DE69731955T2

DE69731955T2 - Kombination von saurer protease-enzyme und saure puffers und ihre verwendung

Info

Publication number: DE69731955T2
Application number: DE69731955T
Authority: DE
Inventors: J. Scott NORTON; Glen Gillis; Michael Bishop
Original assignee: Active Organics Inc
Current assignee: Lipotec USA Inc
Priority date: 1996-06-13
Filing date: 1997-06-13
Publication date: 2005-12-22
Anticipated expiration: 2017-06-14
Also published as: KR20000016635A; DK0921785T3; US5976556A; ES2383682T3; PT921785E; JP2000512298A; ATE284670T1; DE69731955D1; EP1598057A1; US6569437B1; WO1997047283A1; EP0921785A1; EP0921785A4; EP0921785B1; EP1598057B1; JP2007302680A; ATE552891T1; AU3396597A; ES2235239T3; JP4681087B2

Description

1. Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Verbessern der Struktur und des Erscheinungsbildes der Haut, wobei Zusammensetzungen verwendet werden, die zumindest ein saure Protease-Enzym und einen säurehaltigen Puffer umfassen, wobei der säurehaltige Puffer eine Säure und eine pharmazeutisch oder kosmetisch akzeptable Trägersubstanz gemäß Anspruch 1 aufweist.
2. Hintergrund der Erfindung
Es ist gut belegt, dass Abschilferung bzw. Schuppung der epidermalen Schichten bzw. der Oberhautschichten der menschlichen Haut eine erhöhte Rate epidermaler Zellerneuerung induziert (E. Phillips, 1995, U.S. Patent Nr. 5,431,913; W. P. Smith, 1994, Cosmetics and Toiletries 109: 41–8). Die menschliche Epidermis bzw. Oberhaut besteht aus mehreren Lagen in Schichten angeordneter schuppiger Epithelzellen, die sich in einem konstanten Erneuerungszustand befinden. Neue Zellen werden zuerst in der Basalschicht, welche die innerste Zellmembran der Epidermis ist, gebildet. Diese Zellen werden durch die Produktion noch neuerer Zellen verdrängt und nachfolgend zu der Außenschicht der Epidermis, dem Stratum corneum bzw. der Hornschicht, transportiert, wo sie gewöhnlich alle zwei bis drei Wochen abgestoßen (abgeschilfert) werden. Der Allgemeinzustand und das Erscheinungsbild der menschlichen Haut hängen in hohem Maße von der Rate dieses Prozesses ab.
Gewisse Situationen und Bedingungen, wie beispielsweise das Altern oder Umweltbelastung, können diesen normalen Prozess stören und können zu einer allgemein verringerten Zellerneuerungsrate führen (VanScott und Yu, 1984, J. Am. Acad. Dermatol. 11: 867–79). Da die Zeit, die eine Zellschicht benötigt, um von der Basalschicht zur Hornschicht zu wandern, mit dem Alter der Person zunimmt, nimmt die Rate der epidermalen Zellerneuerung ab. Es wurde berichtet, dass sich bei einer typischen zwanzigjährigen Person, die Zellen in den Außenschichten der Epidermis im Durchschnitt alle zwei Wochen erneuern, während die Zellerneuerungsintervalle einer reiferen Haut bis zu doppelt so lang dauern können. (E. Phillips, 1995, U.S. Patent Nr. 5,431,913). Die Abnahme der Zellerneuerungsrate infolge Alterung kann durch Umgebungsbedingungen, wie beispielsweise der Solarstrahlung und anderen Klimabedingungen ausgesetzt zu sein, exazerbieren bzw. verschlechtert werden. (K. E. Burke, 1990, Postgraduate Medicine 88 (1): 207–27). Eine Abnahme der Zellerneuerungsrate erhöht die Zeit, in der Zellen in den Außenschichten der Haut Umweltbedingungen ausgesetzt sind, und kann zu weiterem und/oder kumulativem Schaden führen. Gewisse Studien legen nahe, dass eine Abnahme der epidermalen Zellerneuerungsrate bzw. der Turnover-Rate mit einem Anstieg der Korneocytenkohäsion (intercorneocyte cohesion) verbunden ist (VanScott und Yu, 1989, Cutis 43: 222–28).
Die Zellen der Epidermisschicht werden durch proteinhaltige Bestandteile zusammengehalten, wie beispielsweise durch Hemidesmosomen, Desmosomen, Nexus bzw. Gap-junctions, Glykosaminoglykane, Proteoglykane und andere in der Haut vorkommende Bestandteile, von denen alle die Fähigkeit besitzen, sich miteinander und mit zellulären Komponenten zu verbinden. Dieses Miteinander-Verbinden der Epidermiszellen wird als „Korneocytenkohäsion" bezeichnet und der Grad der beteiligten Kohäsionsfestigkeit wird durch Faktoren wie Hydratisierung und pH-Wert beeinflusst. Erhöhte Korneocytenkohäsion resultiert in Hyperkeratinisierung bzw. Keratinüberproduktion und ist durch dicke und oft trockene oder schuppige Haut charakterisiert, die durch die Retention bzw. das Zurückhalten der Epidermiszellen verursacht ist. Das Gleichgewicht, das zwischen der Kohäsion und der Zell-Turnover-Rate existiert, ist für die normale Verjüngung der jungen Haut verantwortlich und Ungleichgewichte dieser Faktoren können in dem gealterten, rauen und unattraktiven Anblick reifer bzw. alter Epidermisoberflächen resultieren. Die Suche nach lokal wirksamen Bestandteilen, die die Zellerneuerungsrate und die Korneocytenkohäsion im Gleichgewicht halten, ist in heutigen dermatologischen Forschungsbemühungen vordringlich (VanScott und Yu, 1984, J. Am. Acad. Dermatol. 11: 867–79).
Jüngste Fortschritte auf diesem Forschungsgebiet haben eine Anzahl lokal wirksamer saurer Verbindungen geliefert, die in dieser Beziehung viel versprechend sind (Yu et al., 1978, U.S. Patent Nr. 4,105,783; Yu et al., 1982, U.S. Patent Nr. 4,363,815). Langzeitbehandlungen mit diesen sauren Verbindungen resultieren in einer erhöhten Rate epidermaler Zellerneuerung. Diese als epidermal aktiv bekannten sauren Bestandteile, wie beispielsweise Hydroxy- oder Ketosäuren mit niedrigem Molekulargewicht und deren Ester, sind bezüglich ihrer Wirksamkeit als keratolytische bzw. hornhautablösende/Desquamations- bzw. Schälmittel gut dokumentiert. Hohe Konzentrationen dieser Säuren (z. B. Salicyl- und Glykolsäuren) ebenso wie anderer Säuren, wie beispielsweise Trichloressigsäure, sind für ihre Fähigkeit, an der Anwendungsstelle eine Gewebszerstörung zu verursachen, bekannt (W. L. Epstein, 1990, in Irritant Contact Dermatitis, Jackson und Glodner, Hrsg., Marcel Decker, Inc., New York und Basel, S. 127–165; Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, Hrsg., 16. Auflage, Mack Publishing, Inc., Easton, PA., 1980). Es wurde gezeigt, dass diese Säuren bei niedrigeren Konzentrationen die Fähigkeit besitzen, die abgestorbenen Zellen in dem Keratin reichen Stratum corneum bzw. der Hornschicht zu lockern und die Korneocytenkohäsion zu unterbrechen, wodurch die Desquamation bzw. Abschuppung erleichtert wird; diese Wirkung wird „keratolytische Wirkung" genannt (Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, Hrsg., 16. Auflage, Mack Publishing, Inc., Easton, PA., 1980; W. P. Smith, 1994, Cosmetics and Toiletries 109: 41–8).
Die meisten Keratolytika sind Hautreizmittel, einschließlich der oben Aufgelisteten. Obwohl einige Keratolytika als wirksamer als andere hervorgehoben werden, zeigt ein Vergleich des therapeutischen Index jeder dieser Säuren wenig Vorteil untereinander. Der „therapeutische Index" ist ein genaues Verfahren zur Bewertung der Wirksamkeit dieser Bestandteile, welcher die keratolytische Wirkung ebenso wie den Grad der Irritation bzw. Reizung bei einer vorgegebenen Konzentration berücksichtigt. Es wurde gezeigt, dass sogar niedrige Pegel bzw. Werte dieser Bestandteile (größer als 4% Säurekonzentration) eine signifikante Hautirritation bewirken. Die Verwendung sogar niedri gerer Konzentrationen dieser Bestandteile reduziert die Irritation, reduziert aber allgemein die keratolytische Wirksamkeit. Außerdem reduziert Daueranwendung der Säuren die Wirkung der Zellerneuerungsinduktion (W. P. Smith, 1994, Cosmetics and Toiletries 109: 41–8). Diese Unzulänglichkeiten machen auf die Notwendigkeit einer Methodik aufmerksam, die keratolytische Wirksamkeit dieser Säuren bei nicht irritierenden Konzentrationen zu verstärken.
Die Anwendung proteolytischer Enzyme bei einer Lokaltherapie wurde schon eine Zeit lang beispielsweise für Narbenentfernung bei Verbrennungswunden und als Zusatz zur antimikrobiellen Therapie verwendet (G. Rodeheaver, 1975, Am. J. Surg. 129 (5): 537–544). Diese Enzyme umfassen solche, die im Allgemeinen auf pflanzliche Rohstoffquellen beschränkt sind, wie beispielsweise Papaya (Papain), Feige (Ficin) und Ananas (Bromelain). Kosmetische Zubereitungen, die Extrakte dieser Pflanzen enthalten und beworben werden, als Mittel, die die Entfernung der äußeren epidermalen Schichten durch proteolytische Wirkung verstärken, sind kommerziell vermarktet worden. Obwohl die Substratspezifität und das Wirkungsspektrum in Bezug zu dem pH-Wert nahe legt, dass die proteolytische Wirkung dieser Zubereitungen in einer keratolytischen Aktivität an den äußeren Epidermisschichten resultieren sollte, sind Anwendungen proteolytischer Enzyme, die früher bei der Lokaltherapie verwendet wurden, nicht ohne Nachteile gewesen.
Die gegenwärtig bei kosmetischen Anwendungen verwendeten Enzyme (z. B. Papain, Bromelain und Ficin) zeigen im Allgemeinen über einen weiten pH-Bereich von pH 3–pH 9 proteolytische Aktivität (Glazer und Smith, 1971, in The Enzymes, Band 3, P. Boyer, Hrsg., Academic Press, New York, S. 501–546). Wahrscheinlich ist der weite pH-Bereich dieser aus Pflanzen gewonnenen Enzyme für zumindest einige der Probleme verantwortlich, die mit Langzeitexposition auf der Haut assoziiert sind. Menschliche epidermale Systeme halten einen pH-Wert-Gradienten innerhalb der in Lagen angeordneten Schichten der Haut aufrecht; die äußeren Schichten sollen einen Durchschnitts-pH-Wert von ungefähr 5,5 zeigen (W. P. Smith, 1994, Cosmetics and Toiletries 109: 41–48). Der pH-Wert der darauffolgenden Schichten der Epi dermis erhöht sich mit der Tiefe, wobei ein End-pH-Wert näher dem physiologischen Bereich (ungefähr pH 7,4) an der dermalen bzw. Lederhautschicht erreicht wird. Da die oben erwähnten aus Pflanzen gewonnenen Enzyme über diesen pH-Gradienten hinweg aktiv bleiben, gibt es keine pH-Wert-Steuerung der Aktivität dieser pflanzlichen Enzyme, wenn sie auf die Haut aufgetragen werden.
