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Hintergrund
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung richtet sich auf Zusammensetzungen und Verfahren
für die
Behandlung von Krebs mittels Gentherapie, wobei ein therapeutisches
Gen, wie z. B. ein Tumorsuppressorgen verwendet wird, das über ein
Genfreisetzungssystem wie z. B. ein aus einem rekombinanten viralen
Vektor bestehendes Freisetzungssystem, freigesetzt wird, und in
einem Puffer formuliert ist, der ein die Freisetzung verstärktendes Agenz
enthält.
Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Freisetzung eines
Tumorsuppressorgens (z. B. p53 oder Retinoblastom (RB)) in karzinöse Epithelgewebe
und Organe, wie z. B. die Blase, wobei ein rekombinantes Adenovirus-Vektor-Freisetzungssystem
verwendet wird, das in einem Puffer formuliert ist, der ein die Freisetzung
verstärktendes
Agenz enthält.
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Blasenkrebs
stellt eine wichtige Krankheits- und Todesursache dar. In Bezug
auf Krankheiten, die mit Krebs in Zusammenhang stehen, rangiert
Blasenkrebs bei Männern
an zehnter und bei Frauen an zwölfter Stelle
(Cancer Facts and Figures, Amer. Can. Soc. 5: 11, (1995)). Therapien,
die für
die Behandlung von Blasenkrebs anwendbar sind, umfassen adjuvante
Chemotherapie oder Immunotherapie, transurethrale Resektion von
erkranktem oberflächlichem
Gewebe, vollständige
Cystektomie oder Radiotherapie, die häufig mit einer systemischen
Chemotherapie kombiniert wird. Trotz dieser therapeutischen Möglichkeiten
hat sich die allgemeine Überlebensrate
nicht spürbar
verbessert (ebenda). Daher müssen
neue therapeutische Wege für
die Behandlung von Blasenkrebs entwickelt werden.
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Gentherapie-Strategien
wurden als alternativer therapeutischer Ansatz entwickelt (siehe
z. B. Brewster et al. Eur Urol 25: 177–182 (1994); Takahashi et al.,
Proc Natl Acad Sci USA 88: 5257–5261
(1991); Rosenberg, SA, J. Clin Oncol. 10: 180–199 (1992)).
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Spezielle
Ansätze,
die auf Gentransfer-Methoden basieren, wurden entwickelt, um Neoplasmen
zu behandeln. Es wurden Methoden für die Korrektur spezifischer Defekte
in bestimmten Genloci, die die Ursache für neoplastische Transformationen
und Progressionen sind, entwickelt (Spandidos et al., Anticancer
Res. 10: 1543–1554
(1990); Banerjee et al. Cancer Res. 52: 6297–6304 (1992)). Die Überexpression
dominanter Onkogene kann mit Methoden behandelt werden, die das
transformierende Gen oder Genprodukt inhibieren. Der Verlust einer
Tumorsuppressorgen-Funktion kann mit Methoden behandelt werden,
mittels derer die Wildtyp-Tumorsuppressorgen-Funktion wiederhergestellt
wird (Goodrich et al., Cancer Res. 52: 1968–1973 (1992)). Neben diesen
Verfahren, die eine Kompensation von Mutationen zum Ziel haben,
wurden auch genetische Techniken entwickelt, um Tumorzellen spezifisch
und selektiv abzutöten.
Diese Ansätze
einer molekularen Chemotherapie beruhen auf der spezifischen Expression
von Toxingenen in neoplastischen Zellen (Abe et al., Proc Soc Exp
Biol Med. 203: 354–359
(1993)). Schließlich
wurden Gentransfer-Verfahren verwendet, um eine Antitumor-Immunisierung zu
erreichen. Diese Verfahren der genetischen Immunopotenzierung verwenden
Methoden der genetischen Immunoregulation, um die Immunerkennung
von Tumoren zu verstärken. Es
wurde also eine Vielzahl von speziellen Ansätzen entwickelt, um eine Gentherapie
gegen Krebs zustande zu bringen.
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Im
Fall von Blasenkrebs wurde in Tumorsuppressorgenen wie p53 und RB
eine hohe Mutationshäufigkeit
beobachtet (Fujimoto et al. Cancer Res. 521393–1398 (1992); Cairns et al.
Oncogene 6: 2305–2309 (1991)).
Bei solchen genetischen Defekten von Tumorsuppressorgenen kann durch
Austausch gegen das korrespondierende Wildtyp-Tumorsuppressorgen
die Reversion des neoplastischen Phänotyps hervorgerufen werden
(Spandidos, Id.; Banerjee, Id.).
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In
vitro-Untersuchungen mit Zelllinien aus humanem Blasengewebe haben
nach Infektion mit einem rekombinanten Adenovirus eine wirksame
Transgen-Expression
gezeigt (Bass et al. Cancer Gene Therapy 2: 2: 97–104 (1995)).
In vivo-Experimente
haben auch eine Adenovirus-Transgen-Expression in der Harn-Blase von
Nagetieren nach intravesikulärer
Verabreichung gezeigt (ebenda; Morris et al., J. Urology. 152: 506–50 (1994)).
In vitro-Experimente mit Wildtyp-Adenovirus zeigten, dass die Anheftung
und Aufnahme des Virus nicht durch Benzylalkohol beeinflusst wird,
sie zeigten aber ein verstärktes
Unmcoating des Virions (Blixt et al. Arch. Virol. 129: 265–277 (1993)).
In vivo-Behandlungen mit Agenzien (z. B. Aceton, DMSO, Protaminsulfat) können die
schützende "Mucin"-Schicht, die das
Blasenepithel vor Bakterien, Viren und anderen Krankheitserregern
schützt,
aufbrechen (Monson et al. J. Urol. 145: 842–845 (1992); Parsons et al.
J. Urol. 143: 139–142 (1990)).
Keines der bis heute ausprobierten Verfahren erreichte eine verstärkte Freisetzung
eines therapeutischen Tumorsuppressorgens in der Blase zu Behandlung
von Blasenkrebs. Um eine Gentherapie für die Behandlung von Blasenkrebs
zu ermöglichen,
müssen
Gentherapie-Methoden entwickelt werden, die eine direkte, optimale
in vivo-Freisetzung des Tumorsuppressorgens im Blasenepithel ermöglichen.
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Die
vorliegende Erfindung ist auf diese und andere Ziele gerichtet.
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In
den Artikeln "Recombinant
adenovirus-mediated gene transfer to genitourinary epithelium in
vitro and in vivo" von
Bass et al. (1995), "Expression
of the retinoblastoma gene product in bladder carcinoma cells associates
with a low frequency of tumor formation" von Goodrich (1992), und "The Retinoblastom
Gene Functions as a Growth and Tumor Suppressor in Human Bladder
Carcinoma Cells" von
Takahashi et al. (1991) wird die Behandlung von Blasenkrebs mittels
Gentransfer diskutiert.
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In
dem Artikel von Wills et al. mit dem Namen "Development and characterization of
recombinant adenoviruses encoding human p53 for gene therapy of
cancer" wird die
Verwendung von Adenoviren als Vektor für Gene diskutiert. Der Artikel "Adenovirus-mediated
p53 gene transfer inhibits growth of human tumor cells expressing
mutant p53 protein" von
Harris et al. offenbart ebenfalls adenovirale Vektoren.
