DE69731660T2

DE69731660T2 - Insulinähnlicher wachstumfaktor i (igf-i) expressionssystem und methode zur verwendung

Info

Publication number: DE69731660T2
Application number: DE69731660T
Authority: DE
Inventors: Michael Coleman; Robert Schwartz; J. Francesco DEMAYO
Original assignee: Baylor College of Medicine; Urigen Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Baylor College of Medicine; Urigen Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1996-12-02
Filing date: 1997-12-01
Publication date: 2005-12-22
Anticipated expiration: 2017-12-02
Also published as: JP4131569B2; US20030018984A1; WO1998024922A1; ATE282707T1; JP2001505435A; EP0943003A1; EP0943003B1; DE69731660D1; CA2274314A1; CA2274314C

Description

Hintergrund zu der Erfindung
Die Erfindung betrifft für stabile Messenger-RNA (mRNA) kodierende Vektoren und Verfahren zum Verwenden derartiger Vektoren. Insbesondere betrifft diese Erfindung Vektoren, die eine kontrollierte Expression rekombinanter Gene in einem Gewebe errichten, die für Gentherapie und andere Anwendungen geeignete Spiegel aufweisen können. Die Erfindung betrifft ferner Vektoren, die in der Lage sind, insulinähnlichen Wachstumsfaktor I (IGF-I) zu exprimieren.
IGF-I und IGF-II sind Polypeptidhormone mit geringem Molekulargewicht, die das Wachstum und die Differenzierung vieler Zelltypen wie Myoblasten, Nervenzellen, Fibroblasten, Chondrozyten, Osteoblasten, Endothelzellen und Keratinozyten anregen (Daughaday & Rotwein, 1989, Endocrine Reviews 10: 68–91). Die Expression von IGF-I wird normalerweise durch ein Wachstumshormon induziert, und viele der wachstumsfördernden Aktivitäten des Wachstumshormons werden durch (früher als Somatomedin bezeichnetes) IGF-I vermittelt. IGFs zirkulieren gebunden an Bindungsproteine mit hohem Molekulargewicht, deren Funktion es ist, die Zirkulationshalbwertszeit zu steigern, insulinmimetische Effekte zu verhindern und durch Bindung an den Typ I IGF-Rezeptor vermittelte biologische Aktivitäten zu modulieren. IGF-I spielt eine primäre Rolle bei der Förderung von Differen ziation und Wachstum der Skelettmuskulatur. IGFs sind für die myogene Progression Schlüsselfaktoren, die die Zellteilung und die Verschmelzung von Myoblasten fördern und das Wachstum sowie die Hypertrophie von Muskeln in späten Stadien stimulieren. Untersuchungen durch Florini (Florini & Magri, 1989, Am. J. Physiol. (Cell Physiol.) 256: C701–C711) zeigen, dass Myogenese durch IGFs stimuliert wird. Beim Einsetzens des Verschmelzens wird die Biosynthese und Absonderung von IGFI/II- und IGF-Bindungsproteinen in Myoblasten auf natürliche Weise erhöht (Tollefsen et al., 1989, J. Biol. Chem. 264: 13810–13817). Dies geht mit dem Auftreten von muskelspezifischen Genprodukten einher.
Es wurde nachgewiesen (Coleman et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 12109–12116), dass eine durch einen myogenen Expressionsvektor in C2C12-Myoblastenkulturen gelenkte, gesteigerte Biosynthese und Absonderung von IGF-I die Expression von myogenen Helixschleifenhelixfaktoren, MyoD, Myogenis, Desmin und skeletalen Actin-mRNAs in hohem Maße anregt. Im Gegensatz hierzu wurde beobachtet, dass zu den 5'-Sequenzen von IGF-I oder IGF-II-mRNA komplementäre Antisense-Oligodeoxynukleotide eine spontane Differenzierung in myogenen Zelllinien und die Induzierung von Myogenin unterdrücken (Florini et al., 1991, Molecular Endocrinology 5: 718–724).
Ein unmittelbarer Nachweis darüber, dass IGF-I eine Rolle in der Muskelentwicklung spielt, wurde erbracht, als das Einzelkopie-Murin-IGF-I-Gen durch homologe Rekombination deaktiviert wurde (Powell-Braxton et al., 1993, Genes Dev. 7: 2609–2617; Liu et al., 1993, Cell 75: 59–72). Ein Abschalten des IGF-I-Gens führte zu schwerwiegender Muskeldystrophie und zu einer weitgehend reduzierten myofibrilla ren Organisierung der Skelettmuskulatur dieser IGF-I-Mutanten. Die Mehrheit der Mäuse starben bei der Geburt aufgrund von Atemversagen, was vermutlich auf eine mangelhafte Reifung des Zwerchfells und der intercostalen Muskeln zurückzuführen war. Diese Beobachtungen legen nahe, dass IGF-I ein zentraler trophischer Wachstumsfaktor ist, der für die Entwicklung und das Wachstum des embryonalen Muskels unabdingbar ist.
Neuere Studien demonstrieren ebenfalls die Bedeutung von IGF-I für postnatales Muskelwachstum und Hypertrophie. Es wurde nachgewiesen, dass ein Einbeziehen von IGF-I in die Erhaltungsmedien von Primärkulturen von Muskelfasern von Vögeln größere Faserquerschnitte, annähernd zu einer Verdoppelung des Myosingehalts und zu einer Steigerung der Stabilität und Synthese von Protein im Vergleich zu unbehandelten Kulturen führen (Vandenburg et al., 1991, Am. J. Physiol. 260: C475–C484). Verabreichung von Wachstumshormon an hypophysektomierte Ratten führte zu einer erheblichen Steigerung der IGF-I-mRNA und eine Steigerung der Masse von gewissen Muskeln um 50% (Englemann et al., 1989, Mol. Cell. Endocrin. 63: 1–14). Wenn die Expression von IGF-I-Genen durch passives mechanisches Dehnen und akutes Betätigen erhöht wurde, ließ sich eine Muskelhypertrophie beobachten (Elgin et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 3254–3258).
Untersuchungen lassen ferner darauf schließen, dass IGF-I wichtig für die Regeneration und Wiederherstellung von Muskeln ist. Die Regenerationscharakteristik unterscheidet sich abhängig von der Schädigung, bezieht allerdings in jedem Fall eine Proliferation von Präkursormuskelzellen (MPC), ein Verschmelzen zu Myotuben und eine Rein nervation des Muskels mit ein. Während einer Regeneration des Muskels wirkt IGF-I als ein mächtiges Stimulans für die Proliferation und Differenzierung von MPC (Grounds, 1991, Path. Res. Pract. 187: 1–22). Studien zeigen auf, dass IGF-I innerhalb von 24 Stunden nach einer Muskelverletzung in den Mantelzellen und Nerven erzeugt wird und für einige Wochen vermehrt vorhanden bleibt. Bei der Regeneration von Muskel eines Nagers verläuft das Muster von IGF-I-mRNA in einem beschädigten Muskel vom Einsetzen (d. h. nach 18–24 h) bis zum Spitzenwert (nach 5 Tagen) parallel zur Muskelpräkursorreplikation.
Reaktives Nervenkeimen stellt ein weitverbreitetes Phänomen im Nervensystem dar. Es wird angenommen, dass Nervenkeimen durch lokal aktivierende Faktoren initiiert wird. Intramuskuläres Nervenkeimen lässt sich etwa 4 Tage nach einer durch Quetschdenervierung hervorgerufenen Muskelinaktivierung nachweisen. Neuere Studien von Caroni und Schneider, 1994, J. Neurosci. 14: 3378–3388, zeigen, dass IGF-I für die Induzierung des Nervenkeimens erforderlich ist. Untersuchungen lassen ferner annehmen, dass eine Überexpression von IG-I in vivo ausreichen kann, um Nervenkeimen zu verbessern.
Kurzdarstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist teilweise auf der Identifizierung gewisser Nucleinsäuresequenzen begründet, die vorteilhafte Eigenschaften hinsichtlich des Abzielens auf ein Gewebe, der Expression und der Sekretion ermöglichen. Solche Sequenzen finden Verwendung bei der Konstruktion von Plasmidvektoren, die für IGF-I kodieren, um die für IGF-I kodierenden Sequenzen zu liefern und zu exprimieren.
Eine Expression dieser Vektoren kann gewebespezifisch sein. Diese Vektoren sind nützlich, um eine verbesserte Expression in Geweben zu erzielen und um auf Expression mit Gewebespezifität abzuzielen. Diese Vektoren lassen sich einsetzen, um Erkrankungen mittels Gentherapie zu behandeln, indem die Expression eines auf dem Vektor kodierten Gens auf anvisierte Gewebe beschränkt wird. Vektoren, die derartige Sequenzen enthalten, sind in der Lage, eine Genlieferung und kontrollierte Expression rekombinanter Gene innerhalb von Geweben zu schaffen; eine derartige Expression kann gewisse Spiegel erreichen, die für die Gentherapie und andere Anwendungen geeignet sind. Mittels dieser Vektoren lassen sich ferner transgene Lebewesen für die Forschung oder für die Verbesserung eines Zuchtbestandes hervorbringen.
Die Fähigkeit des Expressionsvektors, sowohl eine verbesserte Sezernierung eines Produkts sowie ein Richten der Expression auf spezifische Gewebe vorzusehen, ermöglicht den Einsatz des Vektors für die Behandlung zahlreicher Erkrankungen. Die oben erwähnten Vektoren lassen sich in der Gentherapie einsetzen, bei der ein für ein therapeutisches Produkt kodierender Vektor in ein Gewebe eingeführt wird, so dass das Gewebe das therapeutische Produkt exprimiert. Beispielsweise können die obigen Vektoren zur Behandlung von Muskelatrophie verwendet werden, die mit einer neurologischen, muskulösen oder systemischen Erkrankung oder mit Alterung assoziiert ist, indem die Gewebe veranlasst werden gewisse trophische Faktoren zu exprimieren. Die oben erwähnten Vektoren lassen sich zum Behandeln von Hämophilien verwenden, indem Gewebe veranlasst werden, gewisse Koagula tionsfaktoren zu exprimieren und diese Faktoren in den Kreislauf abzusondern. Außerdem können die oben erwähnten Vektoren verwendet werden, um Atherogenese und atherosklerotische kardiovaskuläre, cerebrovaskuläre oder periphervaskuläre Erkrankungen zu verhindern oder zu therapieren, indem ein Gewebe veranlasst wird, gewisse Faktoren zu exprimieren, die am Lipidmetabolismus beteiligt sind.
Darüber hinaus können die obigen Vektoren für den Austausch von Genen, die für ererbte genetische Defekte oder akquirierte Hormonmangelkrankheiten, beispielsweise Diabetes, zuständig sind, für eine Impfung von Menschen oder anderen Lebewesen, um Immunantworten zu induzieren, oder für ein Erzeugen von transgenen Lebewesen verwendet werden. Die transgenen Lebewesen können als Modelle zum Erforschen von Erkrankungen bei Menschen, zum Einschätzen und Untersuchen neuer therapeutischer Verfahren, zum Bewerten der Wirkungen chemischer und physikalischer Karzinogene und zur Untersuchung der Wirkung vielfältiger Gene und genetischer regulatorischer Elemente verwendet werden. Außerdem können die transgenen Lebewesen für die Entwicklung ökonomisch wichtiger Spezies eines Viehbestands von Nutzen sein. Die oben erwähnten Vektoren eigenen sich ferner dazu, Zellen zu transformieren, so dass diese spezielle Proteine und RNA in vitro erzeugen.
Die Expression derartiger eine für IGF-I kodierende Sequenz aufweisender Vektoren im Körper eines Wirbeltiers, z. B. eines Menschen, kann sowohl mittelbare als auch unmittelbare Wirkungen hervorbringen. Der IGF-I erzeugt unmittelbare Effekte durch das direkte Wirken des IGF-I-Polypeptids. Allerdings können auch indirekte Effekte aufgrund der Eigenschaft des IGF-I erzeugt werden, dass dieser die Expression anderer Gene induziert oder einschaltet.
In einem ersten Aspekt schafft die vorliegende Erfindung einen Vektor zum Exprimieren einer Nucleinsäuresequenz in Gewebe durch Kodieren stabiler mRNA. Der Vektor enthält eine 5'-Flankierungsregion, die für die Expression einer Nucleinsäurekassette erforderliche Sequenzen aufweist, die eine Promotorsequenz aus einer Actin-Gen-Promotorsequenz enthalten. Der Vektor enthält ferner eine 3'-Flankierungsregion, die eine 3'UTR und/oder eine 3'-NCR aus der 3'-Region eines Wachstumshormongens aufweist, das die Absonderung des aus der Nucleinsäurekassette exprimierten Produkts verbessert. Vorzugsweise stammt die 3'-UTR von einem menschlichen Wachstumshormongen. Alternativ können in verwandten Vektoren die 3'-Sequenzen ausgewählt werden, um anstelle einer Verbesserung der Absonderung ein höheres Maß an Retention des Produkts in einem Gewebe, beispielsweise in einem Muskelgewebe vorzusehen. Solche Sequenzen können beispielsweise von einem skeletalen a-Actin-Gen stammen. Der Vektor enthält ferner einen Linker, der die 5'-Flankierungsregion an eine Nucleinsäure bindet. Der Linker enthält nicht die kodierende Sequenz eines Gens, dem der Linker von Natur aus zugeordnet ist. D. h. der Linker ist nicht das normale Gen, das den 5'- und 3'-Regionen zugeordnet ist. Vorzugsweise enthält der Linker eine Sequenz, die für ein IGF-I-Gen kodiert, eher bevorzugt für menschlichen IGF-I. Die 3'-Flankierungsregion liegt 3' gegenüber der Position zum Einfügen der Nucleinsäurekassette.
Der Begriff "Flankierungsregion" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf Nukleotidsequenzen zu beiden Seiten eines zugeordneten Gens. Flankierungsregionen können gegenüber einem in Frage kommenden speziellen Gen entweder von der Art 3' oder 5' sein. Ganz allgemein enthalten Flankierungssequenzen Elemente, die für die Regulierung der Expression eines speziellen Gens erforderlich sind. Zu solchen Elementen zählen, ohne darauf beschränken zu wollen, Sequenzen, die für eine effiziente Expression sowie eine gewebespezifische Expression benötigt werden. Zu Beispielen von Sequenzen, die für effiziente Expression erforderlich sind, können spezifische regulatorische Sequenzen oder Elemente zählen, die zu den Proteinkodierungsregionen von DNA benachbart oder innerhalb derselben angeordnet sind. Diese zu dem Gen benachbart angeordneten Elemente werden als cis-ständig wirkende Elemente bezeichnet. Die Signale werden von anderen diffundierbaren Biomolekülen in trans erkannt, um die Transkriptionsaktivität zu verändern. Diese Biomoleküle werden als trans-ständig wirkende Faktoren bezeichnet. Für trans-ständig wirkende Faktoren und cis-ständig wirkende Elemente wurde nachgewiesen, dass diese zu dem Muster des zeitlichen Einsetzens und Ablaufs der Expression eines Gens beitragen. Von cis-ständig wirkenden Elementen wird gewöhnlich angenommen, dass diese die Transkription regulieren und gewöhnlich innerhalb von Promotorregionen und innerhalb von stromaufwärts gelegenen (5') oder stromabwärts gelegenen (3') DNA-Flankierungsregionen vorzufinden sind.
Flankierende DNA, die regulatorische Elemente aufweist, die die Expression von Genen in Gewebe regulieren, kann ferner modulatorische oder regulatorische Sequenzen umfassen, die durch spezielle Faktoren reguliert werden, z. B. durch Glucocorticoide, Androgene, Progestine, Antiprogestine (PCT US93/04399; PCT US96/04324), Vitamin D₃ und seine Metaboliten, Vitamin A und seine Metaboliten, retinartige Säure, Calcium sowie sonstige Faktoren.
"Modulatorische" oder "regulatorische" Sequenzen in dem hier verwendeten Sinne beziehen sich auf Sequenzen, die sich in der 3'- oder 5'-Flankierungsregion befinden können, wo derartige Sequenzen die Aktivierung und/oder Unterdrückung der Transkription des zugehörigen Gens verbessern können.
"reaktiv sein" oder "antworten auf" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf die Verbesserung der Aktivierung und/oder Unterdrückung einer Gentranskription, wie weiter unten erläutert.
"Metabolit" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf jedes Produkt, das aus dem Metabolismus der regulatorischen Faktoren stammt, die die Genexpression regulieren.
Zusätzlich zu dem oben erwähnten können entweder eine oder beide der 3'- oder 5'-Flankierungsregionen eine Gewebespezifität hervorrufen. Eine derartige Gewebespezifität ermöglicht eine Expression überwiegend in einer spezifizierten Zelle oder einem spezifizierten Gewebe.
"Überwiegend" in dem hier verwendeten Sinne bedeutet, dass das der 3'- oder 5'-Flankierungsregion zugeordnete Gen lediglich in dem spezifischen Gewebe in höherem Maße exprimiert wird, während es in unspezifischem Gewebe nur gering oder überhaupt nicht exprimiert wird. Die 3'- oder 5'-Flankierungsregionen können in dem hier verwendeten Sinne zwar einzeln oder gemeinsam eine Expression des zugehörigen Gens in anderen Geweben vorsehen, jedoch dies in geringerem Maße im Vergleich zur Expression in Gewebe oder Zellen, wo die Expression überwiegt. Die Expression findet bevorzugt in dem spezifizierten Gewebe statt. Eine derartige überwie gende Expression ist vergleichbar mit der Größenordnung der Differenz, wie sie in jenem speziellen Gewebe- oder Zelltypus im Vergleich zu anderen unspezifischen Geweben oder Zellen im Falle der natürlichen Expression des Gens vorzufinden ist (d. h. wie sie in einer Zelle in vivo anzutreffen ist). Derartige Differenzen lassen sich durch die Analyse von mRNA-Spiegeln oder der Expression natürlicher Genprodukte, rekombinanter Genprodukte oder Reportergene beobachten. Darüber hinaus können Northern-Analyse, X-Gal-Immunofluoreszenz oder CAT-Versuche, wie sie hier erörtert sind und aus dem Stand der Technik bekannt sind, zum Erfassen solcher Differenzen verwendet werden.
Die 3'-Flankierungsregion enthält Sequenzen oder Regionen, beispielsweise 3'UTR und/oder 3'-NCR, die die Expression einer Nucleinsäuresequenz regulieren, der sie zugeordnet ist. Die 3'-Flankierungsregionen können für ein zugeordnetes Gen gewebespezifische Expression vorsehen. Die 3'-Flankierungsregion enthält ferner ein Transkriptionsabbruchsignal.
Der Begriff "3'-Flankierungsregion" in dem hier verwendeten Sinne beinhaltet denjenigen Abschnitt einer natürlich vorkommenden Sequenz, der 3' gegenüber dem transkribierten Abschnitt des Gens liegt, die für die mRNA-Verarbeitung und/oder die gewebespezifische Expression verantwortlich sind. Dieser Abschnitt lässt sich ohne weiteres durch bekannte Verfahren definieren. Beispielsweise können die für mRNA-Stabilität und/oder gewebespezifische Expression verantwortlichen Abschnitte einer 3'-Flankierungsregion durch eine Mutationsanalyse oder durch vielfältige Klone abgebildet werden, die erzeugt werden, um die gewünschte Aktivität einer 3'-Flankierungsregion in einem ausgewählten Vektorsystem zu definieren.
Die 3'-Flankierungsregion kann eine 3'UTR und/oder eine 3'-NCR enthalten. Der Begriff " 3'-untranslatierte-Region" oder "3'UTR" kennzeichnet die Sequenz an dem 3'-Ende eines strukturellen Gens, das aus der DNA transkribiert wird, jedoch nicht in Protein translatiert wird. Diese 3'UTR-Region enthält keine Poly(A)-Sequenz, weist allerdings im Allgemeinen ein Stelle auf, an der eine Poly(A)-Sequenz hinzugefügt ist. Poly-(A)-Sequenzen werden lediglich nach dem Transkriptionsvorgang hinzugefügt.
Myogenspezifische 3'UTR-Sequenzen können verwendet werden, um spezielle Stabilität in Muskelzellen oder anderen Geweben zu ermöglichen. Wie nachstehend beschrieben, kennzeichnet der Begriff myogenspezifische Sequenzen Gensequenzen, die normalerweise in Muskelzellen, z. B. skeletalen, Herz- und glatten Muskelzellen exprimiert werden. Myogenspezifische mRNA-Stabilität ermöglicht eine Steigerung der mRNA-Stabilität in myogenen Zellen. Die Stabilitätssteigerung ermöglicht eine erhöhte Expression. Die 3'UTR- und 3'-NCR-Sequenzen können durch eine gesteigerte mRNA-Stabilität für sich oder gemeinsam einen höheren Spiegel der mRNA-Akkumulation ermöglichen. Somit führt eine erhöhte Expression und/oder Stabilität von mRNA zu erhöhten Spiegeln der Proteinproduktion.
Der Begriff "3'-nicht-kodierende-Region" oder "3'NCR" bezeichnet eine Region, die gegenüber der 3'UTR-Region eines strukturellen Gens benachbart angeordnet ist. Die 3'NCR-Region enthält im Allgemeinen ein Transkiptionsabruchsignal. Sobald die Transkription stattfindet und vor einer Translation wird die durch die 3'NCR kodierte RNA- Sequenz gewöhnlich entfernt, so dass sich die Poly(A)-Sequenz der mRNA hinzufügen lässt. Die 3'-NCR-Sequenzen lassen sich ferner einsetzen, um die mRNA-Stabilität, wie sie oben beschrieben ist, zu ermöglichen. Die 3'NCR kann außerdem die Transkriptionsrate der Nucleinsäurekassette steigern.
Es ist möglich nur eine der Sequenzen oder sowohl die 3'UTR- als auch die 3'-NCR-Sequenz aus einer Gruppe myogenspezifischer Gene auszuwählen. Zu Beispielen myogenspezifischer Gene zählen das skeletale a-Actin-Gen, das schnelle Myosin-Leichtketten-1/3-Gen, das Myosin-Schwerkettengen, das Troponin-T-Gen, Acetylcholinrezeptoruntereinheitsgene und das Muskelkreatininkinasegen.
Hinsichtlich der 3'-Flankierungsregionen diese Erfindung kennzeichnet der Begriff "Wachstumshormon" ein Genprodukt, das als Wachstumshormon identifiziert ist, beispielsweise ein menschliches Wachstumshormon oder ein Wachstumshormon vom Rind. Homologe Gensequenzen sind für vielfältige unterschiedliche Wirbeltiere aus dem Stand der Technik bekannt. In unterschiedlichen Ausführungsbeispielen können die Vektoren 3'-Sequenzen verkörpern, einschließlich 3'-UTR-Sequenzen die von derartigen Wachstumshormongenen stammen. Die 3'-Sequenz kann aus der Sequenz modifiziert werden, die auf natürliche Weise in dem Lebewesen vorzufinden ist, beispielsweise durch die Deletion der ALU-Repeat-Sequenz aus der 3'-UTR menschlichen Wachstumshormons. Die Deletion von ALU-Repeats oder ALU-Repeat ähnelnder Sequenzen lassen sich an vielfältigen 3'-Sequenzen durchführen; eine derartige Deletion reduziert im Allgemeinen die Rate der homologen Rekombination. Vielfältige andere Abwandlungen können ferner vorgenommen werden, ohne die Eigenschaf ten der 3'-Sequenz hinsichtlich eines Abzielens auf ein Gewebe, der Stabilisierung und der Sezernierung zu beeinträchtigen.
Die 5'-Flankierungsregion ist 5' gegenüber dem zugehörigen Gen oder der zu exprimierenden Nucleinsäuresequenz angeordnet. Wie im Falle der 3'-Flankierungsregion lässt sich die 5'-Flankierungsregion durch bekannte Verfahren definieren. Beispielsweise kann der aktive Abschnitt der 5'-Flankierungsregion durch Mutationsanalyse oder vielfältige Klone der 5'-Flankierungsregion abgebildet werden, die erzeugt sind, um die gewünschte Aktivität in einem ausgewählten Vektor zu definieren. Die 5'-Flankierungsregion kann zusätzlich zu den oben erwähnten regulatorischen Sequenzen oder Elementen einen Promotor, eine TATA-Box und eine CAP-Stelle beinhalten, die sich für die Expression eines zugeordneten Gens die Sequenz und Position betreffend in einer geeigneten Relation befinden.
In dieser Erfindung sind "für eine Expression erforderliche Sequenzen" jene Elemente der 5'-Flankierungsregion, die sich die Sequenz und Position betreffend in einer geeigneten Relation befinden, um eine kontrollierte Expression eines Gens innerhalb einer Nucleinsäurekassette zu bewirken. Die Expression wird mit Blick auf gewisse Spiegel innerhalb von Geweben kontrolliert, so dass sich das exprimierte Gen für eine Gentherapie und andere eine Lieferung von Genen verwendenden Anwendungen nutzen lässt. Die 5'-Sequenz kann Elemente enthalten, die gewebespezifische Expression regulieren, oder kann Abschnitte eines natürlich auftretenden 5'-Elements aufweisen, das für eine gewebespezifische Expression verantwortlich ist.
Der Begriff "Promotor" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf eine auf einem DNA-Strang vorhandene Erkennungsstelle, an die RNA-Polymerase bindet. Der Promotor ist gewöhnlich ein DNA-Fragment von etwa 100 bis etwa 200 Basenpaaren (in eukaryotischen Genen) in der 5' flankierenden DNA, stromaufwärts der CAP-Stelle oder der Startstelle der Transkriptionsinitiation. Der Promotor bildet mit der RNA-Polymerase einen "Initialisierungskomplex", um die Transkriptionsaktivität zu initiieren und fortzuführen. Der Komplex kann durch als "Förderer (enhancer)" bezeichnete aktivierende Sequenzen oder als "Bremser (silencer)" bezeichnete inhibitorische Sequenzen modifiziert sein. Der Promotor kann ein Promotor sein, der auf natürliche Weise (d. h. zugeordnet, als ob er sich in vivo innerhalb einer Zelle befindet) oder auf nicht natürliche Weise einer 5'-Flankierungsregion zugeordnet sein kann.
Vielfältige Promotoren können verwendet werden. Zu einige Beispiele zählen Thymidinkinasepromotor, myogenspezifische Promotoren, einschließlich skeletalem a-Actin-Gen-Promotor, schnelle Myosin-Leichtketten 1 Promotor, Myosin-Schwerketten-Promotor, Troponin-T-Promotor und Muskelkreatininkinasepromotor, sowie unspezifische Promotoren, einschließlich des unmittelbaren Zytomegalovirusfrühpromotors Rous-Sarcom-Virus LTR. Diese oder andere in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendeten Promotoren lassen sich mutieren, um die Expression des zugehörigen Gens zu steigern. Weiter kann ein Promotor für sich allein oder in Kombination mit Elementen, die von anderen Promotoren stammen, sowie vielfältigen Förderern, Transkriptionsstabilisierern oder sonstigen Sequenzen verwendet werden, die in der Lage sind, die Funktion des Vektors zu verbessern.
"Mutation" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf eine Veränderung der Sequenz genetischen Materials gegenüber der Norm, durch die eine Änderung der funktionellen Eigenschaften des Gens bewirkt wird. Hierzu gehören Genmutationen, bei denen nur eine einzige Base in den natürlichen Genpromotorsequenzen verändert ist, oder auch solche, bei denen mehrere Basen verändert sind.
Der Begriff "Intron" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf einen DNA-Abschnitt, der in einem transkribierten Abschnitt eines Gens vorkommt, der zwar in einer Präkursor-RNA enthalten ist, jedoch anschließend während der Verarbeitung der transkribierten RNA verbraucht wird, bevor die Translation stattfindet. Intronsequenzen sind daher weder innerhalb von mRNA zu finden, noch werden diese in Protein translatiert. Der Begriff "Exon" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf einen Abschnitt eines Gens, der in einem Transkript eines Gens vorhanden ist und die Verarbeitung der RNA in der Zelle überlebt, um zu einem Teil einer reifen mRNA zu werden. Exons kodieren im Allgemeinen für drei eindeutig unterscheidbare funktionelle Regionen des RNA-Transkripts. Die an dem 5'-Ende angeordnete, als 5'-untranslatierte-Region (5'-UTR) bezeichnete erste Region, die nicht in Protein translatiert wird, signalisiert den Beginn der RNA-Transkription und enthält Sequenzen, die die mRNA zu den Ribosomen führen und bewirken, dass die mRNA durch Ribosome gebunden wird, so dass die Proteinsynthese stattfinden kann. Die zweite Region enthält die Information, die sich in die Aminosäuresequenz des Proteins translatieren lässt oder als bioaktives RNA-Molekül wirkt. Die an dem 3'-Ende angeordnete dritte Region, d. h. die 3'-UTR, wird nicht in Protein translatiert sondern enthält die Signale für den Abbruch der Translation und für das Hinzufügen eines Polyadenylierungsanhängsels (Poly(A)). Insbesondere kann die 3'-UTR, wie sie oben definiert ist, mRNA-Stabilität schaffen. Die Intron/Exon-Grenze wird jener Abschnitt in einem speziellen Gen sein, bei dem ein Intron-Abschnitt an einen Exon-Abschnitt anschließt. Die Begriffe "TATA-Box" und "CAP-Stelle" werden gemäß ihrer Bedeutung nach dem Stand der Technik verwendet.
Der Begriff "Linker" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf DNA, die die Erkennungsstelle für eine spezielle Restriktionsendonuklease enthält. Ein Linker kann an die Enden von DNA-Fragmenten ligasiert sein, die durch Spaltung mit einem sonstigen Enzym präpariert sind. Insbesondere stellte der Linker eine Erkennungsstelle zum Einfügen der Nucleinsäurekassette bereit, die eine spezielle zu exprimierende Nuclein(säure)sequenz enthält. Diese Erkennungsstelle kann, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Endonukleasestelle in dem Linker sein, z. B. Cla-I, Not-I, Xmal, BgL-II, Pac-I, Xhol, NheL, Sfi-I. Ein Linker kann geeignet konstruiert werden, so dass die nur einmal vorkommende Endonucleaserestriktionsstelle ein Start-Codon (beispielsweise AUG) oder ein Stopp-Codon (beispielsweise TAA, TGA, TCA) enthält, und diese kritischen Codone rekonstituiert werden, wenn eine für ein Protein kodierende Sequenz in den Linker ligasiert wird. Solche Linker enthalten gewöhnlich eine NcoI- oder SphI-Stelle.