Der Grad therapeutischer Wirksamkeit, der von der lokalen Anwendung proteolytischer Enzyme abgeleitet wird, wurde durch die intrinsischen katalytischen Eigenschaften dieser Enzyme bestimmt. Der weite Bereich proteolytischer Aktivität in Bezug auf den pH-Wert, der von den oben diskutierten Proteasen (pH 3–9) gezeigt wurde, lässt nur wenig oder keine Steuerung der proteolytischen Aktivität durch die Produktzubereitung zu. (Glazer und Smith, 1971, in The Enzymes, Band 3, P. Boyer, Hrsg., Academic Press, New York, S. 501–546). Die Pflanzen, aus denen diese Enzyme gewonnen wurden, sind dafür bekannt, eine irritierende Kontaktdermatitis mit Symptomen, die Juckreiz, Ödeme und Blasenbildung einschließen, zu verursachen. Es wurde postuliert, dass diese Enzyme die Primärursache dieser Symptome sind, und zwar möglicherweise infolge der exzessiven Abnahme der Korneocytenkohäsion (W. L. Epstein, 1990, in Irritant Contact Dermatitis, Jackson und Glodner, Hrsg., Marcel Decker, Inc., New York and Basel, S. 127–165). Die gegenwärtig in kosmetischen Anwendungen verwendeten Enzyme können ihre substratabhängige proteolytische Aktivität durch alle Schichten der Epidermis hindurch zeigen. Ungesteuerte Proteolyse epidermaler Proteine, die der Stabilisierung der Korneocytenkohäsion dienen, könnte diese Korneocytenkohäsion exzessiv verringern und eine nachfolgende Irritation bzw. Reizung bewirken. Proteolytischer Angriff an der Basalschicht der Epidermis, wo die Zellerneuerung entsteht, könnte Ungleichgewichte in der Rate der epidermalen Zellerneuerung bewirken. Blasenbildung und Ödeme könnten das Ergebnis eines ungesteuerten proteolytischen Angriffs an der Basalschicht durch diese Enzymklasse sein. Diese Möglichkeit wird durch die Tatsache gestützt, dass Injektion dieser pflanzlichen Enzyme in die Haut von Säugetieren bekanntermaßen Ödeme in der Haut bewirkt. (Morimoto et al., 1987, Ensho 7 (6): 563–567).
Dieser Befund wurde verwendet, um experimentelle Ödeme in der dermatologischen Forschung zu erzeugen. Ferner sind die oben aufgelisteten Symptome einer irritativen Kontaktdermatitis denen ähnlich, die durch die effektivsten Konzentrationen epidermal aktiver saurer Bestandteile in gegenwärtig verwendeten Lokalanwendungen hervorgerufen werden. Daher sollte ein besser gesteuerter Ansatz zur proteolytischen Aktivität in Bezug auf Lokalanwendungen ein erwünschtes Resultat ohne diese Nebenwirkungen erzeugen.
Es wurde von Zusammensetzungen berichtet, die ein proteolytisches Enzym enthalten, z. B. Pepsin, und mehrere Säuren zur Lösung bzw. Lockerung dichter nekrotischer bzw. abgestorbener Formationen, wie sie zum Beispiel bei Verbrennungen dritten Grades gesehen werden. (Sowjetisches Patent Nr. 439299, 1974). Es gibt keine Anzeichen dafür, dass diese Zusammensetzungen zur Verbesserung der epidermalen Exfoliation bzw. Abschuppung nützlich sind oder dass diese Zusammensetzungen nur für begrenzte Zeitperioden wirksam sind.
3. Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung sieht ein kosmetisches Verfahren gemäß Anspruch 1 zum Verbessern der Struktur und/oder des Erscheinungsbildes der Haut vor. Die verwendeten Zusammensetzungen bestehen zumindest aus einer sauren Protease und einem säurehaltigen Puffer. Für die Zwecke dieser Erfindung ist die saure Protease ein Enzym, welches Peptidylhydrolase (proteolytische) Aktivität unterhalb des Durchschnitts-pH-Werts der Hautoberfläche zeigt und signifikant inaktiv bei einem pH-Wert größer oder gleich dem Durchschnitts-pH-Wert der Hautoberfläche ist, der für Menschen ungefähr beim pH-Wert 5,5 liegt (W. P. Smith, 1994, Cosmetics and Toiletries 109: 41–8). Für Männer beträgt der Durchschnitts-pH-Wert der Hautoberfläche ungefähr pH 5,3 und für Frauen ist er ungefähr bei pH 6 (Ohman und Vahlquist, 1994, Acta Dermato-Venereol. 74 (5): 375–379). Für die Zwecke dieser Erfindung umfasst der Durchschnitts-pH-Wert der Hautoberfläche (der ungefähr bei pH 5,5 liegt) zusätzlich zu anderen, geschlechtsspezifischen Variationen, zum Beispiel dass ein pH-Wert von ungefähr pH 5,5 einen Bereich von ungefähr pH 5,3 umfasst, den Durchschnitts-pH-Wert der Hautoberfläche eines Mannes, bis zu ungefähr pH 6, den Durchschnitts-pH-Wert der Hautoberfläche einer Frau. Vorzugsweise zeigen die in dieser Erfindung nützlichen Proteasen bei einem pH-Wert größer oder gleich dem Durchschnitts-pH-Wert der Hautoberfläche (ungefähr pH 5,3–6) weniger als ungefähr 10% der enzymatischen Aktivität, die sie bei ihren jeweiligen optimalen pH-Werten zeigen, welche unterhalb des Durchschnitts-pH-Werts der Hautoberfläche liegt.
Die saure Protease kann sich in der Apoenzym-, Holoenzym-, Isoenzym- oder Zymogen-Form befinden. Der saure Protease-Bestandteil der Zusammensetzung kann in einer Menge von ungefähr 0,001 bis ungefähr 75 Gewichts-% der Endzusammensetzung vorliegen, vorzugsweise ungefähr 0,1% bis ungefähr 50%, noch bevorzugter ungefähr 1% bis ungefähr 5%. Die Protease(n) besitzt (besitzen) eine spezifische Aktivität von ungefähr 1 bis ungefähr 5000 HUT-Einheiten/mg wie durch das Verfahren bestimmt ist, das im Food Chemical CODEX, 3. Aufl. (1981), S. 496–497, National Academy Press, Washington, D. C., modifiziert wie in Abschnitt 5.1 unten beschrieben ist. Vorzugsweise besitzt (besitzen) die Protease(n) eine spezifische Aktivität von ungefähr 50 bis ungefähr 3000 HUT-Einheiten/mg, noch bevorzugter ungefähr 500 bis ungefähr 1500 HUT-Einheiten/mg.
Der säurehaltige Puffer ist eine Zusammensetzung, die, wenn sie lokal auf die Haut aufgetragen wird, vorübergehend den pH-Wert der Hautoberfläche auf weniger als ungefähr pH 5,5 erniedrigt, aber nicht niedriger als ungefähr pH 1, vorzugsweise auf zwischen ungefähr pH 2,5 und pH 4,5. Die säurehaltige Puffer-Zusammensetzung weist zumindest eine Säure und eine pharmazeutisch oder kosmetisch akzeptable Trägersubstanz, Transportsubstanz oder Grundlagensubstanz auf. Die Säurekomponente des Puffers kann ein oder mehr anorganische Säure, oder ein oder mehr organische Säuren oder eine Kombination aus anorganischen und/oder organischen Säuren sein. Der säurehaltige Puffer ist über die Zeit hinweg für Neutralisation durch natürliche epidermale Vorgänge, wie beispielsweise Perspiration bzw. Hautatmung auf den Durchschnitts-pH-Wert der Hautoberfläche anfällig. Die Zeit, die nötig ist, um den säurehaltigen Puffer zu neutralisieren und somit die Proteasen zu inaktivieren, wird von der Zubereitung des säurehaltigen Puffers abhängen. Zum Beispiel ergeben sich kürzere Zeitperioden, wenn der säurehaltige Puffer eine schwache Säure oder ein schwache Puffersubstanz enthält, um der relativen Basizität der Epidermis entgegenzuwirken; längere Zeitperioden ergeben sich, wenn eine stärkere Säure benutzt wird oder eine stärkere Puffersubstanz in dem säurehaltigen Puffer verwendet wird. Die Säurekomponente des Puffers kann eine oder mehr anorganische Säuren sein, oder eine oder mehr organische Säuren, oder irgendeine Kombination aus anorganischen und/oder organischen Säuren und kann in einer Menge von ungefähr 0,001 bis ungefähr 95 Gewichts-% der Endzusammensetzung vorhanden sein, vorzugsweise ungefähr 0,01% bis ungefähr 25%, noch bevorzugter ungefähr 1% bis ungefähr 5%.
Die Steuerung der Zeitperiode, die erforderlich ist, damit der pH-Wert der Hautoberfläche nach lokaler Anwendung einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung auf einen pH-Wert von ungefähr 5,5 zurückkehrt, erlaubt die Steuerung der Protease-Enzymaktivität. Es ist mittels dieser Steuerung der proteolytischen Aktivität, dass die vorliegende Erfindung die Nachteile und Komplikationen überwindet, die im Stand der Technik gefunden werden, wie beispielsweise Jucken, Brennen, Blasenbildung etc., die durch proteolytische Enzyme mit breitem pH-Wert-Spektrum bewirkt werden. Die Zeitperiode, die der Oberflächen-pH-Wert der Haut benötigt, um auf ungefähr pH 5,5 zurückzukehren, wird durch eine Anzahl von Faktoren bestimmt, einschließlich Hauttyp, Erkrankung oder Störung, die behandelt wird und die Empfindlichkeit der Haut der Einzelperson, die behandelt wird. Um Rückschläge bzw. Nachteile und Komplikationen, die im Stand der Technik gefunden werden zu vermeiden, sollte die Zeitperiode jeder individuelle Anwendung einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung idealerweise 4 Stunden nicht überschreiten, vorzugsweise beträgt die Zeitperiode zwischen ungefähr 5 Minuten bis ungefähr 4 Stunden, noch bevorzugter zwischen ungefähr 30 Minuten und unge fähr 2 Stunden, am bevorzugtesten zwischen ungefähr 30 Minuten bis ungefähr einer Stunde.
Es soll ferner darauf hingewiesen werden, dass die kosmetischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung derart sind, dass sie, wenn sie auf die Haut aufgetragen werden, sie deren Struktur oder Erscheinungsbild verbessern oder das epidermale Abschuppung und/oder epidermale Zellerneuerung, verstärken, ohne notwendigerweise einen Nutzen oder einen Behandlungseffekt zu liefern oder einen abnormen biologischen Zustand, Krankheit oder Störung zu verhindern. In diesem Zusammenhang bedeutet Verbessern der Struktur oder des Erscheinungsbildes der Haut oder Verstärken der epidermalen Abschuppung und/oder epidermalen Zellerneuerung, dass das Vorsehen einer natürlich aussehenden Oberfläche und/oder einer natürlich fühlenden Hautoberfläche eingeschlossen ist, um die Schönheit oder Glätte der Haut gegenüber vor der Behandlung zu verstärken.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel zur Verstärkung der epidermalen Abschuppung und/oder der epidermalen Zellerneuerung, umfasst die Zusammensetzung Pepsin und Milchsäure. In diesem bevorzugten Ausführungsbeispiel zur Verstärkung der epidermalen Abschuppung und/oder der Zellerneuerung, weist die Zusammensetzung ungefähr 1 Gewichts-% Pepsin auf, das eine spezifische Aktivität von ungefähr 1000 HUT-Einheiten/mg besitzt, und ungefähr 3 Gewichts-% Milchsäure. In einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel zur Verstärkung der epidermalen Abschuppung und/oder Zellerneuerung, weist die Zusammensetzung ungefähr 1 Gewichts-% Pepsin mit einer spezifische Aktivität von ungefähr 1000 HUT-Einheiten/mg und ungefähr 1,5 Gewichts-% Milchsäure auf. In noch einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel weist die Zusammensetzung 1 Gewichts-% Pepsin und 1 Gewichts-% Phosphorsäure auf. In einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel weist die Zusammensetzung 1 Gewichts-% Pepsin und 3 Gewichts-% Phosphorsäure auf. In noch einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel weist die Zusammensetzung 1 Gewichts-% Pepsin und 1 Gewichts-% Zitronensäure auf. In noch einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel weist die Zusammensetzung 1 Gewichts-% Pepsin und 3 Gewichts-% Zitronensäure auf.
Die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung zeigen überraschenderweise kosmetische Effekte bei Hautstörungen, die bisher von Säuren, α-Hydroxycarbonsäuren, Salizylsäuren oder Proteasen mit breitem pH-Wert-Spektrum allein nicht erreicht wurden.
3.1 Definitionen

