DE69719312T2

DE69719312T2 - Verfahren und vorrichtung zur behandlung durch komplexierung eines wässrigen milieus

Info

Publication number: DE69719312T2
Application number: DE69719312T
Authority: DE
Inventors: Frederic Ginot
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1996-10-04
Filing date: 1997-10-06
Publication date: 2004-02-12
Anticipated expiration: 2017-10-07
Also published as: US6218116B1; WO1998015832A1; EP0882233A1; CA2239499C; DE69719312D1; EP0882233B1; CA2239499A1; FR2754344A1; ATE233404T1; JP2000502458A; JP3843134B2; FR2754344B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Behandlung eines flüssigen Milieus durch Komplexierung, wobei das flüssige Milieu eine oder mehrere Komponenten enthält, die das Vorhandensein einer Vielzahl oder Vielfalt von in freiem Zustand befindlichen verschiedenen Liganden in dem flüssigen Medium bestimmen.
Nachfolgend werden in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen die folgenden Definitionen verwendet:
Unter "Ligand" wird jegliche Entität oder jegliches Molekül chemischer, biochemischer oder biologischer Natur verstanden, das auf verschiedene Art und Weise an eine andere Entität oder anderes Molekül, genannt "Anti-Ligand", über eine oder mehrere nicht-kovalente Bindungen binden kann.
Aus dieser Definition ergeben sich insbesondere verschiedene biologische oder biochemische Entitäten, insbesondere Biopolymere, die miteinander und auf komplementäre Art und Weise einen Komplex ausbilden können:

– es handelt sich beispielsweise um ein Polypeptid, insbesondere einen Antikörper (Ligand), der spezifisch an ein Epitop oder Antigen (Anti-Ligand) binden kann, oder umgekehrt,
– es handelt sich außerdem, wie beispielsweise in der nachfolgenden Beschreibung gezeigt, um jegliche Nukleinsäure oder jegliches Nukleinsäurematerial, das in einzelsträngiger Form auf komplementäre Art und Weise an ein Oligonukleotid oder Polynukleotid binden kann.

Die Reaktion oder das Gleichgewicht von chemischer Natur, über die bzw. das der Ligand bindet oder sich paart, wird nachfolgend mit dem Begriff "Komplexierung" bezeichnet. Das Produkt dieser Reaktion oder dieses Gleichgewichts wird nachfolgend mit dem Begriff "Komplex" bezeichnet. Handelt es sich um Nukleinsäurematerial oder um ein Nukleinsäuremakromolekül, dann kann der Komplex nachfolgend mit dem Begriff "Duplex" bezeichnet werden.
Unter "Nukleinsäurematerial" oder "Nukleinsäure" wird jegliches Makromolekül verstanden, das zumindest eine lineare nicht-verzweigte Verkettung von jeweils modifizierten oder nicht-modifizierten Nukleotiden aufweist. Aus dieser Definition ergeben sich selbstverständlich jegliche modifizierte oder nicht-modifizierte Desoxyribonukleinsäure, und jegliche modifizierte oder nicht-modifizierte Ribonukleinsäure. Ein solches Makromolekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig vorliegen oder auch jegliche andere Sekundär- oder Tertiärkonformation aufweisen. Üblicherweise und beispielsweise wird in der nachfolgenden Beschreibung das Nukleinsäurematerial ein solches sein, das direkt der Behandlung unterzogen wird, oder ein solches sein, von dem ausgehend ein flüssiges Milieu erhalten wird, das den oder die Liganden enthält, um anschließend gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt zu werden.
Unter "Oligonukleotid" wird jegliches Polynukleotid verstanden, das zumindest fünf Monomere und vorzugsweise sieben, beispielsweise acht Monomere aufweist, die aus einer natürlichen Nukleinsäure oder auch einer im Bereich von zumindest einem der Grundelemente, nämlich dem Zucker, der Stickstoffbase oder auch der Phosphatgruppe, modifizierten Nukleinsäure gebildet werden.
Unter "Träger" wird jegliches Substrat verstanden, auf dessen Oberfläche auf definitive Art und Weise, direkt oder indirekt, Anti-Liganden sowohl auf kovalente als auch auf nicht-kovalente Art und Weise immobilisiert oder befestigt werden können.
Das Substrat ist selbsttragend, beispielsweise eine dünne Platte eines inerten und transparenten Materials, oder wird selbst von einer steifen Basis getragen, beispielsweise eine Acrylamidschicht auf einer dünnen Glasplatte.
Unter "Oberfläche" wird die für die Anti-Liganden zugängliche Oberfläche des Substrats verstanden, wobei es sich um ein ausgefülltes Substrat oder um ein poröses Substrat handelt, bei dem die wirkliche ausgebildete Oberfläche größer ist als die sichtbare Oberfläche.
In der nachfolgenden Beschreibung und beispielsweise bilden die Oligonukleotide die zuvor definierten Anti-Liganden.
Die Komplexierungsreaktion zwischen einem Nukleinsäurematerial oder Nukleinsäure einerseits und einem komplementären Oligonukleotid andererseits, kann nachfolgend mit dem Begriff "Hybridisierung" bezeichnet werden.
Gemäß dem Dokument WO-92/10558 und WO-93/22680 und gemäß eines als "reverser Dotblot" bezeichneten Bio-Essay-Formats wird ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Behandlung eines flüssigen Milieus durch Komplexierung, nämlich Hybridisierung in Gegenwart einer Nukleinsäureprobe beschrieben, die eine oder mehrere Nukleinsäurekomponenten enthält, die das Vorhandensein einer Vielzahl von in freiem Zustand befindlichen verschiedenen Nukleinsäurefragmenten, -sequenzen oder -segmenten (Liganden) bestimmen. Die Hauptanwendung dieser Behandlung ist die Sequenzierung der Nukleinsäureprobe durch Hybridisierung gemäß bekannter Prinzipien und gemäß bekannter Methode, die in den Dokumenten (6) und (7) dargestellt sind.
Gemäß diesem Verfahren:

a) wird ein Träger für mehrfache Komplexierung vom Typ Biochip bereitgestellt, auf dem eine Vielzahl von voneinander getrennten diskreten Kopplungsstellen oder -zonen angeordnet sind, an denen eine Vielzahl von jeweils verschiedenen Oligonukleotiden (Anti-Liganden) immobilisiert sind, die dazu in der Lage sind, mit der oder den komplementären Nukleotidsequenzen des bzw. der Nukleinsäurefragmente zu komplexieren;
b) wird unter isothermen Bedingungen an jeder Kopplungsstelle das flüssige Milieu oder die Nukleinsäureprobe mit dem Träger für die Komplexierung in Kontakt gebracht, wodurch sich die freien Nukleotidsequenzen mit den jeweils fixierten Oligonukleotiden paaren, und auf diese Art an den Träger für mehrfache Komplexierung fixiert werden;
c) wird an den verschiedenen Kopplungsstellen des Trägers für mehrfache Komplexierung ein für das Vorhandensein und/oder der Menge der verschiedenen erhaltenen Komplexe oder Hybriden repräsentative Größe beobachtet, um Signale und/oder Informationen zu generieren, die für das Vorhandensein und/oder die Menge der verschiedenen Nukleotidsequenzen in dem flüssigen Ausgangsmilieu repräsentativ sind; diese Komplexe werden vorzugsweise beobachtet, indem eine Markierung der Komponente oder Komponenten der Nukleinsäureprobe oder eine Markierung der verschiedenen erhaltenen und an den Träger fixierten Hybride durchgeführt wird.

Wie zuvor erwähnt, arbeitet dieses Verfahren unter vollständig isothermen Bedingungen, d. h. indem jede Kopplungsstelle bei gleicher Hybridisierungstemperatur zum Zeitpunkt des InKontakt-Bringens des flüssigen Milieus mit dem Träger für mehrfache Komplexierung, und/oder zum Zeitpunkt des Waschens des Trägers nach der Hybridisierung bereitgestellt wird.
Gemäß dem Dokument EP 0 535 242 wird ein ähnliches Verfahren beschrieben und vorgeschlagen, das gleichermaßen unter isothermen Bedingungen arbeitet, und nach dem an jeder Kopplungsstelle die Konzentration an entsprechendem und für diese Stelle spezifischem Oligonukleotid in Abhängigkeit der Arbeitstemperatur gewählt wird, um die Stabilität des entsprechenden Komplexes zu begünstigen, der mit der komplementären Nukleotidsequenz erhalten wird.
Gemäß diesem Dokument wird diese Konzentration gewählt, indem die prozentualen Anteile der Komplementärnukleotidsequenz beobachtet werden, die bei einem Waschschritt eluiert wird, der mit einer Waschflüssigkeit durchgeführt wird, deren Temperatur variiert wird, und die von dem Wash mit dem Wärmegradient nicht korrekt qualifiziert wird.
Diese zuvor beschriebenen Lösungen führen zu einer technischen Schwierigkeit, die in dem Dokument WO-92/10588 identifiziert ist, jedoch nicht gelöst wird. Tatsächlich ändert sich bei einer vorbestimmten Hybridisierungstemperatur und für eine bestimmte Sequenzlänge des Oligonukleotids (Anti-Ligand) die Stabilität des durch Hybridisierung einer Nukleinsäuresonde mit deren Komplementärzielsequenz erhaltenen Komplexes mit dieser Sequenz. So unterscheiden sich zwei Oligonukleotide in nichts weiter als in einem der Nukleotide, nämlich einem T in dem einen Fall und einem G in dem anderen Fall; obwohl diese dieselbe Länge und ähnliche Sequenzen aufweisen, hybridisieren sie mit ihren jeweiligen Komplementärnukleinsäuren nicht mit gleicher Stabilität. Mit anderen Worten, da die Stabilität der erhaltenen Komplexe von der Temperatur abhängt, muss die Probennukleinsäure mit den Sondenoligonukleotiden, die von dem Träger zur mehrfachen Komplexierung getragen werden, bei einer ausreichend niedrigen Temperatur zur Ausbildung von möglichst stabilen Komplexen hybridisieren, auf die Gefahr hin, nach der Hybridisierung Falsch-Negative, d. h. Sondenoligonukleotide, zu erhalten, die kein Hybridisierungssignal erzeugen, obwohl deren Komplementärsequenz in der Probe vorhanden ist. Geht man jedoch so vor, gelangt man zu Sondenoligonukleotiden, die ausreichend stabile Komplexe mit nicht perfekt komplementären Sequenzen ausbilden; in einem solchen Fall werden dann Falsch-Positive enthalten, d. h. Sondenoligonukleotide, die ein Hybridisierungssignal erzeugen, obwohl deren Komplementärsequenzen nicht in der Nukleinsäureprobe vorhanden sind.
Da diese Falsch-Negativen und diese Falsch-Positiven infolgedessen Fehler in die "Analyse" der Nukleinsäureprobe einbringen, ist die zuvor beschriebene technische Lösung insbesondere für eine Sequenzierung durch Hybridisierung oft nicht verwendbar.
Die vorliegende Erfindung hat folglich zum Gegenstand, die Zuverlässigkeit einer Behandlung durch Komplexierung, insbesondere Hybridisierung, wie zuvor beschrieben, zu erhöhen.
Diese Erfindung geht von der Erkenntnis aus, nach der die Stabilität oder Zuverlässigkeit eines jeden Komplexes aus Ligand und Anti-Ligand direkt oder indirekt von zumindest einem exogenen Parameter abhängt, nachfolgend Referenz genannt, und der den Träger für mehrfache Komplexierung konditioniert.
Unter "exogenem Parameter" wird ein Parameter oder eine in Bezug auf den Liganden und/oder den Anti-Liganden extrinsische, d. h. eine von diesen unabhängige Bedingung, verstanden.
Ein solcher exogener Referenzparameter, der den Träger für mehrfache Komplexierung konditioniert oder konditionieren kann, ist beispielsweise:

– ein physikalischer Parameter oder eine physikalische Bedingung, der bzw. die an den Träger angelegt werden kann, beispielsweise die Temperatur,
– oder ein chemischer, biochemischer oder biologischer Parameter oder eine entsprechende Bedingung, der bzw. die an der Oberfläche dieses Trägers vorherrscht oder verfügbar ist, beispielsweise die Oberflächenkonzentration von einem Anti-Anti-Liganden, der sich praktisch mit sämtlichen Anti-Liganden paaren kann,
– oder auch ein physiko-chemischer Parameter, der auf der Oberfläche des Trägers eingestellt wurde, beispielsweise dessen Benetzbarkeit oder Oberflächenspannung in Bezug auf das flüssige Milieu.

Handelt es sich um einen Liganden vom Typ Nukleinsäure und um einen Anti-Liganden vom Typ Oligonukleotid, so versteht man beispielsweise unter exogenem Parameter auch jeglichen Parameter oder jegliche Charakteristik, die nicht zu den Nukleotidsequenzen der Nukleinsäure und/oder des Oligonukleotids gehört, und die sich beispielsweise in ihren jeweiligen Gehalten an irgendeiner der Nukleinsäurestickstoff-Elementarbasen unterscheiden.
Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich danach durch die Verbindung der beiden folgenden Eigenschaften:

– einerseits werden auf dem gesamten Träger, beispielsweise auf dessen gesamter Oberfläche, die Kopplungsstellen in Abhängigkeit des endogenen Referenzparameters differenziert, der an den verschiedenen Kopplungsstellen jeweils verschiedene Werte hat,
– und die Anti-Liganden werden in Abhängigkeit der vorbestimmten Optimalwerte des exogenen Referenzparameters, die insbesondere die Stabilität der jeweils verschiedenen Komplexe aus Liganden und Anti-Liganden bestimmen, auf die verschiedenen Kopplungsstellen verteilt.

Gemäß der vorliegenden Erfindung arbeitet folglich jede Kopplungsstelle auf dem Träger für mehrfache Komplexierung, an den ein entsprechender Anti-Ligand immobilisiert wird, bei einem Optimalwert des exogenen Referenzparameters in Bezug auf die Stabilität des Komplexes aus Ligand und entsprechendem Antiligand, und dieser Optimalwert kann sich von dem Optimalwert von zumindest einer direkt benachbarten Kopplungsstelle unterscheiden.
Dank der Erfindung wird eine besonders zuverlässige präzise und empfindliche Methode zur mehrfachen Komplexierung erhalten, die außerdem ein gutes Auflösungsvermögen hat.
Unter "Kopplung" wird jegliche kovalente oder nicht-kovalente Verbindung verstanden, die es ermöglicht, auf dauerhafte Art und Weise einen Anti-Liganden an der Oberfläche des Trägers zu immobilisieren.
Die vorliegende Erfindung wird gemäß verschiedener Formate von Bio-Essays durchgeführt, beispielsweise durch direkte Komplexierung oder durch Kompetitionskomplexierung.
Die Erfindung wird ggf. gemäß einem "Sandwich"-Format durchgeführt, bei dem der Ligand zugänglich ist, um sich mit dem fixen Anti-Liganden zu paaren, und bei dem sich eine Probe in dem flüssigen Milieu in freiem Zustand befindet.
Als bevorzugtes Beispiel werden drei verschiedene zweckmäßige Modalitäten gewählt:

– gemäß einer ersten Modalität wird das In-Kontakt-Bringen des flüssigen Milieus mit dem Träger für die Komplexierung durchgeführt, indem der gleiche Minimalwert des exogenen Referenzparameters angelegt wird, wobei dieser Minimalwert ausreichend ist, um praktisch sämtliche Liganden mit den Anti-Liganden zu komplexieren; anschließend wird der Träger gewaschen, indem an die verschiedenen Kopplungsstellen während des einzigen Waschschrittes jeweils verschiedene und vorbestimmte Werte des exogenen Referenzparameters angelegt werden,
– gemäß einer zweiten Modalität wird dasselbe In-Kontakt-Bringen des Trägers mit dem flüssigen Milieu durchgeführt, indem an verschiedene Kopplungsstellen erste, jeweils verschiedene und vorbestimmte Werte des exogenen Referenzparameters angelegt werden; dann wird der Träger gewaschen, wobei die verschiedenen Kopplungsstellen auf jeweils verschiedenen, vorbestimmten zweiten Werten des exogenen Referenzparameters gehalten werden; die ersten Werte sind identisch oder verschieden zu den jeweiligen zweiten Werten des exogenen Referenzparameters;
– gemäß einer dritten Modalität erfolgt das In-Kontakt-Bringen des Trägers mit dem flüssigen Milieu, indem an verschiedene Kopplungsstellen während des einzigen Schrittes der Komplexierung oder Hybridisierung jeweils verschiedene und vorbestimmte Werte des exogenen Referenzparameters angelegt werden, anschließend wird der hybridisierte Träger mit einer

Waschflüssigkeit bei einer vergleichsweise kühlen und konstanten Temperatur gewaschen.
Selbstverständlich ist in einer Detektionsmethode vom so genannten homogenen Typ ein Waschschritt nicht unentbehrlich.
Die erste zuvor definierte Modalität setzt voraus, dass an jeder Kopplungsstelle die Menge oder Konzentration des Anti-Liganden ausreichend ist, um einerseits mit sämtlichen wirklich komplementären Liganden des betroffenen Liganden, und andererseits mit sämtlichen solcher Liganden komplexieren zu können, die sich auf kompetitive oder parasitäre Art mit dem selben Anti-Liganden paaren können.
Vorzugsweise wird auf dem Träger für mehrfache Komplexierung längs wenigstens einer Referenzrichtung des Trägers, beispielsweise im Fall eines rechteckigen Trägers seiner Länge nach, eine räumliche, insbesondere sich auf dem Boden befindliche Abstufung etabliert, beispielsweise ein Gradient des exogenen Referenzparameters. Und folglich legt diese räumliche Abstufung die Position oder Anordnung der verschiedenen Kopplungsstellen mit der Verteilung der Anti-Liganden auf die jeweils verschiedenen Kopplungsstellen fest.
Als Variante oder Ergänzung zu der vorliegenden Erfindung werden die Kopplungsstellen auf den Trägern für mehrfache Komplexierung in Funktion eines anderen exogenen Referenzparameters differenziert, der an den Kopplungsstellen ebenfalls verschiedene Werte hat, und andererseits werden die Anti-Liganden auf die verschiedenen Kopplungsstellen ebenfalls in Funktion von vorbestimmten Optimalwerten des anderen exogenen Referenzparameters verteilt, wodurch gleichfalls die Stabilität der verschiedenen Komplexe aus Ligand und jeweiligem Anti-Ligand bestimmt wird.
Ein anderer exogener Parameter, von dem die Stabilität der verschiedenen Komplexe aus Ligand und Anti-Ligand abhängt, wird auf einen mittleren Wert innerhalb der Werte des genannten anderen Parameters gesetzt, die für die Stabilität der verschiedenen Komplexe aus Ligand und jeweiligem Anti-Ligand erforderlich sind. Dieser andere exogene Parameter ist beispielsweise der pH-Wert oder die Ionenstärke des flüssigen Milieus, das mit dem Träger für mehrfache Komplexierung in Kontakt gebracht wurde, ein von der Zusammensetzung des Hybridisierungspuffers abhängiger Parameter.
Der im Hinblick auf seine verschiedenen Kopplungsstellen erfindungsgemäß gestaltete und konditionierte Träger für mehrfache Komplexierung wird vorzugsweise für die Detektion und/ oder Quantifikation von Liganden eingesetzt.
Zu diesem Zweck werden mehrere Modalitäten berücksichtigt:

– es wird an verschiedenen Kopplungsstellen des Trägers, insbesondere durch Abtastung, eine Größe erfasst, die für das Vorhandensein und/oder die Quantität der verschiedenen Komplexe aus Ligand und Anti-Ligand repräsentativ ist, um Signale und/oder Informationen zu erhalten, die repräsentativ für das Vorhandensein und/oder die Quantität der verschiedenen Liganden in dem flüssigen Ausgangsmilieu sind
– vorzugsweise werden die verschiedenen Komplexe aus Ligand und Anti-Ligand erfasst, indem wenigstens eine der folgenden Operationen durchgeführt wird, nämlich Markierung des oder der Komponenten des flüssigen Milieus, und Markierung der verschiedenen, auf dem Träger fixierten Komplexe aus Ligand und Anti-Ligand.

Klassischerweise wird das flüssige Milieu, das mit dem Träger in Kontakt gebracht wird, ausgehend von einer Probe, beispielsweise einer biologischen Probe oder einem biologischen Material, erhalten, einer Analyse unterzogen, und enthält eine oder mehrere verschiedene Entitäten; dies erfolgt gemäß zweier Modalitäten:

– die Probe wird direkt gemäß dem zuvor definierten Verfahren behandelt, insbesondere direkt durch direktes In-Kontakt-Bringen mit dem Träger für mehrfache Komplexierung,
– oder die Probe wird wenigstens einer vorherigen Behandlung unterzogen, die ausgewählt ist, um in dem behandelten flüssigen Milieu eine oder mehrere Komponenten zu erhalten, die identisch zu oder direkt abgeleitet von jeweils verschiedenen Entitäten und für letztere repräsentativ sind.

