DE69737740T2

DE69737740T2 - GDP-Dissoziation stimulierendes Protein, gehirnspezifisches Nucleosomfügungsprotein, Skelettmuskel-spezifisches Ubiquitin-Conjugationsenzym, Zellproliferationsprotein, Phosphatidylinositolkinase, Nel verwandte Proteine

Info

Publication number: DE69737740T2
Application number: DE69737740T
Authority: DE
Inventors: Tsutomu Fujiwara; Takeshi Itano-gun Watanabe; Masato Tokushima-shi Horie
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1996-03-19
Filing date: 1997-03-19
Publication date: 2008-01-31
Anticipated expiration: 2017-03-20
Also published as: CA2200371C; JP3646191B2; DK1295944T3; US5831058A; EP1295944B1; US20060134634A1; US8106171B2; CA2200371A1; US20110105718A1; ATE362536T1; DE69737740D1; EP1860189A1; US7592438B2; US20070111285A1; EP1295944A3; EP2272960A1; CA2641565A1; US20100048878A1; US8048995B2; US7674889B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gen, das als Indikator in der Prophylaxe, Diagnose und Behandlung bei Erkrankungen bei Menschen nützlich ist. Genauer gesagt betrifft es u.a. neue menschliche Gen-Analoge zu bekannten Ratten-, Maus-, Hefe-, Nematoden- und bekannten menschlichen Genen und ist bei der cDNA-Analyse, der Kartierung der cDNA des auf dem Chromosom und der funktionalen Analyse der cDNA in der Gendiagnostik unter Verwendung dieses Gens, und bei der Entwicklung eines neuen therapeutischen Verfahrens brauchbar.
Technischer Hintergrund
Die genetische Information von Lebewesen ist als Sequenzen (DNA) aus vier Basen, d.h. A, C, G und T, angehäuft, welche in dem Zellnuclei vorhanden ist. Diese genetische Information ist bei jedem individuellen Lebewesen zur Konservierung der Art und der Ontogenese konserviert worden.
Im Fall des Menschen wird vermutet, daß die Anzahl dieser Basen ungefähr 3 Billionen (3 × 10⁹) beträgt, und vermutlich gibt es 50 bis 100 000 Gene darin. Diese genetische Information dient der Bewahrung biologischer Phänomene, insofern als regulatorische Proteine, strukturelle Proteine und Enzyme über den Weg hergestellt werden, daß mRNA von einem Gen (DNA) transkribiert wird und dann in ein Protein translatiert wird. Abnormalitäten in diesem Weg vom Gen zur Proteintranslatierung werden als verantwortlich für Abnormalitäten der lebenserhaltenden Systeme angesehen, beispielsweise bei der Zellproliferation und -differenzierung, und sind daher verantwortlich für zahlreiche Erkrankungen.
Als Ergebnis von Genanalysen, die bisher durchgeführt wurden, sind eine Anzahl an Genen, von denen erwartet wurde, daß sie als nützliche Materialien bei der Medikamentenentwicklung dienen, gefunden wurden, beispielsweise Gene für zahlreiche Rezeptoren wie den Insulin-Rezeptor und LDL-Rezeptor, Gene die an der Zellproliferation und -differenzierung beteiligt sind und Gene für Stoffwechselenzyme wie Proteasen, ATPase und Superoxiddismutasen.
Jedoch sind die Analysen der menschlichen Gene und die Untersuchungen der Funktionen der Gene, die analysiert wurden, und der Beziehungen zwischen den Genen, die analysiert wurden, und der zahlreichen Erkrankungen gerade begonnen worden und viele Punkte bleiben noch unbekannt. Weitere Analysen der neuen Gene, die Analysen der Funktionen davon, die Studien der Beziehung zwischen den analysierten Genen und Erkrankungen, und die Untersuchungen der Anwendung dieser Gene, die analysiert wurden, auf Gendiagnostik oder beispielsweise medizinische Zwecke werden daher auf dem jeweiligen Fachgebiet gewünscht.
Wenn ein neues menschliches Gen, das oben erwähnt wurde, bereitgestellt werden kann, wird es möglich sein, dessen Expressionsniveau in jeder Zelle zu analysieren, und dessen Struktur und die Funktion, und durch die Analyse des Expressionsproduktes und andere Studien kann es möglich werden, die Pathogenese einer Erkrankung, die hiermit verbunden ist, zu entschlüsseln, beispielsweise eine genetische Erkrankung oder Krebs oder beispielsweise die Diagnose und Behandlung dieser Erkrankung. Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein solches neues Gen des Menschen bereitzustellen.
Um das obige Ziel zu erreichen, haben die vorstelligen Erfinder intensive Untersuchungen durchgeführt und die unten erwähnten Befunde erzielt. Auf der Grundlage davon ist die vorliegende Erfindung vollendet worden.
Offenbarung der Erfindung
Das bedeutet, daß die vorstelligen Erfinder cDNAs synthetisiert haben, die auf mRNAs beruht, die aus zahlreichen Geweben extrahiert wurde, einschließlich des menschlichen fötalen Hirns, adulter Blutgefäße und der Plazenta, sie haben Bibliotheken durch Inserieren derselben in Vektoren hergestellt, sie haben Kolonien von Escherichia coli, die mit diesen Bibliotheken transformiert sind, ermöglicht sich auf Agarmedium zu bilden, sie haben Kolonien zufallsgemäß herausgepickt und sie in 96 Well-Mikroplatten überführt und eine große Anzahl an E. coli-Klonen registriert, die menschliche Gene enthalten.
Jeder so registrierte Klon wurde in kleinem Maßstab kultiviert, die DNA wurde extrahiert und gereinigt, und Vier-Basen-spezifische Terminationsextensionsreaktionen wurden durchgeführt, indem das Didesoxykettenabbruchverfahren unter Verwendung der cDNA, die als Matrize extrahiert worden war, durchgeführt wird, und die Basensequenz des Gens wurde vom 5'-Terminus aus gesehen über ungefähr 400 Basen unter Verwendung eines automatischen DNA-Sequenziergeräts bestimmt. Auf Grundlage der so erhaltenen Basensequenzinformation, wurde ein neues Familien-Gen, das analog zu bekannten Genen eines Tieres und einer Pflanzenspezies, wie beispielsweise Bakterien, Hefen, Nematoden, Mäusen und Menschen ist, gesucht.
Das Verfahren der oben erwähnten cDNA-Analyse wird detailliert in der Literatur von Fujiwara, einem der vorstelligen Erfinder [Fujiwara, Tsutomu, Saibo Kogaku (Cell Engineering), 14, 645-654 (1995)] beschrieben.
In dieser Gruppe gibt es neue Rezeptoren, DNA-bindenden Domänenhaltige Transkriptions-regulierende Faktoren, Signalübermittlungssystemfaktoren, Stoffwechselenzyme usw. Auf Grundlage der Homologie des neuen Gens der vorliegenden Erfindung, das durch Genanalyse gewonnen wurde, zu Genen, die dazu analog sind, kann das Produkt des Gens, d.h. die Funktion des Proteins ungefähr durch Analogie abgeschätzt werden. Außerdem können Funktionen wie die Enzymaktivität und die Bindungsfähigkeit durch Inserieren des Kandidatengens in einen Expressionsvektor untersucht werden, um eine Rekombinante zu ergeben.
