DE69734778T2 - POLYNUCLEOTIDE VACCINE FORMULATION AGAINST HORSE DISEASES - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Impfstoffformulierung zur Vakzinierung von Einhufern, insbesondere Pferden. Sie betrifft auch deren Verwendung.The The present invention relates to a vaccine formulation for vaccination of solitary horses, in particular horses. It also concerns their use.
Es gibt eine relativ große Vielfalt an Pferdepathologien. Abgesehen von den bekannten respiratorischen Pathologien, wie Rhinopneumonitis und Grippe, sind Pferde, insbesondere auf dem amerikanischen Kontinent, für verschiedene Enzephalitisarten anfällig. Schließlich weisen Pferde verschiedene andere Pathologien auf, von denen insbesondere Tetanus, Lyme-Krankheit und equine Arteriitis genannt werden können, ohne die Risiken des Ausgesetztseins gegenüber dem Tollwutvirus zu vergessen.It gives a relatively large Variety of equine pathologies. Apart from the known respiratory Pathologies, such as rhinopneumonitis and influenza, are horses, in particular in the Americas, for various types of encephalitis susceptible. After all horses have various other pathologies, of which in particular Tetanus, Lyme disease and equine arteritis can be named without to forget the risks of being exposed to the rabies virus.
Die Umstände, unter denen Pferde den verschiedenen pathogenen Mikroorganismen ausgesetzt werden, wurden durch den Transport großer Zahlen von Pferden über erhebliche Entfernungen über Land oder Luft erhöht, so dass die Tendenz zur Erhöhung des Risikos für Infektionen besteht.The Circumstances, among which horses the various pathogenic microorganisms were suspended by transporting large numbers from horses over considerable distances over Land or air increased, so the tendency to increase the risk for Infections exists.
Angesichts der hohen Kosten dieser Tiere, insbesondere im Fall von Zuchtpferden, Reitpferden und Rennpferden, ist es jedoch aus wirtschaftlicher Sicht wichtig, soweit wie möglich die Infektionsrisiken, die zu einem langen Ausfall oder gar einem Verlust des Tieres führen, zu kontrollieren. Es gibt bereits eine gewisse Anzahl von Vakzinen für Pferde, deren Wirksamkeit unterschiedlich ist.in view of the high cost of these animals, especially in the case of breeding horses, Riding horses and racehorses, but it is more economical View important as much as possible the infection risks leading to a long failure or even a Cause loss of the animal, to control. There are already a certain number of vaccines for horses, their effectiveness is different.
So wurden inaktivierte Impfstoffe oder Subunit-Impfstoffe für die equine Rhinopneumonitis, die durch die verschiedenen Stämme des equinen Herpesvirus (EHV) verursacht wird, entwickelt, von denen jedoch alle gewisse Einschränkungen aufweisen, die sich in einem unvollständigen oder nur kurzfristigen Schutz und gegebenenfalls Problemen bezüglich der Unbedenklichkeit in Verbindung mit den eingesetzten Adjuvantien äußern.So have been inactivated vaccines or subunit vaccines for the equine Rhinopneumonitis caused by the different strains of equine herpes virus (EHV), but of which all are certain restrictions exhibit, which is in an incomplete or only short-term Protection and, if necessary, safety issues in conjunction with the adjuvants used.
Die equine Grippe stellt auch eine wichtige Pathologie dar, deren Vorbeugung durch Impfung auch erforscht wird. Die eingesetzten Impfstoffe sind inaktivierte Impfstoffe oder Subunit- Impfstoffe, die eine gewisse Wirksamkeit zeigen, aber trotzdem nicht problemlos sind. Somit ist der Schutz häufig nicht vollständig und im Allgemeinen von relativ kurzer Dauer, was erneute Impfungen erforderlich macht, wie im Fall der Rhinopneumonitis. Es kann auch zu Problemen in Bezug auf die Unbedenklichkeit kommen.The Equine flu also represents an important pathology whose prevention is also being researched through vaccination. The vaccines used are inactivated vaccines or subunit vaccines that have some effectiveness show, but still not without problems. Thus, the protection often not completely and in general of a relatively short duration, what about re-vaccinations required, as in the case of rhinopneumonitis. It can also come to safety issues.
Es wurden auch Vakzine auf Basis von Tetanustoxoid entwickelt, die unbestritten wirksam sind.It vaccines based on tetanus toxoid have also been developed are undisputedly effective.
Es gibt auch Vakzine gegen Enzephalitis, einige östliche Enzephalitisarten, westliche Enzephalitis und venezuelische Enzephalitis, deren Wirksamkeit noch wenig bekannt ist.It also gives vaccine against encephalitis, some eastern encephalitis species, Western Encephalitis and Venezuelan Encephalitis, their effectiveness still little is known.
Einerseits aus wirtschaftlichen Gründen und andererseits wegen der rationalen Verwaltung von equinen Impfungen wurden bereits multivalente Vakzinformulierungen zur Vermeidung mehrerer dieser infektiösen Krankheiten vorgeschlagen.On the one hand because of economical reasons and on the other because of the rational management of equine vaccinations have already been multivalent vaccine formulations to avoid several of these infectious diseases proposed.
Die Verbindungen, die bisher entwickelt worden sind, wurden aus inaktivierten Impfstoffen oder Lebendimpfstoffen und gegebenenfalls Mischungen derartiger Impfstoffe hergestellt. Bei ihrer Benutzung gibt es Kompatibilitätsprobleme zwischen den Valenzen sowie Stabilitätsprobleme. Es muss nämlich die Kompatibilität zwischen den verschiedenen Valenzen, sowohl in Bezug auf die verschiedenen eingesetzten Antigene als auch in Bezug auf die Formulierungen selber, gleichzeitig gewährleistet werden, insbesondere, wenn inaktivierte Impfstoffe und Lebendimpfstoffe gleichzeitig kombiniert werden. Es besteht auch das Problem der Konservierung derartiger kombinierter Impfstoffe sowie das Problem ihrer Unbedenklichkeit, insbesondere in Gegenwart eines Adjuvans. Im Allgemeinen sind diese Vakzine ziemlich teuer.The Compounds that have been developed so far have been inactivated Vaccines or live vaccines and, where appropriate, mixtures made of such vaccines. There are compatibility issues when using them between the valences as well as stability problems. It must be the compatibility between the different valences, both in relation to the different ones used antigens as well as in terms of the formulations themselves, ensured at the same time especially if inactivated vaccines and live vaccines be combined at the same time. There is also the problem of Preservation of such combined vaccines as well as the problem their safety, especially in the presence of an adjuvant. In general, these vaccines are quite expensive.
Des Weiteren haben diese Formulierungen nicht das Kombinieren drei der Hauptvalenzen ermöglicht, nämlich die Valenzen der equinen Grippe, der Rhinopneumonitis, insbesondere EHV-1 und EHV-4, und des Tetanus. Zum Beispiel sind Kombinationen der Grippe- und Enzephalitisvalenzen oder der Rhinopneumonitis- und Enzephalitisvalenzen bekannt.Of Further, these formulations do not combine three of the Main valences, namely the Equine flu syndromes, rhinopneumonitis, in particular EHV-1 and EHV-4, and tetanus. For example, combinations influenza and encephalitis valencies or rhinopneumonitis and Encephalitis valences known.
