DE69737891T2

DE69737891T2 - Verwendung von immuntherapeutischem wirkstoff auf peptidbasis

Info

Publication number: DE69737891T2
Application number: DE69737891T
Authority: DE
Inventors: Toshio. Rameru-Ichibankan 105 SONE; Akinori Kume; Kazuo Dairiki; Kohsuke Kino
Original assignee: Meiji Dairies Corp
Current assignee: Meiji Dairies Corp
Priority date: 1996-11-13
Filing date: 1997-11-12
Publication date: 2008-03-13
Anticipated expiration: 2017-11-13
Also published as: US7025964B1; CA2270877A1; AU4964997A; ATE366118T1; AU736977C; JP4218987B2; CN100364611C; EP0958834A4; AU736977B2; CN1244804A; KR100540417B1; CA2270877C; DE69737891D1; WO1998020902A1; EP0958834B1; EP0958834A1; KR20000053216A

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines immuntherapeutischen Wirkstoffs auf Peptidbasis. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines peptidbasierten immuntherapeutischen Wirkstoffs, der bei einem Allergiepatienten mit HLA Klasse II-Molekülen, die ein spezifisches, von einem Allergen abgeleitetes Antigenpeptid binden, wirksam ist und ein spezifisches Antigenpeptid als Wirkstoff enthält. Des Weiteren betrifft die vorliegende Offenbarung ein Reagens zur Identifizierung von HLA Klasse II-Molekülen und umfasst ein Antigenpeptid, das spezifisch mit bestimmten HLA Klasse II-Molekülen reagiert.
FACHLICHER HINTERGRUND
Eine allergische Reaktion ist eine unerwünschte Immunreaktion, die von einer Antwort eines Antikörpers oder einer sensibilisierten Zelle auf ein Antigen hervorgerufen wird. Ein Antigen, das eine allergische Reaktion auslöst, wird spezifisch Allergen genannt. Zu den Allergenen gehören eine Vielzahl von Stoffen wie beispielsweise Pollen, Milben, Tierhaut, Insekten, Nahrungsmittel, Arzneistoffe und Chemikalien. Eine allergische Reaktion wird im Allgemeinen charakterisiert durch eine Zweiphasenreaktion, die eine sofortige Reaktion gegenüber einem Allergen und eine folgende verzögerte Reaktion umfasst. Im frühen Stadium einer allergischen Reaktion bindet ein allergenspezifischer IgE-Antikörper an die Oberfläche von Basophilen im peripheren Blut und an Mastzellen im Gewebe. Wenn ein Allergen in den Körper eindringt, kreuzreagieren die IgE-Antikörper auf der Oberfläche der Basophilen oder Mastzellen mit dem Allergen. Infolgedessen werden Entzündungsmediatoren einschließlich Histamin, Prostaglandin und Leukotrien freigesetzt. Als Antwort auf diese Entzündungsmediatoren werden lokal angereicherte Lymphocyten, Monocyten, Basophile und Eosinophile aktiviert und setzen Mediatoren frei, die Gewebeschäden und andere verschieden Antworten in Geweben verursachen, wodurch eine verzögerte Reaktion eingeleitet wird.
Es ist bekannt, dass eine allergische Reaktion durch Cytokine kontrolliert wird. Cytokine sind nicht nur in die Regulation der IgE-Produktion verwickelt, sondern auch in die Aktivierung und Differenzierung von Effektorzellen. Dies wird durch die Beobachtung unterstützt, dass der Spiegel eines allergenspezifischen IgEs im Blut konstant bleibt, auch dann, wenn klinische Symptome eines Allergiepatienten durch Hyposensibilisierung gemildert wurden.
Die Hyposensibilisierung, ein Verfahren zur Behandlung von allergischen Krankheiten, umfasst die Verabreichung einer kleinen Menge eines Antigens (zum Beispiel eines Antigens, das aus japanische Zedernpollen oder Milben extrahiert wurde) an einen Allergiepatienten und die allmähliche Erhöhung der Dosierung. Der Erfolg der Hyposensibilisierung ist auf eine herabgesetzte Antwort der allergenspezifischen T-Zellen zurückzuführen. Vermutlich verursacht die Hyposensibilisierung eine T-Zell-Toleranz (T-Zell-Anergie) und als Folge davon wird ein Cytokin, das für die Entwicklung der allergischen Kaskade wichtig ist, nicht hergestellt. Studien über Allergien haben sich auf die allergenspezifische Immunreaktion im frühen Stadium konzentriert, speziell auf den Mechanismus zur Kontrolle der T-Zell-Antwort bei einer Allergie. Eine allergische Antwort auf ein exogenes Antigen, einschließlich Allergen, wird in Abhängigkeit von antigenpräsentierenden Zellen des Immunsystems eingeleitet. Antigenpräsentierende Zellen, einschließlich B-Zellen, Makrophagen und dentritischer Zellen, nehmen exogene Antigene auf, zerlegen die exogenen Antigene in Antigenpeptide (T-Zell-Epitoppeptide) und exprimieren die fragmentierten Antigene zusammen mit MHC Klasse II (HLA Klasse II beim Menschen) auf der Zelloberfläche, um antigenspezifischen CD4-positiven T-Helferzellen (Th-Zellen) ein Antigen zu präsentieren.
HLA Klasse II-Moleküle (DR, DQ und DP) sind Zelloberflächenantigene, bestehend aus α- und β-Ketten. Die α-Kette des DR-Moleküls wird vom HLA-DRA Gen codiert, die β-Kette des DR-Moleküls wird von den HLA-DRB1-, HLA-DRB3-, HLA-DRB4-, oder HLA-DRB5-Genen codiert. Die α- und β-Ketten des DQ-Moleküls werden von den HLA-DQA1- beziehungsweise HLA-DQB1-Genen codiert, während die α- und β- Ketten der DP-Moleküle von den HLA-DPA1- beziehungsweise HLA-DPB1-Genen codiert werden. Mit Ausnahme von HLA-DRA weist jedes Gen eine Vielzahl von Allelen auf. Die aus α- und β-Kette bestehenden Taschen, die die Antigenpeptide beherbergen, zeigen einen großen Polymorphismus und unterscheiden sich ein wenig in ihrer Struktur voneinander. Als Folge davon werden Antigenpeptidarten, die an die Taschen binden und T-Zellen präsentiert werden, durch ihre Struktur eingeschränkt. Dies verursacht vermutlich die Unterschiede in individuellen Immunreaktionen.
Th-Zellen, die über T-Zell-Rezeptoren (TCR, engl.: T-cell receptor) eine HLA Klasse II-Molekül-restringierte Antigeninformation erhalten, werden aktiviert und sezernieren verschieden Cytokine, um selbst zu proliferieren und B-Zellen in Plasmazellen zu differenzieren, wobei die Antikörperherstellung eingeleitet wird. Zu diesem Zeitpunkt wird das zweite Signal (co-stimulatorische Signal), das von anderen Molekülen als dem TCR vermittelt wird, nötig, um die T-Zellen zu aktivieren. Im Gegensatz dazu wird ohne dieses Signal immunologische Toleranz der Th-Zellen gegenüber einem Antigen ausgelöst (June, C. et al.: Immunol Today, 15:321, 1994).
Das Herabsetzen der T-Zell-Antwort gegenüber einem Antigen steht in Zusammenhang mit dem Erfolg einer Hyposensibilisierung. Zum Beispiel ist in vitro die T-Zell-Antwort auf das Ambrosia-Allergen „Amb a 1" von einem an Ambrosia-Allergie leidenden Patienten, der sich für zehn Jahre einer wirksamen Hyposensibilisierung unterzogen hat, drastisch vermindert im Vergleich zu einem unbehandelten Patienten. Ähnlich war in einem Patienten, der allergisch ist auf das Katzenhaut-Allergen „Fel d 1", die spezifische T-Zell-Antwort gegenüber Fel d 1 offensichtlich vermindert, da die Hyposensibilisierung Auswirkungen zeigte. Diese Verminderung korrespondiert mit der Verminderung der Sensitivität in einem Hauttest. Des Weiteren blieben die Fel d 1 spezifischen IgG- und IgE-Antikörper während der Behandlung auf einem konstanten Spiegel. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass ein therapeutischer Wirkstoff gegen eine Allergie, der direkt antigenspezifische T-Zellen zum Ziel hat, hergestellt werden könnte.
Die Entwicklung biochemischer Trennungs- und Analyseverfahren hat die Aufreinigung verschiedener Allergene ermöglicht. Im Besonderen sind mehr als 100 Arten von Allergengenen cloniert worden und in den letzten Jahren sind unter Verwendung von molekularbiologischen und gentechnischen Verfahren ihre Primärstrukturen bestimmt worden. Bei einigen dieser Allergene wurden auch die T-Zell-Epitopstellen identifiziert.
