R-Polypeptide vermittelt werden. Wie früher erwähnt wurde, können die Peptide verwendet werden, um Antikörper gegen sich selber durch eine Vielzahl von bekannten Techniken herzustellen, und solche Antikörper könnten anschließend isoliert werden und in Tests für die Anwesenheit einer bestimmten transkriptionellen Aktivität in verdächtigen Zielzellen verwendet werden. Alternativ können die hier offenbarten Nukleinsäuren in der Diagnose eingesetzt werden.The The present disclosure also relates to a variety of diagnostic Applications including of methods for detecting the presence of conditions and / or Stimuli, what abnormalities in body weight or adiposity affect, re their ability the Activities trigger, which are mediated by the subject OB-R polypeptides. Like in old times mentioned was, can The peptides are used to get antibodies against themselves to produce a variety of known techniques, and such antibodies could then be isolated be and in tests for the presence of a specific transcriptional activity in suspect Target cells are used. Alternatively, the nucleic acids disclosed herein can be used in be used for the diagnosis.

Antikörperbasierte DiagnostikAntibody based diagnostics

Wie früher erwähnt, umfasst ein diagnostisches Verfahren, welches in der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, das Untersuchen einer zellulären Probe oder eines Mediums mit Hilfsmitteln eines Assays, einschließlich einer effektiven Menge eines OB-R-Bindungspartners, wie eines Anti-Modulator-Antikörpers oder Leptin, vorzugsweise eines affinitätsgereinigten polyklonalen Antikörpers und weiter bevorzugt eines mAb. Zusätzlich ist es vorzuziehen, dass die hier verwendeten Antikörpermoleküle in Form von Fab-, Fab'-, F(ab')2- oder F(v)-Abschnitten oder als vollständige Antikörpermoleküle vorliegen. Wie zuvor diskutiert, schließen Patienten, welche in der Lage sind, von diesen Verfahren zu profitieren, jene ein, die an Krebs, AIDS, Fettleibigkeit oder anderen Zuständen leiden, in denen ein abnormales Körpergewicht ein Bestandteil des Zustands darstellt.As mentioned earlier, a diagnostic method useful in the present disclosure includes assaying a cellular sample or medium with assays of an assay, including an effective amount of an OB-R binding partner, such as an anti-modulator antibody or leptin , preferably an affinity-purified polyclonal antibody, and more preferably a mAb. In addition, it is preferable that the antibody molecules used herein are in the form of Fab, Fab ', F (ab') 2 or F (v) sections or as complete antibody molecules. As previously discussed, patients who are able to benefit from these methods include those who suffer from cancer, AIDS, obesity, or other conditions in which abnormal body weight is a component of the condition.

Ebenfalls können Antikörper, einschließlich von sowohl polyklonalen, als auch monoklonalen Antikörpern, bestimmte diagnostische Anwendungen besitzen und können zum Beispiel für den Zweck des Nachweisens und/oder des Messens von Zuständen verwendet werden, in denen sich wahrscheinlich Abnormalitäten im Körpergewicht entwickeln oder entwickeln können.Also can Antibody, including of both polyclonal and monoclonal antibodies can own diagnostic applications and, for example, for the purpose of detecting and / or measuring states in which probably abnormalities in the body weight develop or develop.

Die diagnostischen Verfahren können verwendet werden, um OB-R in einer biologischen Probe aus einem Individuum nachzuweisen. Die biologische Probe kann eine biologische Flüssigkeit sein, wie Blut, Serum, Plasma, interstitielle Flüssigkeit, mehrfache Ergüsse, Urin, Cerebrospinalflüssigkeit und desgleichen, ist aber nicht darauf beschränkt. Vorzugsweise wird löslicher OB-R in Serum oder Urin nachgewiesen, welche beide einfach erhalten werden. Alternativ kann OB-R aus zellulären Quellen nachgewiesen werden, wie, aber nicht beschränkt auf, Hirngewebe-Biopsien, Fettzellen, Hoden, Herz und desgleichen. Zum Beispiel können Zellen von einem Individuum durch Biopsie erhalten werden und lysiert werden, z. B. durch zyklisches Gefrieren-Auftauen oder eine Behandlung mit einem milden cytolytischen Detergens, wie, aber nicht beschränkt auf TRITON-X-100®, Polyoxyethylenester, Digitonin, IGEPAL/NONIDET P (NP)-40® (Octylphenoxy)polyethoxyethanol, Saponin und desgleichen oder Kombinationen davon (siehe z. B. die internationale Patentveröffentlichung WO 92/08981 , veröffentlicht am 29. Mai 1992). In noch einer anderen Ausführungsform können Proben verwendet werden, welche sowohl Zellen, als auch Körperflüssigkeiten enthalten (siehe ibid.).The diagnostic methods can be used to detect OB-R in a biological sample from an individual. The biological sample may be a biological fluid such as, but not limited to, blood, serum, plasma, interstitial fluid, multiple effusions, urine, cerebrospinal fluid, and the like. Preferably, soluble OB-R is detected in serum or urine, both of which are easily obtained. Alternatively, OB-R can be detected from cellular sources such as, but not limited to, brain tissue biopsies, fat cells, testicles, heart and the like. For example, cells from an individual can be obtained by biopsy and lysed, e.g. For example, by cyclic freezing-thawing or by treatment with a mild cytolytic detergent such as, but not limited to, TRITON X-100 ®, polyoxyethylene esters, digitonin, IGEPAL / NONIDET P (NP) -40 ® (octylphenoxy) polyethoxyethanol, saponin and like or combinations thereof (see, for example, International Patent Publication WO 92/08981 , published May 29, 1992). In yet another embodiment, samples containing both cells and body fluids may be used (see ibid.).

Die Anwesenheit von OB-R in Zellen oder in einer biologischen Flüssigkeit kann durch die üblichen immunologischen Verfahren festgestellt werden, welche für solche Bestimmungen anwendbar sind. Eine Anzahl von geeigneten Verfahren ist bekannt. Drei solcher Verfahren, welche insbesondere geeignet sind, verwenden entweder den OB-R (insbesondere die sezernierte Spleiß-Form), der mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist, Antikörper AB1, der mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist, oder Antikörper Ab2, der mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist.The presence of OB-R in cells or in a biological fluid can be determined by the usual immunological methods applicable to such determinations. A number of suitable methods are known. Three such methods, which are particularly suitable, use either the OB-R (especially the secreted splice form) labeled with a detectable label, antibody AB 1 labeled with a detectable label, or antibody Ab 2 , the marked with a detectable mark.

Die Verfahren und ihre Anwendung sind dem Fachmann alle geläufig und können folglich innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Offenbarung verwendet werden. Zum Beispiel wird ein "kompetitives" Verfahren in den U.S. Patenten Nr. 3,654,090 und 3,850,752 beschrieben. Ein "Sandwich"-Verfahren wird in den U.S. Patenten Nr. RE 31,006 und 4,016,043 beschrieben. Noch andere Verfahren sind bekannt, wie das "Doppelantikörper"- oder "DASP"-Verfahren.The methods and their application are all familiar to those skilled in the art and thus can be used within the scope of the present disclosure. For example, a "competitive" procedure in the U.S. Patent No. 3,654,090 and 3,850,752 described. A "sandwich" procedure is used in the US Pat. No. RE 31,006 and 4,016,043 described. Still other methods are known, such as the "double antibody" or "DASP" method.

Die für diese Studien am häufigsten eingesetzten Markierungen sind radioaktive Elemente, Enzyme, Chemikalien, welche fluoreszieren, wenn sie ultraviolettem Licht ausgesetzt werden, und andere.The for this Studies most often used labels are radioactive elements, enzymes, chemicals, which fluoresce when exposed to ultraviolet light, and other.

Eine Anzahl von fluoreszenten Materialien ist bekannt und kann als Markierungen verwendet werden. Diese schließen zum Beispiel Fluoreszein, Rhodamin und Auramin ein. Ein besonderes Nachweismaterial ist ein Anti-Kaninchen-Antikörper, welcher in Ziegen hergestellt und mit Fluoreszein über ein Isothiocyanat konjugiert wurde.A Number of fluorescent materials is known and can be used as markers be used. Close this for example, fluorescein, rhodamine and auramine. A special Detection material is an anti-rabbit antibody produced in goats and with fluorescein over an isothiocyanate was conjugated.

Die radioaktive Markierung kann durch irgendeines der derzeitig verfügbaren Zählverfahren nachgewiesen werden. Das bevorzugte Isotop kann aus 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 99Tc, 125I, 131I und 186Re ausgewählt werden.Radiolabeling can be detected by any of the currently available counting methods. The preferred isotope can be selected from 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 36 Cl, 51 Cr, 57 Co, 58 Co, 59 Fe, 90 Y, 99 Tc, 125 I, 131 I and 186 Re.

Enzymmarkierungen sind ebenfalls geeignet und können durch irgendeine der derzeit verwendeten kolorimetrischen, spektrophotometrischen, fluorospektrophotometrischen, amperometrischen und gasometrischen Techniken bestimmt werden. Das Enzym wird durch eine Reaktion mit Brückenmolekülen, wie Carbodiimiden, Diisocyanaten, Glutaraldehyd und desgleichen konjugiert. Viele Enzyme, welche in diesen Verfahren verwendet werden können, sind bekannt und können verwendet werden. Die bevorzugten sind Peroxidase, β-Glucuronidase, β-D-Glucosidase, β-D-Galactosidase, Uresse, Glucoseoxidase plus Peroxidase und alkalische Phosphatase. Auf die U.S. Patente Nr. 3,654,090 , 3,850,752 und 4,016,043 wird sich exemplarisch für diese Offenbarung für alternatives Markierungsmaterial und Verfahren bezogen.Enzyme labels are also suitable and can be determined by any of the currently used colorimetric, spectrophotometric, fluorospectrophotometric, amperometric and gasometric techniques. The enzyme is conjugated by reaction with bridging molecules such as carbodiimides, diisocyanates, glutaraldehyde and the like. Many enzymes that can be used in these methods are known and can be used. The preferred are peroxidase, β-glucuronidase, β-D-glucosidase, β-D-galactosidase, uric acid, glucose oxidase plus peroxidase and alkaline phosphatase. On the U.S. Patent No. 3,654,090 . 3,850,752 and 4,016,043 is exemplified for this disclosure for alternative marking material and method.

In einer weiteren Ausführungsform dieser Offenbarung können Testkits hergestellt werden, die zur Verwendung durch einen medizinischen Spezialisten geeignet sind, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von OB-R in verdächtigen Zielzellen oder biologischen Flüssigkeiten zu bestimmen. Gemäß den oben diskutierten Testtechniken wird eine Klasse solcher Kits mindestens das markierte OB-R-Polypeptid oder seine Bindungspartner, zum Beispiel einen dafür spezifischen Antikörper, und Anleitungen, natürlich abhängig von dem ausgewählten Verfahren, enthalten, z. B. "kompetitiv", "Sandwich", "DASP" und desgleichen. Die Kits können ebenfalls periphere Reagenzien, wie Puffer, Stabilisatoren, usw. enthalten.In a further embodiment of this revelation Test kits are manufactured for use by a medical Specialists are suitable for the presence or absence from OB-R to suspects Target cells or biological fluids to determine. According to the above At least one class of such kits will be discussed the labeled OB-R polypeptide or its binding partners, for example a specific one Antibody, and instructions, of course dependent from the selected one Method, included, for. "Competitive", "sandwich", "DASP" and the like. The kits can as well peripheral reagents such as buffers, stabilizers, etc. included.

Nukleinsäure basierte DiagnostikNucleic acid based diagnostics

Wie in den Beispielen, infra, gezeigt wurde, können wie hier offenbarte Nukleinsäuren verwendet werden, um Defekte nachzuweisen, welche mit Defekten im OB-R-Polypeptid verbunden sind, welches mit einem fettleibigen Phänotyp verbunden ist. Zum Beispiel können Nukleinsäure-Sonden (z. B. in einer Northern-Analyse oder einer RT-PCR-Analyse) verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein fettleibiger Phänotyp mit dem Fehlen der Expression von OB-R-mRNA oder der Expression von nicht funktionsfähiger OB-R-mRNA verbunden ist, z. B. wie in db/db-Mäusen (wo sich der Mangel aus einem Fehlen eines wirksamen Leptinrezeptors ergibt) oder wo eine Mutation eine nicht transkribierte mRNA ergibt. Außerdem können die hier offenbarten Nukleinsäure basierten Diagnosetechniken zusammen mit Antikörper basierten Techniken verwendet werden, um weiterhin ein molekulares Verstehen von fettleibigen oder anroektischen Phänotypen zu entwickeln.As In the examples, infra, can be used as disclosed herein nucleic acids to detect defects associated with defects in the OB-R polypeptide associated with an obese phenotype is. For example, you can Nucleic acid probes (eg in a Northern analysis or an RT-PCR analysis) can be used to determine if an obese phenotype with the lack of expression of OB-R mRNA or expression from non-functional OB-R mRNA is linked, e.g. As in db / db mice (where the deficiency is a lack of an effective leptin receptor) or where a Mutation results in an untranscribed mRNA. In addition, the here revealed nucleic acid based diagnostic techniques used together with antibody based techniques to continue to have a molecular understanding of the obese or anochectic phenotypes to develop.

Humane cDNA-Klone können sequenziert werden. Dies vereinfacht die Bestimmung der vollständigen Sequenz des humanen Gens. DNA-Sequenzen aus den Introns des humanen OB-R-Gens können so erhalten werden, und diese können verwendet werden, um PCR-Primer herzustellen, um die kodierende Sequenz des OB-R-Gens aus humaner genomischer DNA mit einer PCR zu amplifizieren, um Mutationen oder Allelvarianten des OB-R-Gens zu identifizieren, alles in Übereinstimmung mit den Protokollen, welche hier zuvor detailliert beschrieben wurden.humane cDNA clones can be sequenced. This simplifies the determination of the complete sequence of the human gene. DNA sequences from the introns of the human OB-R gene can be preserved, and these can used to make PCR primers to the coding Sequence of the OB-R gene from human genomic DNA with a PCR to amplify mutations or allelic variants of the OB-R gene to identify everything in agreement with the protocols described in detail here.

Die derzeitige Hypothese ist, dass heterozygote Mutationen im DB-Gen mit einer milden/moderaten Fettleibigkeit verbunden sein werden, während homozygote Mutationen mit einer schweren Fettleibigkeit verbunden sein würden. Dies würde die Feststellung von Personen mit einem Risiko für die Entwicklung von Fettleibigkeit erlauben und die Anwendung einer Arzneimittelbehandlung und/oder von Änderungen des Lebensstils möglich machen, bevor ein erhöhtes Körpergewicht vollständig entwickelt ist.The current hypothesis is that heterozygous mutations in the DB gene will be associated with mild / moderate obesity, while homozygous mutations associated with severe obesity would be. This would the identification of persons at risk for the development of obesity allow and the application of a drug treatment and / or of changes of lifestyle possible make before a raised body weight Completely is developed.

Alternativ kann die Anwesenheit von Mikrosatelliten, welche mit mutierten Formen des humanen ob-r segregieren, für eine Diagnose verwendet werden. Verschiedene PCR-Primer können diesbezüglich verwendet werden.alternative can detect the presence of microsatellites, which have mutated forms of the human ob-r segregate, for a diagnosis can be used. Various PCR primers can be used in this regard become.

Das OB-R-Gen kann ebenfalls diagnostisch für Messungen seiner kodierten RNA und seines Proteins bei Ernährungsstörungen geeignet sein. Es wird in einer bestimmten Ernährungsstörung von Wichtigkeit sein, zu wissen, ob OB-R-RNA und/oder sein kodiertes Protein hochreguliert oder herunterreguliert ist. Wenn eine fettleibige Person erhöhte Mengen OB-R aufweist, würde es daher sichtbar werden, dass das Problem strangabwärts von OB-R liegt, während, wenn die OB-R-Expression reduziert ist, es sichtbar werden würde, das unangemessen niedrige Mengen von OB-R die Ursache der Fettleibigkeit sein kann (egal, ob der Defekt im OB-R-Gen liegt, oder nicht). Wenn ein Krebs- oder AIDS-Patient, welcher Gewicht verloren hat, erhöhte Mengen OB-R aufweist, kann umgekehrt geschlossen werden, dass eine unangemessen hohe Expression von OB-R für den Gewichtsverlust verantwortlich ist.The OB-R gene can also be used diagnostically for measurements of its encoded RNA and its protein are suitable for nutritional disorders be. It will be of importance in a particular nutritional disorder, too know if OB-R RNA and / or its encoded protein is up-regulated or down regulated. If an obese person has increased amounts OB-R would have it therefore becomes visible that the problem is downstream of OB-R lies, while, if the OB-R expression is reduced, it would become visible, the unreasonably low Quantities of OB-R can be the cause of obesity (no matter whether the defect is in the OB-R gene or not). If a cancer or AIDS patient who has lost weight, may have increased amounts of OB-R conversely concluded that an inappropriately high level of expression from OB-R for the weight loss is responsible.

Die vorliegende Offenbarung befasst sich nicht nur mit unangemessenen Mengen der Expression von OB-R, sondern auch mit der Expression von nicht funktionsfähigen oder dysfunktionellen Spleißformen. Die hier offenbarte Nukleinsäure-Diagnostik stellt ein Bestimmen bereit, ob die hauptsächlich exprimierte Form dysfunktional ist, z. B. für eine Signaltransduktion. Wie in den Beispielen, infra, gezeigt wurde, exprimieren db mutierte Mäuse (C57BL/Ks db/db) eine längere OB-R-mRNA (wie durch RT-PCR bestimmt wurde).The This disclosure is not only inadequate Levels of expression of OB-R, but also with expression from non-functional or dysfunctional splice forms. The nucleic acid diagnosis disclosed herein provides determining whether the predominantly expressed form is dysfunctional is, for. For example a signal transduction. As shown in the examples, infra, express db mutant mice (C57BL / Ks db / db) a longer one OB-R mRNA (as described by RT-PCR was determined).

Therapeutikatherapeutics

Die hier offenbarten Polypeptide, Nukleinsäuren und Antikörper weisen ein erhebliches therapeutisches Potenzial auf. Vorzugsweise wird eine therapeutisch wirksame Menge eines solchen Mittels (z. B. die lösliche Form des Proteins oder DNA für eine Gentherapie oder eine Antisense-Nukleinsäure, um der Leptinaktivität entgegenzuwirken) in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Bindemittel verabreicht.The polypeptides, nucleic acids and antibodies disclosed herein have a considerable therapeutic value great potential. Preferably, a therapeutically effective amount of such agent (e.g., the soluble form of the protein or DNA for gene therapy or an antisense nucleic acid to counteract leptin activity) is administered in a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, or vehicle.

Der Begriff "pharmazeutisch verträglich" betrifft molekulare Einheiten und Zusammensetzungen, welche physiologisch tolerierbar sind und nicht typischerweise eine allergische oder ähnlich unpassende Reaktion hervorrufen, wie Magenstörung, Schwindel und desgleichen, wenn sie an einen Menschen verabreicht werden. In einer Ausführungsform kann der Begriff "pharmazeutisch verträglich", so wie hier verwendet, bedeuten, von einer Aufsichtsbehörde der Bundes- oder einer Staats-Regierung genehmigt zu sein oder in der U.S. Pharmacopeia oder anderen allgemein bekannten Arzneimittelbüchern für die Verwendung in Tieren und insbesondere in Menschen aufgeführt zu sein. Der Begriff "Träger" betrifft ein Verdünnungsmittel, Adjuvans, Bindemittel oder Träger, mit welchem die Verbindung verabreicht wird. Solche pharmazeutischen Träger können sterile Flüssigkeiten sein, wie Wasser und Öle, einschließlich von jenen mit Erdöl-, tierischem, pflanzlichem oder synthetischem Ursprung, wie Erdnussöl, Sojabohnenöl, Mineralöl, Sesamöl und desgleichen. Wasser oder Salzlösungs-Lösungen und wässrige Dextrose- und Glycerollösungen werden vorzugsweise als Träger eingesetzt, insbesondere für injizierbare Lösungen. Geeignete pharmazeutische Träger werden in Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Aufl., Mack Publishing Co., Esston, PA (1990) beschrieben.Of the Term "pharmaceutical compatible "refers to molecular Units and compositions which are physiologically tolerable are not and typically not an allergic or similarly inappropriate Cause reaction, such as stomach disturbance, dizziness and the like, when administered to a human. In one embodiment the term "pharmaceutical compatible ", as used here, mean, from a regulatory agency to be approved by the federal or a state government or in U.S. Pat. Pharmacopeia or other commonly-known pharmacopoeias for use to be listed in animals and especially in humans. The term "carrier" refers to a diluent, Adjuvant, binder or carrier, with which the compound is administered. Such pharmaceutical carrier can sterile liquids be like water and oils, including of those with petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and the like. Water or saline solutions and aqueous Dextrose and Glycerollösungen be preferably as a carrier used, in particular for injectable solutions. Suitable pharmaceutical carriers Be in Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co., Esston, PA (1990).

Der Begriff "therapeutisch wirksame Menge" wird hier verwendet, um eine Menge zu bezeichnen, welche ausreicht, um einen klinisch erheblichen Mangel der Aktivität, Funktion und Antwort des Wirts um mindestens 15%, vorzugsweise um min destens 50%, weiter bevorzugt um mindestens 90% zu reduzieren und am meisten bevorzugt, um ihn zu verhindern. Alternativ ist eine therapeutisch wirksame Menge ausreichend, um eine Verbesserung in einem klinisch erheblichen Zustand im Wirt zu verursachen. Eine Modulation der OB-R-Aktivität kann zum Reduzieren des Körpergewichts (durch Erhöhen seiner Aktivität) oder Erhöhen des Körpergewichts (durch Vermindern seiner Aktivität) geeignet sein.Of the Term "therapeutic effective amount "will used here to denote a quantity that is sufficient to a clinically significant lack of activity, function and response of the Hosts by at least 15%, preferably at least 50%, further preferably reduced by at least 90%, and most preferably, to prevent him. Alternatively, a therapeutically effective Amount sufficient to produce an improvement in a clinically significant To cause state in the host. A modulation of the OB-R activity can be used for Reduce body weight (by increasing his activity) or increase of body weight (by decreasing its activity) be suitable.

Von einer Verabreichung von rekombinantem löslichem OB-R-Polypeptid, welches OB-Re entspricht, wird erwartet, dass es zu einem Gewichtsverlust, insbesondere einer Abnahme des Fettgewebes führt. Der lösliche Typ des OB-Re-Polypeptids kann unter Verwendung von bakteriellen und/oder Säugetier-Standard-Expressionsvektoren, synthetisch oder aus Plasma oder Serum aufgereinigt hergestellt werden, alles wie hier zuvor detailliert beschrieben. Alternativ kann eine erhöhte Expression von nativem löslichen OB-R-Polypeptid durch homologe Rekombinationstechniken, wie supra beschrieben, induziert werden.From administration of recombinant soluble OB-R polypeptide which OB-Re equals, it is expected to cause weight loss, especially a decrease in the fatty tissue leads. The soluble type of OB-Re polypeptide can be detected using bacterial and / or mammalian standard expression vectors, synthesized or purified from plasma or serum will be described in detail as described above. alternative can be an increased Expression of native soluble OB-R polypeptide by homologous recombination techniques, such as supra can be induced.