Die Patentanmeldungen WO-A-90 11 092, WO-A-93 19 183, WO-A-94 21 797 und WO-A-95 20 660 haben vorgeschlagen, die kürzlich entwickelte Technik der Polynukleotidvakzinen zu verwenden. Es ist bekannt, dass bei diesen Vakzinen ein Plasmid verwendet wird, das in der Lage ist, in den Wirtszellen das Antigen zu exprimieren, das in das Plasmid eingefügt wurde. Es wurden alle Wege der Verabreichung vorgeschlagen (intraperitoneal, intravenös, intramuskulär, transkutan, intradermal, über die Schleimhaut, usw.). Es können auch verschiedene Mittel der Impfung verwendet werden, wie auf der Oberfläche von Goldteilchen abgelagerte DNA, wobei die Goldteilchen so beschleunigt werden, dass sie in die Haut des Tieres eindringen (Tang et al., Nature 356, 152–154, 1992), und Flüssigstrahlinjektoren, die es ermöglichen, die Transfizierung zur gleichen Zeit in der Haut, dem Muskel, dem Fettgewebe und dem Brustgewebe zu gewährleisten (Furth et al., Analytical Biochemistry, 205, 365–368, 1992).The patent applications WO-A-90 11 092, WO-A-93 19 183, WO-A-94 21 797 and WO-A-95 20 660 have proposed to use the recently developed technique of polynucleotide vaccines. It is known that these vaccines use a plasmid capable of expressing in the host cells the antigen which has been introduced into the plasmid. All routes of administration have been suggested (intraperitoneally, intravenously, intramuscularly, transcutaneously, intradermally, via the mucosa, etc.). It can Also, various means of vaccination are used, such as DNA deposited on the surface of gold particles, whereby the gold particles are accelerated to penetrate the skin of the animal (Tang et al., Nature 356, 152-154, 1992) and liquid jet injectors which make it possible to ensure transfection at the same time in the skin, muscle, adipose tissue and breast tissue (Furth et al., Analytical Biochemistry, 205, 365-368, 1992).
Die Polynukleotidvakzine können sowohl nackte DNAs als auch formulierte DNAs verwenden, zum Beispiel innerhalb von Liposomen oder kationischen Lipiden.The Polynucleotide vaccines use both naked DNAs and formulated DNAs, for example within liposomes or cationic lipids.
Polynukleotidvektoren, die die Gene HA oder NP enthalten, wurden für das Grippe-Virus (Influenza-Virus) bei Mäusen, Frettchen und Hühnern getestet. Für Pferde sind keine Daten erhältlich.polynucleotide vectors, which contain the genes HA or NP were used for the flu virus (influenza virus) in mice, Ferrets and chickens tested. For Horses are no data available.
Bezüglich Tetanus wurde kürzlich berichtet, dass die Immunisierung von Mäusen durch ein Plasmid, das mit dem C-Fragment den nichttoxischen C-terminalen Bereich des Tetanustoxins exprimiert, bei der Maus das Auftreten von seroprotektiven Antikörpern induziert.Regarding tetanus was recently reported that immunization of mice by a plasmid, the with the C fragment, the non-toxic C-terminal region of tetanus toxin expressed in the mouse induces the appearance of seroprotective antibodies.
Es ist jedoch nicht möglich, die Lehren der bei diesen Tieren mit kurzer Lebensdauer erhaltenen Ergebnisse direkt auf andere Säuger, insbesondere große Säuger, zu übertragen.It is not possible the lessons learned from these short-lived animals Results directly on other mammals, especially big Mammal, transferred to.
Daher muss der Schutz von Einhufern und insbesondere von Pferden gegen infektiöse Pathologie immer noch verbessert werden.Therefore must be the protection of solipeds and especially of horses against infectious Pathology still be improved.
Gegenstand der Erfindung sind monovalente Impfstoffformulierungen, wie sie in den Ansprüchen 1–8 definiert sind, die ein Plasmid umfassen, das ein Gen des equinen Rhinopneumonitisvirus EHV enthält, wobei das Gen gB oder gD ist.object of the invention are monovalent vaccine formulations such as in the claims 1-8 defined which comprise a plasmid which is a gene of equine rhinopneumonia virus Contains EHV, where the gene is gB or gD.
Unter Gen versteht man nicht nur das vollständige Gen, sondern auch abweichende Nukleotidsequenzen, einschließlich Fragmente, die die Fähigkeit bewahren, eine protektive Reaktion zu induzieren. Der Begriff Gen deckt die Nukleotidsequenzen ab, die zu denjenigen äquivalent sind, die in den Beispielen genau beschrieben sind, das heißt, die andersartigen Sequenzen, die aber das gleiche Protein codieren. Er deckt auch die Nukleotidsequenzen von anderen Stämmen des betreffenden Krankheitserregers ab, die einen Kreuzschutz oder einen Schutz gewährleisten, der für einen Stamm oder eine Gruppe von Stämmen spezifisch ist. Er deckt auch die Nukleotidsequenzen ab, die modifiziert wurden, um die in vivo-Exprimierung durch das Wirtstier zu erleichtern, die aber das gleiche Protein codieren.Under Gen is not only understood as the complete gene but also as aberrant Nucleotide sequences, including Fragments, the ability to induce a protective reaction. The term gene covers the nucleotide sequences equivalent to those are precisely described in the examples, that is, the different sequences but encoding the same protein. He also covers the nucleotide sequences of other strains of the pathogens that have a cross-protection or a Ensure protection, the for a strain or a group of strains is specific. He covers also the nucleotide sequences that have been modified to match those in vivo expression by the host animal, but that the encode the same protein.
Somit umfasst besonders bevorzugt das Vakzin gemäß der Erfindung mindestens ein Antigen von dem EHV-1-Stamm und mindestens ein Antigen von dem EHV-4-Stamm, wobei diese Antigene vorzugsweise die gleiche Art von Antigen sind. Es werden bevorzugt die Gene gB und gD, vorzugsweise die der EHV-1- und EHV-4-Stämme kombiniert.Consequently most preferably, the vaccine according to the invention comprises at least an antigen from the EHV-1 strain and at least one antigen from the EHV-4 strain, these antigens preferably the same kind of Antigen are. The genes gB and gD are preferred, preferably those of the EHV-1 and EHV-4 strains combined.
Die therapeutisch wirksamen Mengen der Polynukleotidvalenzen sind in einem Träger enthalten oder dazu gedacht, in diesem enthalten zu sein, welcher zur Verabreichung an das Tier, vorzugsweise zur intramuskulären Verabreichung, geeignet ist. Vorzugsweise ist dieser Träger ein wässriger Träger, dem ölige Bestandteile fehlen.The therapeutically effective amounts of polynucleotide valencies are in a carrier contained or intended to be included in this for administration to the animal, preferably for intramuscular administration, suitable is. Preferably, this carrier is an aqueous carrier lacking oily components.
Das Kombinieren von Genen, die für mehrere Antigene codieren, kann durch eine Mischung von Plasmiden, die ein einzelnes Antigen exprimieren, oder im Gegensatz dazu durch Einfügen von mehreren Genen in ein und dasselbe Plasmid erfolgen.The Combine genes for encode several antigens, can be detected by a mixture of plasmids, which express a single antigen, or by contrast Insert of several genes into one and the same plasmid.
Eine Vakzinformulierung gemäß der Erfindung kann in einem Dosisvolumen von zwischen 0,1 und 10 ml, und insbesondere zwischen 1 und 5 ml dargereicht werden.A Vaccine formulation according to the invention can in a dose volume of between 0.1 and 10 ml, and in particular between 1 and 5 ml.