Klassischerweise wird der Träger für die Komplexierung, auf dem die verschiedenen Liganden fixiert sind, ggf. noch wenigstens einer Folgebehandlung unterzogen, wie einem Waschvorgang, die ausgewählt ist, um von dem genannten Träger die Komponente oder die Komponenten zu trennen, die nicht komplexiert wurden, oder jene, die mit den Anti-Liganden instabile Komplexe gebildet haben, und/oder um die verschiedenen Ligan den, ggf. auf unterschiedliche Weise, zu eluieren oder auszusalzen.
Ein bevorzugter, jedoch nicht ausschließlicher Bereich der Anwendung der vorliegenden Erfindung betrifft die Behandlung und Analyse von Nukleinsäureprodukten oder -verbindungen. In diesem Fall ist der Ligand eine Nukleinsäure, die eine freie, insbesondere einzelsträngige Zielnukleotidsequenz aufweist, die für eine Hybridisierung mit einer anderen komplementären fixen oder fixierten Nukleotid-Sondensequenz zugänglich ist, die ein entsprechender Anti-Ligand aufweist.
Für ein Nukleinsäurematerial umfasst das flüssige Milieu bevorzugterweise stets eine einzige Komponente, nämlich eine Nukleinsäure, die jeweils verschiedene Liganden umfasst oder aufweist, nämlich mehrere Hybridisierungsregionen oder -segmente, wodurch die selbe Komponente mit jeweils verschiedenen Anti-Liganden gepaart wird, nämlich entsprechenden Oligonukleotiden. Folglich bestimmt in diesem Fall die Nukleotidabfolge in zumindest einem Abschnitt der Nukleinsäure eine Vielzahl von Hybridisierungsregionen, und folglich von Liganden, in Übereinstimmung mit den Nukleotid-Zielsequenzen, die jeweils komplementär zu den Nukleotid-Sondensequenzen der Anti-Liganden sind.
Die erfindungsgemäßen Behandlungen, die auf Nukleotid- oder Nukleinsäureprodukte oder -verbindungen angewendet wurden, werden beispielsweise wenigstens in einer der nachfolgenden Anwendungen eingesetzt, nämlich Sequenzierung der Nukleinsäurekomponente des flüssigen Mediums durch Hybridisierung, Resequenzierung der gleichen Nukleinsäurekomponente, Kartographie von Nukleinsäurematerial, Analyse und Identifizierung eines Nukleinsäurematerials oder einer Nukleinsäureprobe, Typisierung eines Nukleinsäurematerials, Trennung von Nukleinsäurematerial, genetische Analyse (vgl. beispielsweise Bibliographiereferenz 8), Detektion eines bakteriellen oder viralen pathogenen Agens.
Eine Anwendung der Erfindung ist die Sequenzierung eines Nukleinsäurematerials durch Hybridisierung, insbesondere indem Überlappungssequenzen dieses Materials bestimmt werden. Die Prinzipien dieser Sequenzierung und deren Modalitäten wurden in den Publikationen (6) und (7) beschrieben. Die Analyse und die Verarbeitung der Informationen, die so erhalten wurden, um die Nukleotidsequenz eines Nukleinsäurematerials zu rekonstruieren, wurde in den Publikationen (9) und (10) beschrieben.
Eine weitere Anwendung der Erfindung ist die Identifizierung von Mikroorganismen oder von Genen, die mit einem Mikroorganismus assoziiert sind, durch Bestimmung eines Hybridisierungsprofils, ohne zwingende Rekonstitution der Sequenzen.
Für sämtliche dieser Anwendungen wird das flüssige Milieu ausgehend von einer Nukleinsäureprobe erhalten, die ein einziges und identisches Nukleinsäurefragment, oder mehrere verschiedene Nukleinsäurefragmente enthält. Und die Nukleinsäureprobe wird ggf. zumindest einer vorherigen Behandlung unterzogen, die aus den folgenden Behandlungen ausgewählt ist, nämlich Denaturierung, Lyse, Fragmentierung, Klonierung und Amplifizierung.
Zwei verschiedene Fälle der erfindungsgemäßen Behandlung müssen berücksichtigt werden:

– in einem ersten Fall enthält das flüssige Medium eine oder mehrere verschiedene Komponenten, die jeweils verschiedene Liganden aufweisen, wodurch diese verschiedenen Komponenten fixiert und voneinander getrennt werden, und gewissermaßen auf dem Träger für mehrfache Komplexierung aufgelöst werden; diese Modalität wird wenigstens in einer der folgenden Anwendungen eingesetzt, nämlich Identifizierung, Quantifizierung, Separation und Fraktionierung von verschiedenen Komponenten;
– in einem weiteren Fall enthält das flüssige Milieu eine einzige Komponente, die selbst mehrere, jeweils verschiedene Liganden umfasst oder aufweist, wodurch die gleiche Komponente mit jeweils verschiedenen Liganden gepaart wird.

Eine Vorrichtung zur erfindungsgemäßen Behandlung umfasst:

– einen Träger für mehrfache Komplexierung, auf dem, beispielsweise in Form einer Matrize, eine Vielzahl von voneinander getrennter Kopplungsstellen verteilt oder angeordnet sind, an denen eine Vielzahl von jeweils verschiedenen Anti-Liganden immobilisiert sind, die dazu geeignet sind, mit den jeweiligen genannten Liganden zu komplexieren,
– ein Mittel zum Kontaktieren des flüssigen Milieus mit dem genannten Träger, das dazu angeordnet ist, um die genannten Liganden mit den jeweiligen genannten Anti-Liganden zu paaren und sie auf dem genannten Träger zu fixieren.

Diese Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, dass sie einerseits außerdem Mittel zur Differenzierung der Kopplungsstellen auf dem Träger in Funktion des exogenen Referenz parameters mit den jeweils verschiedenen Werten des Parameters an diesen Stellen aufweist, und andererseits die Anti-Liganden auf dem Träger auf die verschiedenen Kopplungsstellen in Funktion von vorbestimmten Optimalwerten des exogenen Referenzparameters verteilt sind, wodurch die Stabilität der verschiedenen Komplexe aus Ligand und jeweiligem Anti-Ligand bestimmt wird.
Vorzugsweise, jedoch nicht ausschließlich, ist der reservierte exogene Referenzparameter die Temperatur, wobei die Mittel für die Differenzierung angeordnet sind, um die Temperatur längs wenigstens einer Referenzrichtung abzustufen, z. B. längs eines Temperaturgradienten. In diesem Fall umfasst die Vorrichtung vorzugsweise eine Kältequelle und eine Wärmequelle, zwischen denen sich der Träger längs der Referenzrichtung erstreckt.
Beispielsweise umfasst eine solche Vorrichtung einen einzigen oder mehrere Sensoren, die jeweils verschiedenen Kopplungsstellen des Trägers zugeordnet sind, der wenigstens eine beobachtete Größe erfasst, die repräsentativ für das Vorhandensein und/oder die Quantität des Komplexes aus Ligand und Anti-Ligand an jeder Kopplungsstelle ist, sowie ein oder mehrere Messsignale oder entsprechende Informationen liefert.
Beispielsweise umfasst die Vorrichtung einen einheitlichen Sensor, der sich selbst aus multiplen Grundsensoren zusammensetzt, beispielsweise eine CDD-Kamera, oder einen einzigen Sensor, der die Oberfläche des Trägers für die mehrfache Komplexierung absucht.
Zur Analyse oder Sequenzierung eines Nukleinsäurematerials umfasst die gleiche Vorrichtung beispielsweise eine Einheit zur Bearbeitung von von den verschiedenen Sensoren gelieferten Signalen gemäß vorbestimmter mathematischer und/oder logischer Operationen, oder ist mit dieser verbunden, um eine oder mehrere Informationen zu erhalten, die für die Komponente oder die Komponenten des flüssigen Milieus kennzeichnend sind.
Die erfasste Größe für das Vorhandensein und/oder die Quantität des Komplexes aus Ligand und Anti-Ligand ist beispielsweise Lichtabsorption oder Intensität von emittiertem oder re-emittiertem Licht (beispielsweise Fluoreszenz, Lumineszenz), Intensität einer ionisierenden Strahlung, oder jegliche physikalische, optische, elektrische oder dielektrische oder elektrochemische Eigenschaft der verschiedenen Komplexe aus Ligand und Anti-Ligand, beispielsweise Lichtbrechung, nukleare magnetische Resonanz, Veränderung des Kontaktwinkels, elektrische Leitfähigkeit, Voltammetrie, Amperiometrie, Impedanzmessung.
In einer Ausführungsform umfasst der Träger für mehrfache Komplexierung eines der folgenden inerten Materialien, nämlich Glas, glasartiges Material, poröses Material, anorganisch oder amorph, und Plastikmaterial.
Wenn es sich um einen Biochip handelt, werden dieser Träger und die Kopplungsstellen nach herkömmlichen Techniken der Photolithographie erhalten (vgl. Publikation Nr. 11).
Die vorliegende Erfindung wird nun bezüglich der Behandlung von Nukleinsäure oder Nukleinsäurematerial beispielhaft gemäß dem nachfolgenden detaillierten Versuchsprotokoll beschrieben, wobei auf die beigefügte Zeichnung Bezug genommen wird, in der
die 1a bis 1d das Ergebnis der isothermen Hybridisierungen bei 4°C, 10°C, 20°C bzw. 25°C für die Oligonukleotide und Nukleinsäurefragmente darstellen, die abgekürzt auf den Abszissen identifiziert sind; auf den Ordinaten sind die relativen Werte der erfassten Größe aufgetragen, nämlich das Licht, das über Fluoreszenz von den verschiedenen erhaltenen Komplexen re-emittiert wurde; die ausgefüllten Balken repräsentieren perfekte Paarungen, und die nicht-ausgefüllten Balken repräsentieren externe Misspaarungen;
2 schematisch eine Schnittperspektive einer erfindungsgemäßen Behandlungsvorrichtung darstellt;
3 schematisch eine Draufsicht auf die in 2 dargestellte Vorrichtung darstellt;
4 die Ansicht der Behandlungskavität der in den 2 und 3 dargestellten Vorrichtung bei vergrößertem Maßstab darstellt;
5 eine Draufsicht der in den 2 und 3 dargestellten Vorrichtung darstellt, begrenzt auf die mit Instrumenten ausgestattete Behandlungs- und Messkavität;
6 die Veränderung der erfassten Größe (Fluoreszenz) in Funktion der Temperatur für verschiedene Komplexe aus Nukleinsäurefragment und Oligonukleotid, die in der rechts neben dieser Figur dargestellten Legende identifiziert werden, darstellt;
7 für eine Trägerplatte für mehrfache Komplexierung, die bezüglich der Kavität gemäß der 2 und 3 angepasst und insbesondere in 4 dargestellt ist, die Bereitstellung der Kopplungsstellen entlang der Breite oder Höhe dieser Platte, jedoch auch entlang ihrer Länge in Funktion der ausgewählten Oligonukleotide darstellt;
8 auf analoge Art und Weise wie in den 1a bis 1d unter den selben Konventionen wie in den oben genannten Figuren die Hybridisierung darstellt, die mit den Nukleinsäurefragmenten und Oligonukleotiden, die auf der Abszisse identifiziert sind, und die mit einem erfindungsgemäßen Träger für mehrfache Komplexierung erhalten wurde.
VERSUCHSPROTOKOLL
Nach folgendem Plan:
I – Aufzeigen des Problems, auf dem die vorliegende Erfindung basiert