Der Begriff "Leader" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf eine DNA-Sequenz an dem 5'-Ende eines strukturellen Gens, der gemeinsam mit dem Gen transkribiert und translatiert wird. Der Leader bewirkt gewöhnlich, dass das Protein eine gelegentlich als eine Pro-Sequenz bezeich nete n-terminale Peptiderweiterung aufweist. Für Proteine, die für einen Abgabe entweder an das extrazelluläre Medium oder die Membrane bestimmt sind, lenkt diese Signalsequenz das Protein in das endoplasmatisches Retikulum, aus dem es an den geeigneten Bestimmungsort ausgestoßen wird. Die Leadersequenz wird normalerweise durch die gewünschte Nucleinsäure kodiert, die aus einer unterschiedlichen Gensequenz synthetisch abgeleitet oder isoliert wird. In den Vektoren der vorliegenden Erfindung können vielfältige, von unterschiedlichen Proteinen stammende Leadersequenzen verwendet werden. Zu einigen, nicht als beschränkend zu bewertenden Beispielen zählen Gelsolin, Albumin, Fibrinogen und andere abgesonderte Serumproteine.
Der Begriff "Vektor" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf eine von einem Plasmid, Cosmid, Phasmid oder einem Bakteriophagen abgeleitete, oder durch chemische oder enzymatische Mittel synthetisierte Nucleinsäure, z. B. DNA, in den ein oder mehrere Nucleinsäurefragmente eingeführt oder geklont sein können, die für spezielle Gene kodieren. Der Vektor kann für diesen Zweck eine oder mehrere nur einmal vorkommende Restriktionsstellen enthalten und kann zu autonomer Replikation in einem definierten Wirt oder Organismus in der Lage sein, so dass die klonierte Sequenz reproduziert wird. Der Vektor kann eine lineare, ringförmige oder Superknäuelkonfiguration aufweisen und für bestimmte Zwecke mit anderen Vektoren oder anderen Substanzen zu einem Komplex kombiniert sein. Die Komponenten eines Vektors können, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein, ein DNA-Molekül aufweisen, in dem eingebaut sind: (1) eine für ein therapeutisches oder gewünschtes Produkt kodierende Sequenz; und (2) regulatorische Elemente für die Transkription, Translation, RNA-Stabilität und Replikation.
Der Vektor kann verwendet werden, um die Expression einer Nucleinsäuresequenz in einem Gewebe zu ermöglichen. In der vorliegenden Erfindung wird diese Expression verbessert, indem einem von der Nucleinsäuresequenz stammenden mRNA-Transkript Stabilität verliehen wird und/oder eine Absonderung des therapeutischen Proteins ermöglicht wird. Die Expression beinhaltet die effiziente Transkription eines eingefügten Gens oder einer eingefügten Nucleinsäuresequenz innerhalb des Vektors. Die Expressionsprodukte können Proteine sein, beispielsweise, ohne auf diese beschränken zu wollen, reines Protein (Polypeptid), Glycoprotein, Lipoprotein, Phosphoprotein oder Nucleoprotein. Die Expressionsprodukte können auch RNA sein. Die Nucleinsäuresequenz ist in einer Nucleinsäurekassette untergebracht. Die Expression der Nucleinsäure kann kontinuierlich oder durch endogene oder exogene Stimulanzien kontrolliert stattfinden.
Die Begriffe "kontrollieren" oder "kontrolliert" in dem hier verwendeten Sinne betreffen die Expression von Genprodukten (Protein oder RNA) in ausreichend hohen Mengen, so dass eine therapeutische Wirkung erzielt wird. Ausreichend hohe Spiegel für eine therapeutische Wirkung liegen unterhalb von toxischen Spiegeln. Das Maß der Expression für eine therapeutische Wirkung innerhalb von ausgewählten Geweben entsprechen der reproduzierbaren Aufnahmekinetik, der Eliminierung aus der Zelle, der Verarbeitung nach einer Translation und den Spiegeln einer Genexpression, und, in gewissen Ausprägungen, einer in Antwort auf gewisse endogene oder exogene Stimulanzien (z. B. Hormone, Medikamente) regulierten Expression.
Der Begriff "Nucleinsäurekassette" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf das interessierende genetische Material, das für ein Protein oder eine RNA kodiert. Die Nucleinsäurekassette ist hinsichtlich der Position und der Sequenz innerhalb des Vektors so ausgerichtet, dass sich die Nucleinsäure in der Kassette in RNA transkribieren lässt, und, falls erforderlich, in dem transformierten Gewebe oder der transformierten Zelle in ein Protein translatiert werden kann. Vorzugsweise weist die Kassette 3'- und 5'-Enden auf, die für eine bereitwillige Insertion in einen Vektor geeignet sind, z. B. Endonucleaserestriktionsstellen an jedem Ende. In den Vektoren dieser Erfindung enthält eine Nucleinsäurekassette eine Sequenz, die für den insulinähnlichen Wachstumsfaktor I (IGF-I) kodiert, z. B. für menschlichen IGF-I.
Der Begriff "Gewebe" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf eine Ansammlung von Zellen, die spezialisiert sind, um eine spezielle Funktion durchzuführen, oder möglicherweise auch auf eine einzelne Zelle. Die Zellen können von demselben Typus sein oder unterschiedlicher Art.
Der Begriff "Gen", z. B. "myogene Gene", bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf jene Gene, die hier exemplarisch veranschaulicht sind, und auf dazu äquivalente Gene in anderen Spezies von Lebewesen oder anderen Geweben. Homologe Sequenzen (d. h. Sequenzen mit einem gemeinsamen evolutionären Ursprung, der Mitglieder derselben Oberfamilie repräsentiert) oder analoge Sequenzen (d. h. Sequenzen die trotz eines eindeutig unterschiedlichen evolutionären Ursprungs gemeinsame Eigenschaften aufweisen) sind ebenfalls inbegriffen, so lange sie äquivalente Eigenschaften bezüglich den hier beschrieben aufweisen. Für die vorliegende Erfindung ist von Bedeutung, dass die gewählte Se quenz die verbesserten Expressionsspiegel, die Expression des geeigneten Produkts und/oder eine gewebespezifische Expression ermöglicht, wie sie hier vermerkt ist. Der Fachmann wird erkennen, dass die für derartige Funktionen erforderlichen minimalen Sequenzen durch die oben erwähnte Definition abgedeckt sind. Diese minimalen Sequenzen lassen sich ohne weiteres durch herkömmliche Verfahren determinieren, wie sie hier beispielhaft veranschaulicht sind.
Der Begriff "myogen" bezieht sich auf Muskelgewebe oder Muskelzellen. Das Muskelgewebe oder die Muskelzellen können in vivo, in vitro oder in einer in vitro Gewebekultur vorliegen, und in der Lage sein, zu Muskelgewebe zu differenzieren. Zu myogenen Zellen gehören Skelett-, Herz- und glatte Muskelzellen. Gene werden als "myogen" oder "myogenspezifisch" bezeichnet, falls sie in myogenen Zellen exprimiert werden oder in diesen bevorzugt exprimiert werden. Vektoren werden als "myogen" oder "myogenspezifisch" bezeichnet, falls sie ihre Funktion bevorzugt in myogenem Muskelgewebe oder myogenen Zellen ausüben. Die myogene Aktivität von Vektoren kann durch Transfektion dieser Vektoren in in Kultur vorliegende myogene Zellen bestimmt werden, die in intaktes Muskelgewebe injiziert werden, oder in Oozyten von Säugern injiziert werden, um stabil in das Genom eingebaut zu werden, so dass transgene Lebewesen entstehen, die das Protein oder die interessierende RNA in myogenen Zellen exprimieren.
Der Begriff "nicht myogen" kennzeichnet Gewebe oder Zellen, die nicht Muskel sind. Die Gewebe oder Zellen können in vivo, in vitro oder in einer in vitro Gewebekultur vorliegen.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel kann der oben beschriebene Vektor seine 5'-Flankierungsregion von myogenen Genen, insbesondere dem skeletalen a-Actin-Gen, z. B. einem skeletalen Küken a-Actin-Gen, erhalten haben. Insbesondere kann dies eine Promotorsequenz beinhalten, die mit anderen 5'-UTR-Sequenzen verbunden sein kann, die ein Intron enthalten können. Während hier exemplarisch Vektoren veranschaulicht sind, die skeletale Küken a-Actin-Promotor- und/oder andere 5'-Flankierungssequenzen verwenden, sind die 5'-Sequenzen für a-Actin-Gene in hohem Maße konserviert, mit der Folge, dass solche 5'-a-Actin-Sequenzen von anderen Wirbeltierspezies, einschließlich beispielsweise dem Menschen genutzt werden können.
Die 3'-UTR stammt von einem Wachstumshormongen, vorzugsweise von einem menschlichen Wachstumshormongen, und enthält vorzugsweise ein Poly(A)-Signal. Diese Sequenz kann unmittelbar nach dem natürlichen Translationsabbruch-Codon für eine cDNA-Sequenz, die für das Protein oder die zu exprimierende RNA kodiert, angefügt werden. Wie oben erörtert, können diese Regionen zusätzlich und noch genauer durch Routineverfahren definiert werden, z. B. durch Deletion oder Mutationsanalyse oder dazu äquivalente Verfahren.
Die 5'- oder 3'-Sequenzen können eine Sequenz enthalten, die zu der natürlich vorkommenden Sequenz identisch ist, können allerdings auch veränderte Sequenzen aufweisen, die einem Vektor, in dem derartige 5'- oder 3'-Sequenzen eingebaut sind, äquivalente Funktion verleihen. Eine derartige Änderung könnte beispielsweise eine Änderung von zehn Nukleotiden in einer beliebigen der oben erwähnten Regionen sein. Insbesondere können solche Änderungen die Deletion von ALU-Repeat-Sequenzen aus der 3'-UTR beinhal ten. Dies ist lediglich als Beispiel erwähnt und nicht beschränkend zu bewerten.
Ferner ist in einem bevorzugten Ausführungsbeispiel die für IGF-I kodierende Sequenz eine für synthetisches IGF-I kodierende Sequenz. Eine derartige synthetische Sequenz weist eine Nukleotidsequenz auf, die sich von einer natürlichen für menschliches IGF-I kodierenden Sequenz unterscheidet. Es ist bevorzugt, dass die Sequenz die Codone optimal ausnutzt; vorzugsweise werden wenigstens 50%, 70% oder 90% der Codone optimiert. Somit weist die synthetische DNA-Sequenz gegenüber der Sequenz von SEQ-ID-Nr 1 in bevorzugtem Ausführungsbeispielen wenigstens 80, 90, 95 oder 99% Sequenzübereinstimmung auf. In einem speziellen bevorzugten Ausführungsbeispiel beträgt die Übereinstimmung der synthetischen DNA-Sequenz gegenüber der Sequenz von SEQ-ID Nr. 4 wenigstens 95%, eher bevorzugt wenigstens 99% und am meisten vorzuziehen 100%.
Darüber hinaus kann noch ein Ausführungsbeispiel des obigen Vektors ein regulatorisches System zum Regulieren der Expression der Nucleinsäurekassette beinhalten. Der Begriff "regulatorisches System" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf in die obigen Vektoren eingebaute cis-ständig wirkende oder trans-ständig wirkende Sequenzen, die in einigen Charakteristiken die Expression der interessierenden Nucleinsäuren sowie trans-ständig wirkende Genprodukte regulieren, die in der Zelle mit dem oben erwähnten beschrieben Vektor co-exprimiert werden. Regulatorische Systeme können zur Aufwärtsregulierung oder Abwärtsregulierung einer Expression verwendet werden, und zwar ausgehend von den normalen Expressionsspiegeln oder von den während der Regulierung bestehenden Expressionsspiegeln. Das System trägt zu der zeitlichen Steuerung und dem Muster der Entwicklung der Expression der Nucleinsäure bei.
Ein Konstruktion eines regulatorischen Systems beinhaltet einen chimärischen trans-ständig wirkenden regulatorischen Faktor, der Elemente eines Serumantwortfaktors inkorporiert, der in der Lage ist, die Expression des Vektors in einer Zelle zu regulieren. Der chimärische trans-ständig wirkende regulatorische Faktor wird konstruiert, indem die normale DNA-Bindungsdomänensequenz des Serumantwortfaktors durch eine DNA-Bindungsdomänensequenz eines Rezeptors ersetzt wird. Der Serumantwortfaktor weist eine trans-Aktivierungdomäne auf, die unverändert ist. Die trans-Aktivierungdomäne ist in der Lage, eine Transkription zu aktivieren, wenn ein Agens oder Ligand, der für die Rezeptorbindungsstelle spezifisch ist, an den Rezeptor bindet. Dementsprechend lässt sich die Regulierung kontrollieren, indem die Menge des Agens kontrolliert wird.
Die in den chimärischen trans-ständig aktivierenden regulatorischen Faktor eingearbeitete DNA-Bindungsdomänensequenz eines Rezeptors kann aus vielfältigen Rezeptorgruppen ausgewählt sein, zu denen, ohne auf diese beschränken zu wollen, Vitamin-, Steroid-, Schilddrüsen-, verwaiste Hormon-, retinartige Säuren-, Thyroxin- oder GAL4-Rezeptoren gehören. Der chimärische trans-ständig aktivierende Regulierungsfaktor ist gewöhnlich innerhalb der Sequenz des Promotors angeordnet. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist der in dem Vektor verwendete Promotor der a-Actin-Promotor und der Rezeptor ist der Vitamin-D-Rezeptor.
Der Begriff "Rezeptor" in dem hier verwendeten Sinne schließt natürliche Rezeptoren ein (d. h. wie sie in eine Zelle in vivo zu finden sind) sowie jedes Mittel, das in ähnlicher Weise bindet und Veränderungen der Kompartimentierung in einer Zelle herbeiführt.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel des regulatorischen Systems bezieht die Konstruktion eines Vektor mit zwei funktionellen Einheiten ein. Die eine der funktionellen Einheiten exprimiert einen Rezeptor. Diese funktionelle Einheit enthält für eine Expression erforderliche Elemente, zu denen gehören: ein Promotor, eine für den Rezeptor kodierende Nucleinsäuresequenz und eine 3'-UTR und/oder eine 3'-NCR. Die andere funktionelle Einheit exprimiert ein therapeutisches Protein oder eine therapeutische RNA und enthält darüber hinaus ein dem Rezeptor entsprechendes Antwortelement, einen Promotor, eine Nucleinsäurekassette und eine 3'-UTR und/oder eine 3'-NCR. Diese funktionellen Einheiten können in demselben oder in gesonderten Vektoren vorliegen.
Die erste funktionelle Einheit exprimiert den Rezeptor. Vorzuziehen ist die Verwendung eines Rezeptors, der in dem Zielgewebe nicht in hohen Spiegeln vorzufinden ist. Der Rezeptor geht vor, zeitgleich mit oder nach dem Binden des Agens oder des Liganden an den Rezeptor mit dem Antwortelement auf der zweiten funktionellen Einheit eine Wechselwirkung ein, beispielsweise eine Ionen-, Nichtionen-, hydrophoe oder H-Bindung. Diese Wechselwirkung ermöglicht die Regulierung der Expression der Nucleinsäurekassette. Der Rezeptor kann aus derselben, nicht als beschränkend zu bewertenden Gruppe, wie sie oben offenbart ist, ausgewählt sein. Außerdem kann der Vektor durch Verwenden myogenspezifischer 3'-UTR- und/oder 3'-NCR-Sequenzen myogenspezifisch sein.
Bei einem exemplarischen bevorzugten Ausführungsbeispiel kann das Plasmid pIG0552 oder ein Plasmid sein, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die mit der Sequenz von pIG0552 übereinstimmt. Dies ist lediglich als Beispiel erwähnt und soll nicht beschränkend gewertet werden. Es können daher an einem oder mehreren der Sequenzelementen, beispielsweise den 5'- und 3'-Flankierungsregionen, Sequenzveränderungen oder -abwandlungen vorgenommen werden. Die für diesen exemplarischen Vektor verwendeten Sequenzen weisen den Vorteil auf, dass sie ein IGF-I-RNA-Spleißprodukt bereitstellen, das ein Polypeptid erzeugt, das eine Signalsequenz aufweist, deren Länge mit derjenigen einer Form übereinstimmt, die natürlich in Muskelgewebe und vielen anderen Geweben vorzufinden ist.
In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "gleich", dass die Sequenzen funktional äquivalent sind und ein hohes Maß an Sequenzübereinstimmung aufweisen. Allerdings können die Sequenzen ein geringes Maß an Sequenzunterschieden aufweisen, z. B. in Form einer Substitution, Deletion oder Addition eines oder mehrerer Nukleotide. Der Anteil solcher Sequenzen wird vorzugsweise weniger als 10%, eher bevorzugt weniger als 5% und noch eher bevorzugt weniger als 1 der gesamten Sequenz betragen.
In speziellen Ausführungsformen können die Vektoren des oben erwähnten Aspekts die genannten Elemente oder Sequenzen alternativ enthalten, im Wesentlichen aus diesen aufgebaut sein oder ganz aus diesen bestehen.
Der Begriff "aufweisen/enthalten" bedeutet, dass diesbezügliche Inhalte einbezogen sind, ohne auf diese beschränkten zu wollen. Die Verwendung des Begriffs "aufwei sen/enthalten" zeigt an, dass die aufgelisteten Elemente erforderlich oder unabdingbar sind, dass jedoch andere Elemente optional sind und vorhanden sein können oder auch nicht. Mit dem Begriff "bestehend aus" sollen damit verbundene Inhalte beschränkend eingeschlossen sein. Dementsprechend zeigt der Begriff "bestehend aus" an, dass die aufgelisteten Elemente erforderlich oder unabdingbar sind, und dass keine anderen Elemente vorliegen können. Durch "im Wesentlichen bestehend aus" soll ausgedrückt werden, dass beliebige der diesbezüglich aufgelisteten Elemente eingeschlossen sind, und eine Beschränkung auf andere Elemente besteht, die die in der Offenbarung für die aufgelisteten Elemente spezifizierte Aktivität oder den Vorgang nicht beeinträchtigen bzw. dazu beitragen. Der Begriff "im Wesentlichen bestehend aus" zeigt also an, dass die aufgelisteten Elemente erforderlich oder unabdingbar sind, dass jedoch andere Elemente optional sind und dass diese abhängig davon, ob sie die Aktivität oder Vorgang der aufgelisteten Elemente beeinträchtigen, vorhanden sein können oder ausgeschlossen sind.
Ein verwandter Aspekt der Erfindung schafft eine Formulierung zum Einbringen und Exprimieren eines IGF-I-Gens in einer Zelle, vorzugsweise eines menschlichen IGF-I-Gens. Die Formulierung enthält einen Vektor des oben erwähnten Aspekts zusammen mit einer oder mehreren anderen Komponenten, die beispielsweise auf den Vektor stabilisierend wirken oder die Effizienz der Transfektion verbessern können, die jedoch möglicherweise auch andere Funktionen erfüllen. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel enthält die Formulierung den Vektor in einer Lösung, die zwischen etwa 0,5 und 50% Polyvinyl-Pyrrolidon (PVP) enthält, vorzugsweise etwa 5% PVP. Vorzugsweise weist das PVP ein mittleres Mo lekulargewicht von etwa 50.000 g/Mol auf. Weiteres ist in der PCT US95/17038 offenbart. Allerdings beinhaltet ein weiteres Beispiel einer Formulierung den Vektor mit einem kationischen Lipid (wie es beispielsweise in dem US-Patent 4 897 355, ausgegeben am 30. Januar 1990, beschrieben ist), und kann auch ein Co-Lipid einschließen, beispielsweise ein neutrales Co-Lipid.
Mit Bezug auf die Formulierungen dieser Erfindung zeigt der Begriff "etwa" an, dass in bevorzugten Ausführungsbeispielen der tatsächliche Wert für einen speziellen Parameter im Bereich von 50 bis 200% des genannten Werts liegt.
Ein weiterer verwandter Aspekt der Erfindung beinhaltet Merkmale eines transgenen Lebewesens, bei dem zumindest einige Zellen Vektoren des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung enthalten. Zu diesen Zellen gehören auch Bakterien oder somatische Zellen. Das transgene Lebewesen kann als Modell zum Erforschen von Erkrankungen bei Menschen, zum Einschätzen und Untersuchen neuer therapeutischer Verfahren, zum Auswerten der Wirkungen chemischer und physikalischer Karzinogene und zur Untersuchung der Wirkung vielfältiger Gene und genetischer regulatorischer Elemente verwendet werden. Darüber hinaus können transgene Lebewesen verwendet werden, um wirtschaftlich wichtige Viehbestandsspezies zu entwickeln.
Ein vierter verwandter Aspekt der vorliegenden Erfindung schafft Zellen, die mit einem Vektor der vorliegenden Erfindung transformiert sind, um eine IGF-I Nucleinsäuresequenz, vorzugsweise eine hIGF-I-Nucleinsäuresequenz, zu exprimieren.
In dem hier verwendeten Sinne bedeutet "Transformation" die Veränderung in den phänotypischen Eigenschaften einer Zelle durch die Wirkung eines Gens, das ein Genprodukt exprimiert. Das die Charakteristische Änderung des Phänotypus hervorrufende Gen wurde in die Zelle transfiziert.
Der Begriff "Transfektion" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf einen Mechanismus eines Gentransfers, der die Aufnahme von DNA durch eine Zelle oder durch einen Organismus umfasst. Nach dem Eingang in die Zelle kann die transformierende DNA mit derjenigen des Wirtsorganismus rekombinieren, indem sie physikalisch in die Chromosomen der Wirtszelle integriert wird, kann vorübergehend, ohne repliziert zu werden, als ein episomales Element aufrecht erhalten bleiben oder kann unabhängig als Plasmid replizieren. Vorzugsweise integriert sich die transformierende DNA nicht.
Die Transfektion kann durch in vivo Techniken, wie sie nachstehend beschrieben sind, oder durch ex vivo Techniken ausgeführt werden, bei denen Zellen mit einem Vektor co-transfiziert werden, der einen selektierbaren Marker enthält. Dieser selektierbare Marker wird verwendet, um jene Zellen auszuwählen, die den transformierten Zustand erlangt haben. Dem Fachmann ist der Typ von im Zusammenhang mit Transfektions-/Transformationsstudien zu verwendenden selektierbaren Markern gut bekannt. Ein Beispiel eines derartigen Markers ist ein Neogen, das Neomyzin/Kanamyzin-resistenz bereitstellt. Die Transfektion/Transformation kann gewebespezifisch sein, d. h. die Verwendung von myogenspezifischen Vektoren einbeziehen, die die Expression der Nucleinsäurekassette überwiegend in dem gewählten Gewebe her vorrufen. Insbesondere kann die Gewebespezifität durch die Verwendung eines für eine Expression von myogenen Gewebe spezifischen Promotors und/oder derartigen 3'UTR- und/oder 3'-NCR-Sequenzen auf myogene Zellen gelenkt werden.
Ein fünfter verwandter Aspekt der vorliegenden Erfindung schafft Verfahren zum Transfizieren einer Zelle ex-vivo mit den Vektoren der vorliegenden Erfindung. Dieses Verfahren weist den Schritt auf, eine Zelle in situ mit einem Vektor der vorliegenden Erfindung für eine ausreichende Zeitspanne in Berührung zu bringen, um die Zelle zu transfizieren.
Ein sechster verwandter Aspekt der Erfindung schafft ein Verfahren, um ein IGF-I-Gen, vorzugsweise eine hIGF-I-Gen, ex-vivo zu liefern und zu exprimieren. Zu dem Verfahren gehören ein Transfizieren einer Vielzahl von Zellen ex-vivo mit einem Vektor des ersten Aspekts und ein Inkubieren der Zellen unter Bedingungen, die eine Expression einer für IGF-I kodierenden Nucleinsäuresequenz des Vektors erlauben. Die "eine Expression erlaubenden Bedingungen" können beliebige unter vielfältigen Bedingungen sein. Unter derartigen Bedingungen werden die Zellen das Genprodukt auf der Grundlage der Vektor-DNA in nachweisbaren Mengen hervorbringen.
Ein siebter verwandter Aspekt der vorliegenden Erfindung schafft die Verwendung des oben erwähnten Vektors als Medikament. Die Erkrankung oder Bedingung kann beispielsweise lokal begrenzt oder systemisch sein. Die Erkrankung kann, ohne darauf beschränken zu wollen, Muskelatrophie, Atherogenese, atherosklerotische kardiovaskuläre, cerebrovasculäre oder periphere vaskuläre Erkrankungen, Diabetes, Neuropathie, Wachstumsstörungen und Hämophilie beinhalten.
Diese Vektoren enthalten Nucleinsäuresequenzen, die für den insulinähnlichen Wachstumsfaktor I kodieren.
Die zu behandelnde Muskelatrophie kann auf eine beliebige aus einer Vielzahl verschiedener Ursachen zurückzuführen sein. Beispielsweise kann eine Muskelschwäche hauptsächlich von einer Inaktivitätsatrophie herrühren, die beispielsweise im Allgemeinen in Fällen eines Gelenkersatzes auftreten. Desgleichen kann es zu Schwächung und Atrophie von Muskeln in Folge einer Schädigung des unteren Motorneurons kommen. Eine derartige Schädigung des unteren Motorneurons kann auf eine große Anzahl von verschiedenen Ursachen zurückzuführen sein, beispielsweise Kubitaltunnelsyndrom, Bellsche Lähmung, Karpaltunnelsyndrom, Wirbelfraktur oder diabetische Neuropathie. Zu den Ursachen können ferner genetische Ursachen einer Muskelatrophie, einschließlich beispielsweise Muskeldystrophie zählen. Diese Ursachen und Bedingungen sind lediglich exemplarisch genannt und nicht als beschränkend für die Erfindung zu bewerten.
Dementsprechend kennzeichnet der Begriff "lokalisierte" Erkrankung oder Bedingung eine solche, bei der eine Schädigung oder Atrophie eines speziellen Nervens oder Muskels auf einen definierten und abgegrenzten Bereich des Körpers beschränkt ist. Ein spezielles Beispiel ist Inaktivitätsatrophie. Eine "systemische" Erkrankung oder Bedingung kennzeichnet solche, die den gesamten Organismus betreffen oder innerhalb des Körpers weiträumig auf eine Anzahl von Orte verteilt sind. Hierzu zählen beispielsweise Diabetes, Wachstumsstörungen, Neuropathien und Muskeldystrophie.
Die Therapieverfahren der vorliegenden Erfindung er möglichen Verfahren zum Errichten einer Expression von IGF-I in Gewebe durch Verabreichung eines Vektors. Diese Verfahren der Verwendung der oben erwähnten Vektoren weist den Schritt auf, einem Menschen, einem Lebewesen oder einer Gewebekultur eine wirksame Menge der Vektoren zu verabreichen.
Die Begriffe "verabreichen" oder "Verabreichung" beziehen sich in dem hier verwendeten Sinne auf die Route der Einbringung eines DNA-Vektors oder -Trägerstoffs in den Körper. Die Vektoren der oben erwähnten Verfahren und die weiter unten erörterten Verfahren können über vielfältige Routen verabreicht werden. Insbesondere ist die Skelettmuskelzelle eine bevorzugte Zielzelle für eine Behandlung.
Der Begriff "Skelettmuskel" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf jene Zellen, die den Hauptanteil der Körpermuskulatur bilden, d. h. gestreifte Muskeln.
Eine Verabreichung kann unmittelbar in ein Zielgewebe erfolgen oder kann einen gezielten Transport nach einer systemischen Verabreichung einbeziehen. Die bevorzugten Ausführungsbeispiele basieren auf einer unmittelbaren Injektion in Muskelgewebe oder auf einer gezielten Aufnahme in Muskeln nach einer intravenösen Injektion.
Der Begriff "Lieferung" kennzeichnet das Verfahren, durch das der Vektor mit der bevorzugten Zielzelle nach einer Verabreichung in Berührung kommt. Die Verabreichung kann eine Nadelinjektion in Zellen, Gewebe, Flüssigkeitsräume oder Blutgefäße, Elektroporation, Transfektion, Hypospray, Iontophorese, Partikelbeschuss oder Transplantation von Zellen einbeziehen, die ex vivo genetisch modifiziert wurden. Zu Beispielen der Verabreichung gehören eine intravenöse, intramuskuläre, aerosole, orale, äußerliche, systemische, okulare, intraperitoneale und/oder intrathekale Verabreichung.
Die bevorzugten Mittel zur Verabreichung der oben beschriebenen Vektoren beinhalten die Verwendung von Formulierungen zur Lieferung an die Zielzelle, in der der Vektor mit Elementen wie Lipiden, Proteinen, Kohlenhydraten, synthetischen organischen Verbindungen oder anorganischen Verbindungen assoziiert wird, die den Eintrag des Vektors in den Kern der Zielzelle verbessern, wo Genexpression stattfinden kann. Ein spezielles Beispiel ist PVP.
Der Begriff "Formulierung" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf nicht genetisches Material, das mit dem Vektor in einer Lösung, Suspension oder einem Kolloid kombiniert wird, das die Lieferung des Vektors an ein Gewebe, die Aufnahme durch Zellen innerhalb des Gewebes, den intrazellulären Verkehr durch die Membrane, das Endosom oder das Zytoplasma hindurch in den Kern, die Stabilität des Vektors in extrazellulären oder intrazellulären Kompartimenten und/oder die Expression von genetischem Material durch die Zelle verbessert.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung weist der Vektor und die Formulierung Nanopartikel auf, die als eine Suspension oder ein Kolloid verabreicht werden. Die Formulierung kann Lipide, Proteine, Kohlenhydrate, synthetische organische Verbindungen oder anorganische Verbindungen enthalten. Zu Beispielen von Elementen, die in einer Formulierung vorhanden sind, gehören Lipide, die in der Lage sind, Liposome, kationische Lipide, hydrophile Polymere, Polykationen (beispielsweise Protamin, Polybrin, Spermidin, Polylysin) zu bilden, Rezeptoren, die Peptide oder synthetische Liganden auf der Fläche der Zielzellen erkennen, Peptid oder synthetischer Ligand, der in der Lage ist, Endosomal-Lysis zu induzieren, Peptid oder synthetischer Ligand, der in der Lage ist, Stoffe gezielt zu dem Kern zu befördern, Gele, langsame Freigabematrizen, Salze, Kohlenhydrate, Nährmittel oder lösliche oder nicht lösliche Partikel sowie Analoge oder Derivate von derartigen Elementen. Hierin sind Formulierungselemente eingeschlossen, die die Zufuhr, Aufnahme, Stabilität und/oder Expression genetischen Materials in Zellen verbessern. Diese Liste dient lediglich der Veranschaulichung und ist keinesfalls beschränkend zu bewerten.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung stattet die obigen Vektoren mit Beschichtungselementen aus, die die Expression sowie die Aufnahme durch die Zelle verbessern. Der Begriff "Beschichtung" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf Elemente, Proteine oder Moleküle, die verwendet werden, um sich mit dem Vektor zu assoziieren, um die zelluläre Aufnahme zu verbessern. Insbesondere beinhaltet der Begriff Beschichtung einen DNA-Initialisierungskomplex und Histone. Die Beschichtung verbessert die Stabilität des Vektors, seinen Eintrag in den Kern und die Effizienz der Transkription.
