DE69736739T2

DE69736739T2 - Stabilisierte wachstumshormon zubereitung und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE69736739T2
Application number: DE69736739T
Authority: DE
Inventors: Kevin Michael Alphington McNAMARA; Neil William Parkville CHARMAN; Ann Susan Parkville CHARMAN
Original assignee: CSL Ltd; Monash University
Current assignee: CSL Ltd; Monash University
Priority date: 1996-02-12
Filing date: 1997-02-12
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2017-02-13
Also published as: TR199801558T2; CN1132626C; ATE340587T1; EP0889733A4; WO1997029767A1; US6593296B1; CN1214633A; DK0889733T3; DE69736739D1; CA2246501A1; JP2000504696A; CA2246501C; JP4255515B2; AUPN801296A0; EP0889733A1; RU2191029C2; HK1017851A1; EP0889733B1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft stabilisierte Wachstumshormon(GH)-formulierungen und insbesondere flüssige Formulierungen von humanem Wachstumshormon (hGH), die durch die Einarbeitung von stabilisierenden Streckmitteln stabilisiert sind. Diese flüssigen Formulierungen von hGH weisen verbesserte chemische und physikalische Stabilität auf. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung dieser stabilisierten GH-Formulierungen.
Hintergrund der Erfindung
Die Wachstumshormone von Menschen und tierischen Lebewesen sind Proteine, die etwa 191 Aminosäuren enthalten, die im Hypophysenvorderlappen gefunden werden. Eine biologische Hauptwirkung von GH ist die Förderung der Somatogenese bei jungen Menschen und Tieren und die Aufrechterhaltung von Geweben bei älteren Wesen. Durch GH beeinflusste Organe umfassen das Skelett, die Muskeln, Bindegewebe und die Eingeweide. Wachstumshormon wirkt durch Interaktion mit spezifischen Rezeptoren auf den Zielzellmembranen.
Humanes Wachstumshormon (hGH) ist ein Schlüsselhormon, das an der Regulation des normalen humanen somatischen Wachstums beteiligt ist und auch eine Vielzahl von physiologischen und Stoffwechselfunktionen, die Knochenlängenwachstum, Laktation, und zelluläre Energieverwendung unter anderem umfassen, beeinflusst. Ein Mangel an hGH bei jungen Kindern führt zu einer kurzen Statur und dieser Zustand wird durch exogene Verabreichung von hGH behandelt.
In der Vergangenheit wurde die Aufmerksamkeit auf die Bestimmung der molekularen Funktionen der Wachstumshormone verschiedener Arten konzentriert. Kommerzielles Interesse besteht stark in sowohl medizinischen als auch veterinärmedizinischen Kreisen und das hGH-Gen wurde kloniert. Sowohl hGH als auch ein Derivat desselben, Methionyl-hGH (met-hGH), werden nun biosynthetisch in Säuger- und Bakterienzellkultursystemen produziert.
Damit hGH als therapeutische pharmazeutische Zubereitung kommerziell verfügbar ist, müssen stabile Formulierungen hergestellt werden. Derartige Formulierungen müssen zur Beibehaltung von Aktivität während passender Lagerungszeiten fähig sein, sie müssen ohne weiteres formuliert werden und zur Verabreichung durch Patienten akzeptabel sein.
Humanes GH wurde auf eine Vielzahl von Wegen formuliert. Beispielsweise offenbart das US-Patent 5 096 885 eine stabile, pharmazeutisch akzeptable Formulierung von hGH, die zusätzlich zu hGH Glycin, Mannit, einen Puffer und optional ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel umfasst, wobei das Molverhältnis hGH:Glycin 1:50–200 beträgt. Die WO 93/19776 offenbart injizierbare Formulierungen von GH, die Citrat als Puffersubstanz und optional Wachstumsfaktoren wie insulinähnliche Wachstumsfaktoren oder epidermalen Wachstumsfaktor, Aminosäuren, wie Glycin oder Alanin, Mannit oder andere Zuckeralkohole, Glycerin und/oder ein Konservierungsmittel, wie Benzylalkohol, umfassen. Die internationale Patentveröffentlichung WO 94/01398 offenbart eine GH-Formulierung, die hGH, einen Puffer, ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel und optional Mannit, ein Neutralsalz und/oder ein Konservierungsmittel enthält.
In der europäischen Patentveröffentlichung 0131864 (und dem entsprechenden australischen Patent 579016) wird eine wässrige Lösung von Proteinen mit einem Molekulargewicht von über 8500 Dalton, die vor Adsorption an Grenzflächen, gegen eine Denaturierung und gegen ein Ausfällen des Proteins durch Zugabe einer eine lineare Polyoxyalkylenkette enthaltenden, oberflächenaktiven Substanz als Stabilisierungsmittel geschützt wurde, offenbart.