Eine Reduktion der Leptinaktivität (durch Entwickeln von Antagonisten, Inhibitoren, der Verwendung von neutralisierenden Antikörpern oder Antisense-Molekülen) sollte zu einer Gewichtszunahme führen, wie sie für die Behandlung des Gewichtsverlustes gewünscht sein könnte, welcher mit Krebs, AIDS oder Magersucht verbunden ist. In einer Ausführungsform kann eine Leptin bindende Form des löslichen OB-R eingesetzt werden, welcher Abschnitte fehlen, die für eine Signaltransduktion oder Verstärkung nötig sind.A Reduction of leptin activity (by developing antagonists, inhibitors, the use of neutralizing antibodies or antisense molecules) should lead to weight gain, as for the treatment of weight loss desired could be, which is associated with cancer, AIDS or anorexia. In a embodiment a leptin-binding form of the soluble OB-R can be used, which sections are missing for a signal transduction or amplification are needed.

Polypeptid basierte therapeutische BehandlungPolypeptide based therapeutic treatment

In der einfachsten Analyse ist das OB-R-Gen eng mit der Bestimmung des Körpergewichts in Tieren, insbesondere in Mäusen, Ratten, Hunden und Menschen verbunden. Das OB-R-Genprodukt und entsprechend verwandte Moleküle scheinen einen Teil eines Signalweges darzustellen, mit welchem das Fettgewebe mit dem Gehirn und den anderen Organen kommuniziert. Es wird angenommen, dass mindestens eine Spleißform des OB-R-Polypeptids (z. B. OB-Rb) selber ein Signalmolekül darstellt, d. h. einen Rezeptor für das Hormon Leptin.In In the simplest analysis, the OB-R gene is closely related to the determination of body weight in animals, especially in mice, Connected to rats, dogs and humans. The OB-R gene product and accordingly related molecules seem to represent part of a signaling pathway with which the fatty tissue communicates with the brain and other organs. It is believed that at least one splice form of the OB-R polypeptide (eg, OB-Rb) itself represents a signaling molecule, i. H. a receptor for the Hormone leptin.

Das lösliche OB-R-Polypeptid oder funktionell aktive Fragmente davon oder ein Antagonist davon können oral oder parenteral, vorzugsweise parenteral verabreicht werden. Da die metabolische Homeostase ein kontinuierlicher Vorgang ist, wird eine Verabreichung mit kontrollierter Freisetzung des löslichen OB-R-Polypeptids (OB-Re) bevorzugt. Zum Beispiel kann das Polypeptid unter Verwendung einer intravenösen Infusion, einer implantierbaren osmotischen Pumpe, eines transdermalen Pflasters, von Liposomen oder auf andere Arten der Verabreichung verabreicht werden. In einer Ausführungsform kann eine Pumpe verwendet werden [Langer et al., Hrsg., Medical Applications of Controlled Relase, CRC Press, Boca Raton, Florida (1974), Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14: 201 (1987), Buchwald et al., Surgery, 88: 507 (1980), Saudek et al., N. Engl. J. Med., 321: 574 (1989)]. In einer anderen Ausführungsform können polymere Materialien verwendet werden [Langer, 1974, supra, Sefton, 1987, supra, Smolen et al., Hrsg., Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Wiley, New York (1984), Ranger et al., J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem., 23: 61 (1983), siehe ebenfalls Levy et al., Science, 228: 190 (1985), During et al., Ann. Neurot., 25: 351 (1989), Howard et al., J. Neurosurg., 71: 105 (1989)]. In noch einer anderen Ausführungsform kann ein kontrolliertes Freisetzungssystem in die Nähe des therapeutischen Ziels gebracht werden, d. h. des Gehirns, so dass nur ein Anteil der systemischen Dosis benötigt wird [siehe z. B. Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, Band 2, S. 115–138 (1984)]. Andere kontrollierte Freisetzungssysteme werden im Überblick von Langer, Science, 249: 1527–1533 (1990) diskutiert. In einer anderen Ausführungsform kann die therapeutische Verbindung in einem Vesikel abgegeben werden, insbesondere einem Liposom [siehe Langer, 1990, supra, Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein und Fidler (Hrsg.), Liss, New York, S. 353–365 (1989), Lopez-Berestein, ibid, S. 317–327, siehe allgemein ibid.].The soluble OB-R polypeptide or functionally active fragments thereof or an antagonist thereof may be administered orally or parenterally, preferably parenterally. Since metabolic homeostasis is a continuous process, controlled release administration of the soluble OB-R polypeptide (OB-Re) is preferred. For example, the polypeptide may be administered using an intravenous infusion, an implantable osmotic pump, a transdermal patch, liposomes, or other modes of administration. In one embodiment, a pump may be used [Langer et al., Eds., Medical Applications of Controlled Relase, CRC Press, Boca Raton, Florida (1974), Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14: 201 (1987), Buchwald et al., Surgery, 88: 507 (1980), Saudek et al., N. Engl. J. Med., 321: 574 (1989)]. In another embodiment, polymeric materials may be used [Langer, 1974, supra, Sefton, 1987, supra, Smolen et al., Eds., Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Wiley, New York (1984), Ranger et al., J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem., 23: 61 (1983), see also Levy et al., Science, 228: 190 (1985), During et al., Ann. Neurot., 25: 351 (1989), Howard et al., J. Neurosurg., 71: 105 (1989)]. In yet another embodiment, a controlled release system may be brought near the therapeutic target, ie, the brain, so that only a portion of the systemic dose is needed [see, e.g. Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, Vol. 2, pp. 115-138 (1984)]. Other controlled release systems are reviewed in overview by Langer, Science, 249: 1527-1533 (1990). In another embodiment, the therapeutic compound may be delivered in a vesicle, particularly a liposome [see Langer, 1990, supra, Treat et al., In Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.). , Liss, New York, pp. 353-365 (1989), Lopez-Berestein, ibid, pp. 317-327, see generally ibid.].

In einem weiteren Aspekt können rekombinante Zellen, welche mit der löslichen Spleißform der OB-R-cDNA transformiert wurden (z. B. OB-Re, welches hier verwendet werden wird, um einen löslichen OB-R-Agonisten des Leptins zu bezeichnen), und welche hohe Mengen des Polypeptids exprimieren, in ein Individuum transplantiert werden, welches eine Verstärkung der Leptinaktivität benötigt. Vorzugsweise werden autologe Zellen, welche mit OB-Re transformiert wurden, transplantiert, um eine Abstoßung zu verhindern, alternativ ist eine Technologie verfügbar, um nicht autologe Zellen abzuschirmen, welche lösliche Faktoren innerhalb einer Polymermatrix herstellen, welche eine Immunerkennung und Abstoßung verhindert.In another aspect recombinant cells encoding the soluble splice form of the OB-R cDNA have been transformed (eg, OB-Re, which are used here becomes a soluble OB-R agonist of leptin), and what high levels of the polypeptide be transplanted into an individual who has a reinforcement the leptin activity needed. Preferably, autologous cells are transformed with OB-Re were transplanted to prevent rejection, alternatively is a technology available to shield non-autologous cells, which soluble factors within a Produce polymer matrix, which prevents immune detection and rejection.

Das OB-Re-Polypeptid kann durch intravenöse, intraarterielle, intraperitoneale, intramuskuläre oder subkutane Wege der Verabreichung abgegeben werden. Alternativ kann das OB-Re-Polypeptid, richtig formuliert, durch nasale oder orale Verabreichung verabreicht werden. Eine dauerhafte Versorgung mit OB-Re kann durch Bereistellen einer therapeutisch wirksamen Dosis (d. h. einer Dosis, welche wirksam ist, um metabolische Veränderungen in einem Individuum zu induzieren) in den nötigen Intervallen, z. B. täglich, alle 12 Stunden, usw. sichergestellt werden. Diese Parameter werden von der Schwere des zu behandelnden Krankheitszustands, anderen Aktivitäten, wie eine Diätmodifikation, welche ausgeführt werden, vom Gewicht, Alter und dem Geschlecht des Individuums und von anderen Kriterien abhängen, welche einfach gemäß der guten medizinischen Standardpraxis vom Fachmann bestimmt werden können.The OB-Re polypeptide can be produced by intravenous, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular or subcutaneous routes of administration. alternative Can the OB-Re polypeptide, properly formulated, by nasal or oral administration. A permanent supply Using OB-Re may be beneficial by providing a therapeutically effective Dose (i.e., a dose which is effective to metabolic changes induce in a subject) at the necessary intervals, e.g. B. daily, all 12 hours, etc. are ensured. These parameters are from the severity of the condition to be treated, other activities, such as a diet modification, which executed the weight, age and gender of the individual and depend on other criteria, which simply according to the good Standard medical practice can be determined by the specialist.

Es kann einfach vom Fachmann erkannt werden, dass irgendein lösliches OB-R-Polypeptid, z. B. ein Leptinantagonist, ebenfalls wie oben für OB-Re beschrieben wurde, verabreicht werden kann.It can simply be recognized by the professional that any soluble OB-R polypeptide, z. A leptin antagonist, also as described above for OB-Re, can be administered.

Pharmazeutische ZusammensetzungenPharmaceutical compositions

In noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Offenbarung werden pharmazeutische Zusammensetzungen des oben erwähnten bereitgestellt. Solche pharma zeutischen Zusammensetzungen können für eine Verabreichung durch Injektion, oder für eine orale, pulmonale, nasale oder andere Formen der Verabreichung sein. Im Allgemeinen werden von dieser Offenbarung pharmazeutische Zusammensetzungen eingeschlossen, welche wirksame Mengen des Proteins oder Derivatprodukte zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmitteln, Konservierungsmitteln, Lösungsvermittlern, Emulgatoren, Adjuavantien und/oder Trägern umfassen. Solche Zusammensetzungen schließen Verdünnungsmittel mit unterschiedlichem/r Puffergehalt (z. B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat), pH-Wert und Ionenstärke, Zusatzstoffe, wie Detergenzien und lösungsvermittelnde Mittel (z. B. Tween 80, Polysorbat 80), Antioxidantien (z. B. Ascorbinsäure, Natirummetabisulfit), Konservierungsstoffe (z. B. Thimerosal, Benzylalkohol) und Füllsubstanzen (z. B. Lactose, Mannitol), den Einschluss des Materials in Teilchenpräparationen polymerer Verbindungen, wie Polymilchsäure, Polyglykolsäure, usw. oder in Liposomen, ein. Hyaluronsäure oder andere anionische Polymere können ebenfalls verwendet werden. Solche Zusammensetzungen können den physikalischen Zustand, die Stabilität, die Geschwindigkeit der in vivo Freisetzung und die Geschwindigkeit der in vivo Clearance des vorliegenden Proteins und der Derivate beeinflussen [siehe z. B. Martin, Remginton's Pharmaceutical Sciences, 18. Aufl., (1990, Mack Publishing Co., Esston, PA 18042) Seiten 1435–1712]. Die Zusammensetzungen können in flüssiger Form hergestellt werden oder können in Form von getrocknetem Pulver, wie in lyophilisierter Form, vorliegen.In Still another aspect of the present disclosure is pharmaceutical Compositions of the above-mentioned provided. Such pharmaceutical compositions may be for administration by injection, or for oral, pulmonary, nasal or other forms of administration be. In general, this disclosure will be pharmaceutical Including compositions containing effective amounts of the protein or derivative products together with pharmaceutically acceptable Diluents, Preservatives, solubilizers, Emulsifiers, adjuvants and / or carriers. Such compositions shut down thinner with different buffer content (eg Tris-HCl, acetate, phosphate), pH and ionic strength, Additives such as detergents and solubilizers (e.g. Tween 80, polysorbate 80), antioxidants (e.g., ascorbic acid, sodium tetrabisulfite), Preservatives (eg thimerosal, benzyl alcohol) and fillers (eg lactose, mannitol), the inclusion of the material in particle preparations polymeric compounds such as polylactic acid, polyglycolic acid, etc. or in liposomes, a. Hyaluronic acid or other anionic Polymers can also be used. Such compositions can change the physical condition, the stability that Speed of in vivo release and speed the in vivo clearance of the present protein and derivatives affect [see, for. Martin, Remginton's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., (1990, Mack Publishing Co., Esston, PA 18042) pages 1435-1712]. The compositions can in liquid Form or can be made in the form of dried powder, as in lyophilized form.

Orale AbgabeOral delivery

Für die Verwendung hier sind orale feste Dosierungsformen eingeschlossen, welche im Allgemeinen in Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Aufl., (1990 Mack Publishing Co. Esston PA 18042) in Kapitel 89 beschrieben werden. Feste Dosierungsformen schließen Tabletten, Kapseln, Pillen, Pastillen oder Lutschpastillen, Stärkekapseln oder Kügelchen ein. Liposomale oder proteinoide Einkapselungen können ebenfalls verwendet werden, um die vorliegenden Zusammensetzungen zu formulieren (wie zum Beispiel proteinoide Mikrokugeln [ U.S. Patent Nr. 4,925,673 ]). Eine liposomale Einkapselung kann verwendet werden, und die Liposomen können mit verschiedenen Polymeren derivatisiert werden [z. B. U.S. Patent Nr. 5,013,556 ]. Eine Beschreibung von möglichen festen Dosierungsformen für die Therapeutik wird von Marshall in Modem Pharmaceutics, Kapitel 10, Banker und Rhodes, Hrsg. (1979) gegeben, die Formulierung wird das Protein (oder das chemisch modifizierte Protein) und inerte Inhaltsstoffe einschließen, welche einen Schutz gegen die Magenumgebung und eine Freisetzung des biologisch aktiven Materials im Darm zulassen.For use herein, oral solid dosage forms are generally described in Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., (1990 Mack Publishing Co. Esston PA 18042) in Chapter 89. Solid dosage forms include tablets, capsules, pills, troches or lozenges, starch capsules or beads. Liposomal or proteinoid encapsulations may also be used to formulate the present compositions (such as proteinoid microspheres). U.S. Patent No. 4,925,673 ]). Liposomal encapsulation can be used, and the liposomes can be derivatized with various polymers [e.g. B. U.S. Patent No. 5,013,556 ]. A description of possible solid dosage forms for therapeutics is given by Marshall in Modem Pharmaceutics, Chapter 10, Banker and Rhodes, Ed. (1979), the formulation will include the protein (or the chemically modified protein) and inert ingredients which confer protection against the stomach environment and release of the biologically active material in the intestine.

Ebenfalls spezifisch eingeschlossen sind orale Dosierungsformen der oben erwähnten derivatisierten Proteine. Das Protein kann chemisch modifiziert werden, so dass eine orale Abgabe des Derivats wirksam ist. Im Allgemeinen stellt die eingeschlossene chemische Modifikation eine Anheftung von mindestens einem Rest an das Protein-(oder Peptid-)Molekül selber dar, wobei der Rest (a) eine Inhibition der Proteolyse und (b) eine Aufnahme in dem Blutstrom aus dem Magen oder Darm ermöglicht. Ebenfalls gewünscht ist die Zunahme der Gesamtstabilität des Proteins und die Zunahme der Zirkulationszeit im Körper. Beispiele solcher Reste schließen: Polyethylenglykol, Copolymere aus Ethylenglykol, und Propylenglykol, Carboxyxmethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Polyprolin ein [Abuchowski et al., 1981, supra, Newmark et al., J. Appl. Biochem., 4: 185–189 (1982)]. Andere Polymere, welche verwendet werden könnten, sind Poly-1,3-dioxolan und Poly-1,3,6-trioxocan. Bevorzugt für die pharmazeutische Verwendung sind, wie oben angegeben, Polyethylenglykolreste.Also specifically included are oral dosage forms of the above-mentioned derivatized proteins. The protein can be chemically modified, leaving an oral Delivery of the derivative is effective. In general, the trapped chemical modification attaching at least one residue the protein (or peptide) molecule itself, with the remainder (a) inhibiting proteolysis and (b) allows uptake in the bloodstream from the stomach or intestine. Also desired is the increase in the overall stability of the protein and the increase the circulation time in the body. Examples of such radicals include: Polyethylene glycol, copolymers of ethylene glycol, and propylene glycol, Carboxymethyl cellulose, dextran, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone and polyproline [Abuchowski et al., 1981, supra, Newmark et al., J. Med. Appl. Biochem., 4: 185-189 (1982)]. Other polymers that could be used are Poly-1,3-dioxolane and poly-1,3,6-trioxocane. Preferred for the pharmaceutical Use, as indicated above, polyethylene glycol.

Für das Protein (oder Derivat) kann der Ort der Freisetzung der Magen, der Dünndarm (das Duodenum, das Jejunum oder das Ileum) oder der Dickdarm sein. Der Fachmann hat Formulierungen verfügbar, welche sich im Magen nicht auflösen, aber das Material im Duodenum oder irgendwo anders im Darm freisetzen werden. Vorzugsweise wird die Freisetzung die schädlichen Wirkungen der Magenumgebung vermeiden, entweder durch Schutz des Proteins (oder Derivats) oder durch Freisetzung des biologisch aktiven Materials außerhalb der Magenumgebung, wie im Darm.For the protein (or derivative) may be the site of release of the stomach, the small intestine (the Duodenum, the jejunum or the ileum) or the large intestine. Of the Professional has formulations available which do not dissolve in the stomach, but release the material in the duodenum or somewhere else in the gut. Preferably, the release will be the deleterious effects of the gastric environment avoid, either by protection of the protein (or derivative) or by releasing the biologically active material outside the stomach environment, as in the intestine.

Um eine vollständige Magenresistenz sicherzustellen, ist eine Beschichtung erforderlich, welche bis mindestens pH-Wert 5,0 impermeabel ist. Beispiele für gängigere inerte Inhaltsstoffe, welche als enterische Beschichtungen verwendet werden, sind Zelluloseacetattrimellitat (CAT), Hydroxypropylmethylzellulosephthalat (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, Polyvinylacetatphthalat (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, Zelluloseacetatphthalat (CAP), Eudragit L, Eudragit S und Schellack. Diese Beschichtungen können als gemischte Filme verwendet werden.Around a complete To ensure gastric resistance, a coating is required which is impermeable to at least pH 5.0. Examples of more common ones inert ingredients that are used as enteric coatings are cellulose acetate trimellitate (CAT), hydroxypropylmethyl cellulose phthalate (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, polyvinyl acetate phthalate (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, cellulose acetate phthalate (CAP), Eudragit L, Eudragit S and shellac. These coatings can be used as mixed films become.

Eine Beschichtung oder ein Gemisch aus Beschichtungen kann ebenfalls auf Tabletten verwendet werden, welche nicht für einen Schutz gegen den Magen gedacht sind. Dieses kann Zuckerbeschichtungen einschließen, oder Beschichtungen, welche es einfacher machen, die Tablette zu schlucken. Kapseln können aus einer harten Hülle (wie Gelatine) zur Abgabe eines trockenen Therapeutikums bestehen, z. B. eines Pulvers, für flüssige Formen kann eine weiche Gelatinehülle verwendet werden. Das Hüllmaterial von Stärkekapseln könnte dicke Stärke oder ein anderes essbares Papier sein. Für Pillen, Lutschpastillen, gepresste Tabletten oder Tablettenpulver können feuchtigkeitskonzentrierende Techniken verwendet werden.A Coating or a mixture of coatings can also used on tablets which are not for protection against the stomach are meant. This may include sugar coatings, or Coatings that make it easier to swallow the tablet. Capsules can out a hard shell (like gelatin) to deliver a dry therapeutic, z. B. a powder, for liquid Shapes may be used a soft gelatin shell. The wrapping material of starch capsules could thick starch or another edible paper. For pills, lozenges, pressed tablets or tablet powders can be moisture-concentrating Techniques are used.

Das Therapeutikum kann in die Formulierung als feine Mikropartikel in Form von Granula oder Kügelchen mit einer Partikelgröße von ungefähr 1 mm eingeschlossen werden. Die Formulierung des Materials zur Kapselverabreichung könnte ebenfalls als Pulver, leicht komprimierte Pfropfen oder sogar als Tabletten stattfinden. Das Therapeutikum könnte durch Kompression hergestellt werden.The Therapeutic may be included in the formulation as fine microparticles Form of granules or globules with a particle size of about 1 mm be included. The formulation of the material for capsule administration could also as a powder, slightly compressed plugs or even as Tablets take place. The therapeutic could be made by compression become.

Farbstoffe und Aromastoffe können alle eingeschlossen werden. Zum Beispiel kann das Protein (oder Derivat) formuliert werden (wie durch Liposomen- oder Mikrokugeleinkapselung) und anschließend weiter in ein essbares Produkt, wie ein gekühltes Getränk, aufgenommen werden, welches Farbstoffe und Aromastoffe enthält.dyes and flavorings can all are included. For example, the protein (or derivative) be formulated (as by liposome or microsphere encapsulation) and subsequently be further incorporated into an edible product, such as a chilled beverage, which Contains dyes and flavorings.

Das Therapeutikum kann mit einem inerten Material verdünnt werden oder sein Volumen kann damit erhöht werden. Diese Verdünnungsmittel könnten Kohlenhydrate, insbesondere Mannitol, α-Lactose, wasserfreie Lactose, Zellulose, Saccharose, modifizierte Dextrane und Stärke einschließen. Bestimmte anorganische Salze können ebenfalls als Füllstoffe verwendet werden, einschließlich von Calciumtriphosphat, Magnesiumcarbonat und Natriumchlorid. Einige kommerziell verfügbare Verdünnungsmittel sind Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress und Avicell.The Therapeutic can be diluted with an inert material or its volume can be increased become. These diluents could Carbohydrates, in particular mannitol, α-lactose, anhydrous lactose, Cellulose, sucrose, modified dextrans and starch. Certain inorganic salts can also as fillers can be used, including of calcium triphosphate, magnesium carbonate and sodium chloride. Some commercially available thinner Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress and Avicell.

Disintegrantien können in die Formulierung des Therapeutikums in eine feste Dosierungsform eingeschlossen werden. Materialien, welche als Disintegrantien verwendet werden, schließen Stärke, einschließlich des komerziellen, auf Stärke basierenden Disintegrans Explotab, ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Natriumstärkeglykolat, Amberlit, Natriumcarboxymethylzellulose, Ultramylopektin, Natriumalginat, Gelatine, Orangenschale, saure Carboxymethylzellulose, natürlicher Schwamm und Bentonit können alle verwendet werden. Eine andere Form der Disintegrantien sind die unlöslichen kationischen Austauschharze. Pulverisierte Gummis können als Desintegrantien und als Bindemittel verwendet werden, und diese können pulverisierte Gummis, wie Agar, Karaya und Tragacanth einschließen. Alginsäure und seine Natriumsalze sind ebenfalls als Disintegrantien geeignet.Disintegrants may be included in the formulation of the therapeutic in a solid dosage form. Materials used as disintegrants include, but are not limited to, starch, including the commercial Starol based Disinttegrans Explotab. Nat ammonium starch glycolate, amberlite, sodium carboxymethyl cellulose, ultramylopectin, sodium alginate, gelatin, orange peel, acid carboxymethyl cellulose, natural sponge and bentonite may all be used. Another form of disintegrants are the insoluble cationic exchange resins. Powdered gums may be used as disintegrants and as binders, and these may include powdered gums such as agar, karaya and tragacanth. Alginic acid and its sodium salts are also suitable as disintegrants.