Erfindungsgemäß wird ein neues menschliches Gen bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine Nukleotidsequenz enthält, die eine Aminosäuresequenz codiert, welche in SEQ ID NO:28, 31 definiert ist, und ein menschliches Gen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Nukleotidsequenz enthält, die durch die SEQ ID NO:29, bzw. 32 definiert wird, welche jeweils für die oben erwähnte Aminosäuresequenz codieren, und ein neues menschliches Gen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Nukleotidsequenz hat, die in SEQ ID NO:30 und 33 angegeben ist.
Die hierin verwendeten Symbole zur Angabe der Aminosäuren, Peptide, Nukleotide, Nukleotidsequenzen usw. sind solche, die von IUPAC und IUB oder in den "Richtlinien zum Entwurf von Beschreibungen etc., einschließlich der Nukleotidsequenzen oder Aminosäuresequenzen" (herausgegeben vom japanischen Patentamt) empfohlen sind, oder solche, die in dem relevanten Fachgebiet konventioneller Weise verwendet werden.
Als spezifische Beispiele eines solchen Gens der vorliegenden Erfindung können Gene erwähnt werden, die von der DNA-Sequenz der Klone abgeleitet werden, die bezeichnet werden als "Gen-428B12", welche hierin später in den Beispielen 1 bis 11 gezeigt werden. Die entsprechenden Nukleotidsequenzen sind in der Sequenzliste gezeigt.
Diese Klone haben einen offenen Leserahmen, welcher Nukleotide (Nukleinsäuren) umfaßt, welche jeweils die Aminosäuren codieren, die in der Sequenzliste gezeigt sind. Ihre Molekulargewichte wurden als die Werte, die nachfolgend hier in den entsprechenden Beispielen gezeigt sind, berechnet. Nachfolgend werden die menschlichen Gene manchmal unter der Bezeichnung verwendet, die in den Beispielen 1, 2 und 9 verwendet werden.
Nachfolgend wird das menschliche Gen der vorliegenden Erfindung im weiteren Detail beschrieben.
Wie oben erwähnt wurde, ist jedes menschliche Gen der vorliegenden Erfindung unter anderem analog zu Genen der Ratte, Maus, Hefe, Nematoden und bekannten menschlichen Genen, und kann in der Genanalyse des Menschen auf Grundlage der Information über diese Gen-Analoga, und beim Untersuchen der Funktion des analysierten Gens und der Beziehung zwischen dem analysierten Gen und einer Erkrankung benutzt werden. Es ist möglich dieses Gen in der Gendiagnostik der Erkrankung, die hiermit assoziiert ist, zu verwenden, und bei Untersuchungen zur Nutzung dieses Gens für medizinische Zwecke.
Das erfindungsgemäße Gen wird in Form der einzelsträngigen DNA-Sequenz dargestellt, die in SEQ ID NO:29 gezeigt ist. Es ist anzumerken, daß die vorliegende Erfindung jedoch auch eine DNA-Sequenz einschließt, die komplementär zu einer derartigen einzelsträngigen DNA-Sequenz ist sowie einen Bestandteil, der beide umfaßt.
Das erfindungsgemäße Gen ist nicht hierauf beschränkt, sondern kann natürlich auch eine DNA-Sequenz haben, in der die Codons zufallsgemäß ausgewählt werden und für die entsprechenden Aminosäurereste kombiniert werden. Die Codon-Auswahl kann in konventioneller Weise durchgeführt werden, beispielsweise indem die Codon-Benutzungshäufigkeiten in dem zu verwendenden Wirt in Betracht gezogen werden [Nucl. Acids. Res. 9, 43-74 (1981)].
Das erfindungsgemäße Gen schließt weiter DNA-Sequenzen ein, die für funktionale Äquivalente codieren, die durch teilweise Aminosäure- oder Aminosäuresequenz-Substituierung, -Deletion oder -Addition von der Aminosäuresequenz abstammen, die oben erwähnt wurde. Diese Polypeptide können durch spontane Modifizierung (Mutation) hergestellt werden, oder sie können durch posttranslationale Modifizierung gewonnen werden oder indem das natürliche Gen (der vorliegenden Erfindung) durch eine Technik der rekombinanten Genetik modifiziert wird, beispielsweise durch ortsspezifische Mutagenese [Methods in Enzymology 154, S. 350, 367-382 (1987); ibid. 100, S. 468 (1983); Nucleic Acids Research 12, S. 9441 (1984); Zoku Seikagaku Jikken Koza (Sequel to Experiments in Biochemistry) 1, "Idensi Kenkyu-ho (methods in Gene Research) II", herausgegeben von the Japan Biochemical Society, S. 105 (1986)), oder durch das Synthetisieren mutierter DNAs durch chemische Synthesetechniken, beispielsweise das Phosphotriester-Verfahren oder die Phosphoamidit-Methode [J. Am. Chem. Soc., 89, S. 4801 (1967); ibid. 91, S. 3350 (1969); Science 150, S. 178 (1968); Tetrahedron Lett., 22, S. 1859 (1981); ibid. 24, S. 245 (1983)] oder durch Verwendung von Techniken, die oben erwähnt wurden, in Kombination.
Das Protein, das durch das erfindungsgemäße Gen codiert wird, kann leicht und stabil durch die Verwendung des Gens exprimiert werden, beispielsweise durch Inserieren desselben in einen Vektor zur Verwendung in einem Mikroorganismus, und durch Kultivierung des so transformierten Mikroorganismus.
Das durch die Verwendung des Gens der vorliegenden Erfindung gewonnene Protein kann in der Herstellung spezifischer Antikörper verwendet werden. In diesem Fall kann das Protein, das in großen Mengen durch rekombinante Gentechniken die oben erwähnt wurden herstellbar ist, als Bestandteil verwendet werden, um als Antigen zu dienen. Der gewonnene Antikörper kann polyklonal oder monoklonal sein und kann vorzugsweise bei der Reinigung, in einem Test, bei der Unterscheidung oder Identifizierung des entsprechendes Proteins verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Gen kann leicht auf Grundlage der Sequenzinformation, die hier beschrieben sind, unter Verwendung von allgemein rekombinanten Gentechniken hergestellt werden [cf. z.B. Molecular Cloning, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Zoku Seikagaku Jikken Koza, "Idenshi Kenkyu-ho I, II und III", herausgegeben von the Japan Biochemical Society (1986)].
Dies kann beispielsweise durch Auswählen eines gewünschten Klons aus einer menschlichen cDNA-Bibliothek erreicht werden (hergestellt in konventioneller Weise aus passenden Zellen, mit einem Ursprung, in dem das Gen exprimiert wird) indem eine Sonde oder ein Antikörper verwendet wird, der für das Gen der vorliegenden Erfindung spezifisch ist [z.B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 6613 (1981); Science, 222, 778 (1983)].
Die ursprünglichen Zellen können in dem oben erwähnten Verfahren verwendet werden, und sind beispielsweise Zellen oder Gewebe, in denen das fragliche Gen exprimiert wird, oder kultivierte Zellen, die hiervon abstammen. Die Trennung der Gesamt-RNA, die Auftrennung und Reinigung der mRNA und die Umwandlung (Synthese von) cDNA, deren Klonierung usw. kann durch konventionelle Verfahren durchgeführt werden. cDNA-Bibliotheken sind ebenfalls kommerziell erhältlich und solche cDNA-Bibliotheken, beispielsweise zahlreiche cDNA-Bibliotheken, die von Clontech Lab. Inc. erhältlich sind, können ebenfalls in dem oben erwähnten Verfahren verwendet werden.