Die europäische Patentveröffentlichung 0211601 offenbart eine wachstumsfördernde Formulierung, die ein wässriges Gemisch von einem wachstumsfördernden Hormon und einem Blockcopolymer, das Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Einheiten enthält und ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 1100 bis etwa 40000 aufweist, umfasst, die die Fluidität des wachstumsfördernden Hormons und dessen biologische Aktivität bei Verabreichung beibehält. Die anschließende europäische Patentveröffentlichung 0303746 offenbart verschiedene andere Stabilisierungsmittel für wachstumsförderndes Hormon in wässrigen Umgebungen, die bestimmte Polyole, Aminosäuren, Polymere von Aminosäuren mit einer geladenen Seitengruppe bei physiologischem pH-Wert und Cholinsalze umfassen.
Pharmazeutische Zubereitungen von hGH tendieren, insbesondere in Lösung, dazu, instabil zu sein. Chemisch abgebaute Spezies, wie desamidierte oder sulfoxylierte Formen von hGH kommen vor und Dimere oder aggregierte Spezies mit höherem Molekulargewicht können infolge physikalischer Instabilität auftreten (Becker et. al (1988) Biotechnol Applied Biochem 10, 326; Pearlman und Nguyen (1989), In D. Marshak und D. Liu (Hrsg.), Therapeutic Peptides and Proteins, Formulations, Delivery and Targetting, Current Communications in Molecular Biology, Cold-Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, New York, S. 23–30; Becker et. al (1987) Biotechnol Applied Biochem 9, 478).
Als Folge der Instabilität von hGH in Lösungen tendieren pharmazeutische Formulierungen von hGH dazu, in lyophilisierter Form präsentiert zu werden, die dann vor der Verwendung rekonstituiert werden muss. Eine Lyophilisierung wird häufig zum Aufrechterhalten von biologischer Aktivität und biochemischer Integrität von Polypeptiden in einem Bereich von Lagerungsbedingungen, bei denen die Stabilität in Lösung nicht adäquat ist, verwendet, jedoch wäre es vorteilhaft, eine Lyophilisierung zu vermeiden, da diese eine kostenaufwendige und zeitaufwendige Produktionsstufe ist. Lyophilisierte Formulierungen von hGH werden vor der Verwendung, üblicherweise durch die Zugabe eines pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittels, wie steriles Wasser zu Injektionszwecken, sterile physiologische Kochsalzlösung oder ein geeignetes steriles, physiologisch akzeptables Verdünnungsmittel, rekonstituiert. Rekonstitutierte Lösungen von hGH werden vorzugsweise bei 4°C zur Minimierung chemischer und physikalischer Abbaureaktionen aufbewahrt, jedoch erfolgt ein gewisser Abbau während einer derartigen Lagerung, die über einen Zeitraum von bis zu 14 Tagen erfolgen kann.
Eine pharmazeutische Formulierung von hGH, die in flüssiger Form bereitgestellt wird, insbesondere eine, die Stabilität von hGH über einen längeren Zeitraum beibehält, wäre besonders vorteilhaft. Wie oben beschrieben sind derzeitige flüssige Formulierungen im Hinblick auf die Lagerungsdauer durch die Produkte chemischer und physikalischer Abbaureaktionen, die während der Herstellung und Lagerung auftreten, beschränkt. Die mit Dimerbildung in Verbindung stehenden Probleme wurden bei Becker et. al (1987), aaO, angegeben und frühere Versuche zur Vermeidung der Bildung von hGH-Dimer waren nicht erfolgreich.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung stabiler flüssiger Formulierungen von hGH, die nicht zur Bildung unerwünschter aggregierter Spezies führen oder chemische Veränderungen verursachen, die die biologische Aktivität verringern oder die Rezeptorerkennung verändern. Eine weitere Aufgabe ist die Bereitstellung einer Formulierung, die über eine nadellose Injektionsvorrichtung zugeführt werden kann, zur subkutanen Injektion oder zur pulmonalen Verwendung als Aerosol bereitgestellt werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung einer stabilen flüssigen Formulierung von Wachstumshormon, vorzugsweise humanem Wachstumshormon, die Wachstumshormon, einen Puffer und eine zur Stabilisierung wirksame Menge von mindestens einem Stabilisierungsmittel, das aus der Gruppe von

(i) nichtionischen grenzflächenaktiven Mitteln eines Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymers,
(ii) Taurocholsäure oder Salzen oder Derivaten derselben und
(iii) Methylcellulosederivaten

Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf eine stabile flüssige Formulierung von Wachstumshormon, die durch das Verfahren erhältlich ist, das oben breit beschrieben ist. Die Formulierung kann zur Verwendung als Arzneimittel dienen.
Durchgängig in dieser Beschreibung sind, falls es der Zusammenhang nicht anders erfordert, das Wort "umfassen" oder Variationen wie "umfasst" oder "umfassend" so zu verstehen, dass sie den Einschluss einer angegebenen Zahl oder Gruppe von Zahlen, jedoch nicht den Ausschluss von irgendeiner anderen Zahl oder einer Gruppe von Zahlen implizieren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren der Erfindung zur Herstellung einer stabilisierten, pharmazeutisch akzeptablen flüssigen Formulierung von humanem Wachstumshormon, die

(a) eine pharmazeutisch wirksame Menge von hGH,
(b) 0,01–5,0% (Gew/V) von mindestens einem Stabilisierungsmittel, das aus der oben breit definierten Gruppe ausgewählt ist, und
(c) einen pharmakologisch akzeptablen Puffer umfasst, verwendet.