1.1 Auswahl der Oligonukleotide (Anti-Liganden)
1.2 Synthese der Oligonukleotide
1.3 Methode zum Aufpfropfen der Oligonukleotide
1.4 Hybridisierungen und Visualisierung der Fluoreszenz der Komplexe
1.5 Ergebnisse der Hybridisierung bei isothermen Temperaturen

II – Lösung des Problems mittels eines Trägers für mehrfache Komplexierung, dessen Kopplungsstellen sich entlang eines thermischen Gradienten unterscheiden

2.1 Beschreibung der erfindungsgemäßen Vorrichtung, die das Anlegen eines thermischen Gradienten ermöglicht
2.2 Positionierung der Oligonukleotide bei ihrer vorbestimmten Optimaltemperatur für die Hybridisierung
2.3 Ergebnisse der erfindungsgemäßen Hybridisierung im thermischen Gradienten
2.4 Extrapolation auf das Funktionieren eines "Biochips" universeller Oligonukleotide

I – Aufzeigen des Problems, auf dem die vorliegende Erfindung basiert
1.1 Auswahl der Oligonukleotide (Anti-Liganden)
Um die Schwierigkeiten aufzuzeigen, die bei einer herkömmlichen Hybridisierung von Nukleinsäuren (Liganden) mit auf der Oberfläche eines festen Trägers immobilisierten Oligonukleo tiden aufgetreten sind, wurden in diesem Analysetyp repräsentative Modelloligonukleotide ausgewählt.
Die Länge der ausgewählten Oligonukleotide beträgt 8 Basen: dies ist eine Länge, die für eine Anwendung des Sequenzierungstyps durch Hybridisierung für gewöhnlich zulässig ist (Bibliographiereferenzen 1 und 2).
Es wurden drei mit B, D und J bezeichnete Basissequenzen ausgewählt. Diese sind durch Unterschiede in der Stabilität der entsprechenden doppelsträngigen DNAs gekennzeichnet. Sequenz B, reich an den Nukleotiden A und T, bildet mit deren Komplementärsequenz einen relativ instabilen Duplexkomplex aus. Andererseits bildet Sequenz J, reich an den Nukleotiden C und G, mit deren Komplementärsequenz einen relativ stabilen Duplex aus. Sequenz D, die genauso viel Nukleotide A und T wie Nukleotide C und G enthält, bildet mit deren Komplementärsequenz einen Duplex von mittlerer Stabilität aus. Es ist möglich, die relativen Stabilitäten der doppelsträngigen Oligodesoxyribonukleotide annäherungsweise vorherzusagen, indem das Modell des nächsten Nachbarn von Breslauer und Koll. (vgl. Bibliographiereferenz 3) verwendet wird. Dieses Modell ermöglicht es, für jeden Duplex und bei jeder Temperatur die freie Bindungsenergie in Funktion von dessen Sequenz zu berechnen.
Ausgehend von diesen drei Basissequenzen (mit B, D und J bezeichnet, siehe unten) wurden sieben weitere Sequenzen bestimmt, die mit einfachen Variationen den Sequenzen B, D oder J entsprechen.
Dies sind diese 10 Oligonukleotide, die auf einen festen Träger für die mehrfache Komplexierung immobilisiert wurden. Sie enthalten an ihrem 5'-Ende eine für ihre Immobilisierung notwendige Biotingruppe (siehe § 1.3, unten). In der nachstehenden Tabelle sind die drei Basissequenzen fett geschrieben. Unter der Rubrik "Bemerkung" bezeichnet das Suffix "c" die Komplementärsequenz.
6 fluoreszierende Oligonukleotide (markierte Liganden) wurden mit diesen immobilisierten Oligonukleotiden hybridisiert. Es handelt sich um zu den drei Basissequenzen komplementäre Oligonukleotide, und deren sich durch ein terminales Nukleotid unterscheidende Varianten. Sie enthalten an ihrem 5'-Ende ein Fluoreszin.
1.2 – Synthese der Oligonukleotide
Die mit Biotin und Fluoreszin markierten Oligonukleotide wurden nach dem Koppeln der aktivierten Biotin- und Fluoreszinderivate mit den funktionalisierten Oligonukleotiden durch einen Aminoarm -(CH₂)₆-NH₂- in 5'-Position erhalten.
1.2.1 – Synthese der Oligonukleotide
Die Aminooligonukleotide wurden auf einem ABI 394-Gerät (Applied Biosystems, Forster City, CA) nach der Phosphoramidit-Methode synthetisiert, indem das vom Hersteller angegebene Protokoll verwendet wurde. Sämtliche Reagenzien, einschließlich des Phosphoramiditvorläufers des Aminoarmes, wurden von Applied Biosystems geliefert. Nach der Abspaltung des Trägers und der Deprotektion wurden die Oligonukleotidsequenzen durch Zugabe einer Natriumacetatlösung (3 M) und kaltem Ethanol (–20°C) präzipitiert.
1.2.2 – Synthese des am 5'-Ende biotinylierten Oligonukleotidkonjugats
Das Aminooligonukleotid wird getrocknet und anschließend in einer 0,2 M Natriumcarbonatpuffer-Lösung, 0,15 M NaCl (pH 8,8) solubilisiert. Anschließend wird eine Lösung von Biotin (Biotinoylamidocapronsäure-N-hydroxysuccinimid-Ester, BOEHRINGER) in DMF (5 mg/l) zugegeben. Nach zweistündiger Inkubation bei 37°C wird die Reaktion durch Zugabe von 10 Mikrolitern Ammoniumchloridlösung (1 M) geblockt. Das biotinylierte Oligonukleotid wird anschließend bei –80°C in Ethanol und Natriumacetat (3 M) präzipitiert, in reinem Wasser solubilisiert, anschließend mittels Reverse-Phase-HPLC gereinigt. Seine Konzentration wurde mittels UV-Messung bei 260 nm bestimmt.
1.2.3 – Synthese des am 5'-Ende mit Fluoreszin konjugierten Oligonukleotids
Das Aminooligonukleotid wird getrocknet, anschließend in einer 0,2 M Natricumcarbonatpufferlösung, 0,15 M NaCl (pH 8,8) solubilisiert. Eine Lösung von Fluoreszinisothiocyanat (ALDRICH) in DMF (12,5 mg/l) wird anschließend zugegeben. Nach zweistündiger Inkubation bei 55°C wird die Reaktion durch Zugabe von 25 Mikrolitern einer Ammoniumchloridlösung (1 M) blockiert. Das fluoreszierende Oligonukleotid wird anschließend präzipiert und wie oben angegeben gereinigt. Seine Konzentration wird mittels UV-Messung bei 260 nm bestimmt.
Die Reinheit der verschiedenen Konjugate wird mittels Reversephase-HPLC kontrolliert.
1.3 – Methode zum Aufpfropfen (Immobilisierung) der Oligonukleotide (Anti-Liganden)
Bei dem für die Experimente ausgewählten festen Träger handelt es sich um einen Mikroskopobjektträger aus Glas. Dies ist ein für diese Art von Analyse üblicher Träger. Die verwendeten Objektträger haben die Maße 75 × 25 × 1 mm. Das zur Immobilisierung der Oligonukleotide eingesetzte Verfahren setzt sich aus Techniken zusammen, die üblicherweise in der Glasoberflächenbearbeitung und in der Molekularbiologie verwendet werden.
Der erste Schritt besteht darin, die Aminogruppen auf die Glasoberfläche mittels einer Silanisierung aufzupfropfen. Im zweiten Schritt wird die Oberfläche mittels eines Kopplungsagens aktiviert, das stark mit Aminen reagiert. In einem dritten Schritt wird das Avidin über die Reaktion der primären Amine von dessen Aminosäuren an dem Kopplungsagens kovalent auf die aktivierte Oberfläche gepfropft. Schließlich werden in einem letzten Schritt die biotinylierten Oligonukleotide aufgrund der starken Fixierung des Biotins über das Avidin an die Oberfläche immobilisiert.
Dieses Verfahren gewährleistet eine Fixierung der Oligonukleotide auf die Glasoberfläche über ihr 5'-Ende.
Detailliertes Protokoll:

1. Waschen der Glasobjektträger mit zehnfach verdünnter Chromschwefelsäure (Prolabo), Spülen mit Wasser und Trocknen bei 80°C für 15 min.
2. Eintauchen der Objektträger in eine Toluol-Lösung, die 1 (vol/vol) 3-Aminopropyldimethylethoxysilan (Firma ABCR) enthält. Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur.
3. Zweimaliges Spülen der Objektträger mit Ethanol und Trocknen bei 80°C für 15 min.
4. Eintauchen der Objektträger in Dimethylformamid, das 10 (vol/vol) Pyridin und 0,2 (w/vol) 1,4 Phenyl-Diisothiocyanat (Aldrich) enthält.

Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur.

5. Spülen der Objektträger mit Methanol, anschließend mit Aceton, und Trocknen bei 80°C für 15 min.
6. Auftragen von 2 μl-Tropfen von gelöstem Avidin auf die gewünschten Stellen. Die Avidinlösung setzt sich aus 10 mM Tris-HCl, pH 8; 1 mM EDTA; 1 mg/ml Avidin (Sigma) zusammen. Inkubation für 20 bis 30 min bei Raumtemperatur.
7. Aufnehmen der Avidintropfen mit der Pipette.
B. Spülen der Avidinablagerungen mit einer 1 M NaCl-Lösung, indem mehrfach 2 μl-Tropfen auf die Stellen auf- und abpipettiert werden.
9. Ablegen von 2 μl-Tropfen von biotinylierten Oligonukleotiden (5 μM) auf die selben Stellen. Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur. Aufnahme der Tropfen mit der Pipette.