Die Dosis wird im Allgemeinen zwischen 10 ng und 1 mg, insbesondere zwischen 100 ng und 500 μg, und vorzugsweise zwischen 1 μg und 250 μg pro Plasmidtyp liegen.The Dose is generally between 10 ng and 1 mg, in particular between 100 ng and 500 μg, and preferably between 1 μg and 250 μg per plasmid type.
Vorzugsweise werden nackte Plasmide verwendet, die einfach in den Impfträger gegeben werden, der im Allgemeinen physiologisches Wasser (0,9% NaCl), ultrareines Wasser, TE-Puffer, usw. ist. Es können natürlich alle Formen von Polynukleotidvakzin verwendet werden, die im Stand der Technik beschrieben sind.Preferably Naked plasmids are used which are simply added to the vaccine carrier which is generally physiological water (0.9% NaCl), ultrapure Water, TE buffer, etc. is. It can Naturally all forms of polynucleotide vaccine are used in the state are described in the art.
Jedes Plasmid umfasst einen Promotor, der in der Lage ist, die Expression des Gens, das unter seiner Kontrolle eingefügt ist, in den Wirtszellen zu gewährleisten. Im Allgemeinen handelt es sich um einen starken eukaryontischen Promotor, und insbesondere um einen frühen Cytomegalievirus-Promotor CMV-IE menschlichen oder murinen Ursprungs, oder gegebenenfalls auch von anderem Ursprung, wie von Ratte, Schwein oder Meerschweinchen.Each plasmid comprises a promoter that is capable of expressing the gene that under it Control is inserted to ensure in the host cells. In general, it will be a strong eukaryotic promoter, and particularly an early CMV-IE cytomegalovirus promoter of human or murine origin, or possibly of other origin, such as rat, porcine or guinea pig.
Allgemeiner kann der Promotor entweder von viralem oder von zellulärem Ursprung sein. Als andere virale Schutzmittel als CMV-IE können der frühe oder späte SV-40-Virus-Promotor oder der LTR-Promotor des Rous-Sarkom-Virus genannt werden. Es kann sich auch um einen Promotor des Virus handeln, von dem das Gen hergeleitet ist, zum Beispiel der dem Gen eigene Promotor.general For example, the promoter may be of either viral or cellular origin be. As other viral protective agents than CMV-IE, the early or late SV-40 virus promoter or the LTR promoter of the Rous sarcoma virus. It can also be a promoter of the virus from which the gene is derived is, for example, the gene's own promoter.
Als zellulärer Promotor kann der Promotor eines Gens des Zytoskeletts, wie zum Beispiel der Desminpromotor (Polmont et al., Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology, 1990, 22, 117–122; und Zhenlin et al., Gene, 1989, 78, 243–254), oder auch der Aktinpromotor genannt werden.When cellular Promoter may be the promoter of a gene of the cytoskeleton, such as Example of Desmin promoter (Polmont et al., Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology, 1990, 22, 117-122; and Zhenlin et al., Gene, 1989, 78, 243-254), or the Aktinpromotor be called.
Wenn mehrere Gene in einem Plasmid vorhanden sind, können diese innerhalb der gleichen Transkriptionseinheit oder innerhalb von zwei verschiedenen Einheiten dargestellt werden.If multiple genes are present in a plasmid, these can be within the same Transcription unit or within two different units being represented.
Die Vakzinformulierungen gemäß der Erfindung können über die verschiedenen Verabreichungswege, die im allgemeinen Rahmen der Polynukleotidimpfung vorgeschlagen werden, und unter Verwendung der bekannten Verabreichungstechniken verabreicht werden. Es wird jedoch der intramuskuläre Weg deutlich bevorzugt.The Vaccine formulations according to the invention can over the Different routes of administration, in the general context of Polynucleotide vaccination are proposed, and using administered by known administration techniques. It will however, the intramuscular Way clearly preferred.
Es ist auch möglich, über den intradermalen Weg zu impfen, und zwar mittels eines Flüssigstrahlinjektors, vorzugsweise mit mehreren Strahlen, und insbesondere eines Injektors, bei dem ein Injektionskopf verwendet wird, der mit mehreren Löchern oder Düsen versehen ist, der insbesondere von 5 bis 6 Löcher oder Düsen aufweist, wie die Pigjet-Vorrichtung, die von der Firma Endoscoptic, Laons, Frankreich, hergestellt und vertrieben wird.It is also possible over the vaccinate the intradermal route, by means of a liquid jet injector, preferably with a plurality of jets, and in particular an injector, in which an injection head is used, with multiple holes or Provided nozzles having in particular from 5 to 6 holes or nozzles, such as the Pigjet device, manufactured and sold by Endoscoptic, Laons, France becomes.
Das Dosisvolumen für eine derartige Vorrichtung wird vorzugsweise auf zwischen 0,1 und 0,9 ml, insbesondere zwischen 0,2 und 0,6 ml, und vorteilhafterweise zwischen 0,4 und 0,5 ml reduziert, wobei es möglich ist, das Volumen in einer oder mehreren, vorzugsweise 2, Anwendungen zu verabreichen.The Dose volume for Such a device is preferably between 0.1 and 0.9 ml, in particular between 0.2 and 0.6 ml, and advantageously between 0.4 and 0.5 ml, whereby it is possible to reduce the volume in one or more, preferably 2, to administer applications.
Die Vakzinformulierungen gemäß der Erfindung können auch in Kombination mit einem Vakzin eines anderen Typs (voll lebend oder inaktiviert, rekombinant oder Subunit-Impfstoff) gegen eine andere Pathologie oder als Wiederauffrischung eines Vakzins verwendet werden, wie unten beschrieben.The Vaccine formulations according to the invention can also in combination with a vaccine of another type (fully live or inactivated, recombinant or subunit vaccine) against one other pathology or used as a refresher vaccine as described below.
Somit ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Plasmids gemäß der Erfindung zur Herstellung eines Vakzins, das zur Impfung von Pferden bestimmt ist, die erstgeimpft wurden mittels eines herkömmlichen Erstimpfstoffs (monovalent oder multivalent), der vom gleichen Typ ist wie diejenigen des Stands der Technik und der insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus lebendem Vollimpfstoff, inaktiviertem Vollimpfstoff, Subunit-Impfstoff oder rekombinantem Impfstoff, wobei dieser Erstimpfstoff das oder die von dem Plasmid codierte(n) Antigen(e), oder (ein) Antigen(e), das (die) einen Kreuzschutz verleiht/verleihen, präsentiert (das heißt enthält oder exprimieren kann).Consequently Another object of the present invention is the use a plasmid according to the invention for the preparation of a vaccine intended for the vaccination of horses which were first inoculated by means of a conventional first vaccine (monovalent or multivalent) which is of the same type as those of the state the technique and in particular is selected from the group live whole vaccine, inactivated whole vaccine, subunit vaccine or recombinant vaccine, said first vaccine comprising the or the antigen (s) encoded by the plasmid, or antigen (s), the one who lends / gives a cross guard presents (this means contains or can express).
Bemerkenswerterweise hat das Polynukleotidvakzin eine starke Wiederauffrischungswirkung, die sich in einer Verstärkung der Immunreaktion und der Einstellung einer langfristigen Immunität äußert.Remarkably, the polynucleotide vaccine has a strong rejuvenating effect, which is in a reinforcement immune response and the cessation of long-term immunity.