Vorzugsweise umfasst diese Formulierung 0,05–2,0 (Gew/V), noch besser 0,08–1,0% (Gew/V) des Stabilisierungsmittels bzw. der Stabilisierungsmittel.
Besonders bevorzugte Stabilisierungsmittel sind Pluronic-Polyole, Taurocholsäure und deren Salze und Hydroxypropylmethylcellulose.
Die stabilisierte flüssige Formulierung von Wachstumshormon enthält vorzugsweise auch einen pharmakologisch akzeptablen Puffer, wie einen Phosphat- oder Citratpuffer, mit einer Konzentration von 2,5–50 mM, noch besser 10–20 mM.
Der pH-Wert der Formulierung beträgt vorzugsweise 5,0 bis 7,5, noch günstiger 5,0 bis 6,8, noch günstiger 5,2 bis 6,5 und noch besser 5,4 bis 5,8.
Bei der Herstellung der stabilisierten flüssigen Formulierung von Wachstumshormon wird das Wachstumshormon mit dem Puffer unter derartigen Bedingungen gemischt, dass das Wachstumshormon keinen Pufferkonzentrationen, die größer als das Zweifache der Endkonzentration des Puffers in der Formulierung sind, ausgesetzt wird und anschließend das bzw. die Stabilisierungsmittel zu dem Gemisch unter entsprechenden Bedingungen gegeben werden.
In einem besonders bevorzugten Verfahren zur Herstellung der stabilisierten flüssigen Formulierung von Wachstumshormon ist die Exposition von Wachstumshormon auf Konzentrationen eines Phosphat- oder Citratpuffers und von Pluronic-Polyolen von nicht größer als der zweifachen Endkonzentration jeder Komponente beschränkt.
Stabile flüssige Formulierungen der vorliegenden Erfindung können in einem Verfahren zur Behandlung eines Human- oder Tierpatienten, der Wachstumshormon benötigt, verwendet werden, wobei das Verfahren die Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge einer stabilen flüssigen Formulierung eines Wachstumshormons, die oben breit beschrieben ist, an den Patienten umfasst.
Die flüssige GH-Formulierung kann durch Bolusinjektion, mit einer Aerosolvorrichtung oder einer nadellosen Injektionspistole oder durch kontinuierliche IV-Infusion verabreicht werden.
Im vorliegenden Zusammenhang sollen Verweise auf "Wachstumshormon" alle Arten von GH, die GH von Mensch, Rind, Schwein, Schaf und Lachs unter anderen, insbesondere hGH umfassen, sowie biologisch aktive Derivate von GH umfassen. Derivate von GH sollen GH einer humanen oder Tierspezies mit Variationen der Aminosäuresequenz, beispielsweise kleine Deletionen von Aminosäuren oder Austausch von Aminosäuren durch andere Aminosäurereste, umfassen. Ebenfalls umfasst werden verkürzte Formen von GH und Derivate derselben sowie GH mit Aminosäureadditionen am amino- oder carboxylterminalen Ende des Proteins, wie Methionyl-hGH. Eine andere Art einer hGH-Modifikation ist die durch kovalente Addition von Polyethy lenglykol an reaktive hGH-Aminosäuren gebildete (Davis et. al, US-Patent 4 179 337).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Das durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte Verfahren zur Herstellung von flüssigen Formulierungen von GH und Stabilisierungsmitteln führt zu einer stabilen flüssigen GH-Formulierung, die für längere Lagerung bei Temperaturen unter dem Gefrieren und über dem Gefrieren und zur therapeutischen Verabreichung geeignet ist. Therapeutische Formulierungen, die diese Stabilisierungsmittel enthalten, sind stabil, während sie immer noch eine therapeutische Verabreichung der Formulierung ermöglichen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das GH hGH.
(1) Humane Wachstumshormonzusammensetzungen
Die Ausdrücke "humanes Wachstumshormon" oder "hGH" bezeichnen humanes Wachstumshormon, das beispielsweise durch Extraktion und Reinigung von hGH von natürlichen Quellen oder durch rekombinante Zellkultursysteme produziert wurde. Die Sequenz von hGH und dessen Eigenschaften sind beispielsweise in Hormone Drugs, Gueriguigan et. al, USP Convention, Rockville, MD (1982), beschrieben. Wie oben beschrieben decken die Ausdrücke auch biologisch aktive humane Wachstumshormonäquivalente ab, die im Hinblick auf eine oder mehrere Aminosäuren in der Gesamtsequenz von hGH verschieden sind, die insbesondere met-hGH umfassen. Die Ausdrücke sollen auch Substitutions-, Deletions- und Insertionsaminosäurevarianten von hGH oder posttranslationale Modifikationen abdecken. Das in den Formulierungen der vorliegenden Erfindung verwendete hGH wird allgemein durch rekombinante Mittel wie im Vorhergehenden diskutiert produziert.