Der Begriff "DNA-Initialisierungskomplex" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf einen Komplex, der einen Serumantwortfaktor, einen Transkriptionsinitialisierungsfaktor und einen transregulatorischen Faktor enthält. Der Serumantwortfaktor wird an das Serumantwortelement innerhalb der Promotorregion des Vektors gebunden oder tritt mit diesem in Wechselwirkung. Der Transkriptions-initialisierungsfaktor und der transregulatorische Faktor interagieren anschließend mit dem Serumantwortfaktor und dem Promotor, insbesondere mit der TATA-Box innerhalb des Promotors, um einen stabilen DNA-Komplex zu bilden. Der Begriff "Histon" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf Nukleoproteine, die sich mit DNA, z. B. einem Vektor, assoziieren und/oder an diese binden. Die Histone können spezifisch oder unspezifisch an die DNA binden.
Der Begriff "wirksame Menge" bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf eine ausreichende Menge an Vektor, die Menschen, sonstigen Lebewesen oder einer Gewebekultur verabreicht wird, um den geeigneten Spiegel an Proteinen oder RNA zu erzeugen. Der Fachmann erkennt, dass der angemessene Spiegel an Protein oder RNA von der Verwendung des speziellen Vektors abhängen wird. Diese Spiegel werden sich abhängig von dem Typ der Verabreichung und der Behandlung oder Impfung unterscheiden.
Die Therapieverfahren, wie sie hier offenbart sind, schließen eine Behandlung mit biologischen Produkten (insbesondere Proteinen der oben definierten Art) ein, bei der die behandelte Erkrankung voraussetzt, dass das Protein von dem allgemeinen Kreislauf aus durch den Körper zirkuliert. Beispielsweise gehören zu Störungen, die durch die vorliegende Erfindung mittels einer Expression von IGF-I oder dessen Bindungsproteinen behandelt werden könnten, Osteoporose. Die Auswahl des geeigneten Proteins zum Behandeln unterschiedlicher Erkrankungen sind dem Fachmann bekannt.
Im Wege der Behandlung einer Erkrankung, stellt die vorliegende Erfindung ein Mittel bereit, das dazu dient:
(1) ausreichend hohe Spiegel eines speziellen Proteins zu erreichen, um eine therapeutische Wirkung zu erzielen; (2) ein Produkt kontrolliert mit Spiegeln zu exprimieren, die für eine therapeutische Wirkung ausreichen und unterhalb der toxischen Spiegel liegen; (3) in gewissen Geweben eine kontrollierte Expression zu bewirken, um reproduzierbare pharmakokinetische Charakteristiken und Spiegel einer Genexpression zu erreichen; und (4) die Lieferung mittels klinisch und pharmazeutisch verträglicher Mittel der Verabreichung und Formulierung anstelle einer Transplantation gentechnisch konstruierter und ausgewählter Zellen zu bewirken.
In diesem Prozess schafft die Erfindung wesentliche Vorteile gegenüber dem Stand der Technik. Erstens waren aus viralen Genomen stammende Promotoren und virale Vektoren, die verwendet wurden, um hohe Spiegel einer Expression in Gewebe zu erreichen, nicht in der Lage eine kontrollierte Expression vorzusehen. Zweitens wiesen von vielfältigen gewebespezifischen Genen stammende Promotoren, die verwendet wurden, um eine kontrollierte Expression in Modellen einer Gentherapie transgener Lebewesen und Tiere zu erzielen, keinen ausreichend hohen Expressionsspiegel auf, um eine therapeutische Wirkung zu erzeugen. Darüber hinaus beeinträchtigt die Fähigkeit zum Züchten von Antikörpern gegen Eiweißprodukte im Falle einer Behandlung von Erkrankungen mittels der vorliegenden Erfindung nicht die Fähigkeit, eine kontrollierte Expression von Proteinen innerhalb des therapeutischen Bereichs zu erreichen.
Das in den Zellen verwendete, von den oben erwähnten Vektoren stammende genetische Material kann eine beliebige natürliche oder synthetische Nucleinsäure sein. Die Nu cleinsäure kann beispielsweise (1) normalerweise in dem Gewebe der Zellen vorzufinden sein; (2) normalerweise in einem spezifischen Gewebe vorhanden, jedoch nicht mit physiologisch signifikanten Spiegeln exprimiert sein; (3) normalerweise in spezifischem Gewebe vorhanden und normalerweise mit physiologischen gewünschten Spiegeln exprimiert sein; (4) eine beliebige andere Nucleinsäure sein, die sich für eine Expression in Skelettmuskelzellen modifizieren lässt; und (5) eine beliebige Kombination der oben genannten Formen sein. Neben genetischem Material, das in ein Gewebe eingebaut wird, ist der oben erwähnte Bezug auch auf genetisches Material anwendbar, das in eine Zelle eingebaut wird.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden anhand der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen und anhand der Ansprüche offenkundig.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine schematische Darstellung des skeletalen Küken a-Actin-Gens, das den Ort gewisser nur einmal vorkommender Restriktionsstellen enthält.
2 zeigt ein myogenes Vektorsystem in einer schematischen Darstellung.
3 zeigt ein schematisches Diagramm eines Satzes von skeletalen a-Actin-/insulinähnlichen Wachstumsfaktor-I-/skeletalen a-Actin-Hybrid-Genen.
4 zeigt das exemplarische Plasmid pIG0552 in einer schematischen Darstellung.
5 zeigt eine schematische Darstellung einer exemplarischen Expressionseinheit, wie sie in dem Plasmid pIG0552 eingebaut ist. Die funktionellen Elemente sind bezeichnet mit: SkA-Promotor – von skeletalem Küken a-Actin-Gen stammende 5'-Promotorregion (Bergsma et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 2462–2475); SkA-Erstes-Intron – von skeletalem Küken a-Actin-Gen stammende 5'-UTR (Exon 1), erstes Intron, Exon 2 bis zur Inizialisierungs-ATG (Coleman et al., 1995, J, Biol. Chem. 270: 12109–12116); hIGF-I-cDNA – menschliche IGF-I-cDNA (Jansen et al., 1983, Nature 306(8): 609–611; Powell-Braxton et al., 1993, Genes Dev. 7(12B): 2609–2617); hGH-3'-UTR – von menschlichem Wachstumshormongen stammende 3'-untranslatierte-Region und Poly-A-Angliederungssignal.
6–8 zeigen in einer systematischen Veranschaulichung der Darstellung das Aufbauschema für pIG0552 unter Veranschaulichung der verallgemeinerten Strukturen der in dem Aufbauprozess verwendeten Ausgangs- und intermediären Plasmide.
9 zeigt eine Liste der Häufigkeiten der Codonnutzung im Falle von in hohem Maße exprimierten menschlichen Genen.
10A und 10B zeigen Graphen, die Ergebnisse eines Mausmodells von Nervenquetschung ver anschaulichen. Die gezeigten Daten sind Durchschnittswerte +/– SEM für n gleich 4 bis 5 (Scheinbehandlung) und n gleich 7 bis 8 (Quetschen/Kontroll- und Quetschen/hIGF-I-Plasmid) Tiere/Gruppe Zeitpunkt. 10A zeigt die Wirkung einer Verabreichung des hIGF-I-Plasmids IM auf die Geschwindigkeit der Nervenleitung. 10B zeigt die Wirkung einer Verabreichung des hIGF-I-Plasmids IM auf die elektromyographische Aktivität (EMG).
11 zeigt die für hIGF-I kodierende Sequenz, wie sie in pIG0552 (SEQ-ID Nr. 1) eingebaut ist.
12 zeigt die für hIGF-I kodierende Sequenz mit einer optimierten Codonnutzung (SEQ-ID Nr. 4).
13 zeigt die Aminosäuresequenz, die sowohl durch die SEQ-ID Nr. 1 als auch die SEQ-ID Nr. 4 kodiert wird.
14 stellt die für hIGF-I kodierenden Sequenzen (SEQ-ID-Nr. 1 und 4) gegenüber, um die Positionen aufzuzeigen, an denen sich die Nukleotide der beiden Sequenzen unterscheiden. Wie angezeigt, weisen die Sequenzen eine Übereinstimmung von etwa 80% auf.
15 veranschaulicht schematisch transgenen hIGF-I, der für kodierenden wie er in transgenen Mäuse verwendetet wird.
Die Zeichnungen sind nicht unbedingt maßstabsgetreu, und gewisse Merkmale der Erfindung können maßstäblich übertrieben und mit Blick auf Klarheit und Kürze schematisch dargestellt sein.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Vektoren und Verfahren dieser Erfindung unterstützen die Lieferung und Expression von IGF-I in Säugerzellen, z. B. in menschlichen Zellen. Es zeigte sich, dass IGF-I eine wichtige Rolle in der normalen Muskelentwicklung, dem Muskelwachstum und der Hypertrophie, der Muskelregeneration und der Erhaltung/Regeneration von peripheren Nerven spielt.
Die folgenden Beispiele sind spezielle bevorzugte Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung und sollen die Erfindung nicht beschränken. Diese Beispiele veranschaulichen, wie sich die Expressionsvektorsysteme der vorliegenden Erfindung zur Konstruktion vielfältiger Zellen- oder Tiermodelle einsetzen lassen, und wie Gene durch innerhalb derartiger Vektoren vorhandener Sequenzen reguliert werden können. Die Beschreibung und der Nutzen derartiger und verwandter Vektoren wird hier erörtert und findet sich eingehender in der US-Patentschrift 5 298 422 von Schwartz et al., mit dem Titel " Myogenic Vector Systems", und der parallelen Patentanmeldung von Schwartz et al., Patentanmeldungsnr. 08/472 809, mit dem Titel "Expression Vector Systems and Method of Use" beschrieben.
Im folgenden werden Beispiele spezieller Regionen von 5'-UTR- und 3'-UTR- und/oder 3'-NCR-Regionen myogener Gene vorgeschlagen, die verwendet werden können, um einen Expressionsvektor mit gewissen Funktionalitäten auszustatten, und zwar innerhalb einer transformierten Zelle oder eines Lebewesens, das einen derartigen Vektor enthält. Der Fachmann wird erkennen, dass spezielle Abschnitte dieser Regionen als jene identifiziert werden können, die die funktionelle Nucleinsäuresequenz enthalten, die die gewünschte Eigenschaft bereitstellt, und derartige Regionen lassen sich ohne weiteres mittels routinemäßiger Deletionstechniken oder durch Mutationen auslösende oder dazu äquivalente Techniken definieren. Solche Regionen beinhalten die Promotor-, Förderer- und cis-ständig- und trans-ständig wirkenden Elemente eines regulierbaren Systems. Wie im vorliegenden festgestellt, können derartige Steuersegmente einer Nucleinsäure an einer beliebigen Stelle in den Vektor eingefügt werden, obwohl bevorzugte Stellen, wie sie hier beschrieben sind, vorhanden sein können.
Isolierung von skeletalen Küken-a-Actin-Gen
Die Nucleinsäuresequenz des skeletalen a-Actin-Gens wurde bei Küken, Ratte, Maus und beim Menschen Charakterisiert. Fornwald et al, 1982, Nucl. Acids Res. 10: 3861–3876; R. Zakut, 1982, Nature 298: 857–859; French et al, 1990, Gene (Amst.) 88: 173–180; Hu et al, 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 15–25; Minty et al, 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 2137–2148. Das skeletale a-Actin-Gen ist ein Element der Actin-Multigen-Familie, die in Wirbeltieren aus drei Klassen von Actin-Isoformen aufgebaut ist, die auf der Grundlage ihrer zellulären Verteilung und Muster der Expression in ausgereiften Geweben eindeutig abgegrenzt sind, nämlich "Zytoplasma-", "glatte Muskel-" und "gestreifte" Actine.
Die gestreiften, a-kardialen und a-skeletalen Actine werden spezifisch in kardialen Myozyten und skeletalen Muskelfasern co-exprimiert. Die Expression der a-kardialen und a-skeletalen Actin-Gene werden in der Entwicklung von kardialen und skeletalen Muskel sequentiell aufwärtsgeregelt, wobei die skeletale Isoform in ausgereiften Skelettmuskel überwiegt. (Vandekerckhove & Weber, 1984, J. Mol. Biol. 179: 391–413; McHugh et al., 1991, Dev. Biol. 148: 442–458; Hayward & Schwartz, 1986, J. Cell Biol. 102: 1485–1493.) Das skeletale Küken a-Actin-Gen ist mit etwa 8% an Poly(A)-RNA das am stärksten exprimierte Gen in ausgereiften skeletalen Kükenmuskel.
Zahlreiche Versuche in vitro und in vivo haben nachgewiesen, dass regulatorische Sequenzen, die dem skeletalen a-Actin-Gen die Zelltypus-restringierte und in der Entwicklung geregelte Expression verleihen, hauptsächlich in der unmittelbaren 5'-Promotorregion konzentriert sind. (Bergsma et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 2462–2475; Taylor et al., 1988, Genomics. 3(4): 323–36; Petropoulos et al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9: 3785–3792; Carson et al., 1995, Am. J. Physiol. 268: C918–24.)
Diese regulatorischen Sequenzen sind in den Promotorregionen sämtlicher bekannten skeletalen a-Actin-Gene bei Wirbeltieren vom Vogel bis zum Menschen in hohem Maße konserviert. Zum Aufbau der IGF-I-Expressionskassette wurden von dem skeletalen Küken a-Actin-Gen abgeleitete regulatorische Sequenzen verwendet, obwohl weitere Ausführungsbeispiele andere Actin- oder a-skeletale Actin-Gene nutzen können.
Die primären Sequenzen der skeletalen a-Actin-Gene der vielfältigen Arten wurden von überlappenden cDNA-Klonen abgeleitet. Um vollständige Gene zu erhalten, wurden die cDNA-Klone zum Screenen genomischer DNA verwendet. Beispielsweise enthält das in 1 gezeigte, aus einem lambda-Charon 4A-Vektor isolierte 25 kb EcoRI-Fragment genomischer Küken-DNA das 6,2 kb lange skeletale a-Actin-Gen auf einer einzigen HindIII-Stelle von pBR322. Chang et al., Mol. Cell. Biol. 4: 2498–2508 (1984). Kerntranskriptionsabläufe wurden verwendet, um die transkriptorische Domäne des skeletalen a-Actin-Gens abzubilden. Die Steuersequenzen des skeletalen Küken a-Actins wurden ebenfalls Charakterisiert (Bergsma et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 2462–2475). DNA-Sonden, die Abschnitte der 5'-nicht-kodierenden, Promotor-kodierenden und der zusammenhängenden 3'-nicht-kodierenden Regionen abdeckten, wurden in M13-Vektoren gekloniert, die Sense- und Antisense-Sonden erzeugten. Kerne, die aus Fibroblasten, Myoblasten und Tag-19 embryonalen Muskelzellen isoliert wurden, wurden in in vitro Transkriptionstests verwendet, um RNA-Transkripte mit radioaktiv markierten Nukleotiden zu verlängern. An punktierte DNA-Sonden hybridisierte markierte RNA zeigte, dass die Transkription etwa 1 kb stromabwärts der Poly-A-Angliederungsstelle des skeletalen a-Actin-Gens endet. Dies liegt ab dem Beginn der Transkription innerhalb eines 800 bp großen PvuII-Fragments zwischen den Nukleotiden +2800 und +3600.
Die 3'-UTR und/oder 3'-NCR kann durch Digestion von Restriktionsendonuklease des 6.2 kb Actin-Gens mit der stumpfen Schere NaeI isoliert werden, die 30 bp stromaufwärts des Translationsabbruch-Codons TAA schneidet. HindIII löst den 3' größten Teil des Actin-Gens aus dem Vektor pBR322 (2). Die 3'UTR und 3'NCR wurden verwendet, um DNA-Konstrukte herzustellen. Die skeletalen a-Actin- Promotor- und (mindestens 411 Nukleotide von der mRNA-Cap-Stelle entfernte) DNA-Flankierungssequenzen sowie DNA-Sequenzen, die sich durch den skeletalen 5'-nicht-kodierenden Leader, das erste Intron und bis zu der Initialisierung der bei +196 zu einer NcoI-Klonierungsstelle umgewandelten Translations-ATG erstrecken, wurde von einer M13-Doppelstrang-DNA durch XbaI- und NcoI-Digestion befreit, mit Klenow befüllt und anschließend in die XbaI- und stumpfen SmaI-Stellen von pBluescript II KS gebunden. Die NcoI-Stelle wird durch diesen Klonierungsschritt regeneriert.
Für gewisse in der Patentanmeldung 08/472,809 von Schwartz et al. beschriebene Vektoren wurde die 3'UTR und 3'NCR auf das 2.3 kb NaeI/HindIII-Fragment gezielt in eine stumpfe EcoRV-Stelle und die benachbarte HindIII-Stelle der pBluescript II KS Vektorkassette geklont. Die EcoRV- und NaeI-Stellen werden zerstört. Die wiederhergestellte NcoI-Stelle wurde verwendet, um für cDNA-Sequenzen kodierende Polypeptide einzufügen. Ein weiterer Klonierungsvektor wurde konstruiert, indem der skeletale a-Actin-Promotor von –411 bis –11 benachbart zu der 3'UTR und 3'NCR eingefügt wurde. Dieser Expressionsvektor eliminiert das erste Intron und die skeletale Actin-5'-Leadersequenz. Diese zwei Vektoren wurden bei der Herstellung von DNA-Konstrukten verwendet, um die Wirksamkeit der 3'UTR und 3'-NCR zu testen.
Ergebnisse, die mittels Vektoren erlangt werden, die eine skeletale a-Actin/IGF-I/skeletale a-Actin-Expressionskassette aufweisen, sind weiter unten beschrieben, wobei die intrazelluläre Expression von IGF-I aus Vektorkonstrukten und gewisse Ergebnisse einer derartigen Expression veranschaulicht werden.
Für die exemplarischen Vektoren der vorliegenden Erfindung wurden Sequenzen, die den skeletalen a-Actin-Promotor und das erste Intron enthielten, in Verbindung mit einer für IFG-I kodierenden Sequenz und einem hGH-3'-UTR/Poly(A)-Signal verwendet. Weitere Ergebnisse, die Wirkungen einer IGF-I-Expression zeigen und gewisse vergleichende Ergebnisse mit skeletalem a-Actin/IGF-I/skeletales a-Actin enthaltenden Vektoren sind weiter unten dargelegt.
Menschliches IGF-I-Gen enthaltende Expressionsvektorkonstruktion
Konstruktionen, die den skeletalen a-Actin-Promotor enthalten, wurden unter Verwendung von aus dem Stand der Technik bekannten herkömmlichen, rekombinante DNA verwendenden Techniken an die menschliche IGF-I-cDNA (SEQ-ID Nr. 1) gebunden. Beispiele eines verallgemeinerten Expressionsvektoraufbaus, der skeletale a-Actin 5'- und 3'-Sequenzen verwendet, sind in 2 gezeigt. Einige spezielle IGF-I aufweisende Vektorkonstrukte sind in 3 zu sehen.
Eine erste Konstruktion (SK202 SVa) wurde so erzeugt, dass die SV40 Poly-A-Angliederungsstelle und das klein-t-Intron an die 3'UTR der IGF-I-cDNA gebunden wurden. Die SV40-Sequenzen wurden hinzugefügt, um die Stabilität von Nukleo-IGF-I-RNA-Transkripten zu erhöhen. Da das SV40-t-Intron möglicherweise für die Expression von IGF-I in Muskelzellen nicht ausreichend geeignet ist, wurden fünf andere Vektoren erzeugt.
Der SK733-NcoI-Vektor enthält etwa 411 Nukleotide des skeletalen a-Actin-Promotors, die natürliche CAP-Stelle, den 5'-nicht translatierten Leader und das erste Intron.
Eine NcoI-Stelle wurde entworfen, um eine eindeutige Insertionsklonierungsstelle für die die IGF-I-cDNA enthaltende Kassette zu erzeugen, in der die Initialisierungs-ATG ebenfalls in eine NcoI-Stelle umgewandelt war.
Die SK733IGF-I-Konstruktion verwendet ihre eigene Poly-A-Stelle. Ein NaeI/HindIII-Fragment, das das skeletale a-Actin-3'-UTR, die Poly-A-Angliederungsstelle und Endsequenzen einbaute, wurde an SK202, SK733-NcoI, IGF-I und SK733IGF-I gebunden, dessen IGF-I-Poly-A-Stelle entfernt und durch diejenige des skeletalen a-Actins ausgetauscht worden war. Auf diese Weise sind IGF-I-RNA-Transkripte, die die skeletale a-Actin-3'-UTR enthalten, stabilisiert und akkumulieren in Skelettmuskelzellen. Darüber hinaus wird der IGF-I durch ein Bereitstellen zusammenhängender 3'-NCR's gegen äußere genomische Sequenzen gepuffert und auf diese Weise während der Integration in das Genom besser vor Positionseffekten geschützt. Weiter verhindern die zusätzlichen regulatorische Sequenzen, die die transkriptorische Domäne von skeletalem a-Actin markieren, durch Bereitstellen von natürlichen Endsequenzen "read through transcription" und verbessern die zeitliche Steuerung der Entwicklung und die Transkriptionsaktivität. Die Anwesenheit einer 3'NCR-Sequenz ermöglicht einer einzigen Kopie des integrierten Vektors, 40–100% der Transkriptionsaktivität der endogenen Sequenzen hervorzubringen.
Das SK733-IGF-ISK2-Plasmid-Konstrukt (pIG0100A) ist in der oben erwähnten Patentanmeldung von Schwartz et al., Patentanmeldung Nr. 08/472 809 offenbart. Dieses Plasmid weist eine Ampicillinresistenzhauptkette auf und kodiert für IGF-I. Das ebenfalls von Schwartz et al., in der Patentanmeldung 08/472 809 offenbart Plasmidkonstrukt pIG0335 ähnelt pIG0100A, enthält jedoch eine Kanamyzinresistenzhauptkette.
Der exemplarische Plasmidvektor pIG0552 wurde mittels pIG0100A und pIG0335B und zusätzlicher Konstrukte (pIG0376A und pVC0289A) aufgebaut. Eine schematische Darstellung von pIG0552 ist in 4 gezeigt. Das pIG0552B Expressionsplasmid enthält eine hIGF-I-Gen-Expressionskassette (5) in einer Plasmidhauptkette, die ein Kanamyzinresistenz(KanR)-Gen enthält. Die hIGF-I-Gen-Expressionskassette von pIG0552B enthält: 1) einen von dem skeletalen Küken a-Actin-Promotor abgeleiteten Promotor und erstes Intron, 2) die cDNA des menschlichen insulinähnlichen Wachstumsfaktors I (hIGF-I) und 3) ein 3'-UTR/Poly(A)-Signal, das von der vom 3'-Ende des menschlichen Wachstumshormons (hGH) nicht translatierten Region (3'-UTR) stammt. Die Plasmidhauptkette wird aus dem pBluescript KS+ (Stratagen) abgeleitet, wobei 1) die Substitution eines Kanamyzinresistenz-Gens (neo) und eines prokaryoutischen Promotors (pNEO, Pharmacia) an die Stelle des Ampicillinresistenz-Gens (bla) tritt, und 2) der fl-Ursprung der Replikation entfernt wird.
Dementsprechend unterscheidet sich die oben beschriebene Expressionskassette von dem ursprünglichen pIG0100-Expressionssystem insbesondere in der 3'-UTR (pIG0100 enthält skeletale Actin-3'-UTR; pIG0552 enthält hGH-3'-UTR). Die hGH-3'-UTR wurde an die Stelle des skeletalen Actin-3'-UTR gesetzt, da sie zu einer höheren Lieferung rekombinanten Proteins aus Skelettmuskel an den systemischen Kreislauf führt. Dieses Ergebnis wurde sowohl bei transgenen Lebewesen als auch in nicht viralen Gentherapieparadigmen beobachtet (d. h. sowohl bei integrierter als auch episoma ler Matrize).
Der tatsächliche Aufbau von pIG0552B beinhaltete hauptsächlich drei Startplasmide, nämlich pIG0100A, pIG0376A und pVC0289A. Das Verfahren ist schematisch in 6, 7 und 8 veranschaulicht.
Der skeletale Küken a-Actin-Promotor und die cDNA des ersten Intron und des hIGF-l wurden aus dem Plasmid pIG0100A gewonnen (R. Schwartz, Baylor College of Medicine). Die hGH-3'-UTR wurde aus dem Plasmid pIG0376A gewonnen (R. Schwartz, Baylor College of Medicine). pIG0100A enthält den skeletalen Küken a-Actin-Promotor und ein erstes Intron, menschliche hIGF-l-cDNA und die untranslatierte skeletale Küken a-Actin 3'-Region sowie die 3'-Flankierungssequenz in pBluescript KS+. pIG0376A enthält den skeletalen Küken a-Actin-Promotor und ein erstes Intron, die hGH-Leadersequenz, die hIGF-I-cDNA und hGH-3'-UTR in pBluescript KS+. Wie oben erwähnt, enthält die Plasmidhauptkette pVC0289A das Kanamyzinresistenz-Gen, den pUC-Ursprung der Replikation und eine Multiklonierungsstelle.
Das zum Hervorbringen von pIG0552B aus pIG0100A, pIG0376A und pVC0289A verwendete Aufbauschema erforderte den Aufbau einiger intermediärer Plasmide. Der erste Schritt bei der Konstruktion von pIG0552B beinhaltete den Transfer der Genexpressionskassetten aus pIG0100A und pIG0376A in pVC0289A, um pIG0335B bzw. pIG0336A hervorzubringen. pIG0335B wurde erzeugt, indem das 3472 Basenpaare (bp) lange NotI/Acc65I-Fragment, das den skeletalen Küken a-Actin-Promotor und das erste Intron, die hIGF-I-cDNA und die von pIG0100A stammende skeletale Küken a-Actin-3'-UTR aufweist, in die NotI/Acc65I-Stellen von pVC0289A ligasiert wurden. pIG0336C wurde erzeugt, indem das 1918 bp NotI/Acc65I-Fragment, das den skeletalen Küken a-Actin-Promotor und das erste Intron, die hGH-Leadersequenz, die menschliche IGF-I-cDNA und die von pIG0376C stammende hGH-3'-UTR enthält, in die NotI/Acc65I-Stellen von pVC0289A ligasiert wurden. pIG0526A wurde konstruiert, indem das 1132 bp BamHI-Fragment, das den skeletalen Küken a-Actin-Promotor und das erste Intron und die hIGF-I-cDNA aus pIG0335B enthält, an das 3397 bp BamHI-Fragment ligasiert wurde, das die hGH-3'-UTR in der kanR-Hauptkette und ein Fragment des skeletalen Küken a-Actin-Promotors enthält. pIG0526A weist einen duplizierten Abschnitt des skeletalen Küken a-Actin-Promotors auf. Um den duplizierten Abschnitt des skeletalen Küken a-Actin-Promotors zu löschen, wurde pIG0526A mit StuI abgebaut und das 4057 bp Fragment, das den skeletalen Küken a-Actin-Promotor und das erste Intron, die hIGF-I-cDNA und die hGH-3'-UTR in der KanR-Hauptkette enthielt, wurde religasiert, wobei pIG0533A entstand.
pIG0533A enthält stromabwärts der hGH-3'-UTR eine menschliche ALU-Repeat-Sequenz. Die menschliche ALU-Repeat-Sequenz in pIG0533A wurde entfernt, um das Plasmid pIG0552B zu erzeugen. Das (mit T4-DNA-Polymerase stumpf abgeschlossene) 395 bp lange EcoO1091/BspEI-Fragment, das den 3'-Abschnitt der hIGF-I-cDNA und der hGH-3'UTR enthält, wobei der ALU-Repeat aus pIG0533A ausgeschlossen war, wurde an das (stumpf abgeschlossene) 3175 bp lange XhoI/BspI-Fragment ligasiert, das die KanR-Hauptkette, den skeletalen Küken a-Actin-Promotor und das erste Intron und den 5'-Abschnitt der hIGF-I-cDNA aus pIG0533A enthält, um das endgültige Plasmid pIG0552B hervorzubringen. Die Entfernung des ALU-Repeats reduziert die Häufigkeit einer Integration des Vektors in ein menschliches Chromosom erheblich. Al lerdings zeigte sich, dass sowohl pIG0552 als auch pIG0533 etwa die gleichen Mengen an abgesonderten IGF-I produzierten.
Die tatsächliche Nukleotidsequenz des Plasmids pIG0552 wurde durch Standardverfahren bestimmt. Die erwartete Nukleotidsequenz wurde auf elektronischem Wege mittels Vektor NT, Version 1.2 (InforMax, Inc., Gaithersburg, MD) aus zuvor ermittelten Sub-Sequenzen erstellt oder aus GenBank wie folgt abgerufen: (1) die Plasmidhauptkette, die ein Derivat von pBluescript (Stratagen) ist, in dem das bla-(Amp^r)-Gen durch das neo-(Kan^r)-Gen aus dem Transposon tn5 (Nukleotide 1–2261) ersetzt wurde; (2) skeletaler a-Actin-Promotor (Nukleotide 2262–2688); (3) skeletale a-Actin 5'-untranslatierte-Region (UTR) und erstes Intron (Nukleotide 2689–2884); (4) die menschliche für IGF-I kodierende Sequenz und ein Abschnitt der hIGF-I 3'-UTR (Nukleotide 2885– 3392); (5) die pBluescript-Multiklonierungsstelle (MCS, Nukleotide 3393–3409) und (6) das menschliche Wachstumshormon 3'-UTR (Nukleotide 3410–3509) und die 3'-Flankierungssequenz (Nukleotide 3510–3600; GenBank-Zugriff #J03071, HUMGHCSA). Die erwarteten und tatsächlichen Nukleotidsequenzen für pIG0552 sind in der untenstehenden Tafel I gegenübergestellt.
Die erste Base der Plasmidhauptkettensequenz ist willkürlich mit Nukleotid #1 bezeichnet. Sequenzübereinstimmungen zwischen den gegenüberliegenden Sequenzen sind durch "I" angezeigt. Ausgewählte Sequenzelemente sind markiert und unterstrichen, um den Bezug anzuzeigen. Obwohl für jede Sequenz lediglich ein Strang dargestellt ist, wurden über 47% (Nukleotide 1884–3599) des pIG0552 mit mehrfachen Auslesungen an beiden Strängen sequenziert. Die Nukleotide 2268 bis 3599 von pIG0552 waren mit der erwarteten Sequenz identisch. Diese Region des Plasmids enthält nahezu die Gesamtheit des skeletalen a-Actin-Promotors und der 5'-UTR, die gesamte für hIGF-I kodierende Sequenz (fettgedruckt), die hGH-3'-UTR und die Flankierungssequenz. Dies bestätigt, dass dieses Plasmid für ein Protein kodiert, dessen primäre Aminosäuresequenz zu derjenigen des nativen menschlichen IGF-I-Proteins passt.
Zwischen den tatsächlichen und den erwarteten Sequenzen in anderen Regionen des Plasmids wurde eine Gesamtzahl von 8 Nukleotidunterschieden (angezeigt durch "*") beobachtet. In der erwarteten Sequenz kommt eine einzige Nukleotiddeletion an Position 21 vor. Diese Position befindet sich eine Base stromabwärts einer Kpn-I-Restriktionsstelle, die die letzte Stelle in dem Rest des pBluescripts MCS ist. Es gibt einen einzigen Nukleotidunterschied an der Position 915 in der erwarteten Sequenz. Diese Position befindet sich in einer nicht kritischen Region des bakteriellen Ursprungs der Replikation. Schließlich sind in der erwarteten Sequenz 6 Nukleotidunterschiede zwischen den Positionen 2262 und 2268 vorhanden. Diese Positionen befinden sich an dem Klonierungsübergang zwischen dem pBluescript MCS und dem 5'-Ende der skeletalen a-Actin-Promotorsequenz. Die Unterschiede in dieser nicht kritischen Region sind sehr wahrscheinlich das Ergebnis von Klonierungsartefakten. Nichts deutet darauf hin, dass irgendeiner der beobachteten Unterschiede die maßgebenden biologischen Eigenschaften von pIG0552 beeinträchtigt.
Tafel I
Plasmid pIG0552 Sequenz