Im Allgemeinen können die Vakzine zur Erstimpfung aus den handelsüblichen Vakzinen, die von den verschiedenen Veterinärvakzinherstellern bezogen werden können, ausgewählt sein.in the Generally can the vaccine for initial vaccination from the commercial vaccines available from the various Veterinärvakzinherstellern can be obtained selected be.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung wird dem Tier zunächst eine wirksame Dosis des herkömmlichen Impfstoffs, insbesondere eines inaktivierten, lebenden, abgeschwächten oder rekombinanten Impfstoffs, oder auch eines Subunit-Impfstoffs, verabreicht, um eine Erstimpfung zu gewährleisten, und nach einer Zeitspanne von vorzugsweise 2 bis 4 Wochen wird der polyvalente oder monovalente Impfstoff gemäß der Erfindung verabreicht.at a preferred embodiment of the method according to the invention the animal is first a effective dose of the conventional Vaccine, in particular an inactivated, live, attenuated or recombinant vaccine, or even a subunit vaccine, administered, to ensure a first vaccination, and after a period of preferably 2 to 4 weeks, the polyvalent or monovalent vaccine according to the invention administered.
Die Erfindung wird nun genauer mit Hilfe der Ausführungsformen der Erfindung anhand der Zeichnungen beschrieben. Alle Angaben, die nicht die Vakzine betreffen, wie sie in den Ansprüchen beschrieben sind, stellen nur zusätzliche Informationen dar und bilden nicht Teil der Beschreibung der Erfindung.The The invention will now be described in more detail by means of embodiments of the invention described with reference to the drawings. All information that is not the Concern vaccines, as described in the claims place only additional Information is not part of the description of the invention.
FigurenauflistungFigure List
Auflistung der Sequenzen SEQ ID NRList of sequences SEQ ID NO
- SEQ ID Nr. 1: Oligonukleotid AB013SEQ ID NO: 1: oligonucleotide AB013
- SEQ ID Nr. 2: Oligonukleotid AB014SEQ ID NO: 2: oligonucleotide AB014
- SEQ ID Nr. 3: Oligonukleotid AB071SEQ ID NO: 3: oligonucleotide AB071
- SEQ ID Nr. 4: Oligonukleotid AB074SEQ ID NO: 4: oligonucleotide AB074
- SEQ ID Nr. 5: Oligonukleotid AB030SEQ ID NO: 5: oligonucleotide AB030
- SEQ ID Nr. 6: Oligonukleotid AB031SEQ ID NO: 6: oligonucleotide AB031
- SEQ ID Nr. 7: Oligonukleotid AB075SEQ ID NO: 7: oligonucleotide AB075
- SEQ ID Nr. 8: Oligonukleotid AB076SEQ ID NO: 8: oligonucleotide AB076
- SEQ ID Nr. 9: Oligonukleotid AB015SEQ ID NO: 9: oligonucleotide AB015
- SEQ ID Nr. 10: Oligonukleotid AB016SEQ ID NO: 10: oligonucleotide AB016
- SEQ ID Nr. 11: Oligonukleotid AB077SEQ ID NO: 11: oligonucleotide AB077
- SEQ ID Nr. 12: Oligonukleotid AB078SEQ ID NO: 12: oligonucleotide AB078
- SEQ ID Nr. 13: Oligonukleotid AB186SEQ ID NO: 13: oligonucleotide AB186
- SEQ ID Nr. 14: Oligonukleotid AB187SEQ ID NO: 14: oligonucleotide AB187
- SEQ ID Nr. 15: Sequenz des equinen Grippe-Gens HA (Stamm Fontainbleau)SEQ ID NO: 15: sequence of equine influenza gene HA (strain Fontainbleau)
- SEQ ID Nr. 16: Oligonukleotid AB156SEQ ID NO: 16: oligonucleotide AB156
- SEQ ID Nr. 17: Oligonukleotid AB159SEQ ID NO: 17: oligonucleotide AB159
- SEQ ID Nr. 18: Oligonukleotid AB157SEQ ID NO: 18: oligonucleotide AB157
- SEQ ID Nr. 19: Oligonukleotid AB128SEQ ID NO: 19: oligonucleotide AB128
- SEQ ID Nr. 20: Oligonukleotid AB129SEQ ID NO: 20: oligonucleotide AB129
- SEQ ID Nr. 21: Oligonukleotid AB038SEQ ID NO: 21: oligonucleotide AB038
- SEQ ID Nr. 22: Oligonukleotid AB039SEQ ID NO: 22: oligonucleotide AB039
- SEQ ID Nr. 23: Oligonukleotid AB176SEQ ID NO: 23: oligonucleotide AB176
- SEQ ID Nr. 24: Oligonukleotid AB177SEQ ID NO: 24: oligonucleotide AB177
- SEQ ID Nr. 25: Oligonukleotid AB174SEQ ID NO: 25: oligonucleotide AB174
- SEQ ID Nr. 26: Oligonukleotid AB175SEQ ID NO: 26: oligonucleotide AB175
- SEQ ID Nr. 27: Oligonukleotid AB180SEQ ID NO: 27: oligonucleotide AB180
- SEQ ID Nr. 28: Oligonukleotid AB181SEQ ID NO: 28: oligonucleotide AB181
- SEQ ID Nr. 29: Oligonukleotid AB178SEQ ID NO: 29: oligonucleotide AB178
- SEQ ID Nr. 30: Oligonukleotid AB179SEQ ID NO: 30: oligonucleotide AB179
- SEQ ID Nr. 31: Oligonukleotid AB184SEQ ID NO: 31: oligonucleotide AB184
- SEQ ID Nr. 32: Oligonukleotid AB185SEQ ID NO: 32: oligonucleotide AB185
- SEQ ID Nr. 33: Oligonukleotid AB182SEQ ID NO: 33: oligonucleotide AB182
- SEQ ID Nr. 34: Oligonukleotid AB183SEQ ID NO: 34: oligonucleotide AB183
- SEQ ID Nr. 35: Oligonukleotid AB011SEQ ID NO: 35: oligonucleotide AB011
- SEQ ID Nr. 36: Oligonukleotid AB012SEQ ID NO: 36: oligonucleotide AB012
BEISPIELEEXAMPLES
Beispiel 1: Züchtung der VirenExample 1: Breeding of virus
Die Viren werden auf dem geeigneten Zellsystem gezüchtet, bis ein cytopathischer Effekt erhalten wird. Die für jeden Virus zu verwendenden Zellsysteme sind dem Fachmann bekannt. Kurz gesagt werden Zellen, die für den eingesetzten Virus anfällig sind und in Minimum-Essential-Medium Eagle ("MEM"-Medium) oder einem anderen geeigneten Medium gezüchtet wurden, mit dem untersuchten Virenstamm unter Verwendung einer Vielzahl der Infektion (moi) von 1 beimpft. Die infizierten Zellen werden dann bei 37°C für die Zeit, die notwendig ist für das Auftreten eines vollständigen cytopathischen Effekts, inkubiert (durchschnittlich 36 Stunden).The Viruses are cultured on the appropriate cell system until a cytopathic Effect is obtained. The for Any cell systems to be used for each virus are known to those skilled in the art. In short, cells that are for vulnerable to the virus used are and in minimum essential medium Eagle ("MEM" medium) or one bred other suitable medium were examined with the virus strain using a variety the infection (moi) of 1 is inoculated. The infected cells will be then at 37 ° C for the Time that is necessary for the occurrence of a complete cytopathic effect, incubated (on average 36 hours).