Peptidbasierte immuntherapeutische Zusammensetzungen, die Peptide einschließlich T-Zell-Epitope von Allergenen verwenden, wurden beschrieben (internationale Patentanmeldung, veröffentlicht in Japan Nr.: Hei 7-502890 , Hei 8-502163 und Hei 8-507436 ). Die Verwendung von Peptiden, die einen Teil der Aminosäuresequenz eines T-Zell-Epitoppeptids des Zederpollenantigens aufweisen, zur Behandlung oder Vorbeugung einer Pollinose wird in JP07-118295 beschrieben. Wenn einige Teile eines T-Zell-Epitops des Katzenallergen Fel d 1-Moleküls, aber nicht das ganze, subkutan einer Maus verabreicht wurden, wurde dem Bericht zufolge eine antigenspezifische T-Zell-Toleranz gegenüber der Herausforderung mit dem ganzen Fel d 1 ausgelöst (Briner, T.J. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7608-7612,1994). Einzelne Aminsäureaustausche in Peptiden, abgeleitet von einem japanischen Zedernpollenallergen (Cry j 1), lösen Änderungen in den menschlichen T-Zell-Antworten und im T-Zell-Rezeptor-Antagonismus aus (Ikagawa, S. et al.: Journal of Allergy and Clinical Immunology, 97, Nr. 1 Teil 1, 53-64, 1996). Ob ein Haupt-T-Zell-Epitop wirksam genug ist, um eine T-Zell-Antwort gegenüber einer Herausforderung des ganzen Allergens herabzusetzen und ob dies klinische Symptome lindern kann, ist allerdings durch klinische Versuche im Menschen nicht bestätigt worden. JP 08 04 7392 beschreibt Proteine oder Peptide, die nützlich sind für die Diagnose, Vorbeugung und Behandlung der japanischen Zedernpollinose, wobei die Proteine oder Peptide mindestens ein Epitop, insbesondere ein T-Zell-Epitop, von Cry j 2 umfassen. Ein peptidbasierter immuntherapeutischer Wirkstoff für die Vorbeugung und Therapie von allergischen Erkrankungen wird in WO 97/32600 beschrieben, wobei der Wirkstoff ein monomolekulares Multi-Epitoppeptid enthält, welches durch Verbinden von T-Zell-Epitopregionen, die von verschiedenen Allergenmolekülen stammen, hergestellt wurde.
Berichten zufolge kommen in einem Allergenmolekül 3 bis 16 T-Zell-Epitopbereiche vor, von denen etwa 1 bis 7 Stellen von einem Patienten erkannt werden. Wenn sich der HLA Klasse II-Typ in jedem Patienten unterscheidet, unterscheiden sich auch die von jedem Patienten erkannten T-Zell-Epitopstellen. Wenn der HLA Klasse II-Typ der gleiche ist, werden die gleichen T-Zellepitopstellen erkannt. Daher kann die vorstehend beschriebene, peptidbasierte Immuntherapie unter Verwendung eines Peptids, das nur ein Hauptepitop eines Allergenmoleküls, das in einer bestimmten Patientenpopulation erkannt wird, enthält, nicht für alle Patienten wirksam sein.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, einen peptidbasierten immuntherapeutischen Wirkstoff bereitzustellen, der für jeden Allergiepatienten wirksam ist. Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Reagens zur Typisierung der HLA Klasse II-Moleküle eines Patienten zur Verwendung für die Auswahl eines peptidbasierten immuntherapeutischen Wirkstoffs, der für jeden Allergiepatienten wirksam ist.

* Einzelne Aminsäureaustausche in Peptiden, abgeleitet von einem japanischen Zedernpollenallergen (Cry j 1), lösen Änderungen in den menschlichen T-Zell-Antworten und im T-Zell-Rezeptor-Antagonismus aus (Ikagawa, S. et al.: Journal of Allergy and Clinical Immunology, 97, Nr. 1 Teil 1, 53-64, 1996).
** JP 08 04 7392 beschreibt Proteine oder Peptide, die nützlich sind für die Diagnose, Vorbeugung und Behandlung der japanischen Zedernpollinose., wobei die Proteine oder Peptide mindestens ein Epitop, insbesondere ein T-Zell-Epitop, von Cry j 2, umfassen. Ein peptidbasierter immuntherapeutischer Wirkstoff für die Vorbeugung und Therapie von allergischen Erkrankungen wird in WO 97/32600 beschrieben, wobei der Wirkstoff ein monomolekulares Multi-Epitoppeptid enthält, welches durch Verbinden von T-Zell-Epitopregionen, die von verschiedenen Allergenmolekülen stammen, hergestellt wurde.

Die hier genannten Erfinder konzentrierten sich auf die Tatsache, dass jeder Patient verschiedene T-Zell-Epitope eines Allergens erkennt. Die Erfinder etablierten ein Verfahren, um verschiedene T-Zell-Epitope eines Allergenmoleküls mit den epitoprestringierenden HLA Klasse II-Molekültypen eines Patienten zu korrelieren. Tatsächlich haben sie verschiedene T-Zell-Epitope von Allergenmolekülen mit HLA Klasse II-Molekültypen eines Patienten, welche die Epitope der japanischen Zedernpollenallergene Cry j 1 und Cry j 2 restringieren, wie folgt korreliert.
Basierend auf den bekannten HLA-Bindungsmotiven von DR, DQ und DP (Rammensee, H.G. et al.: Immunogenent. 41:178-228, 1995) können T-Zell-Epitopstellen von Allergenmolekülen bestimmt werden, indem die Primärstruktur der Allergenmoleküle analysiert und das Vorkommen von HLA-Motiven nachgewiesen wird. Um die Möglichkeit zu maximieren, dass T-Zell-Epitopstellen in den herzustellenden Peptiden enthalten sind, sollten daher die Epitopstellen basierend auf bekannten HLA-Bindungsmotiven beurteilt werden und die Peptide sollten unter Verwendung der ermittelten Motive erstellt werden. Allerdings verursachen Peptide, welche die ermittelten HLA-Motive enthalten, nicht immer die erwarteten allergischen Symptome. Für die peptidbasierte Immuntherapie nützliche Antigenpeptide müssen mindestens durch ein Experiment unter Verwendung von T-Zellen (periphere Blut-Lymphocyten, T-Zell-Linien oder T-Zell-Clone) bestimmt werden. Durch solch ein Experiment identifizierten die hier genannten Erfinder Antigenpeptide, die für die peptidbasierte Immuntherapie für jeden HLA-Typ nützlich sind.
Die hier genannten Erfinder kultivierten periphere Lymphocyten, T-Zell-Linien oder T-Zell-Clone, die von einem Patienten stammen, der gegenüber einem bestimmten Allergen empfindlich ist, mit antigenpräsentierenden Zellen und überlappenden Peptiden, bestehend aus etwa 15 bis 30 Aminosäureresten (bei denen der überlappende Anteil etwa 5 bis 10 Reste ausmacht), um die ganze Primärstruktur des Allergens abzudecken. Die T-Zell-Antwort auf diese Peptide wurde dann durch Messen der aufgenommenen [³H]-Thymidinmenge (Antwort über Zellproliferation) getestet. Die Peptide, auf die T-Zellen antworteten, wurden als Antigenpeptide mit mindestens einem T-Zell-Epitop identifiziert. Daraufhin korrelierten die Erfinder unter Verwendung von verschiedenen T-Zell-Linien oder T-Zell-Clonen erfolgreich andere T-Zell-Epitope mit den epitoprestringierenden HLA Klasse II-Molekülen des Patienten.
Des Weiteren identifizierten die Erfinder T-Zell-Epitope, die von einer bestimmten Maus erkannt werden. Die Erfinder fanden, dass die selbe Maus, der das T-Zell-Epitop verabreicht wurde, eine signifikant unterdrückte Immunantwort auf die Peptide, die das T-Zell-Epitop enthielten, zeigte. Basierend auf diesem Ergebnis glaubten die Erfinder, dass ein für jeden Patienten wirksamer, peptidbasierter immuntherapeutischer Wirkstoff durch die Auswahl von T-Zell-Epitoppeptiden, die kompatibel mit einem patientenspezifischen HLA Klasse II-Molekültyp sind, aus Peptiden bereitgestellt werden kann, die ein T-Zell-Epitop enthalten, für das Restriktionsmoleküle identifiziert wurden; so wurde die vorliegende Erfindung vollendet.
Des Weiteren können spezifische T-Zell-Epitope, die an spezifische HLA Klasse II-Moleküle binden, durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden. Die hier genannten Erfinder erwogen die spezifischen T-Zell-Epitope als ein Reagens zur Typisierung der HLA Klasse II-Moleküle von Patienten zu verwenden und vollendeten die vorliegende Erfindung. Das Reagens zur Typisierung der HLA Klasse II-Moleküle kann in wirksamer Weise für die Auswahl eines peptidbasierten immuntherapeutischen Wirkstoffs, der für jeden Patienten wirksam ist, verwendet werden.
Insbesondere besteht die vorliegende Erfindung aus den Erfindungen, die im Anspruch beschrieben sind.
Die hierin verwendeten Begriffe werden nachstehend erläutert.

„T-Zell-Epitop" bedeutet eine Struktur, die spezifisch von einem T-Zell-Rezeptor erkannt wird (oder auf die er antwortet).
Epitope die „erkannt" werden, sind Epitope, die T-Zellen aktivieren. Ob T-Zellen aktiviert werden oder nicht, kann durch die Produktion von Cytokinen wie beispielsweise IL-2, IL-4 und IFN-γ oder durch DNA-Synthese beobachtet werden.