Die Oligonukleotide wurden in 10 mM Tris-HCl, pH 8; 1 mM EDTA; 1 M NaCl verdünnt.

10. Eintauchen der Objektträger in eine Lösung von 1% (vol/vol) Ammoniak, 1 M NaCl. Diese werden so für 10 min bei Raumtemperatur belassen.
11. Eintauchen der Objektträger in Wasser und Trocknen an der Raumluft.

Die Objektträger sind nun fertig für die Hybridisierung oder Komplexierung.
Um die Kopplungsstellen zu bestimmen und die Oligonukleotide präzise auf den Glasobjektträgern zu positionieren, wurden die Schritte 6 bis 9 mittels eines Gilson-Roboters, Modell 222, automatisiert. Dieser Roboter setzt sich aus einem kartesischen Roboterarm zusammen, der mit einer Nadel versehen ist, die mit einem Diluter verbunden ist. Diese Montage ermöglicht das Ablegen und Wiederaufnehmen der Tropfen auf präzise und reproduzierbare Art und Weise.
1.4 – Hybridisierung und Visualisierung der Fluoreszenz (Größe, die das Vorhandensein und/oder die Quantität des Komplexes kennzeichnet)
Die fluoreszierenden Oligonukleotide wurden bei einer Konzentration von 10^–7 M in folgendem Puffer auf die Oberfläche hybridisiert, die die immobilisierten Oligonukleotide trägt 50 mM Tris-Cl, pH 8; 4,5 M TMACl; 2 mM EDTA; 0,01 Sarcosin. Dieser Puffer stammt aus der Bibliographiereferenz 4.
Das Hybridisierungsvolumen beträgt 150 μl. Dieses Volumen entspricht einem Flüssigkeitsfilm von ungefähr 0,1 mm Dicke, wenn Deckgläser von 24 × 50 mm verwendet werden.
Die Dauer der Hybridisierung beträgt 1 h.
Die isothermen Hybridisierungen erfolgten zwischen Objektträger und Deckgläschen in einem Trockenofen oder Wasserbad, die die gewünschte Temperatur sicherstellen.
Für die erfindungsgemäßen Hybridisierungen mit thermischen Gradienten (siehe unten) wird die Hybridisierungslösung (flüssiges Milieu) direkt in den Metallblock eingebracht, der den Gradienten und den Objektträger trägt, der die Oligonukleotide trägt, die darauf aufgebracht wurden, wobei darauf zu achten ist, dass Blasenbildung vermieden wird.
Die Visualisierung oder Beobachtung der Hybridisierungen (Komplexierungen) erfolgte über Fluoreszenz mittels eines FluorImager-Gerätes der Firma Molecular Dynamics (Sunnyvale, Kalifornien, USA). Dieses Gerät sucht die zu beobachtende Oberfläche ab, indem es Punkt für Punkt und Kopplungsstelle für Kopplungsstelle mit Hilfe eines Argonlaserstrahls (Anregung bei 488 nm) bestrahlt und das re-emittierte Licht sammelt, das mittels eines Bündels von Lichtleitfasern beobachtet und detektiert wurde. Ein 515 nm-Hochpassfilter wird unbeweglich in das Gerät eingebracht. Es ist möglich, zusätzliche Filter hinzuzugeben, um das gesammelte und beobachtete Licht hinsichtlich der Wellenlänge besser auswählen zu können.
Für die Beobachtungen wurde ein 530 ± 30 nm-Interferenzfilter hinzugegeben, und der Photomultiplikator des Gerätes wurde auf 920 Volt eingestellt. Die Größe der Pixel des sich ergebenden Bildes entspricht einem Quadrat von 200 × 200 μm. Und eine Kopplungsstelle besteht aus einer Scheibe mit einem Durchmesser von ungefähr 2 mm, was ein Endbild von jeder Stelle in der Größenordnung von etwa zehn Pixel repräsentiert.
Die Oligonukleotide (Anti-Liganden) sind von geringer Größe, und bei den Sequenzen mit den geringsten Stabilitäten (Sequenzen A und B) findet bei Raumtemperatur eine schnelle Dissoziierung der DNA-Duplexe statt. Es wurde auch folgendes Verfahren ausgearbeitet, um die Hybridisierungen zuverlässig beobachten zu können:

1. Rasches Eintauchen der Objektträger in auf – 20°C abgekühlten Hybridisierungspuffer. Schwenken.
2. Rasches Eintauchen der Objektträger in auf –9°C abgekühltes 20X-SSC (Handelsname der Firma AMBESCO, Solon, Ohio, USA). Schwenken. Diese beiden Schritte sollten maximal 10 bis 15 sec einnehmen.
3. Rasches Eintauchen der Objektträger in den auf –20°C abgekühlten Hybridisierungspuffer. Bei dieser Temperatur und in diesem Puffer erfolgt keine Dissoziierung des Duplexes (Komplexes). Dieser Puffer muss entgast werden.
4. Herausnehmen der Objektträger aus der die Zieloligonukleotide (Liganden) enthaltenden Lösung. Aufbringen eines zuvor abgekühlten Deckgläschens. Rasches Abwischen der Unterseite des Objektträgers.
5. Sofortiges Visualisieren und Beobachten mit dem FluorIimager-Gerät.

Die Quantifizierung der Hybridisierungen erfolge mittels der ImageQuant^®-Software, die von der Firma Molecular Dynamics mit dem FluorImager-Gerät bezogen wurde.
Die oben beschriebenen Protokolle gewährleisten einen Variationskoeffizient der Hybridisierungssignale von 25 für von dem selben Objektträger getragenen Duplikate.
1.5 – Ergebnisse der Hybridisierung bei isothermer Temperatur
Die Objektträger, die die 10 Oligonukleotid (Anti-Liganden) bA, bB, bC, bD, bE, bF, bG, bH, bI, bJ tragen, wurden hergestellt und bei 4°C mit einem Gemisch der drei fluoreszierenden Oligonukleotide (Liganden) fBc, fDc, und fJc bei einer Ausgangskonzentration von jeweils 10^–7 M hybridisiert.
Die quantitativen Ergebnisse dieser Hybridisierungen sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Es handelt sich um den Durchschnittswert eines Duplikat-Experimentes, und die Hybridisierungssignale werden ausgedrückt in Funktion des Signals des bJ:JFC-Duplex.
Ausgehend von den Werten der Tabelle 1 entspricht der Intensitätsunterschied der starken und sehr schwachen Hybridisierungssignale ungefähr einem Faktor 15. Eine nicht-detektierbare Hybridisierung ist wenigstens 20 mal schwächer als eine starke Hybridisierung.
Wie erwartet, sind die mit den Oligonukleotiden bB, bD und bJ erhaltenen Hybridisierungen stark, da die freien in Lösungen befindlichen Oligonukleotide deren jeweilige Komplementäre waren.
Die mit bC, bE, bF und bH erhaltenen Hybridisierungen waren sehr schwach und nicht detektierbar, was bedeutet, dass die internen Misspaarungen sich von den perfekten Paarungen leicht unterschieden.
Andererseits gilt dies nicht für die externen Misspaarungen. Wenn bA ein relativ schwaches Hybridisierungssignal generiert, so gilt dies in der Tat nicht für bG und bI, die ebenso wie die perfekten Paarungen starke Hybridisierungssignale generieren. Die zwischen dem Duplex bA:fDc ausgebildete externe Misspaarung wird folglich korrekt unterschieden, jedoch nicht die externen Misspaarungen, die die Duplexe bG:fDc und bI:fJc ausbilden.
Unter diesen Versuchsbedingungen erkennt man folglich, dass es nicht möglich ist, eine unbekannte Probe (flüssiges Milieu) genau zu analysieren. Wenn die obige Hybridisierung mit einer unbekannten Probe durchgeführt worden wäre, wären die Oligonukleotide bB, bD, bG, bI und bJ bezüglich ihrer Hybridi sierung mit der Probe bestimmt worden, was einer Rate von Falsch-Positiven von 40% entspricht.
Um die Unterscheidung der externen Misspaarungen zu verbessern, kann daran gedacht werden, die Hybridisierungstemperatur zu erhöhen. Um diese Lösung zu testen, wurden die sechs Oligonukleotide bA, bB, bD, bG, bI und bJ auf einen Objektträger immobilisiert und mit den Oligonukleotiden fBc, fDc und fJc bei verschiedenen Temperaturen (4, 10, 20, 25, 30 und 37°C) hybridisiert. 1 stellt die Ergebnisse der Hybridisierung dar, die für Temperaturen von 4 bis 25°C erhalten wurden. Es handelt sich um die aus 16 bis 42 Bestimmungen erhaltenen Mittelwerte. Die Ergebnisse werden in relativer Lichtintensität der Hybridisierung bJ:fJc ausgedrückt, denn dieser Duplex scheint der stabilste zu sein. Selbstverständlich verminderte sich die absolute Intensität des Hybridisierungssignals dieses Duplex, wenn die Temperatur anstieg.
1 zeigt, dass bei 10°C das Profil der Hybridisierungen jenem ähnlich ist, das mit Hybridisierungen bei 4°C erhalten wurde. Auf der anderen Seite finden bei 20 bis 25°C gewisse Veränderungen statt. Die externe Misspaarung bG-fDc wird deutlich schwächer als die perfekte Paarung bI:fJc. Gleichermaßen wird die externe Misspaarung bI:fJc deutlich schwächer als die perfekte Paarung bJ:fJc, obwohl der Unterschied für eine vollkommene Unterscheidung bei einer einmaligen Hybridisierung etwas schwach ist. Die perfekte Paarung nimmt jedoch auch in ihrer Intensität ab und generiert ein schwächeres Signal als jenes des missgepaarten Duplex bI:fJc. Es ist folglich nicht möglich, eine Schwelle der Hybridisierungsintensität auszuwählen, die eine fehlerfreie Entscheidung zwischen perfekt gepaarten Duplexen und missgepaarten Duplexen herbeiführt. Wenn beispielsweise eine Hybridisierung bei 25°C mit einer Schwelle von 0,5 gewählt wird, wird das Oligonukleotid bB als negativ erklärt, und das Oligonukleotid bI wird als positiv erklärt. Das Endergebnis umfasst also Falsch-Positive und Falsch-Negative. Wenn dann eine Hybridisierung bei 20°C mit einer Schwelle von 0,4 gewählt wird, wird das Oligonukleotid bB richtigerweise als positiv erklärt, aber ebenso das Oligonukleotid bI, sowie manchmal das Oligonukleotid bG, je nach den Versuchsvariationen.
II – Erfindungsgemäße Lösung mit einem thermischen Gradienten
2.1 – Beschreibung des Aufbaus, der das Anlegen eines thermischen Gradienten ermöglicht
Um das Problem der Unterschneidung der oben dargestellten externen Misspaarungen zu lösen, wurde eine Behandlungsvorrichtung entworfen und entwickelt, die in der Lage ist, auf der Oberfläche des Glasobjektträgers, der die immobilisierten Oligonukleotide trägt, einen thermischen Gradienten zu etablieren, und der einen Träger für mehrfache Komplexierung bildet.
Diese Vorrichtung genügt folgenden Spezifikationen:

– Temperaturgradient von 10°C im Nutz- oder Arbeitsbereich entlang von 1 cm,
– Kenntnis der Temperatur des Objektträgers in jedem Punkt bis auf 0,1°C,
– Reproduzierbarkeit der Temperaturen des Objektträgers von einem Versuch zum anderen: 0,1°C bis auf 0,1 mm; die Raumtemperatur muss frei von 20 bis 25°C variieren können.
– Erleichterte Installierung und Entfernung des die Oligonukleotide tragenden Glasobjektträgers.