Beispiel 2: Züchtung der BakterienExample 2: Breeding of bacteria
Tetanus Die Bakterien werden in den geeigneten Medien und unter den dem Fachmann bekannten Bedingungen gezüchtet, um eine Bakterienbiomasse zu erhalten, die für die Extraktion des genetischen Materials ausreicht. Diese Extraktion wird unter Verwendung der üblichen Techniken durchgeführt, die von Sambrook J. et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1989) beschrieben werden.tetanus The bacteria are in the appropriate media and under the Grower known conditions bred to a bacterial biomass to get that for the extraction of the genetic material is sufficient. This extraction is using the usual Techniques performed, those of Sambrook J. et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1989).
Die Stämme von Borrelia burgdorferi werden in den geeigneten Medien und unter den dem Fachmann bekannten Bedingungen gezüchtet. Diese Bedingungen und Medien werden insbesondere von A. Barbour (J. Biol. Med. 1984, 57, 71–75) beschrieben. Die Extraktion der Bakterien-DNA erfolgte unter den von W. Simpson et al. (Infect. Immun. 1990, 58, 847–853) beschriebenen Bedingungen. Die üblichen Techniken, die von J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1989) beschrieben werden, können auch verwendet werden.The strains by Borrelia burgdorferi be in the appropriate media and under grown according to the conditions known in the art. These conditions and In particular, media are described by A. Barbour (J. Biol. Med. 1984, 57, 71-75) described. The extraction of the bacterial DNA took place among the by W. Simpson et al. (Infect Immun, 1990, 58, 847-853) Conditions. The usual Techniques described by J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1989) can also be used.
Beispiel 3: Extraktion von viraler genomischer DNAExample 3: Extraction of viral genomic DNA
Nach der Züchtung werden der Überstand und die lysierten Zellen entnommen und die gesamte Virensuspension wird 10 Minuten bei 1000 g und +4°C zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu entfernen. Die Virenpartikel werden dann durch Ultrazentrifugieren während 1 Stunde bei 400.000 g und +4°C gewonnen. Der Rückstand wird in einem Minimalvolumen Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA) aufgenommen. Diese konzentrierte Virensuspension wird 2 Stunden mit Proteinase K (Endkonzentration 100 μg/ml) in Gegenwart von Natriumdodecylsulphat (SDS) (Endkonzentration 0,5%) bei 37°C behandelt. Die virale DNA wird dann mit einem Phenol/Chloroform-Gemisch extrahiert und dann mit 2 Volumen reinem Ethanol ausgefällt. Nach einer Nacht bei –20°C wird die DNA bei 10.000 g und +4°C 15 Minuten zentrifugiert. Der DNA-Rückstand wird getrocknet und dann in einem Minimalvolumen von sterilem ultrareinem Wasser aufgenommen. Es kann dann von Restriktionsenzymen geschnitten werden.To of breeding become the supernatant and the lysed cells removed and the entire virus suspension is 10 minutes at 1000 g and + 4 ° C centrifuged to the cell debris to remove. The virus particles are then centrifuged by ultracentrifugation while 1 hour at 400,000 g and + 4 ° C won. The residue is taken up in a minimal volume of buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA). This concentrated virus suspension is 2 hours with proteinase K (final concentration 100 μg / ml) in the presence of sodium dodecyl sulphate (SDS) (final concentration 0.5%) at 37 ° C treated. The viral DNA is then mixed with a phenol / chloroform mixture extracted and then precipitated with 2 volumes of pure ethanol. To one night at -20 ° C will be the DNA at 10,000 g and + 4 ° C Centrifuged for 15 minutes. The DNA residue is dried and then taken in a minimum volume of sterile ultrapure water. It can then be cut by restriction enzymes.
Beispiel 4: Isolierung von viraler genomischer RNAExample 4: Isolation of viral genomic RNA
Die RNA-Viren wurden nach den dem Fachmann bekannten Techniken gereinigt. Die virale genomischer RNA von jedem Virus wurde dann unter Verwendung der Extraktionstechnik "Guanidinthiocyanat/Phenolchloroform", die von P. Chomczynski und N. Sacchi (Anal. Biochem. 1987, 162, 156–159) beschrieben wird, isoliert.The RNA viruses were purified according to techniques known to those skilled in the art. The viral genomic RNA from each virus was then used Extraction technique "guanidine thiocyanate / phenol chloroform", by P. Chomczynski and N. Sacchi (Anal Biochem 1987, 162, 156-159).
Beispiel 5: Molekularbiologische TechnikenExample 5: Molecular Biological techniques
Alle Plasmidkonstruktionen wurden unter Verwendung der molekularbiologischen Standardtechniken durchgeführt, die von J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) beschrieben werden. Alle für die vorliegende Erfindung verwendeten Restriktionsfragmente wurden unter Verwendung des "Geneclean"-Kits (BIO101 Inc. La Jolla, CA) isoliert.All Plasmid constructions were constructed using molecular biological Standard techniques performed, those of J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989). All for the present invention restriction fragments used were prepared using the "Geneclean" kit (BIO101 Inc.). La Jolla, CA).
Beispiel 6: RT-PCR-TechnikExample 6: RT-PCR technique
Spezifische Oligonukleotide (die an ihren 5'-Enden Restriktionsstellen umfassen, um das Klonieren von amplifizierten Fragmenten zu erleichtern) wurden derart synthetisiert, dass sie vollständig die codierenden Bereiche der zu amplifizierenden Gene abdecken (siehe spezifische Beispiele). Die Reverse Transkriptase-Reaktion (RT) und die Amplifizierung durch PCR erfolgten nach den Standardtechniken (Sambrook J. et al. 1989). Jede RT-PCR-Reaktion erfolgte mit einem Paar spezifischer Primer und unter Verwendung von Extrakt viraler genomischer RNA als Matrize. Die amplifizierte komplementäre DNA wurde mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) extrahiert, bevor sie mit den Restriktionsenzymen geschnitten wurde.specific Oligonucleotides (which at their 5 'ends Restriction sites include cloning amplified To facilitate fragments) were synthesized such that they Completely cover the coding regions of the genes to be amplified (see specific examples). The reverse transcriptase reaction (RT) and amplification by PCR were done according to standard techniques (Sambrook J. et al., 1989). Each RT-PCR reaction was performed with a Pair of specific primers and using viral extract genomic RNA as a template. The amplified complementary DNA was extracted with phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1) before she was cut with the restriction enzymes.
Beispiel 7: pVR1012-PlasmidExample 7: pVR1012 plasmid
Das
pVR1012-Plasmid (
Beispiel 8: Konstruktion des pAB042-Plasmids (EHV-1 gB-Gen)Example 8: Construction of the pAB042 plasmid (EHV-1 gB gene)
Es
wurde eine PCR-Reaktion mit der genomischen DNA vom equinen Herpesvirus
Typ 1 (EHV-1) (Stamm
Kentucky D) (P. Guo et al. J. Virol., 1990, 64, 2399–2406) und
unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide durchgeführt: , um das
Gen, das für
das Glycoprotein gB (EHV-1 gB) codiert, in Form eines PstI-NotI-Fragments zu isolieren. Nach
der Reinigung wurde das PCR-Produkt von 2981 bp mit PstI und NotI
geschnitten, um ein PstI-NotI-Fragment von 2959 bp zu isolieren.