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Zusätzlich zu
den oben aufgeführten
technischen Artikeln offenbart eine Reihe von relevanten Patentdokumenten
Hintergrundinformationen für
die vorliegende Erfindung.
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In
der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 95/10265 werden verschiedene
Beispiele der Freisetzung von therapeutischen Zusammensetzungen
diskutiert. In einem anderen internationalen Patent Nr. WO 97/11682
wird die Verwendung von Emulsionen mit biologisch aktiven Substanzen,
wie z. B. DNA, für
die Freisetzung solcher Substanzen in Zellen diskutiert. Das weitere
Patent Nr. WO 93/00052 diskutiert ebenfalls Methoden zur Freisetzung
von Genen in Zellen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Ein
Aspekt der Erfindung ist die Verwendung einer therapeutisch wirksamen
Menge eines Tumorsuppressorgens, das in einem rekombinanten adenoviralen
Vektorfreisetzungssystem enthalten ist, das in einen Puffer formuliert
ist, der ein Detergenz umfasst, zur Herstellung eines medizinischen
Medikaments, um das Tumorsuppressorgen einem Gewebe, das eine epitheliale
Membran aufweist, zu verabreichen.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung
mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines Tumorsuppressorgens,
das in einem rekombinanten adenoviralen Vektorfreisetzungssystem
enthalten ist, das in einen Puffer formuliert ist, der ein Detergenz
umfasst.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung einer therapeutisch
wirksamen Menge eines Tumorsuppressorgens, das in einem rekombinanten
adenoviralen Vektorfreisetzungssystem enthalten ist, das in einen
Puffer formuliert ist, der ein Detergenz umfasst, zur Herstellung
eines medizinischen Medikaments zur Verabreichung bei der Behandlung
von Blasenkrebs.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung ist eine pharmazeutische Formulierung
zur Verabreichung eines rekombinanten Adenovirus, die etwa 109–1011 PN/ml rekombinanten Adenovirus, etwa 2–20 mM Big
CHAP oder etwa 0,1–1,0
mM TRITON®X-100-Detergenz,
phosphatgepufferte Salzlösung
(PBS), etwa 2–3%
Sucrose (w/v) und etwa 1–3
mM MgCl2, etwa pH 6,4–8,4 umfasst.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 stellt
den Einfluss der Rezeptur auf den durch einen Adenovirus vermittelten
Gentransfer und die Expression im Blasenepithel der Ratte nach intravesikulärer Verabreichung
dar.
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2 stellt
die Adenovirus-Transgen-Expression in Blasenepithel-Zellen nach
intravesikulärer
Verabreichung dar.
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3 stellt
die Dosis-abhängige
Adenovirus-Transgen-Expression in der Blase der Ratte nach intravesikulärer Verabreichung
dar.
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4 stellt
eine reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion(RT-PCR)-Analyse der rekombinanten
Adenovirus-Transgen-Expression in der Blase der Maus nach intravesikulärer Verabreichung
dar.
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5 stellt
einen Zeitverlauf der rekombinanten Adenovirus-Transgen-Expression
in Blasen-, Nieren- und Lebergewebe nach intravesikulärer Verabreichung
des Virus dar.
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6 stellt
die rekombinante adenovirale transgene DNA in Blasen- und Nieren-Homogenat nach intravesikulärer Verabreichung
dar.
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7 stellt
die Verbesserung des Gentransfers in Blasenepithel bei Verwendung
einer Big CHAP-Rezeptur (N,N-bis-(3-D-Glukonamidopropyl)-Cholamid
(CALBIOCHEM® Biochemicals)
dar.
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8 stellt
die Verbesserung des Gentransfers in Blasenepithel bei Verwendung
verschiedener Konzentrationen des rekombinanten Adenovirus in einer
7 mM Big CHAP-Rezeptur dar.
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9 stellt
die Verbesserung der rekombinanten Adenovirus-Transgen-Expression
in Blasengewebe durch Verwendung von Ethanol (ETOH) oder einer Big
CHAP-Rezeptur dar.
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10 stellt
den Gentransfer auf Tumoren bei Verwendung einer 4 mM Big CHAP-Rezeptur dar.
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11 stellt
den Transgen-Transfer in Blasenepithel eines Schweins dar.
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12 stellt
die Expression von p53 in Tumorgewebe dar.
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13 stellt
den Gentransfer in die Schleimhaut eines Ratten-Ileums dar.
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Genauere Beschreibung
der Erfindung
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Der
hier benutzte Begriff "Genfreisetzungssystem" bezieht sich auf
jedes Mittel zur Freisetzung eines therapeutischen Gens in einem
bestimmten Epithel-Gewebe
oder Organ, einschließlich
beispielsweise rekombinanter Vektoren und Nicht-Vektor-Systeme.
Beispiele für
Nicht-Vektor-Systeme schließen
jeden Lipid-basierten
Komplex, Lipid-verkapselte DNA oder kationische Lipid-DNA-Komplexe
ein, sind aber nicht darauf limitiert. Beispiele für rekombinante
virale Vektoren schließen
Herpesvirus, Retrovirus, Grippevirus, Adenovirus und adenoassoziierten
Virus ein, sind aber nicht darauf limitiert.
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"Rekombinant" bezieht sich auf
Nukleinsäuren
und Proteine, die durch diese codiert werden, wobei die Nukleinsäuren mit
Methoden der rekombinanten DNA-Technologie
(auch als Gentechnik bezeichnet) konstruiert worden sind. Ein bevorzugter
rekombinanter viraler Vektor ist das adenovirale Vektorfreisetzungssystem, das
eine Deletion auf dem Protein IX-Gen aufweist (siehe internationale
Patentanmeldung WO 95/11984). Das rekombinante Vektorfreisetzungssystem,
das ein therapeutisches Gen wie z. B. ein Tumorsuppressorgen aufweist,
ist in einem Puffer formuliert, der ein die Freisetzung verstärkendes
Agenz enthält.
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Ein "die Freisetzung verstärkendes
Agenz" bezieht sich
auf jedes Agenz, das die Freisetzung eines therapeutischen Gens,
wie z. B. eines Tumorsuppressorgens, in einem karzinösen Gewebe
oder Organ verstärkt.
Diese verstärkte
Freisetzung kann durch verschiedene Mechanismen erreicht werden.
Ein solcher Mechanismus kann das Aufbrechen der schützenden
Glykosaminoglykan-Schicht auf der Epithel-Oberfläche der Blase einschließen. Beispiele
für solche
die Freisetzung verstärkenden
Agenzien sind Detergenzien, Alkohol, Glykole, Tenside, Gallensalze,
Heparin-Antagonisten, Cyclooxygenase-Inhibitoren, hypertonische
Salzlösungen
und Azetate. Alkohole schließen
z. B. die aliphatischen Alkohole wie Ethanol, N-Propanol, Isopropanol, Butylalkohol
und Acetylalcohol ein. Glykole schließen Glycerin, Propylenglykol,
Polyethylenglykol und andere niedermolekulare Glykole wie Glycerol
und Thioglycerol ein.
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Azetate
wie Essigsäure,
Gluconolazetat, und Natriumazetate sind weitere Beispiele für Agenzien,
die die Freisetzung verstärken.
Hypertonische Salzlösungen
wie 1 M NaCl sind weitere Beispiele für Agenzien, die die Freisetzung
verstärken.