„Antigenpeptid" bedeutet ein Peptid, das als ein Antigen funktioniert und T-Zell-Epitope enthält.
„Anergie" meint einen Zustand, in dem Lymphocyten nicht durch Antigene aktiviert werden und funktionell inaktiv sind.
„HLA-Haplotyp" bedeutet die Kombination von HLA-Klasse-Genloci, die gewöhnlich als eigene Gruppe vererbt werden.
„Kopplungsungleichgewicht" bedeutet die Beziehung, die unter verschiedenen Genen gefunden wird, wenn Allele von unterschiedlichen HLA-Loci in einem einzigen Chromosom vorkommen oder wenn ein Haplotyp mit höherer Frequenz als zufällig erwartet auftritt. Das Kopplungsungleichgewicht wird über die Differenz zwischen den erwarteten und beobachteten Werten (Δ) quantifiziert.

Peptide, die an bestimmte HLA-Moleküle binden, enthalten normalerweise bestimmte Aminosäurereste an bestimmten Stellen. „HLA-bindendes Aminosäuremotiv" bedeutet die Kombination der Stellen und Arten von Aminosäureresten (HLA- Ankerreste), die für die Bindung an HLA-Moleküle auf HLA-bindenden Peptiden wichtig sind. Jedes HLA-Allelprodukt enthält sein eigenes Motiv. Ein HLA-bindendes Aminosäuremotiv wird hierin auch einfach als ein HLA-Bindungsmotiv bezeichnet.
T-Zell-Epitope in einem Allergenmolekül können kartiert werden, indem zum Beispiel periphere Blut-Lymphocyten, T-Zell-Linien oder T-Zell-Clone, die von einem Patienten stammen, der sensitiv gegenüber einem bestimmten Allergen ist, zusammen mit antigenpräsentierenden Zellen und einem überlappenden Peptid, das aus etwa 15 bis 30 Aminosäureresten aufgebaut ist (wobei der überlappende Anteil etwa 5 bis 10 Reste ausmacht) und das die ganze Primärstruktur des Allergens abdeckt, kultiviert werden, die T-Zell-Antwort auf diese Peptide durch Messen der aufgenommenen Menge von [³H]-Thymidin ermittelt (Antwort über Zellproliferation) und das Peptid, auf das die T-Zellen antworteten, bestimmt wird. Die genauen Epitopstellen können identifiziert werden durch die Synthese von Deletionspeptidvarianten mittels amino- oder carboxy-terminaler Deletion von Aminosäureresten in den Antigenpeptiden und Beobachten der Änderung der T-Zell-Antwort auf diese Peptidvarianten. In einer anderen Ausführungsform können, wenn mehr als zwei Peptide mit überlappenden Regionen eine T-Zell-Antwort hervorrufen, die genauen Epitopstellen identifiziert werden, indem neue T-Zell-Epitoppeptide, die einen Teil oder die gesamten überlappenden Regionen enthalten, synthetisiert werden und die Änderung der T-Zell-Antwort beobachtet wird. Das Antigenpeptid enthält vorzugsweise mindestens sieben Aminosäurereste.
Eine T-Zell-Antwort auf Antigenpeptide kann durch die Berechung des Stimulationsindexes (SI), der die Stärke der T-Zell-Antwort auf Antigenpeptide angibt, nachgewiesen werden. SI kann berechnet werden, indem der Wert (ZpM) („cpm"; Zählimpulse pro Minute) der [³H]-Thymidinaufnahme als Antwort auf das Peptid durch den Wert (ZpM), der unter Verwendung des Mediums ohne Peptid erhalten wird, dividiert wird. Der SI eines Antigenpeptids, das für eine erfindungsgemäße peptidbasierte Immuntherapie nützlich ist, beträgt mindestens 2,0, vorzugsweise mindestens 2,5, stärker bevorzugt mindestens 3,5 und am meisten bevorzugt mindestens 5,0.
Ein Antigenpeptid ruft in vitro die Proliferation von peripheren Blut-Lymphocyten, T-Zell-Linien oder T-Zell-Clonen, die von individuellen Allergiepatienten stammen und das Peptid restringierende HLA Klasse II-Moleküle aufweisen, hervor. Ein hierin beschriebenes Antigenpeptid reagiert nicht mit einem IgE-Antikörper eines Patienten, der sensitiv gegenüber dem Allergen ist, von dem das Peptid abgeleitet wird. Durch die Verabreichung des Antigenpeptids kann das hierin beschriebene Antigenpeptid eine antigenspezifische T-Zell-Anergie und danach eine Immuntoleranz auslösen und zwar immer, wenn eine Herausforderung mit einem rekombinanten oder natürlichen Allergen, das sich von dem Antigenpeptid ableitet, erfolgt. Des Weiteren kann, sobald ein hierin beschriebenes Antigenpeptid an eine Person verabreicht wurde, die mit einem Allergen sensibilisiert wurde, Immuntoleranz ausgelöst werden, und zwar jederzeit danach durch die Herausforderung mit dem Allergen. Diese Gegebenheiten weisen darauf hin, dass das erfindungsgemäße Antigenpeptid in vitro eine antigenspezifische Immuntoleranz auslöst und für eine peptidbasierte Immuntherapie von Allergiepatienten nützlich ist.
HLA Klasse II-Moleküle von einem Allergiepatienten, die an die Antigenpeptide binden, können wie folgt typisiert werden. Identifizierte Antigenpeptide, von dem Patienten stammende EB-Linien (Epstein-Barr-Virus transformierte B-Zell-Stämme), behandelt mit Mitomycin C, und T-Zellen werden mit einem anti-HLA-DR-, anti-HLA-DQ- oder anti-HLA-DP-Antikörper kultiviert, um die Hemmung der T-Zell-Proliferationsantwort zu testen; dabei wird ermittelt, welches der DR-, DQ- oder DP-Moleküle das Antigenpeptid restringiert. Wenn ermittelt wurde, dass die Restriktionsmoleküle entweder DQ oder DP sind, kann der Restriktionsmolekültyp (DR oder DP) identifiziert werden, indem EB-Linien, die einen bekannten HLA-Haplotyp aufweisen, als antigenpräsentierende Zellen verwendet werden. (Hori, T. et al.: Tissue Antigen 47:485-491, 1996). Die HLA Klasse II-DNA-Typisierung wird mittels Extraktion von DNA aus B-Zell-Linien durchgeführt, wobei die DNA einem PCR-SSO-Verfahren unterzogen wird, das in der 11 ten International Major Histokompatibility Conference eingeführt wurde (Tsuji, K., Aizawa, M. & Sashazwuki, T. Hrsg. (1982) HLA-1991 Bd. 1, S.: 395-518). Wegen des Kopplungsungleichgewichts zwischen DRB1* und den DR-Supertypen (DRB3*, DRB4* und DRB5*) kann das Restriktionsmolekül DR nicht unter Verwendung von EB-Linien als antigenpräsentierende Zellen identifiziert werden. Daher werden Restriktionsmoleküle durch die Transformation einer Maus-L-Zelle mit DRB1* oder nur einem Typ der DR-Supertypen identifiziert, wobei die Transformante, die das eingeführte Gen exprimiert, als antigenpräsentierende Zelle verwendet wird.
Beispiele von Antigenpeptiden und deren restringierende HLA Klasse II-Moleküle sind wie folgt.
Gegenwärtig sind die Hauptallergene Cry j 1 und Cry j 2 des japanischen Zedernpollenallergens isoliert und aufgereinigt worden. cDNAs von beiden Allergenen sind isoliert und ihre ermittelten Primärstrukturen beschrieben worden (internationale Patentanmeldung, veröffentlicht in Japan Nrs.: Hei 8-502163 und Hei 8-505284 ). T-Zell-Epitopstellen im Cry j 1-Molekül wurden basierend auf der Primärstruktur des Moleküls identifiziert. Eine therapeutische Zusammensetzung gegen Zedernpollenallergie, die aus einem Peptid, welches die Epitopstelle als Wirkstoff enthält, besteht, ist beschrieben worden (internationale Patentanmeldung, veröffentlicht in Japan Nr.: Hei 8-502163 ). Es wurde berichtet, dass mehr als 90% der Patienten, die an einer japanischen Zedernpollenallergie leiden, IgE-Antikörper besitzen, die spezifisch sind für Cry j 1 und Cry j 2; die verbleibenden 10% der Patienten haben IgE-Antikörper, die entweder für Cry j 1 oder Cry j 2 spezifisch sind (Hashimoto, M. et al.: Clin. Exp. Allergy 44:840-841, 1995).
Basierend auf dem vorstehenden Bericht gingen die hier genannten Erfinder davon aus, dass eine peptidbasierte Immuntherapie mit der Verabreichung von entweder Cry j 1-T-Zell-Epitopen oder Cry j 2-T-Zell-Epitopen nicht ausreichend sein würde. Für eine wirksame peptidbasierte Immuntherapie einer japanischen Zedernpollenallergie stellten die hier genannten Erfinder Multi-Epitoppeptide, die eine Mindestlänge aufweisen, bereit. Diese Multi-Epitoppeptide umfassen Antigenpeptide, die durch unterschiedliche HLA Klasse II-Moleküle (DR, DQ oder DP) präsentiert werden, und Antigenpeptide, die sich sowohl von Cry j 1 als auch Cry j 2 ableiten und die von HLA-DPB1*0501 präsentiert werden (japanische Patentanmeldung Nr.: Hei 8-80702 ). HLA-DPB1*0501 kommt mit großer Häufigkeit in Patienten, die an japanischer Zedernpollenallergie leiden, vor.