Dieses Fragment wurde mit dem pVR1012-Vektor (Beispiel 7) ligiert,
der zuvor mit PstI und NotI geschnitten worden war, um das pAB042-Plasmid
(7841 bp) zu ergeben (
Beispiel 9: Konstruktion des pAB031-Plasmids (EHV-4 gB-Gen)Example 9: Construction of the pAB031 plasmid (EHV-4 gB gene)
Es wurde eine PCR-Reaktion mit der genomischen DNA vom equinen Herpesvirus Typ 4 (EHV-4) (Stamm 1942) (M. Riggio et al. J. Virol., 1989, 63, 1123–1133) und unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide durchgeführt: , um ein Fragment von 2949 bp, das das Gen enthält, das für das Glycoprotein gB von EHV-4 codiert, in Form eines PstI-XbaI-Fragments zu amplifizieren. Nach der Reinigung wurde das PCR-Produkt mit PstI und XbaI geschnitten, um ein PstI-XbaI-Fragment von 2931 bp zu ergeben.A PCR reaction was performed with equine herpesvirus genomic DNA type 4 (EHV-4) (strain 1942) (Riggio, M. et al., J. Virol., 1989, 63, 1123-1133) and using the following oligonucleotides carried out: to amplify a fragment of 2949 bp containing the gene coding for the glycoprotein gB of EHV-4 in the form of a PstI-XbaI fragment. After purification, the PCR product was cut with PstI and XbaI to give a 2931 bp PstI-XbaI fragment.
Dieses
Fragment wurde mit dem pVR1012-Vektor (Beispiel 7) ligiert, der
zuvor mit PstI und XbaI geschnitten worden war, um das pAB031-Plasmid
(7806 bp) zu ergeben (
Beispiel 10: Konstruktion des pAB013-Plasmids (EHV-1 gD-Gen)Example 10: Construction of the pAB013 plasmid (EHV-1 gD gene)
Es
wurde eine PCR-Reaktion mit der genomischen DNA vom equinen Herpesvirus
Typ 1 (EHV-1) (Stamm
Kentucky D) (J. C. Audonnet et al. J. Gen. Virol., 1990, 71, 2969–2978) und
mit den folgenden Oligonukleotiden durchgeführt: , um das
Gen, das für
das Glycoprotein gD (EHV-1 gD) codiert, in Form eines PstI-BamHI-Fragments zu isolieren.
Nach der Reinigung wurde das PCR-Produkt von 1228 bp mit PstI und
BamHI geschnitten, um ein PstI-BamHI-Fragment von 1211 bp zu isolieren.
Dieses Fragment wurde mit dem pVR1012-Vektor (Beispiel 7) ligiert,
der zuvor mit PstI und BamHI geschnitten worden war, um das pAB013-Plasmid
(6070 bp) zu ergeben (
Beispiel 11: Konstruktion des pAB032-Plasmids (EHV-4 gD-Gen)Example 11: Construction of the pAB032 plasmid (EHV-4 gD gene)
Es
wurde eine PCR-Reaktion mit der genomischen DNA vom equinen Herpesvirus
Typ 4 (EHV-4) (A. Cullinane
et al., J. Gen. Virol., 1993, 74, 1959–1964) und mit den folgenden
Oligonukleotiden durchgeführt: , um das
Gen, das für
das Glycoprotein gD von EHV-4 (EHV-4 gD) codiert, in Form eines
PstI-BamHI-Fragments
zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das PCR-Produkt von 1230
bp mit PstI und BamHI geschnitten, um ein PstI-BamHI-Fragment von
1212 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem pVR1012-Vektor
(Beispiel 7) ligiert, der zuvor mit PstI und BamHI geschnitten worden
war, um das pAB032-Plasmid (6071 bp) zu ergeben (
Beispiel 12: Konstruktion des pAB043-Plasmids (equines Grippe HA-Gen, Stamm Prag)Example 12: Construction of the pAB043 plasmid (equine influenza HA gene, Prague strain)
Es
wurde gemäß der in
Beispiel 6 beschriebenen Technik eine RT-PCR-Reaktion mit der genomischen RNA
des equinen Grippe-Virus (equines Influenza-Virus oder EIV) (Stamm
H7N7 Prag) (J. McCauley, Zugangsnr. der Sequenz in der Genbank =
X62552), die gemäß der in
Beispiel 4 beschriebenen Technik hergestellt worden war, und mit
den folgenden Oligonukleotiden durchgeführt: , um das
Gen, das für
das Glycoprotein HA des equinen Grippe-Virus codiert, in Form eines
SalI-BamHI-Fragments
zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt von 1733
bp mit SalI und BamHI geschnitten, um ein SalI-BamHI-Fragment von
1720 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem pVR1012-Vektor (Beispiel
7) ligiert, der zuvor mit SalI und BamHI geschnitten worden war,
um das pAB043-Plasmid (6588 bp) zu ergeben (
Beispiel 13: Konstruktion des pAB033-Plasmids (equines Grippe HA-Gen, Stamm Suffolk)Example 13: Construction of the pAB033 plasmid (equine influenza HA gene, strain Suffolk)
Es
wurde eine RT-PCR-Reaktion gemäß der Technik
aus Beispiel 6 mit der genomischen RNA des equinen Grippe-Virus
(EIV) (Stamm Suffolk) (M. Binns, Zugangsnr. der Sequenz in der Genbank
= X68437), die gemäß der Technik
aus Beispiel 4 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden
durchgeführt: um das
Gen, das für
das Glycoprotein HA des equinen Grippe-Virus codiert, in Form eines
SalI-BamHI-Fragments
zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt von 1729
bp mit SalI und BamHI geschnitten, um ein SalI-BamHI-Fragment von
1717 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem pVR1012-Vektor (Beispiel
7) ligiert, der zuvor mit SalI und BamHI geschnitten worden war,
um das pAB033-Plasmid (6584 bp) zu ergeben (
Beispiel 14: Konstruktion des pAB099-Plasmids (equines Grippe HA-Gen, Stamm Fontainebleau)Example 14: Construction of the pAB099 plasmid (equine influenza HA gene, strain Fontainebleau)
Es
wurde eine RT-PCR-Reaktion gemäß Beispiel
6 mit der genomischen RNA des equinen Grippe-Virus (EIV) (Stamm
Fontainebleau), die gemäß Beispiel
4 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden
durchgeführt: , um das
Gen, das für
das Glycoprotein HA des equinen Grippe-Virus (Stamm Fontainebleau)
(
Beispiel 15: Konstruktion des pAB085-Plasmids (equines Grippe NP-Gen, Stamm Prag)Example 15: Construction of the pAB085 plasmid (equine influenza NP gene, Prague strain)
Es
wurde eine RT-PCR-Reaktion gemäß der Technik
aus Beispiel 6 mit der genomischen RNA des equinen Grippe-Virus
(EIV) (Stamm H7N7 Prag) (O. Gorman et al., J. Virol., 1991, 65,
3704–3714),
die gemäß der Technik
aus Beispiel 4 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden
durchgeführt: , um das
Gen, das für
das Nukleoprotein NP des equinen Grippe-Virus codiert, in Form eines
SalI-BamHI-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das
RT-PCR-Produkt von 1515 bp mit SalI und BamHI geschnitten, um ein
SalI-BamHI-Fragment von 1503 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde
mit dem pVR1012-Vektor (Beispiel 7) liegiert, der zuvor mit SalI
und BamHI geschnitten worden war, um das pAB085-Plasmid (6371 bp) zu
ergeben (
Beispiel 16: Konstruktion des pAB084-Plasmids (equines Grippe NP-Gen, Stamm Jillin)Example 16: Construction of the pAB084 plasmid (equine influenza NP gene, strain Jillin)
Es
wurde eine RT-PCR-Reaktion gemäß der Technik
aus Beispiel 6 mit der genomischen RNA des equinen Grippe-Virus
(EIV) (Stamm H3N8 Jillin) (O. Gorman et al., J. Virol., 1991, 65,