Obere Sequenz: erwartete Sequenz für pIG0552 (Nukleotide 1–3600) (SEQ-ID Nr. 2)
Untere Sequenz: tatsächliche Sequenz für pIG0552 (Nukleotide 1–3599) (SEQ-ID Nr. 3)

Wie oben erwähnt, zeigte eine Analyse der genauen Sequenz von pIG0552, dass gegenüber der resultierenden Sequenz, die basierend auf den Sequenzen der verwendeten Sequenzkomponenten vorherberechnet wurde, eine kleine Zahl von Sequenzänderungen stattgefunden hatten. Es stellte sich heraus, dass diese Änderungen nicht in kritischen Sequenzen aufgetreten waren. Das Vorhandensein derartiger Änderungen bei in hohem Maße funktionellen Vektoren sorgt für eine weitere Bestätigung, dass Vektoren in der Lage sind, unter Verwendung derselben Hauptsequenzelemente vielfältige unterschiedliche Sequenzen einzubauen. Die offenbarte Sequenz ist daher lediglich als Beispiel anzusehen.
Es ist vorteilhaft, anstelle der natürlichen für IGF-I kodierenden Sequenz, synthetische Sequenzen zu nutzen, die für IGF-I kodieren. Solche synthetischen Sequenzen weisen eine von der natürlichen Sequenz abweichende Codonnutzung auf und unterscheiden sich daher in ihren Nukleotidsequenzen sehr von der natürlichen Sequenz. Insbesondere können synthetische Sequenzen verwendet werden, deren Codonnutzung wenigstens teilweise für eine Expression beim Menschen optimiert ist. Die natürlichen Sequenzen verfügen nicht über eine solche optimale Codonnutzung. Vorzugsweise sind im Wesentlichen sämtliche der Codons optimiert.
Eine optimale Codonnutzung bei Menschen ist durch Häufigkeiten der Codonnutzung für in hohem Maße exprimierte menschliche Gene indiziert, wie in 9 gezeigt. Die Codonnutzungstabelle ist dem Programm "Human_High.cod" aus dem Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8.1, der Genetics Computer Group, Madison, WI, entnommen. Die in in hohem Maße exprimierten menschlichen Genen am häufigsten verwendeten Codones sind vermutlich die optimalen Codones für eine Expression in menschlichen Wirtszellen und bilden daher die Basis für die Konstruktion einer synthetischen kodierenden Sequenz.
Allerdings kann es erwünscht sein, anstelle einer Sequenz mit vollkommen optimierter Codonnutzung, eine für IGF-I kodierende Sequenz zu nutzen, die zwar eine optimierte Codonnutzung aufweist, jedoch diese nicht in Bereichen, in denen dieselbe Aminosäure zu nahe beieinander angeordnet ist oder abundant ist, um eine optimal gleichmäßige Codonnutzung zu erreichen.
Darüber hinaus können andere synthetische Sequenzen verwendet werden, bei denen wesentliche Abschnitte der Codonnutzung optimiert sind, beispielsweise mit wenigstens 50%, 70%, 80% oder 90% optimierten Codones. Andere spezielle synthetische Sequenzen für IGF-I können anhand der Codonnutzungstabelle in 9 ausgewählt werden. Eine Sequenz wird ausgewählt, indem für jede der Aminosäuren der Polypeptidsequenzen ein Codon gewählt wird. Für sämtliche Polypeptide können dann jeweils entsprechende DNA-Moleküle durch standardisierte chemische Syntheseverfahren konstruiert werden. Beispielsweise können kürzere Oligonukleotide synthetisiert und anschließend in den geeigneten Verhältnissen ligasiert werden, um die kodierenden Sequenzen in voller Länge aufzubauen.
Eine spezielle bevorzugte für synthetisches IGF-I kodierende Sequenz ist in SEQ-ID Nr. 4 geschaffen.
Zubereitung und Reinigung von IGF-I-Plasmid
A. Zubereitung der Masterzellenbank
Kompetente Zellen wurden mit dem oben beschriebenen IGF-I-Plasmid pIG0552 transfiziert. Die für die Transformation verwendeten Zellen waren MAX Efficiency DH5a^TM Competent Cells (GIBCO BRL/Life Technologies). Das mit den Zellen mitgelieferte Certificate of Analysis (Analyseattest) zeigt, dass diese einen (durch lac-Operondeletion erteilten) Phänotypus Lac^– aufweisen, durch Nitrofurantoin inhibiert sind (zeigt den recA1 Genotypus) und gegenüber Antibiotika empfindlich sind, die gewöhnlich für Plasmidstabilität verwendet werden (Ampicillin, Kanamyzin und Tetracyclin). Der veröffentlichte Genotypus von E. coli DH5a ist F^–∅80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169 endA1 recA1 hsdR17 (r_K ^–m_K ⁺) deoR thi-l supE44 λ^–gyrA96 relA1.
Vor der Entwicklung der Masterzellenbank (MCB) wurden zwei Gruppen von pIG0552-DNA erzeugt (nämlich pIG0552B.16S und pIG0552B.100). Aufgrund der geringen Plasmidausbeuten und langen Fermentationszeit wurde die Klonselektion in die Entwicklung der MCB einbezogen.
Um die Klonselektion zu beginnen, wurden drei Kolonien aus einer frischen Transformationsplatte ausgewählt und als Klone X, Y und Z bezeichnet. Diese Kolonien wurden gleichzeitig auf LB-Kan-Agarplatten streifenförmig ausgebracht und in 50 ml LB-Kan-Flüssig-Medium inokuliert. Als Kontrolle wurden außerdem 20 μl pIG0552B in 50 ml LB-Kan inokuliert; dieses wurde mit Klon B bezeichnet. Die Agarplatten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert, in Parafilm eingewickelt und bei 4°C gelagert. Die flüssigen Kulturen wurden für 17 Stunden bei 37°C und mit 250 U/min geschüttelt und anschließend in einem Eisbad angeordnet.
An jeder der flüssigen Kulturen wurde die Plasmidausbeute gemessen. Spezifische Ausbeuten (in mg/gDCW) betrugen 5,1, < 1, 2,8 und 6,2 für die Klone B, X, Y bzw. Z. An jedem der unverdünnten Zelllysate wurden Ethanolausfällungen durchgeführt.
Klon Z wies verbesserte Ausbeuten auf; daher wurden aus der pIG0552Z-Agarplatte fünf isolierte Kolonien ausgewählt und in einem mit Prallblechen ausgestatteten Fernbach-Kulturröhrchen mit einem Schaum- und Nesseltuchfilter in 500 ml LB-Kan-Flüssig-Medium inokuliert. Die Kultur wurde unter Schütteln bei 37°C und mit 300 U/min für 16 Stunden inkubiert und anschließend zum Abkühlen in einem Eiswasserbad angeordnet. Die optische Dichte der Kultur betrug 3,4. Steriles 5%iges Glycerol wurde auf Eis gekühlt, und es wurden der Kultur 120 ml davon zugefügt. Die Kultur blieb unter Rühren auf dem Eis, während etwa 1 ml davon in vorher etikettierte Kryoampullen abgeführt wurde. Die Phiolen wurden in das auf –20°C eingestellte Tiefkühlgerät verbracht. Am folgenden Tag wurden die Phiolen auf –80°C abgekühlt und anschließend für eine langfristige Lagerung über die anschließende Woche in flüssigen Stickstoff getaucht.
Um die Ausbeute der MCB zu ermitteln, wurde eine Phiole aufgetaut und 50 μL wurden verwendet, um 50 ml von LB-Kan-Flüssig-Medium zu inokulieren. Nach einem Wachstum bei 37°C und mit 250 U/min für 16 Stunden wurde die Kultur auf Plasmidausbeute analysiert. Die spezifische Ausbeute (mg/g DCW) betrug 5,2, was innerhalb der erwarteten Grenzen für Kulturen lag, die von einer Phiole anstelle eine Agarplatte gestartet werden.
B. Grundzubereitung
Die Grundmasse an hIGF-I-Plasmid wird mittels Batch-Fermentation mit Escherichia coli (E. coli, DH5-a) als dem Wirtsorganismus erzeugt. Die Fermentation und die nachfolgenden Recoversprozessschritte sind weiter unten beschrieben. Für die nachstehende Beschreibung wird der Prozess unter Zugrundelegen folgender Vorgaben beschrieben: 1 Liter Nährboden, Dichte (A_600nm) 83, 39,9 g/L Trockenzellengewicht (DCW) und spezifische Ausbeute von Rohplasmid 5 mg/g DCW, gemessen bei der Vorreinigung. Dies sind Näherungswerte; die tatsächlichen Mengen werden abhängig von der Produktivität der Fermentation variieren.
1. In dem Verfahren verwendete Lösungen
Anmerkungen zu Puffern, Medien und Lösungen:

1) Sämtliche Mengen ohne Bereichsangaben sind lediglich Nennwerte.
2) Mengen mit Bereichsangaben sind auf den spezifizierten Bereich beschränkt.
3) Viele Puffer, die Tris-HCl enthalten, sind mit Tris-Base zubereitet, wobei HCl zur pH-Wert-Einstellung verwendet wird.