Bindemittel können verwendet werden, um das therapeutische Mittel zusammenzuhalten, um einen feste Tablette zu bilden, und schließen Materialen aus natürlichen Produkten, wie Akazie, Tragacanth, Stärke und Gelatine ein. Andere schließen Methylzellulose (MC), Ethylzellulose (EC) und Carboxymethylzellulose (CMC) ein. Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Hydroxypropylmethylzellulose (HPMC) könnten beide in alkoholischen Lösungen verwendet werden, um das Therapeutikum zu granulieren.binder can used to hold the therapeutic agent together, to form a solid tablet, and exclude materials from natural ones Products such as acacia, tragacanth, starch and gelatin. Other shut down Methylcellulose (MC), ethylcellulose (EC) and carboxymethylcellulose (CMC) one. Polyvinylpyrrolidone (PVP) and hydroxypropyl methylcellulose (HPMC) could both in alcoholic solutions used to granulate the therapeutic.

Ein Anti-Abriebmittel kann in die Formulierung des Therapeutikums eingeschlossen werden, um ein Haftenbleiben während des Formulierungsverfahrens zu ver hindern. Gleitmittel können als Schicht zwischen dem Therapeutikum und der Pressformwand verwendet werden, und diese können: Stearinsäure, einschließlich seiner Magnesium- und Calciumsalze, Polytetrafluorethylen (PTFE), Paraffinöl, Pflanzenöle und Wachse einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt. Lösliche Gleitmittel können ebenfalls verwendet werden, wie Natriumlaurylsulfat, Magnesiumlaurylsulfat, Polyethylenglykol mit verschiedenen Molekulargewichten und Carbowax 4000 und 6000.One Anti-abrasive may be included in the formulation of the therapeutic be to stick to it while the formulation process to prevent ver. Lubricants can be used as Layer used between the therapeutic and the mold wall and they can: stearic acid, including its magnesium and calcium salts, polytetrafluoroethylene (PTFE), Paraffin oil, vegetable oils and include waxes, but are not limited to this. soluble Lubricants can also be used, such as sodium lauryl sulfate, magnesium lauryl sulfate, Polyethylene glycol of various molecular weights and Carbowax 4000 and 6000.

Flussregulierungsmittel, welche die Fließeigenschaften des Arzneimittels während der Formulierung verbessern könnten und um eine Wiederanordnung während der Kompression zu unterstützen, könnten hinzugefügt werden. Die Flussregulierungsmittel können Stärke, Talk, pyrogenes Silika und hydriertes Silikoaluminat einschließen.Flow control agent, which the flow properties of the drug during could improve the formulation and a rearrangement during to support the compression, could added become. The flux regulators may be starch, talc, fumed silica and hydrogenated silicoaluminate.

Um die Lösung des Therapeutikums in der wässrigen Umgebung zu unterstützen, könnte ein oberflächenaktives Mittel als Benetzungsmittel hinzugefügt werden. Oberflächenaktive Mittel können anionische Detergenzien einschließen, wie Natriumlaurylsulfat, Dioctylnatriumsulfosuccinat und Dioctylnatriumsulfonat. Kationische Detergenzien könnten verwendet werden und könnten Benzalkoniumchlorid und Benzethomiumchlorid einschließen. Die Liste von möglichen nichtionischen Detergenzien, welche in die Formulierung als oberflächenaktive Mittel eingeschlossen werden könnten, ist Lauromacrogol 400, Polyoxyl 40-Stearat, Polyoxyethylen, hydriertes Rizinusöl 10, 50 und 60, Glycerinmonostearat, Polysorbat 40, 60, 65 und 80, Saccharosefettsäureester, Methylzellulose und Carboxymethylcellulose. Diese oberflächenaktiven Mittel könnten in der Formulierung des Proteins oder Derivats entweder alleine oder als ein Gemisch mit verschiedenen Verhältnissen anwesend sein.Around the solution Therapeutic in aqueous To support the environment could a surface active Agents are added as wetting agents. surfactants Means can anionic detergents, such as sodium lauryl sulfate, Dioctyl sodium sulfosuccinate and dioctyl sodium sulfonate. cationic Detergents could be used and could Benzalkonium chloride and benzethomium chloride. The List of possible nonionic detergents incorporated in the formulation as surface active agents Funds could be included Lauromacrogol 400, polyoxyl 40 stearate, polyoxyethylene, hydrogenated castor oil 10, 50 and 60, glycerol monostearate, polysorbate 40, 60, 65 and 80, Saccharosefettsäureester, Methylcellulose and carboxymethylcellulose. This surface active Could mean in the formulation of the protein or derivative either alone or be present as a mixture with different ratios.

Zusatzstoffe, welche möglicherweise die Aufnahme des Proteins (oder Derivats) verstärken, sind zum Beispiel die Fettsäuren Ölsäure, Linolsäure und Linolensäure.additives which possibly enhance the uptake of the protein (or derivative) are, for example, the Oleic acid, linoleic acid and fatty acids Linolenic acid.

Eine Formulierung mit kontrollierter Freisetzung kann gewünscht sein. Das Arzneimittel könnte in eine inerte Matrix eingeschlossen werden, welche eine Freisetzung entweder durch Diffusions- oder Auslaug-Mechanismen erlaubt, z. B. Kaugummis. Langsam degenerierende Matrices können ebenfalls in die Formulierung eingeschlossen werden. Eine andere Form einer kontrollierten Freisetzung dieses Therapeutikums ist durch ein Verfahren, welches auf dem therapeutischen Oros-System basiert (Alza Corp.), d. h. das Arzneimittel wird in eine semipermeable Membran eingeschlossen, welche es Wasser erlaubt einzutreten und das Arzneimittel durch eine einzige kleine Öffnung aufgrund von osmotischen Wirkungen herauszudrücken. Einige enterische Beschichtungen weisen ebenfalls eine verzögerte Freisetzungswirkung auf.A A controlled release formulation may be desired. The drug could be included in an inert matrix, which is a release either by diffusion or leaching mechanisms allowed, for. B. chewing gum. Slowly degenerating matrices may also be included in the formulation become. Another form of controlled release of this Therapeutic is by a method which is based on the therapeutic Oros system based (Alza Corp.), d. H. The medicine becomes semipermeable Membrane included, which allows water to enter and the drug through a single small opening due to osmotic To express effects. Some enteric coatings also have a delayed release effect on.

Andere Beschichtungen können für die Formulierung verwendet werden. Diese schließen eine Vielzahl von Zuckern ein, welche in einem Beschichtungstiegel aufgebracht werden könnten. Das therapeutische Mittel könnte ebenfalls in einer filmbeschichteten Tablette gegeben werden. Die Materialien, welche in diesem Fall verwendet werden, sind in zwei Gruppen aufgeteilt. Die ersten sind die nicht enterischen Materialien und schließen Methylzellulose, Ethylzellulose, Hydroxyethylzellulose, Methylhydroxy-Ethylzellulose, Hydroxypropylzellulose, Hydroxypropyl-Methylzellulose, Natriumcarboxymethylzellulose, Providon und Polyethylenglykole ein. Die zweite Gruppe besteht aus den enterischen Materialien, welche gewöhnlich Ester der Phthalsäure sind.Other Coatings can for the Formulation to be used. These include a variety of sugars which could be applied in a coating crucible. The therapeutic agent could also be given in a film-coated tablet. The Materials used in this case are in two Split groups. The first are the nonenteric materials and close Methylcellulose, ethylcellulose, hydroxyethylcellulose, methylhydroxy-ethylcellulose, Hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, Providon and polyethylene glycols. The second group consists of the enteric materials, which are usually esters of phthalic acid.

Ein Gemisch aus Materialien könnte verwendet werden, um die optimale Filmbeschichtung bereitzustellen. Eine Filmbeschichtung kann in einem Tiegelbeschichter oder in einem Fließbett oder durch Kompressionsbeschichtung durchgeführt werden.A mixture of materials could be used to provide the optimum film coating. A film coating can be done in a pan coater or in a fluidized bed or by compression sion coating.

Pulmonale AbgabePulmonary delivery

Ebenfalls hier eingeschlossen ist die pulmonale Abgabe des vorliegenden löslichen Proteins (oder der Derivate davon). Das Protein (oder Derivat) wird an die Lungen eines Säugetiers beim Einatmen abgegeben und durchdringt die epitheliale Auskleidung der Lunge in den Blutstrom. Andere Berichte davon schließen Adjei et al., Pharmaceutical Research, 7(6): 565–569 (1990), Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics, 63: 135–144 (1990) (Leuprolidacetat), Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13 (Suppl. 5): 143–146 (1989) (Endothelin-1), Hubbard et al., Annals of Intemal Medicine, 3(3): 206–212 (1989) (α1-Antitrypsin), Smith et al., J. Clin. Invest., 84: 1145–1146 (1989) (α1-Proteinase), Oswein et al., "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, (März 1990), (rekombinantes humanes Wachstumshormon), Debs et al., J. Immunol., 140: 3482–3488 (1988) und Platz et al., U.S. Patent Nr. 5,284,656 (Granulozytenkolonie stimulierender Faktor) ein. Vorgesehen für die Verwendung in der Ausführung dieser Offenbarung ist ein weiter Bereich von mechanischen Geräten, welche für eine pulmonale Abgabe von therapeutischen Produkten entworfen wurden, einschließlich von, aber nicht beschränkt auf Zerstäuber, Dosierinhalatoren und Pulverinhalatoren, welche dem Fachmann alle geläufig sind.Also included herein is pulmonary delivery of the present soluble protein (or derivatives thereof). The protein (or derivative) is delivered to the lungs of a mammal upon inhalation and penetrates the epithelial lining of the lung into the bloodstream. Other reports include Adjei et al., Pharmaceutical Research, 7 (6): 565-569 (1990), Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics, 63: 135-144 (1990) (leuprolide acetate), Braquet et al. , Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13 (Suppl. 5): 143-146 (1989) (endothelin-1), Hubbard et al., Annals of Internal Medicine, 3 (3): 206-212 (1989) (α1-antitrypsin ), Smith et al., J. Clin. Invest., 84: 1145-1146 (1989) (α1-proteinase), Oswein et al., "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, (March 1990), (recombinant human growth hormone ), Debs et al., J. Immunol., 140: 3482-3488 (1988) and Platz et al., U.S. Patent No. 5,284,656 (Granulocyte colony stimulating factor). Intended for use in the practice of this disclosure is a wide range of mechanical devices designed for pulmonary delivery of therapeutic products, including, but not limited to, nebulizers, metered dose inhalers and powder inhalers, all of which will be apparent to those skilled in the art.

Einige spezifische Beispiele für kommerziell verfügbare Geräte, welche für die Ausführung dieser Offenbarung geeignet sind, sind der Ultravent-Zerstäuber, hergestellt von Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri, der Acorn II-Zerstäuber, hergestellt von Marquest Medical Products, Englewood, Colorado, der Ventolin-Dosierinhalator, hergestellt von Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina und der Spinhaler-Pulverinhalator, hergestellt von Fisons Corp., Redford, Massachusetts.Some specific examples of commercially available Equipment, which for execution suitable for this disclosure are the Ultravent atomizer by Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri, the Acorn II atomizer Marquest Medical Products, Englewood, Colorado, Ventolin Dosing Inhaler, manufactured by Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina and the spinhaler powder inhaler manufactured by Fisons Corp. Redford, Massachusetts.

Alle solche Geräte erfordern die Verwendung von Formulierungen, welche zum Verteilen des Proteins (oder Derivats) geeignet sind. Typischerweise ist jede Formulierung spezifisch für den Typ des eingesetzten Geräts und kann die Verwendung eines geeigneten Treibmittelmaterials einschließen, zusätzlich zu den üblichen Verdünnungsmitteln, Adjuvantien und/oder Trägern, welche für die Therapie geeignet sind. Die Verwendung von Liposomen, Mikrokapseln oder Mikrokugeln, Inklusionskomplexen oder anderen Typen von Trägern ist ebenfalls eingeschlos sen. Chemisch modifiziertes Protein kann ebenfalls in verschiedenen Formulierungen hergestellt werden, abhängig vom Typ der chemischen Modifikation oder vom Typ des eingesetzten Geräts.All such devices require the use of formulations for distribution of the protein (or derivative) are suitable. Typically, each one is Formulation specific for the type of device used and may include the use of a suitable propellant material, in addition to the usual Diluents, Adjuvants and / or carriers, which for the therapy are suitable. The use of liposomes, microcapsules or microspheres, inclusion complexes or other types of carriers also included. Chemically modified protein can also be prepared in different formulations, depending on Type of chemical modification or type of equipment used.

Formulierungen, welche für eine Verwendung in einem Zerstäuber, entweder einem Düsen- oder einem Ultraschall-Zerstäuber, geeignet sind, werden typischerweise ein Protein (oder Derivat) gelöst in Wasser in einer Konzentration von ungefähr 0,1 bis 25 mg biologisch aktives Protein pro ml Lösung umfassen. Die Formulierung kann ebenfalls einen Puffer und einen einfachen Zucker einschließen (z. B. zur Proteinstabilisierung und Regulierung des osmotischen Drucks). Die Zerstäuberformulierung kann ebenfalls ein oberflächenaktives Mittel enthalten, um eine oberflächeninduzierte Aggregation des Proteins zu reduzieren oder zu verhindern, welche durch die Zerstäubung der Lösung beim Bilden des Aerosols verursacht wird.formulations which for a use in a nebulizer, either a nozzle or an ultrasonic atomizer, are typically a protein (or derivative) solved in water in a concentration of about 0.1 to 25 mg biologically active protein per ml of solution include. The formulation may also contain a buffer and a include simple sugars (eg for protein stabilization and regulation of the osmotic Pressure). The nebulizer formulation may also be a surfactant included to a surface-induced Aggregation of the protein to reduce or prevent which through the atomization the solution is caused when forming the aerosol.

Formulierungen zur Verwendung in einem Dosierinhalatorgerät werden im Allgemeinen ein fein zerteiltes Pulver enthalten, welches das Protein (oder Derivat) enthält, welches mit Hilfe eines oberflächenaktiven Mittels in einem Treibmittel suspendiert ist. Das Treibmittel kann irgendein gängiges Material sein, welches für diesen Zweck eingesetzt wird, wie ein Chlorfluorkohlenstoff, ein Chlorfluorkohlenwasserstoff, ein Fluorkohlenwasserstoff oder ein Kohlenwasserstoff, einschließlich von Trichlorfluormethan, Dichlordifluormethan, Dichlortetrafluorethanol und 1,1,1,2-Tetrafluorethan oder Kombinationen davon. Geeignete oberflächenaktive Mittel schließen Sorbitantrioleat und Sojalecithin ein. Ölsäure kann ebenfalls als ein oberflächenaktives Mittel geeignet sein.formulations for use in a metered dose inhaler device generally containing finely divided powder containing the protein (or derivative) contains which by means of a surfactant suspended in a propellant. The propellant may be any course Be material for this Purpose, such as a chlorofluorocarbon, a hydrochlorofluorocarbon, a hydrofluorocarbon or a hydrocarbon, including Trichlorofluoromethane, dichlorodifluoromethane, dichlorotetrafluoroethanol and 1,1,1,2-tetrafluoroethane or combinations thereof. suitable surfactants Close funds Sorbitan trioleate and soya lecithin. Oleic acid can also be used as a surfactant Means be suitable.

Formulierungen zum Verteilen aus einem Pulverinhalatorgerät werden ein fein zerteiltes Trockenpulver umfassen, welches das Protein (oder Derivat) enthält, und können ebenfalls ein Füllmittel, wie Lactose, Sorbitol, Saccharose oder Mannitol in Mengen einschließen, welche eine Verteilung des Pulvers aus dem Gerät unterstützen, z. B. 50 bis 90 Gew.-% der Formulierung. Das Protein (oder Derivat) sollte am vorteilhaftesten in Teilchenform mit einer durchschnittlichen Teilchen größe von weniger als 10 μm (oder Mikrometer), am meisten bevorzugt 0,5 bis 5 μm, für die wirksamste Abgabe an die distale Lunge hergestellt werden.formulations for dispensing from a Pulverinhalatorgerät be a finely divided Dry powder comprising the protein (or derivative), and can also a filler, such as lactose, sorbitol, sucrose or mannitol in amounts which support a distribution of the powder from the device, for. B. 50 to 90 wt .-% the formulation. The protein (or derivative) should be most advantageous in Particle shape with an average particle size of less than 10 μm (or microns), most preferably 0.5 to 5 microns, for the most effective Delivery can be made to the distal lung.

Nasale AbgabeNasal delivery

Eine nasale Abgabe des Proteins (oder Derivats) ist ebenfalls eingeschlossen. Eine nasale Abgabe erlaubt die Passage des Proteins in den Blutstrom direkt nach der Verabreichung des therapeutischen Produkts an die Nase, ohne die Notwendigkeit der Ablagerung des Produkts in der Lunge. Formulierungen für eine nasale Abgabe schließen jene mit Dextran oder Cyclodextran ein.Nasal delivery of the protein (or derivative) is also included. Nasal delivery allows passage of the protein into the bloodstream immediately after administration of the therapeutic pro to the nose without the need to deposit the product in the lungs. Formulations for nasal delivery include those with dextran or cyclodextran.

Verfahren der Behandlung, Verfahren des Herstellens eines MedikamentsMethod of treatment, method of Producing a drug

In noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Offenbarung werden Verfahren der Behandlung und Herstellung eines Medikaments bereitgestellt. Die Zustände, die durch die Verabreichung der vorliegenden Derivate gelindert oder moduliert werden, sind jene, welche oben angegeben sind.In Yet another aspect of the present disclosure is methods the treatment and preparation of a medicament. The conditions, which is alleviated by the administration of the present derivatives or modulated are those given above.

Dosierungendoses

Für alle der oben erwähnten Moleküle werden Informationen bezüglich der geeigneten Dosierungsmengen zur Behandlung verschiedener Zustände in verschiedenen Patienten bekannt werden, wenn weitere Studien durchgeführt werden, und der Fachmann wird unter Berücksichtigung des therapeutischen Zusammenhangs, des Alters und der allgemeinen Gesundheit des Empfängers in der Lage sein, die richtige Dosierung festzulegen. Im Allgemeinen wird die Dosierung für eine Injektion oder Infusion zwischen 0,01 μg biologisch aktives Protein/kg Körpergewicht (wobei die Masse des Proteins alleine ohne chemische Modifikation berechnet wird) und 10 mg/kg (auf derselben Grundlage) liegen. Der Dosierungsplan kann abhängig von der Zirkulationshalbwertszeit des verwendeten Proteins oder Derivats, ob das Polypeptid durch eine Bolusdosis oder kontinuierliche Infusion abgegeben wird, und der verwendeten Formulierung variieren.For all of them mentioned above molecules will be information regarding the appropriate dosage levels for treating different conditions in different Patients become known when further studies are carried out, and the skilled person is considered of therapeutic context, age and general Health of the recipient be able to set the right dosage. In general will the dosage for an injection or infusion between 0.01 μg of biologically active protein / kg body weight (where the mass of the protein is calculated alone without chemical modification and 10 mg / kg (on the same basis). The dosage plan can be dependent from the circulation half-life of the protein used or Derivatives, whether the polypeptide by a bolus dose or continuous Infusion is dispensed, and the formulation used vary.

Verabreichung mit anderen VerbindungenAdministration with others links

Für eine mit Fettleibigkeit verbundene Therapie kann das vorliegende lösliche Protein (oder die Derivate) zusammen mit einer oder mehreren pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden, die zum Behandeln anderer klinischer Komplikationen der Fettleibigkeit verwendet werden, wie jene, welche zur Behandlung von Diabetes (z. B. Insulin), Bluthochdruck, hohem Cholesterinspiegel und anderen nachteiligen Zuständen, welche als Nebenwirkung der Fettleibigkeit auftreten, verwendet werden. Ebenfalls können andere Appetitunterdrücker gleichzeitig verabreicht werden, z. B. Amphetamine. Die Verabreichung kann gleichzeitig (zum Beispiel eine Verabreichung eines Gemisches des vorliegenden Proteins und Insulin) oder in seriatim stattfinden.For a with Obesity-related therapy may be the present soluble protein (or the derivatives) together with one or more pharmaceutical Be administered compositions for treating others clinical complications of obesity are used as those used to treat diabetes (eg insulin), hypertension, high cholesterol and other adverse conditions can be used as a side effect of obesity. Likewise other appetite suppressants be administered simultaneously, for. B. amphetamines. The administration may simultaneously (for example, administration of a mixture the present protein and insulin) or in seriatim.

Nukleinsäure basierte therapeutische BehandlungNucleic acid based therapeutic treatment

Ein OB-R-Gen, welches in der Lage zum Vermitteln einer Signaltransduktion ist, z. B. OB-Rb, könnte in humane Hypothalamuszellen eingeführt werden, um eine Gentherapie für Fettleibigkeit zu entwickeln. Von einer solchen Therapie würde erwartet werden, dass sie das Körpergewicht vermindert. Umgekehrt würde ein Einführen von Antisense-Konstrukten in Hirnzellen, insbesondere den Hypothalamus, aber ebenfalls einschließlich des Plexus choroideus oder anderer Zellen, in denen OB-R exprimiert wird, die Mengen des aktiven OB-R-Polypeptids reduzieren, und es würde vorausgesagt werden, dass es die Körperadiposität erhöht.One OB-R gene capable of mediating signal transduction is, for. B. OB-Rb, could be in introduced human hypothalamic cells be for a gene therapy for To develop obesity. Such therapy would be expected Be that body weight reduced. Conversely, would an introduction of antisense constructs in brain cells, especially the hypothalamus, but also inclusive of the choroid plexus or other cells in which OB-R is expressed will reduce the levels of the active OB-R polypeptide and it would be predicted become that it increases the body adiposity.

In einer Ausführungsform wird ein Gen, welches ein OB-R-Polypeptid kodiert, in vivo in einem viralen Vektor eingeführt. Solche Vektoren schließen ein attenuiertes oder defektes DNA-Virus ein, wie das Herpes simplex Virus (HSV), das Papillomavirus, das Epstein Barr-Virus (EBV), das Adenovirus, das Adeno-assoziierte Virus (AAV) und desgleichen, sind aber nicht darauf beschränkt. Defekte Viren, denen die viralen Gene vollständig oder fast vollständig fehlen, sind bevorzugt. Ein defektes Virus ist nach dem Einführen in eine Zelle nicht infektiös. Die Verwen dung von defekten viralen Vektoren erlaubt eine Verabreichung an Zellen in ein spezifisches lokalisiertes Gebiet, ohne Bedenken, dass der Vektor andere Zellen infizieren kann. Daher kann spezifisch auf Hirngewebe abgezielt werden. Beispiele für bestimmte Vektoren schließen einen defekten Herpes Virus 1(HSV1)-Vektor [Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci., 2: 320–330 (1991)], einen attenuierten Adenovirus-Vektor, wie den Vektor, welcher von Strafford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest., 90: 626–630 (1992) beschrieben wurde, und einen defekten Adeno-assoziierten Virus-Vektor [Samulski et al., J. Virol., 61: 3096–3101 (1987), Samulski et al., J. Virol., 63: 3822–3828 (1989)] ein, sind aber nicht darauf beschränkt.In an embodiment For example, a gene encoding an OB-R polypeptide is expressed in vivo in vivo viral vector introduced. Close such vectors an attenuated or defective DNA virus, such as the herpes simplex Virus (HSV), the papillomavirus, the Epstein Barr virus (EBV), the Adenovirus, the adeno-associated virus (AAV) and the like but not limited to that. Defective viruses that completely or almost completely lack the viral genes, are preferred. A defective virus is present after insertion into a cell is not infectious. The use of defective viral vectors allows for administration to cells in a specific localized area, without hesitation, that the vector can infect other cells. Therefore, specific be targeted to brain tissue. Examples of particular vectors include one defective herpes virus 1 (HSV1) vector [Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci., 2: 320-330 (1991)], an attenuated adenovirus vector such as the vector Strafford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest., 90: 626-630 (1992) and a defective adeno-associated virus vector [Samulski et al., J. Virol., 61: 3096-3101 (1987), Samulski et al., J. Virol., 63: 3822-3828 (1989)], but are not limited to this.