3704–3714),
die gemäß der Technik
aus Beispiel 4 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden
durchgeführt: , um das
Gen, das für
das Nukleoprotein NP des equinen Grippe-Virus codiert, in Form eines
SalI-BamHI-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das
RT-PCR-Produkt von 1515 bp mit SalI und BamHI geschnitten, um ein
SalI-BamHI-Fragment von 1503 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde
mit dem pVR1012-Vektor (Beispiel 7) ligiert, der zuvor mit SalI
und BamHI geschnitten worden war, um das pAB084-Plasmid (6371 bp) zu
ergeben (
Beispiel 17: Konstruktion des pAB070-Plasmids (Subunit C-Gen, Tetanustoxin)Example 17: Construction of the pAB070 plasmid (subunit C gene, tetanus toxin)
Es
wurde eine PCR-Reaktion mit der genomischen DNA von Clostridium
tetani (Stamm CN3911) (N. Fairweather et al., J. Bact. 1986, 165,
21–27),
die gemäß der Technik
aus Beispiel 2 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden
durchgeführt: , um die
Sequenz, die für
die Subunit C des Clostridium tetani-Toxins codiert, in Form eines
PstI-BamHI-Fragments
zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das PCR-Produkt von 1377
bp mit PstI und BamHI geschnitten, um ein PstI-BamHI-Fragment von
1361 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem pVR1012-Vektor
(Beispiel 7) ligiert, der zuvor mit PstI und BamHI geschnitten worden
war, um das pAB070-Plasmid (6219 bp) zu ergeben (
Beispiel 18: Konstruktion des pAB017-Plasmids (ospA-Gen von Borrelia burgdorferi)Example 18: Construction of the pAB017 plasmid (ospA gene from Borrelia burgdorferi)
Es
wurde eine PCR-Reaktion mit der genomischen DNA von Borrelia burgdorferi
(Stamm B31) (S. Bergstrom et al., Mol. Microbiol., 1989, 3, 479–486), die
gemäß der Technik
aus Beispiel 2 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden
durchgeführt: , um das
Gen, das für
das Membranprotein OspA codiert, in Form eines SalI-BamHI-Fragments
zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das PCR-Produkt von 842 bp
mit SalI und BamHI geschnitten, um ein SalI-BamHI-Fragment von 829
bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem pVR1012-Vektor (Beispiel
7) ligiert, der zuvor mit SalI und BamHI geschnitten worden war,
um das pA8017-Plasmid (5698 bp) zu ergeben (
Beispiel 19: Konstruktion des pAB094-Plasmids (E2-Gen des östlichen Enzephalitisvirus)Example 19: Construction of the pAB094 plasmid (E2 gene of the eastern Encephalitis virus)
Es
wurde eine RT-PCR-Reaktion gemäß der Technik
aus Beispiel 6 mit der genomischen RNA des östlichen Enzephalitisvirus
(EEV) (Stamm Nordamerika 82V2137) (S. Weaver et al., Virology, 1993,
197, 375–390),
die gemäß der Technik
aus Beispiel 4 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden
durchgeführt: , um das
Gen, das für
das Glycoprotein E2 des EEV codiert, in Form eines PstI-BamHI-Fragments zu isolieren. Nach
der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt von 1294 bp mit PstI und
BamHI geschnitten, um ein PstI-BamHI-Fragment von 1278 bp zu isolieren.
Dieses Fragment wurde mit dem pVR1012-Vektor (Beispiel 7) ligiert,
der zuvor mit PstI und BamHI geschnitten worden war, um das pAB094-Plasmid
(6136 bp) zu ergeben (
Beispiel 20: Konstruktion des pAB093-Plasmids (C-Gen des östlichen Enzephalitisvirus)Example 20: Construction of the pAB093 plasmid (C gene of the eastern Encephalitis virus)
Es
wurde eine RT-PCR-Reaktion gemäß der Technik
aus Beispiel 6 mit der genomischen RNA des östlichen Enzephalitisvirus
(EEV) (Stamm Nordamerika 82V2137) (S. Weaver et al., Virology, 1993,
197, 375–390),
die gemäß der Technik
aus Beispiel 4 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden
durchgeführt: , um das
Gen, das für
das Capsidprotein C (EEV C) codiert, in Form eines PstI-BglII-Fragments
zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt von 801
bp mit PstI und BglII geschnitten, um ein PstI-BglII-Fragment von
785 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem pVR1012-Vektor
(Beispiel 7) ligiert, der zuvor mit PstI und BglII geschnitten worden
war, um das pAB093-Plasmid (5650 bp) zu ergeben (
Beispiel 21: Konstruktion des pAB096-Plasmids (E2-Gen des westlichen Enzephalitisvirus)Example 21: Construction of pAB096 plasmid (E2 gene of Western Encephalitis virus)
Es
wurde eine RT-PCR-Reaktion gemäß der Technik
aus Beispiel 6 mit der genomischen RNA des westlichen Enzephalitisvirus
(WEV) (Stamm BSF1703) (C. Hahn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1988, 85, 5997–6001),
die gemäß der Technik
aus Beispiel 4 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden
durchgeführt: , um das
Gen, das für
das Glycoprotein E2 des WEV codiert, in Form eines SalI-BamHI-Fragments zu isolieren. Nach
der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt von 1304 bp mit SalI und
BamHI geschnitten, um ein SalI-BamHI-Fragment von 1291 bp zu isolieren.
Dieses Fragment wurde mit dem pVR1012-Vektor (Beispiel 7) ligiert,
der zuvor mit SalI und BamHI geschnitten worden war, um das pAB096-Plasmid
(6159 bp) zu ergeben (
Beispiel 22: Konstruktion des pAB095-Plasmids (C-Gen des westlichen Enzephalitisvirus)Example 22: Construction of the pAB095 plasmid (Western Encephalitis C gene)
Es
wurde eine RT-PCR-Reaktion gemäß Beispiel
6 mit der genomischen RNA des westlichen Enzephalitisvirus (WEV)
(Stamm BSF1703) (C. Hahn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988,
85, 5997–6001),
die gemäß Beispiel
4 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden
durchgeführt: , um das
Gen, das für
das Capsidprotein C des WEV-Virus codiert, in Form eines SalI-BamHI-Fragments zu isolieren.
Nach der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt von 809 bp mit SalI
und BamHI geschnitten, um ein SalI-BamHI-Fragment von 796 bp zu
isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem pVR1012-Vektor (Beispiel
7) ligiert, der zuvor mit SalI und BamHI geschnitten worden war,
um das pAB095-Plasmid (5664 bp) zu ergeben (
Beispiel 23: Konstruktion des pAB098-Plasmids (E2-Gen des venezuelischen Enzephalitisvirus)Example 23: Construction of the pAB098 plasmid (E2 gene of the Venezuelan encephalitis virus)
Es
wurde eine RT-PCR-Reaktion gemäß Beispiel
6 mit der genomischen RNA des venezuelischen Enzephalitisvirus (VEV)
(Stamm P676) (Typ IC)) (R. Kinney et al., Virology, 1992, 191, 569–580), die
gemäß Beispiel
4 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden
durchgeführt: , um das
Gen, das für
das Glycoprotein E2 des VEV-Virus codiert, in Form eines SalI-BamHI-Fragments zu isolieren.