₄

₂

₄

₂

₄

₂

₄

₂

₄

₃

₂

₄

2. Fermentationsprozess und Isolierung
Medienzubereitung. Das Medium für den Ansatzschritt wird in vorsterilisierten Pyrexbehältern in Mengen von etwa 2 Litern zubereitet und mittels Dampf sterilisiert. Das Antibiotikum wird dann nach einer Filterung durch einen vorsterilisierten 0,2 Mikrometer-Filter hinzugefügt. Dieses sterile Anzuchtmedium wird bis zu seiner Verwendung bei 4°C gelagert. Das Fermentationsmedium wird unmittelbar vor dem Gebrauch zubereitet. Das Hauptkulturmedium wird in situ sterilisiert und dem Fermenter wird mit 0,2 Mikrometer sterilfiltriertes Antibiotikum mittels einer aseptischen Übertragung hinzugefügt.
Fermentationsprozess. Der Prozess wird mit einer Anzuchtphiole aus der Masterzellenbank (MCB) begonnen. Der auf zwei Stufen basierende Anzuchtsprozess beginnt mit dem Schritt der Herstellung einer Anzucht unter einer biologischen Sicherheitshaube. 10–25 ml steriles Anzuchtmedium wird aseptisch in einen vorsterilisierten Glaskolben zugefügt. Sterilfiltrierte antibiotische Lösung wird der geeigneten endgültigen Konzentration hinzugefügt (20–100 μg/ml). Die Kultur wird anschließend mit ≥ 200 μL bakterieller Kultur aus der MCB-Phiole inokuliert. Der Glaskolben wird zugedeckt und in eine Inkubierungsschüttler angeordnet. Die Anzucht wird bei 37°C unter Schütteln mit etwa 250 U/min für zwei bis sechs Stunden inkubiert, um die Impfkultur für die nächste Stufe zu entwickeln. Die nächste Anzuchtstufe weist dieselbe Antibiotikakonzentration und ein Volumen von 1–10% für den Fermentationsschritt verwendeten Volumens auf und wird in ähnlicher Weise für zwei bis acht Stunden inkubiert.
Das Fermentationsmedium enthält 25–100 μg/ml sterilfiltriertes Antibiotikum, das, um einen Plasmidverlust zu vermeiden, nach einer Sterilisation des Mediums aseptisch hinzugefügt wird.
Die Fermentation beginnt, wenn die aus der Anzucht stammende Impfkultur aseptisch in den Fermenter überführt ist. Die Fermentation wird während des Verfahrens mit bis zu 100 μg/ml Antibiotikum ergänzt, um den selektiven Druck während des Ansteigens der Zelldichte aufrecht zu erhalten. Die Fermentation dauert an, bis ein Anstieg von gelöste Sauerstoff eine Nährmittelverarmung anzeigt, ein Zeitpunkt bei dem das Schütteln vermindert wird und die Kultur abgekühlt wird. Nachdem die Temperatur auf unter 15°C gefallen ist, werden Isolierungsschritte initiiert. Nach der Fermentation wird der Kultur eine Probe für eine grobe Analyse der Plasmidausbeute entnommen, die verwendet wird, um auf spätere in dem Verfahren angewandte Reinigungsschritte vorzubereiten.
Isolierung: Die Fermentationskultur wird zentrifugiert. Das Bakterienzellenpellet wird aus dem (den) Schleuderbecher(n) geschabt und zur Resuspension und zum Mischen in vorsterilisierte 450-ml-Polypropylenflaschen oder wieder abdichtbare Polyethylenbeutel überführt. Die Zellen werden einmal mit einem gleichen Volumen an Waschpuffer gespült, nochmals zentrifugiert und entweder für nicht mehr als 24 Stunden bei 2° bis 8°C gelagert oder bis zum Zeitpunkt der Verwendung bei –20°C gelagert.
D. Reinigung
Vorreinigung: Die Zellen werden vorsichtig mit dem gleichen Puffer resuspendiert, der für das Spülen von Zellen verwendet wird, und zwar mit einer Menge, die für ein Gesamtvolumen von etwa 7–12 ml/g Nasszellengewicht (WCW) ausreicht. Nochmals suspendierte Zellen werden vorsichtig in eine größere Flasche oder ein Gefäß überführt, und es werden etwa 7–12 ml Lyselösung pro Gramm (WCW) Ausgangszellen hinzugefügt, um Zellen aufzubrechen und Zellprotein und Chromosomen-DNA zu denaturieren. Nach dem Hinzufügen der Lyselösung wird der Inhalt vorsichtig gemischt und für etwa fünf Minuten bei Raumtemperatur (20–25°C) gehalten. Etwa 11–19 ml/g WCW eiskalte Neutralisierungslösung wird hinzugefügt, wobei der pH-Wert reduziert wird und zelluläre Nucleinsäuren, Protein und chaotropea Agens aus dem Lysepuffer ausfällen. Die sich ergebende Suspension wird aufrecht erhalten, während sie mindestens 1/2 Stunde gekühlt wird.
Die für diese und andere Schritte zubereiteten Puffer und Lösungen werden mit 0,2 Mikrometer gefiltert und entweder in vorsterilisierten Pyrexflaschen oder in sterilen und endotoxinfreien Einmalbeuteln gelagert. Das verwendete Wasser ist steriles Wasser zur Wässerung (WFI).
Die Trennung von Feststoff und Flüssigkeit wird zunächst durch Zentrifugieren durchgeführt. Das Zentrifugieren wird bei einer Temperatur von 0–8°C durchgeführt. Der Überstand, der feine Kolloidpartikel enthält, wird mit 0,3 Mikrometer gefiltert, um die übrige Fällung zu entfernen, womit die Trennung von festen und flüssigen Stoffen zu Ende geführt ist. Der verwendete endgültige Behälter wird vorsterilisiert, nochmals mit 0,5 N Natriumhydroxid gespült und anschließend dreifache mit WFI gespült. Dieselbe Behandlung wird mit Ausnahme der für reine Massenlagerung verwendeten Behälter nach diesem Punkt auf sämtliche verwendeten Produktbehälter und Transferschläuche angewandt.
RNaseA-Stammlösung in 100 × Konzentration wird bei –20°C gelagert. Nach einem Äquilibrieren des gefilterten alkalischen Lysepools auf Raumtemperatur und Hinzufügen von 0,01 v/v RNase-Stammlösung wird RNA abgebaut. Die Lösung wird mindestens sechzig Minuten bei einer Temperatur von 30–45°C inkubiert. Die sich ergebende Lösung wird sofort chromatographisch verarbeitet oder über Nacht bei 2 bis 8°C in sterilisierten Pyrexbehältern gehalten.
Reinigung: Das Material wird vor der Chromatographie durch einen Filter von 0,2 Mikrometer gefiltert. Der Plasmid, andere zelluläre Nucleinsäuren und Protein enthaltende Überstand wird mit zwei Volumina von WFI dreifach verdünnt.
In dem Q-Anionenaustauschschritt wird das Harz (Pharmacia Q hoher Leistung) für 30–35 Minuten in der Säule als eine Vorsorgemaßnahme mit 1 N NaOH behandelt. Die Säule wird mit etwa 5 Säulenvolumen (CV) Q- und DEAE-Aufbereitungspuffer konditioniert, anschließend mit etwa 5 CV Q-Äquilibrierungspuffer äquilibriert (das Volumen kann geringer sein, solange es hinsichtlich des pH-Werts und der elektrischen Leitfähigkeit angemessen erscheint). Die Säuleneinspeisungsrate ist für sämtliche Schritte eine lineare Geschwindigkeit von etwa 155 cm/h. Die verdünnte Einspeisung wird maximal bis auf ein mg Rohplasmid pro ml Harz geladen. Nach dem Beladen wird die Säule für ein zusätzliches CV mit Q-Waschpuffer gewaschen, nachdem der Säulendetektor anzeigt, dass sich der Ausstoß der Grundlinie weitgehend genähert hat. Das Produkt wird mit etwa 5 CV von Eluierungspuffer ausgewaschen, wobei der tatsächliche Spitzenwert auf dem Chromatogramm anzeigt, wann das Ansammeln von Eluat beginnt und endet. Die Säule wird mit etwa 5 CV jeder der drei Q-Regenerationslösungen regeneriert. Das Harz wird nach einem Pumpen von 5–10 CV von 0,01 N NaOH durch die Säule bis zur nächsten Verwendung in der Säule gelagert oder nochmals dem Zyklus unterworfen. Das Q-Eluat kann bei 2 bis 8°C gelagert werden.
Die RNA wird mittels einer groben Plasmidanalyse getestet. Falls das Verhältnis des vorderen RNA enthaltenden Spitzenwerts zu den die zweiten Produkte enthaltenden Spitzenwert oberhalb einer vorher festgesetzten Grenze liegt, wird eine alternative alkalische Hydrolyse- und Neutralisierungsprozedur durchgeführt. Anschließend wird dem Q-Eluat unter sanftem Mischen 0,1 N NaOH langsam hinzugefügt, um einen endgültigen pH-Wert von 11,2–11,3 zu erreichen. Der pH-Wert einer Probe der behandelten Lösung wird gemessen und protokolliert. Die Lösung wird für etwa zehn Minuten bei einer Temperatur von 20–25°C gehalten. Anschließend wird allmählich unter sanftem Mischen 0,1 N HCl hinzugefügt, um die Lösung zu neutralisieren; der Raster-pH-Wert (zwischen 7,5–8,0) wird gemessen und protokolliert.
Der Pool wird etwa zweifach mit WFI verdünnt, um eine geeignete Salzkonzentration für den zweiten Reinigungsschritt zu erhalten. Als Vorsorgemaßnahme wird das Harz (Tosohaas DEAF 6505) in dem DEAE-Anionenaustauschschritt für 30–35 Minuten in der Säule mit 0,1 N NaOH behandelt. Die Säule wird mit etwa 5 CV von Q- und DEAE-Aufbereitungspuffer konditioniert, anschließend mit etwa 5 CV Volumina von DEAE-Äquilibrierungspuffer äquilibriert. Die Säulenströmungsrate ist für sämtliche Schritte eine lineare Geschwindigkeit von etwa 155 cm/h. Die Beladung wird auf ein Maximum von 0,7 mg Rohplasmid pro ml Harz gefahren. Nach dem Beladen wird die Säule für eine zusätzliche CV mit DEAE-Waschpuffer gewaschen, nachdem der Säulendetektor an zeigt, dass sich der Ausstoß weitgehend der Grundlinie genähert hat. Die Elution findet mit etwa 5 CV von DEAE-Elutionspuffer statt, wobei der Anfang und das Ende der Spitzensammlung anhand des Chromatogramms ermittelt wird. Die Säule wird mit etwa 5 CV jeder der drei Regenerationslösungen regeneriert. Das Harz wird nach einem Pumpen von 5–10 CV von 0,01 N NaOH durch die Säule bis zur nächsten Verwendung gelagert oder nochmals dem Zyklus unterworfen. Das DEAE-Eluat wird bei 2 bis 8°C gelagert.
Das DEAE-Eluat wird mit hydrophober wechselwirkender Chromatographie-(HIC)-Aufbereitungslösung zweifach verdünnt. Das HIC-Harz (Tosohaas Phenyl 6505) wird in der Säule als Vorsorgemaßnahme für 30–35 Minuten mit 0,1 N NaOH behandelt. Die Säule wird mit etwa 5 CV HIC von Äquilibrierungspuffer äquilibriert. Die Säuleneinspeisungsrate ist für sämtliche Schritte eine lineare Geschwindigkeit von etwa 75 cm/h. Die Beladung wird beladen auf ein Maximum von 0,5 mg Rohplasmid pro ml Harz gebracht und der Durchfluss wird gesammelt. Nach dem Beladen wird die Säule, nachdem der Detektor anzeigt, dass sich das Chromatogramm nahe der Grundlinie befindet, mit einem CV von HIC-Äquilibrierungspuffer gewaschen; das Spülwasser wird zusammen mit dem Durchfluss gesammelt. Die Säule wird mit etwa 5–10 CV jeder der drei Regenerationslösungen regeneriert. Das Harz wird nochmals dem Zyklus unterworfen oder nach einem Pumpen von 5–10 CV von 20% (v/v) Ethanol durch die Säule bis zur nächsten Verwendung gelagert. Das HIC-Eluat wird bei 2–8°C gelagert.
Alternativ kann der Reinigungsprozess wie in der US-Patentanmeldung 60/022 157 beschrieben durchgeführt werden.
Myogene Zellkulturen
Entsprechend dem aus dem Stand der Technik beschriebenen Protokoll wurden aus Brustmuskel weißer Leghorn-Kückenembryos von Tag 11 primäre Kükenmyoblastkulturen entwickelt. Grichnik et al., Nucleic Acids Research 14: 1683–1701 (1986). Angereicherte Myoblasten wurden mit einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen pro 60 mm kollagenisierter Gewebekulturschale beschichtet.
Einen Tag vor der Transfektion wurden Subkulturen myogener Säuger-C₂C₁₂- und Sol-8-Zellen (1 × 10⁵) auf 60-mm-Schalen angelegt.
DNA-Transfer
Die Gewebekulturzellen wurden mit Plasmid-DNA mittels des aus dem Stand der Technik bekannten Calciumphosphatausfällungs-Glycerolschockprotokolls transfiziert. Wigler et al., Cell 14: 725–731 (1978). Eine Gesamtmenge von 10 μg DNA wurde verwendet, um die Gewebekulturzellen jeder 60-mm-Schale zu transfizieren. Die Transfektionen wurden vierfach und mit drei unterschiedlichen MVSCAT-MLC-Plasmidpräparationen ausgeführt, um Unterschiede in der DNA-Qualität und Beschichtungsdichte von Zellen auszugleichen.
CAT-Versuch
Nach der Transfektion von zwei Populationen von Zellen, wurden gleichzeitig mit der Reduplikation Myoblasten und nach Verschmelzung entstandene Myotuben geerntet und wie aus dem Stand der Technik beschrieben auf CAT-Aktivität getestet. Gorman et al., Molec. Cell. Biol. 2: 1044–1051 (1982). Die Zellpellets wurden durch wiederholte Einfrier-Auftau-Zyklen in 50 μl von 250 mM Tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,5 lysiert. Die Produktion von acetyliertem [¹⁴C] Chloramphenikol (0,5 μCi pro Versuch, 57,8 mCi/mMol) wurde für 90 Minuten bei 37°C getestet. Acetyliertes Chloramphenikol wurde nach einer Dünnschichtchromatographie auf Silikagelplatten mittels Autoradiographie beobachtet. Getrennt acetylierte Chloramphenikoleinfärbungen wurden durch Scannen auf einem Betagen-Phosphoimagerschirm quantitativ bestimmt. Die Daten wurden als Prozentsatz von umgewandeltem [¹⁴C] Chloramphenikol pro μg Zellprotein wiedergegeben. Die Proteinkonzentration von Zellextrakten wurde zu jedem Zeitpunkt durch das Verfahren von Bradford, Anal. Biochem. 72: 254–258 (1976)) bestimmt, um die Einheitlichkeit in den Tests zu gewährleisten.
Spleißen von IGF-I-Konstrukten
Wie oben beschrieben, wurde das pIG0100-Konstrukt so geklont, dass er den skeletalen Küken Actin-Promotor und Intron (einschließlich der 5'- und 3'-Spleißstellen), das menschliche 48 Aminosäuren lange IGF-I-Signalpeptid, das 70 Aminosäuren lange reife Protein und das E-Peptid enthielt. Die aus diesem Expressionssystem erzeugte RNA benutzt nicht die Actin 3'-Spleißstelle, sondern spleißt an einer Stelle in der Peptidsequenz des IGF-I-Signals. Das Spleißen wurde durch Sequenzieren von RT-PCR-Produkten bestätigt. Es wird angenommen, dass das sich ergebende Polypeptid eine 25 Aminosäuren lange Signalsequenz aufweist, eine Form, die natürlich in Muskel- und vielen anderen Geweben vorkommt. Adamo et al., 1994, Adv: Exp. Med. Biol. 343: 1–11.
Das pIG0552-Konstrukt enthält die gleichen stromaufwärts gelegenen Sequenzen wie das pIG0100-Konstrukt, jedoch anstelle der skeletalen Küken a-Actin-3'-UTR, die 3'-UTR des menschlichen Wachstumshormons. Es wird angenommen, dass das Spleißen des pIG0552-Produkts identisch ist mit jenem im Falle des pIG0100-Produkts. Durch Agarose-Gelanalyse von RT-PCR-Produkten wurde bestätigt, dass die Produkte beider Konstrukte in der Größe übereinstimmen.
Aktivität von Expressionsvektorkonstrukten
Um die Wirksamkeit von hybriden Actin-Promotor/Gen-IGFI-Genen in myogenen Zellen von Mäusen zu ermitteln, wurde der Expressionsvektor erforscht, indem diese Gene im Hintergrund von Säuger-C₂C₁₂-Myoblasten durch die Produktion einer Population stabiler transfizierter C₂C₁₂-Myoblasten verwendet wurden. Die veränderten IGF-I-Expressionsspiegel wurden unmittelbar in diesen stabilen Myoblastzelllinien ausgewertet. Jede der in 3 gezeigten IGF-I-Konstruktionen wurde mit dem medikamentös selektierbaren Vektor EMSV-Hygromyzin in Maus-C₂C₁₂-Zellen co-transfiziert. Nach zwei Wochen Selektion wurde eine Population von stabilen Myoblasten ausgewählt. Eine Population von C₂C₁₂ Myoblasten, die lediglich mit EMSV-Hygromyzin stabil transfiziert wurden, dienten als Kontrollgruppen. Eine visuelle Untersuchung der transfizierten Myoblasten ermöglichte einige Einblicke in die Rolle von IGF-I bei der Differenzierung von Muskelzellen, die in transgenen Mäuse nicht offensichtlich wäre. Im Allgemeinen bewirkten sämtliche der myogenen Zelllinien, die IGF-I-Gene enthielten, dass Myoblasten in einem Wachstumssubstrat (10% fötales Kalbserum) extensiver als die Kontrollgruppen replizierten. Ein Auswechseln des Kultursubstrat mit 2% Pferdeserum initiiert den Differenzie rungsprozess. Während des Vorgangs fusionieren Kontroll-C₂C₁₂-Myoblasten, um über einen Zeitraum von vier Tagen mit Multi-Kernen ausgestattete Myotuben zu bilden. Bei derselben Zellendichte pro Kulturschale verschmolzen Myoblasten, die SK733IGF-I, SK202IGF-I-SK, SK733IGF-I-SK1 und SK733IGF-I-SK2 enthielten mindestens zwei bis drei Tage früher als C₂C₁₂- oder EMSV-Hygromyzin-Kontrollmyoblasten.
Um die dauerhafte Anhäufung von IGF-I-MRNA in C₂C₁₂-Myoblasten zu erforschen, wurden gleiche Mengen von gesamter zellulärer RNA von stabil transfizierten C₂C₁₂-Myoblasten isoliert, die in einem Wachstumssubstrat ("G") oder Differenzierungssubstrat ("D") gezüchtet wurden. Die RNA wurde mittels Elektrophorese auf denaturierenden Agarose-Gelen getrennt, auf Nylonfilter übertragen und mittels Standard-Hybridisierungstechniken mit einheitlich ³²p^–markierter menschlicher IGF-I-cDNA voller Länge getestet. Die Intensität des autoradiographischen Signals auf Röntgenfilm stellt eine Bezugsgröße für die mRNA-Akkumulation, den Gesamtindex kombinierter Transkriptionsaktivität und die mRNA-Stabilität der Expressionsvektoren bereit. Die IGF-I-mRNA in dem Vektor SK202IGF-I-3'SVa akkumulierte in Myotuben nicht oberhalb von Myoblastspiegeln. Dies stellt eine typische Expressionsaktivität dar. Der SK733IGF-I-Vektor enthält die IGF-I-3'UTR. Die IGF-I-mRNA aus diesem Vektor akkumulierte in Myotuben, allerdings mit Spiegeln, die wesentlich niedriger sind als im Falle von SK202IGF-I-SK oder SK733IGFI-SK2. Diese zuletzt erwähnten beiden Vektoren enthalten die skeletale Actin 3'UTR und 3'NCR. Da der Hauptunterschied dieser Vektoren die 3'UTR ist, führt die aufgrund der skeletalen 3'UTR erhöhte Stabilisierung der RNA-Transkripte zu einer Differenz des RNA-Gehalts um ein Hundertfaches.
In einem ähnlichen Versuch wurde IGF-I auch aus pIG0552 in C₂C₁₂Zellen mit hohen Spiegeln erzeugt.
Messung von anhand von IGF-I-Genlieferung durch den Expressionsvektor abgesonderten Spiegeln von IGF-I
Um den Anteil an IGF-I zu erfassen, der in dem Medium synthetisiert und abgesondert wurde, wurden differenzierte Myotubuskulturen in Minimalmedien (DMEM und 0,05% Rinderserumalbumin, RIA-Klasse) gezüchtet. SK733IGF-I-SK2 ist die wirkungsvollste Konstruktion zum Exprimieren des IGF-I in Muskelzellen. IGF-I wurde sowohl durch Radioimmunoassays von Gewebekulturmedien als auch durch Immunoperoxidase-Anfärbung von Zellen getestet. Es ließen sich erhöhte Spiegel von IGF-I während des Verschmelzens einiger Muskelkulturen nachweisen. Der Vergleich von Spiegeln unterschiedlicher Expressionsvektoren ist Tafel II zu entnehmen. In Kontrollkulturen lag der Spiegel von IGF-I im Bereich von 0,2–0,5 ng/ml. Im Vergleich weist der Vektor SK733IGF-I-SK2 (pIG0100A oder pIG0335) Spiegel von IGF-I auf, die mindestens einhundertmal höher sind. Tafel II IGF-I-Spiegel in stabil transfizierten C₂C₁₂-Myoblasten

Konstruktion IGF-I (ng/ml Medien/4 Tage)