In einer anderen Ausführungsform kann das Gen in einem retroviralen Vektor eingeführt werden [z. B. Anderson et al., U.S. Patent Nr. 5,399,346 , Mann et al., Cell, 33: 153 (1983), Temin et al., U.S. Patent Nr. 4,650,764 , Temin et al., U.S. Patent Nr. 4,980,289 , Markowitz et al., J. Virol., 62: 1120 (1988), Temin et al., U.S. Patent Nr. 5,124,263 , internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 95/07358 , veröffentlicht am 16. März 1995, von Dougherty et al., und Kuo et al., Blood, 82: 845 (1993)].In another embodiment, the gene may be introduced into a retroviral vector [e.g. Anderson et al., U.S. Patent No. 5,399,346 , Mann et al., Cell, 33: 153 (1983), Temin et al. U.S. Patent No. 4,650,764 , Temin et al., U.S. Patent No. 4,980,289 , Markowitz et al., J. Virol., 62: 1120 (1988), Temin et al. U.S. Patent No. 5,124,263 , International Patent Publication No. WO 95/07358 , published March 16, 1995, by Dougherty et al., and Kuo et al., Blood, 82: 845 (1993)].

Alternativ kann der Vektor in vivo durch Lipofektion eingeführt werden. Im letzten Jahrzehnt gab es eine steigende Verwendung von Liposomen zur Einkapselung und Transfektion von Nukleinsäuren in vitro. Synthetische kationische Lipide, welche entworfen wurden, um die Schwierigkeiten und Gefahren zu beschränken, welche bei einer Liposomen vermittelten Transfektion auftreten, können verwendet werden, um Liposomen für eine in vivo Transfektion eines Gens herzustellen, welches einen Marker kodiert [Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413–7417 (1987), siehe Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8027–8031 (1988)]. Die Verwendung von kationischen Lipiden kann die Einkapselung von negativ geladenen Nukleinsäuren fördern und ebenfalls die Fusion mit negativ geladenen Zellmembranen fördern [Felgner et al., Science, 337: 387–388 (1989)]. Die Verwendung der Lipofektion, um exogene Gene in spezifische Organe in vivo einzuführen, hat bestimmte praktische Vorteile. Die molekulare Ausrichtung von Liposomen auf spezifische Zellen stellt ein Gebiet des Nutzens dar. Es ist eindeutig, dass das Ausrichten der Transfektion auf bestimmte Zelltypen insbesondere vorteilhaft in einem Gewebe mit zellulärer Heterogenität sein würde, wie der Bauchspeicheldrüse, der Leber, der Niere und dem Gehirn. Lipide können chemisch an andere Moleküle für den Zweck der Ausrichtung gekoppelt werden (siehe Mackey et al., 1988, supra). Zielgerichtete Peptide, z. B. Hormone oder Neurotransmitter und Proteine, wie Antikörper, oder Nicht-Peptid-Moleküle könnten chemisch an Liposomen gekoppelt werden.alternative For example, the vector can be introduced in vivo by lipofection. In the last decade There has been an increasing use of liposomes for encapsulation and transfection of nucleic acids in vitro. Synthetic cationic lipids that have been designed to limit the difficulties and dangers associated with liposomes mediated transfection can be used to create liposomes for one to produce in vivo transfection of a gene which is a marker encodes [Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987), see Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8027-8031 (1988)]. The use of cationic lipids may be the encapsulation of negatively charged nucleic acids promote and also promote fusion with negatively charged cell membranes [Felgner et al., Science, 337: 387-388 (1989)]. The use of lipofection to transform exogenous genes into specific ones To introduce organs in vivo, has certain practical advantages. The molecular orientation of Liposomes on specific cells is one area of utility. It is clear that targeting the transfection to certain Cell types would be particularly advantageous in a tissue with cellular heterogeneity, such as the pancreas, the liver, the kidney and the brain. Lipids can be chemically linked to other molecules for the purpose alignment (see Mackey et al., 1988, supra). Targeted peptides, e.g. As hormones or neurotransmitters and Proteins, such as antibodies, or non-peptide molecules could be chemically coupled to liposomes.

Es ist ebenfalls möglich, den Vektor in vivo als ein nacktes DNA-Plasmid einzuführen. Nackte DNA-Vektoren zur Gentherapie können in die gewünschte Wirtszelle durch Verfahren eingeführt werden, welche im Stand der Technik bekannt sind, z. B. Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Transduktion, Zellfusion, DEAE-Dextran, Calciumphosphat-Präzipitation, Verwendung einer Genpistole oder Verwendung eines DNA-Vektor-Transporters [siehe z. B. Wu et al., J. Biol. Chem., 267: 963–967 (1992), Wu et al., J. Biol. Chem., 263: 14621–14624 (1988), Hartmut et al., kanadische Patentanmeldung Nr. 2,012,311 , eingereicht am 15. März 1990)].It is also possible to introduce the vector in vivo as a naked DNA plasmid. Naked DNA vectors for gene therapy may be introduced into the desired host cell by methods known in the art, e.g. Transfection, electroporation, microinjection, transduction, cell fusion, DEAE-dextran, calcium phosphate precipitation, use of a gene gun, or use of a DNA vector transporter [see, e.g. Wu et al., J. Biol. Chem., 267: 963-967 (1992), Wu et al., J. Biol. Chem., 263: 14621-14624 (1988), Hartmut et al. Canadian Patent Application No. 2,012,311 , filed March 15, 1990)].

Landwirtschaftliche AnwendungenAgricultural applications

Das OB-R-Gen kann ebenfalls aus Haustieren isoliert werden, und das entsprechende OB-R-Polypeptid kann dadurch erhalten werden. Es wird erwartet, dass die aus dem Mäuse-OB-R-Gen abgeleitete Sonde mit entsprechenden homologen kodierenden Sequenzen aus einer großen Anzahl von Tierarten hybridisiert. Wie für Humantherapien diskutiert, können die rekombinanten Proteine ebenfalls für Haustiere hergestellt und ihnen verabreicht werden. Die Verabreichung des löslichen Polypeptids kann angewandt werden, um magerere Nahrungstiere herzustellen, wie Fleischrinder, Schweine, Geflügel, Schafe, usw. Vorzugsweise wird ein autologes OB-Polypeptid verabreicht, obwohl die Offenbarung hier ebenfalls eine Verabreichung von nicht autologem Polypeptid umfasst. Da das lösliche OB-R-Polypeptid aus ungefähr 800 Aminosäureresten besteht, kann es hoch immunogen sein. Daher ist die Verabreichung von autologem Polypeptid bevorzugt.The OB-R gene can also be isolated from pets, and that corresponding OB-R polypeptide can be obtained thereby. It will expected to be from the mouse OB-R gene derived probe with corresponding homologous coding sequences from a big one Number of animal species hybridized. As discussed for human therapies, can the recombinant proteins are also produced for pets and them be administered. Administration of the soluble polypeptide may be used to produce leaner food animals, such as beef cattle, Pigs, poultry, Sheep, etc. Preferably, an autologous OB polypeptide is administered, although the disclosure here also does not indicate administration autologous polypeptide. Because the soluble OB-R polypeptide consists of about 800 amino acid residues it can be highly immunogenic. Therefore, the administration is of autologous polypeptide.

Alternativ würde es die Einführung der klonierten Gene in transgene Haustiere erlauben, das Körpergewicht und die Adiposität durch Überexprimieren eines OB-R-Transgens möglicherweise zu vermindern. Das einfachste Hilfsmittel dies zu erreichen würde sein, mit einem OB-R-Transgen auf das Gehirn unter Verwendung seines eigenen oder eines anderen gehirnspezifischen Promotors abzuzielen.alternative it would the introduction the cloned genes in transgenic pets allow body weight and the adiposity by overexpressing an OB-R transgene possibly to diminish. The easiest way to achieve this would be using an OB-R transgene on the brain using its own or another brain-specific promoter.

Umgekehrt könnten Anstiege des Körperfetts unter anderen Umständen gewünscht sein, wie für die Entwicklung von Kobe-Rindfleisch oder Fettleber, um Gänseleberpastete herzustellen. Dies könnte durch Abzielen eines Antisense-OB-R-Transgens auf das Gehirn oder durch Verwenden der Gen-Knockout-Technologie erreicht werden. Alternativ kann, wenn ein Anstieg des Körpergewichts als prozentualer Anteil des Fetts gewünscht ist, ein Inhibitor oder Antagonist des OB-R-Polypeptids verabreicht werden. Solche Inhibitoren oder Antagonisten schließen Antikörper, welche mit dem Polypeptid reaktiv sind, und Fragmente des Polypeptids, welche den OB-Rezeptor binden, aber nicht aktivieren, d. h. Antagonisten von Leptin, ein, sind aber nicht darauf beschränkt.Vice versa could Increases in body fat in other circumstances required be like for the development from Kobe beef or fatty liver to goose liver pate manufacture. this could by targeting an antisense OB-R transgene to the brain or through Using gene knockout technology be achieved. Alternatively, if an increase in body weight is desired as a percentage of the fat, an inhibitor or Antagonist of the OB-R polypeptide. Such inhibitors or antagonists close Antibody, which are reactive with the polypeptide, and fragments of the polypeptide which bind but do not activate the OB receptor, d. H. antagonists by Leptin, but are not limited to this.

Kosmetische ImplikationenCosmetic implications

Das OB-R-Polypeptid hat zusätzlich zu den Gesundheitsnutzen einen erheblichen Wert für die kosmetische Verwendung. Da die hier offenbarten OB-R-Polypeptide, einschließlich der Derivate und Agonisten-Analoga davon, insbesondere für eine Modulation der Geschwindigkeit und Menge der Fettzellablagerung in einem Tier geeignet sind, sind sie zum Reduzieren von unansehnlichem Fettgewebe geeignet, z. B. Fettablagerungen im Bauch, den Hüften, den Oberschenkeln, am Hals und Kinn, welche nicht nötigerweise auf einen fettleibigen Zustand hinauslaufen, aber welche dennoch die Erscheinung eines Individuums beeinträchtigen. Es wird angenommen, dass die Fettreduktionswirkung zum Teil durch eine Reduktion des Appetits, d. h. eine Reduktion der Nahrungsmittelaufnahme, durch einen Anstieg des basalen Metabolismus oder durch beides erreicht wird. Daher ist das vorlie gende lösliche OB-Re-Polypeptid oder seine Derivate oder Agonisten-Analoga zur Verabreichung an ein Individuum geeignet, um kosmetische Änderungen in Fettgewebeablagerungen zu bewirken, ob durch Modulieren der Fettablagerung, durch Reduzieren des Appetits oder durch beides.The OB-R polypeptide has a significant value for cosmetic use in addition to health benefits. Since the OB-R polypeptides disclosed herein, including the derivatives and agonist analogs thereof, are particularly useful for modulating the rate and amount of fat cell deposition in an animal, they are useful for reducing unsightly adipose tissue, e.g. As fat deposits in the abdomen, hips, thighs, neck and chin, which does not necessarily result in an obese state, but which still affect the appearance of an individual. It is believed that the fat reduction effect is partly due to a reduction in appetite, ie a reduct food intake, by an increase in basal metabolism, or by both. Therefore, the present soluble OB-Re polypeptide or its derivatives or agonist analogs are suitable for administration to an individual to effect cosmetic changes in fatty tissue deposits, whether by modulating fat deposition, reducing appetite, or both.

Zusätzlich können die vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren zusammen mit verschiedenen Verfahren verwendet werden, wie kosmetischen Operationen, welche entworfen sind, um die Gesamterscheinung eines Körpers zu ändern (z. B. Liposuktion oder Laseroperationen, welche entworfen sind, um Körpermasse durch Absaugen oder Abtragen von Fettgewebe zu reduzieren), Bewegung (insbesondere Laufen und Gewichtstraining), Niedrigfettdiät, Hypnose, Biofeedback, als Beispiele der Wege, die versucht werden können, um den prozentualen Anteil des Fettgewebes zu vermindern und die Körpererscheinung zu verbessern.In addition, the present compositions and methods together with various Procedures used, such as cosmetic surgery, which are designed to change the overall appearance of a body (eg, liposuction or Laser Surgeries Designed to Absorb Body Mass by Suction To reduce abrasion of adipose tissue), movement (especially running and Weight training), low-fat diet, Hypnosis, biofeedback, as examples of ways that can be tried to to decrease the percentage of adipose tissue and the body appearance to improve.

Folglich betrifft die vorliegende Offenbarung ein Verfahren zum Bewirken einer kosmetischen Fettgewebemodulation in einem Individuum, umfassend das Verabreichen einer fettmodulierenden Menge eines löslichen OB-R-Polypeptids oder Derivats oder Agonisten-Analogons davon, an ein Individuum, welches eine kosmetische Fettgewebemodulation wünscht, um die Gesamtkörpererscheinung zu verbessern. In einem bestimmten Aspekt ist die Fettgewebemodulation eine Folge der Appetitunterdrückung. Vorzugsweise ist die Fettgewebemodulation eine Reduktion des Fettgewebes.consequently The present disclosure relates to a method of effecting a cosmetic adipose tissue modulation in a subject comprising administering a fat modulating amount of a soluble OB-R polypeptide or derivative or agonist analogs thereof an individual who desires cosmetic adipose tissue modulation the total body appearance to improve. In one particular aspect is the adipose tissue modulation a consequence of appetite suppression. Preferably, the adipose tissue modulation is a reduction in adipose tissue.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft diese Offenbarung ein Verfahren zum Bewirken eines kosmetischen Fettgewebeverlustes, umfassend das Kombinieren eines Verfahrens zum Ändern der Körpererscheinung mit der Verabreichung einer fettmodulierenden Menge eines löslichen OB-R-Polypeptids oder Derivats oder Agonisten-Analogons davon, an ein Individuum, welches eine kosmetische Fettgewebemodulation wünscht, um die Gesamtkörpererscheinung zu verbessern.In a further embodiment This disclosure relates to a method for effecting a cosmetic Adipose tissue loss, comprising combining a method to change the physical appearance with the administration of a fat modulating amount of a soluble OB-R polypeptide or derivative or agonist analogs thereof an individual who desires cosmetic adipose tissue modulation the total body appearance to improve.

Diese Offenbarung kann unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, welche beabsichtigen, exemplarisch und nicht beschränkend zu sein, besser verstanden werden. Aspekte der Beispiele, welche nicht spezifisch die beanspruchte Erfindung betreffen, sind nur zur Darstellung und zum Vergleich eingeschlossen.These Revelation may be made with reference to the following examples which intended to be exemplary and not restrictive. Aspects of Examples which did not specifically claim that Relate invention are only for illustration and comparison locked in.

BEISPIEL 1: ISOLIERUNG DER DB-cDNA-KLONEEXAMPLE 1: Isolation of the DB cDNA Clone

Mutationen im Maus-db-Gen führen zu schwerer Fettleibigkeit und Diabetes mit einem Syndrom, welches krankhafter humaner Fettleibigkeit ähnelt. [Hummel et al., Science, 153: 1127 (1966)]. Frühere Daten legten nahe, dass das db-Gen den Rezeptor für das Genprodukt des ob-Locus kodiert, welches als Leptin bekannt ist [Coleman, Diabetologia, 14: 141 (1978), Zhang et al., Nature, 372: 425 (1994)]. Kürzlich erschien ein Bericht, dass der Leptinrezeptor aus dem Plexus choroideus kloniert wurde, für diesen Klon wurde gezeigt, dass er in derselben Region von Chromosom 4 liegt, wie db [Tartaglia et al., Cell, 83: 1263 (1995)]. Dieser Rezeptor ist ein Mitglied der Familie der Rezeptoren, welche sich mit den JAK-Tyrosinkinasen verbinden. Es wurden jedoch in diesem Rezeptor keine Mutationen in C57BL/6J db/db-Mäusen identifiziert, was nahe legt, dass die Mutation in diesen Tieren eine Spleißvariante dieses Gens darstellen könnte [Tartaglia et al., supra].mutations in the mouse db gene to severe obesity and diabetes with a syndrome which morbid human obesity is similar. [Hummel et al., Science, 153: 1127 (1966)]. earlier Data suggested that the db gene is the receptor for the gene product of the ob-locus known as leptin [Coleman, Diabetologia, 14: 141 (1978), Zhang et al., Nature, 372: 425 (1994)]. Recently appeared a report that the leptin receptor clones from the choroid plexus was for This clone was shown to be in the same region of chromosome 4, as db [Tartaglia et al., Cell, 83: 1263 (1995)]. This Receptor is a member of the family of receptors, which is itself with the JAK tyrosine kinases connect. However, there were no mutations in this receptor in C57BL / 6J db / db mice identifies what suggests that the mutation in these animals a splice variant could represent this gene [Tartaglia et al., Supra].

Das vorliegende Beispiel zeigt, dass der Leptinrezeptor auf demselben 300 kb Intervall auf dem Mäusechromosom 4 liegt, wie db. Eine cDNA-Selektion und ein Exon-Trapping aus dieser Region identifizierten mehrere ESTs mit Sequenzen, welche identisch zum Leptinrezeptor sind. Eine Charakterisierung der entsprechenden cDNA-Klone, welche aus einer Mäusegehirn-cDNA-Bibliothek isoliert wurden, ergab, dass es mindestens fünf alternative gespleißte Formen des Leptinrezeptors gibt, jede mit Unterschieden an ihrem Amino- und/oder Carboxylterminus. Eine der Spleißvarianten wird in einer großen Menge im Hypothalamus und in niedrigerer Menge in anderen Geweben exprimiert. Dieses Transkript ist in C57BL/Ks db/db-Mäusen mutiert. Diese Mutation ist das Ergebnis eines abnormalen Spleißings, was zu einer 106 bp Insertion in das 3'-Ende der RNA führt, was zu einer verkürzten cytoplasmatischen Region führt, welche "Box 2" deletiert, eine Proteinstelle, von welcher bekannt ist, dass sie mit JAK-Proteinen interagiert [Mu rakami et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 11349 (1991), Fukunaga, et al., EMBO, 10: 2855 (1991)], sie ist wahrscheinlich in der Signaltransduktion defekt [Bahary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8642 (1990), Modl et al., Cytogenetics Cell Genetics, 67: 232 (1995)]. Diese Daten legen nahe, dass die gewichtsreduzierenden Wirkungen von Leptin durch Interaktionen mit einem Rezeptor im Hypothalamus und vielleicht in anderen Geweben vermittelt werden.The present example shows that the leptin receptor on the same 300 kb interval on the mouse chromosome 4 lies as db. A cDNA selection and exon trapping from this Region identified multiple ESTs with sequences that are identical to the leptin receptor. A characterization of the corresponding cDNA clones derived from a mouse brain cDNA library were isolated, revealed that there are at least five alternative spliced forms of the leptin receptor, each with differences in their amino and / or Carboxyl terminus. One of the splice variants comes in a large amount expressed in the hypothalamus and at lower levels in other tissues. This transcript is mutated in C57BL / Ks db / db mice. This mutation is the result of an abnormal splice, resulting in a 106 bp Insertion in the 3'-end of the RNA leads, what a shortened cytoplasmic region leads, which "Box 2" deleted, one Protein site known to be associated with JAK proteins interacts [Mu rakami et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 11349 (1991), Fukunaga, et al., EMBO, 10: 2855 (1991)], it is probable defective in signal transduction [Bahary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8642 (1990), Modl et al., Cytogenetics Cell Genetics, 67: 232 (1995)]. These data suggest that the weight-reducing Effects of leptin on interactions with a receptor in the hypothalamus and maybe mediated in other tissues.

Material und Methodenmaterial and methods

Isolierung von genomischen Klonen. YAC-Klone wurden durch PCR-Screening isoliert und auf einem CHEF MAPPER (Bio-Rad) ausgemessen [Green et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1213 (1996), Kasumi et al., Mammalian Genome, 4: 391 (1993)]. Die YAC-Enden wurden unter Verwendung einer Vectorette-PCR und eines Plasmid-Rescues gewonnen [Riley et al., Nucl. Acids Res., 18: 2887 (1990), Hermanson et al., Nucl. Acids Res., 19: 4943 (1991)]. P1-Klone wurden durch Schicken spezifischer Paare von PCR-Primern an Genome Systems Inc. (St. Louis, MO) isoliert, welche Einzelauswahlen von einzelnen Mäuse-P1-Klonen bereitstellten [Sternsberg, Trends Genet., 8: 11 (1992)]. Die P1-Enden wurden unter Verwendung einer Vectorette-PCR gewonnen [Hart) et al., Bio Techniques, 15: 201 (1993)]. BACs wurden wie beschrieben isoliert [Shizuya, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 8794 (1992)]. Die Primerauswahl und die PCR-Amplifikation wurden wie beschrieben durchgeführt: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 3 min, 25 Zyklen mit 94° für 1 min, 55° für 2 min und 72° für 3 min [Zhang, 1994, supra]. Die Primer waren:

Figure 00990001
Isolation of genomic clones. YAC clones were isolated by PCR and screened on a CHEF MAPPER (Bio-Rad) [Green et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1213 (1996), Kasumi et al., Mammalian Genome, 4: 391 (1993)]. The YAC ends were recovered using vectorette PCR and plasmid rescues [Riley et al., Nucl. Acids Res., 18: 2887 (1990), Hermanson et al., Nucl. Acids Res., 19: 4943 (1991)]. P1 clones were isolated by sending specific pairs of PCR primers to Genome Systems Inc. (St. Louis, MO), which provided single selections of individual mouse P1 clones [Sternsberg, Trends Genet., 8: 11 (1992)]. , The P1 ends were recovered using Vectorette PCR [Hart] et al., Bio Techniques, 15: 201 (1993)]. BACs were isolated as described [Shizuya, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 8794 (1992)]. Primer selection and PCR amplification were performed as described: initial denaturation at 94 ° C for 3 min, 25 cycles at 94 ° for 1 min, 55 ° for 2 min and 72 ° for 3 min [Zhang, 1994, supra] , The primers were:
Figure 00990001

Isolierung der db-Klone. Eine cDNA-Auswahl wurde wie beschrieben unter Verwendung von Mäusegehirn-RNA aus dem Hypothalamus als Ausgangsmaterial durchgeführt [Morgan et al., Nucl. Acids. Res., 20: 5173 (1992)]. Bibliotheken screening, Exon-Trapping und DNA-Sequenzierung wurden wie beschrieben durchgeführt [Zhang et al., 1994, supra (siehe Beispiel 3)]. Die C-terminalen Sequenzen von OB-Ra, OB-Re, OB-Rd und OB-Re wurden in verschiedenen cDNA-Klonen gefunden. Die C-terminale Sequenz von OB-Rb war nicht vollständig. Die Sequenz des C-Terminus dieser Variante wurde schließlich durch Sequenzieren genomischer DNA vervollständigt. Die Matrize wurde unter Verwendung einer Vectorette-PCR von BAC 242 mit Primern aus der cDNA29 hergestellt [Riley et al., Nucl. Acids Res., 18: 2887 (1990)]. Die Sequenz wurde durch Sequenzieren von RT-PCR-Produkten bestätigt.Isolation of the db clones. A cDNA selection was performed as described using mouse brain RNA from the hypothalamus as the starting material [Morgan et al., Nucl. Acids. Res., 20: 5173 (1992)]. Libraries screening, exon trapping and DNA sequencing were performed as described [Zhang et al., 1994, supra (see Example 3)]. The C-terminal sequences of OB-Ra, OB-Re, OB-Rd and OB-Re were found in various cDNA clones. The C-terminal sequence of OB-Rb was not complete. The sequence of the C-terminus of this variant was finally completed by sequencing genomic DNA. The template was prepared using Vectorette PCR of BAC 242 with primers from cDNA 29 [Riley et al., Nucl. Acids Res., 18: 2887 (1990)]. The sequence was confirmed by sequencing RT-PCR products.