Von diesem Multi-Epitoppeptid kann erwartet werden, dass es die Wirksamkeit in Allergiepatienten erhöht, aber unwirksam ist bei Patienten, die keine HLA-Moleküle besitzen, die ein aus den Epitoppeptiden bestehendes Antigenpeptid beschränken. Für eine wirksame peptidbasierte Immuntherapie sollte ein Antigenpeptid, das mit einem individuellen HLA-Typ kompatibel ist, an das Individuum verabreicht werden. Beispiele für Kombinationen von Antigenpeptiden und HLA Klasse II-Restriktionsmolekültypen in Patienten, die an japanischer Zedernpollenallergie leiden, werden nachstehend aufgeführt. Zu besonderen Beispielen von HLA Klasse II-Molekülen und ihren Antigenpeptid-Bindungspartnern gehören:

1) DRB5*0101 eines Patienten, der an japanischer Zedernpollenallergie leidet, bindet an die Antigenpeptide p106-120 (SEQ ID NO: 3) und p109-117 (SEQ ID NO: 4), abgeleitet von Cry j 1, und die Antigenpeptide p66-80 (SEQ ID NO: 14) und p236-250 (SEQ ID NO: 19), abgeleitet von Cry j 2,
2) DRB4*0101 bindet an die Antigenpeptide p191-205 (SEQ ID NO: 7), abgeleitet von Cry j 1, und die Antigenpeptide p16-30 (SEQ ID NO: 12) und p186-200 (SEQ ID NO: 18), abgeleitet von Cry j 2,
3) DQA1*0102-DQB1*0602 bindet an die Antigenpeptide p16-30 (SEQ ID NO: 1), p146-160 (SEQ ID NO: 5), p191-205 (SEQ ID NO: 7), p251-265 (SEQ ID NO: 9) und p326-340 (SEQ ID NO: 10), abgeleitet von Cry j 1, und die Antigenpeptide p326-340 (SEQ ID NO: 21) und p341-355 (SEQ ID NO: 23), abgeleitet von Cry j 2,
4) DPA1*0101-DPB1*0501 bindet an die Antigenpeptide p61-75 (SEQ ID NO: 2) und p211-225 (SEQ ID NO: 8), abgeleitet von Cry j 1, und das Antigenpeptid p76-90 (SEQ ID NO: 15), abgeleitet von Cry j 2,
5) DPA1*0202-DPB1*0501 bindet an das Antigenpeptid p336-350 (SEQ ID NO: 22), abgeleitet von Cry j 2,
6) DPA1*0101-DPB*201 bindet an p181-195 (SEQ ID NO: 17), abgeleitet von Cry j 2,
7) DRB1*0901 bindet an die Antigenpeptide p151-165 (SEQ ID NO: 6) und p191-205 (SEQ ID NO: 7), abgeleitet von Cry j 1, und die Antigenpeptide p16-30 (SEQ ID NO: 12), p151-165 (SEQ ID NO: 16) und p321-335 (SEQ ID NO: 20), abgeleitet von Cry j 2 und
8) DRB1*1501 bindet an die Antigenpeptide p36-50 (SEQ ID NO: 13) und p236-250 (SEQ ID NO: 19), abgeleitet von Cry j 2.

Eine Kernsequenz des Antigenpeptids p106-120 (SEQ ID NO: 3), abgeleitet von Cry j 1, ist p109-117 (SEQ ID NO: 4).
Ikagawa et al. berichteten, dass das Cry j 1-Antigenpeptid p335-346 (SEQ ID NO: 11) von DRB3*0301 präsentiert wurde (Ikagawa, S. et al.: J. Allergy Clin. Immunol. 97:53-64, 1996). Hori et al. berichteten, dass das Cry j 1-Antigenpeptid p214-222 (SEQ ID NO: 24) von DPA1*0202-DPB1*0501 präsentiert wurde (Hori et al.: Tissue Antigens, 47:481-491, 1996).
Für gewöhnlich wurde angenommen, dass es in Abhängigkeit vom Antigentyp eine Vorliebe für Restriktionsmoleküle auf HLA Klasse II-Genlocusebene gibt. Die vorstehenden Studien zeigten, dass im Grunde alle DR-, DQ- und DP-Moleküle als Restriktionsmoleküle genutzt werden und ohne Bevorzugung Antigenpeptide, die sich von Cry j 1 oder Cry j 2 ableiten, präsentieren.
Zu den Haupthistokompatibilitätsmolekülen, welche die spezifischen Antigene in Cry j 1 binden, gehören: DPA1*0101-DPB1*0501, welches an p61-75 (SEQ ID NO: 2) bindet, DQA1*0102-DQB1*0602, welches an p146-160 (SEQ ID NO: 5) bindet, und DPA1*0101-DPB1*0501, welches an p211-225 (SEQ ID NO: 8) bindet. Für Cry j 2 gehören zu diesen: DRB1*0901, welches an p16-30 (SEQ ID NO: 12) bindet, DRB1*1501, welches an p36-50 (SEQ ID NO: 13) bindet, DPA1*0101-DPB1*0501, welches an p76-90 (SEQ ID NO: 15) bindet, DRB4*0101, welches an p186-200 (SEQ ID NO: 18) bindet, und DPA1*0202-DPB1*0501, welches an p336-350 (SEQ ID NO: 22) bindet. Die anderen Peptide können nicht nur an die identifizierten Restriktionsmoleküle binden, sondern auch an andere Moleküle, und werden daher als multi-bindende Peptide bezeichnet.
Im Allgemeinen enthält ein Antigenpeptid, das an ein bestimmtes HLA-Molekül bindet, ein allgemeines HLA-bindendes Aminosäuremotiv. HLA-bindende Aminosäuremotive sind nötig für Antigenpeptide, um an HLA-Moleküle zu binden. HLA-Moleküle haben keine hohe Selektivität, um an Antigenpeptide zu binden, obgleich andere Peptidhormon-Rezeptoren gegenüber ihren Liganden eine hohe Selektivität aufweisen. Daher können HLA-Moleküle verschiedene potentielle Antigenpeptide binden. Bei HLA Klasse II-Molekülen besteht ein Bindungsmotiv eines Antigenpeptids aus 3 bis 5 Aminosäureresten, getrennt lokalisiert mit 1 bis 2 dazwischengelagerten Aminosäuren (Matsushita, S. et al.: J. Exp. Med. 180:873-883, 1994; Rammensee, H.-G. et al.: Immunogenet. 41:178-228, 1995). Unter Verwendung dieser bekannten HLA Klasse II-Bindungsmotive können Antigenpeptide, die an die beispielhaft erläuterten HLA Klasse II-Moleküle binden können, auf Grund der Primärstruktur der japanischen Zedernpollenallergenmoleküle weiter ausgewählt werden. Daher sind erfindungsgemäße Antigenpeptide, die an einen bestimmten HLA Klasse II-Typ binden, den ein an japanischer Zedernpollenallergie leidender Patienten besitzt, nicht auf die beispielhaft erläuterten Antigenpeptide in dieser Erfindung beschränkt, sondern schließen Antigenpeptide ein, von denen erwartet wird, dass sie bestimmte HLA Klasse II-Typen binden.
Die vorstehend beschriebenen Antigenpeptide, die an bestimmte HLA Klasse II-Typen binden, können als peptidbasierter immuntherapeutischer Wirkstoff für einen Patienten, der diese HLA Klasse II-Typen besitzt, verwendet werden. Wenn das erfindungsgemäße Antigenpeptid als peptidbasierter immuntherapeutischer Wirkstoff zur Behandlung eines Allergiepatienten verwendet wird, kann es mit pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmitteln und Trägern kombiniert werden. Die so erhaltene Zusammensetzung kann über einfache Verfahren wie beispielsweise Injektion (subkutan oder intradermal), Instillation, Nasenspülung, orale Verabreichung, Inhalation, perkutane Applikation oder transmukosal verabreicht werden. Die Dosierung kann durch herkömmliche Verfahren vom Fachmann bestimmt werden.
Um einen für jeden Patienten geeigneten peptidbasierten immuntherapeutischen Wirkstoff auszuwählen, sollte der HLA Klasse II-Typ des Patienten bestimmt werden. Unter Verwendung eines Antigenpeptids als Reagens, das spezifisch mit dem HLA Klasse II-Molekül reagiert, kann der HLA Klasse II-Typ eines Patienten bestimmt werden.