Beispiele für
Tenside sind Natrium Dodecyl-Sulfat (SDS) und Lysolecithin, Polysorbat
80, Nonylphenoxypolyoxyethylen, Lysophosphatidylcholin, Polyethylenglykol
400, Polysorbat 80, Polyoxyethylenether, Polyglykolether-Tenside
und DMSO. Gallensalze wie Taurocholat, Natrium-Tauro-Deoxycholat, Deoxycholat,
Chenodesoxycholate, Glykocholinsäure,
Glykochenodeoxycholinsäure
und andere Adstringentien wie Silbernitrat können verwendet werden. Heparin-Antagonisten
wie quaternäre
Amine, wie z. B. Protaminsulfat können auch verwendet werden.
Cyclooxygenase-Inhibitoren wie z. B. Natrimsalicylat, Salicylsäure, und
nichtsteroidale entzündungshemmende
Mittel (NSAIDS) wie Indomethacin, Naproxen oder Diclofenac können verwendet
werden.
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Detergenzien
schließen
anionische, kationische zwitterionische und nichtionische Detergenzien
ein. Beispielhafte Detergenzien schließen Taurocholat, Deoxycholat,
Taurocholat, Tauro-Deoxycholat, Cetylpyridum, Benzalkoniumchlorid,
ZWITTERGENT®3-14-Detergenz,
CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)Dimethylammonio]-1-Propaneulfonat-Hydrate,
Aldrich), Big CHAP, Deoxy Big CHAP, TRITON®-X-100
Detergenz, C12E8, Octyl-β-D-Glucopyranosid,
PLURONIC®-F68-Detergenz,
TWEEN® 20
Detergenz, und TWEEN® 80 Detergenz (CALBIOCHEM® Biochemicals)
ein.
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In
einer Ausgestaltung ist das die Freisetzung verstärkende Agenz
in dem Puffer enthalten, in dem das rekombinante adenovirale Vektorfreisetzungssystem
formuliert ist. Das die Freisetzung verstärkende Agenz kann vor dem rekombinanten
Virus verabreicht werden oder gleichzeitig mit dem Virus. In einigen
Ausgestaltungen wird das die Freisetzung verstärkende Agenz mit dem Virus
verabreicht, indem eine Virus-Präparation mit
einer Agenz-Zusammensetzung, die die Freisetzung verstärkt, kurz
vor Verabreichung an den Patienten gemischt wird. In anderen Ausgestaltungen
werden das die Freisetzung verstärkende
Agenz und das Virus dem Pfleger in einem gemeinsamen Gefäß für die Verabreichung
geliefert.
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Im
Falle einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein in einem rekombinanten
adenoviralen Vektorfreisetzungssystem enthaltenes Tumorsuppressorgen
aufweist, das in einen Puffer formuliert ist, der außerdem ein
Agenz umfasst, das die Freisetzung verstärkt, kann die pharmazeutische
Zusammensetzung über einen
Zeitraum im Bereich von ungefähr
5 Minuten bis 3 Stunden verabreicht werden, bevorzugt ungefähr 10 Minuten
bis 120 Minuten, und besonders bevorzugt ungefähr 15 Minuten bis 90 Minuten.
In einer anderen Ausgestaltung kann das die Freisetzung verstärkende Agenz
vor Verabreichung des rekombinanten adenoviralen Vektorfreisetzungssystems,
das das Tumorsuppressorgen enthält,
verabreicht werden.
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Die
vorgezogene Verabreichung des die Freisetzung verstärkenden
Agenz kann im Bereich von ungefähr
30 Sekunden bis 1 Stunde, bevorzugt ungefähr 1 Minute bis 10 Minuten,
und besonders bevorzugt ungefähr
1 Minute bis 5 Minuten vor der Verabreichung des rekombinanten adenoviralen
Vektorfreisetzungssystems, das das Tumorsuppressorgen enthält, geschehen.
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Die
Konzentration des die Freisetzung verstärkenden Agenz wird von einer
Reihe von Faktoren, die dem Fachmann bekannt sind, abhängen, wie
z. B. dem jeweils spezifisch verwendeten, die Freisetzung verstärkenden
Agenz, dem Puffer, dem pH, dem Zielgewebe oder -Organ, und der Art
der Verabreichung. Die Konzentration des die Freisetzung verstärkenden
Agenz wird sich im Bereich von 1% bis 50% (v/v), bevorzugt 10% bis
40% (v/v), und besonders bevorzugt 15% bis 30% (v/v) bewegen. Bevorzugt
wird die Konzentration des Detergents in der finalen Rezeptur, die
den Patienten verabreicht wird, ungefähr das 0,5–2-fache der kritischen Mizellbildungskonzentration
(CMC) betragen. Eine bevorzugte Konzentration von Big CHAP beträgt ungefähr 2–20 mM,
besonders bevorzugt ungefähr
3,5–7
mM.
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Der
Puffer, der das die Freisetzung verstärkende Agenz enthält, kann
jeder pharmazeutische Puffer sein, wie z. B. phosphatgepufferte
Salzlösung,
oder Natriumsphosphat/Natriumsulfat, Tris-Puffer, Glycinpuffer, steriles
Wasser und andere Puffer, die dem Fachmann bekannt sind, wie z.
B. jene, die durch von Good et al. (1966) in Biochemistry 5: 467
beschrieben worden sind. Der pH des Puffers in der pharmazeutischen
Zusammensetzung, die das in dem rekombinanten adenoviralen Vektorfreisetzungssystem
enthaltene Tumorsuppressorgen aufweist, kann im Bereich zwischen
6,4–8,4
liegen, bevorzugt 7–7,5,
und besonders bevorzugt 7,2–7,4.
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Eine
bevorzugte Rezeptur für
die Verabreichung eines rekombinanten Adenovirus enthält etwa 109–1011 PN/ml Virus, etwa 2–20 mM Big CHAP oder etwa 0,1–1,0 mM
TRITON®X-100-Detergenz
in phosphatgepufferte Salzlösung
(PBS), sowie etwa 2–3%
Sucrose (w/v) und etwa 1–3
mM MgCl2, bei einem pH von etwa 6,4–8,4.
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Der
Begriff "verstärkend" beschreibt die erhöhte Freisetzung
des therapeutischen Gens, wie z. B. eines Tumorsuppressorgens, in
das karzinöse
Gewebe oder Organ. Die erhöhte
Freisetzung eines therapeutischen Gens, wie z. B. eines Tumorsuppressorgens,
kann mit verschiedenen Mitteln gemessen werden, z. B. in dem die
Expression des Tumorsuppressorgens im Vergleich zu Expressionslevels
gemessen wird, die sich einstellen, wenn das Tumorsuppressorgen
in einem adenoviralen Vektorfreisetzungssystem mit einem Puffer, der
kein die Freisetzung verstärkendes
Agenz enthält,
freigesetzt wird.