Identifikation von Mutationen in db. RT-PCR und Sequenzierung wurden wie beschrieben durchgeführt. Die genomischen Sequenzen am Spleißakzeptor von OB-Rb wurden durch eine Vectorette-PCR von BAC 242 mit dem rückwärts gerichteten OB-Rb-Primer erhalten. Für die RT-PCR von OB-Ra, OB-Rb, OB-Re und OB-Rd war der vorwärts gerichtete Primer derselbe
5' ACACTGTTAATTTCACACCAGAG 3' (SEQ ID NR: 24) (ebenfalls als F1 in 3C markiert). Die rückwärts gerichteten (r) Primer waren:
OB-Ra 5' AGTCATTCAAACCATTAGTTTAGG 3' (SEQ ID NR: 25),
OB-Rb 5' TGGATAAACCCTTGCTCTTCA 3' (SEQ ID NR: 26)
OB-Rc 5' TGAACACAACAACATAAAGCCC 3' (SEQ ID NR: 27)
OB-Rd 5' AGGCTCCCTCAGGGCCAC 3' (SEQ ID NR: 28). Der Intron-Primer für OB-Rb (in 3C F2 markiert) war
5' GTGACTGAATGAAGATGTAATATAC 3' (SEQ ID NR: 29).Identification of mutations in db. RT-PCR and sequencing were performed as described. The genomic sequences at the splice acceptor of OB-Rb were obtained by vectorette PCR of BAC 242 with the reverse OB-Rb primer. For the RT-PCR of OB-Ra, OB-Rb, OB-Re and OB-Rd, the forward primer was the same
5 'ACACTGTTAATTTCACACCAGAG 3' (SEQ ID NO: 24) (also referred to as F1 in 3C marked). The backward primers were:
OB-Ra 5 'AGTCATTCAAACCATTAGTTTAGG 3' (SEQ ID NO: 25)
OB-Rb 5 'TGGATAAACCCTTGCTCTTCA 3' (SEQ ID NO: 26)
OB-Rc 5 'TGAACACAACAACATAAAGCCC 3' (SEQ ID NO: 27)
OB-Rd 5 'AGGCTCCCTCAGGGCCAC 3' (SEQ ID NO: 28). The intron primer for OB-Rb (in 3C F2 marked) was
5 'GTGACTGAATGAAGATGTAATATAC 3' (SEQ ID NO: 29).

Gewebeverteilung des alternativ gespleißten Leptinrezeptors. Die RT-PCR wurde wie beschrieben durchgeführt. Die Primersequenzen für OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc und OB-Rd sind oben gezeigt. Die Primer für OB-Re waren:
f 5' TGTTATATCTGGTTATTGAATGG (SEQ ID NR: 30),
r 5' CATTAAATGATTTATTATCAGAATTGC 3' (SEQ ID NR: 31).Tissue distribution of the alternatively spliced leptin receptor. RT-PCR was performed as described. The primer sequences for OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc and OB-Rd are shown above. The primers for OB-Re were:
f 5 'TGTTATATCTGGTTATTGAATGG (SEQ ID NO: 30),
r 5'CATTAAATGATTTATTATCAGAATTGC 3 '(SEQ ID NO: 31).

Ergebnisse und DiskussionResults and discussion

Eine Reihe von genetischen Kreuzungen, welche db aufspalten, wurde etabliert. Diese schlossen 50 fettleibige (db/db) Nachkommen einer C57BL/Ks db/db x Mus spretus-Kreuzung und 350 fettleibige (db/db) Nachkommen einer C57BL/Ks db/db x Mus castaneus-Kreuzung ein. Die Zuordnung des Genotyps als der db-Locus wurde wie zuvor beschrieben vorgenommen [Bahary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 37: 8642 (1990)].A Series of genetic crosses that split db has been established. These included 50 obese (db / db) offspring of a C57BL / Ks db / db x Mus spretus cross and 350 obese (db / db) offspring a C57BL / Ks db / db x Mus castaneus junction. The assignment of the genotype as the db locus was made as previously described [Bahary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 37: 8642 (1990)].

Mehrere Mikrosatellitenmarker, welche db flankieren, wurden verwendet, um die DNA von jedem Tier zu typisieren. Diese schlossen einen distalen Marker, D4Mit31, und einen proximalen Marker, Ifnα, ein. Eine genetische Karte in der Region von db wurde unter Verwendung dieser und anderer Loci erstellt (1). Die Maus-Homologa von zwei zuvor klonierten humanen Genen wurden in der Region von db gefunden: JAK1 und PDE4B. Beide diese Gene liegen auf dem humanen Chromosom 1p31, was nahe legt, dass das humane db-Gen in der chromosomalen Region liegt [Modi et al., Cytogenetics Cell Genetics, 69: 232 (1995), Milatovich et al., Somatic Cell Mol. Gen., 20: 75 (1994)].Several microsatellite markers flanking db were used to characterize the DNA of each animal. These included a distal marker, D4Mit31, and a proximal marker, Ifnα. A genetic map in the region of db was created using this and other loci ( 1 ). The mouse homologs of two previously cloned human genes were found in the region of db: JAK1 and PDE4B. Both of these genes are located on human chromosome 1p31, suggesting that the human db gene is located in the chromosomal region [Modi et al., Cytogenetics Cell Genetics, 69: 232 (1995), Milatovich et al., Somatic Cell Mol. Gen., 20: 75 (1994)].

Für einen Mikrodissektionsklon, D4Rck22 wurde gefunden, dass er distal von db liegt und in drei Tieren rekombinant ist [Bahary et al., Mammalian Genome, 4: 411–515 (1993)]. D6Rck22 wurde als Ausgangspunkt eines Chromosomen-Walks unter Verwendung von künstlichen Hefechromosomen (YACs), künstlichen bakteriellen Chromosomen (BACs) und P1-Bakteriophagen-Klonen verwendet [Zhang et al., 1994, supra, Steinberg, Trends Genet., 8: 11 (1994), Shizuya, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 8794 (1992)]. Ein 2,7 mB Kontig wurde durch Chromosomen-Walking aus diesem Marker zusammengebaut. Es sei angemerkt, dass eine ungefähr 200 kB-Region in keiner verfügbaren Mäuse-YAC-Bibliothek identifiziert wurde (~12 Genomäquivalente wurden gescreent). Diese Lücke im Kontig wurde nach einem Chromosomen-Walking mit einer Reihe von BAC- und P1-Klonen, gefolgt von der Isolierung eines zusätzlichen YAC geschlossen, welcher sich auf zusätzliche 500 kB proximal zu dieser Region erstreckte. Rekombinante Tiere wurden mit genetischen Markern (sowohl RFLPs und SSLPs) typisiert, welche von den Enden der einzelnen genomischen Klone abgeleitet waren. Die db-Mutation wurde zwischen dem distalen Rekombinationsereignis in Tier 324 und den proximalen Rekombinationsereignissen in Tier 1028 lokalisiert. Sieben andere proximale Rekombinationen mit 50 kB wurden beobachtet, was nahe legt, dass dies ein Hot Spot für die Rekombination darstellt. Das gesamte nicht rekombinante Intervall entspricht ~300 kB der DNA und wurde von zwei BACs, 43 und 242, abgedeckt (1).A microdissection clone, D4Rck22, was found to be distal to db and recombinant in three animals [Bahary et al., Mammalian Genome, 4: 411-515 (1993)]. D6Rck22 was used as the starting point of a chromosome walk using yeast artificial chromosomes (YACs), bacterial artificial chromosomes (BACs) and P1 bacteriophage clones [Zhang et al., 1994, supra, Steinberg, Trends Genet., 8: 11 ( 1994), Shizuya, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 8794 (1992)]. A 2.7 mb contig was assembled by chromosome walking from this marker. Note that an approximately 200 kb region was not identified in any available mouse YAC library (~ 12 genome equivalents were screened). This gap in the contig was closed after chromosome walking with a series of BAC and P1 clones, followed by isolation of an additional YAC extending to an additional 500 kb proximal to this region. Recombinant animals were typed with genetic markers (both RFLPs and SSLPs) derived from the ends of the individual genomic clones. The db mutation was located between the distal recombination event in animal 324 and the proximal recombination events in animal 1028. Seven other 50 kb proximal recombinations were observed, suggesting that this is a hot spot for recombination. The entire non-recombinant interval corresponds to ~ 300 kB of DNA and was covered by two BACs, 43 and 242 ( 1 ).

Kandidatengene für db wurden aus den BACs 43 und 242 unter Verwendung von Exon-Trapping und cDNA-Selektion aus Mäuse-Hypothalamus isoliert [Church et al., Nature Genetics, 6: 98 (1994), Morgan et al., Nucl. Acids Res., 20: 5173 (1992)]. Eine Mäusegehirn-cDNA-Bibliothek wurde mit vermeintlichen Genfragmenten gescreent. Eine Analyse von acht Gehirn-cDNA-Klonen wies darauf hin, dass sechs unabhängige Produkte der cDNA-Selektion und zwei cDNAs, welche unter Verwendung des Exon-Trapping identifiziert wurden, auf überlappenden Transkripten anwesend waren. Die Nukleotidsequenz von jedem cDNA-Klon sagte N-terminale Sequenzen voraus, welche mindestens teilweise identisch zum Mäuse-Leptinrezeptor (OB-R) waren. Die Position der Sequenzen vom 5'- und 3'-Ende der OB-R-RNA wurde durch den STS-Gehalt von jedem BAC bestimmt und ist auf der physikalischen Karte gezeigt (1). Diese Daten weisen darauf hin, dass das Gen ~100 kB abdeckt und in Richtung auf das Telomer transkribiert wird.Candidate genes for db were isolated from BACs 43 and 242 using mouse hypothalamic exon trapping and cDNA selection [Church et al., Nature Genetics, 6:98 (1994), Morgan et al., Nucl. Acids Res., 20: 5173 (1992)]. A mouse brain cDNA library was screened with putative gene fragments. Analysis of eight brain cDNA clones indicated that six independent products of cDNA selection and two cDNAs identified using exon trapping were present on overlapping transcripts. The nucleotide sequence of each cDNA clone predicted N-terminal sequences which were at least partially identical to the mouse leptin receptor (OB-R). The position of the 5 'and 3' end sequences of the OB-R RNA was determined by the STS content of each BAC and is shown on the physical map ( 1 ). These data indicate that the gene covers ~ 100 kb and is transcribed toward the telomere.

Diese cDNA-Klone divergieren am Carboxylterminus. In vier Fällen waren die vorausgesagten Sequenzen mindestens teilweise bis zu Lysin 889 des Leptinrezeptors identisch, was die Transmembrandomäne einschließt. Nach diesem Punkt sagen die cDNAs Proteine mit Unterschieden in der cytoplasmatischen Domäne voraus, welche OB-Ra (SEQ ID NR: 11), OB-Rb (SEQ ID NR: 12), OB-Rc (SEQ ID NR: 13) und OB-Rd (SEQ ID NR: 14) bezeichnet wurden (2B). OB-Re sagte eine unterschiedliche Aminosäuresequenz nach His796 voraus (SEQ ID NR: 15), welche einen löslichen Rezeptor zu kodieren scheint (2B). Die Klone für OB-Ra, OB-Rb und OB-Re divergierten an ihrem N-Terminus. In allen Fällen lag die divergierende Sequenz ebenfalls auf dem BAC-Kontig. OB-Ra entspricht im Allgemeinen dem Mäuse-OB-R [Tartaglia et al., Cell, 83: 1263 (1995)].These cDNA clones diverge at the carboxyl terminus. In four cases, the predicted sequences were at least partially identical to lysine 889 of the leptin receptor, which includes the transmembrane domain. After this point, the cDNAs predict proteins with differences in the cytoplasmic domain, which include OB-Ra (SEQ ID NO: 11), OB-Rb (SEQ ID NO: 12), OB-Rc (SEQ ID NO: 13), and OB Rd (SEQ ID NO: 14) were designated ( 2 B ). OB-Re predicted a different amino acid sequence to His 796 (SEQ ID NO: 15), which seems to encode a soluble receptor ( 2 B ). The clones for OB-Ra, OB-Rb and OB-Re diverged at their N-terminus. In all cases, the divergent sequence was also on the BAC contig. OB-Ra generally corresponds to the mouse OB-R [Tartaglia et al., Cell, 83: 1263 (1995)].

Der C-Terminus von OB-Rb war zu 78 Prozent identisch mit dem humanen OB-Rezeptor, was nahe legt, dass er das Maus-Homologon darstellt [Tartaglia et al, supra]. Der Leptinrezeptor ist ein Mitglied der gp-130-Familie der Rezeptoren, welche mit JAK-Proteinkinase interagieren. Die cytoplasmatischen Domänen der gp-130-Rezeptoren werden im Allgemeinen für die Bindung von JAKs und die Signaltransduktion benötigt [Kishimoto et al., Cell, 76: 253 (1994)]. Die OB-Rb-cDNA-Sequenz sagt eine mögliche "Box 2"-Sequenz (in 2B unterstrichen) voraus, ein Proteinmotiv, welches zum Binden mit JAK-Proteinkinasen benötigt wird [Kishimoto, supra]. "Box 2" ist unter vielen Mitgliedern dieser Rezeptorfamilie konserviert und wird zur Signaltransduktion der GCSF- und IL6-Rezeptoren benötigt [Murakami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 11349 (1991); Fukunaga et al., EMBO J., 10: 2855 (1991)]. Keines der anderen Transkripte sagt eine "Box 2"-Sequenz voraus. Von den acht charakterisierten cDNA-Klonen wurde OB-Ra dreimal und OB-Re zweimal isoliert. OB-Rb, OB-Rc und OB-Rd wurde jeweils einmal isoliert. Es ist wahrscheinlich, dass zusätzliche Spleißvarianten identifiziert werden.The C-terminus of OB-Rb was 78 percent identical to the human OB receptor, suggesting that it is the mouse homologue [Tartaglia et al, supra]. The leptin receptor is a member of the gp-130 family of receptors that interact with JAK protein kinase. The cytoplasmic domains of gp-130 receptors are generally required for JAK binding and signal transduction [Kishimoto et al., Cell, 76: 253 (1994)]. The OB-Rb cDNA sequence says a possible "Box 2" sequence (in 2 B underlined), a protein motif required for binding with JAK protein kinases [Kishimoto, supra]. "Box 2" is conserved among many members of this receptor family and is required for signal transduction of the GCSF and IL6 receptors [Murakami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 11349 (1991); Fukunaga et al., EMBO J., 10: 2855 (1991)]. None of the other transcripts predicts a "Box 2" sequence. Of the eight characterized cDNA clones, OB-Ra was isolated three times and OB-Re twice. OB-Rb, OB-Rc and OB-Rd were each isolated once. It is likely that additional splice variants will be identified.

C57BL/Ks db/db-Mäuse weisen eine längere Fragmentlänge von OB-Rb spezifischen RT-PCR-Produkten (es sollte erwähnt werden, dass diese PCR 3'-Nukleinsäuren amplifizierte, und daher spezifisch für alle Spleißvarianten ist, welche Eigenschaften einer cytoplasmatischen Domäne von OB-OB-Rb aufweisen, aber keine Daten über die extrazelluläre Domäne bereitstellt) aus RNA aus dem Hypothalamus auf, als Wildtyp-Wurfgeschwister (3A). Die PCR-amplifizierte genomische DNA, welche den Spleißakzeptor an Pro890 abdeckt, war jedoch von normaler Größe in C57BL/Ks db/db verglichen mit dem Wildtyp (3B). Eine DNA-Sequenzierung dieses Fragments bestätigte, dass die genomischen Sequenzen am Spleißakzeptor in db-Mäusen Wildtyp sind. Zusätzlich waren sowohl die Größe, als auch die Nukleotidsequenz der RT-PCR-Produkte, welche anderen 3'-Enden entsprachen, in den db-Mäusen normal, was nahe legt, dass der Spleißdonor an Lys889 ebenfalls normal ist (4). Diese Daten legen nahe, dass das längere OB-Rb spezifische Fragment aus C57BL/Ks db/db-Mäusen das Ergebnis eines abnormalen Spleißings war.C57BL / Ks db / db mice have a longer fragment length of OB-Rb specific RT-PCR products (it should be noted that this PCR amplified 3 'nucleic acids, and thus is specific for all splice variants, showing cytoplasmic domain characteristics from OB-OB-Rb, but does not provide data on the extracellular domain) from RNA from the hypothalamus, as wild-type littermates ( 3A ). However, the PCR amplified genomic DNA covering the splice acceptor on Pro 890 was of normal size in C57BL / Ks db / db compared to the wild-type ( 3B ). DNA sequencing of this fragment confirmed that the genomic sequences at the splice acceptor in db mice are wild-type. In addition, both the size and nucleotide sequence of the RT-PCR pro which corresponded to other 3 'ends in the db mice normal, suggesting that the splice donor on Lys 889 is also normal ( 4 ). These data suggest that the longer OB-Rb specific fragment from C57BL / Ks db / db mice was the result of abnormal splicing.

Eine Sequenzierung der RT-PCR-Produkte von OB-Rb aus den mutierten Mäusen ergab eine 106 bp Insertion zwischen dem Spleißdonor an Lys889 und dem Spleißakzeptor an Pro890. Die Sequenz der inserierten DNA war identisch mit den ersten 106 bp des einzigartigen OB-Ra-Exons, strangabwärts von seinem Spleißakzeptor an Arg890 (5A). Eine Sequenzierung der genomischen DNA und der RT-PCR-Produkte der nicht translatierten 3'-Region von OB-Ra aus C57BL/Ks db/db-Mäusen identifizierte eine g→t Mutation 106 bp nach dem Spleißakzeptor (vergleiche 5B und 5C). Diese Mutation führt zu dem Auftreten einer Spleißdonor-Konsensusstelle, AGGTAAA (5C) [Lodish et al., Mol. Cell. Biol., Scientific American Books: New York, S. 1–1344 (1986)]. Dieser mutierte Spleißdonor führt zum Spleißen von 106 bp des terminalen OB-Ra-Exons in den Spleißakzeptor an Pro890 in der OB-Rb-RNA. Das sich ergebende mutierte OB-Rb-Protein weist ein Terminationscodon fünf Aminosäuren nach dem Spleiß und eine identische Aminosäuresequenz zu OB-Ra auf. Dem mutierten Rezeptor fehlt ein Großteil der cytoplasmatischen Region, einschließlich des möglichen "Box 2"-Motivs. Während die RT-PCR zeigte, dass die Größen der anderen 3'-Enden in C57BL/K9 db/db-Mäusen normal waren, ist es möglich, dass dieses alternative Exon ebenso in andere Transkripte inseriert wird.Sequencing of the RT-PCR products of OB-Rb from the mutant mice revealed a 106 bp insertion between the splice donor on Lys 889 and the splice acceptor on Pro 890 . The sequence of the inserted DNA was identical to the first 106 bp of the unique OB-Ra exon, downstream of its splice acceptor on Arg 890 (FIG. 5A ). Sequencing of the genomic DNA and RT-PCR products of the 3 'untranslated region of OB-Ra from C57BL / Ks db / db mice identified a g → t mutation 106 bp after the splice acceptor (see 5B and 5C ). This mutation leads to the appearance of a splice donor consensus site, AGGTAAA ( 5C ) [Lodish et al., Mol. Cell. Biol., Scientific American Books: New York, pp. 1-1344 (1986)]. This mutated splice donor results in the splicing of 106 bp of the terminal OB-Ra exon into the splice acceptor on Pro 890 in the OB-Rb RNA. The resulting mutant OB-Rb protein has a termination codon five amino acids after the splice and an identical amino acid sequence to OB-Ra. The mutant receptor lacks much of the cytoplasmic region, including the potential "box 2" motif. While the RT-PCR showed that the sizes of the other 3 'ends in C57BL / K were normal 9 db / db mice, it is possible that this alternative exon is inserted also in other transcripts.

Der OB-Rb-Leptinrezeptor wird in einer großen Menge im Hypothalamus verglichen mit anderen Geweben exprimiert (6). Eine Expression mit niedrigerer Menge wird in den Hoden, mit einer noch niedrigeren Menge im Fettgewebe beobachtet. Die anderen alternativ gespleißten mRNAs werden in mehreren Geweben exprimiert, in einigen Fällen einschließlich des Hypothalamus (6). OB-Re, welcher einen möglichen löslichen Rezeptor kodiert, wird in Fettgewebe stark exprimiert und wird in einer niedrigeren Menge im Gehirn, Herz und den Hoden exprimiert (6E).The OB-Rb leptin receptor is expressed in a large amount in the hypothalamus compared to other tissues ( 6 ). Lower level expression is observed in the testes, with even lower levels in adipose tissue. The other alternatively spliced mRNAs are expressed in several tissues, in some cases including the hypothalamus ( 6 ). OB-Re, which encodes a possible soluble receptor, is highly expressed in adipose tissue and is expressed in a lower amount in the brain, heart, and testes ( 6E ).