Nach der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt von 1304 bp mit SalI
und BamHI geschnitten, um ein SalI-BamHI-Fragment von 1291 bp zu
isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem pVR1012-Vektor (Beispiel
7) ligiert, der zuvor mit SalI und BamHI geschnitten worden war,
um das pAB098-Plasmid (6159 bp) zu ergeben (
Beispiel 24: Konstruktion des pAB097-Plasmids (C-Gen des venezuelischen Enzephalitisvirus)Example 24: Construction of the pAB097 plasmid (C gene of the Venezuelan encephalitis virus)
Es
wurde eine RT-PCR-Reaktion gemäß Beispiel
6 mit der genomischen RNA des venezuelischen Enzephalitisvirus (VEV)
(Stamm P676) (Typ IC)) (R. Kinney et al., Virology, 1992, 191, 569–580), die
gemäß Beispiel
4 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden
durchgeführt: , um das
Gen, das für
das Capsidprotein C des VEV-Virus codiert, in Form eines PstI-BamHI-Fragments zu isolieren.
Nach der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt von 856 bp mit PstI
und BamHI geschnitten, um ein PstI-BamHI-Fragment von 839 bp zu
isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem pVR1012-Vektor (Beispiel
7) ligiert, der zuvor mit PstI und BamHI geschnitten worden war,
um das pAB097-Plasmid (5698 bp) zu ergeben (
Beispiel 25: Konstruktion des pAB041-Plasmids (C-Gen des Tollwutvirus)Example 25: Construction of the pAB041 plasmid (C gene of rabies virus)
Es
wurde eine RT-PCR-Reaktion gemäß Beispiel
6 mit der genomischen RNA des Tollwutvirus (Stamm ERA) (A. Anilionis
et al., Nature, 1981, 294, 275–278),
die gemäß Beispiel
4 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden
durchgeführt: , um ein
Fragment von 1589 bp zu amplifizieren, das das Gen enthält, das
für das
Protein G des Tollwutvirus codiert. Nach der Reinigung wurde das
RT-PCR-Produkt mit PstI und BamHI geschnitten, um ein PstI-BamHI-Fragment
von 1578 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem pVR1012-Vektor
(Beispiel 7) ligiert, der zuvor mit PstI und BamHI geschnitten worden
war, um das pAB041-Plasmid (6437 bp) zu ergeben (
Beispiel 26: Herstellung und Reinigung der PlasmideExample 26: Production and purification of the plasmids
Zur Herstellung von Plasmiden für die Impfung von Tieren kann jede Technik verwendet werden, die es ermöglicht, eine Suspension von gereinigten Plasmiden zu erhalten, die zum größten Teil in der supercoiled- Form vorliegen. Diese Techniken sind dem Fachmann bekannt. Insbesondere kann die Technik der Alkalilyse, gefolgt von zwei aufeinanderfolgenden Ultrazentrifugationen in einem Cäsiumchloridgradienten in Gegenwart von Ethidiumbromid, genannt werden, wie in J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) beschrieben. Es kann auch auf die Patentanmeldungen PCT WO 95/21250 und PCT WO 96/02658 verwiesen werden, die Verfahren zur Herstellung von für die Impfung verwendbaren Plasmiden im industriellen Maßstab beschreiben. Für die Herstellung von Impfstoffen (siehe Beispiel 17) werden die gereinigten Plasmide derart resuspendiert, dass Lösungen mit hoher Konzentration (> 2 mg/ml) erhalten werden, die zum Lagern geeignet sind. Hierfür werden die Plasmide entweder in ultrareinem Wasser oder in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH-Wert 8,0) resuspendiert.to Preparation of Plasmids for The vaccination of animals can be used any technique that it allows to obtain a suspension of purified plasmids, for the most part in supercoiled form. These techniques are those skilled in the art known. In particular, the technique of alkali lysis followed by two consecutive ultracentrifugations in a cesium chloride gradient in the presence of ethidium bromide, as in J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989). It may also refer to patent applications PCT WO 95/21250 and PCT WO 96/02658, the methods of preparation for vaccination describe useful plasmids on an industrial scale. For the production of vaccines (see Example 17), the purified plasmids so resuspended that solutions with high concentration (> 2 mg / ml) suitable for storage. For this will be the plasmids either in ultrapure water or in TE buffer (10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH 8.0).
Beispiel 27: Herstellung von kombinierten VakzinenExample 27: Preparation of combined vaccines
Die verschiedenen Plasmide, die zur Herstellung eines kombinierten Vakzins erforderlich sind, werden ausgehend von ihren konzentrierten Lösungen gemischt (Beispiel 16). Die Mischungen werden so hergestellt, dass die Endkonzentration jedes Plasmids der wirksamen Dosis jedes Plasmids entspricht. Die Lösungen, die verwendbar sind, um die Endkonzentration des Impfstoffs einzustellen, können entweder eine 0,9%ige NaCl-Lösung oder PBS-Puffer sein.The various plasmids used for producing a combined vaccine are required, are mixed starting from their concentrated solutions (Example 16). The mixtures are prepared so that the final concentration of each plasmid corresponds to the effective dose of each plasmid. The Solutions, which are useful to adjust the final concentration of the vaccine, can either a 0.9% NaCl solution or PBS buffer.
Besondere Formulierungen, wie Liposome, kationische Lipide, können auch für die Herstellung von Impfstoffen verwendet werden.Special Formulations, such as liposomes, cationic lipids, can also for the Manufacture of vaccines can be used.
Beispiel 28: Impfung von PferdenExample 28: Vaccination of horses
Die Pferde werden mit Dosen von 100 μg, 250 μg oder 500 μg pro Plasmid geimpft.The Horses are given with doses of 100 μg, 250 μg or 500 μg per Inoculated plasmid.
Die Injektionen können auf intramuskulärem Weg unter Verwendung einer Nadel in den Halsmuskel durchgeführt werden. In diesem Fall werden die Impfdosen in einem Volumen von 2 ml verabreicht.The Injections can on intramuscular Be carried out using a needle in the neck muscle. In this case, the vaccine doses are administered in a volume of 2 ml.
Die Injektionen können auf intradermalem Weg unter Verwendung einer Flüssigstrahlinjektionsvorrichtung (ohne Nadel) durchgeführt werden, die eine 0,2 ml-Dosis an 5 Punkten liefert (0,04 ml pro Injektionspunkt) (zum Beispiel die "PIGJET"-Vorrichtung). In diesem Fall werden die Impfdosen in Volumen von 0,2 oder 0,4 ml verabreicht, was einer bzw. zwei Verabreichungen entspricht. Wenn zwei aufeinanderfolgende Verabreichungen unter Verwendung der PIGJET-Vorrichtung erfolgen, werden diese Verabreichungen versetzt vorgenommen, so dass die beiden Injektionsbereiche durch einen Abstand von etwa 1 bis 2 Zentimetern voneinander getrennt sind.The Injections can by an intradermal route using a liquid jet injection device (without needle) which delivers a 0.2 ml dose at 5 points (0.04 ml per Injection point) (for example, the "PIGJET" device). In this case will be the doses administered in volumes of 0.2 or 0.4 ml, giving a or two administrations. If two consecutive Administrations using the PIGJET device, these administrations are made offset so that the two Injection areas by a distance of about 1 to 2 centimeters are separated from each other.
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