SK202IGF-I-3'SVa 4,4

SK733IGF-I 3,8

SK733IGF-I-SK2 79,0

Kontroll-C₂C₁₂ 0,5
In ähnlicher Weise wies eine Immunoperoxidase-Einfär bung von myogenen Kulturen in stabilen transfizierten Myoblasten die erhöhte Produktion von immunologischen reaktiven IGF-I auf, jedoch nicht in den der Kontrolle dienenden mit EMSV-Hygromyzin transfizierten Myoblasten oder in Perfusion-C₂C₁₂-Zellen. Antikörper gegen die A- und D-Regionen wurden in Verdünnungen von 1 : 1000 verwendet. Sämtliche der transfizierten Linien, die SK202IGF-I enthielten, wurden positiv immunoperoxidasegefärbt. Somit ist es offensichtlich, dass verbesserte Spiegel an IGF-I synthetisiert und aus den stabilen Myoblasten exportiert werden.
Insertion von Expressionsvektoren in transgene Mäuse
Transgene Mäuse, die hIGF-I enthaltende Vektoren tragen, wurden durch Standardinjektion von Oozyten erzeugt (Brinster, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438–4442 (1958)) und gezüchtet, um eine stabile Übertragung von Transgenen auf nachfolgende Generationen nachzuweisen. Die Transgene wurden durch Polymerasekettenreaktion oder Southern-Genom-DNA-Blottinganalyse anhand von DNA identifiziert, deren Enden gekappt waren. Die Transgene wurden durch RNA-Blotten der aus einigen Geweben isolierten Gesamt-RNA auf muskelspezifische Expression des übertragenen IGF-I-Vektors getestet. Unabhängige transgene Mauslinien 5484, 5496, 5832, 5834 wurden mit SK202IGF-I-3'SVa erzeugt, die das SV40 3'-Intron und die Poly-A Additionssequenz enthielten. Es stellte sich heraus, dass Mäuse dieser Stämme hauptsächlich in Herzgewebe schwache Expression aufwiesen, jedoch wurden sehr geringe Spiegel in Skelettmuskel- und nicht myogenen Geweben, wie in Niere und Gehirn, gefunden. Mit SK733IGF-I-3'SK2 (pIG0100A oder pIG0335) erzeugte unabhängige transgene Mauslinien 3357, 3359. Bei Mäusen dieser Stämme stellten sich erhöhte Ex pressionsspiegel von IGF-I heraus. Diese Spiegel sind mit der a-Actin-Gen-Aktivität endogener Mäuse vergleichbar. Diese von SK733IGF-I-3'SK2 (pIG0100A oder pIG0335) stammenden Spiegel zeigen wenigstens 100–1000fach größere Anhäufung von IGF-I-mRNA im Vergleich zu den durch den SK202IGF-I-3'SVa-Vektor erzeugten werten. Das Hinzufügen der skeletalen a-Actin-3'UTR und 3'-Flankierungsregion ermöglichten eher in Skelettmuskeln als in kardialen Muskeln eine bevorzugte Steigerung der IGF-I-RNA. Dementsprechend fördern die 3'UTR und 3'-NCR von skeletalem a-Actin die muskelspezifische Genexpression.
Mäuse dieser Stämme zeigten eine vermehrte Muskelmasse und reduzierte Prozentsätze an Körperfett gegenüber den Elterntypen. Die Verwendung von menschlichem IGF-I in der Maus zeigte die artenübergreifende Einsatzfähigkeit dieses speziellen Gens.
Darüber hinaus wird der IGF-I durch ein Bereitstellen zusammenhängender 3'-NCR gegen äußere genomische Sequenzen gepuffert und ist auf diese Weise während des Einbaus in das Genom besser vor Positionseffekten geschützt. Außerdem verhindern die zusätzlichen regulatorischen Sequenzen, die die transkriptorische Domäne von skeletalem a-Actin markieren, durch Bereitstellen von natürlichen Endsequenzen eine Durchlesetranskription und verbessern die Gewebespezifität, die Zeitsteuerung der Entwicklung und die Transkriptionsaktivität. Die Anwesenheit einer 3'NCR-Sequenz ermöglicht es, dass eine einzige Kopie des integrierten Vektors 40–50% der Transkriptionsaktivität der endogenen Sequenzen hervorbringt.
Somatischer Gentransfer an Skelettmuskel in vivo
Um den Nachweis einer Wirkung der für IGF-I kodierenden Vektoren zu führen, wie sie in der Gentherapie in vivo verwendet werden, wurden für den Exprimierungszweck der Expression eines speziellen Polypeptids Vektoren in ausgereiften Muskel injiziert. In diesen Studien wurde der mit Wachstumshormon unterversorgte Mäusestamm, "klein" verwendet. Der Vektor SK733IGF-I-SK2 (pIG0100A oder pIG0335) oder der Kontrollvektor SKSK wurde durch Niederschlag pelletiert, unter Vakuum getrocknet und in den Quadrizepsmuskel von 2 Sätzen von 6 kleinwüchsigen Mäusen punktiert (20 μg/Pellet – 3 Pellets/Muskel). Der gesamte Muskel jedes der Tiere, die eine Inokulation erhalten hatten, wurde 2 Wochen nach Einführung der DNA entfernt und auf IGF-I-Protein in dem Gewebe getestet. Die Menge an IGF-I in jedem Gewebe wurde durch mittels eines radioisotopischen Versuchs getestet. Für Mäuse, die den Vektor SK733IGF1-3'SK enthielten, wurde eine geringe, jedoch signifikante (p > 0,05) Steigerung der IGF-I-Expression von 4,2 ng auf 6,9 ng IGF-I/100 μg Gesamtprotein von Muskelllysat gegenüber Mäusen beobachtet, die lediglich den Vektor (keinen IGF-I) aufwiesen (siehe Tafel III).
TAFEL III IGF-I Spiegel in Geweben von mit IGF-I Vektor injizierten kleinen MÄUSEN
Intramuskuläre Injektionen eines myogenen IGF-I enthaltenden Vektors in diabetische Ratten
Die Wirkung von intramuskulären Injektionen eines muskelspezifischen DNA-Vektors wurde untersucht, der den menschlichen insulinähnlichen Wachstumsfaktor-I ("IGF-I") trägt, und zwar auf durch Diabetes induzierte Änderungen der Körper- und Muskelgewichte, auf Plasmaglucosespiegel und auf mRNA-Spiegel, die auf den injizierten IGF-I-Vektor zurückzuführen waren. Für diese Arbeit wurde ein IGF-I exprimierender Vektor gewählt, da es sich zeigte, dass Injektionen von rekombinantem IGF-I bei einer Anzahl von Kachexie-Modellen anabolische Wirkungen aufwiesen.
Der Diabetes wurde in männliche Sprague-Dawley-Ratten (175200 g) mit intravenösen Injektionen von Streptozotocin (STZ; 55 mg/kg) induziert, das in Natriumcitratpuffer (0,05 M, pH-Wert 4,5) aufgelöst war. Nicht diabetische Kontrolltiere wurden nach Alter, Gewicht und Geschlecht zusammengestellt und empfingen gleiche Volumeninjektionen der Trägersubstanz. Die Diabetes wurde durch das Auftreten von Hyperglykämie, Glukosurie und einer reduzierten Wachstumsrate bestätigt. Drei Tage nach einer Verabreichung von STZ wurden nicht auf Fasten gesetzte Tiere mit Pentobarbital (50 mg/kg) anästhetisiert und Blutproben wurden mittels Kardialpunktion gewonnen. Blut wurde in EDTA enthaltende Röhrchen überführt, mit 3000 × g für 15 Minuten zentrifugiert und bei –70°C gelagert. Zu den Gastrocnemius wurde beidseitig injiziert, mit einer anschließenden direkten Aufdeckung des Muskels durch eine kutane Inzision. In den rechten Gastrocnemiusmuskel einzelner Ratten wurde 0, 50, 200 oder 800 μg des IGF-I-Vektors in 200 μl isotonischer physiologischer Kochsalzlösung injiziert. Der kontralaterale (linke) Gastrocnemius erhielt Injektionen von 200 μl einer isotonischen physiologischen Kochsalzlösung. Der in diesen Versuchsreihen verwendete IGF-I-Vektor war Sk-733-IGF-I-Sk2, wie er oben beschrieben ist. Sechs Tage nach der intramuskulären Injektion von muskelspezifischem Vektor wurde den Tieren (12–16 h) Nahrung entzogen, gefolgt von einer Euthanasie durch Dekapitation. Das Blut wurde anschließend gesammelt und der gesamte Gastrocnemiusmuskel wurde entfernt (Dissektion von Sehne zu Sehne).
Für die Analyse von Vektorwirkungen auf Körper- und Muskelgewicht wurden basierend auf dem Körpergewicht vor der Vektorinjektion Dosierungsgruppen vergleichend zusammengestellt und es wurden lediglich diabetische Tiere in die Analyse einbezogen. Das Plasmaglucosekriterium für eine Einbeziehung in die Analyse war ein Nicht-Nüchtern-Plasmaglucosespiegel von mehr als 300 mg/100 ml. Körpergewichte vor einer Vektorinjektion wurden angeglichen indem lediglich Tiere mit einem Körpergewicht zwischen 175–195 g einbezogen wurden. Für die Analyse von Vektorwirkungen auf Plasmaglucosespiegel wurden die Gruppen basierend auf deren Plasmaglukosespiegel vor der Vektorinjektion verglichen.
Intramuskuläre Injektionen von IGF-I-Vektor führen zu einem erhöhten Körpergewicht (Mittelwert ± SD; Lediglich Trägersubstanz = 181,37 ± 6,17; 50 μg = 193,43 ± 5,71; 200 μg = 186,6 ± 8,01; 800 μg = 191,14 ± 7,54). Diese Steigerung des Körpergewichts ist statistisch signifikant bei dem Dosisspiegel von 50 und 800 μg, jedoch nicht bei dem Dosisspiegel 200 μg, (a priori t-Test: Kontrollgruppe gegenüber 50 μg, t = 3,57, df = 12; Kontrollgruppe gegenüber 200 μg, t = 1,17, df 10; Kontrollgruppe gegenüber 800 μg, t = 2,29, df = 12).
Neben einer Erhöhung des Körpergewichts steigern IGF-I-Vektorinjektionen auch das Gewicht des mit Vektor injizierten Gastrocnemius (Mittelwert ± SD; Lediglich Trägersubstanz = 1,00 ± 0,08; 50 μg 1,10 ± 0,07; 200 μg = 1,07 ± 0,03; 800 μg = 1,09' ± 0,05). Diese Gewichtssteigerung des mit Vektor injizierten Gastrocnemius ist statistisch signifikant bei dem Dosisspiegel 50 und 800 μg jedoch nicht bei dem Dosisspiegel 200 μg, (a priori t-Test: Kontrollgruppe gegenüber 50 μg, t = 2,32, df = 12; Kontrollgruppe gegenüber 200 μg, t = 1,75, df 10; Kontrollgruppe gegenüber 800 μg, t = 2,32, df = 12). Das Gewicht des kontralateralen Gastrocnemius war ebenfalls höher, jedoch erreichte diese Steigerung keine statistische Signifikanz (Mittelwert ± SD; Lediglich Trägersubstanz = 1,00 ± 0,07; 50 μg = 1,07 ± 0,06; 200 μg = 1,05 ± 0,01; 800 μg = 1,08 ± 0,06; a priori t-Test: Kontrollgruppe gegenüber 50 μg, t = 1,72, df = 12; Kontrollgruppe gegenüber 200 μg, t = 1,43, df 10; Kontrollgruppe gegenüber-800 μg, t = 2,11, df = 12).
Der Expressionsspiegel des injizierten IGF-I-Konstrukts wurde bestimmt, indem der Spiegel der für IGF-I-spezifischen mRNA ermittelt wurde. Aus dem injizierten und dem Kontroll-, d. h. kontralateralen, Gastrocnemius isolierte Gesamt-RNA der Zellen wurde mit DNAase behandelt und mittels Oligo-dT als einem Primer einer umgekehrten Transkription unterworfen, um cDNA-Repliken von mRNA zu erzeugen. Die cDNA wurde anschließend in einer Polymerasekettenreaktion mit IGF-I-spezifischen Primern umgesetzt, um den Expressionsspiegel von mRNA in der ursprünglichen Muskelprobe abzuschätzen. Die Bänder, die Produkten entsprachen, die durch für IGF-I spezifische Primer amplifiziert wurden, wurden erfasst. Die Daten lassen erkennen, dass das IGF-I-Vektor-IGF-I-Konstrukt mit signifikanten Spiegeln in dem injizierten Muskel exprimiert wird. Die Muskel der Kontrollgruppen wiesen keine Expression von menschlichem IGF-I auf.
Gegenüber der Kontrollgruppe waren Nüchtern-Plasmaglukosespiegel in der Dosisgruppe von 50 μg IGF-I-Vektor erheblich niedriger (Mittelwert ± SD; Lediglich Trägersubstanz = 277,14 ± 113,65; 50 μg = 155,42 ± 37,54; 200 μg = 224,06 ± 89,21; 800 μg = 216,57 ± 100,55 mg/100 ml). (a priori t-Test Kontrollgruppe gegenüber 50 μg, t = 3,23, df = 12; Kontrollgruppe gegenüber 200 μg, t = 1,04, df 17; Kontrollgruppe gegenüber 800 μg, t = 1,09, df = 16).
Diese Befunde machen deutlich, dass intramuskuläre Injektionen von IGF-I-Vektor (SK-7331-IGF-I-SK2) diabetische Hyperglykämie reduzieren und das Körper- und Muskelgewicht steigern, was annehmen lässt, dass die IGF-I-Expressionsspiegel ausreichen, um eine anabolische Wirkung auszulösen. Die Erkenntnis, dass der mit Vektor injizierte Gastrocnemius erheblich an Gewicht zunimmt, der kontralaterale jedoch nicht, lässt auf eine Differenz in der örtlichen IGF-I-Konzentration in den beiden Muskeln schließen.
Auswirkung eines Austausches der hGH-3'-UTR gegen die skeletale Actin-3'-UTR in skeletalen Actin – IGF-I-Transgenen auf zirkulierende Konzentrationen von hIGF-I in transgenen Mäusen
Es wurden transgene Mäuse erzeugt, die die in 15 beschriebenen skeletalen Actin-IGF-I-Transgene aufweisen. Serumproben wurden gewonnen und auf hIGF-I getestet. Die Ergebnisse (Tafel IV) zeigen deutlich, dass Transgene, die die hGH-3'-UTR enthalten, im Kreislauf erhöhte Konzentrationen von hIGF-I hervorrufen gegenüber Transgenen, die die skeletale Actin-3'-UTR enthalten. Andere Variablen, wie die Anwesenheit/Abwesenheit oder der Ursprung des Intron und der Ursprung der 5'-UTR scheinen geringe oder überhaupt keine Wirkung zu haben.
Tafel IV Konzentrationen von menschlichem IGF-I in Serum von Mäusen, die skeletale Actin – IGF-I Transgene tragen
Wie aus den Daten in der Tafel zu ersehen ist, führen die GH-3'-UTR-Sequenzen zu erheblich verbesserten Serumkonzentrationen (d. h. zu einer verbesserten Absonderung) des kodierten Polypeptids im Vergleich zur Verwendung von 3'-Sequenzen, beispielsweise skeletaler Actin-3'-UTR, was eine höhere Retention des Produkts in dem Gewebe ermöglicht. Somit wird durch eine Selektion von 3'-UTR-Sequenzen, die eine angemessene Absonderung oder die Retention fördernde Eigenschaften aufweisen, ermöglicht, die Lokalisierung des kodierten Produkts zu kontrollieren.
Verbesserte Vektorexpression im intakten Muskel
Intakte Plasmid-DNA lässt sich in einer sterilen 20% Sacharoselösung (Gew./vol) in ausgereiften Muskel von Säugern oder Vögeln injizieren. Nach einer einzigen Injektion verhält sich die Vektor-DNA mindestens 30 Tage als eine nicht integrierte extrachromosomale ringförmige DNA in Muskelkernen stabil und ist die Transkription betreffend aktiv. Wolf et al., Science, vol. 247, pp. 1465–1468 (1990). Allerdings wird unter dem Wolff-Protokoll mehr als 99% der injizierten DNA im Muskel zerstört (Wolff, et al., BioTechniques 11: 4374–485 (1991)). Dieses Protokoll lässt sich durch ein Erhöhen der Aufnahme von Plasmid-DNA in den Muskel und ein Vermindern von Vektorzerfall verbessern. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann Expressionsvektor-DNA verwenden, die mit den maßgebenden transkriptorischen regulatorischen Faktoren, dem menschlichen Serumantwortfaktor und anderen dem Menschen zugeordneten Nukleoproteinen, z. B. Histon und Transkriptionsinitialisierungsfaktoren, beschichtet ist, um die Aufnahme und Stabilität zu verbessern. Die regulatorischen Proteine schützen die DNA gegen Muskelnukleasen und erleichtern die Aufnahme der mit Protein beschichteten DNA in myogene Kerne.
Der Expressionsvektor bildet einen Protein/DNA-Komplex durch die sequenzspezifische Bindung des Serumantwortfaktors mit dem Serumantwortelement des inneren Kerns CCXXXXXXGG (wobei X entweder A oder T; SEQ-ID Nr. 6 sein kann) und durch das Hinzufügen von Histon. Die Wechselwirkung mit dem inneren Kern des Promotors erleichtert dem myogenen Zelltypus die restringierte Expression des skeletalen a-Actin-Gens. Durch eine Bindungsreaktion in vitro werden dem Expressionsvektor der Serumantwortfaktor, der Transkriptionsinitialisierungsfaktor, der transregulatorische Faktor und Histone hinzugefügt, um einen rekonstituierten Protein/DNA-Komplex zu bilden.
Beschichtung des Expressionsvektorsystems
Eine spezielle Formulierung verwendet eine Beschichtung des Vektors mit Elementen des Transkriptionsinitialisierungskomplexes und Histon. Diese Formulierung dient dazu, sowohl die Lieferung des Vektors an die Zelle als auch die Expression des Vektors innerhalb der Zelle zu verbessern.
Das folgende Protokoll wurde verwendet, um auf bakteriellem Wege menschlichen Serumantwortfaktor (SRF) zu exprimieren und zu reinigen. Plasmid pARSRF-Nde ist ein T7-Polymerase-Vektor (Studier, F. W. und Moffatt, J. Mol. Biol. 189: 113–130 (1986)), der auf eine Induzierung von IPTG (Isopropyl-B-D-Thiogalactopyranosid) hin SRF-Protein voller Länge erzeugte. (Manak et al., Genes and Development 4: 955–967 (1990)). E. coli BL21, das das Plasmid beherbergt, wurde bei einer Temperatur von 37°C an ein OD₆₀₀ von 0,4 in TYP-Medium gezüchtet, das mit Ampicillin (50 μg/ml) ergänzt war. Die Synthese des SRF wurde anschließend mit 1 mM IPTG für 2,0 h induziert und die Zellen wurden danach zentrifugiert, einmal in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH-Wert 7,0) gespült und nochmals in ein 40fach gepacktes Zellvolumen suspendiert und gegen (10 mM HEPES [N-2 Hydroxyethylpiperzin-N-2-Ethansulfonsäure, pH-Wert 7,4)], 60 mM KCl, 1 mM 2-Mercaptoethanol 0,5 mM EDTA, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 10% Glycerol) dialysiert. Die Zellen wurden mittels Ultraschall auf Eis aufgebrochen. Das Lysat wurde durch Zentrifugieren (mit 15.000 g für 20 Minuten) geklärt und der überexprimierten SRF enthaltende Hochgeschwindigkeitsüberstand wurde bei –80C gelagert. Eine partielle Reinigung des SRF wurde wie folgt durchgeführt. Eine Menge von 10 ml des Lysats wurde auf eine 10 ml Phosphocellulosesäule aufgetragen, die mit Säulenpuffer (der mit dem Dialysepuffer, wie er oben beschrieben ist, übereinstimmte) und 0,05% Nonidet P-40 äquilibriert war. Die Durchflussfraktionen wurden gesammelt und auf eine 5-ml Heparinagarosesäule aufgetragen. Die Säule wurde mit 0,35 M KC1 gespült und der SRF wurde mit 0,5 M KCl ausgewaschen. Der SRF wurde anschließend dialysiert und bei –80°C gelagert.
SRF-Protein in einem Gewichtsverhältnis gegenüber dem Expressionsvektor-DNA von etwa 5 zu 1 wurde erlaubt, gemeinsam in einer Lösung zu inkubieren, die 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0, 0,1 mM EDTA, 2 mM Dithiothreitol, 5% Glycerol plus 100 mM KCl) enthielt. Die Bindung des SRF an den Actin-Promotor wurde, wie aus dem Stand der Technik be kannt, durch DNA-Bindungstests und durch Nukleasefingerabdrucksschutztests verifiziert. Transkriptionsinitialisierungsfaktoren, beispielsweise das TATA-Box-Protein (TBP) und andere Initialisierungsfaktoren, beispielsweise TFIIB, E und F, werden durch das Protokoll von Dignam et al., Mol. Cell. Biol. 10: 582–598 (1983), mit 0,42 M KCl in dem oben erwähnten Dialysepuffer aus den gereinigten HeLa-Zellenkernen ausgewaschen. Kernlysate, die Transkriptionsinitialisierungsfaktoren enthielten, werden mit dem SRF-DNA-Plasmid in einem Verhältnis von 10 Teilen Protein zu einem Teil SRF-DNA vermischt, um die Bildung eines Vorinitialisierungskomplexes zu unterstützen, der für 24 Stunden dialysiert wird. Zuletzt wird eine grobe Histonzubereitung, die aus HeLa-Kernen in 6 M Harnstoff abgeschieden wurde, 2 M NaCl gegen Dialysepuffer mit geringem Salzanteil dialysiert. Das vollständige Komplement von Histon wird langsam bis zu einem endgültiges Verhältnis von 1 zu 1 (Histon zu SRF-Protein-DNA-Komplex) hinzugefügt, um über der ungeschützten DNA Nukleosompartikel zu bilden. Durch das Hinzufügen von Histon sind die DNA-Regionen im Vergleich zu nackter/unbehandelter DNA aus zellulären Nukleasen besser geschützt.
Der Nucleoproteinkomplex wird anschließend mit einer Lipidbase, einer nicht wässerigen Base und/oder Liposomen weiter formuliert, um unmittelbar in Muskel injiziert zu werden. Wegen der Abwesenheit spezifischer Transkriptionsfaktoren, die Kernzielsequenzen enthalten, wird die Expressionsvektor-DNA bereitwillig in die Muskelkerne geliefert und von diesen aufgenommen.
Der Vektor kann auch in einer Formulierung mit anderen DNA-Bindungszusammensetzungen zubereitet werden. Beispiels weise kann der Vektor mit Polyvinyl-Pyrrolidon (PVP) zubereitet werden. PVP ist ein synthetisches Polymer, das aus linearen 1-Vinyl-2-Pyrrolidongruppen aufgebaut ist. PVP ist im Handel in vielfältigen Stufen der Polymerisation und unterschiedlichen Molekulargewichten erhältlich. Pharmazeutisch einsetzbares PVP wird unter den Markennamen Plasdone (International Specialty Products, ISP) und Kollidon (BASF) vermarktet. ISP beschreibt die typischen Eigenschaften von Plasdone C-30 in der zugehörigen Produktbeschreibung. Plasdone C-30 weist ein mittleres Molekulargewicht von 50.000 g/Mol auf.
Es ist nachgewiesen, dass PVP mit DNA durch Wasserstoffbindung interagiert. PVP schützt ferner nachweislich DNA in vitro vor Nuklease-(DNase 1)-Zerfall. Reportergene (CMV-CAT oder CMV-b-gal) wurden in PVP-Lösungen formuliert und in Rattentibialismuskeln nach einer chirurgischen Behandlung injiziert. Die Ergebnisse zeigten, dass mit 3 mg/ml in 5% PVP in 150 MM NaCl formulierte DNA die größte Verbesserung der Genexpression gegenüber in physiologischer Kochsalzlösung formulierter DNA erbrachte. Die Spiegel einer Genexpression, die PVP mit geringerem Molekulargewicht (Plasdone C-15) verwendete, waren etwa um die Hälfte niedriger als Spiegel einer Genexpression, die mit Plasdone C-30 hergestellte Formulierungen verwendete. Wenn in Rattentibialismuskeln eine DNA injiziert wurde, die entweder in physiologischer Kochsalzlösung oder in 5% PVP (Plasdone C-30) formuliert worden war, zeigte ein immunochemische Einfärbung mit Blick auf b-Galaktosidase auf, dass die Einfärbung in den mit der formulierten DNA behandelten Muskeln breiter verteilt war. Die Einfärbung zeigte ferner, dass die PVP-Formulierung zu einer Erhöhung der Anzahl an b-gal exprimierenden Zellen führte, und dass diese Zellen im Ver gleich zu einer in physiologischer Kochsalzlösung injizierten DNA über einen größeren Bereich verteilt waren. Es wird darauf hingewiesen, dass die erhöhte Gewebedispersion von DNA bei Verwendung von PVP-Formulierungen auf eine hyperosmotische Wirkung in dem Muskel zurückzuführen ist. DNA (3 mg/ml) in 5% PVP (Plasdone C-30) in 150 mM NaCl übt einen osmotischen Druck von 341 ± 1 mOsm/kg H₂O aus.
Eine exemplarische Formulierung des hIGF-I-Plasmids ist ein Dreiphiolensystem, mit Produktkomponenten, die unmittelbar vor der Verwendung zu mischen sind. Die Produktkomponenten sind:

1. Menschliches IGF-I-Plasmid in sterilem Wasser;
2. Lyophilisiertes PVP (Polyvinyl-Pyrrolidon; Plasdone C-30, Povidon U. S. P.); chemische Formel (C₆H₉NO)_n;
3. 115 mM Natriumcitratpuffer (pH-Wert 4) in 50 NaCl.