Die C57BL/Ks db/db-Mutation ist koisogen und führt zur funktionellen Ersetzung der cytoplasmatischen Domäne, welche OB-Rb entspricht, durch die von OB-Ra. Diese Daten, vereinigt mit der Lokalisation des Leptinrezeptors an genau derselben chromosomalen Region wie db, bestätigt stark, dass OB-Rb allelisch mit db ist. Die Identifikation von Mutationen in den zwei anderen verfügbaren Allelen von db wird zusätzliche Information über die Struktur-Funktions-Beziehung des Proteins bereitstellen. Die Tatsache, dass die C57BL/Ks db/db-Mutation in dem einzigartigen C-Terminus von OB-Rb gefunden wird, erklärt, warum die Sequenz von OB-Ra in C57BL/Ks db/db-Mäusen unverändert war, und dass das Binden von Leptin an den Plexus choroideus in diesen Tieren normal war. Die Leptinbindung in C57BL/Ks db/db-Mäusen ist wahrscheinlich an allen Orten normal. Der fettleibige Phänotyp scheint sich eher aus der Unfähigkeit des OB-Ra C-Terminus zu ergeben, eine Signaltransduktion auszulösen, wenn er anstelle des C-Terminus von OB-Rb exprimiert wird. Eine Aufklärung des Signaltransduktionsweges und eine Identifikation von möglichen Stellen der JAK-Bindung an die cytoplasmatische Region dieses Rezeptors werden in Erwägung gezogen.The C57BL / Ks db / db mutation is co -ogenic and results in functional replacement the cytoplasmic domain, which corresponds to OB-Rb, by OB-Ra. This data, united with the location of the leptin receptor on exactly the same chromosomal Region like db, confirmed strong that OB-Rb is allelic with db. The identification of mutations in the other two available Alleles of db will provide additional information about the Provide structure-function relationship of the protein. The fact, that the C57BL / Ks db / db mutation in the unique C-terminus is found by OB-Rb, explains why the sequence of OB-Ra in C57BL / Ks db / db mice was unchanged, and that binding of leptin to the choroid plexus was normal in these animals. Leptin binding in C57BL / Ks db / db mice is likely at all Places normal. The obese phenotype seems rather out of the incompetence of the OB-Ra C-terminus, triggering signal transduction when it is expressed in place of the C-terminus of OB-Rb. An enlightenment of the Signal transduction path and an identification of possible Establish JAK binding to the cytoplasmic region of this receptor will be considered drawn.

Diese Ergebnisse legen nahe, dass die gewichtsreduzierenden Wirkungen von Leptin zumindest teilweise durch Interaktionen mit dem OB-Rb-Rezeptor vermittelt werden, welcher eine C-terminale (cytoplasmatische) Domäne aufweist, welche charakteristisch für OB-Rb im Hypothalamus ist, einer Gehirnregion, von welcher bekannt ist, dass sie eine wichtige Rolle beim Regulieren des Körpergewichts spielt. Dies wird durch die gesteigerte Wirksamkeit von Leptin, wenn es direkt in die CSF verabreicht wird, und die Wirkungen von Leptin auf die elektrische Aktivität der Neuronen des Hypothalamus unterstützt. Leptin kann die Aktivität von NPY, GLP-1 und anderen Peptiden modulieren, von welchen bekannt ist, dass sie das Ernährungsverhalten im Hypothalamus und Gehirn beeinflussen [Stephens et al, supra, Tarton et al., Nature, 379: 69 (1996)]. Es kann ebenfalls Wirkungen auf andere Gewebe aufweisen, welche den Leptinrezeptor exprimieren, einschließlich von Fett. Der Rezeptor, welcher im Plexus choroideus exprimiert wird, wahrscheinlich OB-Ra oder eine Spleißvariante, welche einen ähnlichen C-Terminus teilt, kann wirken, um das Protein zur CSF zu transportieren, ein Mechanismus, welcher ähnlich zu dem ist, der für den Transport von Insulin durch den Insulinrezeptor vorgeschlagen wird [Bahary et al., 1990, supra, Partridge et al., Neurochem., 44: 1771 (1985), Van Routen und Posner, Nature, 282: 623 (1979), Wood und Park, Am. J. Physiol., 233: E331–E334 (1979)].These Results suggest that the weight-reducing effects of leptin, at least in part, through interactions with the OB-Rb receptor which has a C-terminal (cytoplasmic) domain, which characteristic of OB-Rb is in the hypothalamus, a brain region known from which is that they have an important role in regulating body weight plays. This is due to the increased efficacy of leptin, when administered directly into the CSF, and the effects of Leptin on the electrical activity of neurons of the hypothalamus supported. Leptin may be the activity of NPY, GLP-1 and other peptides, some of which are known is that they are the dietary behavior in the hypothalamus and brain [Stephens et al, supra, Tarton et al., Nature, 379: 69 (1996)]. It can also have effects have other tissues expressing the leptin receptor, including from Fat. The receptor expressed in the choroid plexus, probably OB-Ra or a splice variant, which has a similar C-terminus may act to transport the protein to CSF, a mechanism similar to that is who for proposed the transport of insulin by the insulin receptor [Bahary et al., 1990, supra, Partridge et al., Neurochem. 44: 1771 (1985), Van Routes and Posner, Nature, 282: 623 (1979), Wood and Park, Am. J. Physiol., 233: E331-E334 (1979)].

Von OB-Re, dem vermeintlich löslichen Rezeptor wird angenommen, dass er im Kreislauf an Leptin bindet. Er könnte als Transportprotein wirken, um die Leptinaktivität zu fördern [siehe z. B. Davis et al., Science, 259: 1736 (1993), Kishimoto et al, supra; Davis et al., Science, 260: 1805 (1993)].From OB-Re, the supposedly soluble Receptor is believed to bind to leptin in the circulation. He could act as a transport protein to promote leptin activity [see z. Davis et al., Science, 259: 1736 (1993), Kishimoto et al. supra; Davis et al., Science, 260: 1805 (1993)].

BEISPIEL 2: HERSTELLUNG VON ANTIKÖRPERN GEGEN DAS OB-POLYPEPTIDEXAMPLE 2: PREPARATION OF ANTIBODIES THE OB POLYPEPTIDE

Zusätzlich zur Verwendung des rekombinanten Proteins, um polyklonale Antikörper zu erzeugen, wurde ein Satz von drei Peptidsequenzen aus der abgeleiteten vollständigen Mäuse-OB-R-Sequenz identifiziert (d. h. SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8, 10). Die vier internen Peptidfragmente sind:
Peptid A (Aminosäurenummern 145–158) (SEQ ID NR: 32):
Glu-Pro-Leu-Pro-Lys-Asn-Pro-Phe-Lys-Asn-Tyr-Asp-Ser-Lys
Peptid B (Aminosäurenummern 465–484) (SEQ ID NR: 33):
His-Arg-Arg-Ser-Leu-Tyr-Cys-Pro-Asp-Ser-Pro-Ser-IIe-His-Pro-Thr-Ser-Glu-Pro-Lys
Peptid C (Aminosäurenummern 863–881) (SEQ ID NR: 34):
Gln-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Phe-Trp-Asp-Asp-Val-Pro-Asn-Pro-Lys-Asn-Cys-Ser-TrpIn addition to using the recombinant protein to generate polyclonal antibodies, WUR Figure 4c identifies a set of three peptide sequences from the deduced complete mouse OB-R sequence (ie, SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10). The four internal peptide fragments are:
Peptide A (amino acid numbers 145-158) (SEQ ID NO: 32):
Glu-Pro-Leu-Pro-Lys-Asn-Pro-Phe-Lys-Asn-Tyr-Asp-Ser-Lys
Peptide B (amino acid numbers 465-484) (SEQ ID NO: 33):
His-Arg-Arg-Ser-Leu-Tyr-Cys-Pro-Asp-Ser-Pro-Ser-IIe-His-Pro-Thr-Ser-Glu-Pro-Lys
Peptide C (amino acid numbers 863-881) (SEQ ID NO: 34):
Gln-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Phe-Trp-Asp-Asp-Val-Pro-Asn-Pro-Lys-Asn-Cys-Ser-Trp

Diese Peptide wurden unter Verwendung einer Standard-Festphasen-Peptidsynthese hergestellt. Die gereinigten synthetischen Peptide werden an KLH konjugiert, und die Peptid-KLH-Konjugate werden verwendet, um Kaninchen unter Verwendung von Standardtechniken zu immunisieren. Polyklonale Antiseren, welche spezifisch für jedes Peptid sind, werden aus den Kaninchen gewonnen.These Peptides were prepared using standard solid phase peptide synthesis. The purified synthetic peptides are conjugated to KLH, and the peptide-KLH conjugates are used to rescue rabbits to immunize by standard techniques. Polyclonal antisera which are specific for each Peptides are obtained from the rabbits.

BEISPIEL 3: HERSTELLUNG VON PCR-SONDEN AUS cDNA-SELEKTIONS- UND EXON-TRAPPING-KLONENEXAMPLE 3: PREPARATION OF PCR PROBES FROM cDNA SELECTION AND EXON-TRAPPING CLONES

Dieses Beispiel beschreibt die cDNA-Selektions-Klone, welche identifiziert wurden, um OB-R zu entsprechen. Die PCR-Primer von diesen Klonen wurden als Sonden für OB-R-cDNA und genomische Klone verwendet und sind zum Identifizieren von OB-R-DNA, sowie zum Charakterisieren verschiedener OB-R-Spleißvarianten geeignet.This Example describes the cDNA selection clones which identified were to comply with OB-R. The PCR primers of these clones were used as probes for OB-R cDNA and genomic clones are used and are for identification OB-R-DNA, and to characterize different OB-R splice variants suitable.

Für fünf cDNA-Selektions-Klone wurde gefunden, dass sie als Sonden geeignet sind: die Klone 7 (SEQ ID NR: 35), 11 (SEQ ID NR: 36), 42 (SEQ ID NR: 37), 46 (SEQ ID NR: 38) und 58 (SEQ ID NR: 39). Für zwei cDNA-Selektions-Klone, welche durch eine Hybridisierung mit Exon-Trapping-Klonen identifiziert wurden, wurde ebenfalls gefunden, dass sie geeignete Sonden sind: die Klone S3 (SEQ ID NR: 40) und S14 (SEQ ID NR: 41).For five cDNA selection clones were found to be suitable as probes: clones 7 (SEQ ID NO: 35), 11 (SEQ ID NO: 36), 42 (SEQ ID NO: 37), 46 (SEQ ID NO: 38) and 58 (SEQ ID NO: 39). For two cDNA selection clones obtained by hybridization with exon-trapping clones were also found to be suitable Probes are: clones S3 (SEQ ID NO: 40) and S14 (SEQ ID NO: 41).

Die PCR-Primer wurden von jedem der oben genannten Klone zur Verwendung als Sonden beim Identifizieren von OB-R-DNA hergestellt. Tabelle 1 zeigt die vorwärts gerichteten und rückwärts gerichteten Primer für jeden der Klone und gibt an, welche Spleißvarianten von OB-R, sowie welche vorausgesagte kodierende Region jede Sonde markiert. Tabelle 1. PCR-Primer-Sonden für OB-R-DNA

Figure 01080001
The PCR primers were prepared from each of the above clones for use as probes in identifying OB-R DNA. Table 1 shows the forward and reverse primers for each of the clones and indicates which splice variants of OB-R as well as which predicted coding region labels each probe. Table 1. PCR primer probes for OB-R DNA
Figure 01080001

Wie in der Tabelle angegeben, waren die Sonden aus den Klonen 7 und 11 beim Identifizieren aller Spleißformen von OB-R, welche bis heute identifiziert sind, geeignet. Sonde 42 ist geeignet, um eine Spleißvariante mit einer cytoplasmatischen Domäne, welche OB-Rb entspricht, zu identifizieren, d. h. welche möglicherweise signaltransduktionskompetent ist. Die Sonden 46 und S14 sind geeignet, um Spleißvarianten zu identifizieren, welche eine N-terminale Aminosäuresequenz aufweisen, die OB-Rd und OB-Re entspricht (was identisch zu der N-terminalen Sequenz des veröffentlichten Mäuse-OB-R bis zu den C-terminalen Spleißstellen ist, die für diese Proteine identifiziert wurden, siehe 2B). Sonde 58 ist geeignet, um ein OB-R zu identifizieren, welches eine einzigartige 5'-Region enthält, die in der cDNA der OB-Rb-Spleißvariante gefunden wurde, was eine nicht kodieren de Region sein kann. S3 identifiziert Nukleinsäuren, welche extrazelluläre Domänen kodieren, die in den Varianten a, d und e gefunden werden (entsprechend der veröffentlichten extrazellulären Mäuse-OB-R-Domäne).As indicated in the table, the probes from clones 7 and 11 were useful in identifying all splice forms of OB-R identified to date. Probe 42 is useful to identify a splice variant with a cytoplasmic domain corresponding to OB-Rb, ie which may be signal transduction competent. Probes 46 and S14 are useful for identifying splice variants having an N-terminal amino acid sequence corresponding to OB-Rd and OB-Re (which is identical to the N-terminal sequence of published mouse OB-R up to the C -terminal splice sites identified for these proteins, see 2 B ). Probe 58 is useful to identify an OB-R that contains a unique 5 'region found in the cDNA of the OB-Rb splice variant, which may be a non-coding region. S3 identifies nucleic acids encoding extracellular domains found in variants a, d, and e (corresponding to the published murine extracellular murine OB-R domain).

Die Hybridisierungsbedingungen zum Screenen der Mäusegehirn-cDNA-Bibliothek waren wie folgt: die Sonden mit einer Länge von ungefähr 150–300 bp Länge wurden mit 32P-dCTP unter Verwendung einer Hot-PCR markiert. Die Filter wurden zuerst für mindestens eine Stunde bei 65°C unter Verwendung von RAPID-HYB-Puffer (Amersham LIFE SCIENCES) prähybridisiert. Die markierte Sonde wurde bis zu einer Endkonzentration von 106 cpm/ml RAPID-HYB-Lösung hinzugefügt, und die Hybridisierung wurde für mindestens 6 Stunden bei 65°C durchgeführt. Die Filter wurden mit 2 × SSC/0,1% SDS, RT für 30 min gewaschen, gefolgt von einem stringenteren Waschschritt mit 0,3 × SSC/0,1% SDS, RT, für 1/2 Stunden.The hybridization conditions for screening the mouse brain cDNA library were as follows: probes of about 150-300 bp in length were labeled with 32 P-dCTP using hot PCR. The filters were first prehybridized for at least one hour at 65 ° C using RAPID-HYB buffer (Amersham LIFE SCIENCES). The labeled probe was added to a final concentration of 10 6 cpm / ml RAPID-HYB solution and hybridization was performed for at least 6 hours at 65 ° C. The filters were washed with 2 x SSC / 0.1% SDS, RT for 30 min, followed by a more stringent 0.3 x SSC / 0.1% SDS, RT, wash for 1/2 hr.

So sind die in diesem Beispiel beschriebenen Sonden zum Identifizieren von OB-R, sowie zum Identifizieren von einzigartigen Spleißvarianten geeignet. Es wird zum Beispiel angenommen, dass eine Spleißvariante mit einer extrazellulären Domäne, welche OB-Ra oder OB-Rc/d/e entspricht, mit einer cytoplasmatischen Domäne, welche OB-Rb entspricht, verbunden werden kann.So are the probes for identification described in this example from OB-R, as well suitable for identifying unique splice variants. It will For example, suppose that a splice variant with an extracellular domain, which OB-Ra or OB-Rc / d / e corresponds to a cytoplasmic domain which OB-Rb corresponds, can be connected.

BEISPIEL 4: LEPTINREZEPTOR-MUTATIONEN IN 129 DB3J/DB3J-MÄUSEN UND NIH FACP/FACP-RATTENEXAMPLE 4: LEPTIN RECEPTOR MUTATIONS IN 129 DB 3J / DB 3J MICE AND NIH FA CP / FA CP RATES

Mutationen im Mäuse-db-Gen und seinem Rattenhomologon fa führen zu Fettleibigkeit und Diabetes als Teil eines Syndroms, welches krankhafter humaner Fettleibigkeit ähnelt. Bis heute wurde von Mutationen im Leptinrezeptor (Lepr) in C57BL/Ks db/db-Mäusen und 13 M fa/fa-Ratten berichtet. Dieses Beispiel zeigt, dass NIH facp/facp-Ratten eine Nonsens-Mutation an Aminosäure Tyr763 aufweisen, und dass 129 db3J/db3J-Mäuse eine 17 Basenpaar lange Deletion und eine Leserahmenverschiebung aufweisen, welche zu einem verkürzten Protein mit 636 Aminosäuren führt. Diese Daten bestätigen die Tatsache, dass das db-Gen und Lepr allelisch sind. Zusätzlich ist der Phänotyp von 129 db3J/db3J-Mäusen, welche Defekte in allen Formen von Lept aufweisen, und von C57BL/6J db/db-Mäusen, welchen nur der OB-Rb fehlt, identisch. Diese Daten legen nahe, dass die anderen alternativ gespleißten Formen des Leptinrezeptors (OB-Ra, c, d, e) wahrscheinlich nicht Funktionen dienen, die unabhängig von OB-Rb sind.Mutations in the mouse db gene and its rat homologue fa lead to obesity and diabetes as part of a syndrome resembling morbid human obesity. To date, mutations in the leptin receptor (Lepr) have been reported in C57BL / Ks db / db mice and 13 M fa / fa rats. This example shows that NIH fa cp / fa cp rats have a nonsense mutation at amino acid Tyr763, and that 129 db 3J / db 3J mice have a 17 base pair deletion and a frame shift resulting in a truncated protein of 636 amino acids leads. These data confirm the fact that the db gene and Lepr are allelic. In addition, the phenotype of 129 db 3J / db 3J mice deficient in all forms of lept and C57BL / 6J db / db mice lacking only the OB-Rb is identical. These data suggest that the other alternatively spliced forms of the leptin receptor (OB-Ra, c, d, e) are unlikely to serve functions that are independent of OB-Rb.

Die Klonierung von Leptin und seinem Rezeptor hat zur Identifikation eines neuen Signaltransduktionswegs geführt, welcher wichtig für die Körpergewichtsregulation ist. Die Daten aus Beispiel 1 weisen darauf hin, dass das db-Gen mehrere alternativ gespleißte Formen des Rezeptors für das ob-Genprodukt Leptin kodiert. Von diesen Spleiß-Formen enthält nur eine, OB-Rb, eine lange cytoplasmatische Domäne, welche Motive einschließt, die mit der Signaltransduktion in Verbindung gebracht werden. OB-Rb wird im Hypothalamus stark exprimiert und wird in C57BL/Ks db/db-Mäusen abnormal gespleißt, was zu der Verkürzung der OB-Rb-Isoform führt und zum Verlust seiner signaltransduzierenden Fähigkeit [Beispiel 1, supra, Ghitardi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 632–635 (1996), Vaisse et al., Nature Genetics, 14: 95–97 (1996)]. Kürzlich wurde eine Missense-Mutation in fatty-Ratten (welche allelisch mit db ist) in der fatty(fa/fa)-Zucker-Ratte identifiziert [Chua et al., Diabetes 45: 1141–1143 (1996)]. Diese Mutation verändert wahrscheinlich die Bindung von Leptin an der Zelloberfläche [Chua et al., (1996) supra, Philips et al., Nature Genetics 13: 18–19 (1996)].The Cloning of leptin and its receptor is for identification led to a new signal transduction pathway, which is important for body weight regulation is. The data from Example 1 indicate that the db gene several alternatively spliced Forms of the receptor for the ob gene product encodes leptin. From these splice forms contains only one, OB-Rb, a long cytoplasmic domain that includes motifs that be associated with signal transduction. OB-Rb is highly expressed in the hypothalamus and becomes abnormal in C57BL / Ks db / db mice spliced, what about the shortening the OB-Rb isoform leads and loss of its signal-transducing ability [Example 1, supra, Ghitardi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 632-635 (1996), Vaisse et al., Nature Genetics, 14: 95-97 (1996)]. Recently became a missense mutation in fatty rats (which is allelic with db is) identified in the fatty (fa / fa) sugar rat [Chua et al., Diabetes 45: 1141-1143 (1996)]. This mutation changed probably the binding of leptin to the cell surface [Chua et al., (1996) supra, Philips et al., Nature Genetics 13: 18-19 (1996)].

Mutationen im Mäuse-db-Locus und in seinem Rattenhomologon fatty sind mehrmals unabhängig aufgetreten [Truett et et., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7806–7809 (1991), Hummel et al., Science, 153: 1127–1128 (1966), Hubert et al., Journal of Nutrition 115: 327–333, (1985), Koletsky, Experimental & Molecular Pathology 19: 53–60 (1973), Leiter et al., Diabetologia 19: 58–65 (1980)]. Die molekulare Grundlage der Mutationen in diesen anderen mutierten Stämmen könnte Information über die Struktur-Funktions-Beziehung von Leptin und Lepr bereitstellen. Dieses Beispiel zeigt die molekulare Grundlage der Mutationen in den kodierenden Regionen von Lepr aus mutierten 129 db3J/db3J-Ratten und NIH facp/facp-Ratten.Mutations in the mouse db locus and in its rat homologue fatty have occurred several times independently [Truett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7806-7809 (1991), Hummel et al., Science, 153: 1127-1128 (1966), Hubert et al., Journal of Nutrition 115: 327-333, (1985), Koletsky, Experimental & Molecular Pathology 19: 53-60 (1973), Leiter et al., Diabetologia 19: 58-65 (1980)]. The molecular basis of the mutations in these other mutant strains could provide information about the structure-function relationship of leptin and lepr. This example shows the molecular basis of the mutations in the coding regions of Lepr from mutant 129 db 3J / db 3J rats and NIH fa cp / fa cp rats.

Material und Methodenmaterial and methods

Sequenzbestimmung von Mäuse- und Ratten-Lepr (OB-R). Gehirn- und Hypothalamus-RNA wurde durch ein modifiziertes Guanidin-HCl-Verfahren isoliert [Chirgwin et al., Biochemistry 18: 5294–5299 (1979)]. Zehn Mikrogramm Gesamt-RNA wurden als Matrize verwendet, um cDNA mit Mo-MuLV reverser Transkriptase gemäß den Empfehlungen des Herstellers zu synthetisieren [Lee et al., (1996) supra]. Lepr-DNA-Fragmente wurden unter Verwendung von cDNA oder genomischer DNA aus mutierten und Wildtyp-Tieren mit Taq-DNA-Polymerase und Primern amplifiziert, welche auf der Mäuse- oder Ratten-Lepr-cDNA-Sequenz basierten. Die Proben wurden mit den Primer n 43 M137R 5'CTCACTGTGTAGTGTGAGGAGG-3' (SEQ ID NR: 43) und A83'R 5'CCTTGTGCCCAGGAACAATTC-3' (SEQ ID NR: 55) amplifiziert. Die amplifizierten Fragmente wurden aus Agarosegelen gereinigt und unter Verwendung eines ABI DNA-Sequenzierers wie beschrieben sequenziert [Zhang et al., Nature 372: 425– 432 (1994)]. Die Agarosegele wurden wie beschrieben laufen gelassen [Zhang et al., (1994) supra].sequence determination from mouse and rat lepr (OB-R). Brain and hypothalamic RNA was through a modified guanidine-HCl method isolated [Chirgwin et al., Biochemistry 18: 5294-5299 (1979)]. Ten micrograms of total RNA was used as template cDNA with Mo-MuLV reverse transcriptase according to the recommendations of the manufacturer to synthesize [Lee et al., (1996) supra]. Lepr DNA fragments were mutated using cDNA or genomic DNA and wild-type animals amplified with Taq DNA polymerase and primers, which on the mouse or rat lepr cDNA sequence. The samples were taken with the Primer n 43 M137R 5'CTCACTGTGTAGTGTGAGGAGG-3 '(SEQ ID NO: 43) and A83'R 5'CCTTGTGCCCAGGAACAATTC-3 '(SEQ ID NO: 55) amplified. The amplified fragments were made from agarose gels purified and sequenced using an ABI DNA sequencer as described [Zhang et al., Nature 372: 425-432 (1994)]. The agarose gels were run as described [Zhang et al., (1994) supra].