Die Durchmusterung nach dem erfindungsgemäßen Gen in diesen cDNA-Bibliotheken kann unter Verwendung des oben erwähnten konventionellen Verfahrens durchgeführt werden. Diese Durchmusterungsverfahren schließen beispielsweise das Verfahren ein, das das Auswählen eines cDNA-Klons durch immunologisches Durchmustern unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers für das produzierte Protein der entsprechenden cDNA ein, die Technik der Plaque- oder Koloniehybridisierung unter Verwendung von Sonden, die selektiv an die gewünscht DNA-Sequenz binden, oder eine Kombination daraus. Im Hinblick auf die hier zu verwendende Sonde, wird im allgemeinen eine DNA-Sequenz, die chemisch auf der Grundlage der Information synthetisiert wurde, die über die erfindungsgemäße DNA-Sequenz verfügbar ist, verwendet. Es ist natürlich möglich das Gen der vorliegenden Erfindung, oder Fragmente davon, als Sonde zu verwenden.
Außerdem können ein Sense-Primer und ein Antisense-Primer, die auf Grundlage der Information über die Teilaminosäuresequenz eines natürlichen Extrakts entworfen werden, welcher aus Zellen oder einem Gewebe isoliert oder gereinigt wird, als Sonden zum Durchmustern verwendet werden.
Um das Gen der vorliegenden Erfindung zu erhalten, kann die Technik der DNA/RNA-Amplifizierung durch das PCR-Verfahren [Science 230, 1350-1354 (1984)] erwähnt werden. Insbesondere, wenn die cDNA voller Länge kaum aus der Bibliothek zu gewinnen ist, können das RACE-Verfahren (rapid amplification of cDNA ends; Jikken Igaku (Experimental Medicine), 12(6), 35-38 (1994)], insbesondere das 5'-RACE-Verfahren [Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988)] vorzugsweise verwendet werden. Die Primer, die in einem solchen PCR-Verfahren zu verwenden sind, können entsprechend auf der Grundlage der Sequenzinformation des erfindungsgemäßen Gens entworfen werden, die hier offenbart ist, und sie können durch ein konventionelles Verfahren synthetisiert werden.
Das amplifizierte DNA/RNA-Fragment kann isoliert und gereinigt werden, indem ein konventionelles Verfahren, das oben erwähnt wurde, verwendet wird, zum Beispiel die Gelelektrophorese.
Die Nukleotidsequenz des so erhaltenen erfindungsgemäßen Gens oder irgendeines der zahlreichen DNA-Fragmente kann durch ein konventionelles Verfahren bestimmt werden, zum Beispiel das Didesoxyverfahren [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977)] oder durch das Maxam-Gilbert-Verfahren [Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)]. Eine derartige Nukleotidsequenzbestimmung kann ebenfalls leicht unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Sequenzierkits durchgeführt werden.
Wenn das erfindungsgemäße Gen verwendet wird, und konventionelle Techniken der rekombinanten DNA-Technologie [siehe z.B. Science, 224, S. 1431 (1984); Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, S. 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, S. 5990 (1983) und die oben zitierten Referenzen] befolgt werden, kann ein rekombinantes Protein gewonnen werden. Genauer gesagt kann dieses Protein durch Herstellen einer rekombinanten DNA hergestellt werden, was ermöglicht, das erfindungsgemäße Gen in Wirtszellen zu exprimieren, es in Wirtszellen für die Transformation derselben einzuschleusen und die erhaltenen Transformanten zu kultivieren.
In diesem Fall können die Wirtszellen eukaryontisch oder prokaryontisch sein. Die eukaryontischen Zellen schließen Wirbeltierzellen, Hefezellen usw. ein., und die Wirbeltierzellen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Affenzellen, die als COS-Zellen bezeichnet werden [Cell, 23, 175-182 (1981)], Chinesische Hamster-Quarzellen und Dihydrofolatreduktase-defiziente Zelllinien die davon abstammen [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220 (1980)] und ähnliche, die häufig verwendet werden.
Hinsichtlich des Expressionsvektors, der in Wirbeltierzellen zu verwenden ist, kann im allgemeinen ein Expressionsvektor mit einem Promotor, der stromaufwärts des zu exprimierenden Gens lokalisiert ist, RNA-Spleiß-Stellen, eine Polyadenylierungsstelle und eine Transkriptions-Terminierungs-Sequenz verwendet werden. Dieser kann, falls notwendig ferner einen Replikationsursprung haben. Als ein Beispiel eines derartigen Expressionsvektors kann pSV2dhfr erwähnt werden [Mol. Cell. Biol., 1, 854 (1981)], der den SV40 Early-Promotor aufweist. Hinsichtlich des eukaryontischen Mikroorganismus werden allgemein und häufig Hefen verwendet, und hierunter Hefen des Genus Saccharomyces, die mit Vorteil zu verwenden sind. Hinsichtlich des Expressionsvektors zur Verwendung in diesen Hefen und anderen eukaryontischen Mikroorganismen kann beispielsweise pAM82 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1-5 (1983)], der den Saure Phosphatase-Genpromotor aufweist, verwendet werden.
Des weiteren kann ein prokaryontischer Gen-Fusionsvektor vorzugsweise als Expressionsvektor des erfindungsgemäßen Gens verwendet werden. Als spezifisches Beispiel für diesen Vektor können erwähnt werden pGEX-2TK und pGEX-4T-2, die eine GST-Domäne haben (von S. japonicum stammend) mit einem Molekulargewicht von 26 000.
Escherichia coli und Bacillus subtillis sind allgemein und vorzugsweise als prokaryontische Wirte zu verwenden. Wenn diese als Wirte in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wird ein Expressionsplasmid, das von einem Plasmidvektor abstammt, der in der Lage ist, sich in diesen Wirtsorganismen zu replizieren, und vorausgesetzt, daß diese Verbindung einen Promotor und die SD-Sequenz (Shine and Dalgarno) stromaufwärts dieses Gens zur Ermöglichung der Expression des Gens der vorliegenden Erfindung, und ferner mit einem Initiationscodon (z.B. ATG), der für die Initiierung der Proteinsynthese notwendig ist, hat, vorzugsweise verwendet. Der Escherichia coli-Stamm K12 ist u.a. vorzugsweise als Wirt Escherichia coli zu verwenden und pBR322 und modifizierte Vektoren, die hiervon abstammen sind allgemein und vorzugsweise als Vektoren zu verwenden, wenngleich zahlreiche bekannte Stämme und Vektoren ebenfalls verwendet werden können. Beispiele für den Promotor, der verwendet werden kann, ist der Tryptophan-(trp)-Promotor, lpp-Promotor, lac-Promotor und PL/PR-Promotor.
Die so gewonnene gewünschte rekombinante DNA kann in Wirtszellen zur Transformation unter Verwendung zahlreicher allgemeiner Verfahren eingeschleust werden. Die gewonnene Transformante kann durch ein konventionelles Verfahren kultiviert werden, und die Kultur führt zur Expression und Produktion des gewünschten Proteins, das durch das erfindungsgemäße Gen codiert wird. Das zu verwendende Medium in dieser Kultur kann aus zahlreichen Medien der konventionellen Verwendung entsprechend den benutzten Wirtszellen ausgewählt werden. Die Wirtszellen können unter Bedingungen kultiviert werden, die für deren Wachstum geeignet sind.