Eine "pharmazeutisch wirksame Menge" von GH, insbesondere hGH, bezeichnet die Menge, die eine therapeutische Wirkung in verschiedenen Verabreichungsprotokollen ergibt. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können derart hergestellt werden, dass sie Mengen an GH von mindestens etwa 0,1 mg/ml bis etwa 20 mg/ml oder mehr, vorzugsweise etwa 1 mg/ml bis etwa 10 mg/ml, insbesondere etwa 1 mg/ml bis etwa 5 mg/ml enthalten.
(2) Puffer und pH-Wert
Der Puffer kann ein beliebiges pharmazeutisch akzeptables Puffermittel, wie Phosphat, Tris-HCl, Citrat und dergleichen, sein. Der bevorzugte Puffer ist ein Phosphat- oder Citratpuffer. Eine Pufferkonzentration von größer als oder gleich 2 mM und weniger als 50 mM ist bevorzugt, noch günstiger 10–20 mM. Geeignete pH-Bereiche, die mit Puffer eingestellt werden, zur Herstellung der Formulierungen hierfür sind etwa 5 bis etwa 7,5, noch günstiger etwa 5,8. Der pH-Wert der Formulierung sollte weniger als 7,5 betragen, um eine Desamidierung von GH zu verringern.
(3) Stabilisierungsmittel
Gemäß der vorliegenden Erfindung enthält die Formulierung ein oder mehrere Stabilisierungsmittel für verstärkte GH-Stabilität. Das Stabilisierungsmittel kann ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel eines Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymers, beispielsweise ein Pluronic-Polyol, beispielsweise Pluronics F127, F68, L64, PE6800 und PE6400, Gallensalz, wie ein Taurocholsäuresalz oder ein Derivat desselben, oder ein Methylcellulosederivat, wie Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), sein. Die Formulierung kann ein einziges Stabilisierungsmittel oder eine Kombination von zwei oder mehreren derselben enthalten.
Die Konzentration des bzw. der zugesetzten Stabilisierungsmittel(s) wird durch die Wahl von Puffer und pH-Wert bestimmt, sie liegt jedoch im Bereich von 0,01 bis 5,0%, noch günstiger 0,05 bis 2,0% und noch besser 0,08 bis 1,0 auf der Basis von Gewicht/Volumen. Die Verwendung von Stabilisierungsmitteln verbessert die Formulierungsstabilität, wenn sie einer längeren Lagerung über einen Bereich von Temperaturen, die unter Gefrieren und über Gefrieren umfassen, unterzogen wird oder wenn die Formulierung einer Grenzflächenbelastung unterworfen wird.
Das bzw. die Stabilisierungsmittel verbessern die Formulierungsstabilität gegenüber Grenzflächenbelastung mit zunehmender Konzentration. Jedoch verringert eine zunehmende Konzentration von Stabilisierungsmittel(n) die chemische Stabilität. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Konzentration von Stabilisierungsmittel(n) so optimiert, dass hohe Stabilität gegenüber einer Grenzflächenbelastung mit minimaler zusätzlicher chemischer Instabilität erreicht wird.
(4) Bevorzugte Formulierung von Stabilisierungsmitteln und hGH
Bei der Herstellung einer Formulierung gemäß der vorliegenden Erfindung werden ein oder mehrere Stabilisierungsmittel zu einer flüssigen hGH-Formulierung gegeben. Wie oben beschrieben wird während der Formulierung das Wachstumshormon Pufferkonzentrationen, die nicht mehr als das Zweifache der Endkonzentration des Puffers betragen, ausgesetzt, und vorzugsweise werden das bzw. die Stabilisierungsmittel der Formulierung unmittelbar vor der Endvolumeneinstellung zugesetzt. Die gebildeten Formulierungen weisen erhöhte Stabilität gegenüber Denaturierung auf und sind für unerwünschte Reaktionen, die während der Behandlung und Lagerung auftreten können, nicht empfänglich. Der darin verwendete Ausdruck Behandlung umfasst Filtration, Einfüllen von hGH-Lösungen in Ampullen und andere Manipulationen, die an der Herstellung der Formulierungen beteiligt sind.
Flüssige Formulierungen von hGH zur therapeutischen Verabreichung können durch Kombination von hGH und Stabilisierungsmitteln mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit physiologisch akzeptablen Streckmitteln, Puffern oder Konservierungsmitteln (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Osol, Hrsg. (1980)) hergestellt werden. Akzeptable Streckmittel sind diejenigen, die für den Patienten in den verwendeten Konzentrationen und Dosierungen nicht-toxisch sind, und sie umfassen Puffer, Konservierungsmittel, Antioxidationsmittel, pH- und Tonizitätsmodifizierungsmittel.
Die flüssige Formulierung von Wachstumshormon kann auch, falls gewünscht, ein oder mehrere andere Stabilisierungsstreckmittel umfassen. Zusätzliche Stabilisierungsstreckmittel können beispielsweise Aminosäuren, wie Glycin oder Alanin, Mannit oder andere Zuckeralkohole, oder Glycerin umfassen. Ferner kann die flüssige Formulierung andere Wachstumsfaktoren, wie insulinähnliche Wachstumsfaktoren oder epidermalen Wachstumsfaktor, umfassen.