PCR von cDNA und genomischer DNA. Sowohl cDNA, als auch genomische DNA aus der extrazellulären Region von Lepr wurden PCR-amplifiziert. Die DNA wurde von 129 db3J/db3J- und Wildtyp-Mäusen erhalten. Die Primersequenzen waren wie folgt: für die cDNA war der vorwärts gerichtete Primer 3JF1 5'GAGAATAACCTTCAATTCCAGATTC3' (SEQ ID NR: 56) und der rückwärts gerichtete Primer war 3JR1 5'CCCAAGCTTAAGGCCCTCTCATAGGAAC3' (SEQ ID NR: 57), für die genomische DNA war der vorwärts gerichtete Primer 3JF2 5'GACCTCTCTGCAGTCTATGTGGTCCA3' (SEQ ID NR: 58) und der rückwärts gerichtete Primer war 3JR2 5'GAAAGGTTTTCAGTCACGCTTGAAG3' (SEQ ID NR: 59).PCR of cDNA and genomic DNA. Both cDNA and genomic DNA from the extracellular region of Lepr were PCR amplified. The DNA was obtained from 129 db 3J / db 3J and wild type mice. The primer sequences were as follows: for the cDNA, the forward primer was 3JF1 5'GAGAATAACCTTCAATTCCAGATTC3 '(SEQ ID NO: 56) and the reverse primer was 3JR1 5'CCCAAGCTTAAGGCCCTCTCATAGGAAC3' (SEQ ID NO: 57) for which genomic DNA was the forward primer was 3JF2 5'GACCTCTCTGCAGTCTATGTGGTCCA3 '(SEQ ID NO: 58) and the reverse primer was 3JR2 5'GAAAGGTTTTCAGTCACGCTTGAAG3' (SEQ ID NO: 59).

Ergebnisse und DiskussionResults and discussion

Die fettleibige NIH-Corpulent-Ratte (cp/cp) ist genetisches Inzuchtmodell des nicht Insulin abhängigen Diabetes, welche durch progressiv ansteigende Fettleibigkeit und Hyperinsulinämie vor dem Auftreten einer anhaltenden Hyperglykämie gekennzeichnet ist [Koletsky (1973) supra]. Für die cp-Mutation wurde zuvor gezeigt, dass sie ein fa-Allel ist (facp)/facp), da Kreuzungen von Ratten, welche die fa-Mutation tragen, mit Ratten, welche die cp-Mutation tragen, fettleibige Nachkommen ergaben [Yen et al., Heredity 38 (1977)]. cDNA wurde aus dem Hypothalamus von mageren und fettleibigen Ratten hergestellt, und die Sequenz der vollständigen kodierenden Region für Lepr wurde verglichen. Eine einzelne Basenänderung von T zu A an Nukleotid 2289 wurde in der fettleibigen Corpulent-Ratte identifiziert, welche zur Umwandlung von Tyr763 in ein Stopcodon führt (7). Um dies zu bestätigen, wurden spezifische Primer, welche die Mutation eng flankieren, corp-F und corp-R, verwendet, um genomische DNA von sowohl mageren, als auch fettleibigen Ratten zu amplifizieren. Die Sequenzierung der genomischen DNA bestätigte die T zu A-Änderung. Diese Nonsense-Mutation führt zur Termination der Translation aminoterminal der Transmembrandomäne. Als eine Folge enthält keine der Lepr-Isoformen in cp/cp-Ratten eine Transmembrandomäne, noch irgendeines der Motive, welche für die Signaltransduktion nötig sind.The obese NIH corpulent rat (cp / cp) is a genetic inbred model of non-insulin-dependent diabetes characterized by progressively increasing obesity and hyperinsulinaemia prior to the onset of persistent hyperglycemia [Koletsky (1973) supra]. For the cp mutation was previously ge shows that it is a fa allele (fa cp ) / fa cp ), as crosses of rats carrying the fa mutation with rats bearing the cp mutation gave rise to obese offspring [Yen et al., Heredity 38 (1977)]. cDNA was prepared from the hypothalamus of lean and obese rats and the sequence of the complete coding region for Lepr was compared. A single base change from T to A at nucleotide 2289 was identified in the corpulent obese rat, which leads to the conversion of Tyr763 into a stop codon ( 7 ). To confirm this, specific primers closely flanking the mutation, corp-F and corp-R, were used to amplify genomic DNA from both lean and obese rats. Sequencing of the genomic DNA confirmed the T to A change. This nonsense mutation leads to the termination of translation aminoterminal of the transmembrane domain. As a result, none of the Lepr isoforms in cp / cp rats contain a transmembrane domain, nor any of the motifs necessary for signal transduction.

Die db3J-Mutation trat spontan in dem 129/J-Stamm im Jackson Laborstory auf. Die mutierten Tiere weisen schwere Fettleibigkeit und Hypoglykämie, eher als Hyperglykämie auf, gekoppelt mit merklicher Hyperinsulinämie und stark vergrößerten Langerhans'schen Inseln [Leiter et al., (1980) supra]. Um die db3J-Mutation zu identifizieren, wurde RNA aus dem Hypothalamus von db3J- und Wildtyp-Mäusen hergestellt. Eine Agarosegel-Elektrophorese ergab, dass ein RT-PCR-Produkt vom Aminoterminus der db3J-Rezeptor-Mäuse kleiner ist, als das von 129 +/+-Mäusen. Das PCR-Produkt der genomischen DNA aus dieser Region des Rezeptors war in den mutierten Mäusen ebenfalls kürzer (8). Eine Sequenzierung der PCR-Produkte identifizierte eine 17 Nukleotide lange Deletion, welche an Base G1874 (Ser625) in mutierten Mäusen beginnt, was eine Leserahmenverschiebung verursacht (9). In den db3J/db3J-Mäusen stoppt die Translation von OB-R an der 11. Aminosäure nach der Deletionsstelle. Das Ergebnis ist die Synthese eines verkürzten Proteins ohne Transmembrandomäne. Immunblots bestätigen, dass die Rezeptorprotein-Bande in dieser Mutante fehlt. Daher führt diese Mutation zu einem verkürzten Rezeptor, welcher alle Lepr-Spleißvarianten beeinflusst.The db 3J mutation appeared spontaneously in the 129 / J strain in the Jackson Laboratory. The mutant animals have severe obesity and hypoglycemia, rather than hyperglycemia, coupled with marked hyperinsulinemia and greatly enlarged islets of Langerhans [Leiter et al., (1980) supra]. To identify the db 3J mutation, RNA was prepared from the hypothalamus of db 3J and wild type mice. Agarose gel electrophoresis revealed that an RT-PCR product from the amino terminus of the db 3J receptor mice is smaller than that from 129 + / + mice. The PCR product of the genomic DNA from this region of the receptor was also shorter in the mutant mice ( 8th ). Sequencing of the PCR products identified a 17 nucleotide deletion which starts at base G 1874 (Ser625) in mutant mice, causing a frame shift ( 9 ). In the db 3J / db 3J mice, translation of OB-R at the 11th amino acid stops after the deletion site. The result is the synthesis of a truncated protein without a transmembrane domain. Immunoblots confirm that the receptor protein band is missing in this mutant. Therefore, this mutation results in a truncated receptor that affects all Lepr splice variants.

Die Nonsense-Mutation in der Corpulent-(cp/cp)-Ratte und die Leserahmenverschiebungs-db-Mutation in 129J-(db/db)-Mäusen bestätigt, dass Defekte im Leptinrezeptor zu Abnormalitäten im Leptin-Lepr-Weg und zu einem fettleibigen Phänotyp führen. Zusätzlich ist der Phänotyp von 129 db3J/db3J-Mäusen, welche Defekte in allen Formen von Lepr aufweisen, und von C57BL/6J db/db-Mäusen, welchen nur OB-Rb fehlt, identisch (10). Diese Daten legen nahe, dass die anderen alternativ gespleißten Formen des Leptinrezeptors (OB-Ra, c, d, e) wahrscheinlich nicht Funktionen dienen, die unabhängig von OB-Rb sind.The nonsense mutation in the corpulent (cp / cp) rat and the frame shift db mutation in 129J (db / db) mice confirm that defects in the leptin receptor lead to abnormalities in the leptin-Lepr pathway and to an obese one Cause phenotype. In addition, the phenotype of 129 db 3J / db 3J mice having defects in all forms of Lepr and C57BL / 6J db / db mice lacking only OB-Rb is identical ( 10 ). These data suggest that the other alternatively spliced forms of the leptin receptor (OB-Ra, c, d, e) are unlikely to serve functions that are independent of OB-Rb.

BEISPIEL 5: EXPRESSION VON LÖSLICHEM MAUSE-OB-REZEPTOR UND OB-REZEPTOR-MUTANTEN UNTER VERWENDUNG EINES BACULOVIRUS-SYSTEMSEXAMPLE 5: EXPRESSION OF SOLUBLE MAUSE OB RECEPTOR AND OB RECEPTOR MUTANTS USING ONE BACULOVIRUS SYSTEMS

Erzeugung von Baculovirus- Transferkonstrukten. Alle Konstrukte zur Expression des löslichen OB-Rezeptors (OB-Re) und der OB-Re-Mutanten wurden auf der Grundlage eines Baculovirus-Polyhedrinpromotor basierten Transfer-Klonierungsvektors erzeugt, welcher pMelBac genannt wird (Invitrogen, Kat.Nr. V1950-20). Dieser Vektor ist entworfen, um die Expression von rekombinanten Proteinen über den sekretorischen Weg in das extrazellulare Medium zu steuern. Der Vektor enthält eine Signalsequenz für Honigbienen-Melittin (HBM), welches stark exprimiert und effizient von SF9-Zellen, einer Insekten-Zelllinie, sezerniert wird. Die HBM-Signalsequenz in pMelBac ersetzt die endogene Signalsequenz des rekombinanten Proteins. Eine PCR wurde während des anfänglichen Klonierungsschrittes verwendet, um Inserts für die Ligation zu erzeugen. OB-Re-cDNA diente als PCR-Matrize (SEQ ID NR: 10). Primer-Oligonukleotide für die PCR wurden entworfen, um die benötigte Region der OB-Re-cDNA zu amplifizieren, um die gewünschte/n Punktmutation/en und das Stopcodon, wenn nötig, einzuführen, sowie, um Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen zu erzeugen, welche für die Klonierung in den pMelBac-Vektor benötigt wurden (11, Tabelle 2).Generation of Baculovirus Transfer Constructs. All constructs for the expression of the soluble OB receptor (OB-Re) and the OB-Re mutants were generated on the basis of a baculovirus polyhedrin promoter-based transfer cloning vector called pMelBac (Invitrogen, Cat No V1950-20). , This vector is designed to direct the expression of recombinant proteins via the secretory pathway into the extracellular medium. The vector contains a signal sequence for honeybee melittin (HBM) which is highly expressed and efficiently secreted by SF9 cells, an insect cell line. The HBM signal sequence in pMelBac replaces the endogenous signal sequence of the recombinant protein. PCR was used during the initial cloning step to generate inserts for ligation. OB Re cDNA served as a PCR template (SEQ ID NO: 10). Primer oligonucleotides for PCR were designed to amplify the required region of the OB-Re cDNA to introduce the desired point mutation (s) and stop codon, if necessary, as well as to generate restriction enzyme recognition sequences coding for the cloning into the pMelBac vector was needed ( 11 , Table 2).

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Die Wahl zwischen pMelBac A-, B- oder C-Klonierungsvektoren basierte auf ihren offenen Leserahmen, welche eine Insertion des rekombinanten Gens im Leserahmen mit der Melittin-Signalsequenz zur Sekretion des rekombinanten Proteins erlauben. Die PCR-Produkte und Klonierungsvektoren wurden mit den entsprechenden Restriktionsenzymen (New England Biolabs) vor der Ligation, welche über Nacht bei 16°C unter Verwendung von T4-Ligase (Gibco BRL) durchgeführt wurde, gespalten. Die Ligationsgemische wurden in DH5a-Zellen transformiert, welche über Nacht auf LB-Platten, die 50 μg/ml Ampicillin enthielten, gezogen. Die Klone wurden durch eine PCR unter Verwendung der rekombinanten Baculovirus PCR-Primer von Invitrogen (Kat. N610-04) auf die Anwesenheit des Inserts analysiert. Die positiven Klone, welche durch die PCR identifiziert wurden, wurden mit den vorwärts gerichteten Polyhedrin (Kat. N598-02) und rückwärts gerichteten Baculovirus (+15) (Kat. N615-02) Sequenzierungsprimern von Invitrogen sequenziert, um zu bestätigen, dass das rekombinante Gen richtig orientiert und mit dem Melittin-Sekretionssignal fusioniert war.The Choice between pMelBac A, B or C cloning vectors was based on its open reading frame, which is an insertion of the recombinant Gene in reading frame with the melittin signal sequence for secretion of the recombinant protein. The PCR products and cloning vectors were mixed with the appropriate restriction enzymes (New England Biolabs) before the ligation, which over Night at 16 ° C using T4 ligase (Gibco BRL), split. The ligation mixtures were transformed into DH5a cells, which over Night on LB plates containing 50 μg / ml Ampicillin contained, pulled. The clones were analyzed by PCR using the recombinant baculovirus PCR primer from Invitrogen (Cat. N610-04) for the presence of the insert. The positive ones Clones identified by the PCR were labeled with the forward directed polyhedrin (cat. N598-02) and backward baculovirus (+15) (Cat. N615-02) Sequencing primers from Invitrogen sequenced, to confirm, that the recombinant gene is properly oriented and with the melittin secretion signal was merged.

Herstellung des rekombinanten Virus. SF9-Insektenzellen wurden zur Herstellung und Amplifikation von rekombinantem Virus verwendet. Grace-Insektenwachstumsmedium wurde von Gibco BRL (Kat. 11605) erhalten und mit 10% fötalem bovinem Serum (Gibco BRL, Kat. 26140), 1 μg/ml Gentamicin (Gibco BRL, Kat. 15710) und 625 ng/ml Fungizon (Gibco BRL, Kat. 15295) ergänzt. Pluronic F-68-Säure (Sigma, Kat. P-1300) wurde zu Suspensionszellkulturen mit 0,2% (Gew./Vol.) hinzugefügt. Die rekombinanten Konstrukte wurden zusammen mit der linearisierten Bac-N-Blue-DNA in SF9-Zellen unter Verwendung des Bac-N-Blue-Transfektionskits von Invitrogen (Kat. BK855-01) gemäß den Herstellerangaben transifiziert. Wachstumsmedium, welches ein Gemisch aus rekombinanten und Wildtyp-Viruspartikeln enthielt, wurde 72 Std. und 120 Std. nach der Transfektion gesammelt. Mögliche rekombinante Virusisolate wurden durch Infizieren von SF9-Zellen mit Verdünnungen der Transfektionsstammlösung und Isolieren von Fokuspunkten der Infektion (Plaques) aus einem Agarose-Overlay (Plaque-Assay) gereinigt. Rekombinante Viren wurden durch ihre Fähigkeit, blaue Plaques auf X-gal aufgrund der Anwesenheit des lacZ-Gens in einem pMelBac-Transfervektor zu bilden, identifiziert. Mögliche rekombinante Plaques wurden zu viralen P1-Stammlösungen mit niedrigem Titer in niedrigem Maßstab durch Infizieren von ungefähr 2 × 106 SF9-Zellen und Sammeln des Wachstumsmediums 5–7 Tage nach der Infektion amplifiziert. Die Anwesenheit eines rekombinanten Geninserts in einem möglichen rekombinanten Virus und die Reinheit des rekombinanten Plaques wurde durch eine PCR-Analyse der Virus-DNA unter Verwendung der rekombinanten Baculovirus PCR-Primer, welche oben beschrieben wurden, bestätigt.manufacturing of the recombinant virus. SF9 insect cells were used for production and amplification of recombinant virus. Grace's insect growth medium was obtained from Gibco BRL (cat. 11605) and 10% fetal bovine Serum (Gibco BRL, Cat. 26140), 1 μg / ml Gentamicin (Gibco BRL, cat. 15710) and 625 ng / ml fungizone (Gibco BRL, Cat. 15295). Pluronic F-68 acid (Sigma, Cat. P-1300) was added to suspension cell cultures at 0.2% (w / v) added. The recombinant constructs were linearized along with the Bac-N-Blue DNA in SF9 cells using the Bac-N-Blue transfection kit by Invitrogen (Cat. BK855-01) according to the manufacturer's instructions. Growth medium containing a mixture of recombinant and wild-type virus particles was collected 72 hours and 120 hours post-transfection. Possible Recombinant virus isolates were obtained by infecting SF9 cells with dilutions the transfection stock solution and isolating focal points of infection (plaques) from an agarose overlay (Plaque assay). Recombinant viruses were characterized by their ability to blue plaques on X-gal due to the presence of the lacZ gene in a pMelBac transfer vector to form, identified. Possible recombinant plaques became low P1 viral P1 stocks in low scale by infecting about 2 × 106 SF9 cells and collecting the growth medium 5-7 days after infection amplified. The presence of a recombinant gene insert in a possible recombinant virus and the purity of recombinant plaques by a PCR analysis of the viral DNA using the recombinant Baculovirus PCR primers described above.

Die Expression von rekombinantem Protein wurde durch eine Western Blot-Analyse des Wachstumsmediums unter Verwendung von polyklonalen Kaninchen-Antikörpern, welche gegen Peptide entwickelt wurden, die von der OB-Re-Aminosäuresequenz abgeleitet waren (Beispiel 2, supra), bestätigt. Zusätzlich wurde der C-terminale OB-Re-Abschnitt (Aminosäuren 420–641) verwendet, um Kaninchen zu immunisieren. PCR- und Western-Analysen-positive virale P1-Stammlösungen wurden weiterhin zu P2-Stammlösungen mit hohem Titer und niedrigem Maßstab durch Infizieren einer Suspensionskultur aus ungefähr 2 × 108 SF9-Zellen und Sammeln des Wachstumsmediums 5–7 Tage nach der Infektion amplifiziert. Der Virustiter der P2-Stammlösungen wurde durch Durchführen eines Plaque-Assays mit Reihenverdünnungen der Virusstammlösungen und Zählen der Anzahl der Plaques bestimmt. Die Viren wurden weiterhin zu Master-Stammlösungen mit hohem Titer im hohen Maßstab durch Infizieren von Suspensionskulturen aus SF9-Zellen mit den P2-Stammlösungen mit bekanntem Virustiter mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) gleich 0,5 (0,5 infektiöse Viruspartikel pro SF9-Zelle) amplifiziert. Die sich ergebenden Master-Stammlösungen wurden getitert und für Expressionsstudien des rekombinanten Proteins verwendet.Expression of recombinant protein was confirmed by Western blot analysis of the growth medium using rabbit polyclonal antibodies developed against peptides derived from the OB-Re amino acid sequence (Example 2, supra). In addition, the C-terminal OB Re portion (amino acids 420-641) was used to immunize rabbits. PCR and Western analysis P1 positive viral stock solutions were further amplified into high titer, low-scale P2 stock solutions by infecting a suspension culture of approximately 2 x 10 8 SF9 cells and collecting the growth medium 5-7 days after infection. The virus titer of the P2 stock solutions was determined by performing a plaque assay with serial dilutions of virus stock solutions and counting the number of plaques. The viruses were further made into high titer high titer master stock solutions by infecting suspension cultures of SF9 cells with the P2 stocks of known virus titer with a multiplicity of infection (MOI) equal to 0.5 (0.5 infectious virus particles per SF9 Cell). The resulting master stock solutions were titered and used for expression studies of the recombinant protein.

Expression des rekombinanten Proteins. Die Expressionsmengen der rekombinanten Proteine wurden durch Testen verschiedener Zelllinien, verschiedener MOI und durch Optimieren der Zeitpunkte der Proteinernte optimiert. Typischerweise wurden alle OB-R abgeleiteten rekombinanten Proteine in erheblich höheren Mengen in High Five-Zellen (Kat. B855-02, Invitrogen) verglichen mit den Expres sionsmengen in SF9-Zellen exprimiert. EX-CELL 405 Wachstumsmedium (JRH Biosciences, Kat. 14405-79P), ergänzt mit 3 μg/ml Gentamicin und 1,25 μg/ml Fungizon wurden für das serumfreie Wachstum der High Five-Zellen verwendet, um die Reinigung der sezernierten rekombinanten Proteine zu vereinfachen. Die optimale MOI reichte von 5 bis 10. Die optimale Protein-Sammelzeit lag gewöhnlich ungefähr 72 Std. nach der Infektion.expression of the recombinant protein. The expression levels of the recombinant Proteins were prepared by testing different cell lines, various MOI and optimized by optimizing the timing of the protein harvest. Typically, all OB-R derived recombinant proteins in considerably higher Quantities were compared in high five cells (cat. B855-02, Invitrogen) expressed with expression levels in SF9 cells. EX-CELL 405 Growth medium (JRH Biosciences, Cat. 14405-79P), supplemented with 3 μg / ml gentamicin and 1.25 μg / ml Fungizon were for The serum-free growth of the High Five cells used to cleanse of the secreted recombinant proteins. The optimal MOI ranged from 5 to 10. The optimal protein collection time was usually about 72 hours. after the infection.

Für eine Expression des rekombinanten Proteins in großem Maßstab wurde eine Suspensionskultur aus High Five-Zellen auf einem Schüttler bei 27°C mit ungefähr 100–120 rpm bis zu einer Dichte von ungefähr 2 × 106 Zellen/ml (Log-Stadium des Wachstums) gezogen. Die Zellen wurden mit einer rekombinanten Virus-Masterstammlösung mit der optimalen MOI infiziert, und. das Wachstumsmedium wurde zum optimalen Zeitpunkt gesammelt. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 5000 g für 10 Minuten entfernt, und die sezernierten Proteine wurden durch das Hinzufügen von Ammoniumsulfat präzipitiert. FPLC basierte Protokolle wurden für eine weitere Reinigung der rekombinanten Proteine eingesetzt.For large scale expression of the recombinant protein, a suspension culture of High Five cells was grown on a shaker at 27 ° C at approximately 100-120 rpm to a density of approximately 2 × 10 6 cells / ml (log stage of growth). drawn. The cells were infected with a recombinant virus master stock solution at the optimal MOI, and. the growth medium was collected at the optimal time. Cell debris was removed by centrifugation at 5000 g for 10 minutes, and the secreted proteins were precipitated by the addition of ammonium sulfate. FPLC based protocols were used for further purification of the recombinant proteins.