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Beispiele
für therapeutische
Gene sind Tumorsuppressorgene und das Suizidgen Thymidinkinase. Beispiele
für Tumorsuppressorgene
schließen
p53, das Retinoblastom-Gen, entweder in voller Länge (p110RB) oder
als Fragmente, wie z. B. p94RB or p56RB), und p16 ein, sind aber nicht darauf
limitiert. Andere therapeutische Gene schließen CFTR, für Cytokine codierende Gene
(wie die Interferone α, β, γ, δ und die
Interleukine IL-4, IL-10 und IL-2) GM-CSF und alle anderen Gene
ein, die für
Proteine kodieren, die ein therapeutisches Potenzial bei der Behandlung
von nicht karzinösen
Erkrankungen der Blase aufweisen, wie z. B. Cystitis. In einigen
Ausgestaltungen der Erfindung codiert das therapeutische Gen für Antisense-RNA.
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In
einigen Ausgestaltungen enthalten die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
eine therapeutisch wirksame Menge eines therapeutischen Gen, wie
z. B. eines Tumorsuppressorgen, in einem rekombinanten viralen Vektorfreisetzungssystem,
in einem Puffer, der ein die Freisetzung verstärkendes Agenz enthält. Der
hier benutzte Begriff "therapeutisch
wirksam" bezieht
sich auf die Vermeidung, Verminderung oder Heilung von Symptomen,
die mit einem Krankheitsstatus einhergehen.
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Gemäß der Lehre
der vorliegenden Erfindung werden therapeutisch wirksame Mengen
der pharmazeutischen Zusammensetzung mit einem therapeutischen Gen,
wie z. B. p53 oder dem Retinoblastom-Tumorsuppressorgen, in einem
rekombinanten viralen Vektorfreisetzungssystem, das in einem Puffer
formuliert ist, der ein die Freisetzung verstärkendes Agenz enthält, verabreicht.
Therapeutisch wirksame Mengen des Retinoblastom-Tumorsuppressorgens
in dem rekombinanten viralen Vektorfreisetzungssystem, das in einem
Puffer formuliert ist, der ein die Freisetzung verstärkendes
Agenz enthält,
liegen im Bereich von ungefähr
1 × 108 Partikel/ml bis 1 × 1012 Partikel/ml,
typischerweise ungefähr
1 × 108 Partikel/ml bis 5 × 1011 Partikel/ml,
besonders typisch 1 × 109 Partikel/ml bis 1 × 1011 Partikel/ml
(PN/ml).
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Die
Zusammensetzungen dieser Erfindung können außerdem einen Stabilisator,
Verstärker
oder andere pharmazeutisch akzeptable Carrier oder Träger enthalten.
Ein pharmazeutisch akzeptabler Carrier kann einen physiologisch
akzeptablen Bestandteil enthalten der z. B. wirkt, indem er das
rekombinante virale Vektorfreisetzungssystem, das das Tumorsuppressorgen
enthält,
stabilisiert.
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Ein
physiologisch akzeptabler Bestandteil kann z. B. Kohlenhydrate,
wie z. B. Glucose, Sucrose oder Dextrane, Antioxidantien, wie z.
B. Ascorbinsäure
oder Glutathion, Chelatbildner, niederkulare Proteine oder andere
Stabilisatoren oder Arzneistoffträger umfassen. Andere physiologisch
akzeptable Bestandteile umfassen Feuchthaltemittel, Emulgatoren,
Dispergiermittel oder Konservierungsstoffe, die besonders nützlich für die Verhinderung
von Wachstum oder Aktivität
von Mikroorganismen sind. Es sind verschiedene Konservierungsstoffe
wohlbekannt, einschließlich
z. B. Phenol und Ascorbinsäure.
Ein Fachmann weiß,
dass die Auswahl eines pharmazeutisch akzeptablen Carriers vom Weg
der Verabreichung und den besonderen physio-chemischen Eigenschaften
des rekombinanten adenoviralen Vektorfreisetzungssystem und dem
jeweiligen darin enthaltenen Tumorsuppressorgen abhängig ist.
Beispiele für
Carrier, Stabilisatoren oder Hilfsstoffe finden sich in Martin,
Remington's Pharm.
Sci., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton, Pa. 1975), dessen Offenbarungsgehalt durch
die Bezugnahme in diese Schrift aufgenommen wird.
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Das
rekombinante virale Vektorfreisetzungssystem, das ein therapeutisches
Gen enthält
und in einem Puffer formuliert ist, der ein die Freisetzung verstärkendes
Agenz enthält,
kann in jedem karzinösen
Gewebe oder Organ freigesetzt werden, in em jede Freisetzungsmethode,
die dem normal ausgebildeten Fachmann bekannt ist, verwendet wird,
beispielsweise intratumorale oder intravesikuläre Verabreichung. Karzinöse Gewebe
und Organe umfassen jedes Gewebe oder Organ, das eine Epithel-Membran
aufweist, wie z. B. den Gastrointestinaltrakt, die Blase, die Atemwege
und die Lunge. Beispiele umfassen Karzinome der Blase und der oberen
Atemwege, der Vulva, des Gebärmutterhalses,
der Vagina oder der Bronchien; lokale metastatische Tumoren des
Bauchfells, bronchio-alveolare Karzinome, pleurale metastatische
Tumore, Karzinome des Mundes und der Mandeln, Karzinome des Nasopharynx,
der Nase, des Kehlkopfs, der Speiseröhren, des Magens, des Dickdarms
und des Rektums, der Gallenblase, oder der Haut, oder Melanome,
sind aber nicht hierauf begrenzt.
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Das
erfindungsgemäße die Freisetzung
verstärkende
Agenz kann auch verwendet werden, um andere pharmazeutische Agenzien,
wie z. B. Proteine, Nukleinsäuren,
Antisense-RNA, kleine Moleküle,
etc. für
die Verabreichung an jedes Gewebe oder Organ mit einer Epithel-Membranen
zu formulieren.
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Die
folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, aber
den Schutzbereich nicht einschränken.
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Experimentelle
Beispiele
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Beispiel 1
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Ethanol verbessert
den Gentransfer in der Blase
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Anfängliche
Experimente haben gezeigt, dass verschiedene Faktoren einschließlich der
Viruskonzentration, der Zeit der Verabreichung, und dem Volumen der
Dosierung den Gentransfer in das Blasenepithel nach intravesikulärer Verabreichung
an Ratten beeinflussen können.
Da durch intravesikuläre
Verabreichung verschiedener Lösungsmittel
eine erhöhte
Eindringtiefe von Farbstoffen erreicht werden kann, wurde auch eine
Veränderung
der Adenovirus-Rezeptur
als alternative Strategie zur Erhöhung der Adenovirus-Transgen-Expression in der
Blase untersucht (Monson et al. Urology 145: 842–845 (1991)). Die ersten Experimente richteten
sich auf die Verwendung von Ethanol zur Erhöhung der Adenovirus-Transgen-Expression
in der Blase.
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Neun
weibliche Buffalo-Ratten (Harlan Sprague Dawley) wurden mit Isofluran
anästhesiert
und erhielten eine intravesikuläre
Verabreichung eines menschlichen rekombinanten Adenovirus, der für das lacZ-Gen (rAd-βgal) codiert.
Der menschliche rekombinante Adenovirus, der für das lacZ-Gen (rAd-βgal) codiert,
wird in Wills et al. Human Gene Therapy 5: 1079–1088 (1994) beschrieben. Vor
der Verabreichung wurden die Blasen mit PBS gespült und entleert. rAd-βgal wurde
dann verdünnt,
um eine finale Konzentration von 1.7 × 1011 PN/ml in
1) VPBS (2% (w/v) Sucrose und 2 mM MgCl2 in
PBS), 2) 30% (v/v) Ethanol, oder 3) 50% (v/v) DMSO, zu erreichen,
und wurde in einem Volumen von 250 μl verabreicht (N = 3 Tiere/Gruppe).