Die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ergibt ein Mittel zur wirksamen Stabilisierung von hGH. Die bevorzugte Formulierung enthält ein oder mehrere Stabilisierungsmittel, die aus Pluronic-Polyolen, Taurocholsäure oder Salzen oder Derivaten derselben und Methylcellulosederivaten ausgewählt sind. Die Formulierung enthält vorzugsweise im Wesentlichen reines hGH, das frei von kontaminierenden Peptiden oder Proteinen oder infektiösen Mitteln, die in einem Menschen gefunden werden, ist. Formulierungen dieser bevorzugten Ausführungsform können zusätzlich pharmazeutisch akzeptable Additive enthalten. Diese umfassen beispielsweise Puffer, Isotonizitäts- und pH-Modifizierungs mittel, Chelatbildner, Konservierungsmittel, Antioxidationsmittel, Colösemittel und dergleichen, wobei spezielle Beispiele hierfür Citratsalze, Phosphatsalze und dergleichen umfassen können. Ein Konservierungsmittel kann zugegeben werden, wenn die vorweggenommene Verwendung der Formulierung Sterilität gefährden kann, und in einem derartigen Fall kann ein pharmazeutisch akzeptables Konservierungsmittel, wie Benzylalkohol oder Phenol, verwendet werden.
Die erhöhte Stabilität von hGH, die durch die Formulierung, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, bereitgestellt wurde, erlaubt eine breitere Verwendung von hGH-Formulierungen, die stärker konzentriert als die üblicherweise bei der Verwendung in Abwesenheit von Stabilisierungsmitteln sein können. Beispielsweise verringern stabilisierte flüssige hGH-Formulierungen auch das Auftreten einer oberflächeninduzierten Denaturierung von hGH, die während einer Aerosolbildung oder nadellosen Injektion einer hGH-Formulierung auftritt. Eine weitere optimale Dispensierung der hGH-Formulierungen kann erfolgen, wobei die hGH-Formulierungen der vorliegenden Erfindung in Ampullen mit 1–50 mg/Ampulle, vorzugsweise 2–25 mg/Ampulle und noch besser 3–10 mg/Ampulle dispensiert werden. Die erhöhte Stabilität von hGH-Formulierungen ermöglicht eine langzeitige Lagerung bei einer geeigneten Temperatur, beispielsweise unter Gefrieren (vorzugsweise bei –20°C) oder über Gefrieren, vorzugsweise bei 2–8°C, noch besser bei 4°C.
Zur in-vivo-Verabreichung zu verwendende Formulierungen von hGH müssen steril sein. Dies wird durch Filtration über Sterilfiltrationsmembranen ohne weiteres erreicht.
Therapeutische flüssige hGH-Formulierungen werden generell in einen Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung, beispielsweise einen Beutel oder eine Ampulle einer intravenösen Lösung mit einem Stopfen, der durch eine hypodermale Injektionsnadel durchstoßen werden kann, gegeben.
Der Verabreichungsweg der flüssigen hGH-Formulierungen gemäß der vorliegenden Erfindung entspricht bekannter Praxis, beispielsweise eine Injektion oder Infusion auf intravenösem, intraperitonealem, intrazerebralem, intramuskulärem, intraokularem, intraarteriellem oder intraläsionalem Weg oder durch kontinuierliche IV-Infusion.
Weitere Merkmale der vorliegenden Erfindung werden aus den folgenden Beispielen und den beigefügten Zeichnungen deutlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die chemische Stabilität von hGH (1,5 mg/ml) in 5 mM Phosphatpuffer, pH 6,0–7,5.
2 zeigt die Abhängigkeit der Aggregation von hGH (2 mg/ml in 10 mM Acetatpuffer, pH 4,1–4,5 oder 5 mM Phosphatpuffer, pH 6,0–7,5), die durch Grenzflächenbelastung (Verwirbelungsrühren) induziert wird, vom pH-Wert der Lösung.
3 fasst graphisch die Fähigkeit verschiedener Stabilisierungsmittel zur Verringerung der Ausfällung von aggregiertem hGH, die durch Grenzflächenbelastung (Verwirbelungsrühren) induziert wird, zusammen.
4 zeigt die Stabilität von zwei hGH (5 mg/ml)-Formulierungen, die sich nur im Hinblick auf das Verfahren zur Einführung des hGH zu den Streckmitteln unterscheiden, und einer dritten hGH-Formulierung, der 0,005% (Gew/V) EDTA zugesetzt wurde.
Beispiele
Beispiel 1 Verfahren zum Screening von Stabilisierungsmitteln
Die Fähigkeit von Stabilisierungsmitteln zur Verringerung oder Verhinderung einer GH- und insbesondere einer hGH-Aggregation als Reaktion auf Grenzflächenbelastung wurde unter Verwendung eines raschen Aggregationsverfahrens beurteilt und durch Größenausschlusschromatographie (SEC) analysiert. Die Chromatographie von hGH wurde unter Verwendung von zwei TSK G3000SW-Säulen (7,8 mm i.d. × 300 mm, Toyo Sodo, Japan) in Reihe durchgeführt. Die mobile Phase bestand aus 0,1M Phosphat-Puffer, pH 7,0, und sie wurde mit einer Durchflussrate von 0,9 ml/min gepumpt. Die Elution von hGH wurde durch UV-Extinktion bei 214 nm unter Verwendung eines Probenvolumens von 20 μl detektiert.