In der oben angegebenen Weise wird das gewünschte rekombinante Protein innerhalb der transformierten Zellen oder extrazellulär oder auf der Zellmembran exprimiert und produziert und akkumuliert oder sezerniert.
Das rekombinante Protein kann nach Wunsch durch zahlreiche Trennverfahren abgetrennt und gereinigt werden, indem physikalische, chemische oder andere Eigenschaften davon verwendet werden [z.B. "Seikagaku (Biochemistry) Data Book II", Seiten 1175-1259, 1. Auflage, 1. Druck, veröffentlicht am 23. Juni 1980 von Tokyo Kagaku Dojin; Biochemistry 25, (25), 8274-8277 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313-321 (1987)]. Genauer gesagt schließen diese Verfahren u.a. die gewöhnlichen Rekonstituierungsbehandlungen, die Behandlung mit einem Proteinpräzipitationsmittel (Aus salzen), die Zentrifugierung, die osmotische Schockbehandlung, die Beschallung, die Ultrafiltration, zahlreiche Flüssigchromatographie-Techniken wie die molekulare Sieb-Chromatographie (Gelfiltration), die Adsorptions-Chromatographie, die Innenaustausch-Chromatographie, die Affinitäts-Chromatographie und die Hochleichtungsflüssig-Chromatographie (HPLC), die Dialye und Kombinationen davon ein. Von diesen ist die Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung einer Säule mit dem gewünschten Protein, das daran gebunden wird, besonders bevorzugt.
Außerdem ist es auf Grundlage der Sequenzinformation des erfindungsgemäßen Gens, das in der vorliegenden Erfindung gefunden wurde, beispielsweise unter Verwendung eines Teils oder der gesamten Sequenz des Gens möglich, die Expression des Gens der vorliegenden Erfindung in zahlreichen menschlichen Geweben nachzuweisen. Dies kann durch ein konventionelles Verfahren, zum Beispiel durch die RNA-Amplifizierung mittels RT-PCR (revers transkribierte Polymerasekettenreaktion) [Kawasaki, E.S., et al., Amplification of RNA, in PCR Protocol, A guide to methods and applications, Academic Press, Inc., San Diego, 21,27 (1991)] oder durch Northern-Blot-Analyse [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)] mit guten Ergebnissen durchgeführt werden.
Die zu verwendenden Primer bei der Benutzung des oben erwähnten PCR-Verfahrens sind nicht auf besondere beschränkt, vorausgesetzt, daß sie für das Gen der vorliegenden Erfindung spezifisch sind und ermöglichen daß allein das erfindungsgemäße Gen spezifisch amplifiziert wird. Sie können auf Grundlage der Geninformation, die in der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, entworfen und entsprechend ausgewählt werden. Sie können eine Teilsequenz haben, die ungefähr 20 bis 30 Nukleotide umfaßt, entsprechend der etablierten Praxis. Geeignete Beispiele sind in den Beispielen gezeigt.
Das bedeutet, daß die vorliegende Erfindung auch Primer und/oder Sonden bereitstellt, die beim spezifischen Nachweisen eines derartigen neuen Gens nützlich sind.
Unter Verwendung des neuen Gens, das durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, ist es möglich, die Expression dieses Gens in zahlreichen Geweben nachzuweisen, die Struktur und die Funktion davon zu analysieren und des weiteren das menschliche Protein, das durch dieses Gen codiert wird, mittels rekombinanter Gentechnik herzustellen. Dies macht es möglich, das Expressionsprodukt zu analysieren, die Pathologie einer Erkrankung, die hiermit verbunden ist, zu offenbaren, beispielsweise eine genetische Erkrankung oder Krebs, und die Erkrankung zu diagnostizieren und zu behandeln.
Auf die folgenden Zeichnungen wird in den Beispielen Bezug genommen.
1 zeigt das Ergebnis, das durch Testen der P24-Kinaseaktivität von NPIK in Beispiel 9 gewonnen wurde. 2 zeigt die Wirkung von Triton-X100 und Adenosin auf die NPIK-Aktivität.
Beispiele
Die folgenden Beispiele stellen die vorliegende Erfindung in weiteren Details dar.
Beispiel 1
Nur technischer Hintergrund des Beispiels 9.
GDP-Dissoziationsstimulator-Gen (nicht Teil der Erfindung)
(1) Klonierung und DNA-Sequenzierung des GDP-Dissozierungs-Stimulator-Gens
mRNA, die aus Geweben eines menschlichen fötalen Hirns, adulten Blutgefäßen und Plazenta extrahiert wurden, wurde von Clontech bezogen und als Ausgangsmaterial verwendet.
Von jeder mRNA wurde cDNA synthetisiert und in den Vektor λZAPII (Stratagene) inseriert, um dadurch eine cDNA-Bibliothek herzustellen (Otsuka GEN Gesearch Institute, Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.).
Den das menschliche Gen enthaltenden Escherichia coli-Kolonien wurde ermöglicht auf Agarmedium durch die In-vivo-Exzisionstechnik Kolonien zu bilden [Short, J.M., et al., Nucleic Acids Res. 16, 7583-7600 (1988)]. Die Kolonien wurden zufallsgemäß herausgepickt, und die das menschliche Gen enthaltenden Escherichia coli-Klone wurden in 96 Well-Mikroplatten registriert. Die Klone, die registriert wurden, wurden bei –80°C gelagert.
Jeder der registrierten Klone wurde über Nacht in 1,5 ml LB-Medium kultiviert, und die DNA wurde daraus extrahiert und unter Verwendung eines PI-100-Modells zur automatischen Plasmid-Extraktion (Kurabo) gereinigt. Kontaminierende Escherichia coli-RNAs wurden zersetzt und durch RNase-Behandlung entfernt. Die DNA wurde in einem Endvolumen von 30 μl gelöst. Ein 2 μl-Teil wurde für eine grobe Überprüfung der Größe der DNA und deren Menge unter Verwendung eines Minigels verwendet, und 7 μl wurden für Sequenzreaktionen verwendet, und der restliche Teil (21 μl) wurde als Plasmid-DNA bei 4°C gelagert.
Dieses Verfahren ermöglicht nach leichten Änderungen im Programm die Extraktion des Cosmids, welches ebenfalls als Sonde für FISH (Fluoreszenz- in-situ-Hybridisierung) nützlich ist, wie in den Beispielen später gezeigt wird.
Dann wurde das Didesoxy-Abbruchverfahren nach Sanger et al. [Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977)] unter Verwendung von T3, T7 oder einem synthetischen Oligonukleotidprimer oder die Cyclussequenziermethode [Carothers, A.M., et al., Bio. Techniques, 7, 494-499 (1989)], umfassend das Didesoxy-Kettenabbruchverfahren plus PCR-Verfahren, durchgeführt. Diese sind Verfahren zur spezifischen Beendigung der Extensionsreaktion an den vier Basen, unter Verwendung einer geringen Menge an Plasmid-DNA (ungefähr 0,1-0,5 μg) als Matrize.
Die verwendeten Sequenzierprimer waren FITC (Fluoresceinisothiocyanat)-markiert. Im allgemeinen wurden ungefähr 25 Reaktionszyklen unter Verwendung von Taq-Polymerase durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden auf einem Polyacrylamidharnstoff-Gel aufgetrennt, und die Fluoreszenzmarkierten DNA-Fragmente wurden einem automatischen DNA-Sequenziergerät (ALF^TM DNA Sequencer; Pharmacia) zugeführt, um die Sequenz von ungefähr 400 Basen am 5'-Ende der cDNA zu bestimmen.