Die verabreichte Zusammensetzung verblieb für 45 Minuten in der Blase.
Die Blase wurde dann mit PBS gespült, und die Tiere konnten sich
von der Behandlung erholen. Zwei Tage nach der Verabreichung wurden
die Ratten getötet,
die Blasen wurden entnommen, fixiert und die ganzen Organe wurden
mit einer X-Gal(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactosid)-Lösung gefärbt, um
den Reportergen-Transfer auszuwerten. X-Gal-gefärbte Gewebe wurden dann in
Paraffin eingebettet, geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin gegengefärbt. Die
Hydrolyse von X-Gal durch β-Galactosidase
führt zu
einer blauen Farbe, die auf dem oberflächlichen luminalen Blasenepithel auftritt.
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In
den Blasen aller Tiere, die mit rAd-βgal behandelt wurden, wurde
im Anschluss an die Freisetzung durch den adenoviralen Vektor eine
Transgen-Expression
beobachtet, nicht jedoch in den unbehandelten Kontrolltieren. Die
Transgen-Expression war ähnlich
zu bereits veröffentlichten
Ergebnissen, für
die die PBS/Sucrose-Rezeptur verwendet wurde (Bass et al. Cancer
Gene Therapy 2: 2: 97–104
(1995)). In scharfen Gegensatz dazu war die β-Galaktosidase-Expression in
der luminalen Epithel-Oberfläche
bei Tieren, die rAd-βgal
verdünnt
in 30% Ethano erhalten hatten, wesentlich verstärkt (1). Die
in 1 beschriebenen Blasen-Proben wurden eingebettet, geschnitten
und mit Hämatoxylin
und Eosin gegengefärbt.
Die histologische Auswertung des Blasengewebes zeigte eine erhöhte β-Galaktosidase-Expression
des geschnittenen Blasenepithels, wenn der Adenovirus-Rezeptur Ethanol
beigefügt
war (2). Die Wechselwirkung von Ethanol mit der schützenden
Glykosaminoglykan-Schicht (GAG) auf der Epithel-Oberfläche stellt einen Mechanismus
für den
beobachteten Anstieg der Transgen-Expression dar. Das Aufbrechen dieser
Schicht kann die Wechselwirkung zwischen Virus und Zelle auf der
Oberfläche
erleichtern und möglicherweise
das Eindringen in die Submucosa verstärken.
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Beispiel 2
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Dosis-abhängige Transgen-Expression
in der Blase der Ratte
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In
einem anderen Experiment wurden 18 weibliche Sprague-Dawley-Ratten
mit Isofluran anästhesiert und
erhielten einen intravesikulären
Bolus (0.5 ml) rAd-βgal
in Konzentrationen von 2 × 107, 2 × 108, 2 × 109, 2 × 1010, und 2 × 1011 PN/ml
in einer 22.5%igen (v/v) Ethanol-Rezeptur. Nach einer 45-minütigen Inkubation wurden
die Blasen mit PBS gespült,
und die Tiere konnten sich von der Behandlung erholen. Zwei Tage
später wurden
die Ratten getötet,
die Blasen wurden entnommen, fixiert und die ganzen Organe wurden
mit X-Gal-Lösung
gefärbt,
um die Adenovirus-Transgen-Expression
auszuwerten. Die β-Galaktosidase-Expression
im luminalen Blasenepithel korrelierte mit der Konzentration des
verabreichten rekombinanten Adenovirus (3). Zwischen
den Tieren, die 2 × 1010 oder und 2 × 1011 PN/ml
erhielten, wurden keine wesentlichen Unterschiede beobachtet, was
für eine
Sättigung
der Transgen-Expression in diesem Modell spricht. Die Analyse des
entnommenen Flüssigkeitsvolumens
nach der Verabreichung zeigte bei diesen hohen Dosen lediglich eine
geringe Reduktion des infektiösen
Titers der verabreichten Substanz. Die Expression der β-Galaktosidase
nahm bei geringeren Konzentrationen ab. Bei Tieren mit einer Dosierung
von 1 × 107 PN/ml und bei einem unbehandelten Kontrolltier
wurde kein Hinweis auf eine β-Galaktosidase-Aktivität gefunden.
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Beispiel 3
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ACNRB Gentransfer
in die Blase der Maus
-
Um
die Expression des RB-Transgens spezifisch auszuwerten, wurde eine
Pilot-Studie mit einem RT-PCR-Assay durchgeführt. Der rekombinante Adenovirus,
der in dieser Studie verwendet wurde, basierte auf dem menschlichen
Serotyp 5-Adenovirus,
aus dem die frühe
virale Region 1, die für
E1a, E1b und pIX-Proteine codiert, entfernt worden war. Dieser Adenovirus
ist beschränkt
auf die Fortpflanzung in 293 Zellen, die die Ad5 E1-Genprodukte,
die für
die Replikation erforderlich sind, produzieren. Transfer-Plasmide,
die entweder für
vollständiges
oder trunkiertes RB kodieren, wurden aus pACN (Wills et al. Cancer
Gene Therapy 2: 191–197
(1995)) erzeugt und wurden einer nach dem anderen verwendet, um
die rekombinanten Adenoviren zu konstruieren. Dazu wurde entweder
eine vollständige
RB-cDNA (1–928
Aminosäuren),
die als ein 2,8 kB Xba1-BamH1-Fragment aus dem Plasmid pETRbc (Huang
et al. Nature 350: 160–162
(1991)) subkloniert wurde, oder ein trunkiertes Fragment (Aminosäuren 381–928), das
als ein 1,7 kB Xba1-BamH1-cDNA-Fragment subkloniert
wurde, stromabwärts
des CMV-Promotor/Emhancer und der dreiteiligen Ad2-leader-cDNA des Plasmids
pACN angeordnet. Diese Plasmide wurden anschließend mit EcoR1 linearisiert
und entweder mit dem isolierten, durch Cla1 verdauten großen Fragment
aus H5ilE4 (Hemstrom et al. J Virol. 62: 3258–3264 (1988)) cotransfiziert
(CaPO4, Stratagene), um Ad-RB56 (ACN 56) mit einer partiellen E4-Deletion
zu erhalten, oder mit dem großen
Fragment aus einem Hybrid-Virus
aus d1327 (Ginsberg et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3823–3827 (1980))
und H5ilE4, um Ad-Rb110 (ACNRB) zu erhalten, der Deletionen sowohl
in der E3- als auch
in der E4-Region des Vektors enthält.
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Acht
weibliche ICR-Mäuse
(Charles River Laboratories) wurden mit Avertin anästhesiert,
und jede erhielt eine intravesikuläre Verabreichung (80 μl) ACNRB.
ACNRB (4 × 1011 PN/ml) wurde verdünnt und in einer PBS-Lösung oder
einer 30%igen (v/v) Ethanollösung
formuliert. Nachdem der Virus für
45 min in der Blase war, konnten sich die Tiere entleeren und erholen.