Das rasche Aggregationsverfahren umfasste die Einführung einer großen Luft/Wasser-Grenzfläche durch Verwirbelungsrühren von hGH-Lösungen mit einer konstanten Geschwindigkeit während 15–60 s in durch eine Kappe verschlossenen Polypropylenröhrchen (11 mm i.d. × 74 mm). Die Proben wurden 30 min bei Raumtemperatur equilibriert, damit eine Ausfällung erfolgen konnte, dann über 0,2-μm-Celluloseacetatmikrozentrifugenfilter filtriert und das Filtrat wurde durch SEC analysiert. Kontrolllösungen jeder Probe, die keine Behandlung erhielten, waren in der SEC-Analyse enthalten.
Die Menge des gesamten verbleibenden löslichen hGH (Peakfläche von Monomerenspezies und Spezies mit höherem Molekulargewicht) wurde als Prozentsatz der Gesamtpeakfläche (aufgrund von hGH) der entsprechenden unbehandelten Kontrolllösung ausgedrückt.
Die Tabelle 1 zeigt die Wirkung verschiedener Stabilisierungsmittel auf das Ausmaß einer durch Grenzflächenbelastung induzierten Aggregation von hGH bei pH 7,0.
Die Tabelle 2 zeigt die Wirkung verschiedener Stabilisierungsmittel auf das Ausmaß einer durch Grenzflächenbelastung induzierten Aggregation von hGH bei pH 6,0.
Die Tabelle 3 zeigt die Wirkung verschiedener Stabilisierungsmittel auf das Ausmaß einer durch Grenzflächenbelastung induzierten Aggregation von hGH bei pH 5,6.
Die Tabelle 4 zeigt die Wirkung einer Isotonizitätseinstellung auf das Ausmaß der Aggregation von hGH (1,5 mg/ml) in verschiedenen Puffern bei pH 5,6.
Die Tabelle 5 zeigt die Wirkung verschiedener Stabilisierungsmittel auf das Ausmaß der Aggregation von durch Einfrieren/Auftauen induzierter Aggregation von hGH bei pH 5,6.
Wie aus den beigefügten Tabellen ersichtlich ist, war eine Zahl von Streckmitteln zur Verringerung oder Verhinderung einer Aggregation von hGH, die durch Grenzflächenbelastung induziert wurde, sehr wirksam. Pluronic-Polyole ergaben einen nahezu quantitativen Schutz in Konzentrationen von über 0,05% (Gew/V), wobei nur monomeres hGH verblieb. Taurocholat ergab einen nahezu quantitativen Schutz in Konzentrationen von über 0,02% (Gew/V), wobei nur monomeres hGH verblieb. Taurodesoxycholat war als Stabilisierungsmittel bei einem pH-Wert von 5,6 nicht geeignet, da es eine Dimerisierung von hGH in Abwesenheit von Grenzflächenbelastung verursachte. Tabelle 1 Aggregation von hGH (1,5 mg/ml) in Gegenwart von Streckmitteln bei pH 7,0, die durch Grenzflächenbelastung induziert wurde
Tabelle 2 Aggregation von hGH (1,5 mg/ml) in Gegenwart von Streckmitteln bei pH 6,0, die durch Grenzflächenbelastung induziert wurde

Tabelle 3 Aggregation von hGH (1,5 mg/ml) in Gegenwart von Streckmitteln bei pH 5,6, die durch Grenzflächenbelastung induziert wurde

* in Gegenwart von Taurodesoxycholat erfolgte Dimerisierung in Abwesenheit von Grenzflächenbelastung

Aggregationseigenschaften von hGH (1,5 mg/ml, pH 5,6) in Citrat- oder Phosphatpuffern (5 oder 20 mM) mit oder ohne zugesetztem Natriumchlorid (für Isotonizität) wurden untersucht, da berichtet wurde, dass die Aggregation von der Phosphatkonzentration abhängig ist (Pearlman und Nguyen, 1992, J. Pharm. Pharmacol. 44: 178–185).
Dem experimentellen Verfahren, das zuvor beschrieben wurde, wurde mit einer Modifikation der Behandlungsdauer (15 s) gefolgt. Tabelle 4 Aggregation von hGH (1–5 mg/ml) in verschiedenen Puffersystemen bei pH 5,6

^a Monomer plus Spezies mit höherem Molekulargewicht
^b unzureichende hGH-Löslichkeit

Es wurde nicht ermittelt, dass die Aggregation von hGH von der Natur des Puffers oder der Pufferkonzentration abhängig war. Die Aggregation von hGH stand in inverser Beziehung zur Ionenstärke (bei Einstellung mit NaCl).