Genauer können die HLA Klasse II-Moleküle eines Allergiepatienten und einer gesunden Person folgendermaßen typisiert werden: Wegen des ausgeprägten Polymorphismus variieren, abhängig von den HLA Klasse II-Typen die Aminosäuremotive von Antigenpeptiden, die an jedes Molekül binden. HLA Klasse II-Moleküle eines Patienten und einer gesunden Person können daher typisiert werden, indem Antigenpeptide mit verschiedenen Bindungsmotiven markiert werden und die spezifische Bindung an HLA Klasse II-Moleküle nachgewiesen wird. Antigenpeptide können durch Binden eines bekannten Markers wie beispielsweise eines Radioisotops, Enzyms, Fluoreszenzmarkers oder Lumineszenzmarkers an einen Aminosäurerest (zum Beispiel einen Tyrosinrest) mit Ausnahme der HLA-Ankeraminosäurereste des Antigenpeptids markiert werden. In einer anderen Ausführungsform werden biotinylierte Antigenpeptide mit Streptavidin (oder Avidin), gebunden an den vorstehenden Marker, nachgewiesen. Ein Allergiepatient kann diagnostiziert werden, indem dessen periphere Blut-Lymphocyten in Anwesenheit verschiedener Antigenpeptide, abgeleitet von dem Allergen, kultiviert werden und die T-Zell-Antwort, durch zum Beispiel Zugabe von [³H]-Thymidin zum Kulturmedium und Messen der aufgenommenen [³H]-Thymidinmenge beobachtet wird.
Von Testpersonen, bei denen eine T-Zell-Antwort nachgewiesen wurden (ein Antwort-positiver Allergiepatient) kann der Typ des HLA Klasse II-Restriktionsmoleküls für das Antigenpeptid, das die T-Zell-Antwort hervorruft, identifiziert werden, genauso wie der HLA Klasse II-Typ der Person.
Der Zusammenhang zwischen dem HLA Klasse II-Typ des Patienten und den durch dieses Verfahren identifizierten Antigenpeptiden kann verwendet werden, um die Rolle von jedem HLA Klasse II-Typ zu Beginn der Allergie zu untersuchen oder um Antigenpeptide auszuwählen, die in einem peptidbasierten immuntherapeutischen Wirkstoff für den Allergiepatienten Verwendung finden.
Ein peptidbasierter immuntherapeutischer Wirkstoff kann für einen bestimmten Allergiepatienten, dessen HLA Klasse II-Molekültyp identifiziert worden ist, hergestellt werden, indem ein Antigenpeptid, das mit dem HLA-Typ des Patienten kompatibel ist, ausgewählt wird, die Antwort auf das Peptid, die vom Patienten stammenden peripheren Blut-Lymphocyten zur Vermehrung zu bringen, gemessen und die Stärke der Antwort auf das Peptid verglichen wird. Zum Beispiel weist der Patienten PB, der an japanischer Zedernpollenallergie leidet und in Beispiel 6 beschrieben wird, folgende Haplotypen von HLA Klasse I und Klasse II auf: A2/24-B39/55-Cw7/w3-DRB1*1501/0901-DRB4*0101-DRB5*0101, und DQA1*0102/0301-DQB1*0602/0303-DPA1*0101/0101-DPB1*0501/0201. Wenn Antigenpeptide zur Verwendung für die peptidbasierte Immuntherapie für diesen Patienten ausgewählt werden, sollten die Antigenpeptide p211-225 (SEQ ID NO: 8), präsentiert von DPA1*0101-DPB1*0501, p106-120 (SEQ ID NO: 3), präsentiert von DBR5*0101, p191-205 (SEQ ID NO: 7) oder p251-265 (SEQ ID NO: 9), präsentiert von DQA1*0102-DQB1*0602, aus Cry j 1 ausgewählt werden; aus Cry j 2 sollten p76-90 (SEQ ID NO: 15), präsentiert von DPA1*0101-DPB1*0501, p186-200 (SEQ ID NO: 18), präsentiert von DRB4*0101, und p66-80 (SEQ ID NO: 14), präsentiert von DRB5*0101 ausgewählt werden. Bevor eine peptidbasierte Immuntherapie unter Verwendung dieser Antigenpeptide wirksam wird, sollte die Antwort auf diese Antigenpeptide, nämlich periphere Blut-Lymphocyten, die von dem Patienten stammen, zur Proliferation zu bringen, gemessen werden, um die Antigenpeptide, die eine relativ hohe Proliferationsaktivität aufweisen, auszuwählen und zu bestimmen, welches Antigen für die peptidbasierte Immuntherapie verwendet werden muss.
Um die Löslichkeit, die therapeutischen oder prophylaktischen Wirkungen und die Wirkungsstabilität zu verbessern, kann das erfindungsgemäß verwendete Antigenpeptid, ohne dessen Funktion zu stören, durch Austausch, Deletion oder Addition von Aminosäureresten mit Ausnahme der HLA-Anker modifiziert werden. Eine bestimmte Aminosäure kann geeignet durch Ala, Ser, Glu oder Methyl-Aminosäuren ausgetauscht werden, die Austauschaminosäuren sind aber nicht darauf beschränkt. Ein Cys-Rest bildet über eine Disulfid-Brücke ein Dimer und funktioniert als Multi-bindendes Agens. Daher kann die Immunisierung mit einem Peptid, das einen Cys-Rest enthält, das Erkennen von Stellen, die ursprünglich keine Rolle in der Antigenität spielen, bewirken und dadurch neue Epitope erzeugen. In diesem Fall kann ein Cys-Rest durch ein Ala, Ser, Thr, Leu oder Glu ersetzt werden. Ebenso kann er durch eine D-Aminosäure oder eine nicht-natürliche Aminosäure ersetzt werden. Ein Vektor wurde entwickelt, der in der Lage ist, ein Peptid mit einem Histidin-Polymer (zum Beispiel ein Histidin-Hexamer), welches an den N- oder C-Terminus gebunden ist, als ein Polypeptid zu exprimieren. Das Expressionsprodukt kann mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Nickelchelatbildenden Säule sogar in Anwesenheit eines Denaturierungsmittels aufgereinigt werden.
Das erfindungsgemäß verwendete Antigenpeptid kann von einem Allergenmolekül oder zwei oder mehreren verschiedenen Molekülen abgeleitet werden. Alle Proteinallergene können verwendet werden, einschließlich Pollen von Grünpflanzen wie Beifuß-Ambrosie, Knäuelgras („dactylis") und Englisches Raigras („perennial ryegrass"), Baumpollen wie japanische Zeder, Scheinzypressen und Bergzeder, Milben, Tiere, Pilze, Insekten und Nahrungsmittel.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 zeigt Cry j 1-überlappende Peptidsequenzen und die T-Zell-Epitopstellen des Patienten. In der Figur steht ☐ für 2≤SI < 5 und ∎ steht für 5≤SI. T-Zell-Clone wurden von PB und PJ präpariert.
2 zeigt Cry j 2-überlappende Peptide und die T-Zell-Epitopstellen des Patienten. In der Figur steht ☐ für 2≤SI<5 und ∎ steht für 5≤SI. T-Zell-Clone wurden von PB, PC und PR präpariert.
3 zeigt die Epitopstellen, die von Cry j 1-erkennenden T-Zell-Clonen erkannt werden, die Moleküle, welche die Clone beschränken, die Produktion von Lymphokinen durch die Clone und die Th-Typen der Clone. In der Figur steht Th2 für IL-4/IFNγ>10, Th1 für IFNγ/IL-4>10 und Th0 für einen dazwischenliegenden Spiegel.
4 zeigt die Epitopstellen, die von Cry j 1-erkennenden T-Zell-Clonen erkannt werden, die Moleküle, welche die Clone beschränken, die Produktion von Lymphokinen durch die Clone und die Th-Typen der Clone. In der Figur steht Th2 für IL-4/IFNγ>10, Th1 für IFNγ/IL-4>10, Th0 für einen dazwischenliegenden Spiegel und Thp für keine Lymphokinproduktion.
5 zeigt die Immunantwort von CB6F1-Mäusen auf Cry j 2, wenn das Antigenpeptide p66-80 von Cry j 2 an die Mäuse verabreicht wurde.
6 zeigt die Immunantwort von CB6F1-Mäusen auf Cry j 2, wenn das Antigenpeptide p236-250 von Cry j 2 an die Mäuse verabreicht wurde.
DIE BESTE ART UND WEISE DIE ERFINDUNG UMZUSETZEN
Die vorliegende Erfindung wird mit Bezugnahme auf die nachstehenden Beispiele veranschaulicht, ist aber nicht darauf ausgelegt, durch diese beschränkt zu werden.
Beispiel 1: Aufreinigung des japanischen Zedernpollenallergens
Cry j 1 wurde mit dem Verfahren von Yasueda et al. aufgereinigt (Yasueda, H. et al., J. Allergy Clin. Immunol 71:77-86, 1983). Cry j 2 wurde aufgereinigt durch Insertion des Cry j 2-Gens (ungeprüfte, veröffentlichte japanische Patentanmeldung ( JP-A) Nr. Hei 8-47392 ) in den Expressionsvektor pQE9 (Qiagen GmbH, Deutschland), Transformation von E.coli mit dem Vektor, um das Gen zu exprimieren, und Aufreinigung des Genexpressionsprodukt durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Ni² ⁺-NTA-Agarose (Qiagen, Inc. USA) (Komiyama, N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 201:1021-1028, 1994).