Die Mäuse
wurden 2 beziehungsweise 14 Tage nach ACNRB-Verabreichung getötet, und
die Blasen, Lebern und Nieren jedes Tieres wurden entnommen, homogenisiert
und für
die Analyse verarbeitet (N = 2 Tiere/Gruppe). Die Transgen-Expression
wurde mit einem für ACNRB
spezifischen Primer mittels RT-PCR bestimmt. Genauer gesagt wurden
Primer hergestellt, um ACNRB zu identifizieren und die Region zwischen
dem 3'-Ende der
CMV-Sequenz und dem 5'-Ende
der RB-Sequenz zu amplifizieren. Nach der Amplifikation (30 Zyklen)
wurden die RT-PCR-Produkte auf einem 10%igen Polyacrylamid-Gel,
das mit Etidiumbromid gefärbt
wurde, getrennt und fotografiert. Eine erhöhte ACNRB-Expression wurde nach Behandlung mit
ACNRB in 30%igem (w/v) Ethanol beobachtet, im Vergleich zu einer
sehr geringen Expression nach Behandlung mit ACNRB in VPBS. Die
Positivkontrollen für
den Assay umfassten Proben aus ACNRB-infizierten menschlichen 5637
Blasenkrebs-Zellen (KONTROLLE). RNA-Proben aus Blasen von ACNRB-infizierten
Tieren, die mit Primern amplifiziert wurden, die spezifisch für beta-Aktin sind,
lieferten eine interne Kontrolle für die Qualität der RNA.
Unbehandelte Proben und Blasenproben ohne die Reverse Transkriptase
(RT) lieferten Kontrollen für
kontaminierende DNA. Zwei Tage nach der Verabreichung wurden ACNRB-Expressionraten
in den Blasenhomogenaten von Tieren, die ACNRB in 30%igem Ethanol
erhalten hatten, festgestellt (4). In nicht-Blasengewebe
oder in Proben, die 14 Tage nach der Verabreichung entnommen worden
waren, wurde kein Hinweis auf Expression festgestellt.
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Beispiel 4
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Kinetik der
Biodistribution und ACNRB-Expression nach intravesikulärer Verabreichung
an Mäuse
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Um
den Zeitverlauf der Expression nach intravesikulärer Verabreichung zu untersuchen,
wurden 40 weibliche Mäuse
(Charles River Laboratories) mit Avertin anästhesiert und erhielten einen
intravesikulären
Bolus (0.80 μl)
ACNRB (4 × 1010 PN/ml in 22%igem (v/v) Ethanol). Die verabreichte
Zusammensetzung verblieb für
45 Minuten in der Blase, und die Tiere konnten sich von der Behandlung
erholen. Die Mäuse
wurden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, und 14 Tage nach der Verabreichung für die Analyse
getötet
(N = 4/Zeitraum). Blasen, Lebern und Nieren wurden entnommen und
in flüssigen
Stickstoff für
die anschließende
Analyse schockgefroren. Für
die Detektion der ACNRB-Expression wurden Gewebeproben homogenisiert
und die Gesamt-RNA mit TRI-Reagent® extrahiert.
Ein Aliquot der Gesamt-RNA wurde in einem RT-PCR-Assay mit für ACNRB
spezifischen Primern amplifiziert, um die Transgen-Expression von
der endogenen Expression zu unterscheiden. Für die Detektion der ACNRB-DNA
wurde ein DNA-Extraktionskit (Stratagene) für Gewebehomogenate verwendet.
Die PCR wurde mit den für
ACNRB spezifischen Primern durchgeführt, wie es oben für die RT-PCR-Analyse
beschrieben ist.
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Eine
transgene ACNRB-Expression in den Blasenhomogenaten nur in solchen
Proben entdeckt, die an den Tagen 1–6 entnommen worden waren,
wobei die Expression relativ zum endogenen p53 mit der Zeit abnahm
(5, obere Abbildung). In Proben, die 7 und 14 Tage
nach der Verabreichung entnommen worden waren, wurde keine Expression
entdeckt. Interessanterweise wurde eine geringe ACNRB-Expression
in den Nieren der Tage 1, 2 und 3 entdeckt, allerdings wurde in
der Leber keine Expression beobachtet (5, untere Abbildungen).
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ACNRB-DNA
wurde in Blasengewebe aller Tiere, die ACNRB erhielten, entdeckt,
einschließlich
derer, die 14 Tage nach Verabreichung entnommen worden waren (6,
linke Abbildung). Auch in den Nierenhomogenaten wurde DNA gefunden,
was die in diesem Gewebe entdeckte ACNRB-Expression bestätigt (6, rechte
Abbildung). In Leberproben, die während der Studie entnommen
worden waren, wurde kein Hinweis auf ACNRB-DNA gefunden (Daten nicht
gezeigt). Proben aus einem unbehandelten Tier (U) und gereinigte ACNRB-DNA
(PC) dienten als Negativ- bzw. 25 Positivkontrollen.
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Da
die systemische Verabreichung von rekombinanten Adenoviren hauptsächlich in
einer Transgen-Expression in der Leber resultiert (Li et al. Human
Gene Therapy 4: 403–409
(1993)), spricht die Abwesenheit von ACNRB-DNA und Expression in
Leberproben (5 und 6) für eine zu
vernachlässigende systemische
Einwirkung von ACNRB nach intravesikulärer Verabreichung. Ein Rückfluss
durch die Harnleiter kann zur Detektion von ACNRB in der Niere beigetragen
haben.
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Die
oben gezeigten Daten zeigen eine Transgen-Expression in der Blase
von Nagetieren nach intravesikulärer
Verabreichung von ACNRB. Diese Untersuchungen zeigen weiterhin,
dass der Adenovirus-vermittelte Gentransfer in das Blasenepithel
durch die Anwesenheit eines die Freisetzung verstärkenden
Agenz, wie z. B. Ethanol, in der Rezeptur verstärkt werden kann. Ein Mechanismus
für den
erhöhten
Gentransfer kann das Aufbrechen der schützenden Glykosaminoglykan-Schicht
auf der Epithel-Oberfläche
der Blase sein. Eine einzige inravesikuläre Verabreichung von ACNRB
in einer 20–30%igen
(v/v) Ethanol-Rezeptur führt
zu einer Transgen-Expression
in der Blase, die für
ungefähr
eine Woche andauert. Ein Rückfluss
durch die Harnleiter ist eine mögliche
Erklärung
für die
zeitweilige Expression von ACNRB in der Niere. Das Fehlen der ACNRB-Expression
und ACNRB-DNA in der Leber spricht für eine begrenzte systemische
Einwirkung von ACNRB nach intravesikulärer Verabreichung.
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Beispiel 5
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Verwendung
von Detergenz-Rezepturen
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Um
Nebenwirkungen zu minimieren, ohne Verluste bei der Wirksamkeit
des Gentransfers hinzunehmen, wurden andere Hilfsstoffe getestet.
Es ist bekannt, dass Detergenzien mit Zellmembranen interagieren und
große
Löcher
ausbilden, ohne die Zellen weiter zu beschädigen. Die Wirksamkeit von
rekombinanten Adenoviren, die in weniger toxischen Detergenzien
formuliert waren, wurde in Gentransfer-Modellen an der Ratte und
Maus untersucht.