Der Expressionsvektor kann auch wie nachstehend beschrieben geliefert werden.
Verabreichung
Eine Verabreichung bezieht sich in dem hier verwendeten Sinne auf die Route der Einführung eines Vektors oder Trägerstoffs einer DNA in den Körper. Die Verabreichung kann unmittelbar in ein Zielgewebe oder nach einer systemischen Verabreichung durch gezielte Lieferung an das Zielgewebe erfolgen. Insbesondere kann die vorliegende Erfindung zur Behandlung einer Erkrankung verwendet werden, in dem der Vektor dem Körper verabreicht wird, um eine kontrollierte Expression einer beliebigen spezifischen Nucleinsäuresequenz innerhalb von Geweben mit gewissen Spiegel einzurichten, die für Gentherapie geeignet sind.
Das bevorzugte Mittel für die Verabreichung eines Vektors und die Verwendung von Formulierungen zur Lieferung sind oben beschrieben. Das bevorzugte Ausführungsbeispiel basiert auf unmittelbarer Injektion mittels Injektionsnadel oder Hypospray.
Die Verabreichungsroute jedes ausgewählten Vektorkonstrukts wird von dem speziellen Nutzen für die Expressionsvektoren abhängen. Im Allgemeinen wird eine spezielle Formulierung für jedes verwendete Vektorkonstrukt sich auf die Vektoraufnahme hinsichtlich des speziellen, ins Visier genommene Gewebes, gefolgt von dem Nachweis der Wirksamkeit konzentrieren. Aufnahmeuntersuchungen werden Aufnahmetests einschließen, um die zelluläre Aufnahme der Vektoren und die Expression der gewählten gewebespezifischen DNA auszuwerten. Solche Tests bestimmen ferner die Lokalisierung der Ziel-DNA nach der Aufnahme, und die Einrichtung der Voraussetzungen für die Aufrechterhaltung einer dauerhaften Konzentrationen von exprimierten Protein. Die Wirksamkeit und Zytotoxizität kann dann getestet werden. In die Toxizität wird nicht nur die Lebensfähigkeit einer Zelle, sondern auch deren Funktion eingeschlossen sein.
Muskelzellen haben die einzigartige Fähigkeit, nach einer einfachen Injektion von DNA-Partikeln in Form einer Lösung, einer Suspension oder eines Kolloids in den Muskel, DNA aus der extrazellulären Umgebung aufzunehmen. Die Expression von DNA mittels dieses Verfahrens kann für einige Monate aufrechterhalten werden.
Die Lieferung von formulierten DNA-Vektoren bezieht einen Einbau von DNA in makromolekulare Komplexe ein, die einer Endozytose durch die Zielzelle unterworfen werden. Zu solchen Komplexen können Lipide, Proteine, Kohlenhydrate, synthetische organische Verbindungen oder anorganische Verbindungen gehören. Die Eigenschaften des mittels des Vektors gebildeten Komplexes (Abmessung, Ladung, Oberflächeneigenschaften, Zusammensetzung) bestimmt die Bioverfügbarkeit des Vektors innerhalb des Körpers. Andere Elemente der Formulierung wirken als Ligand, der mit speziellen Rezeptoren auf der Oberfläche oder im Innern der Zelle in Wechselwirkung tritt. Weitere Elemente der Formulierung dienen dazu, den Eintrag in die Zelle, die Freigabe vom Endosom und den Eintrag in den Kern zu verbessern.
Die Lieferung kann auch durch Verwendung von DNA-Trägerstoffen erfolgen. Als DNA-Trägerstoffe werden Moleküle bezeichnet, die an DNA-Vektoren binden und durch Epidermiszellen aufgenommen werden können. DNA-Trägerstoffe enthalten einen molekularen Komplex, der in der Lage ist, nicht kovalent an die DNA zu binden und die DNA effizient durch die Zellmembran zu transportieren. Es ist bevorzugt, dass der Trägerstoff auch die DNA durch die Kernmembran befördert. Siehe beispielsweise die folgenden Patentanmeldungen, auf die in ihrer Gesamtheit (einschließlich der Zeichnungen) hier Bezug genommen wird: (1) Woo et al., US-Patentanmeldung S. Nr. 07/855 389, mit dem Titel "A DNA Transporter System and Method of Use", eingereicht am 20. März 1992, inzwischen fallengelassen; (2) Woo et al., PCT/US93/02725, Internationale Veröffentlichung WO93/18759, mit dem Titel "A DNA Transporter System and method of Use", (vorgesehen für die USA und andere Länder) eingereicht am 19. März 1993; (3) eine "Continuation-in-part"-Anmeldung von Woo et al., mit dem Titel "Nucleic Acid Transporter Systems and Methods of Use", eingereicht am 14. Dezember 1993, die US-Patentanmeldung mit der S. Nr. 08/167 641; (4) Szoka et al., US-Patentanmeldung mit der S. Nr. 07/913 669, mit dem Titel "Self-Assembling Polynucleotide Delivery System", eingereicht am 14. Juli 1992 und (5) Szoka et al., PCT/US93/03406, Internationale Veröffentlichung. Die WO93/19768 mit dem Titel "Self-Assembling Polynucleotide Delivery System", (vorgesehen für die USA und andere Länder) eingereicht am 5. April 1993.
Der Transfer von Genen unmittelbar in den Muskel war bisher sehr effizient. Versuche zeigen, dass eine Verabreichung durch unmittelbare Injektion von DNA in Muskelzellen zu einer Expression des Gens in dem Bereich der Injektion führt. Eine Injektion von Plasmiden, die IGF-I enthalten, führt zu einer Expression des Gens, die für Monate mit verhältnismäßig konstanten Spiegeln anhält. Die injizierte DNA verharrt anscheinend in einem nicht integrierten extrachromosomalen Zustand. Dieses Mittel eines Transfers ist das bevorzugte Ausführungsbeispiel.
Ein weiteres bevorzugtes Verfahren zum Liefern verwendet ein DNA-Trägerstoffsystem. Das DNA-Trägerstoffsystem weist Partikel auf, die einige Elemente enthalten, die unabhängig und nicht kovalent an DNA gebunden werden. Jedes Element basiert auf einem Liganden, der spezielle Rezeptoren oder andere funktionelle Gruppen, beispielsweise ein Protein, das einen Komplex mit einer an DNA bindenden kationischen Gruppe bildet. Beispiele von Kationen, die verwendet werden können, sind Spermin, Sperminderivate, His ton, kationische Peptide und/oder Polylysin. Eines der Elemente ist in der Lage, sowohl an den DNA-Vektor als auch an einen Zellenoberflächenrezeptor auf der Zielzelle zu binden. Beispiele solcher Elemente sind organische Verbindungen, die mit dem Asialoglycoprotein-Rezeptor, dem Folat-Rezeptor, dem Mannose-6-Phosphat-Rezeptor oder dem Carnitin-Rezeptor interagieren. Ein zweites Element ist in der Lage, sowohl an den DNA-Vektor als auch an einen Rezeptor auf der Kernmembran zu binden. Der Kernligand ist in der Lage, ein Trägerstoffsystem zu erkennen und dieses durch eine Kernmembran zu transportieren. Ein Beispiel eines derartigen Liganden ist die Kernzielsequenz aus dem SV40 Groß-T-Antigen oder Histon. Ein drittes Element ist in der Lage, sowohl an den DNA-Vektor als auch an Elemente zu binden, die episomale Lyse induzieren. Zu den Beispielen zählen nicht aktivierte Viruspartikel, beispielsweise Adenovirus, Peptide, die Influenzavirushämagglutinin betreffen, oder das in dem oben erwähnten Patent von Skoka beschriebene GALA-Peptid.
Die Verabreichung kann auch Lipide verwenden. Die Lipide können Liposome bilden, die hohlkugelförmige Vesikel sind, die aus Lipiden, die in unilaminarer, bilaminarer oder multilaminarer Weise angeordnet sind, und einem internen wässerigen Raum aufgebaut sind, der dazu dient, wasserlösliche Verbindungen einschließen, z. B. DNA, deren Durchmesser im Bereich von 0,05 bis einigen Mykrometern beträgt. Lipide können nützlich sein, ohne dass diese Liposome bilden. Spezielle Beispiele schließen die Verwendung von kationischen Lipiden und Komplexen ein, die DOPE enthalten, das mit DNA und mit der Membrane der Zielzelle zusammenwirkt, um den Eintrag von DNA in die Zelle zu erleichtern.
Die Genlieferung kann auch durch Transplantieren gentechnisch veränderter Zellen ausgeführt werden. Beispielsweise können als Myoblasten bezeichnete unreife Muskelzellen dafür eingesetzt werden, Gene in die Muskelfasern zu tragen. Myoblasten, die gentechnisch verändert sind, um rekombinantes menschliches Wachstumshormon zu exprimieren, sind in der Lage, das Wachstumshormon in das Blut des Lebewesens abzusondern. Die Absonderung des eingebauten Gens kann über Zeiträume bis zu 3 Monaten aufrechterhalten werden.
Myoblasten differenzieren sich gegebenenfalls und verschmelzen mit bestehendem Muskelgewebe. Da die Zelle in eine vorhandene Struktur eingegliedert ist, wird sie nicht nur toleriert, sondern auch ernährt. Myoblasten können ohne weiteres gewonnen werden, indem einer gentherapeutisch zu behandelnden Person Muskelgewebe entnommen wird, und die gentechnisch veränderten Zellen lassen sich ebenso einfach ohne Schädigung in den Muskel des Patienten zurückgeben. In ähnlicher Weise können Keratinozyten dafür eingesetzt werden, um Gene an Gewebe zu liefern. Durch Züchten einer geringen Probeexzision lassen sich große Zahlen von Keratinozyten erzeugen. Die Kulturen können als geschichtete Folien zubereitet werden, die nach einer Verpflanzung auf einen Menschen Epidermis erzeugen, die über viele Jahre hinweg ihre gewebetypische Qualität weiter verbessert. Die Keratinozyten werden während der Züchtung gentechnisch verändert, indem die Keratinozyten mit dem geeigneten Vektor transfiziert werden. Obwohl Keratinozyten durch die Basalmembran, die die Epidermis von der Dermis trennt, von dem Kreislauf getrennt sind, sondern menschliche Keratinozyten das erzeugte Protein in den Kreislauf ab.
Die Lieferung kann die Verwendung von viralen Vektoren einbeziehen. Beispielsweise kann ein Adenovirus-Vektor konstruiert werden, indem die E1-Region des Virusgenoms mit den in dieser Erfindung beschriebenen Vektorelementen, zu denen Promotor, 5'UTR, 3'UTR und Nucleinsäurekassette gehören, ersetzt werden und dieses rekombinante Genom in 293-Zellen eingeführt wird, die dieses Gen in ein infektiöses Viruspartikel packen. Das Virus aus dieser Zelle kann in diesem Fall verwendet werden, um Gewebe ex vivo oder in vivo zu infizieren, um den Vektor in Gewebe einzuführen, was zu einer Expression des Gens in der Nucleinsäurekassette führt.
Das gewählte Verfahren der Lieferung sollte eine Expression des innerhalb der Nucleinsäurekassette kodierten Genprodukts mit Spiegeln hervorrufen, die eine angemessene biologische Wirkung erzielen. Die Rate der Expression wird von der Erkrankung, der Pharmakokinetik des Vektors und des Genprodukts und von der Verabreichungsroute abhängen, sollte jedoch zwischen 1–1000 mg/kg des Körpergewichts/Tag betragen. Dieser Spiegel lässt sich ohne weiteres durch Standardverfahren bestimmen. Er könnte im wesentlichen von der optimalen Dosierung abhängen. Die Dauer der Behandlung deckt sich mit dem Verlauf der Krankheitssymptome und kann ununterbrochen sein. Die Anzahl der Dosen wird von dem Verabreichungsbindemittel für die Erkrankung und von den anhand von klinischen Erprobungen gewonnenen Daten über die Wirksamkeit abhängen.
Untersuchungen zur Sicherheit für das Lebewesen/der Toxikologie
A. Akute 7-Tage- und subchronische 28-Tage-Toxizitätsstudien
Akute 7-Tage- und subchronische 28-Tage-Toxizitätsstudien wurden an Hunden entsprechend den Vorschriften des Good Laboratory Practice (GLP) (Laborpraxisverordnung) der United States Food and Drug Administration (21 CFR Abschnitt 58) durchgeführt. Die Testartikel und die in diesen Studien verwendete Trägersubstanz wurden mittels cGMP-Verfahren hergestellt. Hunde wurden verwendet, da der reife menschliche IGF-I (hIGF-I), der durch das Plasmid exprimiert wird, identisch mit Hunde-IGF-I ist.
Das Ziel des 7-Tage-Akut-Tests bestand darin, die potentielle akute Toxizität von hIGF-I-Plasmids nach einer einzigen intravenösen Injektion in den Hund zu untersuchen. Vier Gruppen von Beagels, die jeweils zwei Männchen und zwei Weibchen umfassten, wurden intravenös mit dem Testartikel injiziert, nämlich mit einem in Polyvinyl-Pyrrolidon (PVP) formuliertem hIGF-I-Plasmid, mit Dosispegeln von 0,1, 1,0 und 12,0 mg/kg. Der höchste Dosispegel wurde basierend auf der maximalen Löslichkeit des Testartikels in der Trägersubstanz und dem für eine Injektion in Hunden zugelassenen Gesamtvolumen ausgewählt. Die untere Dosis entspricht der in vorklinischen Tierstudien an Nagern ermittelten minimal wirksamen Dosis.
Eine Kontrollgruppe erhielt lediglich die Trägersubstanz (PVP) in der in Zusammenhang mit dem Testartikel verwendeten höchsten Dosierung. Zwei zusätzliche Genesungsgruppen (in jeder zwei Männchen und zwei Weibchen), die mit der höchsten Dosis des Testartikels behandelt worden waren und Kontrolltiere wurden eine weitere Woche gehalten. Die Hunde wurden am Tag 8 nach der Injektion getötet, und die Genesungsgruppen wurden am Tag 15 nach der Injektion getötet.
Eine intravenöse Verabreichungsroute wurde verwendet, um ein Szenario eines "ungünstigsten Falls" einer systemischen Exposition des Testartikels zu simulieren. Mortalitätsprüfungen wurden über den gesamten Untersuchungszeitraum zweimal täglich durchgeführt, und es wurde in den ersten vier Stunden nach der Verabreichung der Dosis stündlich und während des Beobachtungszeitraum täglich eingehend nach Symptomen geforscht. Die Körpergewichte wurden während der letzten Woche der Akklimatisation und über den gesamten Beobachtungszeitraum hinweg zweimal wöchentlich ermittelt. Laboruntersuchungen (Hämatologie, klinisch Biochemie und Urinanalyse) wurden während der Vorbehandlungsperiode und an Proben durchgeführt, die für sämtliche überlebende Tiere am Tag 2, 7 und 14 gesammelt wurden. Eine vollständige Nekropsie wurde an sämtlichen Tieren durchgeführt, und ausgewählte Organe einschließlich der Muskeln wurden gewogen.
Es waren weder abnorme Symptome noch Auswirkungen auf Parameter des Körpergewichts, der Nahrungsaufnahme, der Hämatologie, der klinischen Biochemie oder der Urinanalyse vorhanden. Darüber hinaus waren keine auf das hIGF-I-Plasmid zurückzuführende Differenzen hinsichtlich Organgewichten oder signifikanter pathologischer Befunde vorhanden. Mit Histaminfreigabe konsistente Symptome wurden in Kontroll- und hochdosierten Tiergruppen beobachtet. Diese Symptome dauerten für etwa zwei Stunden an und waren mit früheren Berichten über die in Hunden beobachtete Histaminfreigabe in Antwort auf PVP konsistent. Somit waren die Symptome auf das in den Dosisformulierungen vorhandene PVP zurückzuführen und nicht auf das hIGF-I-Plasmid.
Das Ziel der subchronischen Untersuchung war, die potentielle Toxizität von hIGF-I-Plasmid während einer vierwöchigen Phase wöchentlicher intramuskulärer Injektionen, die an Beagels vorgenommenen wurden, gefolgt von einer vier Wochen dauernden Genesungsphase zu untersuchen. Die intramuskuläre Route ist die für Menschen vorgesehene Verabreichungsroute. Die Hunde wurden einmal wöchentlich für vier Wochen mit 0,1, 1,0 und 6,0 mg/kg intramuskulär injiziert. Jede Gruppe wies drei Hunde pro Geschlecht auf. Zusätzliche Genesungsgruppen (zwei Hunde/Geschlecht), die unter der höchsten Dosierung standen, und Kontrollgruppentiere wurden für zusätzliche 28 Tage beobachtet. Mortalitätsprüfungen wurden über den gesamten Untersuchungszeitraum mindestens zweimal täglich durchgeführt, und Untersuchungen auf Symptome einer Gesundheitsverschlechterung oder einem Ansprechen auf die Behandlung wurden mindestens zweimal täglich nach dem Beginn der Behandlung durchgeführt. Die individuellen Körpergewichte wurden am Tag der Randomisierung und während der Behandlungs- und Genesungsphasen wöchentlich ermittelt. Die Nahrungsaufnahme wurde während der Behandlungs- und Genesungsphasen täglich gemessen. Einmal vor dem Beginn der Behandlung und nochmals während der letzten Woche der Behandlung (Woche 4) und während der letzten Woche der Genesungsphase (Woche 8) wurde eine Augenspiegelung durchgeführt. Kardiovaskuläre Studien (Elektrokardiogramme und systolische Blutdruckmessungen) und Laboruntersuchungen (Hämatologie, klinisch Biochemie und Urinanalyse) wurden einmal vor dem Beginn der Behandlung und nochmals während Woche 4 und 8 durchgeführt. Darüber hinaus wurden zu denselben Gelegenheiten Serumproben gewonnen und für eine eventuelle zukünftige Analyse gelagert. An sämtlichen Tieren, die am Ende der Behandlungsperiode getötet wurden, wurde eine vollständige Nekropsie durchgeführt.
Ausgewählte Organe wurden gewogen, und eine vollständige Liste von Geweben wurde aufbewahrt und mikroskopisch ausgewertet.
Es konnten weder abnorme Symptome noch Auswirkungen auf Parameter des Körpergewichts, der Nahrungsaufnahme, des Blutdrucks, der Elektrokardiogramme, der Hämatologie, der klinischen Biochemie, der Urinanalyse oder okularer Veränderungen beobachtet werden, die möglicherweise mit hIGF-I-Plasmid in Verbindung zu bringen sind. Wie in dem Akut-Test wurden in Kontrollgruppen und in hochdosierten Tiergruppen nach Verabreichung der Kontroll- oder Testartikel Symptome beobachtet, die konsistent mit einer Histaminfreigabe waren. In Antwort auf gelegentliche (d. h. 4 von 16) schwerwiegende Reaktionen, wurde Epinephrin intravenös verabreicht, um Mortalität zu verhindern. Wie zuvor ließen sich diese Reaktionen auf das in dem Testartikel vorhandene PVP zurückführen, und nicht auf das hIGF-I-Plasmid.
Eine an zwei Hunden durchgeführte Pilotstudie bestätigte, dass die beobachteten Symptome auf Histaminfreigabe zurückzuführen waren. Den Hunden wurde die Trägersubstanz intramuskulär mit jenem hohen Dosisspiegel (6 mg/kg) injiziert, der die Symptome der Histaminfreigabe auslöste. Einer der Hunde wurde mit einem H₁ Histaminrezeptorblocker, Diphenhydraminhydrochlorid (Benadryl^R, 1 mg/kg) vorbehandelt. Beide Hunde entwickelten die Symptome, und eine Vorbehandlung mit dem Histaminantagonisten hob die Symptome nicht auf. Blutproben wurden auf Histaminspiegel analysiert, und diese lagen bei beiden Hunden um das Hundertfache oder mehr über den Spiegeln vor der Behandlung. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Dosierung von Histaminblockern unangemessen war. Es wird angenommen, dass die bei Hunden beobachteten Effekte artspezifisch sind und Hunden eigentümlich sind. Erfahrungen mit dem bei Menschen als ein Blutexpander verwendeten PVP zeigten bisher keine vergleichbaren Symptome. Es kam zu keinen Differenzen in Gewichten von Organen oder allgemeinen oder histopathologischen Befunden, die sich mit hIGF-I-Plasmid in Verbindung hätten bringen lassen.
Eine Verabreichung von hIGF-I-Plasmid mittels einer wöchentlichen intramuskulären Injektion über vier Wochen erbrachte daher bei Dosierungen von bis zu 6 mg/kg/Anlass keinerlei Anzeichen einer Toxizität. Symptome, die mit in Kontroll- und hochdosierten Tiergruppen beobachteter Histaminfreigabe konsistent waren, wurden auf das in den Dosisformulierungen vorhandene Polyvinyl-Pyrrolidon zurückgeführt, und nicht auf hIGF-I-Plasmid.
B. Test von Hundeserum auf Anti-hIGF-I und Anti-DNA-Antikörper
Serumproben, die von Hunden gewonnen wurden, die in der subchronischen (28 Tage-) Toxizitätsstudie mit hIGF-I-Plasmid behandelt worden waren, wurden auf die Anwesenheit von Antikörpern gegen rhIGF-I und Doppelstrang-(ds) DNA getestet. Den Hunden wurde über einen Zeitraum von 28 Tagen hIGF-I-Plasmid mit Dosierungen von 0 (Trägersubstanzkontrollgruppe), 0,1, 1,0 und 12,0 mg/kg alle 7 Tage intramuskulär injiziert. Die Serumproben (siehe Profil in Tafel V) wurden vor dem Beginn der Dosierung (Pre-Bleed), am Ende des Verabreichungszeitraums (Tag 27) und nach einer Genesungsphase von 28 Tagen (Tag 55) gewonnen. Eine Gesamtzahl von 76 Proben wurden untersucht.
Tafel V Profile von auf Antikörper gegen hIGF-I und gegen DNA getestete Serumproben
Antikörper gegen rhIGF-I wurden mittels genormter ELISA-Verfahren getestet. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die von behandelten Hunden stammenden Serumproben keine nachweisbaren Antikörper gegen rhIGF-I enthielten. Antikörper gegen dsDNA wurden mittels eines ELISA-Kits (The Binding Site, Inc., Birmingham, U. K.) getestet, der dazu entwickelt wurde, um Antikörper gegen dsDNA in menschlichem Serum zu quantifizieren, und modifiziert wurde, um Antikörper in Hundeserum zu quantifizieren. Der Antihuman-IgG-HRP-Paarling wurde durch den Kaninchen-Anti-Hund-IgG-HRP-Paarling als den zweiten Antikörper ersetzt. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass keine der von behandelten Hunden stammenden Serumproben nachweisbare Antikörper gegen ds-DNA enthielten.
Untersuchungen der Pharmakokinetik/Biodistribution
A. Zeitlicher Verlauf der Expression von rhIGF-I im skeletalen Muskel von Ratten
Die Expression von rhIGF-I im Tibialismuskeln von Ratten wurde zu Zeitpunkten nach einer intramuskulären Injektion von hIGF-I-Plasmid bestimmt. In Polyvinyl-Pyrrolidon formuliertes menschliches IGF-I-Plasmid wurde beidseitig in die Tibialismuskeln (150 μg DNA/Muskel) von männlichen Fisher-344-Ratten (etwa 125 g BW) injiziert. Die Ratten wurden nach einem Zufallsprinzip in zwei Gruppen aufgeteilt, wobei die Tiere der einen Gruppe über die Dauer des Versuchs jeden zweiten Tag Injektionen des Immunosuppressivums Cyclosporin A (5 mg/kg BW) in den Gesäßmuskel erhielten. Ratten aus jeder Gruppe wurden zu den Zeitpunkten 24 Stunden, 48 Stunden, 7 Tage, 14 Tage und 28 Tage nach Injektion des hIGF-I-Plasmids getötet (n = 5–6 Ratten/Gruppe/Zeitpunkt). Die Tibialismuskeln wurden zu diesen Zeitpunkten entnehmen und durch einen immunoradiometrischen Test (Diagnostic Systems Laboratories, Inc., Webster, TX) auf eine Expression von rhIGF-I analysiert.
Eine Revertase-PCR-Analyse der aus beherrschten Muskeln stammenden Gesamt-RNA zeigte 24 oder 48 Stunden nach der Injektion keine Expression von hIGF-I-mRNA. Eine Expression von hIGF-I-mRNA wurde am Tag 7, 14 und 28 beobachtet. Die Ergebnisse für den intramuskulären Gehalt an rhIGF-I am Tag 7, 14 und 28 nach der Injektion zeigen, dass der intramuskuläre Gehalt an rhIGF-I mit etwa 1,5–2,5 ng/g Muskel zwischen dem Tag 7 und 14 nach der Injektion ähnlich war und sich in den 28 Tagen nach der Injektion bis auf etwa 35 Prozent des Wertes von Tag 7 verminderte. Eine zur Unterdrückung der Immunanwort dienende Behandlung mit Cyclosporin A hatte keinen Einfluss auf den intramuskulären rhIGF-I-Gehalt (p > 0,10), noch wurden Antikörper gegen hIGF-I in Serum von Ratten entdeckt, die die Behandlung mit Cyclosporin A am Tag 28 nach der Injektion nicht erhalten hatten. Insgesamt lassen diese Ergebnisse darauf schließen, dass die Verringerung an intramuskulärem rhIGF-I nicht auf eine Immunantwort des Wirtsorganismus zurückzuführen ist. Zu keinem Zeitpunkt wurde in Serumproben aus geimpften Ratten menschliches IGF-I festgestellt.
B. Bestimmung der Pharmakokinetik und der Verteilung von hIGF-I-Plasmid in Gewebe
Das Ziel dieser Studien war, die Pharmakokinetik und Verteilung von hIGF-I-Plasmid in Gewebe nach einer Verabreichung zu ermitteln. Wie das Hunde-IGFd I, ist das reife Meerschweinchen-IGF-I-Polypeptid mit menschlicher IGF-I identisch, was das Meerschweinchen zu einer geeigneten Spezies für eine Erforschung der Pharmakokinetik und Biodistribution des hIGF-I-Plasmids macht. Zwei Gruppen von Hartley-Meerschweinchen (50 Männchen und 50 Weibchen pro Verabreichungsroute) wurden jeweils einmal entweder eine niedrige Dosis (0,1 mg/kg) oder eine hohe Dosis (1,5 mg/kg) von in 5% PVP formuliertem hIGF-I-Plasmid über intramuskuläre oder intravenöse Injektionen verabreicht.
Aus jeder Behandlungsgruppe wurden pro Geschlecht in den folgenden Zeitintervallen fünf Tiere getötet: 30 Minuten, 1 Stunde, 6 Stunden, 12 Stunden, 1 Tag, 2 Tage, 1 Wo che, 4 Wochen und 3 Monate. Als Kontrolle erhielt eine Gruppe von 10 männlichen und 10 weiblichen Meerschweinchen pro Verabreichungsroute die Trägersubstanz in demselben Volumen/Gewichtsverhältnis wie die mit hohen Dosen behandelte Gruppe.
Keimdrüsen, Lymphknoten, Leber, Milz, Niere, Lungen, Herz, Gehirn, Knochenmark, Muskel und Blut wurden zu jedem Zeitpunkt der Opferung gesammelt. Das Blut wurde bei 5°C gelagert, und die Gewebe wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –70°C gelagert. Die DNA aus Blutproben wurde mittels eines empfindlichen von Hand trennen Polymerasekettenreaktions-(PCR)-Tests auf die Anwesenheit des menschlichen IGF-I-Plasmids analysiert. Falls das Plasmid in dem Blut entdeckt wurde, wurde davon ausgegangen, dass die ausgewählten Gewebe positiv waren und diese wurden nicht analysiert. Falls das Plasmid in der Blutprobe nicht erfasst wurde, wurde die DNA aus den Gewebeproben in doppelter Ausführung amplifiziert. Ein Probe jedes Duplikats wurde mit einer Kopienanzahl nahe der Erfassungsgrenze mit dem Testplasmid geimpft, um die Abwesenheit jeder Inhibition einer Polymerasekettenreaktions (PCR) sicherzustellen. Proben aus Tieren, die mittels der hoch dosierten intramuskulären und der intravenösen Routen behandelt worden waren, wurden noch nicht analysiert. Jedes positive Gewebe kann auf menschliche IGF-I-Messenger-RNA getestet werden, um eine Genexpression zu ermitteln.
Eine PCR-Analyse der Blutproben von Tieren, die im Laufe des zweiten Tages nach Dosierung mit Testartikel getötet wurden, zeigte die Anwesenheit des DNA-Plasmids an. Bis Tag 7 nach Dosisverabreichung war das Plasmid aus dem Blut verschwunden. Eine PCR-Analyse von Proben (aus Keimdrüsen-, Nieren-, Leber-, Herz- und Muskelgewebe) der Tiere, die drei Monate nach der intramuskulären Injektion einer geringen Dosis des hIGF-I-Plasmids (0,1 mg/kg) getötet wurden, zeigten an der Injektionsstelle und in den umgebenden systemischen Bereichen eine Eliminierung des größten Anteils des Testplasmids.
Es wurden bei sämtlichen Probanden beider Geschlechter im Laufe der Untersuchung keinerlei Symptome einer Toxizität beobachtet. Sämtliche Tiere überlebten bis zur planmäßigen Opferung. Die Tiere, für die die Endkörpergewichte aufgezeichnet worden waren (nach Tag 1 geopferte Tiere), nahmen an Gewicht vom Zeitpunkt der Dosierung an bis zum Zeitpunkt der Opferung zu. Es waren keine offensichtlichen signifikanten auf chemische Reaktionen zurückzuführende Wirkungen auf das Körpergewicht vorhanden. Massentest bei einer Nekropsie an ausgewählten Geweben zeigten bis auf eine einzige Ausnahme zu keinem Zeitpunkt ungewöhnliche Befunde. Es wurden in einem niedrig dosierten Weibchen braune Herde auf sämtlichen Lungenlappen beobachtet; jedoch wurde dieser Befund nicht im Zusammenhang mit der Behandlung mit dem Testartikel erachtet.
Ganz allgemein ließ sich den Daten entnehmen, dass das hIGF-I-Plasmid nach drei Monaten eliminiert ist. Aus einer Gesamtanzahl von fünfzig analysierten Geweben, die aus zehn Tieren stammten, denen das Plasmid in geringen Dosen intramuskulär injiziert worden war, wurden lediglich drei positive Signale festgestellt: ein Eierstock, eine Leber und ein Muskel. Die Signale waren sporadisch und schienen nicht gewebespezifisch zu sein. Sämtliche negativen Kontrollgewebe erbrachten negative Befunde.
Demzufolge ist der Testartikel (in der verabreichten Form) angesichts der Tatsache, dass bei einer Nekropsie drei Monate nach der Exposition keinerlei auf den Testartikel zurückzuführende Mortalität, Symptome einer Toxizität, Wirkungen auf das Körpergewicht oder größere Schädigungen festgestellt werden konnten, bei den getesteten Dosierungen nicht toxisch.
Zellentransfektion und Transformation
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung beinhaltet ein Transfizieren von Zellen mit den oben beschriebenen Vektoren. Sobald die Zellen transfiziert sind, exprimieren die transformierten Zellen das Protein oder die RNA, für die die Nucleinsäurekassette kodiert. Zu Beispielen von Proteinen gehören, ohne darauf beschränken zu wollen, Polypeptid, Glycoprotein, Lipoprotein, Phosphoprotein oder Nucleoprotein.
Die Nucleinsäurekassette, die das interessierende genetische Material enthält, ist hinsichtlich der Position und der Sequenz innerhalb der Vektoren ausgerichtet, so dass die in der Kassette befindliche Nucleinsäure in RNA transkribiert und, falls erforderlich, in den transformierten Zellen in Proteinen oder Polypeptiden translatiert werden kann.
In den transformierten Zellen können durch die Sequenz in der Nucleinsäurekassette vielfältige Proteine exprimiert werden. Jene Proteine, die exprimiert werden können, lassen sich im Zytoplasma, im Kern, in Membranen (einschließlich der Plasmamembran, der Kernmembran, des endoplasmatischen Retikulums oder anderer interner Membraneabteile), in Orga nellen (zu denen die Mitochondrien, das Peroxisom, das Lysosom, das Endosom oder andere Organellen gehören) lokalisieren oder können darin abgesondert werden. Diese Proteine können als intrazelluläre oder extrazelluläre strukturelle Elemente, Liganden, Hormone, Neurotransmitter, Wachstumsregulationsfaktoren, Differenzierungsfaktoren, Genexpressionsregulierungsfaktoren, DNA-zugeordnete Proteine, Enzyme, Serumproteine, Rezeptoren, Trägerstoffe für organische oder anorganische Verbindungen geringen Molekulargewichts, Medikamente, Immunmodulatoren, Onkogene, Tumorhemmstoff, Toxine, Tumor-Antigene oder Antigene wirken. Diese Proteine können eine natürliche Sequenz oder eine mutierte Sequenz aufweisen, um deren biologische Aktivität zu verbessern, zu verhindern, zu regulieren oder zu eliminieren. Ein spezielles Beispiel eines zu exprimierenden Proteins ist hIGF-I.
Darüber hinaus ist die Nucleinsäurekassette in der Lage, für RNA zu kodieren. Die RNA kann als eine Matrize für die Translation, als ein Antisense-Inhibitor einer Genexpression, als ein Inhibitor gegen Bildung von Trippelsträngen bei der Genexpression, als Enzym (Ribozym) oder als Ligand wirken, der spezielle strukturelle Determinanten auf zellulären Strukturen erkennt, um deren Aktivität zu modifizieren. Zu speziellen Beispielen gehören RNA-Moleküle, die dazu dienen, die Expression oder Funktion von Prostaglandinsynthetase, Lipooxenganse, Histokompatibilitätsantigenen (Klasse I oder Klasse II), Zelladhäsionsmolekülen, nitrose Oxidsynthase, b₂-Mikroglobulin, Onkogenen und Wachstumsfaktoren zu verhindern.
Die Bestandteile, die sich einbauen lassen, sind lediglich durch die Verfügbarkeit der Nucleinsäuresequenz für das einzubauende Protein oder Polypeptid beschränkt. Der Fachmann wird ohne weiteres erkennen, dass mit einer weiteren Identifizierung von Proteinen und Polypeptiden, diese sich in das Vektorsystem der vorliegenden Erfindung integrieren lassen und in Geweben von Lebewesen einschließlich des Menschen exprimiert werden können.
Die Transfektion kann durch Techniken in vivo oder ex vivo durchgeführt werden. Beispielsweise können Muskelzellen in Kultur vermehrt, mit dem transformierenden Gen transfiziert und anschließend in Muskelgewebe transplantiert werden. Alternativ können die Vektoren den Zellen durch die oben erörterten Verfahren verabreicht werden.
Verfahren der Verwendung
A. Behandlung mit Wachstumshormon
Wachstumshormon wird normalerweise von dem Hypophysenvorderlappen erzeugt und von diesem abgesondert, und fördert beim Kind in der Vorpubertät ein lineares Wachstum. Wachstumshormon wirkt auf die Leber und andere Gewebe, um die Erzeugung des insulinähnlichen Wachstumsfaktors I zu stimulieren. Dieser Faktor ist wiederum ursächlich für die wachstumsfördernden Wirkungen des Wachstumshormons. Darüber hinaus dient dieser Faktor als ein Indikator für die Gesamtabsonderung an Wachstumshormon. Die Konzentration von Serum-IGF-I steigt in Antwort auf endogen und exogen verabreichte Wachstumshormone an. Diese Konzentrationen sind bei einem Wachstumshormonmangel niedrig.
Insulinähnliche Wachstumsfaktoren stellen einen der Schlüsselfaktoren dar, die die Entwicklung und das Wachstum von Muskeln potenzieren. Myoblasten sondern während des Einsetzens eines Verschmelzens von Natur aus IGF-I/IGF-II sowie dessen verwandte Bindungsproteine ab. Dieser Vorgang geht mit dem Auftauchen von muskelspezifischen Genprodukten einher. Im terminal differenzierten Muskel induzieren Signale, die aufgrund von durch passives Strecken induzierter Hypertrophie ausgebreitet werden, die Expression von IGF-Genen. Viele der Wirkungen von IGF auf Muskeln sind auf Wechselwirkungen mit dem IGF-I-Rezeptor zurückzuführen.
Die intramuskuläre Injektion eines Expressionsvektors, der die Sequenz für IGF-I (beispielsweise pIG0552) enthält, kann zur Behandlung von Wachstumsstörungen verwendet werden. Die Vektoren sind konstruiert, um die Expression von IGF-I in einem Bereich von 100–400 ng/ml zu regulieren. Da die intramuskuläre Expression von Vektoren ein monatelange Expression des durch die Nucleinsäurekassette kodierten Produkts bewirkt, schafft dieses Verfahren einen auf lange Sicht kostengünstigen Weg, um die systemische Blutkonzentration von IGF-I in Patienten mit Wachstumshormonmangel zu steigern.
B. Wirkung von IGF-I-Vektorexpression auf Inaktivitätsatrophie
Die Hinterlaufsuspension ist ein bekanntes Versuchsverfahren, das dazu dient, um Atrophie von Kälbermuskeln zu induzieren. Die Wirkungen einer Hinterlaufsuspension ähneln jenen, die durch Gipsschienenimmobilisierung oder durch ein längeres Aussetzen der Schwerelosigkeit induziert werden.
Mäusen (12/Gruppe) wurden am Tag 0 und 7 der Suspensionsphase in den Gastrocnemius und die Tibialismuskeln entweder IGF-I enthaltender Vektor (IGF-I) oder Kontrollplasmid (PLAS) injiziert. Die Vektoren waren mit 3 mg/ml in Polyvinylpyrrolidon-(PVP)-Lösung formuliert und in Dosen von 25 μl (75 μg DNA) in den Tibialismuskel und 50 μl (150 μg DNA) in den Gastrocnemiusmuskel verabreicht. Dies entspricht einer Dosierung von etwa 1 μg DNA/mg Muskelnassgewicht.
Messungen der Kontraktionskraft (Stärke) und Gewicht der Muskeln wurden 1–2 Tage nach Beendigung der Hinterlaufsuspension vorgenommen. Tiere, die nicht der Hinterlaufsuspension (NORM) unterworfen worden waren, wurden zum Vergleich einbezogen.
Den in Tafel VI gezeigten Ergebnissen ist zu entnehmen, dass eine Hinterlaufsuspension einen Verlust von etwa 20–25% an Muskelmasse und -Kraft auslöste, und dass eine Behandlung mit der IGF-I-Vektorformulierung diese Effekte reduzierte (p < 0,10).
Tafel VI Mittelwerte für ausgewählte Parameter
C. Wirkungen der IGF-I-Vektorexpression nach Quetschungsdenervierung
Hüftnervenquetschung stellt ein gewöhnlich verwendetes und gut Charakterisiertes Modell zum Auslösen der Prozesse dar, die an der Degeneration und Regeneration einer neuromuskulären Funktion nach einer Verletzung beteiligt sind (M. Jaweed, 1994, The Physiological Basis of Rehabilitation, Downey et al., Ausg., Seite 543–561. Eine Quetschschädigung des Hüftnervs führt zu einer raschen Degeneration von gegenüber der Läsion distalen Axonen, Nervenleitungsverlust und Atrophie in dem (den) denervierten Muskel(n). Frühe Reaktionen einer Nervenregeneration treten innerhalb von Stunden nach einer Quetschschädigung ein, wobei eine Abfolge von regenerativen Prozessen eingeleitet werden, die bei Nagern nach 14–21 Tagen zu einer Wiederherstellung der neuromuskulären Synapsen führen und nach etwa 6 Wochen zur Wiederaufnahme der normalen neuromuskulären Transmission. Infolge einer Denervierung werden nach 14 Tagen etwa 40–50% Atrophie bei betroffenen Muskelfasern und eine begleitende Verringerung an isometrischer Kontraktionskraft beobachtet, mit einer endgültigen Wiederherstellung von 80–90% des Normalzustands. Ein Wiedererlangen der vor der Schädigung vorhandenen Muskelmasse erfordert einige Monate.
Frühere Untersuchungen an Nagern zeigten, das die tägliche Verabreichung von rhIGF-I-Protein die Wiederherstellung der neuromuskulären Funktion nach einer Hüftnervenquetschung verbessern kann.
Reife ICR-Stamm-Mäusen wurden entweder unilateralen Schein-(SHAM)-Operationen oder Hüftnervenquetschungen unterworfen. Eine IGF-I enthaltende Vektorformulierung (IGF-I) oder ein Kontrollplasmid (PLAS) wurde in die Tibialis- und Gastrocnemiusmuskeln der behandelten Extremität injiziert. Mäusen in den entsprechenden Gruppen wurden anschließend und jeden 7. Tag danach entweder eine IGF-I-For mulierung oder eine Kontrollplasmidformulierung injiziert. Die Vektoren waren mit 3 mg/ml in Polyvinyl-Pyrrolidon-(PVP)-Lösung formuliert und wurden in einer Dosis von 25 μl (75 μg DNA) in den Tibialismuskel und 50 μl (150 μg DNA) in den Gastrocnemiusmuskel verabreicht. Dies entspricht einer Dosierung von etwa 1 μg DNA/mg Muskelnassgewicht.
Analysen der Kontraktionskraft, des Muskelgewichts, der elektromyographischen (EMG) Aktivität und der Nervenleitungsgeschwindigkeit (NCV) wurden in Intervallen von 14 Tagen nach der Nervenquetschung durchgeführt. Die Messung der EMG-Aktivität und der NCV wurden mittels eines Dantec Neuromatic 2000 EMG/EP-Systems durchgeführt.
Die Hüftnervenquetschung löste eine merkliche Muskelatrophie, einhergehend mit einem Verlust an Nervenleitung und EMG-Aktivität aus (10A & B). Zwei Wochen nach der Quetschung wurden bei diesen Parametern keine wesentlichen Unterschiede zwischen mit hIGF-I-Plasmid behandelten und Kontrollgruppentieren festgestellt. Allerdings löste eine Behandlung mit hIGF-I-Plasmid drei Wochen nach der Quetschung eine leichte Verbesserung der Gastrocnemiusmasse aus, mit deutlichen Verbesserungen der EMG-Aktivität und der NCV beginnend drei Wochen nach der Quetschung. Diese Daten lassen vermuten, dass die vorteilhaften Wirkungen des hIGF-I-Plasmids sich verhältnismäßig früh in dem regenerativen Prozess (d. h. vor Ablauf von drei Wochen) manifestieren.
Diese Ergebnisse zeigen an, dass die auf die IGF-I enthaltende Vektorformulierung zurückzuführende Expression die Genesung von einer Hüftnervenquetschung beschleunigte.
D. Behandlung altersbedingter Muskelatrophie
Die Wachstumshormonspiegel sinken mit steigendem Alter. Die Spiegel bei gesunden Männern und Frauen über 55 sind etwa um ein Drittel niedriger als die Spiegel bei Männern und Frauen zwischen 18 und 33. Dies geht mit einer Verringerung der Konzentration von IGF-I einher. Das Sinken von Wachstumshormon und IGF-I-Produktion korreliert mit der als Altersmuskelatrophie bezeichneten Verringerung der Muskelmasse und der bei gesunden Menschen auftretenden Steigerung der Adipositas. Eine Verabreichung von Wachstumshormon dreimal pro Woche an gesunde Männer im Alter zwischen 61 und 81 Jahren, deren Serumspiegel unterhalb derjenigen von gesunden jüngeren Männer lagen, erhöhte den IGF-I-Serumspiegel auf einen bei gesunden jungen Erwachsenen vorzufindenden Bereich. Diese erhöhten Spiegel führten zu vermehrter Muskelmasse und -Kraft und reduzierten das Körperfett. Die Absonderung von Wachstumshormon wird durch ein stimulatorisches (Wachstumshormon freigebendes Hormon) und ein inhibitorisches (wachstumshemmendes) Hypothalamushormon reguliert.
Die leicht zugänglichen Klonierungsstellen in den Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung werden verwendet, um Vektoren zu konstruieren, die eine menschliche Wachstumshormon-cDNA-Sequenz, das menschliche Wachstumshormon freigebende Hormon (GHRH), oder IGF-I enthalten. Diese Vielseitigkeit ist von Bedeutung, da GHRH, GH (Wachstumshormon) und IGF-I zwar äquivalente gewünschte Wirkungen auf die Masse eines Muskels aufweisen, jedoch möglicherweise unterschiedliche Nebenwirkungen oder Kinetikeigenschaften haben, die ihre Wirksamkeit beeinträchtigen könnten. Die Expression des Wachstumsfaktor freigebenden Hor mons könnte vorteilhafter sein als die Expression von IGF-I oder der Transkripte der Wachstumshormonvektoren. Da GHRH bei älteren Personen vermindert vorhanden ist, erscheint es eher für das Fehlen von GH-Absonderung ursächlich zu sein, als die Fähigkeit der Hypophysenvorderlappen zur Synthetisierung von Wachstumshormon, daher würde die erhöhte Expression von GHRH aus Muskel die GHRH-Spiegel in dem systemischen Blutsystem erhöhen und kann die natürlichen täglichen Absonderungsmuster von GH aus dem Hypophysenvorderlappen ermöglichen. Auf diese Weise könnte GHRH als das natürliche Sekretagogum wirken, was eine erhöhte Absonderung oder Freigabe von GH aus dem Hypothalamus bei älteren Personen ermöglichen würde.
Somit stellt die Anwendung der hier beschriebenen Vektorsysteme, um insulinähnliche Wachstumsfaktoren zu exprimieren, indem in ausgereiften Muskel älterer Personen pIG0552 oder verwandte Vektoren, der SK 733 IGF-I Sk2 Vektor, HG exprimierende Vektoren oder GHRH injiziert wird, einen langfristig kostengünstigen Weg dar, um die Konzentration von IGF-I in systemischem Blut bei älteren Personen zu steigern.
Eine Verabreichung der Vektoren kann intravenös, durch unmittelbare Injektion in den Muskel oder durch ein beliebiges der oben beschriebenen Verfahren erfolgen. Die Dosierungen werden von der Schwere der Erkrankung abhängen, und die Dosismenge lässt sich ohne weiteres durch Standardverfahren bestimmen. Die Dauer der Behandlung deckt sich mit dem Verlauf der Krankheitssymptome und kann ununterbrochen sein.
E. Behandlung von durch neurologische Dysfunktion hervorgerufenen Muskelatrophien beim Menschen
Insulinähnliche Wachstumsfaktoren sind auch als neurotrophische Agenzien bekannt, die unter neurodegenerativen Bedingungen neuronale muskulöse Synapsen, die Unversehrtheit des Neurons und die Lebensdauer neuronaler Zellen aufrecht erhalten und die Nervenregeneration positiv beeinflussen. Da die durch Expressionsvektoren aktivierten Gene verhältnismäßig unempfindlich gegenüber dem Nervenversorgungszustand des Muskels sind, ermöglichen sie eine unmittelbare und ziemlich weitläufige Anwendung für die Therapie gewisser Arten von Muskelatrophien beim Menschen, die auf Rückenmarkverletzungen und neuromuskuläre Erkrankungen zurückzuführen sind, die durch Medikamente, Erkrankung an Diabetes Typ I, Diabetes Typ II, genetische Erkrankungen, beispielsweise das CHACOT-Marie-Tooth-Syndrom, oder durch gewisse andere Erkrankungen hervorgerufen werden. Weiter kann eine IGF-I-Absonderung ein übermäßiges Wachstum von Neuriten induzieren. Bei dieser Behandlung wirkt das Produkt des Vektors als ein neurotropes Agens, das von dem injizierten Muskel abgesondert wird, und als hypertrophes Agens, um die Unversehrtheit des Muskels aufrecht zu erhalten.
Eine Verabreichung der Vektoren kann intravenös, durch unmittelbare Injektion oder durch ein beliebiges der oben beschriebenen Verfahren erfolgen. Die Dosierungen werden von der Schwere der Erkrankung abhängen, und die Dosismenge lässt sich ohne weiteres durch Standardverfahren bestimmen. Die Dauer der Behandlung deckt sich mit dem Verlauf der Krankheitssymptome und kann ununterbrochen sein.
F. Behandlung von Diabetes
Insulin spielt eine zentrale Rolle in der Regulierung des Metabolismus von Kohlenhydraten, Fetten und Proteinen. Bei Diabetikern kann eine Behandlung mit Insulin zu einer Insulinresistenz führen, bei der die Insulinbehandlung nicht zu einer angemessenen metabolischen Steuerung führt. Diese Resistenz kann in Anwesenheit von im Kreislauf vorhandenen Insulin oder Insulinrezeptor-Antikörpern oder Insulinrezeptoranomalien, oder periodisch bei Patienten auftreten, die zuvor an typischen insulinabhängigem Diabetes mellitus erkrankt waren. Die Optionen einer Therapie für Patienten, die an schwerer Insulinresistenz leiden, sind beschränkt.
IGF-I kann in der Behandlung von Insulinresistenz verwendet werden. Eine Behandlung mit IGF-I mittels der Vektoren der vorliegenden Erfindung ermöglicht eine glykämische Steuerung, indem Hyperglykämie und Ketoazidose zurückgebildet werden. Eine Behandlung mit IGF-I wird außerdem den Grad des Ansprechens auf Insulin verbessern. Die leicht zugänglichen Klonierungsstellen in den Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung werden verwendet, um Vektoren zu konstruieren, die die cDNA-Sequenz von IGF-I enthalten. Eine Expression von IGF-I ermöglicht insulinähnliche metabolische Wirkungen. Dem IGF-I sind Sequenzhomologie und biologische Eigenschaften mit Insulin gemein.
Eine Verabreichung der Vektoren kann intravenös, durch unmittelbare Injektion oder durch ein beliebiges der oben beschriebenen Verfahren erfolgen. Die Dosierungen werden von der Schwere der Erkrankung abhängen, und die Dosismenge lässt sich ohne weiteres durch Standardverfahren bestimmen. Die Dauer der Behandlung deckt sich mit dem Verlauf der Krankheitssymptome und kann ununterbrochen sein.
G. Behandlung peripherer Neuropathien
Periphere Neuropathien sind degenerative Prozesse sensorischer und motorischer Nerven, die häufig von Diabetes, Diabetes Typ I, Diabetes Typ II, eine genetische Erkrankung, beispielsweise das CHACOT-Marie-Tooth-Syndrom, AIDS, Entzündungen und Nebenwirkungen von Medikamenten gegen Krebs und Viruserkrankungen herrühren. Eine herkömmliche Behandlung ist auf Schmerzlinderung beschränkt, wobei sich keine Behandlung gegen die zugrundeliegenden zellulären Ursachen richtet. Der Einsatz rekombinanter IGF-I wurde vorgeschlagen, um einige der degenerativen Prozesse in peripheren Neuropathien umzukehren und die mit diesen verbundene Dysfunktion zu lindern.
Eine Verabreichung eines für IGF-I kodierenden Vektors an lokal begrenzte Muskeln, die an peripherer Neuropathie erkrankt sind, durch unmittelbare Injektion oder Hypospray wird die Regeneration von Neuronen unterstützen, die Schmerzwahrnehmung vermindern und die Mobilität der betroffenen Stelle steigern. Der klare Vorteil einer Vektorverabreichung von IGF-I basiert auf erhöhten Spiegeln an den Orten des Bedarfs, zusammen mit einer Reduzierung der Anzahl der Verabreichungen. Im Falle von Diabetikern können Dosierungspläne die kombinierte Wirkung einer Linderung von Symptomen einer peripheren Neuropathie und einer Steigerung des Wirkungsgrads von Insulin ermöglichen.
Eine Verabreichung der Vektoren kann intravenös, durch unmittelbare Injektion oder durch ein beliebiges der oben beschriebenen Verfahren erfolgen. Die Dosierungen werden von der Schwere der Erkrankung abhängen, und die Dosismenge lässt sich ohne weiteres durch Standardverfahren bestimmen.
Die Dauer der Behandlung deckt sich mit dem Verlauf der Krankheitssymptome und kann ununterbrochen sein.
H. Behandlung von Osteoporose
Osteoporose ist ein häufig mit dem Altern auftretender allgemeiner beschleunigter Verlust an Knochenmasse. Die mit Osteoporose verbundene verminderte Knochendichte führt zu einer erhöhten Neigung zu Knochenbrüchen. Eine Behandlung mit IGF-I bringt eine Steigerung der Knochendichte mit sich. Die Verabreichung eines für IGF-I kodierenden Vektors in Muskeln durch unmittelbare Injektion oder Hypospray wird die Neuanlagerung von Knochen unterstützen und dadurch das Risiko von Brüchen verringern.
Eine Verabreichung der Vektoren kann intravenös, durch unmittelbare Injektion oder durch ein beliebiges der oben beschriebenen Verfahren erfolgen. Die Dosierungen werden von der Schwere der Erkrankung abhängen, und die Dosismenge lässt sich ohne weiteres durch Standardverfahren bestimmen. Die Dauer der Behandlung deckt sich mit dem Verlauf der Krankheitssymptome und kann ununterbrochen sein.
Transgenes Schwein
Ein zusätzliches Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist die 5 Entwicklung eines verbesserten Viehbestands. Insbesondere wird eine Einführung des Vektors pIG0552 oder eines Vektors, der ein IGF-I Derivat von Schwein, Rind oder Schaf exprimiert, in Oozyten des Hausschweins mittels des oben für die Entwicklung von transgenen Mäusen beschriebenen Verfahrens Schweine erzeugen, die in myogenem Gewebe IGF-I exprimieren. Diese transgenen Schweine weisen die gewünschte Bestandsmerkmale einer vermehrten Muskelmasse und reduzierten Fetts auf.
Darüber hinaus wird der IGF-I durch ein Bereitstellen zusammenhängender 3'-NCR gegen äußere genomische Sequenzen gepuffert und ist auf diese Weise während des Einbaus in das Genom besser vor Positionseffekten geschützt. Weiter verhindern die zusätzlichen regulatorischen Sequenzen, die die transkriptorische Domäne von skeletalem a-Actin markieren, durch Bereitstellen von natürlichen Endsequenzen eine head-trough-transkription und verbessern die Gewebespezifität, die zeitliche Steuerung der Entwicklung und die Transkriptionsaktivität. Die Anwesenheit einer 3'NCR-Sequenz ermöglicht, dass eine einzige Kopie des integrierten Vektors 40–50% der Transkriptionsaktivität der endogenen Sequenzen hervorbringt.
Bestandsverbesserung
Ein zusätzliches Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist die Bestandsverbesserung durch Injektion von IGF-I-Vektorkonstrukten oder ähnlicher Konstrukte, die für andere Wachstumshormone kodieren, z. B. für Wachstumshormon oder Wachstumshormon freigebendes Hormon. Eine Injektion von für IGF-I kodierende Vektoren mittels hypodermischer oder Hyposprayverabreichung in den Muskel wird bei wichtigen Viehbestandsarten, beispielsweise Rindern, Schafen, Schweinen, Kaninchen, Wild, Fischen und Vögeln, beispielsweise Truthähnen, Hühnern, Enten und Gänsen, eine Vermehrung der Muskelmasse und eine Verringerung des Körperfetts fördern. Die Verabreichung der Vektoren kann ebenfalls durch ein beliebiges der oben beschriebenen Verfahren erfolgen.
Der Fachmann wird ohne weiteres erkennen, dass sich die vorliegende Erfindung gut eignet, um die genannten Aufgaben zu erfüllen und die erwähnten Ergebnisse und Vorteile sowie solche die damit verbunden sind zu erzielen. Die hier beschriebenen Vektorsysteme, zusammen mit den Methoden, Verfahren, Behandlungen und Impfungen sind gegenwärtig repräsentativ für bevorzugte Ausführungsbeispiele; sie dienen als Beispiele und sind nicht als beschränkend für den Schutzumfang der Erfindung zu bewerten.