Die folgenden Ausdrücke, so wie sie in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sollen Folgendes umfassen:

Säurehaltiger Puffer:

Eine Zusammensetzung, die eine Säure und ein pharmazeutisch oder kosmetisch akzeptable Träger-, Transport- oder Grundlagensubstanz enthält, welche bei lokaler Anwendung auf der Haut den OberflächenpH-Wert der Haut auf unter ungefähr pH 5,5 erniedrigt und durch natürliche Hautvorgänge einer Neutralisation unterliegt, so dass die natürlichen Hautprozesse den pH-Wert der Hautoberfläche in Abhängigkeit von der Zeit auf normal zurückbringen (was ungefähr bei pH 5,5 liegt). Der Säurebestandteil des Puffers kann eine oder mehr anorganische Säuren, oder eine oder mehr organische Säuren oder irgendeine Kombination aus anorganischen und/oder organischen Säuren sein.

Saure Protease:

Ein Enzym, welches Peptidylhydrolase-(proteolytische)-Aktivität bei einem pH-Wert unterhalb des normalen durchschnittlichen Oberflächen-pH-Werts der Haut, welcher ungefähr bei pH 5,5 liegt, aufweist, und welches unbedeutend aktiv ist bei einem pH-

	Wert, der höher oder gleich einem solchen durchschnittlichen Oberflächen-pH-Wert der Haut ist, d. h. weniger als ungefähr 10% Aktivität bei ungefähr pH 5,5 oder höher verglichen mit der Spitzenaktivität bei einem pH-Wert niedriger als pH 5,5. Die saure Protease kann in der Apoenzym-, Holoenzym-, Isoenzym oder Zymogenform vorliegen.
kosmetisch:	Eine Zubereitung, die auf die Haut aufgetragen werden soll, die ihre Struktur oder ihr Erscheinungsbild verbessert, ohne notwendigerweise einen Nutzen oder einen Effekt beim Behandeln oder Verhindern eines anormalen biologischen Zustands oder einer Krankheit zu bringen. Solche Verbesserung umfasst das Vorsehen eines vorübergehenden Feuchthalteeffekts an der Säugetierepidermis.
wirksame Menge:	Eine Menge einer Zusammensetzung, die ausreicht, um signifikant eine positive Modifizierung des zu behandelnden Zustands hervorzurufen, aber gering genug ist, um schwerwiegende Nebenwirkungen zu vermeiden. Die wirksame Menge der Zusammensetzung wird mit dem zu behandelndem Einzelzustand, dem Alter und dem körperlichen Zustand der zu behandelnden Person, der Schwere des Zustands, der Dauer der Behandlung, den kosmetisch akzeptablen verwendeten Trägersubstanzen und ähnlichen Faktoren innerhalb des Wissensbereichs und der Expertise der Fachleute variieren.
Epidermale Zellerneuerung:	Der Prozess, bei welchem neue Hautzellen in der Basalschicht gebildet, zu der Außenschicht, der Hornschicht (Stratum corneum), transportiert und an

	schließend abgeschilfert und durch noch neuere Hautzellen ersetzt werden.
Exfoliation:	Das Lösen und Abwerfen der oberflächlichen Zellen eines Epithels und von irgendeinem Oberflächengewebe.
Regulieren der Hautatrophie:	Das Verhindern, Verlangsamen, Anhalten, Behandeln oder Umkehren des Atrophie-Prozesses der Säugetierhaut.
Hautatrophie:	Das Dünnerwerden und/oder der allgemeine Abbau der Lederhaut- bzw. Dermisschicht der Säugetierhaut, häufig durch eine Abnahme von Kollagen und/oder Elastin ebenso wie durch eine verringerte Zahl, Größe und Teilungspotential der Fibroblastenzellen gekennzeichnet. Hautatrophie ist ein natürliches Ergebnis des Alterns, kann aber sowohl durch intrinsische als auch extrinsische Faktoren verursacht sein, wie normales Zeitaltern, Lichtschaden, Verbrennungs- oder chemischer Schaden, oder das Ausgesetztsein gegen Verunreinigungen oder Allergene, z. B. Zigarettenrauch. Hautatrophie ist oft ein unerwünschter Nebeneffekt, der aus der Behandlung mit α-Hydroxycarbonsäuren oder Salizylsäuren resultiert.