Beispiel 2: Synthese von überlappenden Peptiden
Basierend auf den Primärstrukturen von Cry j 1 ( WO94/01 560 ) und Cry j 2 ( JP-A Nr. Hei 8-47392 ), wurden mit einem Peptid-Synthetisegerät (Shimadzu, Model PSSM-8) 69 Arten von überlappenden Peptiden für Cry j 1 (1) und 74 Arten für Cry j 2 (2) synthetisiert. Diese überlappenden Peptide decken alle Primärstrukturen von Cry j 1 oder Cry j 2 ab und bestehen aus 15 Aminosäureresten, in denen der überlappende Anteil 10 Reste aufweist. Die Peptide wurden in PBS, welches 8 M bis 2 mM Harnstoff enthielt, gelöst. Wenn die Peptide für den Test der T-Zell-Proliferationsantwort dem Kultursystem zugegeben wurden, wurden die Peptide 500-fach verdünnt, um die Wirkung des Harnstoffs zu beseitigen.
Beispiel 3: Etablierung von antigenpräsentierenden Zellen
Periphere Blut-Lymphocyten wurden aus dem peripheren Blut eines Patienten, der an japanischer Zedernpollenallergie leidet, mittels Ficoll-Paque (Pharmacia) spezifischem Dichte-Zentrifugationsverfahren isoliert. B95-8 (abstammend von einem Krallenaffen, ATCC CRL1612)-Zellkulturüberstand mit Epstein-Barr (EB)-Virus wurde zu 1 × 10⁶ peripheren Blut-Lymphocyten gegeben, um B-Zellen in den peripheren Blut-Lymphocyten mit dem EB-Virus zu infizieren. Infizierte B-Zellen wurden in RPMI-1640-Medium mit 200 ng/ml Cyclosporin A und 20% fötalem Kälberserum (FKS) für die Dauer von etwa 20 Tagen kultiviert, um transformierte B-Zell-Linien zu etablieren.
Beispiel 4: Etablierung von T-Zell-Linien und T-Zell-Clonen
4 × 10⁶ periphere Blut-Lymphocyten wurden in 2 ml RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 20% menschlichem Serum, suspendiert und für die Dauer von 8 Tagen in Anwesenheit von 50 µg/ml Cry j 1 oder 2 zu 10 µg/ml Cry j 2 kultiviert, um T-Zellen zu aktivieren, die Cry j 1 oder Cry j 2 erkennen.
Als aktivierte T-Zellen erscheinen, wurden T-Zell-Linien, die spezifisch Cry j 1 oder Cry j 2 erkennen, etabliert, indem das Medium durch RPMI-1640 mit 200 E/ml IL-2 (Boehringer-Mannheim) und 15% menschlichem Serum ersetzt wurde und die Zellen für weitere 14 Tage kultiviert wurden.
T-Zell-Clone, die spezifisch Cry j 1 oder Cry j 2 erkennen, wurden wie folgt etabliert:
Als die aktivierten T-Zellen erscheinen, wurden die T-Zellen in 10 cm-Kulturschalen verteilt und einzeln unter Verwendung einer Mikropipette selektiert. Gesondert wurden die gleichen, nicht-aktivierten, mit dem EB-Virus infizierten Zellen mit Mitomycin C (Kyowa Hakko Kogyo) behandelt und jede Vertiefung einer 96-Mulden-Mikrokulturplatte mit 1 × 10⁵ Zellen/Vertiefung inokuliert. Die vorstehend genannten, aktivierten T-Zellen wurden mit eine Zelle pro Vertiefung auf die 96-Mulde-Platte überführt. Weitere 50 µg/ml Cry j 1 oder 2 zu 10 µg/ml Cry j 2 wurden in jede Vertiefung zugegeben und für die Dauer von 7 Tagen zur Herausforderung kultiviert. Die Herausforderung wurde in einem Intervall von 7 Tagen zwei- oder dreimal wiederholt, um die T-Zell-Clone zu etablieren.
Beispiel 5: Identifizierung von Cry j 1- und Cry j 2-T-Zell-Epitopen
Periphere Blut-Lymphocyten von 18 Patienten, die an japanischer Zedernpollenallergie leiden, wurden dem Cry j 1- oder Cry j 2-Allergen herausgefordert, um T-Zell-Linien zu etablieren, die Cry j 1 oder Cry j 2 spezifisch für jeden Patienten erkennen. 5 × 10⁴ Zellen einer eigenen B-Zell-Linie, die mit Mitomycin C behandelt wurden, 2 µM überlappende Peptide und 2 × 10⁴ Zellen der T-Zell-Linie wurden in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 0,2 ml 15%igem Serum, in einer 96-Mulden-Mikroplatte für die Dauer von zwei Tagen kultiviert. 0,5 µCi [³H]-Thymidin wurden zugegeben und das Kulturmedium wurde für die Dauer von weiteren 18 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden in einem Glasfilter mit einer Zellerntevorrichtung gesammelt und die Aufnahme von [³H]-Thymidin wurde mit einem Flüssigkeitsszintillationszähler gemessen. T-Zellen, die in der Lage waren, die Antigeninformation von Cry j 1 oder Cry j 2 genauso wie HLA Klasse II-Moleküle zu erkennen, proliferierten und bauten [³H]-Thymidin ein. Von Zellen, die einen Stimulationsindex von 2 oder höher aufweisen, wurde angenommen, dass sie die zugegebenen Antigenpeptide erkannten.
Die Identifizierung von T-Zell-Epitopstellen, die unter Verwendung der Cry j 1-erkennenden T-Zell-Linien gefunden wurden, zeigte, dass die Anzahl von T-Zell-Epitopstellen, die von jedem Patienten erkannt wurden, durchschnittlich 9,8±3,0 betrug, und lag im Bereich von 4≤15 Epitopen. Unter Verwendung der Cry j 2-erkennenden T-Zell-Linien betrug die Anzahl von T-Zell-Epitopstellen, die von jedem Patienten erkannt wurde, durchschnittlich 8,7±3,3 und lag im Bereich von 2≤13 Epitopen. Da Cry j 1 aus 353 Aminosäuren aufgebaut ist (internationale Patentanmeldung veröffentlicht in Japan Nr. Hei 8-502163 ) und Cry j 2 aus 379 Aminosäuren besteht ( JP-A Nr. Hei 8-47392 ) bedeuten die vorstehenden Ergebnisse, dass etwa 2,3 bis 2,8 T-Zell-Epitopstellen pro 100 Aminosäurereste vorliegen. Jeder Patient hat verschiedene HLA Klasse II-Typen und erkennt deshalb unterschiedliche T-Zell-Epitope, abhängig von den HLA Klasse II-Typen. Durch Kennzeichnen der T-Zell-Epitopstellen auf dem Cry j 1- oder Cry j 2-Molekül wurde eine Epitopkarte der T-Zell-Epitopstellen, die von jedem Patienten auf dem Cry j 1- oder Cry j 2-Molekül erkannt werden, erstellt. Die Ergebnisse sind in den 1 und 2 aufgeführt.
Beispiel 6: Identifizierung von T-Zell-Epitopen, die T-Zell-Clone erkennen
Von 18 Patienten, die an einer japanischen Zedernpollenallergie leiden, wurden 2 Patienten, die die Antigenpeptide p211-225 und p106-120 von Cry j 1 erkennen [Patient B (nachstehend als PB bezeichnet) und Patient J (nachstehend als PJ bezeichnet)] und 3 Patienten, die die Antigenpeptide p66-80, p186-200, p236-250 und p341-355 von Cry j 2 erkennen [PB, Patient C (nachstehend als PC bezeichnet) und Patient R (nachstehend als PR bezeichnet)], ausgewählt. T-Zell-Clone, die Cry j 1 oder Cry j 2 erkennen, wurden durch die Stimulation von peripheren Blut-Leukocyten dieser japanischen Zedernpollenallergiepatienten durch Cry j 1 oder Cry j 2 etabliert. Die HLA Klasse I- und II-Typen der vier Patienten sind wie folgt: PB:
A2/24 – B39/55 – Cw7/w3 – DRB1*1501/0901 – DRB4*0101 – DRB5*0101, DQA1*0102/0301 – DQB1*0602/0303 – DPA1*0101/0101 – DPB1*0501/0201; PJ:
A24/- – B61/51 – Cw3/- – DRB1*1501/0802 – DRB5*0101, DQA1*0102/0401 – DQB1*0602/0402 – DPA1*-/- – DPB1*0501/0402; PC: A-2/2 – B54/51 – Cw1/- – DRB1*0405/1501 – DRB4*0101 – DRB5*0101 – DQA1*0301/0102 – DQB1*0401/0602 – DPA1*0202/0202 – DPB1*0201/0501; PR: A-11/- – B60/35 – Cw7/w3 – DRB1*0901/1501 – DRB4*0101 – DRB5*0101, DQA1*0301/0102 – DQB1*0303/0602 – DPA1*01/0202 – DPB1*0201/0201.