Die einfache Art und Weise, an der Oberfläche eines Trägers einen thermischen Gradienten zu etablieren, besteht darin, die Enden dieses Trägers an eine Kältequelle 3 bzw. eine Wärmequelle 4 anzuschließen. Es etabliert sich dann zwischen diesen beiden Quellen ein thermischer Gradient. Wenn der Träger eine konstante Dicke aufweist, ist der Temperaturgradient konstant, d. h., dass die Temperatur linear auf dem Träger in Funktion der Entfernung längs des letzteren variiert.
Unter dem praktischen Gesichtspunkt ist es notwendig, dass der Glasobjektträger 2, auf dem die Oligonukleotide immobilisiert wurden, von einem Versuch zum anderen leicht austauschbar sind, und dass es keinen Unterschied der Wärmeaustausche zwischen den verschiedenen Versuchen gibt. Deshalb wurde der thermische Gradient nicht direkt in dem Glasobjektträger, sondern in dem Metallblock 1 an der Oberfläche etabliert, in dem eine kleine Kavität 1a ausgespart wurde. Der Glasobjektträger 2 wird mit der Seite, die die immobilisierten Oligonukleotide trägt, nach unten in diese Kavität eingesetzt. Zwischen dem Metallblock 1 und dem Glasobjektträger 2, der von Keilen 11 getragen wird, befindet sich Hybridisierungslösung 5 (vgl. 4) oder flüssiges Milieu.
In 4 sind Anschläge 6 zur Positionierung des Glasobjektträgers 2 angegeben. In der Tat wird der Objektträger mit diesen Anschlägen in Kontakt gebracht. Bei der Immobilisierung der Oligonukleotide auf dem Objektträger wird die Position der Oligonukleotide in dem thermischen Gradienten ausgehend vom Objektträgerrand 2a bestimmt, der folglich in Anschlag gebracht wird. Der Metallblock 1 besteht aus nicht-rostendem Stahl 3041, der beispielsweise eine Wärmeleitfähigkeit von 10 bis 50 W/mK aufweist; er wird von einer Hülle 7 mit einer intrinsischen Leitfähigkeit von beispielsweise unterhalb von 0,06 W/mK, beispielsweise aus Polyurethan, isoliert.
Die Enden der Vorrichtung sind mit zirkulierenden Wasserbädern kalter bzw. heißer Quelle angeschlossen, deren Wärmeregelung gemäß der Angaben des Herstellers (Cryothermostat Ministat Huber, –25/+120°C) auf ±0,02°C stabil ist.
Die Temperaturen der Vorrichtung wurden mit Hilfe der Chromel-Alumel-Thermoelemente (Typ K) kontrolliert, die in 5 beschrieben sind. Die Thermoelemente TC1 und TC4 sind beidseits des Objektträgers 2 angeordnet, wohingegen die Thermoelemente TC2 und TC3, deren Drähte einen Gesamtdurchmesser von 0,08 mm haben, unter dem Glasobjektträger in der Hybridisierungslösung angeordnet sind. Diese Thermoelemente wurden mittels elektrischer Entladung direkt auf den Stahl verschweißt. Ihre Positionen (Medianwerte zwischen den beiden Drähten der Thermoelemente) wurden bis auf 0,02 mm mittels eines Binokulars bestimmt, durch das eine x,y-Mikrometertafel hineingeragt wird. Sie sind in differentieller Anordnung mit einer Vergleichsstelle montiert, die in ein Bad eiskalten reinen Wassers eintaucht. Die Differenzialspannungen werden mit tels eines Universalmessgerätes mit hoher Genauigkeit (Keithley, Modell 2000, Genauigkeit: 0,1 μV) gemessen und mittels der Standardtabelle für diese Thermoelemente in Temperaturen umgesetzt.
Die Dimensionierung der zuvor beschriebenen Behandlungsvorrichtung ist mittels der Bezugszeichen in 2 gezeigt und beträgt: AA: 40 mm, BB: 40 mm, CC: 20 mm, DD: 15 mm, JJ: 120 mm, EE: 10 mm, FF: 10 mm, GG: 20 mm, HH: 40 mm, II: 12 mm.
Die Linearität des thermischen Gradienten, die mittels numerischer Simulationen vorhergesagt wurde, wurde experimentell mittels der Thermoelemente verifiziert, die in den Aufbau platziert wurden. Der Gradient ist linear, wobei die Temperaturen in jedem Punkt des Nutzbereichs des Objektträgers 2 auf einfache Art und Weise ausgehend von den durch die Thermoelemente TC2 und TC3 gegebenen Temperaturen errechnet werden können.
Die Temperaturmessungen, die für mehrere Temperaturen der heißen und kalten Quellen und verschiedenfach wiederholt wurden, zeigen, dass die Temperaturverteilung von einem Versuch zum anderen bis auf 0,1°C reproduzierbar ist.
In den meisten hier dargestellten Experimenten wurde das kalte Wasserbad auf –9°C und das heiße Wasserbad auf +61°C eingestellt. Die Flüssigkeit der kalten Quelle 3 war glycolisiertes Wasser (25 Glycol), und die der heißen Quelle 2 war reines Wasser. Der etablierte Gradient betrug 1,085°C/mm. Die beiden 25 mm beabstandeten Ränder des Glasobjektträgers lagen bei 13,2 bzw. 40,3°C.
2.2 – Positionierung der Oligonukleotide bei ihrer vorbestimmten Optimaltemperatur für die Hybridisierung
Die Ergebnisse der isothermen Hybridisierungen zeigen, dass die Hybridisierungstemperatur für jedes Oligonukleotid ausreichend heiß ist, um eine korrekte Unterscheidung der externen Misspaarungen zu ergeben. Diese Temperatur muss jedoch ausreichend niedrig sein, damit das Hybridisierungssignal detektierbar ist. Mit der zuvor beschriebenen Vorrichtung wurde die Hybridisierungstemperatur festgesetzt, so dass das Hybridisierungssignal 25 desjenigen bei 4°C erhaltenen Hybridisierungssignals entspricht, welches der Sättigung der immobilisierten Oligonukleotide entspricht. So wird die Positionierung und Verteilung der Oligonukleotide in dem thermischen Gradient auf der Oberfläche des Glasobjektträgers 2 (ebener Träger) approximativ bestimmt.
Um die jeweiligen Positionen der Oligonukleotide in dem Gradient zu verfeinern, wurden Objektträger hergestellt, die die Oligonukleotide in Gradientenrichtung in Fünfergruppen tragen. Die 5 Kopplungsstellen einer Fünfergruppe befinden sich bei 5, 8,8, 12,6, 16,4 bzw. 20,2 mm vom kalten Rand 2a des Objektträgers 2. Die Objektträger werden danach mit verschiedenen Kombinationen von komplementären fluoreszierenden Oligonukleotiden hybridisiert. 6 zeigt das Ergebnis einer solchen Hybridisierung mit den Oligonukleotiden fBc, fDc und fJc. In diesem Experiment sind die Wasserbäder für den thermischen Gradienten auf –9 und +71°C eingestellt.
Am Ende einiger Experimente diesen Typs wurden die Lokalisierungen der Kopplungsstellen für die jeweils verschiedenen Oligonukleotide definiert:
bA: 23,5°C; bB: 23°C; bD: 26,5°C; bG: 27,5°C; bI: 27,5°C; bJ: 29°C
2.3 – Ergebnisse der erfindungsgemäßen Hybridisierung im thermischen Gradienten
Für diese Experimente wurden die Oligonukleotide bA, bB, bD, bG, bI und bJ auf Glasobjektträger bei 9,5, 9, 12,2, 13,2, 13, 2 bzw. 14 , 6 mm vom kalten Rand 2a des Objektträgers 2 immobilisiert. Wenn die Wasserbäder kalter und heißer Quellen auf –9 und +61°C eingestellt werden, entsprechen diese Positionen den oben definierten Temperaturen. Die Oligonukleotide wurden in Duplikaten gemäß dem Schema der 7 aufgetragen. Die Objektträger 2 wurden danach im thermischen Gradienten mit der gleichen Mischung der Oligonukleotide fBc, fDc und fJc hybridisiert, die zuvor in den isothermen Hybridisierungen verwendet wurden.
Die erhaltenen Ergebnisse der Hybridisierung sind in 8 zusammengefasst. Es handelt sich um aus fünf Bestimmungen erhaltene Mittelwerte. Die Ergebnisse werden ausgedrückt als relative Intensität der Hybridisierung bJ:fJc, wie für die in den 1a bis 1d gezeigten Ergebnisse.