Die vorliegende Erfindung kann durch Bezugnahme auf die detaillierte Beschreibung und die verdeutlichenden Beispiele, die unbegrenzte Ausführungsbeispiele der Erfindung beispielhaft darstellen sollen, besser verstanden werden.
4. Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Balkendiagramm, das den Effekt auf die Zellerneuerungsrate bei unterschiedlichen Konzentrationen einer sauren Protease (HUT-Einheiten × 10⁶/g) (Pepsin) mit zwei unterschiedlichen Mengen eines säurehaltigen Puffers (Milchsäure) darstellt.
1,5% Milchsäure, ☐ 3% Milchsäure
2 ist ein Balkendiagramm, das den Prozentanstieg der Exfoliation/Zellerneuerungsrate darstellt bei unterschiedlichen Konzentrationen einer sauren Protease (HUT-Einheiten × 10⁶/g) (Pepsin) im Bezug zu einem säurehaltigen Puffer allein (Milchsäure) bei Konzentrationen von 1,5% und 3% darstellt.
1,5% Milchsäure, ☐ 3% Milchsäure
3 ist ein Balkendiagramm, das die Unterschiede in der Aktivität von Pepsin und AFP 2000, Solvay, Inc. Elkhart IN, zeigt, eine aus Pilzen gewonnene saure Protease, bei variierenden pH-Pegeln in dem HUT-Assay bzw. der HUT-Analyse.
AFP 2000, ☐ Pepsin
5. Detaillierte Beschreibung der Erfindung
5.1 Zusammensetzungen
Die vorliegende Erfindung sieht neuartige Zusammensetzungen vor, die die Struktur oder das Erscheinungsbild der Haut verbessern und/oder die epidermale Exfoliation bzw. Schuppung verstärken und/oder die epidermale Zellerneuerung verstärken. Die Zusammensetzungen umfassen zumindest eine saure Protease und einen säurehaltigen Puffer. Solche Zusammensetzungen werden vorzugsweise lokal aufgetragen, um systemische Effekte oder unerwünschte Nebenwirkungen zu minimieren. Der Erfinder möchte nicht auf eine spezifische Vorgehensweise eingegrenzt werden; der Erfinder glaubt jedoch, dass die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung die Verfahren der vorliegenden Erfindung dadurch erreichen, dass sie zuerst den pH-Wert der Hautoberfläche auf einen niedrigeren Wert als der durchschnittliche pH-Wert der Haut, der bei Menschen ungefähr bei pH 5,5 liegt, erniedrigen. Die pH-Reduktion ermöglicht die Aktivierung der sauren Protease-Komponente der Zusammensetzung, welche eine proteolytische/keratolytische Aktivität während des Zeitraums zeigt, in dem der Oberflächen-pH-Wert der Haut unterhalb ungefähr 5,5 liegt. Diese Zeitperiode hängt von den Haut-pH-Wert-Bedingungen des Individuums ab und kann durch die Zubereitung der säurehaltigen Pufferkomponente reguliert werden. Es liegt innerhalb der Fähigkeiten eines Fachmanns die Rezeptur so anzupassen, dass die Zeitperioden variiert werden und das gewünschte Resultat erreicht wird.
Während dieser Zeitperiode wird der säurehaltig Puffer durch natürliche epidermale Prozesse, z. B. Perspiration, neutralisiert, so dass der pH-Wert der Hautoberfläche auf normal zurückkehrt, was durchschnittlich ungefähr bei pH 5,5 liegt. Der Anstieg des pH-Wertes inaktiviert somit die saure Protease und die proteolytische/keratolytische Aktivität hört auf, d. h. nimmt um ungefähr 90% ab. Die Zeitperiode, in der der pH-Wert der Hautoberfläche unter etwa pH 5,5 liegt, und in der die Protease-Komponente aktiv ist, dauert von ungefähr 1 Minute bis ungefähr 4 Stunden, vorzugsweise von ungefähr 30 Minuten bis ungefähr 2 Stunden, noch bevorzugter zwischen etwa 30 Minuten bis etwa 1 Stunde.
Zum Zweck dieser Erfindung ist die saure Protease ein Enzym, welches signifikante Peptidylhydrolase (proteolytische) Aktivität unterhalb etwa pH 5,5 zeigt, was der durchschnittliche normale pH-Wert der Hautoberfläche ist, und bei einem pH-Wert von ungefähr 5,5 und höher signifikant inaktiv ist. Für Männer beträgt der Durchschnitts-pH-Wert der Hautoberfläche etwa 5,3 und für Frauen ungefähr 6. Zum Zweck dieser Erfindung umfasst der durchschnittliche pH-Wert der Hautoberfläche, welcher bei ungefähr pH 5,5 liegt, neben anderen, geschlechts-spezifischen Variationen, zum Beispiel dass ein pH-Wert von ungefähr 5,5 einen Bereich von ungefähr 5,3, dem Durchschnitts-pH-Wert der Haut eines Mannes, bis ungefähr pH-Wert 6, dem Durchschnitts- pH-Wert der Haut einer Frau, umfasst. Die Protease ist signifikant inaktiv, wenn ihre Aktivität gleich oder geringer als 10% der Aktivität beträgt, verglichen beispielsweise mit ihrer Aktivität kurz nach dem Auftragen auf die Haut, wie sie durch den in Abschnitt 6.1 beschriebenen Dansyl-Chlorid-Test gemessen wurde. In der vorliegenden Erfindung nützliche Proteasen sind diejenigen, welche in einem in vitro Assay bei pH-Werten von ungefähr 5,5 und höher, weniger als ungefähr 10% der enzymatischen Aktivität zeigen, die in derselben in vitro Methode bei einem optimalen pH-Wert (weniger als ungefähr 5,5) der bestimmten Protease gemessen wurde. Siehe z. B. Abschnitt 6.4 unten.
Die saure Protease kann sich in der Apoenzym-, Holoenzym-, Isoenzym- oder Zymogenform befinden. Ferner kann die saure Protease von irgendeiner dem Fachmann bekannten Quelle isoliert werden, wie beispielsweise Bakterien, Pilze, Gewebekulturzellen und Tieren. Die saure Protease-Zubereitung kann in einer Menge von ungefähr 0,001 bis 75 Gewichts-% der Endzusammensetzung vorhanden sein, vorzugsweise ungefähr 0,1% bis ungefähr 50% und am bevorzugtesten ungefähr 1% bis ungefähr 5%. Die Protease(n) wird (werden) eine spezifische Aktivität von etwa 1 bis etwa 5000 HUT-Einheiten/mg, vorzugsweise etwa 50 bis etwa 3000 HUT-Einheiten/mg und am bevorzugtesten etwa 500 bis etwa 1500 HUT-Einheiten/mg besitzen, wie es durch das in Food Chemicals CODEX, 3. Auflage, (1981), S. 496–497, National Academy Press, Washington, D. C., beschriebene Verfahren bestimmt wurde, das wie unten beschrieben modifiziert wurde.
Kurz gesagt, man bereitet zuerst die folgende Stammlösung zu. Hämoglobinsubstrat wird durch das Mischen von 2 g bovinem bzw. Rinder-Hämoglobin in 80 ml destilliertem Wasser zubereitet. Die Lösung wird dann durch Zusetzen von beispielsweise Phosphorsäure und/oder Zitronensäure auf einen pH-Wert von 2 titriert und zusätzliches destilliertes Wasser wird bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ml hinzugefügt. Diese Lösung wird in vier gleiche Teile aufgeteilt und jeder Teil wird mit 50% Natriumhydroxid oder 50% Salzsäure auf den gewünschten pH-Wert titriert. Diese Endlösungen werden bei 30°C für 20 Minuten erwärmt und dann durch Glaswolle gefiltert. TCA Stammlösung wird durch Auflösen von Trichloressigsäure in destilliertem Wasser zubereitet für eine Endkonzentration von 5% (G/V = Gewicht/Volumen) TCA.
Danach bereite für jede Probe, deren proteolytische Aktivität gemessen werden soll, mit „B" und „T" gekennzeichnete Reagenzgläser bzw. Röhrchen vor. Fülle in jedes Röhrchen 4 ml der Hämoglobinlösung und lagere es bei 37°C, so dass die Probe auf 37°C vorgewärmt wird. Füge dem „T"-Röhrchen 100 μg Enzymlösung hinzu, rühre behutsam um und inkubiere es bei 37°C für 20 Minuten. Als nächstes füge zu jedem 10 ml TCA-Stammlösung hinzu. Füge dem mit „B" bezeichnetem Röhrchen, welches die Kontrolle für die Hintergrundabsorbanz ist, eine gleiche Menge des Enzyms, wie oben dem „T"-Röhrchen, zu. Zentrifugiere jedes Röhrchen und filtere jede Probe durch einen Spritzenfilter und platziere die gefilterte Probe in eine Quartzkuvette um die Absorbanz bei 280 nm abzulesen. Die tatsächliche Absorbanz wird bestimmt durch Subtrahieren der Absorbanz der „T"-Probe von der Hintergrundprobe (background). Eine Standardkurve kann durch Messen bekannter Protease-Aktivitätsmengen erzeugt werden.
Eine HUT-Einheit proteolytischer Aktivität wird definiert als die Enzymmenge, die in einer Minute unter spezifischen Assay-Bedingungen ein Hydrolysat erzeugt, dessen Absorbanz bei 280 nm die gleiche ist wie die einer Lösung, die 1,10 μg Tyrosin pro ml in 0,006 N Salzsäure enthält. HUT-Einheiten pro Gramm werden durch die folgende Gleichung bestimmt: HUT/g = (Absorbanz bei 280 nm × V)/(0,0084 × T × W)wobei V das Endvolumen der Testlösung, T die Reaktionszeit in Minuten und W das Trockengewicht der in dem Assay verwendeten Originalenzymprobe in Gramm ist. Die Proteinkonzentration wird durch irgendein in der Technik bekanntes Verfahren bestimmt, wie beispielsweise der Bradford-Assay, welcher in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., (Hrsg.), John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994, beschrieben ist.