Da die 3'-nicht-translatierte Region jedes Gens hoch heterogen ist und daher für die Unterscheidung individueller Gene voneinander geeignet ist, wurde eine Sequenzierung auf der 3'-Seite ebenfalls abhängig von der Situation durchgeführt.
Die enorme Anzahl der Nukleotidsequenzinformation, die durch das DNA-Sequenziergerät gewonnen wurde, wurde in einem 64 bit DEC 3400-Computer für eine Homologieanalyse mittels des Computers überführt. In der Homologieanalyse wurde eine Datenbank (GenBank, EMBL) verwendet, um gemäß dem UWGCG FASIA-Programm [Pearson, W.R. und Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-2448 (1988)] zu suchen.
Als Ergebnis einer willkürlichen Auswahl des oben erwähnten Verfahrens und der cDNA-Sequenzanalyse wurde ein Klon, der als GEN-501D08 bezeichnet wird und ein 0,8 Kilobasen-Insert trägt, gefunden, welches ein hohes Niveau an Homologie mit dem C-terminalen Bereich des menschlichen Ral-Guanidin-Nukleotid-Dissoziationsstimulator-(RalGDS)-Gen aufweist. Da RalGDS vermutlich eine bestimmte Rolle in den Signaltransmissionswegen spielt, wurde die gesamte Nukleotidsequenz des cDNA-Insertteils, welches das menschliche Homologon bereitstellt, weiter bestimmt.
(2) Northern-Blot-Analyse
Die Expression der RalGDS-Protein-mRNA in normalen menschlichen Geweben wurde durch Northern-Blut unter Verwendung des menschlichen cDNA- Klons, welcher durch eine Zufalls-Oligonukleotidpriming-Methode markiert wurde, als Sonde begutachtet.
Die Northern-Blot-Analyse wurde mit einem menschlichen MTN-Blut (Human Multiple Tissue Northern blot; Clontech, Palo Alto, CA, USA) nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt.
Auf diese Weise wurde das PCR-Amplifikationsprodukt des oben erwähnten Klons GEN-501D08 zur Verwendung als Sonde mit [³²P]-dCTP markiert (random-primed DNA labeling kit, Boehringer, Mannheim).
Für das Blotten, wurde eine Hybridisierung über Nacht bei 42°C in einer Lösung durchgeführt, die 50 % Formamid/5 × SSC/50 × Denhardt's-Lösung/0,1 % SDS (enthaltend 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA) umfaßt. Nach dem Waschen mit 2 Anteilen 2 × SSC/0,01 % SDS bei Raumtemperatur wurde der Membranfilter weiter dreimal mit 0,1 × SSC/0,05 % SDS bei 50°C für 40 Minuten gewaschen. Ein Röntgenfilm (Kodak) wurde dem Filter bei –70°C für 18 Stunden ausgesetzt.
Als Ergebnis wurde gezeigt, daß ein 900 bp-Transkript in allen menschlichen Geweben, die untersucht wurden, exprimiert wurde. Zusätzlich wurde ein 3,2 kb-Transkript spezifisch im Herz und der Skelettmuskulatur beobachtet. Die Expression dieser Transkripte, die sich in der Größe unterscheiden, kann entweder aufgrund eines alternativen Spleißings oder einer Kreuzhybridisierung mit homologen Genen begründet sein.
(3) Cosmid-Klon und Chromosomen-Lokalisierung mittels FISH
FISH wurde durch das Durchmustern einer Bibliothek menschlicher Chromosome durchgeführt, die in den Cosmid-Vektor pWE15 kloniert worden waren, in dem als Sonde das 0,8 kb-Insert des cDNA-Klons verwendet wurde [Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, 2. Ausgabe, S. 3.1-3.58, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)].
Die FISH für die Chromosomen-Zuordnung wurde nach dem Verfahren von Inazawa et al. durchgeführt, welches den Vergleich der G-Bandenmuster zur Bestätigung umfaßt [Inazawa, J. et al., Genomics, 17, 153-162 (1993)].
Zur Verwendung als Sonde wurde die Cosmid-DNA (0,5 μg), welche durch das Chromosom-Durchmustern gewonnen wurde und dem GEN-501D08 entspricht, mit Biotin-16-dUTP durch Nick-Translatierung markiert.
Um den Hintergrund aufgrund repetitiver Sequenzen zu eliminieren, wurden 0,5 μl beschallter menschlicher Plazenta-DNA (10 mg/ml) zu 9,5 μl der Sondenlösung gegeben. Die Mischung wurde bei 80°C für 5 Minuten denaturiert und mit einem gleichen Volumen an 4 × SSC enthaltend 20 % Dextransulfat gemischt. Dann wurde ein denaturierter Glasobjektträger mit der Hybridisierungsmischung bedeckt, und nach dem Abschließen mit Paraffin in einer feuchten Kammer bei 37°C für 16 bis 18 Stunden inkubiert. Nach dem Waschen mit 50 % Formamid/2 × SSC bei 37°C für 15 Minuten wurde der Objektträger mit 2 × SSC für 15 Minuten gewaschen und dann weiter mit 1 × SSC für 15 Minuten.
Der Objektträger wurde dann in 4 × SSC, supplementiert durch "1 % Block Ace" (Handelsmarke, Dainippon Pharmaceutical) enthaltend Avidin-FITC (5 μg/ml) bei 37°C für 40 Minuten inkubiert. Dann wurde der Objektträger mit 4 × SSC für 10 Minuten gewaschen und mit 4 × SSC enthaltender 0,05 % Triton-X-100 für 10 Minuten und dann in einer Antibleich-PPD-Lösung getränkt [hergestellt durch Einstellung von 100 mg PPD (Wako-Katalog Nr. 164-015321) und 10 ml PBS(–) (pH 7,4) auf pH 8,0 mit 0,5 M Na₂CO₃/0,5 M NaHCO₃ (9:1, V/V)-Puffer (pH 9,0) und Zugabe von Glycerin, um ein Gesamtvolumen von 100 ml zu ergeben], enthaltend 1 % DABCO [1 % DABCO (Sigma) in PBS(–):Glycerin 1:9 (V:V(], gefolgt von einer Gegenfärbung mit DAPI (4,6-Diamino-2-phenylindol; Sigma).
Bei mehr als 100 getesteten Zellen in der Metaphase wurde ein spezifisches Hybridisierungssignal auf dem Chromosom in der Bande 6p21.3 beobachtet, ohne irgendein Signal auf anderen Chromosomen. Es wurde daher bestätigt, daß das RalGDS-Gen auf Chromosom 6p21.3 lokalisiert ist.
Beispiel 2
(Für darstellende Zwecke)
Die 5'-RACE-Technik [Frohman, M.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, 8998-9002 (1988)] wurde verwendet.
(2) 5'-RACE (5' rapid amplification of cDNA ends)
Ein cDNA-Klon, der den 5'-Anteil des Gens der vorliegenden Erfindung enthält wurde für die Analyse durch die 5'-RACE-Technik unter Verwendung eines kommerziellen Kits (5'-Rapid AmpliFinder RACE kit, Clontech) gemäß dem Protokoll des Herstellers mit geringfügigen Modifikationen wie folgt durchgeführt.