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Um
die Wirksamkeit des Gentransfers in das Blasenepithel auszuwerten,
wurde rAd-βgal
in verschiedene Detergenzien bei deren kritischer Mizellbildungskonzentration
formuliert. Weibliche Ratten (ungefähr 200 g b/w, Harlan Sprague
Dawley) wurden mit Isofluran anästhesiert
und erhielten eine intravesikuläre
Verabreichung rAd-βgal
(1 × 1011 PN/ml) in verschiedenen Detergenz-Rezepturen
(siehe Tabelle 1). Vor der Verabreichung wurden die Blasen mit PBS
gespült
und entleert. rAd-βgal
wurde dann in einem Volumen von 0.5 ml verabreicht. Die verabreichte
Lösung
blieb 45 Minuten in der Blase. Die Blasen wurden dann mit PBS gespült, und
die Tiere konnten sich von der Behandlung erholen. 48 h später wurden
die Ratten getötet,
die Blasen entnommen und in Formalin fixiert. Nach der Fixierung
wurden die Blasen durch einen Längsschnitt
geöffnet, so
dass das Urothel dem Farbstoff (X-Gal) ausgesetzt wurde, der in
eine blaue Farbe umgewandelt wird, wenn eine Expression des Reportergens
(β-Galaktosidase)
vorliegt. Die luminale Epithel-Oberfläche der
gesamten Blase wurde fotografiert, und die blaue Färbung ausgewertet:
+ (minimale Färbung),
++ (mäßige Färbung); +++
(intensive Färbung,
die die gesamte Epithel-Oberfläche
der Blase bedeckt). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Einige
der anionischen Detergenzien (Taurodeoxycholat), zwitterionischen
Detergenzien (CHAPS, ZWITTERGENT® und
nichtionischen Detergenzien (Big CHAP, TRITON®-X-100)
verstärkten
den Gentransfer wesentlich. Kationische Detergenzien und einige
der nichtionischen Detergenzien (PLURONIC®-F68, TWEEN® 20)
hatten keine vergleichbaren Effekte. Im allgemeinen gingen Verbesserungen
des Gentransfers mit Cystitis einher. Zwitterionische Detergenzien
erleichterten die Bildung von Blasensteinen.
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Mögliche Erscheinungsformen
der Cystitis, die bei Verwendung von Ethanol beobachtet wurden,
wurden bei Mäusen
mit einer 7 mM Big CHAP (2 × CMC)
oder 0,05 mM TRITON®-X-100-Detergenz-Rezeptur (CMC)
untersucht. Rezepturen wurden intraversikuär mit einem Volumen von 80 μl verabreicht,
und die Tiere wurden 7 Tage lang beobachtet. Nach der Tötung wurden
die Blasen in Paraffin eingebettet, geschnitten und mit Hämatoxylin
und Eosin für
die pathologische Auswertung gefärbt.
Bei Mäusen,
die mit Big CHAP behandelt worden waren, wurde nur eine schwache
Makrophagen-Infiltration in das Blasengewebe beobachtet. TRITON®-X-100
verursachte eine deutlichere Makrophagen-Infiltration (schwach bis
mittel). In scharfem Kontrast dazu wurde bei Mäusen, die mit 22%igem Ethanol
behandelt wurden, eine deutliche Cystitis festgestellt.
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Beispiel 6
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Gentransfer
von ACNRB
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Zusätzlich zu
den Experimenten mit dem Reportergen wurde eine andere Versuchsreihe
durchgeführt, um
den Gentransfer von ACNRB spezifisch auszuwerten. Weibliche ICR-Mäuse wurden
mit Avertin anästhesiert,
und jede Maus erhielt eine intravesikuläre Verabreichung (80 μl) ACNRB.
ACNRB (4 × 1010 PN/ml) war in VPBS, 22%iger (v/v) Ethanollösung oder
3 mM Big CHAP formuliert. Nachdem der Virus für 45 min in der Blase war,
konnten sich die Tiere erholen. Die Mäuse wurden 48 h nach ACNRB-Verabreichung
getötet,
und die Blasen wurden in flüssigen
Stickstoff schockgefroren.
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Die
Transgen-Expression wurde mittels RT-PCR bestimmt. Die Gewebe wurden
in RNAse-freiem Wasser gespült,
homogenisiert, in Tri-Reagenz (Molecular Research Center) verdaut
und die gesamte zelluläre
RNA extrahiert. ACNRB wurde mit einem 5'-Primer, der in der CMV-Region des ACNRB-Vektors
beheimatet war, sondiert, und ein 3'-Primer saß am 5'-Ende des Rb-Genoms. Die RT-PCR wurde
im Perkin Elmer 9600 GeneAmp PCR System durchgeführt. Die Zyklus-Bedingungen
waren 10 min bei 65°C,
8 min bei 50°C und
5 min bei 95°C.
32 PCR-Zyklen wurden durchgeführt,
wobei jeder Zyklus aus 30 s bei 94°C, 30 s bei 58°C und 30
s bei 72°C
bestand. Der 32igste Zyklus beinhaltete einen 10-minütigen Elongationsschritt
bei 72°C,
um eine vollständige
Verlängerung
unvollständiger
DNA-Fragmente zu garantieren. ACNRB-RNA-Banden wurden mit Etidiumbromid
gefärbt.
Die Ergebnisse, nämlich
eine verstärkte
Expression bei Verwendung einer Ethanol- oder Big CHAP-Rezeptur,
sind in 9 gezeigt.
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Beispiel 7
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Big CHAP verbessert
die Transgen-Expression bei minimaler Cystitis
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Da
Big CHAP die Transgen-Expression bei minimaler Cystitis verbessert,
wurde diese Rezeptur für weitere
Untersuchungen ausgewählt,
einschließlich
Konzentration- und Dosis-Abhängigkeit
in Studien, die ähnlich
den oben beschriebenen waren. Anästhesierten
weiblichen Ratten wurde rAd-βgal
(1 × 1011 PN/ml) über einen intravesikulären Katheter
in die Blase verabreicht. rAd-βgal
war in verschiedenen Konzentrationen von Big CHAP formuliert. Ein
Volumen von 0.5 ml wurde injiziert und Verblieb für 45 Minuten
in der Blase. Die Tiere wurden 48 h später getötet, die Blasen in 4% Formalin/Glutaraldehyd
fixiert, durch einen Längsschnitt geöffnet und
die β-Galaktosidase-Enzymaktivität mit X-Gal-Substrat
gemessen. Die Intensität
der Blaufärbung korreliert
mit der β-Gal-Transgen-Expression.
Die Abbildung zeigt die Epithel-Oberfläche X-Gal-gefärbter Blasen.
Die Ergebnisse weisen auf einen konzentrations-abhängigen Anstieg
des Gentransfers in das Epithel hin. Die 3.5–7 mM-Konzentration des Big
CHAP verbesserte den Gentransfer wesentlich. Die Rezeptur alleine (7,
untere Abbildung) löste
keine Blaufärbung
des X-Gal-Substrats aus. Eine höhere
Konzentration (17,5 mM) erhöhte
den Gentransfer oder die Expression nicht erkennbar, löste jedoch
in einigen der getesteten Tiere Cystitis aus.