Beispiele solcher Proteasen umfassen, sind aber nicht auf sie beschränkt, Pepsin, Kathepsin, menschliche Harnsäureprotease, aus Neurospora oryzae, Mucor pusillus, Mucor miehei, Rhizopus chinensis oder Endothia parasitica gewonnene Pilzproteasen, bakterielle Proteasen Rhizopuspepsin, Penecillopepsin und Endothiapepsin. Ferner können die Proteasen aus Prozessen gewonnen werden, die Gentechnologieverfahren und -methoden beinhalten, sei es, dass embryonale, reife oder induzierte bzw. künstliche hergestellte Zellen und Produkte beteiligt sind, die DNA-Segmente, Plasmide, Vektoren oder Expressionen davon, oder transformierte Zellen oder reine Kulturen umfassen. Es sollte klar sein, dass zwei oder mehr saure Proteasen in Kombination verwendet werden können, so dass die Gesamtmenge in Gewichtsprozent innerhalb der oben erwähnten Bereiche liegt.
Der säurehaltige Puffer ist eine Zusammensetzung, die bei lokaler Anwendung auf der Haut den pH-Wert der Hautoberfläche vorübergehend auf niedriger als etwa pH 5,5 erniedrigt, aber nicht niedriger als etwa pH 1, vorzugsweise auf etwa pH 2,5 bis etwa pH 4,5. Die säurehaltige Pufferzusammensetzung enthält zumindest eine Säure und eine pharmazeutisch oder kosmetisch akzeptable Träger-, Transport- oder Grundlagensubstanz. Die Säurekomponente des Puffers unterliegt der Neutralisation auf den durchschnittlichen Normal-pH-Wert der Hautoberfläche, und zwar durch natürliche epidermale Prozesse, wie beispielsweise Perspiration, in Abhängigkeit von der Zeit. Die Zeit, die zur Neutralisation des säurehaltigen Puffers nötig ist und somit um die Protease zu inaktivieren, wird von der Zubereitung des säurehaltigen Puffers abhängen. Zum Beispiel ergeben sich kürzere Zeitperioden, wenn das Säure- und/oder Pufferagens in dem säurehaltigen Puffer bezüglich der Neutralisationskapazität schwach ist; längere Zeitperioden ergeben sich, wenn eine stärkere Säure verwendet wird oder ein stärkeres Pufferungsagens in dem säurehaltigen Puffer eingesetzt wird.
Die Säurekomponente des säurehaltigen Puffers der Zusammensetzung kann eine oder mehr organische Säuren, oder eine oder mehr anorganische Säuren, oder irgendeine Kombination aus anorganischen und/oder organischen Säuren sein und kann in einer Menge von ungefähr 0,001 bis ungefähr 95 Gewichts-% der Endzusammensetzung vorliegen, vorzugsweise etwa 0,01% bis etwa 25%, noch bevorzugter etwa 1% bis etwa 5%. Der Gewichtsanteil wird von der Säurestärke und der Molarität abhängen. Außerdem sollte die Menge und Stärke der Säurekomponente in der Zusammensetzung derart sein, dass effektive Grade proteolytischer/keratolytischer Aktivität, aber keine signifikanten Grade von Hautirritation auftreten. Ferner kann die Säurekomponente des säurehaltigen Puffers eine Säure umfassen oder nicht, von der zwar nicht bewiesen ist, dass sie keratolytische Aktivität zeigt, die aber zur Aktivierung der Protease lediglich eine saure Umgebung liefert. Beispiele solcher Säuren umfassen jedes Molekül, das in einer Zusammensetzung dazu gebracht werden kann, den pH-Wert der Epidermis auf pH-Wert-Bereiche von ungefähr 0,1 bis ungefähr 7 abzupuffern, wobei die Folgenden eingeschlossen, aber nicht auf sie beschränkt sind: Milchsäure, Sorbinsäure, Phosphorsäure, Zitronensäure, Glykolsäure, Apfelsäure, Glukonsäure, Phosphorsäure, Trichloressigsäure, Polyphosphorsäure, Natriumbisulfat und Kaliumbisulfat. Es sollte klar sein, dass zwei oder mehr Säuren in Kombination verwendet werden können, und zwar so, dass die Gesamtmenge in Gewichtsprozent innerhalb der oben genannten Bereiche liegt.
Der säurehaltige Puffer enthält auch eine Komponente, welche eine pharmazeutisch oder kosmetisch akzeptable Träger-, Transport- oder Grundlagensubstanz ist. Beispiele für solche pharmazeutisch akzeptablen Träger-, Transport- oder Grundlagensubstanzen sind Fachleuten bekannt und können beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage, A. R. Gennaro, Hrsg., Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1990, gefunden werden. Beispiele solch kosmetisch akzeptabler Träger-, Transport- oder Grundlagensubstanzen sind Fachleuten bekannt und können beispielsweise im CTFA International Cosmetic Ingredient Dictionary, 4. Auflage, J: M. Nikitakis, Hrsg., The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association, Washington, D. C., 1991, gefunden werden.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind für lokale Anwendung vorgesehen und können Träger-, Grundlagen- und Trägersubstanzbestandteile, wie beispielsweise Wasser, Azeton, Ethanol, Äthylenglykol, Propylenglykol, Butan-1,3-diol, Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat, Mineralöl und Mischungen daraus enthalten, um Lotionen, Tinkturen, Cremes, Emulsionen, Gels oder Salben zu bilden, die nicht-toxisch und pharmazeutisch, kosmetisch oder dermatologisch akzeptabel sind. Zusätzliche Feuchtigkeitsmittel oder Austrocknungsmittel können, wenn erwünscht, den vorliegenden Zusammensetzungen beigefügt werden. Beispiele solch zusätzlicher Bestandteile, die für kosmetische Zusammensetzungen nützlich sind, können im CTFA International Cosmetic Ingredient Dictionary, 4. Auflage, J. M. Nikitakis, Hrsg., The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association, Washington, D. C., 1991, gefunden werden.
Die Steuerung der Zeitperiode, die nach dem lokalen Auftragen einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung erforderlich ist, dass der pH-Wert der Hautoberfläche auf einen Normal-pH-Wert von ungefähr 5,5 zurückkehrt, berücksichtigt die Steuerung der Protease-Enzymaktivität. Mittels dieser Steuerung der proteolytischen Aktivität überwindet die vorliegende Erfindung die Nachteile und Komplikationen, die im Stand der Technik gefunden werden, wie beispielsweise Jucken, Brennen, Blasenbildung und andere unerwünschte Nebeneffekte, die durch proteolytische Enzyme mit breitem pH-Wert-Spektrum verursacht werden. Die Bestimmung der Zeitperiode, die die Hautoberfläche braucht, um auf einen Normal-pH-Wert von ungefähr 5,5 zurückzukehren, wird durch eine Anzahl von Faktoren bestimmt, inklusive des Typs der Hauterkrankung, der Krankheit oder Störung, die behandelt wird, Hauttyp und die Lokalisation am Körper und die Empfindlichkeit der Haut der speziellen Person, die behandelt wird. Um die Nachteile und Komplikationen zu vermeiden, die im Stand der Technik gefunden werden, sollte die Zeitperiode für irgendeine individuelle Anwendung einer Zusammensetzung der Erfindung idealerweise 4 Stunden nicht überschreiten. Die Zeitbegrenzung wird von einer Anzahl von Faktoren abhängen, wie beispielsweise dem Zweck der Anwendung, der täglichen Pflege, der Entfernung rauer trockener Haut. Andere Faktoren umfassen den Hauttyp, ob empfindlich, normal oder unemp toren umfassen den Hauttyp, ob empfindlich, normal oder unempfindlich, und die Auftragungsweise, zum Beispiel eine einmalige Anwendung oder eine Dauerwaschlösung oder das Auftragen einer Creme oder Lotion. Ein anderer Faktor ist die in der sauren Protease-Komponente verwendete spezifischen Protease oder Proteasen, da die Protease-Aktivität substratabhängig ist.
5.2 Anwendungsverfahren der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
Die vorliegende Erfindung sieht Verfahren zum Verbessern der Hautstruktur und/oder des Erscheinungsbildes bzw. Aussehens der Haut vor. Solche Verfahren umfassen das Auftragen einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, welche ein saures Protease-Enzym umfasst, das unterhalb von etwa pH 5,5 proteolytische Aktivität zeigt und bei oder oberhalb eines pH-Wertes von ungefähr 5,5 unbedeutende Aktivität, und einen säurehaltigen Puffer, der den pH-Wert der Hautoberfläche auf unterhalb von etwa pH 5,5 erniedrigt, auf eine Hautfläche einer Person, und zwar für einen Zeitraum, der effektiv ist, die Struktur und/oder das Aussehen der Haut zu verbessern, wobei der säurehaltige Puffer einer Neutralisation durch natürliche epidermale Prozesse unterliegt.