Die Gen-spezifischen Primer P1 und Primer P2, die hier verwendet wurden, wurden durch das konventionelle Verfahren synthetisiert, und ihre Nukleotidsequenzen sind unten in Tabelle 1 gezeigt. Der Ankerprimer, der verwendet wurde, war der, der in dem kommerziellen Kit vorhanden war. Tabelle 1

Primer Nukleotidsequenz

Primer P1 5'-ACACCAATCCAGTAGCCAGGCTTG-3'

Primer P2 5'-CACTCGAGAATCTGTGAGACCTACATACATGACG-3'
cDNA wurde durch Reverse Transkription von 0,1 μg menschlicher fötaler Hirn-Poly(A)-RNA durch die Zufalls-Hexamertechnik unter Verwendung von Reverser Transkriptase (Superscript^TM II, Life Technologies) gewonnen und die cDNA wurde durch die erste PCR unter Verwendung des P1-Primers und dem Ankerprimer gemäß Watanabe et al. [Watanabe, T., et al., Cell Genet., in Druck) amplifiziert.
So wurden zu 0,1 μg der oben erwähnten cDNA 2,5 mM dNTP/1 × Taq-Puffer (Takara Shuzo)/0,2 μM P1-Primer, 0,2 μM Adaptor-Primer/0,25 Einheiten ExTaq-Enzym (Takara Shuzo) gegeben, um ein Gesamtvolumen von 50 μl zu ergeben, gefolgt von der Zugabe des Ankerprimers. Die Mischung wurde einer PCR unterworfen. So wurden 35 Zyklen der Amplifikation unter den Bedingungen: 94°C für 45 Sekunden, 60°C für 45 Sekunden und 72°C für 2 Minuten durchgeführt. Zum Schluß wurde das Gemisch für 5 Minuten bei 72°C erwärmt.
Dann wurden 1 μl des ersten 50 μl-PCR-Produktes einer Amplifikation durch eine zweite PCR unter Verwendung des spezifischen Nested-P2-Primers und des Ankerprimers unterworfen. Das zweite PCR-Produkt wurde mit einer 1,5%igen Agarosegel-Elektrophorese analysiert.
Bei der Agarosegel-Elektrophorese wurde eine einzelne Bande einer Größe von ungefähr 650 Nukleotiden nachgewiesen. Das Produkt dieser Bande wurde in den Vektor inseriert (pT7Blue(R)T-Vektor, Novagen) und eine Vielzahl von Klonen mit dem Insert mit entsprechender Größe wurden ausgewählt.
6 der 5'-RACE-Klone, die durch das PCR-Produkt gewonnen wurden, haben die gleiche Sequenz aber verschiedene Längen. Durch Sequenzieren von zwei überlappenden cDNA-Klonen, GEN-080G01 und GEN-080G149 wurde die codierende Proteinsequenz und die 5'- und 3'-flankierenden Sequenzen, 1015 Nukleotide in Gesamtlänge, bestimmt.
Beispiel 9
Menschliches NPIK-Gen
(1) Menschliches NPIK-Gen Klonierung und DNA-Sequenzierung
Nach den Verfahren des Beispiels 1 wurden cDNA-Klone zufallsgemäß aus einer menschlichen fötalen Hirn-cDNA-Bibliothek ausgewählt und einer Sequenzanalyse unterworfen, und Datenbankenrecherchen wurden durchgeführt. Im Ergebnis wurden zwei cDNA-Klone, die hoch homolog zum Gen sind, welches für eine Aminosäuresequenz codiert, die in Phosphatidylinositol 3- und 4-Kinasen konserviert ist [Kunz, J. et al., Cell, 73, 585-596 (1993)], gewonnen. Diese wurden als GEN-428B12c1 und GEN-428B12c2 bezeichnet, und die gesamten Sequenzen derselben wurden wie in den vorhergehenden Beispielen bestimmt.
Im Ergebnis wurde gefunden, daß der GEN-428B12c1-cDNA-Klon und der GEN-428B12c2-Klon codierende Sequenzen haben, die sich in 12 Aminosäureresten am 5'-Terminus unterscheiden, wobei der GEN-428B12c1 cDNA-Klon 12 Aminosäurereste länger ist.
Die GEN-428B12c1-cDNA-Sequenz des menschlichen NPIK-Gens enthielt ein offenes Leseraster von 2487 Nukleotiden, wie in SEQ ID NO:32 gezeigt ist, welche eine Aminosäuresequenz codiert, die 829 Aminosäurerest codiert, wie in SEQ ID NO:31 gezeigt ist. Die Nukleotidsequenz des cDNA-Klons vollständiger Länge umfaßte 3324 Nukleotide, wie in SEQ ID NO:33 gezeigt ist.
Der geschätzte Initiationscodon war, wie in SEQ ID NO:33 gezeigt, bei den Nukleotiden Nrn. 115-117 lokalisiert, welches dem zweiten ATG-Triplett des cDNA-Klons entsprach. Der Terminationscodon war bei den Nukleotiden Nrn. 2602-2604 lokalisiert, und das Polyadenylierungssignal (AATAAA) bei den Nrn. 3305-3310.
Andererseits enthielt die GEN-428B12c2-cDNA-Sequenz des menschlichen NPIK-Gens ein offenes Leseraster aus 2451 Nukleotiden, wie in SEQ ID NO:29 gezeigt ist. Die Aminosäuresequenz, die hierdurch codiert wurde, umfaßte 817 Aminosäurereste, wie in SEQ ID NO:28 gezeigt ist. Die Nukleotidsequenz des vollständigen cDNA-Klons umfaßte 3602 Nukleotide, wie in SEQ ID NO:30 gezeigt ist.
Der geschätzte Initiationscodon war wie in SEQ ID NO:30 gezeigt ist, bei den Nukleotiden Positionen 429-431 zu finden, entsprechend dem 7. ATG-Triplett des cDNA-Klons. Der Terminationscodon war bei den Nukleotiden mit den Positionen 2880-2882 zu finden und das Polyandenylierungssignal (AATAAA) an den Positionen 3583-3588.
(2) Northern-Blot-Analyse
Eine Northern-Blot-Analyse wurde wie in Beispiel 1 (2) beschrieben durchgeführt. Das heißt, daß die gesamte Sequenz des menschlichen NPIK-Gens durch PCR amplifiziert wurde, das PCR-Produkt gereinigt wurde und mit [³²P]-dCTP (random-primed DNA labeling kit, Boehringer, Mannheim) markiert wurde und normale menschliche Gewebe auf die Expression der menschlichen NPIK-mRNA unter Verwendung der MTN-Blut-Membran mit dem markierten Produkt als Sonde untersucht wurden.
Im Ergebnis wurde die Expression des menschlichen NPIK-Gens in 16 verschiedenen menschlichen adulten Geweben, die untersucht wurden, beobachtet, und ein ungefähr 3,8 kb-Transkript und ein ungefähr 5 kb-Transkript konnten nachgewiesen werden.