Es ist festzustellen, dass die drei perfekten Paarungen ein Hybridisierungssignal von vergleichbarer Intensität (von 0,84 bis 1) generieren, während die externen Misspaarungen signifikant schwächere Signale ergeben. Entgegen der in der isothermen Hybridisierung erhaltenen Ergebnisse ist es hier möglich, eine Intensitätsschwelle zu definieren, die eine Entscheidung zwischen den perfekten Paarungen und den Misspaarungen ermöglicht, beispielsweise eine Schwelle von 0,7.
Um das gute Funktionieren der zuvor beschriebenen Vorrichtung zu verifizieren, wurden identische Objektträger mit anderen Kombinationen der fluoreszierenden Oligonukleotide fAc, fBc, fDc, fGc, fIc und fJc hybridisiert. Diese Kombinationen weisen systematisch das Oligonukleotid fBc auf. Sie weisen unter anderem fIc oder fJc, und fAc, oder fDc, oder fGc auf. Auf diese Art und Weise interferieren die drei fluoreszierenden Oligonukleotide jeder Kombination nicht in ihren Hybridisierungen, denn sie paaren sich nie mit dem selben fixierten Oligonukleotid. Es wurde auch eine Kombination getestet, die fAc, fGc und fIc aufweist. Tatsächlich sind die Kreuzhybridisierungen zwischen den Sequenzen A und G sehr schwach (siehe Ergebnisse unten).
Die Ergebnisse dieser Hybridisierungen sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Sie werden relativ als Intensität des Hybridisierungssignals des Duplex bB:fBc ausgedrückt. Außerdem werden für die Misspaarungen die Ergebnisse auch relativ zur Intensität des Hybridisierungssignals der entsprechenden perfekten Paarung ausgedrückt.
Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, dass sämtliche perfekte Paarungen Signale von ähnlicher Intensität generieren. Die Paarung bG:fGc generiert jedoch ein geringfügig zu schwaches Signal, da es bei 0,79 mit einer Standardabweichung für 6 Be stimmungen von 0,22 liegt. Die Wahrscheinlichkeit, dass es sich bei dem Signal nicht um eine experimentelle Schwankung sondern um ein echtes Signal handelt, das tatsächlich kleiner als 1 ist, liegt bei etwa deutlichen 97%. Dies bedeutet, dass die Position von G in diesen Experimenten in dem thermischen Gradienten ein wenig heiß ist, und dass G in Richtung der kalten Quelle positioniert werden kann.
Darüber hinaus zeigen diese Ergebnisse auch, dass die externen Misspaarungen deutlich schwächere Signale generieren als der perfekte Duplex bB:fBc, oder auch deren jeweilige perfekten Homologe. Wie für den speziellen Fall der Hybridisierungen mit der Kombination fBc+fDc+fJc, ermöglicht eine Schwelle von 0,7 hinsichtlich eines perfekten Duplex als Referenz, perfekte Paarungen von externen Misspaarungen zu unterscheiden.
Anschließend wurden neue Experimente mit Objektträgern durchgeführt, auf denen das Oligonukleotid bG bei 26,8°C lokalisiert wurde (12,5 mm vom kalten Rand 2a vom Objektträger 2), die Position der anderen Oligonukleotide blieb unverändert. Diese Objektträger wurden mit den Kombinationen von fluoreszierenden Oligonukleotiden fBc+fGc+fIc und fBc+fGc+fJc hybridisiert. Der Mittelwert des Hybridisierungssignals des Duplex bG:fGc im Vergleich zu dem Duplex bB:fBc lag dann bei 1,08 für 7 Bestimmungen mit einer Standardabweichung von 0,32. Es wurden dann die Signale der Misspaarungen bG:fDc und bG:fAc bei dieser neuen Temperatur bei bG extrapoliert, indem sämtliche früheren Werte genommen wurden und mit dem Verhältnis 1,08 : 0,79 = 1,367 multipliziert wurden. Ebenso wurden die Signale der Misspaarungen bD:fGc und bA:fGc in Bezug auf ihr entsprechendes perfektes Homolog bG:fGc von den vorhe rigen Werten hergeleitet, indem diese durch 1,367 dividiert wurden. Sämtliche dieser Ergebnisse und dieser Berechnungen werden in Tabelle 3 dargestellt.
Wie erwartet, bestätigen und verbessern diese Ergebnisse die vorherigen. Sämtliche perfekten Paarungen generieren ein Hybridisierungssignal bei 1, während die letzten Misspaarungen Signale unter 0,5 generieren, außer bI:fJc, das geringfügig höher liegt. Eine Schwelle von 0,7 ermöglicht es klar, die perfekten Paarungen von externen Misspaarungen zu unterscheiden.
2.4 – Anwendung auf die Arbeitsweise eines Biochips universeller Oligonukleotide
Bei der Verwendung eines Oligonukleotid-Biochips, der beispielsweise insgesamt 65.536 mögliche Oktamere trägt, ist es nicht sehr effizient, einfach eine Intensitätsschwelle anzusetzen, um zu bestimmen, ob ein Signal positiv oder negativ ist. In der Tat sind die Signale der stabilsten Misspaarungen nur zweimal schwächer als die Signale der perfekten Paarungen, wobei es möglich ist, dass Versuchsschwankungen dazu führen werden, dass eine bestimmte Anzahl von perfekten Paarungen als negativ detektiert wird, und dass ebenso eine bestimmte Anzahl von externen Misspaarungen als positiv bestimmt wird. Beispielsweise gibt es bei sämtlichen in Tabelle 3 zusammengefassten Daten 2 unter den 39 gezeigten Signalen für perfekte Paarung, die unterhalb der Schwelle von 0,7 liegen (5,1%), und es gibt 2 von 56 (3,6%) Bestimmungen von externen Misspaarungen, die über dieser Schwelle von 0,7 liegen. Es handelt sich um einen Wert für den Duplex bJ:fIc und um einen Wert für den Duplex bJ:fIc. Diese beiden Duplexe gehören zu den drei stabilsten missgepaarten Duplexe aus den durchgeführten Experimenten.
Eine effektive Art und Weise vorzugehen besteht darin, sämtliche der Oligonukleotide in der selben Gruppe zu vereinen, die sich nur durch ihre terminalen Nukleotide unterscheiden (16 Oktamere pro Biochip, der sämtliche möglichen Oktamere trägt), und für jede Gruppe das stärkste Signal zu bestimmen. Es ist dann einfach, die positiven Gruppen von den negativen Gruppen zu unterscheiden, denn dies wird darauf hinaus laufen, perfekte Paarungen von internen Misspaarungen zu unterscheiden. Beispielsweise wird im Hinblick auf die stärksten Signale eine Schwelle von 0,4 angewendet.
Danach kann für jede Gruppe von Oligonukleotiden hinsichtlich des stärksten Signals eine Schwelle von 0,7 angewendet werden.
Wenn auf diese Art und Weise für sämtliche der in Tabelle 3 dargestellten Experimente vorgegangen wird, wird keine perfekte Paarung als negativ bestimmt, denn sämtliche Paarungen liegen hinsichtlich des stärksten Signals des Experimentes weit über der Schwelle von 0,4. Andererseits bleiben die beiden Werte, die als falsch-positiv bestimmt werden, falsch positiv.
Durch die Anwendung dieser Angaben hätte ein auf diese Art und Weise funktionierender Biochip universeller Nukleotide also einen Anteil Falsch-Negativer von 0%, einen Anteil von falschpositiven internen Misspaarungen von 0% und einen Anteil von falsch positiven externen Misspaarungen von 3 bis 4%, was tatsächlich einem Anteil von Falsch-Positiven von ungefähr 10 für 30 und 40 externer Misspaarungen entspricht. Solche Anteile von Falsch-Positiven stellen eine deutliche Verbesserung des Standes der Technik dar, indem die Hybridisierung isotherm erfolgt. Solche Anteile sind ausreichend gering, um die Rekonstruktion der Sequenz einer Nukleinsäureprobe mittels Sequenzierung durch Hybridisierung zu ermöglichen. Tatsächlich können diese verbleibenden Hybridisierungsfehler mittels einer adäquaten Datenanalysesoftware auf Grund der Redundanz der Hybridisierungen verbessert werden (5).
Um die Qualität der Ergebnisse noch weiter zu verbessern, können anstatt nur einem zwei Hybridisierungsexperimente pro Probe durchgeführt werden. Der Anteil Falsch-Positiver sollte dann in der Größenordnung von 1 für 30 bis 40 externer Misspaarungen liegen.
TABELLE 1