Das Verfahren der Verabreichung einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung auf ein Hautgebiet geschieht durch lokales Auftragen. Die Menge des säurehaltigen Puffers und der sauren Protease in der Endzusammensetzung und die Häufigkeit des lokales Auftragens auf die Haut kann stark variieren, abhängig von Faktoren wie beispielsweise der besonderen Hauterkrankung, der Schwere der Hauterkrankung, der Lokalisation und/oder des Typ der betroffenen Haut, der Hautempfindlichkeit der Person und dem Grad der gewünschten Behandlung. Es liegt innerhalb des Aufgabenbereichs des Fachmanns, die Dosierungen gemäß dem Bedarf der Person zu regulieren. Es wird beispielsweise vorgeschlagen, dass eine Lokalanwendung von etwa einmal pro Woche bis etwa 4 oder 5 mal täglich umfasst, vorzugsweise von ungefähr 3 mal wöchentlich bis ungefähr 3 mal täglich, am bevorzugtesten etwa einmal oder zweimal täglich. Die Endzusammensetzung einer Lokalanwendung wird von ungefähr 0,001% bis ungefähr 95%, vorzugsweise 0,01% bis ungefähr 25%, am bevorzugtesten von ungefähr 0,01% bis ungefähr 5% der Säurekomponente enthalten. Die Endzusammensetzung einer Lokalanwendung wird von ungefähr 0,001% bis ungefähr 75%, vorzugsweise 0,1% bis ungefähr 50%, am bevorzugtesten von ungefähr 1% bis ungefähr 5% der sauren Protease-Komponente enthalten. Eine weitere bevorzugte Verabreichungsmethode ist die chronische Verabreichung. „Chronische" Verabreichung, wie hier verwendet, bedeutet, dass die Periode bzw. Zeitdauer der Lokalanwendung sich über die gesamte Lebenszeit des Patienten erstreckt, vorzugsweise über einen Zeitraum von mindestens einem Monat, bevorzugter von ungefähr drei Monaten bis zu über 20 Jahre, bevorzugter von ungefähr sechs Monaten bis zu ungefähr 10 Jahren, noch bevorzugter von ungefähr einem Jahr bis zu fünf Jahren, wodurch eine Verbesserung der Struktur oder des Erscheinungsbildes der Haut oder Verbesserung der epidermalen Exfoliation bzw. Schuppung und/oder der epidermalen Zellerneuerung oder der Regulierung der Hautatrophiewirkungen erreicht wird.
In einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung umfassen die oben beschriebenen Verfahren das gleichzeitige Auftragen auf die Haut von sowohl einer wirksamen Menge der Zusammensetzung, die einen säurehaltigen Puffer und eine saure Protease aufweist, als auch einer wirksamen Menge eines oder mehrerer Sonnenschutzagenzien, eines Antioxidans/Radikalfängeragens, eines Chelatbildners, eines Retinoids, Selbstbräunungsmaterials, und/oder eines Benzofuranderivats. „Gleichzeitiges Auftragen" oder „gleichzeitig", wie hier verwendet, bedeutet das Auftragen der Wirkstoffe bzw. Agenzien an der gleichen Stelle auf dem Köper zu ungefähr dem gleichen Zeitpunkt. Obwohl dies durch getrenntes Auftragen der Agenzien auf die Haut erreicht werden kann, ist es das bevorzugte Verfahren, eine alle erwünschten Agenzien enthaltende Zusammensetzung auf die Haut aufzutragen. Die Menge des verabreichten Sonnenschutzwirkstoffs beträgt im Allgemeinen zwischen ungefähr 0,02 mg bis zu ungefähr 1 mg pro cm² Haut. Die Menge des verabreichten Chelatbildners beträgt im Allgemeinen zwischen ungefähr 0,001 mg bis zu ungefähr 1 mg, vorzugsweise von etwa 0,01 mg bis etwa 0,5 mg, bevorzugter von ungefähr 0,05 mg bis ungefähr 0,1 mg pro cm² Haut. Die Menge des verabreichten Retinoids beträgt zwischen ungefähr 0,00001 mg bis zu ungefähr 0,02 mg pro cm² Haut. Die Menge des verabreichten Benzofuranderivats beträgt im Allgemeinen zwischen ungefähr 0,001 mg bis zu ungefähr 1 mg/cm² Haut pro Anwendung, vorzugsweise von etwa 0,01 bis 0,5 mg/cm² Haut pro Anwendung. Die Menge der aufgetragenen Zusammensetzung, die einen säurehaltigen Puffer und eine saure Protease enthält, reicht im Allgemeinen von etwa 0,001 mg bis etwa 1 mg pro cm² Haut pro Anwendung, vorzugsweise von etwa 0,01 mg bis etwa 0,5 mg pro cm², bevorzugter von ungefähr 0,05 bis ungefähr 0,25 mg/cm² Haut pro Anwendung, und zwar abhängig von der Schwere des zu behandelnden Zustands, der Empfindlichkeit der Haut des Patienten, der Lokalisation der Behandlungsstelle an dem Patienten und der Wirksamkeit der verwendeten Verbindungen.
6. Beispiele
Um die Natur der Erfindung und die Art der Ausführung derselben genauer darzustellen, sind die folgenden Beispiele vorgesehen, die nicht ausgelegt werden dürfen, dass sie den Rest der Offenbarung oder den Rahmen der Erfindung auf irgendeine Art und Weise begrenzen.
Die folgenden Reagenzien wurden in den Zusammensetzungen verwendet und die Methoden bzw. Verfahren in den Abschnitten 6.1 bis 6.4 beschrieben:
AFP 2000, eine von Pilzen gewonnene saure Protease, Solvay Inc., Eklhart IN; Algenextrakt/Aloenextrakt, Active Organics, Inc., Dallas TX; Allantoin, Sutton Laboratories, Chatham NJ; Arlacel 65, ICI Surfactants, Wilmington DE; Asparaginsäure, Ajimoto USA, Inc., Teaneck NJ; BHT, Eastman Kodak, Co., Rochester NY; Butylenglykol, Hoechst Celanese, Co., Charlotte NC; Carbomer, B. F. Goodrich, CO., Brecksville OH; Cetearylalkohol, Lipo Chemicals, Inc., Patterson NJ; Cetylalkohol, Lipo Chemicals, Inc., Patterson NJ; Zitronensäure, Roche Vitamins and Fine Chemicals, Nutley NJ; Cosmowax, Croda Chemicals, Ltd., Parsippany NJ; Cyclomethicon, Dow Chemicals USA, Midland MI; Dihydroxyaceton, Rona/E. Merck Industries, Hawthorne NY; Dimethicon, Dow Chemicals USA, Midland MI; Disodium-EDTA, Ciba-Geigy Co., Greenboro NC; DL-Panthenol, Roche Vitamins and Fine Chemicals, Nutley NJ; Ethoxydiglykol, Gattefosse S. A., Paris, France; Glukonsäure, Sigma Chemicals, St. Louis MO; Glycereth-26, Amerchol Co., Edison NJ, Glycerolstearat, Croda Chemicals, Ltd., Parsippany NJ; Milchsäure USP 88%, Rita Corporation, Woodstock IL; Lezithin/Asiatische Säure, Active Organics, Inc., Dallas TX; Methylgluceth-20, Amerchol Co., Edison NJ, Methylparaben, Napp Co., Lodi NJ; Octylpalmitat, ICI Surfactants, Wilmington DE; Octyldodeylneopentanoat, ICI Surfactants, Wilmington DE; PEG-75, Lipo Chemicals, Inc., Patterson NJ; PEG-40 Stearat, Lipo Chemicals, Inc., Patterson NJ; Pepsin 1:15.000 NF, American Laboratories, Inc., Omaha NE; Phosphorsäure 85%, Sigma Chemicals, St. Louis MO; Polyacrylamid/C13-14 Isoparaffin/Laureth-7, Seppic, Co., Paris, France; Propylenglykol, Dow Chemicals USA, Midland MI; Propylparaben, Napp Co., Lodi NJ; Retinylpalmitat, Roche Vitamins and Fine Chemicals, Nutley NJ; Salizylsäure, Kalama Co., Seattle WA; Natriumcarboxymethylcellulose 7HXF, Aqualon, Co., Wilmington DE; Natriumhyaluronat, Active Organics, Inc., Dallas TX; Steareth-10, Lipo Chemicals, Inc., Patterson NJ; Tokopherylazetat, Roche Vitamins and Fine Chemicals, Nutley NJ; Triethanolamin 99%, BASF Co., Mount Olive NJ; und Xantham, Kelco, San Diego, CA.
6.1 Verbesserung der Hautexfoliation bzw. -schuppung
Eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wurde bei unterschiedlichen Konzentrationen der sauren Protease Pepsin, 1:15.000 NF, American Laboratories, Inc., Omaha NE, und des säurehaltigen Puffers Milchsäure an Innenseiten individueller menschlicher Unterarme zur Verbesserung bzw. Verstärkung der Hautschuppung und Zellerneuerung getestet. Zwanzig Versuchspersonen im Alter zwischen 30 und 60 Jahren wurden ausgewählt und wurden aufgefordert, keinerlei Erzeugnisse auf den Innenseiten ihrer Unterarme zu verwenden außer denjenigen, die im Zusammenhang mit dem Test verfahren geliefert wurden (welche eine synthetische Seife umfassten), und zwar 5 Tage lang vor und während der Testperiode. Keiner der Versuchspersonen war (1) schwanger oder stillte oder beabsichtigte innerhalb der drei dem Test folgenden Monate schwanger zu werden; (2) litt an einer oder mehr bekannten übertragbaren Krankheiten; (3) nahm zur Zeit des Tests an irgendeiner andern klinischen Studie teil; (4) litt an Psoriasis, Dermatitis und/oder Ekzemen; (5) nahm Medikamente, die als geeignet betrachtet werden, die Testergebnisse zu stören, einschließlich Retinoiden, Corticosteroiden oder Antibiotika; (6) hatte während der sechs Monate vor dem Test Retinoide, Corticosteroide oder Antibiotika eingenommen; und/oder (7) hatte Tabakprodukte gebraucht, hatte eine empfindliche Haut, hatte eine für den Test als ungeeignet eingestufte Haut oder hatte andere Merkmale, die als wahrscheinlich betrachtet wurden, sie für den Test ungeeignet zu machen.
Jede Innenarmunterseite jeder Versuchsperson wurde mit vier 2 × 3 cm großen Pflasterverbänden beklebt, auf die 1–2 g/cm² von 5% ultrareinem in Petrolatum gemahlenen Dansylchlorid aufgetragen war. Drei der auf jedem Unterarm befindlichen Pflaster wurden als Teststellen verwendet und das eine übrig Bleibende wurde als Vergleichsprobe bzw. Kontrolle verwendet.
