DE69717463T2

DE69717463T2 - hCG UND DERIVATE ALS MATRIXMETALLOPROTEASE-INHIBITOREN

Info

Publication number: DE69717463T2
Application number: DE69717463T
Authority: DE
Inventors: Adriana Albini; Giorgia Orengo
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 1996-08-07
Filing date: 1997-07-25
Publication date: 2003-07-10
Anticipated expiration: 2017-07-26
Also published as: IL128399A0; PT920330E; AU732972B2; US20010006940A1; AR009013A1; IT1284876B1; CA2262582A1; DK0920330T3; IL128399A; ES2183205T3; JP2000516582A; CA2262582C; EP0920330A1; ITRM960566A0; DE69717463D1; US6444639B2; JP3996952B2; AU3771197A; WO1998005353A1; EP0920330B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von hCG, der hCG II- Untereinheit sowie von Abschnitten und aktiven Derivaten davon oder von hCG "β- core" zur Herstellung eines Medikaments zur Prophylaxe und/oder zur Behandlung nicht Tumor-assoziierter Pathologien, wobei die Inhibition der enzymatischen Aktivität der Matrixmetalloprotease (MMP) erforderlich ist.

Hintergrund der Erfindung

Bei zahlreichen pathologischen Prozessen tritt Geweberemodellierung und Gewebeabbau auf, einschließlich bei der Tumorinvasion, Zerstörung des Gelenks bei rheumatoider Arthritis oder Osteoarthritis, Periodontotitis und Angiogenese-abhängigen Erkrankungen, wie zum Beispiel bei kornealer Gefäßneubildung bzw. Neovaskularisierung, diabetischer Retinopathie, neovaskulärem Glaukom, Hämangiom, Psoriasis, Skleroderma und soliden Tumoren.
Die Tumorinvasion ist ein komplexer vielstufiger Prozeß, der einschließt (a) Tumorzellenaustritt aus dem Primärtumor und Übertritt über die Wirtsbasalmembran; (b) Durchdringung (Intravasierung) und Passage durch das vaskuläre System (c) Anhaftung an distaler Stelle im Gefäßsystem und Austritt aus dem Kreislauf durch Repenetration der endothelialen Basalmembran (Extravasierung); (d) Eintritt in das Zielgewebe und Proliferation an der Sekundärstelle.
Eines der Schlüsselereignisse, das nötig ist, um die Passage der Tumorzellen zu ermöglichen, ist die Beseitigung der extrazellulären Matrix (ECI) durch ECM-abbauende Enzyme, die durch metastatische Tumorzellen und/oder Tumor-aktivierte Wirtsstromazellen sekretiert werden (D J. Dodwell et al., 1993).
Die Basalmembran und das interstitielle Bindegewebe bilden die ECM, die aus Kollagen, Proteoglycanen und Adhäsionsglycoproteinen aufgebaut ist. Die ECM stellt ein natürliches Stützsystem für Zellen und Gewebe dar und die Zell-ECM-Interaktionen regulieren Zellwachstum, Zelldifferenzierung und Zellwanderung.
ECM-abbauende Enzyme schließen Matrixmetalloproteasen (MMPs), Urokinase, den Gewebeplasminogenaktivator ("tissue plasminogen activator"), Cathepsine, Trypsine und Heparanasen ein.
MMPs, die als Proenzyme sekretiert werden und die aktiviert werden müssen, umfassen drei Unterklassen, beruhend auf der Substratpräferenz: Iaterstitielle Kollagenasen, Gelatinasen oder Typ IV-Kollagenasen und Stromelysine (dargestellt bei J. F. Woessner, 1991, siehe insbesondere Tabelle 1).
Eine positive Korrelation zwischen der Überexpression von MMP (zumeist Typ IV Kollagenasen und Stromelysin-3) und der Tumoraggressivität ist für verschiedene Typen von Tumoren festgestellt worden (siehe I. C. Anderson et al., 1995; B. L. Lokeshwar et al., 1993, W. C. Powell et al., 1993; und J. M. Ray, 1995).
Bei rheumatoider Arthritis und Osteoarthritis produzieren infiltrierende Monozyten/Makrophagen, inflammtorische Zytokin-aktivierte synoviale Fibroblasten und Chondrozyten abnorme Mengen von Kollagenase, die zum Knorpelabbau und zur Progression der Erkrankung beitragen (A. M. M. Miltenburg et al., 1995).
MMPs sind auch an der normalen und pathologischen Angiogenese beteiligt, da endotheliale Zellen die ECM abbauen müssen, um aus dem Ursprunggefäß austreten und ein neues Kapillarnetzwerk initiieren zu können (R. B. Vernon et al., 1995).
Es ist auch vorgeschlagen worden, daß MMPs eine Rolle bei multipler Sklerose in Verbindung mit einer Schädigung der Blut-Hirn-Schranke spielen könnten (G. A. Rosenberg et al., 1996).