Oligonukleotide Hybridisierung

bA:fDc 0,31

bB:fBc 0,86

bC:fBc 0,06

bD:fDc 0,73

bE:fDc 0,02

bF:fBc 0,14

bG:fDc 1,03

bH:fJc 0,14

bI:fJc 0,79

bJ:fJc 1,00
TABELLE 2 Ergebnisse der Hybridisierungen im thermischen Gradienten
TABELLE 3 Ergebnisse der Hybridisierungen im thermischen Gradienten bG positioniert bei 26,8°C
Bibliographische Referenzen, die, sofern notwendig, in die vorliegende Beschreibung einbezogen sind
(1) K. R. Khrapko, Y. P. Lysov, A. A. Khorlyn. V. V. Shick, V. L. Florentiev und A. D. Mirzabekov; An oligonucleotide hybridization approach to DNA sequencing; FEBS Letters; 1989; 256; 118–122.
(2) M. J. Doktycz, M. D. Morris, S. J. Dormady, K. L. Beattie und K. B. Jacobson; Optical melting of 128 octamer DNA duplexes; J. Biol. Chem.; 1995; 270; 8439–8445.
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(11) Sze VLSI Technology, Mc Graw Hill 1983.

Claims

Verfahren zur Behandlung eines flüssigen Milieus durch Komplexierung, wobei das flüssige Milieu eine oder mehrere Komponenten enthält, die das Vorhandensein einer Vielzahl von in freiem Zustand befindlichen verschiedenen Liganden in dem flüssigen Milieu bestimmen, bei dem: a) ein Träger für mehrfache Komplexierung bereitgestellt wird, auf dem eine Vielzahl von voneinander getrennten Kopplungsstellen angeordnet sind, an denen eine Vielzahl von jeweils verschiedenen Anti-Liganden immobilisiert sind, die dazu in der Lage sind, mit den jeweiligen Liganden zu komplexieren, b) das genannte flüssige Milieu mit dem Träger für die Komplexierung in Kontakt gebracht wird, wodurch sich die genannten Liganden mit den genannten jeweiligen Anti-Liganden paaren und an den Träger fixiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Stabilität eines jeden Komplexes aus Ligand und Anti-Ligand direkt oder indirekt von wenigstens einem Referenzparameter genannten exogenen Parameter abhängt, wodurch der genannte Träger konditioniert wird, einerseits die Kopplungsstellen auf dem Träger in Funktion des exogenen Referenzparameters unterschieden werden, der an den Stellen jeweils verschiedene Werte aufweist, und andererseits die Anti-Liganden auf die verschiedenen Kopplungsstellen in Funktion von Optimalwerten verteilt werden, die durch den exogenen Referenzparameter vorbestimmt werden, wodurch die Stabilität der verschiedenen Komplexe aus Ligand und jeweiligem Anti-Ligand bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Kontakt gemäß Schritt b) dadurch bewirkt wird, dass an allen Kopplungsstellen derselbe Minimalwert des exogenen Referenzparameters angelegt wird, der ausreicht, um praktisch alle Liganden mit den Anti-Liganden zu komplexieren, und der Träger dann gewaschen wird, wobei an verschiedene Kopplungsstellen jeweils verschiedene und vorbestimmte Werte des exogenen Referenzparameters angelegt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass der Kontakt gemäß Schritt b) dadurch hergestellt wird, dass an verschiedene Kopplungsstellen erste, jeweils verschiedene und vorbestimmte Werte des exogenen Referenzparameters angelegt werden, und dann der Träger gewaschen wird, wobei die verschiedenen Kopplungsstellen auf jeweils verschiedenen, vorbestimmten zweiten Werten des exogenen Referenzparameters gehalten werden, wobei die ersten Werte identisch oder verschieden zu den jeweiligen zweiten Werten des exogenen Referenzparameters sind.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Kontakt des Trägers mit dem flüssigen Milieu dadurch bewirkt wird, dass an verschiedene Kopplungsstellen jeweils verschiedene und vorbestimmte Werte des exogenen Referenzparameters angelegt werden, und dass der hybridisierte Träger mit einer Waschflüssigkeit bei einer vergleichsweise kühlen und konstanten Temperatur gewaschen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Träger längs wenigstens einer Referenzrichtung des Trägers eine räumliche Abstufung des exogenen Referenzparame ters, insbesondere ein Gradient des genannten Parameters, etabliert wird, wobei die genannte räumliche Abstufung die Position der verschiedenen Kopplungsstellen und die Verteilung der Anti-Liganden auf die jeweiligen Kopplungsstellen fixiert.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der exogene Referenzparameter – entweder ein physikalischer Parameter oder Zustand, bspw. die Temperatur, – oder ein chemischer, biochemischer oder biologischer Parameter oder Zustand auf der Oberfläche des Trägers für die Komplexierung, z. B. die Oberflächenkonzentration eines Anti-Anti-Liganden, der dazu in der Lage ist, sich mit praktisch allen Anti-Liganden zu paaren, – oder ein physiko-chemischer Parameter der Oberfläche des Trägers ist, z. B. ihre Benetzbarkeit oder Oberflächenspannung bezogen auf das flüssige Milieu.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein anderer exogener Parameter, von dem die Stabilität der verschiedenen Komplexe aus Ligand und Anti-Ligand abhängt, auf einen mittleren Wert innerhalb der Werte des genannten anderen Parameters gesetzt wird, die für die Stabilität der verschiedenen Komplexe aus Ligand und jeweiligem Anti-Ligand erforderlich sind.
Verfahren nach den Ansprüchen 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass einerseits die Kopplungsstellen auf dem Träger in Funktion von einem weiteren exogenen Referenzparameter unterschieden werden, der an den genannten Stellen verschiedene Werte aufweist, und andererseits die Anti-Liganden auf die verschiedenen Kopplungsstellen ebenfalls in Funktion von vorbestimmten Optimalwerten des anderen exogenen Referenzparameters verteilt werden, wodurch gleichfalls die Stabilität der verschiedenen Komplexe aus Ligand und jeweiligem Anti-Ligand bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass an verschiedenen Kopplungsstellen des Trägers eine Größe erfasst wird, die für das Vorhandensein und/oder die Quantität der verschiedenen Komplexe aus Ligand und Anti-Ligand repräsentativ ist, um Signale und/oder Informationen zu erhalten, die repräsentativ für das Vorhandensein und/oder die Quantität der verschiedenen Liganden in dem flüssigen Ausgangsmilieu sind.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die verschiedenen Komplexe aus Ligand und Anti-Ligand erfasst werden, indem wenigstens eine der folgenden Operationen durchgeführt wird, nämlich Markierung des oder der Komponenten des flüssigen Milieus und Markierung der verschiedenen, auf dem Träger fixierten Komplexe aus Ligand und Anti-Ligand.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das flüssige Milieu ausgehend von einer Probe, bspw. einer biologischen Probe oder einem biologischen Material erhalten wird, worin eine oder mehrere verschiedene Entitäten enthalten sind, die zu analysieren sind.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe wenigstens einer vorherigen Behandlung unterzogen wird, die ausgewählt ist, um in dem behandelten flüssigen Milieu eine oder mehrere Komponenten zu erhalten, die identisch zu oder direkt abgeleitet von jeweils verschiedenen Entitäten und für letztere repräsentativ sind.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger für die Komplexierung, auf dem die verschiedenen Liganden fixiert sind, wenigstens einer Folgebehandlung unterzogen wird, die ausgewählt ist, um von dem genannten Träger die Komponente oder die Komponenten zu trennen, die nicht gekoppelt wurden, und/oder um die verschiedenen Liganden, ggf. auf unterschiedliche Weise, zu eluieren oder auszusalzen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Ligand eine Nukleinsäure ist, die eine Nukleotid-Zielsequenz umfasst, insbesondere in einzelsträngiger Form, die einer Hybridisierung mit einer anderen, komplementären Nukleotid-Sondensequenz zugänglich ist, die in einem entsprechenden Anti-Liganden vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das flüssige Milieu mehrere verschiedene Komponenten umfasst, die jeweils verschiedene Liganden umfassen, wodurch die verschiedenen Komponenten auf dem Träger für die Komplexierung fixiert und voneinander getrennt werden.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass es in wenigstens einer der folgenden Anwendungen eingesetzt wird, nämlich Identifizierung, Quantifizierung, Trennung und Fraktionierung der verschiedenen Moleküle.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das flüssige Milieu eine einzige Komponente umfasst, die mehrere, jeweils verschiedene Liganden umfasst oder aufweist, wodurch dieselbe Komponente mit jeweils verschiedenen Anti-Liganden gepaart wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 14 und 17, dadurch gekennzeichnet, dass die einzige Komponente eine Nukleinsäure ist, deren Nukleotidabfolge in wenigstens einem Abschnitt eine Vielzahl von Hybridisierungsregionen, und folglich von Liganden, in Übereinstimmung mit den Nukleotid-Zielsequenzen bestimmt, die jeweils komplementär zu den Nukleotid-Sondensequenzen der Anti-Liganden sind.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es in wenigstens einer der folgenden Anwendungen eingesetzt wird, nämlich Sequenzierung der Nukleinsäurekomponente des flüssigen Milieus durch Hybridisierung, Resequenzierung der Nukleinsäurekomponente, Analyse und Identifizierung eines Nukleinsäure-Materials oder einer Nukleinsäure-Probe, Typisierung eines Nukleinsäure-Materials.
Verfahren nach den Ansprüchen 11 und 14, dadurch gekennzeichnet, dass das flüssige Milieu ausgehend von einer Nukleinsäure-Probe erhalten wird, die ein einziges Fragment oder mehrere, verschiedene Nukleinsäure-Fragmente enthält.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure-Probe wenigstens einer vorherigen Behandlung unterzogen wird, die aus den folgenden Behandlungen ausgewählt ist, nämlich Denaturierung, Klonierung, Amplifizierung.
Vorrichtung zur Behandlung eines flüssigen Milieus durch Komplexierung, wobei das flüssige Milieu eine oder mehrere Komponenten enthält, die das Vorhandensein einer Vielzahl von im freien Zustand befindlichen, verschiedenen Liganden in dem flüssigen Milieu bestimmen, wobei die Vorrichtung umfasst: – einen Träger für mehrfache Komplexierung, auf dem eine Vielzahl von voneinander getrennten Kopplungsstellen angeordnet sind, an denen eine Vielzahl von jeweils verschiedenen Anti-Liganden immobilisiert sind, die dazu geeignet sind, mit den jeweiligen genannten Liganden zu komplexieren, – ein Mittel zum Kontaktieren des flüssigen Milieus mit dem genannten Träger, das dazu angeordnet ist, um die genannten Liganden mit den jeweiligen genannten Anti-Liganden zu paaren und sie auf dem genannten Träger zu fixieren, dadurch gekennzeichnet, dass die Stabilität eines jeden Komplexes aus Ligand und Anti-Ligand direkt oder indirekt von wenigstens einem Referenzparameter genannten exogenen Parameter abhängt, wodurch der genannte Träger konditioniert wird, wobei die Vorrichtung einerseits unter anderem Mittel umfasst, um die Kopplungsstellen auf dem Träger in Funktion des exogenen Referenzparameters mit jeweils verschiedenen Werten des Parameters an den genannten Stellen zu differenzieren, und andererseits die Anti-Liganden auf dem Träger auf die verschiedenen Kopplungsstellen in Funktion von vorbestimmten Optimalwerten des exogenen Referenzparameters verteilt sind, wodurch die Stabilität der verschiedenen Komplexe aus Ligand und jeweiligem Anti-Ligand bestimmt wird.
Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der für die Komplexierung reservierte exogene Referenzparameter die Temperatur ist, wobei die Mittel für die Differen zierung angeordnet sind, um die Temperatur längs wenigstens einer Referenzrichtung zu kalibrieren, z. B. längs eines Temperaturgradienten.
Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Kältequelle und eine Wärmequelle umfasst, zwischen denen sich ein Träger längs der genannten Referenzrichtung erstreckt,
Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen oder mehrere Sensoren umfasst, die jeweils verschiedenen Kopplungsstellen des Trägers zugeordnet sind und jeder wenigstens eine beobachtete Größe erfasst, die repräsentativ für das Vorhandensein und/oder die Quantität des Komplexes aus Ligand und Anti-Ligand an jeder Kopplungsstelle ist, und die ein oder mehrere Messsignale oder entsprechende Informationen liefern.
Vorrichtung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Einheit zur Bearbeitung von von den verschiedenen Sensoren gelieferten Signalen gemäß vorbestimmter mathematischer und/oder logischer Operationen umfasst, um eine oder mehrere Informationen zu erhalten, die für die Komponente oder die Komponenten des flüssigen Milieus kennzeichnend sind.
Vorrichtung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die erfasste Größe ausgewählt ist aus den folgenden Größen, nämlich Lichtabsorption, Intensität von emittiertem oder re-emittiertem Licht sowie jegliche physikalische, optische, elektrische, dielektrische oder elektrochemische Eigenschaft der verschiedenen Komplexe aus Ligand und Anti-Ligand.
Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger eben ist.
Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger wenigstens eines der folgenden Materialien umfasst, nämlich Glas, poröses Material, glasartiges Material, anorganisch oder amorph, und Plastikmaterial.