Claims

Vektor zum Exprimieren einer Nucleinsäuresequenz in einer Zelle, zu dem gehören: eine Nucleinsäurekassette, die für eine für IGF-I kodierende Nukleotidsequenz enthält; eine 5'-Flankierungsregion, die ein oder mehrere Folgen aufweist, die zum Exprimieren der Nucleinsäurekassette benötigt werden, wobei die Folgen einen von einem skeletalen α-Actin-Gen stammenden Promotor enthalten; ein Linker, der die 5'-Flankierungsregion an eine Nucleinsäure bindet, wobei der Linker eine Position zum Einfügen der Nucleinsäurekassette aufweist und der Linker nicht auf natürlichem Wege mit den 5'- und 3'-Regionen assoziiert ist; und eine 3'-Flankierungsregion, mit einer 3'UTR und optional einer 3'NCR, wobei die 3'-Flankierungsregion eine Region 3' bis zu der Position zum Einfügen der Nucleinsäurekassette ist, und die 3'UTR eine funktionelle Sequenz aus einem Wachstumshormon 3'-UTR aufweist.
Vektor nach Anspruch 1, bei dem das IGF-I menschliches IGF-I ist.
Vektor nach Anspruch 2, bei dem die für menschliches IGF-I kodierende Nukleotidsequenz eine synthetische Sequenz ist.
Vektor nach Anspruch 3, bei dem die für menschliches IGF-I kodierende Nukleotidsequenz die Sequenz von SEQ ID NO. 4 aufweist.
Vektor nach Anspruch 1, bei dem der von einem skeletalen α-Actin-Gen stammende Promotor von einem Küken stammt.
Vektor nach Anspruch 1, bei dem der von einem skeletalen α-Actin-Gen stammende Promotor vom Menschen stammt.
Vektor nach Anspruch 1, bei dem das Wachstumshormon 3'UTR von einem menschlichen Wachstumshormon-Gen stammt.
Vektor nach Anspruch 1, bei dem aus der 3' UTR ein ALU-Repeat oder eine einem ALU-Repeat ähnelnde Sequenz entfernt ist.
Vektor nach Anspruch 1, bei dem der IGF-I menschlicher IGF-I ist, der von einem skeletalen α-Actin-Gen stammende Promotor von einem Küken stammt und das Wachstumshormon 3'-UTR von einem menschlichen Wachstumshormon-Gen stammt.
Vektor nach Anspruch 1, bei dem die 5'-Flankierungsregion oder die 3'-Flankierungsregion oder beide überwiegend ein Exprimieren der Nucleinsäurekassette in einem spezifische Gewebe regulieren.
Vektor nach Anspruch 2, bei dem das spezifische Gewebe myogen ist.
Vektor nach Anspruch 1, bei dem die 5'-Flankierungsregion einen Promotor, eine TATA-Box, eine Cap-Stelle und eine erste Intron- und Intron/Exon-Grenze enthält, die sich in einer für ein Exprimieren der Nucleinsäurekassette geeigneten Relation befinden.
Vektor nach Anspruch 12, bei dem die 5'-Flankierungsregion ferner eine 5'-mRNA Leadersequenz aufweist, die zwischen dem Promotor und der Nucleinsäurekassette eingefügt ist.
Vektor nach Anspruch 1, bei dem der Vektor ferner eine Intron/5'-UTR von einem skeletale Küken-α-Actin-Gen aufweist.
Vektor nach Anspruch 1, bei dem der Vektor ferner ein Antibiotika-Resistenzgen aufweist.
Vektor nach Anspruch 1, bei dem der Vektor eine Nukleotidsequenz aufweist, die mit der Nukleotidsequenz des in Tabelle 1 gezeigten Plasmids pIG0552 übereinstimmt.
Formulierung zum Liefern und Exprimieren eines menschlichen IGP-I-Gens in einer Zelle, wobei die Formulierung enthält: einen Vektor nach Anspruch 1 in einer Lösung, die zwischen 0,5% und 50% PVP aufweist.
Formulierung nach Anspruch 17, bei der die Lösung etwa 5% PVP enthält.
Nicht menschliches transgenes Lebewesen, das eine Vielzahl von Zellen aufweist, die den Vektor nach Anspruch 1 enthalten.
Transgenes Lebewesen nach Anspruch 19, bei dem die Zelle ein Bakterium oder eine somatische Zelle ist.
Zelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 1 transformiert ist.
Transformierte Zelle nach Anspruch 21, wobei die Zelle myogen ist.
Verfahren zum Transfizieren einer Zelle ex vivo, mit dem Schritt, die Zelle über eine ausreichende Zeitspanne mit einem Vektor nach Anspruch 1 in Kontakt zu bringen, um die Zelle zu transfizieren.
Verfahren nach Anspruch 23, bei dem das Inkontaktbringen in Anwesenheit einer etwa 5% PVP enthaltenden Lösung durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei zu dem Verfahren ferner die Schritte gehören, den Vektor mit einem selektierbaren Marker zu co-transfizieren und die transformierten Zellen zu selektieren.
Verfahren zum Liefern und Exprimieren eines menschlichen IGF-I-Gens ex vivo in eine Vielzahl von Zellen, mit den Schritten: (a) Transfizieren der Vielzahl von Zellen ex vivo mit einem Vektor nach Anspruch 1; und (b) Inkubieren der Vielzahl von Zellen unter Bedingungen, die ein Exprimieren einer Nucleinsäuresequenz aus dem Vektor erlauben, wobei die Nucleinsäuresequenz für IGF-I kodiert.
Verfahren nach Anspruch 26, bei dem das IGF-I hIGF-I ist, und die Zellen menschliche Zellen sind.
Verfahren nach Anspruch 27, bei dem das Inkontaktringen in Anwesenheit einer etwa 5% PVP enthaltenden Lösung durchgeführt wird.
Verwenden eines Vektors nach Anspruch 1, der geeignet ist, eine Zelle in Form eines Medikaments in situ zu transfizieren.
Verwenden eines Vektors nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Erkrankung oder eines Zustands, ausgewählt aus der Gruppe, zu der Muskelatrophie, Osteoporose, Diabetes, Neuropathie und Wachstumsstörungen gehören.
Verfahren nach Anspruch 30, bei dem die Erkrankung oder der Zustand eine Muskelatrophie ist, die in Folge einer Schädigung oder Inaktivität des unteren Motoneurons auftritt.