Unter Verwendung von Primer A mit der Nukleotidsequenz, die in Tabelle 8 unten gezeigt ist, und den Initiationscodon des GEN-428B12c2 der cDNA und des Primers B, welcher in Tabelle 2 gezeigt ist, und den Terminationscodon enthält, wurde eine PCR mit menschlicher fötaler Hirn-Marathon-Ready-cDNA (Clontech) als Matrize durchgeführt, und die Nukleotidsequenz des PCR-Produktes wurde bestimmt. Tabelle 2

Primer Nukleotidsequenz

Primer A 5'-ATGGGAGATACAGTAGTGGAGC-3'

Primer B 5'-TCACATGATGCCGTTGGTGAG-3'
Im Ergebnis wurde gefunden, daß die menschliche NPIK-mRNA, die exprimiert wurde, eine einschloß, der die Nukleotide der Position 1060-1104 der GEN-428B12c1 cDNA (SEQ ID NO:33) (Aminosäuren Positionen 316-330 der Aminosäuresequenz in SEQ ID NO:31) fehlten sowie eine, der die Nukleotide der Position 1897-1911 der GEN-428B12c1-cDNA-Sequenz fehlten (SEQ ID NO:33) (Aminosäuren Position 595-599 der Aminosäuresequenz in SEQ ID NO:31).
Es wurde weiter gezeigt, daß ein Polymorphismus in diesem Gen vorhanden war (428B12cl.fasta), wie unten in Tabelle 3 im Bereich der Basen mit den Positionen 1941-1966 der GEN-428B12c1-cDNA-Sequenz gezeigt ist, die in SEQ ID NO:33 gezeigt wird, wobei ein mutiertes Protein codiert wurde, welches aus der Mutation von IQDSCEITT (Aminosäurereste-Positionen 610-618 in der Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:31), welche durch das GEN-428B12c1 codiert wird) in YKILVISA hervorging.
Tabelle 3
(3) Chromosomale Kartierung des menschlichen NPIK-Gens durch FISH
Chromosomale Kartierung des menschlichen NPIK-Gens wurde durch FISH wie in Beispiel 1 (3) beschrieben, durchgeführt.
Im Ergebnis wurde gefunden, daß der Lokus des menschlichen NPIK-Gens an der chromosomalen Position 1q21.1-q21.3 liegt.
Das menschliche NPIK-Gen, ein neues Gen, der vorliegenden Erfindung schloß zwei cDNAs ein, die sich in der 5'-Region unterschieden und in der Lage waren, 829 bzw. 817 Aminosäurereste zu codieren, wie oben erwähnt wurde. Im Hinblick auf dies und weiter im Hinblick auf die Befunde, daß die mRNA, die diesen Gen entspricht zwei deletierbare Stellen einschließt und ein Polymorphismus in einer spezifischen Region vorhanden ist, welcher den Aminosäureresten Nr. 610-618 der GEN-428B12c1 Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:31) entspricht, wodurch ein mutiertes Protein codiert wird, ist es vorhersehbar, daß das menschliche NPIK Spezies einschließt, die aus einer bestimmten Anzahl an Kombinationen hervorgehen, d.h. menschliches NPIK, Deletions-haltiges menschliches NPIK, menschliche NPIK-Mutante und/oder Deletions-haltige menschliches NPIK-Mutante.
Kürzlich wurden mehrere Proteine, die zur Familie gehören, die die oben erwähnten PI3- und 4-Kinasen mit Proteinkinaseaktivität einschließt [Dhand, R. et al., EMBO J., 13, 522-533 (1994); Stack, J.H. und Emr, S.D., J. Biol. Chem. 269, 31552-31562 (1994); Hartley, K.O. et al., Cell, 82, 848-856 (1995)].
Es wurde ebenfalls gezeigt, daß ein Protein, das zu dieser Familie gehört, an der DNA-Reparatur beteiligt ist [Hartley, K.O., et al., Cell, 82, 849-856 (1995)] und das verantwortliche Gen für eine Ataxie ist [Savitsky, K., et al., Science, 268, 1749-1753 (1995)].
Es kann vorhergesehen werden, daß das vom menschlichen NPIK-Gen codierte Protein hochhomolog zur Familie dieser PI-Kinasen ist und ein neues Enzym ist, das Lipide oder Proteine phosphoryliert.
Nach diesem Beispiel wird das neue menschliche NPIK-Gen bereitgestellt. Die Verwendung dieses Gens macht es möglich, die Expression dieses Gens in zahlreichen Geweben nachzuweisen und das menschliche NPIK-Protein durch die Gentechnik herzustellen, und dadurch wird es möglich Lipid- oder Protein-phosphorylierende Enzyme, wie das oben erwähnte zu untersuchen, DNA-Reparatur zu untersuchen, Erkrankungen zu untersuchen oder zu diagnostizieren, an denen sie beteiligt sind, beispielsweise Krebs und Medikamente zur Behandlung oder Prävention zur Begutachtung davon auszumustern.
(4) Konstruktion eines Expressionsvektors für ein Fusionsprotein
Um die codierende Region eines menschlichen NPIK-Gens (GEN-428B12c2) zu subklonieren, wurden zuerst zwei Primer C1 und C2 mit den unten in Tabelle 4 gezeigten Sequenzen auf Grundlage der DNA-Sequenzen, die in (1) oben gewonnen wurden, gebildet. Tabelle 4

Primer Nukleotidsequenz

Primer C1 5'-CTCAGATCTATGGGAGATACAGTAGTGGAGC-3'

Primer C2 5'-TCGAGATCTTCACATGATGCCGTTGGTGAG-3'
Sowohl die Primer C1 als auch C2 haben BglII-Schnittstellen und der Primer C2 ist ein Antisense-Primer.
Unter Verwendung dieser zwei Primer wurde cDNA, die aus menschlichen fötalen Hirn-mRNA stammt, durch PCR amplifiziert, um ein Produkt mit einer Länge von ungefähr 2500 Basen bereitzustellen. Die amplifizierte cDNA wurde mit Ethanol präzipitiert und in den pT7BlueT-Vektor (Produkt von Novagen) inseriert, und die Subklonierung wurde beendet. Die gesamte Sequenz wurde in gleicher Weise wie oben in den Beispielen bestimmt. Als Ergebnis wurde gezeigt, daß dieses Gen einen Polymorphismus hat, der oben in Tabelle 9 gezeigt ist.
Die oben erwähnte cDNA wurde mit BglII gespalten und einer Agarosegelelektrophoese unterworfen. Die cDNA wurde dann aus einem Agarose-Gel ausgeschnitten und unter Verwendung von GENECLEAN II KIT (Produkt von Bio 101) eingesammelt. Die cDNA wurde in pBlueBacHis2B-Vektor inseriert (Produkt von Invitrogen) an der BglII-Spaltstelle und die Subklonierung wurde vollendet.
Der Fusionsvektor, der so erhalten wurde, hatte eine BglII-Spaltstelle und war ein Expressionsvektor für ein Fusionsprotein des vorhergesagten Genprodukts (ungefähr 91 kD) und 38 Aminosäuren stammten vom pBlueBachHis2B-Vektor und enthielten einen Polyhistidin-Bereich und ein Epitop der vom Anti-Express^TM-Antikörper erkannt wird (Produkt von Invitrogen).
(5) Transfektion in die Insektenzelle Sf-9
Das menschliche NPIK-Gen wurde mit dem Baculovirus-Expressionssystem exprimiert. Baculovirus ist ein cyclischer doppelsträngiger pathogener Virus und kann große Menge an Einschlußkörperchen, die als Polyhedrin bezeichnet werden, in den Zellen der Insekten herstellen. Unter Verwendung von Bac-N-Blue^TM-Transfektions-Kit unter Verwendung dieser Eigenschaften des Baculovirus, welcher von Invitrogen entwickelt worden ist, wurde die Baculovirus-Expression durchgeführt.