Die Aggregation von hGH (1,5 mg/ml in 20 mM isotonischem Citratpuffer, pH 5,6) in Gegenwart von Streckmitteln, die durch Gefrieren/Auftauen induziert wurde, wurde untersucht. Proben von hGH (100 μl) in Gegenwart verschiedener Streckmittel wurden bei –20°C 24 h eingefroren, dann bei Raumtemperatur aufgetaut und 30 min equilibrieren gelassen, damit eine Ausfällung erfolgen konnte. Die Analyse gefilterter Proben wurde durch SEC wie zuvor beschrieben durchgeführt. Tabelle 5 Aggregation von hGH (1,5 mg/ml) in Gegenwart von Streckmitteln bei pH 5,6, die durch Gefrieren/Auftauen induziert ist
Die Aggregation von hGH nach Gefrieren/Auftauen war nicht übermäßig, wurde jedoch durch die Zugabe von Streckmitteln nicht erhöht.
Beispiel 2
1 ist ein repräsentatives Profil der chemischen Stabilität von hGH (1,5 mg/ml) in 5 mM Phosphatpuffer, pH 6,0–7,5 (bei 40°C gelagert). Abgebaute Proben wurden durch Umkehrphasenhochleistungsflüssigchromatographie (RP-HPLC) nach dem Verfahren gemäß der Beschreibung in der United States Pharmacopoeia (USP 1990) unter Verwendung einer Vydac C-4-Säule analysiert. Abbauprodukte wurden nach dem Verfahren gemäß der Beschreibung in US Pharmacopeial Previews, Nov–Dez, 1990, als Desamido-hGH oder oxidiertes hGH identifiziert. Die in einer abgebauten Probe vorhandene Menge an nativem hGH (Panel A), Desamido-hGH (Panel B) und oxidiertem hGH (Panel C) wurde als Prozent der Peakfläche (für natives hGH oder abgebaute Spezies), bezogen auf die Gesamtpeakfläche (aufgrund von hGH) für pH 6,0 (o), pH 6,5 (⦁), pH 7,0 (∇) und pH 7,5
ausgedrückt.
Es wurde ermittelt, dass die Abnahme von nativem hGH einer Kinetik erster Ordnung im pH-Bereich von 6,0–7,5 und Arrhenius-Verhalten im Temperaturbereich von 8–40°C folgte. Die Geschwindigkeitskonstanten erster Ordnung bei 40°C wurden im Bereich von 2,4 × 10^–2 d^–1 bei pH 6, 0 bis 7,4 × 10^–2 d^–1 bei pH 7,5 ermittelt. Desamidation und Oxidation waren die Hauptabbauwege von hGH, was mit veröffentlichten Berichten konsistent ist (Pearlman und Nguyen, 1989, aaO). Desamido-hGH bildete sich mit einer rascheren Geschwindigkeit als oxidiertes hGH. Die chemische Stabilität war bei einem pH-Wert von 6,0 oder darunter verstärkt.
2 zeigt die Aggregation und Ausfällung von hGH (2 mg/ml) in 10 mM Acetatpuffer (pH 4,1–4,5) oder 5 mM Phosphatpuffer (pH 6,6–7,5), die durch Grenzflächenbelastung unter Verwendung von Verfahren gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 induziert wurde. Die Menge an monomerem hGH (Peakfläche aufgrund von Monomer) oder gesamtem löslichem hGH (Peakfläche aufgrund von Monomer plus aggregierter Spezies höherer Ordnung), das verbleibt, wurde als Prozentsatz, bezogen auf die Peakfläche der entsprechenden unbehandelten Kontrolllösung, ausgedrückt. Die Daten stellen die Menge von löslichem monomerem hGH (Panel A) oder verbleibenden gesamtem löslichem hGH (Panel B), das nach Verwirbeln während 30 s (o) oder 60 s (⦁) verbleibt, dar.
Die Aggregation und anschließende Ausfällung von hGH war im Bereich von pH 5 bis 6 maximal. Nur monomeres hGH verblieb nach einer Grenzflächenbelastung im pH-Bereich von 4,1–6,0 in der Lösung. Lösliche aggregierte Spezies (Dimere und Aggregate höherer Ordnung) waren nur im pH-Bereich von 7,0–7,5 vorhanden.
3 zeigt die Wirkung von Streckmitteln (% (Gew/V)) auf die Aggregation von hGH (1,5 mg/ml in 5 mM Phosphatpuffer, pH 5,6), die durch Grenzflächenbelastung durch Verwirbeln mit konstanter Geschwindigkeit während 60 s gemäß der Beschreibung bei 2 induziert wurde. Die Daten stellen den Prozentsatz von verbleibendem gesamtem löslichem hGH (Monomer plus aggregierte Spezies höherer Ordnung) nach der Behandlung, ausgedrückt als Prozentsatz, bezogen auf die Peakfläche aufgrund von hGH durch SEC-Analyse der entsprechenden Kontrolllösung in Gegenwart von Pluronic F-68 (o), Pluronic F-127 (⦁), Natriumtaurocholat (∇) oder HPMC
dar.
In Abwesenheit von Streckmitteln verblieben weniger als 1 hGH in der Lösung. Die Zugabe von Pluronic-Polyolen, Taurocholat oder HPMC führte zu einer wesentlichen Erhöhung von verbleibendem löslichem hGH. Pluronics-F68 und F-127 und Taurocholat insbesondere ergaben einen nahezu quantitativen Schutz von hGH vor einer Aggregation.