Die vier Stellen auf jedem Unterarm jeder Versuchsperson wurden mit Dansylchlorid beladenen Pflastern bedeckt und wurden 24 Stunden ungestört belassen. Am Ende der 24 Stunden-Periode, wurden die Pflaster entfernt, die Stellen gewaschen und das Verfärben der Stellen durch Dansylchlorid wurde durch Betrachten mit einer langwelligen UV-Lichtquelle bestätigt. Die sechs Nichtkontrollstellen mit Dansylchloridverfärbung an jeder Versuchsperson erhielten zweimal täglich lokale Anwendungen von 1–2 ml/cm² einer randomisierten Auswahl von Testzusammensetzungen, die in Tabelle I beschrieben sind. Bei der Anwendung wurden die Testzusammensetzungen an den Teststellen in die Haut gerieben bis die Stellen nicht mehr nass waren. Nachdem die Dansylchloridverfärbung verifiziert war, wurden die Teststellen und die Kontrollstellen unbedeckt gelassen und wurden auf die gleiche Art und Weise behandelt, außer dass die Teststellen die Testanwendungen erhielten und die Kontrollstellen keine Testzusammensetzung erhielten.
Tabelle I
Exfoliation/Keratolyse des Stratum Corneum bzw. der Hornschicht wurde durch tägliches Betrachten der Dansylchloridverfärbungen bzw. flecken unter einer langwelligen UV-Lichtquelle bestimmt, um die Verfärbungsentfernung zu messen. Der Prozentanstieg in Exfoliation/Keratolyse und die einhergehende Zellerneuerung des Stratum corneum wurde durch die folgende Formel berechnet:
Tabelle II
Die bei dem Test gesammelten Daten sind in den Tabellen II und in 1 und 2 zusammengefasst. Wie in Tabelle II, Spalte 5 zu sehen, hatte der säurehaltige Puffer Milchsäure einige positive keratolytische/Zellerneuerungseffekte [vergleiche Testzusammensetzung 2 und 8 mit der Kontrolle (Testzusammensetzung 1)] bei Konzentrationen von 1,5 und 3 Gewichts-%. Diese positiven keratolytischen/Zellerneuerungseffekte werden signifikant durch die Gegenwart der sauren Protease Pepsin verstärkt (siehe Testzusammensetzungen 3– 7 und 9–13). Es ist auch offensichtlich, dass die Verstärkungen dosisabhängig sind, d. h. die Schuppung der Hornschicht/Zellerneuerungsraten steigen mit dem Anstieg der sauren Protease Konzentration, siehe Spalte 5 der Tabelle II. 1 stellt die Daten in Spalte 5 graphisch dar.
Spalte 6 der Tabelle II spiegelt den Prozentanstieg der Schuppung/Zellerneuerungsraten wider, und zwar bei unterschiedlichen Konzentrationen der sauren Protease Pepsin im Vergleich zu Milchsäure allein bei 1,5% und 3 Gewichtskonzentration. Die Daten in Säule 6 sind in 2 graphisch dargestellt. Es ist offensichtlich, dass, obwohl der saure Protease-Effekt bei beiden verwendeten Milchsäurekonzentrationen signifikant ist, wird die prozentual größere Verstärkung durch die saure Protease Pepsin bei einer Milchsäurekonzentration von 1,5 Gewichts-% erreicht.
Ein niedriger Grad von Rötung und Schwellung wurde auf der Haut von einigen der Testpersonen beobachtet, und zwar ungefähr 75% der Hautteststellen bei einer 3 Gewichts-% Milchsäurekonzentration, aber sehr wenig wurde beobachtet bei einer 1,5 Gewichts-% Milchsäurekonzentration. Ferner war diese Beobachtung im Großen und Ganzen unabhängig von der Gegenwart von Pepsin. Somit wird eine signifikante Schuppung/Zellerneuerung durch Verwenden eines säurehaltigen Puffers bei einem niedrigen, nicht-reizenden bzw. nicht-irritierenden Pegel in Gegenwart einer sauren Protease erreicht. Im Gegensatz zu Proteasen, die im physiologischen pH-Wert-Bereich aktiv sind, behalten saure Proteasen, wie hier definiert, die auf der Haut aufgetragen werden, ihre proteolytische Aktivität nur bis die natürlichen Prozesse der Haut den pH-Wert der Hautoberfläche auf ihren Normalwert von ungefähr 5,5 angehoben haben.
6.2 Zusammensetzungen für Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung
Die folgenden Tabellen geben die Zubereitungen der verschiedenen Beispiele der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung wider. Sämtliche der folgenden Zusammensetzungen wurden mit beispielsweise verdünnter Phosphorsäure oder Natriumhydroxid NaOH, auf einen pH-Wert von etwa 3 bis 3,2 eingestellt.
Tabelle III Waschlösung AP-01
Tabelle IVa Waschlösung AP-02
Tabelle V Serum AP-03
Tabelle VI Serum AP-04
Tabelle VII Pepsin Lotion AP-05
Tabelle VIII Renewal Gel AP-05
Tabelle IX Renewal Gel AP-07
Tabelle X Selbstbräunungslotion AP-08
6.3 Stabilisationszusammensetzung
Die folgende Zusammensetzung behält bei einem pH-Wert 3 mindestens 90% ihrer saure Protease-Aktivität über einen Zeitraum von mindestens drei Monaten, während dem die Zusammensetzung bei 37°C gelagert wurde.
6.4 Proteolytische Aktivität bei unterschiedlichen pH-Wert-Pegeln
Zwei saure Protease-Enzyme wurden über einen Bereich von pH-Werten getestet, um zu bestimmen, ob sie bei einem pH-Wert niedriger als ungefähr pH 5,5 proteolytische Aktivität besitzen, und ob die Aktivität auf weniger als ungefähr 10%, verglichen mit ihrer Aktivität bei dem pH-Optimum, abnimmt. Die proteolytische Aktivität wurde durch das Bestimmen des proteolytischen Effektes auf Hämoglobin gemessen, wobei die HUT-Assay bzw. Test, wie unten beschrieben, verwendet wurde. Die zwei sauren Proteasen waren Pepsin 1:15.000 NF, bei ungefähr 1000 HUT-Einheiten/mg, angeboten von American Laboratories, Inc., Omaha NE; und AFP 2000, eine aus Pilzen gewonnene Protease, angeboten von Solvay Inc., Elkhart IN, mit ungefähr 100 HUT- Einheiten/mg. Der Assay wurde zuerst durch Bereiten der Stammlösungen Hämoglobinsubstrat und TCA-Stammlösung durchgeführt. Das Hämoglobinsubstrat wurde durch Lösen von 2 g bovinem bzw. Rinderhämoglobin, Sigma Chemicals, St. Louis MO; in 80 ml destilliertem Wasser zubereitet. Diese Lösung wurde dann auf den korrekten pH-Wert, pH 2, 3,5, 5,5 oder 6 titriert. Für pH-Werte zwischen 1 und 3, wurden 1,8 g Phosphorsäure für eine Endkonzentration von 100 mM gelöst und der pH-Wert wurde mit 50% Natriumhydroxid oder 50% Salzsäure eingestellt. Für pH-Werte zwischen 3 und 6, wurden 2 g Zitronensäure für eine Endkonzentration von 100 mM gelöst und der pH-Wert wurde mit 50% Natriumhydroxid oder Salzsäure eingestellt. Die Lösungen wurden durch Hinzufügen von destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 100 ml gebracht. Die Substrate mit unterschiedlichen pH-Werten wurden dann bei 30°C für 20 Minuten inkubiert und nachfolgend durch Glasswolle gefiltert. Die TCA-Stammlösung wurde durch Lösen von 5 g Trichloressigsäure in 100 ml destilliertem Wasser zubereitet.
Die Enzymstandardsubstanzen wurden dann durch Lösen von 10 mg Pepsin in 10 ml destilliertem Wasser und durch Lösen von AFP 2000 und 300 mg Zitronensäure in 8 ml destilliertem Wasser zubereitet. Diese Lösung wurden dann auf einen pH-Wert von ungefähr 3,5 eingestellt mit 6 M HCl von 50% Natriumhydroxid und das Endvolumen wurde durch Hinzufügen von destilliertem Wasser auf 10 ml gebracht.
Für jede der Proben wurden vier Röhrchen mit „B", „T1", „T2" und „T3" markiert und 4 ml Hämoglobinsubstratlösung wurde jedem Röhrchen zugefügt, die dann bei 37°C gelagert wurden. 100 μl der Enzymstandardsubstanzen wurden jedem mit „T" bezeichneten Röhrchen zugefügt, d. h. T1, T2 und T3. Die Röhrchen wurden dann bei 37°C 20 Minuten lang für Pepsin und 30 Minuten lang für AFP 2000 inkubiert. 10 ml der TCA-Stammlösung wurden dann allen Röhrchen zugefügt und 100 μl des Enzyms wurden zu Röhrchen „B" hinzugefügt. Die Röhrchen wurden dann eine Minute lang bei 1000 Upm zentrifugiert. Die Probe in jedem Röhrchen wurde durch einen Spritzenfilter in eine Quarzkuvette gefiltert und die Absorbanz wurde bei 280 nm gemessen. Die Hin tergrundabsorbanz wurde von jeder der „T"-Absorbanzen abgezogen und für jedes Enzym bei jedem getesteten pH-Wert wurden die individuellen „T1"-, „T2"- und „T3"-Absorbanzen gemittelt.
3 zeigt, dass beide Enzyme bei pH 2 optimal aktiv waren. Ferner besaßen beide Enzyme weniger als 10% Aktivität bei pH-Wert 5,5 und höher im Vergleich zu dem optimalen Pegel bei pH-Wert 2. Dieser Assay zeigt deutlich, dass diese Enzyme Enzyme sind, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Ferner kann durch Verwendung eines solchen Assay bestimmt werden, welche zusätzlichen Enzyme für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind.