35 und 14 Typen der T-Zell-Clone, die spezifisch Cry j 1 erkennen, wurden von den peripheren Blut-Lymphocyten, die von PB bzw. von PJ stammten, etabliert. Ähnlich wurden 31, 10 und 17 Typen von T-Zell-Clonen, die spezifisch Cry j 2 erkennen, von den peripheren Blut-Lymphocyten, die von PB, PC bzw. von PR stammten, etabliert. Alle diese T-Zell-Clone waren CD3⁺, CD4⁺, CD8^–, TCRαβ⁺, TCRγδ^– und daher handelt es sich bei den Restriktionsmolekülen um HLA Klasse II-Moleküle. 5 × 10⁴ eigene B- Zell-Linien, behandelt mit Mitomycin C, 2 µM der überlappenden Peptide und 2 × 10⁴ T-Zell-Clone wurden in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 0,2 ml 15%igem Serum, in einer 96-Mulden-Mirkrotiterplatte für die Dauer von 2 Tagen kultiviert. Nach der Zugabe von 0,5 µCi [³H]-Thymidin wurden die Zellen für die Dauer von weiteren 18 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden mit Hilfe einer Zellerntervorrichtung in einem Glasfilter gesammelt und die Aufnahme von [³H]-Thymidin wurde unter Verwendung eines Flüssigkeitsszintillationszähler gemessen. T-Zell-Epitope, die von jedem T-Zell-Clon erkannt wurden, wurden durch die vorstehende Verfahrensweise identifiziert. 69 Prozent (34/49) der Cry j 1-erkennenden T-Zell-Clone proliferierten als Antwort auf die Stimulation mit dem Peptid, welches T-Zell-Epitope enthält, und die Antigenpeptide wurden identifiziert. Ähnlich wurden Antigenpeptide unter 69% (40/58) der Cry j 2-erkennnenden T-Zell-Clone identifiziert. Von Cry j 1-spezifisch erkennenden T-Zell-Clonen erkannte Peptide sind: p16-30, p61-75, p91-105, p106-120, p146-160, p151-165, p191-205, p211-225, p251-265, p326-340 und p331-346. Von Cry j 2-spezifisch erkennenden T-Zell-Clonen erkannte Peptide sind: p16-30, p21-35, p36-50, p66-80, p76-90, p81-95, p151-165, p181-195, p186-200, p236-250, p321-335, p326-340, p336-350, p341-355 und p346-360. Die Ergebnisse sind in 1 und 2 zusammengefasst (Histogramme in der Mitte).
Beispiel 7: Identifizierung von HLA Klasse II-Restriktionsmolekülen auf Locusebene
HLA Klasse II-Restriktionsmoleküle wurden auf Locusebene identifiziert, indem monoclonale Antikörper, die spezifisch mit HLA Klasse II-DR, HLA Klasse II-DQ oder HLA Klasse II-DP reagieren, zu dem Proliferationsantwort-System der in Beispiel 4 etablierten T-Zell-Clone gegeben wurden, um die T-Zell-Proliferationsantwort zu hemmen.
2 × 10⁴ eigene B-Zell-Linien, behandelt mit Mitomycin C, 2 µM überlappende Peptide, 3 µg/ml monoclonale anti-DR-, DQ- oder DP-Antikörper (Becton/Dickinson) und 2 × 10⁴ T-Zell-Clone wurden in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 0,2 ml 15%igem Serum, für die Dauer von zwei Tagen kultiviert. Nach Zugabe von 0,5 µCi [³H]-Thymidin wurde das Kultivieren für die Dauer von weiteren 18 Stunden durchgeführt. Die Zellen wurden in einem Glasfilter mit einer Zellerntevorrichtung gesammelt und die Aufnahme von [³H]-Thymidin wurde mit einem Flüssigkeitsszintillationszähler gemessen.
Beispiel 8: Identifizierung von Restriktionsmolekülen eines jeden HLA Klasse II-Molekültyps
Restriktionsmoleküle jeden HLA Klasse II-Typs von T-Zell-Clonen, deren Restriktionsmoleküle auf Locusebene identifiziert wurden, können unter Verwendung von Maus-L-Zellen als antigenpräsentierende Zellen, die mit dem DR-Gen transformiert sind, und B-Zell-Linien, die den gleichen DQ- oder DP-Haplotyp aufweisen, identifiziert werden.
5 × 10⁴ der vorstehenden Maus-L-Zellen oder B-Zell-Linien mit dem passenden Haplotyp, behandelt mit Mitomycin C, 2 µM überlappende Peptide, 3 µg/ml eines monoclonalen anti-DR-, DQ- oder DP-Antikörpers (Becton/Dickinson) und 2 × 10⁴ T-Zell-Clone wurden in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 0,2 ml 15%igem Serum, für die Dauer von zwei Tagen kultiviert. Nach Zugabe von 0,5 µCi [³H]-Thymidin wurde das Kultivieren für die Dauer von weiteren 18 Stunden fortgesetzt. Die Zellen wurden mit einer Zellerntevorrichtung in einem Glasfilter gesammelt und die Aufnahme von [³H]-Thymidin wurde mit einem Flüssigkeitsszintillationszähler gemessen. Restriktionszellen können identifiziert werden, wenn Proliferationsantworten der T-Zell-Clone beobachtet werden. Die Ergebnisse der Analyse sind in 3 und 4 dargestellt.
Beispiel 9: Identifizierung der Th-Typen der T-Zell-Clone
Th2-Zellen sind vermutlich an der Entstehung einer Allergie beteiligt. Bisher ist noch nicht gezeigt worden, ob die Differenzierung von T-Zellen in Th1- oder Th2-Zellen in Antwort auf eine Antigenstimulation von spezifischen Epitoppeptiden oder dem HLA Klasse II-Locus kontrolliert wird. Wenn für die Auswahl der Antigenpeptide Th2-Zellen zuerst nach der Stimulation durch die Peptide induziert werden, würde sich die japanische Zedernpollenallergie wegen der Verabreichung der Peptide verschlimmern. Um die vorstehende Hypothese zu überprüfen, wurden die Th-Typen der in Beispiel 4 hergestellten T-Zell-Clone bestimmt, indem die Clone durch die Epitoppeptide, die von den T-Zellen erkannte werden, stimuliert und die Produktion von IL-2, IL-4 und IFN-γ gemessen wurde.
Genauer, 1 × 10⁵ eigene B-Zell-Linien, behandelt mit Mitomycin C, 2 µM Epitoppeptide und 5 × 10⁵ T-Zell-Clone wurden in RPMI-1640-Medium mit 1 ml 10%igem menschlichem Serum für die Dauer von 24 Stunden kultiviert. Dann wurde der Überstand mittels Zentrifugation gewonnen. IL-2, IL-4 und IFN-γ im Überstand wurden unter Verwendung der im Handel erhältlichen ELISA-Kits [IL-2 (R&D), IL-4 (Medgenics) und IFN-γ (Otsuka Assay Laborstory)] bestimmt. Die 3 und 4 zeigen die Produktion von IL-2, IL-4 und IFN-γ und die Th-Typen von jedem Clon. Die Anzahl bei den Cry j 1-erkennenden T-Zell-Clonen beträgt 12 Th2, 1 Th1 und 16 Th0. Daher war die Anzahl von Th2 größer als die von Th1. Im Gegensatz dazu beträgt die Anzahl bei den Cry j 2-erkennenden T-Zell-Clonen 10 Th2, 8 Th1 und 8 Th0. Daher war die Anzahl von Th1 nahezu gleich mit der von Th2. Bei dem Vergleich der T-Zell-Epitope, die von jedem T-Zell-Clon erkannt werden, der Restriktionsmoleküle und der Th-Typen wurde gefunden, dass jeder T-Zell-Clon hinsichtlich des Th2-, Th1- oder Th0-Typs unterschiedlich war. Für mehrere T-Zell-Clone, die die gleichen Epitope und gleichen antigenpräsentierenden Moleküle erkennen, wurden sowohl Th2- als auch Th1-Zellen identifiziert. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Differenzierung von T-Zellen in Th2-, Th1- oder Th0-Zellen nach der Stimulation durch Cry j 1 oder Cry j 2 nicht durch die Kombination von spezifischen T-Zell-Epitopen oder spezifischen Restriktionsmolekülen bestimmt wird. In anderen Worten, jedes Peptide, das T-Zell-Epitopstellen enthält, kann T-Zellen stimulieren und kann als Peptid für die Verwendung als peptidbasierter immuntherapeutischer Wirkstoff gewählt werden.