Genauer gesagt wurden 4 μg des pBlueBacHis2B, welcher den Bereich des menschlichen NPIK-Gens enthält und 1 μg von Bac-N-Blue^TM-DNA (Produkt von Invitrogen) in Sf-9-Zellen in Gegenwart von Insectin^TM-Liposomen (Produkt von Invitrogen) co-transfiziert.
Vor der Co-Transfektion wurde das LacZ-Gen in Bac-N-Blu^TM-DNA inkorporiert, so daß LacZ nur exprimiert werden würde, wenn eine homologe Rekombination zwischen der Bac-N-Blue^TM-DNA und pBlueBacHis2B stattgefunden hat. Daher wurde, wenn die co-transfizierten Sf-9-Zellen auf Agarmedium inkubiert wurden, die Plaques des Virus, welcher das vollständige Gen exprimieren, als blaue Plaques leicht nachgewiesen.
Die blauen Plaques wurden aus jedem Agar ausgeschnitten und in 400 μl Medium suspendiert, um das Virus darin zu dispergieren. Die Suspension wurde einer Zentrifugation unterworfen, um einen Überstand zu ergeben, der das Virus enthält. Sf-9-Zellen wurden mit dem Virus erneut infiziert, um den Titer zu erhöhen, und um eine große Menge infektiöser Viruslösung zu gewinnen.
(6) Herstellung von menschlichem NPIK
Die Expression des vorhergesagten menschlichen NPIK-Gens wurde drei Tage nach der Infektion mit dem Virus wie folgt bestätigt.
Sf-9-Zellen wurden eingesammelt und mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit einem SDS-PAGE-Beladungspuffer für 5 Minuten gekocht und eine SDS-PAGE wurde durchgeführt. Gemäß der Western-Blut-Technik unter Verwendung von Anti-Xpress als Antikörper wurde das vorhergesagte Protein an der Position des vermuteten Molekulargewichts nachgewiesen. Im Gegensatz dazu wurde im Fall von Kontrollzellen, die mit dem Virus nicht infiziert wurden, im gleichen Test keine Bande nachgewiesen, die dem menschlichen NPIK entsprach.
Genauer gesagt, wurden drei Tage nach der Infektion 15 Flaschen (175 cm², FALCON) halb-konfluenter Sf-9-Zellen geerntet und mit PBS gewaschen, gefolgt von einer Resuspendierung in einem Puffer (20 mM Tris/HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA und 1 mM DTT). Die suspendierten Zellen wurden durch 4-maliges Beschallen für 30 Sekunden bei 4°C mit 30 Sekunden Intervallen suspendiert. Die beschallten Zellen wurden einer Zentrifugation unterworfen und der Überstand wurde eingesammelt. Das Protein im Überstand wurde immunpräzipitiert, indem ein Anti-Xpress-Antikörper verwendet wurde und als Aufschlämmung von Protein-A-Sepharose-Kügelchen gewonnen. Die Aufschlämmung wurde mit einem SDS-PAGE Beladungspuffer für 5 Minuten gekocht. SDS-PAGE wurde für die Identifizierung und Quantifizierung von NPIK durchgeführt. Die Aufschlämmung selbst wurde dem folgenden Test unterworfen.
(7) Bestätigung der PI4-Kinaseaktivität
Von NPIK wurde erwartet, daß es die Aktivität zum Einbau von Phosphorsäure an der 4-Position des Inositol-Rings von Phosphatidylinositol (PI) hat, d.h. PI4-Kinaseaktivität.
PI4-Kinaseaktivität von NPIK wurde gemäß dem Verfahren von Takenawa et al. (Yamakawa, A. und Tadenawa, T., J. Biol. Chem., 263, 17555-17560 (1988)) wie unten gezeigt wird untersucht.
Zuerst wurde eine Mischung aus 10 μl einer NPIK-Aufschlämmung (20 mM Tris/HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 1 mM DTT und 50 % Protein-A-Perlen), 10 μl einer PI-Lösung (hergestellt durch das Trocknen von 5 mg der PI-haltigen kommerziellen Chloroform-Lösung in einem Stickstofffluß auf einer Glasröhrchenwand unter Zugabe von 1 ml 20 mM Tris/HCl (pH 7,5)-Puffer und Bilden von Mizellen durch Beschallung), 10 μl eines zugegebenen Puffers (210 mM Tris/HCl (pH 7,5), 5 mM EGTA und 100 mM MgCl₂) und 10 μl destilliertem Wassers hergestellt. Hierzu wurden 10 μl einer ATP-Lösung gegeben (5 μl 500 μM ATP, 4,9 μl destilliertes Wasser und 0,1 μl γ-³²P ATP (6000 Ci/mmol, Produkt von NEN Co., Ltd.)). Die Reaktion wurde bei 30°C gestartet und für 2, 5, 10 und 20 Minuten fortgesetzt. Der Zeitpunkt 10 Minuten wurde als Inkubationszeit ausgewählt, da ein gradliniger Anstieg bei ungefähr 10 Minuten bei Einbau der Phosphorsäure in PI beobachtet wird, indem das Verfahren, das unten beschrieben wird, getestet wurde.
Nach der Beendigung der Reaktion wurde PI durch das Lösungsmittel-Extraktionsverfahren fraktioniert und schließlich in Chloroform resuspendiert. Die Suspension wurde durch Dünnschichtchromatographie (TLC) entwickelt und die Radioaktivität des Reaktionsproduktes an der PI4P-Position wurde unter Verwendung eines Analysegeräts untersucht (Warenname: Bio-Image; Produkt von Fuji Photo Film Co., Ltd.).
1 zeigt die Ergebnisse. 1 ist ein anlytisches Diagramm der Ergebnisse der Untersuchung der Radioaktivität auf Grundlage der oben erwähnten TLC. Die rechte Spur (2) ist die Fraktion des Sf-9-Zell-Cytoplasmas, das mit dem NPIK-haltigen Virus infiziert wurde, während die linke Spur (1) die Fraktion nicht-identifizierten Sf-9-Zellcytoplasmas ist.
Ferner wurden vorherbestimmten Mengen an Triton X-100 und Adenosin zu dem oben erwähnten Reaktionssystem hinzugegeben, um zu überprüfen, wie eine derartige Zugabe die PI4-Kinaseaktivität beeinflussen würde. Die PI4-Kinaseaktivität wurde in gleicher Weise wie oben untersucht.
2 zeigt die Ergebnisse. Die Ergebnisse bestätigten, daß NPIK eine typische PI4-Kinaseaktivität hat, die durch Triton X-100 beschleunigt wird und durch Adenosin inhibiert wird.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Menschliches NPIK-Gen, umfassend eine Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz codiert, die in SEQ ID NO: 28 gezeigt ist.
Menschliches NPIK-Gen, umfassend eine Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 29 gezeigt ist.
Menschliches NPIK-Gen wie in Anspruch 2 definiert, welches die in SEQ ID NO: 30 gezeigte Nukleotidsequenz hat.
Menschliches NPIK-Gen, umfassend eine Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz codiert, die in SEQ ID NO: 31 gezeigt ist.
Menschliches NPIK-Gen, umfassend eine Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 32 gezeigt ist.
Menschliches NPIK-Gen wie in Anspruch 5 definiert, welches die in SEQ ID NO: 33 gezeigte Nukleotidsequenz hat.