Claims

Ein kosmetisches Verfahren zum Verbessern der Struktur oder des Erscheinungsbildes der Haut, das lokales Auftragen auf einer Hautfläche einer Versuchsperson vorsieht und zwar von einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die aus Folgendem besteht: (1) einer sauren Protease, die unterhalb pH-Wertes von ungefähr 5,5 enzymatisch aktiv ist und welche unbedeutend aktiv ist bei oder über pH 5,5; und (2) einem säurehaltigen Puffer, der eine Säure enthält, die bei Anwendung auf der Haut vorübergehend den Oberflächen pH-Wert der Haut unter ungefähr pH 5,5 erniedrigt, wobei der säurehaltige Puffer der Neutralisation durch natürliche Epidermisprozesse unterworfen ist, und zwar derart, dass der Oberflächen pH-Wert der Haut, auf die solch säurehaltiger Puffer aufgebracht wurde, zu dem pH-Wert von ungefähr 5,5 zurückkehrt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Säurekomponente des säurehaltigen Puffers aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus anorganischen Säuren, organischen Säuren und Gemischen daraus besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die organische Säure aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Milchsäure, Zitronensäure, Sorbinsäure, Glykolsäure, Apfelsäure, Glukonsäure und Gemische daraus besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Säurekomponente des Puffers eine anorganische Säure ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Phosphorsäure, Pyrophosphorsäure, Triphosphorsäure, Polyphosphorsäure, Natriumbisulfat, Kaliumbisulfat und Gemischen daraus besteht.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der säurehaltige Puffer weiterhin eine pharmazeutisch oder kosmetisch akzeptable Trä gersubstanz (carrier), Transportsubstanz (vehicle) oder Grundlagensubstanz (excipient) enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die pharmazeutisch oder kosmetisch akzeptable Trägersubstanz-, Transportsubstanz- oder Grundlagenkomponente des säurehaltigen Puffers ausgewählt ist aus einer Gruppe, die aus Lotionen, Tinkturen, Cremes, Emulsionen, Gels, Salben, Wasser, mit Wasser verarbeitbare Creme (water-workable cream), Polyvinylalkohol, Hydroxyethylcellulose, Cellulose, hydrophilem Acrylpolymer, Weichmacher, Hautbefeuchtungskomponenten, Enzymstabilisatoren, Glyzerin, Surfactants (Tensiden), Konservierungsmitteln, hydrophilen Verdickungsmitteln, die in pharmazeutischen Rezepturen verwendet werden und Gemischen davon besteht.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die saure Protease aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Pilzproteasen, Bakterienproteasen und Säugetierproteasen und Gemischen daraus bestehen.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die saure Protease aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Pepsin, Kathepsin, menschlicher Harnsäureprotease, Rhizopuspepsin, Penicillopepsin, Endothiapepsin und Gemischen daraus besteht.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die saure Protease in einer Menge vorhanden ist von ungefähr 0,001% bis ungefähr 75 Gewichts-% der Endzusammensetzung.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die saure Protease in einer Menge vorhanden ist von ungefähr 0,1% bis ungefähr 50% des Gewichts der Endzusammensetzung.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die saure Protease in einer Menge vorhanden ist von ungefähr 1% bis ungefähr 5% des Gewichts der Endzusammensetzung.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die saure Protease eine gesamte spezifische Aktivität von ungefähr 1 bis ungefähr 5000 HUT Einheiten/mg besitzt.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die saure Protease eine gesamte spezifische Aktivität von ungefähr 50 bis ungefähr 3000 HUT Einheiten/mg besitzt.
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei die saure Protease eine gesamte spezifische Aktivität von ungefähr 500 bis ungefähr 1500 HUT Einheiten/mg besitzt.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die saure Komponente des säurehältigen Puffers in einer Menge von ungefähr 0,001% bis ungefähr 95% des Gewichts der Endzusammensetzung vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die saure Komponente des säurehältigen Puffers in einer Menge von ungefähr 0,01% bis ungefähr 25% des Gewichts der Endzusammensetzung vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die saure Komponente des säurehältigen Puffers in einer Menge von ungefähr 1% bis ungefähr 5% des Gewichts der Endzusammensetzung vorhanden ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei der Oberflächen-pH der Haut für ungefähr 5 Minuten bis ungefähr 4 Stunden unter ungefähr pH 5,5 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei der Oberflächen-pH der Haut für ungefähr 30 Minuten bis ungefähr 2 Stunden unter ungefähr pH 5,5 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei der Oberflächen-pH der Haut für ungefähr 30 Minuten bis ungefähr 1 Stunde unter ungefähr pH 5,5 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die saure Protease in einer Menge von 4 Gewichtsprozent der Endzusammensetzung vorhanden ist, die eine Aktivität von 4000 HUT Einheiten/mg besitzt, und wobei der säurehaltige Puffer Milchsäure enthält, die in einer Menge von 3 Gewichtsprozent der Endzusammensetzung vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die saure Protease in einer Menge von 4 Gewichtsprozent der Endzusammensetzung vorhanden ist, die eine Aktivität von 4000 HUT Einheiten/mg besitzt, und wobei der säurehaltige Puffer Milchsäure enthält, die in einer Menge von 1,5 Gewichtsprozent der Endzusammensetzung vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die saure Protease in einer Menge von 4 Gewichtsprozent der Endzusammensetzung vorhanden ist, die eine Aktivität von 4000 HUT Einheiten/mg besitzt, und wobei der säurehaltige Puffer Zitronensäure enthält, die in einer Menge von 3 Gewichtsprozent der Endzusammensetzung vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die saure Protease in einer Menge von 4 Gewichtsprozent der Endzusammensetzung vorhanden ist, die eine Aktivität von 4000 HUT Einheiten/mg besitzt, und wobei der säurehaltige Puffer Milchsäure enthält, die in einer Menge von 1,5 Gewichtsprozent der Endzusammensetzung vorhanden ist, und Zitronensäure enthält, die in einer Menge von 1,5 Gewichtsprozent der Endzusammensetzung vorhanden ist.