Beispiel 10: Identifizierung von T-Zell-Epitopen in einer CB6F1-Maus
Acht Wochen alte männliche CB6F1-Mäuse wurden mit 10 µg rekombinantem Cry j 2 (rCry j 2) zusammen mit einem Adjuvans (Imject Alum, Pierce) dreimal alle zwei Wochen (ip) immunisiert. Eine Woche nach der letzten Immunisierung wurden Splenocyten aus drei Mäusen präpariert und vereinigt. In jeder Vertiefung einer 96-Mulden-Platte (Falcon) wurden 5 × 10⁶ Splenocyten zusammen mit 0,115 µM der 74 Typen überlappender Peptide, die aus 15 Aminosäureresten bestehen, in 0,2 ml RPMI-Medium (10% FKS, 2 mM L-Glutamin, 50 E/ml Penicillin und 50 µg/ml Streptomycin) kultiviert. Als Kontrolle wurden die Antworten auf PBS, 50 mg/ml Cry j 1 und 0,3 µg/ml rCry j 2 ermittelt. Drei Vertiefungen wurden mit jedem Reagens beimpft und die Zellen wurden bei 37°C in 5% CO₂ für die Dauer von drei Tagen kultiviert. Eine Puls-Markierung wurde mit 0,5 µCi/Vertiefung [³H]-Thymidin für die letzten 6 Stunden durchgeführt und die Zellen wurden mit Hilfe einer Zellerntervorrichtung (Inoteck, Bertold Japan) in einem Glasfilter gesammelt. Nach dem Trocknen der Zellen wurde die Aufnahme von [³H]-Thymidin in die Zellen mit einem Flüssigkeitsszintillationszähler (TRI-CARS 4530, Packard Japan) gemessen. CB6F1-Mäuse, die mit rCry j 2 immunisiert waren, zeigten eine starke Antwort auf das rCry j 2-Antigen, aber antworteten nicht auf das andere japanische Zedernpollenhauptantigen Cry j 1, was darauf hinweist, dass dieses System eine antigenspezifische Reaktion aufweist. Von den 74 getesteten überlappenden Peptiden zeigten CB6F1-Mäuse, die mit rCry j 2 immunisiert waren, beachtliche Antworten auf p66-80 (SEQ ID NO: 14) und p236-250 (SEQ ID NO: 19). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Peptide p66-p80 und p236-250 bei CB6F1-Mäusen als Haupt-T-Zell-Epitoppeptide in die Antigenpräsentation verwickelt sind. Im Menschen sind p66-80 (SEQ ID NO: 14) und p236-250 (SEQ ID NO: 19) ebenfalls Haupt-T-Zell-Epitoppeptide. Daher können CB6F1-Mäuse ein nützliches Tiermodel sein, um die Wirksamkeit von Peptidzusammensetzungen für die Verwendung in der peptidbasierten Immuntherapie gegen japanische Zedernpollenallergie zu bewerten.
Beispiel 11: In vivo-Immunreaktion gegenüber dem Antigenpeptid p66-80 (SEQ ID NO: 14)
Drei mg des p66-80-Peptids (SEQ ID NO: 14), gelöst in physiologischer Kochsalzlösung, wurde subkutan an acht Wochen alte männliche Mäuse zweimal in einem Abstand von 5 Tagen verabreicht. Auf ähnliche Weise wurde das gleiche Volumen (100 μl) einer physiologischer Kochsalzlösung an Mäuse einer Kontrollgruppe verabreicht. Sowohl die Gruppe, der das Peptid verabreicht wurde, als auch die Kontrollgruppe bestanden aus acht Mäusen. Für die Immunisierung wurde fünf Tage nach der zweiten Peptidverabreichung allen Mäusen 50 µg rCry j 2, gemischt mit einem Adjuvans (Imject Alum), subkutan verabreicht. Eine Woche nach der Immunisierung wurden aus jeder Maus die Splenocyten präpariert. In jeder Vertiefung einer 96-Mulden-Platte (Falcon) wurden 5 × 10⁶ Splenocyten zusammen mit 3 µg/ml rCry j 2 in 0,2 ml RPMI-Medium (10% FKS, 2 mM L-Glutamin, 50 E/ml Penicillin und 50 µg/ml Streptomycin) kultiviert. Als Kontrolle wurden die Zellen im gleichen Medium ohne rCry j 2 kultiviert. Die Aufnahme von [³H]-Thymidin wurde, wie in Beispiel 10 beschrieben, gemessen. Wenn p66-88 (SEQ ID NO: 14) vor der Antigenstimulation mit rCry j 2 subkutan an CB6F1-Mäuse verabreicht wurde, wurde die Immunantwort der T-Zellen signifikant gehemmt im Vergleich mit der Gruppe, die physiologische Kochsalzlösung erhalten hatte (p<0,01, 5). Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass im Mausmodell das System mit p66-88 (SEQ ID NO: 14) eine vorbeugende Wirkung in der peptidbasierten Immuntherapie zur Behandlung der japanischen Zedernpollenallergie zeigt.
Beispiel 12: In vivo-Immunantwort auf das Antigenpeptid p236-250 (Peptid Nr. 48, SEQ ID NO: 19)
Drei mg des p236-250-Peptids (SEQ ID NO: 19), gelöst in physiologischer Kochsalzlösung, wurde subkutan an sechs Wochen alte männliche Mäuse zweimal in einem Abstand von 5 Tagen verabreicht. Als Kontrolle wurde das gleiche Volumen (200 μl) einer physiologischer Kochsalzlösung an Mäuse in der gleichen Art und Weise wie vorstehend verabreicht. Sowohl die Gruppe, der das Peptid verabreicht wurde, als auch die Kontrollgruppe bestanden aus acht Mäusen. Fünf Tage nach der zweiten Peptidverabreichung wurden an alle Mäusen 50 µg rCry j 2, gemischt mit dem Adjuvans Imject Alum, subkutan verabreicht. Eine Woche nach der Immunisierung wurden aus jeder Maus die Splenocyten präpariert. In jeder Vertiefung einer 96-Mulden-Platte (Falcon) wurden 5 × 10⁶ Splenocyten zusammen mit 3 µg/ml rCry j 2 in 0,2 ml RPMI-Medium (10% FKS, 2 mM L-Glutamin, 50 E/ml Penicillin und 50 µg/ml Streptomycin) kultiviert. Als Kontrolle wurden die Zellen im gleichen Medium, das kein rCry j 2 enthielt, kultiviert. Die Aufnahme von [³H]-Thymidin wurde, wie in Beispiel 10 beschrieben, gemessen.
Wenn p236-250 (SEQ ID NO: 19) vor der Antigenstimulation mit rCry j 2 subkutan an CB6F1-Mäuse verabreicht wurde, wurde die Immunantwort auf die T-Zellen im Vergleich mit der Gruppe, der physiologische Kochsalzlösung verabreicht wurde, signifikant gehemmt (p<0,05, 6). Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass im Mausmodell das System mit p236-250 (SEQ ID NO: 19) eine vorbeugende Wirkung in der peptidbasierten Immuntherapie zur Behandlung der japanischen Zedernpollenallergie zeigt (6).
Die vorstehenden Ergebnisse machen deutlich, dass beim Menschen die gewöhnliche Hyposensibilisierung unter Verwendung eines japanischen Zedernpollenextraktes auf dem T-Zell-Epitop-vermittelten Mechanismus beruht.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Antigenpeptid, das mit einem Haplotyp der HLA Klasse II-Moleküle eines jeden Allergiepatienten zusammenpasst, als peptidbasierter immuntherapeutischer Wirkstoff für diesen Patienten verwendet werden. Die vorliegende Erfindung ermöglicht die optimale peptidbasierte Immuntherapie für jeden Patienten. Daher wird erwartet, dass die Wirksamkeit der peptidbasierten Immuntherapie beträchtlich verbessert wird. Des Weiteren liefert die vorliegende Offenbarung einen peptidbasierten immuntherapeutischen Wirkstoff, der bei einem Patienten wirksam ist, der nicht mittels peptidbasierter Immuntherapie unter Verwendung der Hauptantigenpeptide, die in einer bestimmten Patientenpopulation erkannt werden, behandelt werden kann.
Zusätzlich kann die Typisierung von HLA Klasse II-Molekülen einfach und leicht unter Verwendung eines Antigenpeptides, das hierin vorstehend beschrieben wird, durchgeführt werden.
Sequenzprotokoll
Sequenzprotokoll Anhang

Claims

Verwendung (i) eines Antigenpeptids, abgeleitet aus dem japanischen Zedernpollenallergen Cry j 1 oder Cry j 2, und (ii) eines pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittels oder Trägers für die Herstellung einer peptidbasierten immuntherapeutischen Zusammensetzung, welche bei jedem Allergiepatienten wirksam ist, der an japanischer Zedernpollenallergie leidet und ein spezifisches HLA Klasse II-Molekül exprimiert, welches an das Antigenpeptid bindet, wobei: (a) wenn das HLA Klasse II-Molekül als DQA1*0102-DQB1*0602 identifiziert wird, das Antigenpeptid ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 9, 10, 21, 23 und der Aminosäuresequenz LKLTSGKIASCLNDN; (b) wenn das HLA Klasse II-Molekül als DPA1*0101-DPB1*0501 identifiziert wird, das Antigenpeptid ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 2, 8, und 15; (c) wenn das HLA Klasse II-Molekül als DPA1*0101-DPB1*0201 identifiziert wird, das Antigenpeptid ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 17; (d) wenn das HLA Klasse II-Molekül als DPA1*0202-DPB1*0501 identifiziert wird, das Antigenpeptid ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 22; (e) wenn das HLA Klasse II-Molekül als DRB5*0101 identifiziert wird, das Antigenpeptid ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 14 und 19; (f) wenn das HLA Klasse II-Molekül als DRB1*0901 identifiziert wird, das Antigenpeptid ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 6, 7, 12, 16 und 20; (g) wenn das HLA Klasse II-Molekül als DRB4*0101 identifiziert wird, das Antigenpeptid ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 7, 12 und 18; und (h) wenn das HLA Klasse II-Molekül als DRB1*1501 identifiziert wird, das Antigenpeptid ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 13 und 19.