Alles zusammengenommen lassen die vorgenannten Daten vermuten, daß MMPs ein therapeutisches Ziel bei zahlreichen Erkrankungen darstellen könnten. Entsprechend wurden verschiedene Strategien, die auf natürlichen oder synthetischen Verbindungen beruhen, entwickelt, um die MMP-Aktivität zu inhibieren.
Der ECM-Abbau ist ein streng reguliert ablaufender Prozeß, und die Kollagenase- Proteolyse wird nach Sekretion durch natürlich auftretende Inhibitoren kontrolliert. Inhibitoren von größter Bedeutung sind die Gewebe-Inhibitoren der MMPs ("tissue inhibitors of MMPs", TMPs), die lokal durch die Wirtsgewebe und sogar durch Tumorzellen produziert werden (E. C. Kohn et al., 1995).
TIMPs bilden Komplexe mit MMPs, wodurch die Proenzym-Aktivierung und die katalytische MMP-Aktivität unterbunden wird.
Es wurde nachgewiesen, daß die Blockade der MMP-Produktion und/oder Aktivität in vitro und in vivo das Tumorwachstum und die Tumorinvasion (LC. Anderson et al., 1996; X. Wang et al., 1994; A. Albini et al., 1995; A. Melchiori et al., 1992; A. Albini et al., 1994; R. Benelli et al., 1994), die Angiogenese (R. E. Galardy et al., 1994; M. A. Moses, 1993); und die Knorpel/Knochenzerstörung bei Arthritis (J. G. Conway et al., 1995, E. M. O'Byrne et ab, 1995; L. J. Bonassar et al., 1995) verhindert.
Humanes Choriongonadotropin (hCG) ist ein Glykoproteinhormon, das durch die Plazenta und andere normale oder neoplastische Gewebe sekretiert wird. Es wird sekretiert und wirkt derart sowohl in endokriner als auch in parakriner Weise. hCG ist ein Heterodimer, zusammengesetzt aus nicht-kovalent gebundenen Untereinheiten α und β, wobei jede einzelne eine Strukturhomologie mit der "Cystine-Knot-Familie" der Wachstumsfaktoren ("platelet derived growth factor" (PDGF), "vascular endothelial growth factor" (VEGF), "nerve growth factor" (NGF) u. a. aufweist, die mit hCG oder mit der Familie der Glycoproteinhormone nicht verwandt sind, wie durch die Analyse der Kristallstruktur von hCG kürzlich gezeigt werden konnte.
Die dissoziierten hCG-Untereinheiten können im Urin gefunden werden und werden häufig durch Tumore der Blase, Pankreas, Cervix, Lunge, Leber und des Magens und auch durch trophoblastische Tumore und testikuläre Keimzelltumore produziert.
Neben den dissoziierten Untereinheiten kann eine Vielzahl von anderen metabolischen Formen von hCG angetroffen werden, insbesondere im Urin, einschließlich hCG- Isoformen mit unterschiedlichen Glycosilierungsgraden, "nicked" hCG und ein typischer proteolytischer hCG β-Abschnitt, genannt "β-core", der ein über eine Disulfidbrücke verbundenes zweikettiges Polypeptid ist, umfassend die Reste 640 und 55-92 der hCGß-Untereinheit.
Zusätzlich zu den obengenannten Isoformen kann deglykosiliertes hCG durch verschiedene chemische und/oder biotechnologische Methoden erhalten werden, wie z. B. bei Kalyan und Bahl (siehe Kalyan et al., 1983) beschrieben.
"β-core", als deglykosiliertes hCG oder als einzelne isolierte Untereinheiten, weist keine hCG-ähnliche biologische Aktivität auf, stellt aber die Hauptform des immunreaktiven hCG dar und kann pharmazeutische Präparationen von urinösem hCG kontaminieren.
Lunardi-Iskandar et al. (Lunardi-Iskandar et al., 1995) haben nachgewiesen, daß hCG und die hCG-β-Untereinheit KS-Zellinien, die vom Kaposi-Sarkom abgeleitet sind, inhibiert und die Tumorproduktion durch derartige Zellinien in Nacktmäusen inhibiert. Die Regression des Kaposi-Sarkoms wurde bei zwei Patientinnen während der Schwangerschaft gezeigt, also dann, wenn die Konzentration dieses Hormons hoch ist.
Der Anmelder hat früher ebenfalls gezeigt (siehe italienische Patentanmeldung Nr. RM96A309), daß die KS-Zellmembranen, wie oben beschrieben, Bindungsstellen für "β-core" und deglykosiliertes hCG enthalten, woraus geschlossen wurde, daß "β- core" selbst und/oder deglykosiliertes hCG als Agens für die von Lunardi-Iskandar aufgefundenen in vivo und in vitro biologischen Aktivitäten verantwortlich ist.