Assay auf die biologische Aktivität (Leptinbindung). Die biologische Aktivität des rekombinanten OB-Re und der OB-Re-Mutanten wurde durch ihre Fähigkeit getestet, Leptin, welches an SEPHAROSE-Kügelchen konjugiert war, zu binden. Wachstumsmedium, welches sezerniertes rekombinantes Protein enthielt, wurde über Nacht mit Leptin-SEPHAROSE-Kügelchen inkubiert. Die Kügelchen wurden gewaschen, mit SDS gekocht und die gebundenen Proteine wurden durch einen Western-Blot analysiert. Alle analysierten rekombinanten Proteine waren in der Lage, Leptin zu binden. Die Bindung des rekombinanten vollständigen OB-Re an Leptin ist sehr stark, da OB-Re bei Raumtemperatur mit starken chaotropischen Mitteln, wie SDS, Harnstoff oder Guanidiniumhydrochlorid nicht von der Leptin-SEPHAROSE-Säule eluiert werden konnte. Die Spezifität der rekombinantes Protein-Leptin-Interaktion wurde durch einen kompetitiven Inhibitionsassay überprüft (12). Medium, welches rekombinante Proteine enthielt, wurde mit löslichem Leptin vor der Inkubation mit Leptin-Sepharose präinkubiert. Für lösliches Leptin wurde gefunden, dass es die Bindung der rekombinanten OB-Re-Proteine an Lep tin-Sepharose-Kügelchen in einer konzentrationsabhängigen Weise inhibiert (Tabelle 3).Assay for biological activity (leptin binding). The biological activity of recombinant OB-Re and OB-Re mutants was tested by their ability to bind leptin conjugated to SEPHAROSE beads. Growth medium containing secreted recombinant protein was incubated overnight with leptin-SEPHAROSE beads. The beads were washed, boiled with SDS, and the bound proteins were analyzed by Western blot. All recombinant proteins analyzed were able to bind leptin. The binding of the recombinant whole OB-Re to leptin is very strong since OB-Re could not be eluted from the leptin-SEPHAROSE column at room temperature with strong chaotropic agents such as SDS, urea or guanidinium hydrochloride. The specificity of the recombinant protein-leptin interaction was checked by a competitive inhibition assay ( 12 ). Medium containing recombinant proteins was preincubated with soluble leptin prior to incubation with leptin-sepharose. Soluble leptin was found to inhibit the binding of recombinant OB-Re proteins to lepin-Sepharose beads in a concentration-dependent manner (Table 3).

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Die vorliegende Erfindung soll durch die hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen in ihrem Schutzumfang nicht beschränkt werden. In der Tat werden verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu jenen, welche hier beschrieben wurden, dem Fachmann aus der vorangehenden Beschreibung und den beigefügten Figuren offensichtlich werden. Es ist beabsichtigt, dass solche Modifikationen in den Schutzumfang der beigefügten Ansprüche fallen.The present invention should not be limited in scope by the specific embodiments described herein. In fact, various modifications of the invention in addition to those described herein will become apparent to those skilled in the art from the foregoing description and the attached figures will become apparent. It is intended that such modifications fall within the scope of the appended claims.

Wo Nukleotid- oder Aminosäuresequenzlängen bereitgestellt werden oder Molekulargewichtswerte angegeben werden, sind sie ungefähre Angaben. SEQUENZPROTOKOLL

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Where nucleotide or amino acid sequence lengths are provided or molecular weight values are given, they are approximate. SEQUENCE LISTING
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Claims (22)

Lösliches Leptinrezeptor(OB-R)-Polypeptid, welches a) OB-Re nach Definition von SEQ ID NR: 10 ist; b) ein Polypeptid ist, das den N-Terminus von OB-Re SEQ ID NR: 10 von Pro664 bis His796 und den C-Terminus von OB-Re SEQ ID NR: 10 nach His796 aufweist; c) ein Leptinrezeptor ist, bei dem a) die N-terminale Sequenz i) die Aminosäurereste 1 bis 796 von SEQ ID NR: 10, ii) die Aminosäurereste 23 bis 796 von SEQ ID NR: 10, iii) die Aminosäurereste 28 bis 796 von SEQ ID NR: 10, iv) die Aminosäurereste 133 bis 796 von SEQ ID NR: 10 oder v) die Aminosäurereste 733 bis 796 von SEQ ID NR: 10 ist und b) die C-terminale Sequenz SEQ ID NR: 15 nach His796 ist; d) ein Leptinrezeptor ist, der eine N-terminale Sequenz aufweist, die Aminosäurereste 28 bis 796 von SEQ ID NR: 10 und ein vorausgehendes N-terminales Asp-Pro Dipeptid ist und eine C-terminale Sequenz, die SEQ ID NR: 15 nach His796 ist; e) ein Leptinrezeptor ist, der die Sequenz i) Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Tyr420 (SEQ ID NR: 77) gefolgt von Ala421 bis Pro641 von SEQ ID NR: 10, ii) Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Ser118 (SEQ ID NR: 78) gefolgt von Ala421 bis Pro641 von SEQ ID NR: 10 oder iii) Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Leu123 (SEQ ID NR: 79) gefolgt von Ala421 bis Pro641 von SEQ ID NR: 10 aufweist; f) ein Leptinrezeptor ist, der aus der Sequenz i) Tyr420 bis Pro641 von SEQ ID NR: 10, ii) Ser118 bis Pro641 von SEQ ID NR: 10, oder iii) Leu123 bis Val331 von SEQ ID NR: 10 besteht; oder g) ein Leptinrezeptor ist, der eines der vorstehenden Peptide ist und bei dem ein Cystein durch ein Serin, Threonin, Methionin oder Alanin ersetzt ist.A soluble leptin receptor (OB-R) polypeptide which is a) OB-Re as defined by SEQ ID NO: 10; b) is a polypeptide having the N-terminus of OB-Re SEQ ID NO: 10 of Pro 664 to His 796 and the C-terminus of OB-Re SEQ ID NO: 10 to His 796 ; c) a leptin receptor in which a) the N-terminal sequence i) amino acid residues 1 to 796 of SEQ ID NO: 10, ii) amino acid residues 23 to 796 of SEQ ID NO: 10, iii) amino acid residues 28 to 796 SEQ ID NO: 10, iv) amino acid residues 133 to 796 of SEQ ID NO: 10 or v) amino acid residues 733 to 796 of SEQ ID NO: 10 and b) the C-terminal sequence SEQ ID NO: 15 to His 796 is; d) is a leptin receptor having an N-terminal sequence, which is amino acid residues 28 to 796 of SEQ ID NO: 10 and a preceding N-terminal Asp-Pro dipeptide, and a C-terminal sequence, SEQ ID NO: 15 His is 796 ; e) a leptin receptor having the sequence i) Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Tyr 420 (SEQ ID NO: 77) followed by Ala 421 to Pro 641 of SEQ ID NO: 10, ii) Asp-Arg Trp-Gly-Ser-Ser 118 (SEQ ID NO: 78) followed by Ala 421 to Pro 641 of SEQ ID NO: 10 or iii) Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Leu 123 (SEQ ID NO: 79) followed by Ala 421 to Pro 641 of SEQ ID NO: 10; f) a leptin receptor consisting of the sequence i) Tyr 420 to Pro 641 of SEQ ID NO: 10, ii) Ser 118 to Pro 641 of SEQ ID NO: 10, or iii) Leu 123 to Val 331 of SEQ ID NO : 10 exists; or g) is a leptin receptor, which is one of the above peptides and in which a cysteine is replaced by a serine, threonine, methionine or alanine. Leptinrezeptor nach Anspruch 1, der ein natürlich vorkommender muriner Lep tinrezeptor ist.The leptin receptor of claim 1, which is a naturally occurring is murine leprosin receptor. Derivat, das aus dem Leptinrezeptor gemäß einem der vorstehenden Ansprüche und einer daran gekoppelten chemischen Einheit besteht.Derivative derived from the leptin receptor according to a of the preceding claims and a chemical entity coupled thereto. Derivat nach Anspruch 3, bei dem die chemische Einheit ein wasserlösliches Polymer wie beispielsweise Polyethylenglycol ist.A derivative according to claim 3, wherein the chemical entity a water-soluble Polymer such as polyethylene glycol. Isolierte Nukleinsäure, die den Leptinrezeptor nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 kodiert.Isolated nucleic acid containing the leptin receptor encoded according to claim 1 or claim 2. Isolierte Nukleinsäure, die bei Expression ein lösliches Leptinrezeptor-Polypeptid, das die Fähigkeit, Leptin zu binden, aufweist, kodiert, welche a) ein DNA-Molekül nach SEQ ID NR: 9, b) die komplementäre Sequenz des in a) definierten DNA-Moleküls oder c) ein DNA-Molekül, das bei Expression ein Polypeptid kodiert, das von einem beliebigen der vorstehenden DNA-Molekül kodiert wird, ist.Isolated nucleic acid which upon expression soluble Leptin receptor polypeptide, that's the ability to leptin to bind, coded, which a) a DNA molecule according to SEQ ID NO: 9, b) the complementary Sequence of the DNA molecule defined in a) or c) a DNA molecule that is in Expression encodes a polypeptide derived from any of projecting DNA molecule is encoded is. Vektor, umfassend die DNA nach Anspruch 6, der vorzugsweise ein Expressionsvektor, umfassend die DNA nach Anspruch 6, die operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden ist, oder ein transgener Vektor ist.A vector comprising the DNA of claim 6, preferably an expression vector comprising the DNA of claim 6 operatively is linked to an expression control sequence, or a transgenic vector is. Einzelliger Wirt, der mit einem DNA-Molekül nach Anspruch 6 oder einem Vektor nach Anspruch 7 transformiert oder transfiziert ist, wobei die Wirtszelle vorzugsweise eine Bakterien-, Hefe-, Säuger-, Pflanzen- oder Insektenzelle in Gewebekultur ist.Unicellular host treated with a DNA molecule according to claim 6 or a vector according to claim 7 transformed or transfected wherein the host cell preferably comprises a bacterial, yeast, mammalian, plant or insect cell in tissue culture. Einzelliger Wirt nach Anspruch 8, wobei der einzellige Wirt eine E. coli-, Pseudomonas-, Bacillus-, Streptomyces-, Saccharomyces-, Pichia-, Candida-, Hansenula-, Torulopsis-, CHO-, R1.1-, B-W-, LM-, COS 1-, COS 7-, BSC1-, BSC40-, BMT10- oder Sf9-Zelle ist.Unicellular host according to claim 8, wherein the unicellular Host an E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula, Torulopsis, CHO, R1.1, B-W, LM, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, BMT10 or Sf9 cell. Verfahren zur Herstellung eines Leptinrezeptor-Polypeptids umfassend: a) das Kultivieren einer Zelle nach Anspruch 8 oder Anspruch 9 unter Bedingungen, welche die Expression des Leptinrezeptor-Poylpeptids bewirken; und b) das Gewinnen des exprimierten Polypeptids.Process for the preparation of a leptin receptor polypeptide full: a) cultivating a cell according to claim 8 or Claim 9 under conditions involving expression of the leptin receptor polypeptide cause; and b) recovering the expressed polypeptide. Antikörper, der spezifisch für den Leptinrezeptor nach einem der Ansprüche 1 bis 4 ist.Antibody, specific for The leptin receptor according to any one of claims 1 to 4. Antikörper nach Anspruch 11, wobei der Antikörper ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper ist.antibody according to claim 11, wherein the antibody is a monoclonal or monoclonal antibody polyclonal antibody is. Antikörper nach Anspruch 12, der mit einer detektierbaren Markierung markiert ist.antibody according to claim 12 labeled with a detectable label is. Immortale Zelllinie, die einen monoklonalen Antikörper nach Anspruch 12 herstellt.Immortal cell line containing a monoclonal antibody Claim 12 manufactures. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, der spezifisch für einen löslichen Leptinrezeptor nach Anspruch 1 bis 4 ist, umfassend a) das Immunisieren eines Wirtstieres mit den Leptinrezeptor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dem ein Adjuvans beigemischt ist und/oder der an ein Trägerprotein gekoppelt ist, und b) das Erhalten des Antikörpers aus dem immunisierten Wirtstier.Process for the preparation of an antibody which specific for a soluble one Leptinrezeptor according to claim 1 to 4, comprising a) the Immunize a host animal with the leptin receptor after one the claims 1 to 4, to which an adjuvant is admixed and / or to a carrier protein is coupled, and b) obtaining the antibody the immunized host animal. Verfahren zum Messen des Vorhandenseins eines löslichen Leptinrezeptors nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in einer Probe, umfassend: a) das Inkontaktbringen einer Probe, von der vermutet wird, daß sie einen Leptinrezeptor nach Anspruch 1 bis 4 enthält, mit einem Antikörper, der spezifisch an einen löslichen Leptinrezeptor nach Anspruch 1 bis 4 bindet, wobei der Antikörper optional an einen Festphasenträger gebunden ist, unter Bedingungen, welche die Bildung eines Reaktionskomplexes umfassend den Antikörper und den Leptinrezeptor, erlauben und b) das Nachweisen der Bildung von Reaktionskomplexen, umfassend den Antikörper und den Leptinrezeptor, in der Probe, wobei der Nachweis der Bildung von Reaktionskomplexen das Vorhandensein von Leptinrezeptor in der Probe anzeigt und wobei das Verfahren optional c) das Bestimmen der Menge der gebildeten Reaktionskomplexe einschließt, wobei die Menge an Reaktionskomplexen mit der Menge an Leptinrezeptor der biologischen Probe entspricht, und wobei das Verfahren weiter optional den Schritt des Vergleichens des Niveaus, die in diesem Schritt bestimmt wird, mit dem Niveau des Leptinrezeptors, der in normalen Individuen oder in dem Individuum zu einem früheren Zeitpunkt vorhanden ist bzw. war, enthält, wobei ein Anstieg des Leptinrezeptorniveaus, verglichen mit normalen Leveln eine Krankheit, die mit erhöhten Leptinrezeptorniveaus einher geht, anzeigt, und eine Abnahme des Leptinrezeptorniveaus verglichen mit normalen Niveaus eine Krankheit, die mit erniedrigten Leptinrezeptorniveaus einher geht, anzeigt.A method for measuring the presence of a soluble leptin receptor according to any one of claims 1 to 4 in a sample, comprising: a) contacting a sample suspected of containing a leptin receptor according to claims 1 to 4 with an antibody which is specific to a soluble leptin receptor according to claims 1 to 4, wherein the antibody is optionally bound to a solid phase support under conditions which allow the formation of a reaction complex comprising the antibody and the leptin receptor, and b) detecting the formation of reaction complexes comprising the antibody and the leptin receptor, in the sample, wherein the detection of the formation of reaction complexes indicates the presence of leptin receptor in the sample and optionally wherein the method includes c) determining the amount of reaction complexes formed, the amount of reaction complexes being equal to the amount of leptin receptor of the biological sample; optionally further comprising the step of comparing the level determined in this step with the level of the leptin receptor present in normal individuals or in the individual at an earlier time, wherein an increase in leptin receptor level compared to normal levels indicate a disease associated with elevated leptin receptor levels, and a decrease in leptin receptor levels as compared to normal levels indicates a disease associated with decreased leptin receptor levels. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen löslichen Leptinrezeptor nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, zur Verwendung in der Medizin.A pharmaceutical composition comprising a soluble The leptin receptor of claim 1 or claim 2 and a pharmaceutical acceptable Carrier, for use in medicine. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 17 zur Verwendung bei der Behandlung von Fettleibigkeit in einem Individuum.Pharmaceutical composition according to claim 17 for use in the treatment of obesity in an individual. Verwendung eines löslichen Leptinrezeptors nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 in der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Fettleibigkeit in einem Individuum.Use of a soluble leptin receptor after Claim 1 or claim 2 in the manufacture of a medicament for the treatment of obesity in an individual. Kit, umfassend die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 17 und eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Diabetes, Bluthochdruck oder erhöhtem Cholesterinspiegel.Kit comprising the pharmaceutical composition according to claim 17 and a pharmaceutical composition for treatment diabetes, high blood pressure or elevated cholesterol. Die körperliche Erscheinung verbessernde kosmetische Zusammensetzung zur Reduktion des Körpergewichtes eines Individuums, umfassend einen löslichen Leptinrezeptor nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 und einen verträglichen Träger.The physical Appearance improving cosmetic composition for reduction of body weight of an individual comprising a soluble leptin receptor Claim 1 or claim 2 and a compatible carrier. Verfahren zur kosmetischen Behandlung zur Verbesserung der körperlichen Erscheinung, umfassend das Verabreichen einer Zusammensetzung, umfassend einen löslichen Leptinrezeptor nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 und einen verträglichen Träger, an ein Individuum.Method of cosmetic treatment for improvement the physical A show comprising administering a composition comprising a soluble one Leptin receptor according to claim 1 or claim 2 and a compatible one Carrier, to an individual.
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Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6310034B1 (en) 1993-05-21 2001-10-30 Ut-Battelle, Llc Agouti polypeptide compositions
US6001968A (en) * 1994-08-17 1999-12-14 The Rockefeller University OB polypeptides, modified forms and compositions
US6287782B1 (en) * 1995-11-27 2001-09-11 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods of using the Ob receptor to identify therapeutic compounds
US6620413B1 (en) 1995-12-27 2003-09-16 Genentech, Inc. OB protein-polymer chimeras
ES2244990T3 (en) * 1996-01-04 2005-12-16 Amgen Inc. RECEIVER OF PROTEIN OB AND RELATED COMPOSITIONS AND METHODS.
US6541604B1 (en) 1996-01-08 2003-04-01 Genentech, Inc. Leptin receptor having a WSX motif
US7074397B1 (en) 1996-01-08 2006-07-11 Genentech, Inc. Method for enhancing proliferation or differentiation of a cell using ob protein
US20050019325A1 (en) 1996-01-08 2005-01-27 Carter Paul J. WSX receptor agonist antibodies
US6281346B1 (en) * 1996-03-22 2001-08-28 Merck & Co., Inc. Rat ob-receptors and nucleotides encoding them
WO1997046587A2 (en) * 1996-06-07 1997-12-11 Eli Lilly And Company Ob PROTEIN BINDING PROTEIN
AU4075897A (en) * 1996-08-16 1998-03-06 Roger Lallone A leptin binding protein and its use in methods for diagnosing and treating abnormalities of the endogenous leptin pathway
WO1998012224A1 (en) * 1996-09-20 1998-03-26 Hoechst Aktiengesellschaft Use of leptin antagonists for treating insulin resistance in type ii diabetes
WO1998024881A1 (en) 1996-12-02 1998-06-11 Merck & Co., Inc. Mutant ob receptors and nucleotides encoding them
AU7821798A (en) * 1997-06-09 1998-12-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Assay systems for leptin-enhancing agents
US6770444B2 (en) 1998-07-16 2004-08-03 Synaptic Pharmaceutical Corporation Methods of identifying or screening for agents that binds the Ob-Re
CA2335107C (en) 1998-07-28 2010-01-19 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Leptin-mediated gene-induction
US6777388B1 (en) 1998-08-21 2004-08-17 Clf Medical Technology Acceleration Program, Inc. Leptin-related peptides
CA2376933A1 (en) * 1999-06-11 2000-12-21 Baylor College Of Medicine Methods and compositions for control of bone formation via modulation of leptin activity
AU767068B2 (en) * 1999-06-11 2003-10-30 Baylor College Of Medicine Methods and compositions for control of bone formation via modulation of leptin activity
AU8178401A (en) 2000-05-22 2001-12-03 Vlaams Interuniv Inst Biotech Receptor-based interaction trap
US7235629B2 (en) * 2000-11-14 2007-06-26 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Functional fragment of the leptin receptor
AU2067202A (en) * 2000-11-14 2002-05-27 Vlaams Interuniv Inst Biotech Functional fragment of the lectine receptor
US6992174B2 (en) 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
AU2002315165A1 (en) * 2001-06-14 2003-01-02 Genelink, Inc. Kits and methods for assessing leptin-mediated lipid matabolism
EP1812038A1 (en) 2004-11-18 2007-08-01 VIB vzw Fibronectin iii domain as leptin receptor antagonists
JP7042816B2 (en) * 2016-11-08 2022-03-28 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Antigen-binding protein that antagonizes the leptin receptor
CN112040980A (en) 2018-04-06 2020-12-04 瑞泽恩制药公司 Leptin receptor agonist antibodies for the treatment of metabolic dysfunction or hypoleptin

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990014092A1 (en) 1989-05-18 1990-11-29 Cell Genesys, Inc. Single-strand site-directed modification of mammalian genes in vivo
US5194596A (en) * 1989-07-27 1993-03-16 California Biotechnology Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor
US5350836A (en) * 1989-10-12 1994-09-27 Ohio University Growth hormone antagonists
EP0747485B1 (en) 1989-11-06 1998-12-02 Cell Genesys, Inc. Production of proteins using homologous recombination
JP3501286B2 (en) 1989-12-22 2004-03-02 アプライド リサーチ システムズ，エーアールエス ホールディング ナームロゼ ベノートスハップ Methods for altering the expression characteristics of endogenous genes in certain cell lines or microorganisms
DE69123241T2 (en) 1990-12-14 1997-04-17 Cell Genesys Inc CHIMERIC CHAINS FOR TRANSDUCTING RECEPTOR-RELATED SIGNAL PATHS
WO1994005332A2 (en) * 1992-09-01 1994-03-17 Berlex Laboratories, Inc. Glycolation of glycosylated macromolecules
IL107378A (en) * 1993-10-24 2005-05-17 Yeda Res & Dev SOLUBLE INTERFERON alpha-RECEPTOR, ITS PREPARATION AND USE
US5643748A (en) * 1994-09-14 1997-07-01 Progenitor, Inc. HU-B1.219, a novel human hematopoietin receptor
US5912123A (en) 1994-09-14 1999-06-15 Progenitor, Inc. Detection of the leptin receptor in reproductive organs and methods for regulating reproductive biology
JP2000507081A (en) * 1995-05-08 2000-06-13 カイロン コーポレイション Nucleic acids for treating obesity
AUPN564195A0 (en) 1995-09-26 1995-10-19 Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research, The A novel haemopoietin receptor and genetic sequences encoding same
US6482927B1 (en) * 1995-11-27 2002-11-19 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Chimeric proteins comprising the extracellular domain of murine Ob receptor
US6506877B1 (en) * 1995-11-27 2003-01-14 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Ob receptor
ES2244990T3 (en) 1996-01-04 2005-12-16 Amgen Inc. RECEIVER OF PROTEIN OB AND RELATED COMPOSITIONS AND METHODS.
EP1619250B1 (en) * 1996-01-08 2009-11-25 Genentech, Inc. OB receptor variant and ligands
AU1833197A (en) 1996-01-18 1997-08-11 Progenitor, Inc. Detection of a leptin receptor variant and methods for regulating obesity
JP2002515739A (en) 1996-02-22 2002-05-28 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド Rat OB receptors and nucleotides encoding them
CA2252443A1 (en) 1996-04-22 1997-10-30 Merck & Co., Inc. Leptin assay
WO1997041217A1 (en) 1996-04-30 1997-11-06 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. ob PROTEIN RECEPTOR GENES AND USE OF THE SAME
WO1997042340A1 (en) 1996-05-06 1997-11-13 Merck & Co., Inc. Ob receptor isoforms and nucleic acids encoding them

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Publication number Publication date
MX9805814A (en) 1998-12-31
EP0879286A1 (en) 1998-11-25
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US7063958B1 (en) 2006-06-20
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IL195948A (en) 2010-12-30
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WO1997026335A1 (en) 1997-07-24
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