Beispiel 3
4 zeigt die Wirkung eines Verfahrens zur Formulierung auf die Stabilität von hGH-Formulierungen. Die Formulierung 1 wurde durch Konzentration einer gereinigten hGH-Lösung auf 7–7,5 mg/ml und Zugabe eines zweifachen Konzentrats einer Lösung, die alle Streckmittel enthielt, die auf einen pH eingestellt wurde, die eine flüssige Formulierung eines pH-Werts von 5,6 ohne weitere Einstellung ergibt, und eine letzte Einstellung mit Wasser zum Erreichen einer Endkonzentration von hGH von 5 mg/ml hergestellt.

Die Formulierung 2 wurde durch Pufferaustausch hergestellt und eine gereinigte hGH-Lösung wurde zur gewünschten Konzentration durch Austausch in einen Puffer, der alle Streckmittel (außer Pluronic F-68) in der erforderlichen Konzentration enthielt, konzentriert. Ausreichend festes Pluronic F-68 wurde dann zugegeben, um die erforderliche Konzentration zu erhalten. Der pH-Wert wurde dann überprüft und, falls nötig, eingestellt. Die Formulierungen 1 und 2 weisen die gleichen Spezifikationen auf:

hGH (Somatropin)	5 mg
Citronensäuremonohydrat	2,04 mg/ml
Trinatriumcitratdihydrat	2,85 mg/ml
Natriumchlorid	6,23 mg/ml
Natriumhydroxid	0,388 mg/ml
Benzylalkohol	0,9%
Pluronic F-68	0,08%
pH	5,6

Die Formulierung 3 wurde wie für die Formulierung 2 mit den gleichen Spezifikationen wie die Formulierungen 1 und 2 unter Zugabe von 0,005% (Gew/V) EDTA hergestellt.
Die Formulierungen 1 bis 3 wurden bei 40°C gelagert und auf den hGH-Gehalt durch Größenausschluss-HPLC in Abständen über 40 Tage getestet. Wie in 4 gezeigt ist, zeigten die Formulierungen 2 und 3 hervorragende Stabilität, insbesondere im Vergleich mit der Formulierung 1, in diesem beschleunigten Stabilitätstest bei 40°C.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer stabilen flüssigen Formulierung von Wachstumshormon, vorzugsweise humanem Wachstumshormon, die Wachstumshormon, einen Puffer und eine zur Stabilisierung wirksame Menge von mindestens einem Stabilisierungsmittel, das aus der Gruppe von (i) nichtionischen grenzflächenaktiven Mitteln eines Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymers, (ii) Taurocholsäure oder Salzen oder Derivaten derselben und (iii) Methylcellulosederivaten ausgewählt ist, umfasst, wobei das Verfahren das Mischen des Wachstumshormons mit dem Puffer und dem Stabilisierungsmittel bzw. den Stabilisierungsmitteln unter derartigen Bedingungen, dass das Wachstumshormon keinen Konzentrationen des Puffers oder des Stabilisierungsmittels bzw. der Stabilisierungsmittel, die größer als das Zweifache der Endkonzentrationen des Puffers oder des Stabilisierungsmittels bzw. der Stabilisierungsmittel in der Formulierung sind, ausgesetzt wird, umfasst und wobei die Endkonzentration des Stabilisierungsmittels bzw. der Stabilisierungsmittel in der Formulierung 0,01–5,0% (Gew/V) beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Formulierung 0,05–2,0% (Gew/V), vorzugsweise 0,08–1,0% (Gew/V) an dem Stabilisierungsmittel bzw. den Stabilisierungsmitteln umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Stabilisierungsmittel bzw. die Stabilisierungsmittel aus Pluronic-Polyolen, Taurocholsäure und deren Salzen und Hydroxypropylmethylcellulose ausgewählt sind, wobei die Formulierung vorzugsweise 0,08% (Gew/V) eines Pluronic-Polyols als Stabilisierungsmittel umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Formulierung einen pharmakologisch akzeptablen Puffer, vorzugsweise einen Phosphat- oder Citratpuffer, in einer Konzentration von 2,5 bis 50 mM, vorzugsweise 10–20 mM umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der pH-Wert der Formulierung 5,0 bis 7,5, vorzugsweise 5,0 bis 6,8, noch günstiger 5,2 bis 6,5 und noch besser 5,4 bis 5,8 beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Stabilisierungsmittel bzw. die Stabilisierungsmittel der Formulierung unmittelbar vor der Einstellung des Endvolumens zugesetzt werden.
Stabile flüssige Formulierung von Wachstumshormon, die durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 erhältlich ist.
Stabile flüssige Formulierung von Wachstumshormon gemäß der Definition in Anspruch 7 zur Verwendung als Arzneimittel.
Verwendung einer stabilen flüssigen Formulierung von Wachstumshormon gemäß der Definition in Anspruch 7 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Wachstumshormon benötigenden Human- oder Tierpatienten.