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Die
Wirkungen höherer
Konzentrationen des rekombinanten Adenovirus wurden ebenfalls getestet. Anästhesierten
weiblichen Ratten wurden unterschiedliche Konzentrationen an Big
CHAP formuliertem rAd-βgal über einen
intravesikulären
Katheter in die Blase verabreicht. Die Tiere wurden 48 h später getötet, die
Blasen in 4% Formalin/Glutaraldehyd fixiert, durch einen Längsschnitt
geöffnet
und mit X-Gal gefärbt. 8 zeigt
einen konzentrationsabhängigen
Anstieg des Gentransfers in das Epithel. Eine Konzentration von 1,3 × 1011 PN/ml induzierte einen maximalen Gentransfer.
Eine höhere
Konzentration (6,5 × 1011 PN/ml) erhöhte die Blaufärbung nicht
erkennbar. Bei geringeren Konzentrationen an rAd-βgal, 1,3 × 1010 PN/ml, oder 1,3 × 109 PN/ml,
nahm die Transgen-Expression dosisabhängig ab. Beim Vergleich zwischen
3,5 und 7 mM-Rezepturen war die β-Galaktosidase-Expression ähnlich,
obwohl die verstärkte
Wirkung bei Tieren, die mit der 7 mM Big CHAP-Rezeptur behandelt
worden waren, stärker
reproduzierbar erschien.
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Beispiel 8
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Transgen-Expression
in Tumoren mit einer Big CHAP-Rezeptur
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Da
sich die ursprünglichen
Untersuchungen auf Tiere mit intakten Blasenepithel konzentriert
hatten, wurde der durch den Adenovirus vermittelte Gentransfer in
einem Tiermodell, bestehend aus einem transitionalen Zellkarzinom,
ebenfalls untersucht. In männlichen
Fisher-Ratten wurden Tumoren durch sechsmonatige Hinzufügung von
0,05% BBN zum Trinkwasser induziert. rAd-βgal (1 × 1011 PN/ml),
das in 4 mM Big CHAP oder VPBS formuliert war, wurde für 45 min
durch direkte Injektion in die Blase verabreicht. Die β-Gal-Expression
wurde 48 h nach der Behandlung untersucht. Im Einklang mit früheren Experimenten,
bei denen tumorfreie Tiere verwendet wurden, war der Gentransfer
ins Tumorgewebe bei der Big CHAP-Rezeptur im Vergleich zu der VPBS-Rezeptur
verbessert (10).
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Der
Gentransfer des rAD, das das p53-Gen trug (rAD-p53) (Wills et al.
Human Gene Therapy 5: 1079–1088
(1994)), wurde ebenfalls in diesem Tiermodell für Blasenkrebs untersucht. In
weiblichen Fisher-Ratten wurden Blasentumoren durch dreimonatige
Hinzufügung
von 0,05% BBN (N-Butyl-N-(4-Hydroxybutyl)-Nitrosamin) zum Trinkwasser
induziert. rAD-p53 (1 × 1011 PN/ml) war in 7 mM Big CHAP formuliert.
Unter Isofluran-Anästhesie
wurde für
die Verabreichung ein Katheter (24 G) in die Blase geschoben. rAD-p53
wurde der Blase für
45 min verabreicht. Die Tiere konnten sich dann von der Anästhesie
erholen. 24 h später
wurden die Tiere getötet,
und die Blase in Formalin fixiert. Nach Einbettung in Paraffin und
schneiden wurde die p53-Expression mittels Immunohiostochemie mit
dem p53ES-Kit (Oncogene) und AEC (AEC-Kit, Vector Labs) als Substrat
untersucht. Die Gewebe wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt. 12 zeigt
die p53-Genexpression im Oberflächenbereich
des proliferierenden Epithels (linke Abbildung) und die Kernfärbung für die p53-Expression
bei stärkerer
Vergrößerung (rechte
Abbildung). In unbehandelten Tieren wurde keine Färbung im
Tumorgewebe beobachtet.
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Beispiel 9
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Big CHAP verbessert
die Transgen-Expression in Schweine-Urothel
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Um
Volumina zu simulieren, die für
klinische Untersuchungen erwartet werden, wurde die 7 mM Big CHAP-Rezeptur
in Zusammenarbeit mit der SPRI Drug Safety and Metabolism Group
an einem chronisch katheterisierten adulten Schweinemodell getestet.
rAd-βgal
(1 × 1011 PN/ml) wurde in VPBS oder 7 mM Big CHAP formuliert.
Ein Volumen von 50 ml wurde über
den Katheter in die Blasen der bei Bewusstsein befindlichen Tiere
injiziert. Die verabreichte Substanz verblieb dort für 2 h. Die
Tiere wurden 48 h später
getötet,
und eine mittige Sektion der Blase wurde entnommen und für die β-Galaktosidase-Expression
gefärbt.
Im Vergleich zu dem mit VPBS-behandelten Schwein wurde bei dem mit
7 mM Big CHAP behandelten Schwein eine Zunahme der Intensität der Genexpression
beobachtet (11). Die histologische Untersuchung
zeigte eine Transduktion mehrerer Epithelschichten bei Verwendung
von Big CHAP (linke Abbildung), aber nur eine oberflächliche Transduktion
bei Verwendung des VPBS-Puffers (rechte Abbildung).
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Beispiel 10
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Gentransfer
in Darmepithel bei Ratten
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Eine
leichte Modifikation des Verfahrens von Sandberg et al. (Human Gene
Therapy 5: 1161–1168 (1994))
wurde verwendet, um Abschnitte aus dem Ratten-Ileum für die Transfer-Studien vorzubereiten.
Weibliche Sprague-Dawley-Ratten wurden mit Isofluran anästhesiert.
Die Bauchhöhle
wurde geöffnet
und ein rostral vom Peyerschen Plaque gelegenes Ileum-Segment wurde
isoliert. Das Segment (ungefähr
3 cm) wurde sorgfältig
von Speiseresten gereinigt, und beide Seiten wurden mit atraumatischen
Gefäßklemmen
verschlossen. 0,5 ml rAd-βgal
(1 × 1011 PN/ml) wurden mit einer 24 G-Nadel direkt
in das Segment injiziert und wurden dort für 45 min inkubiert. rAd-βgal war in
10 mM Taurodeoxycholat (in steril filtriertem, destilliertem Wasser) (Testgruppe
1) oder VPBS (Testgruppe 2) formuliert. Eine dritte Testgruppe umfasste
Tiere, die mit 10 mM Taurodeoxycholat behandelt worden waren. Anschließend wurden
die Klemmen entfernt und eine lockere Seidennaht wurde zur Wiedererkennung
bei der späteren
Autopsie an beiden Enden befestigt.
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Der
Bauchhöhlenschnitt
wurde geschlossen und die Tiere konnten sich in ihrem Käfigen erholen.
48 h später
wurden die Tiere getötet.
Das infizierte Segment und ein Kontrollsegment wurden entnommen
und für die
X-Gal-Färbung
des gesamten Organs fixiert.
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Die
Ergebnisse sind in 13 gezeigt. Das Ausmaß der X-Gal-Blaufärbung zeigte
das Vorhandensein der Transgen-Expression in den Ileum-Abschnitten.
Für die
Detergenz-Rezeptur war ein verstärkter
Gentransfer erkennbar (mittlere Abbildung).
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Alle
Publikationen und Patentanmeldungen, die in dieser Anmeldung zitiert
sind, werden durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit in den Offenbarungsgehalt
dieser Schrift aufgenommen, so als ob für jede einzelne Publikationen
oder Patentanmeldung angegeben wäre,
dass sie durch die Bezugnahme aufgenommen wurde.