Beschreibung der Erfindung

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von hCG, hCG-β- Untereinheit sowie von aktiven Fragmenten und Derivaten davon, oder von hCG "β- core" zur Herstellung eines Medikaments zur Prophylaxe und/oder zur Behandlung nicht Tumor-assoziierter Pathologien, die die Inhibition der enzymatischen Aktivität von MMP verlangen. Beispiele für solche Pathologien schließen ein: Chronische inflammatorische Erkrankungen, wie z. B. rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Periodontitis, multiple Sklerose und andere Angiogenese-verwandte Pathologien.
Für die humane Therapie umfaßt die bevorzugte Dosis des aktiven Bestandteils zwischen 10.000 und 500.000 "Units".
Der Verabreichungsweg dieses aktiven Bestandteils kann intravenös, intramuskulär oder subkutan sein. Andere Verabreichungswege, die die gewünschten Blutkonzentration des aktiven Bestandteils sicherstellen können, werden gleichfalls durch die vorliegende Erfindung erfaßt.
hCG ist vorzugsweise rekombinant und kann bspw. durch Expression aus CHO ("Chinese Hamster Ovary") Zellen, die mit der entsprechenden DNA geeignet transfiziert wurden, nach der im Patent EP 160,699 beschriebenen Technik bereitgestellt werden.
Geeignete lyophilisierte pharmazeutische Zusammensetzungen, die hCG enthalten, sind in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 93/11788 offenbart und können vorteilhafterweise im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Flüssige pharmazeutische Formulierungen, direkt zur Verwendung geeignet, werden in der PCT-Anmeldung 95/EP/1778 beschrieben und können auch vorteilhafterweise im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung wird nunmehr mit Hilfe der nachfolgenden Ausführungsbeispiele beschrieben, die in keiner Weise als den Erfindungsgegenstand beschränkend ausgelegt werden dürfen. Das Ausführungsbeispiel bezieht sich auf die Figuren, wie angegeben.

Beschreibung der Figuren

Fig. 4: zeigt ein Zymogramm von Proteinen, sekretiert durch Kaposi-Sarkom- Zellen KS-IMM, inkubiert im Kollagenase-Puffer ohne (A) oder mit r-hCG 20 ug/ml (13), hCG-β-Untereinheit 10 ug/ml (C) oder "β-core"-Fragment 5 ug/ml (D). KS-IMM- Zellen sekretieren die aktive Form (72 kD) von MMP-2, wie durch die weiße Bande für die Lyse bei dem betreffenden Molekulargewicht (A) nachgewiesen. Die MMP-2-Bande verschwand, sobald die Gele mit r-hCG (B), hCG-β-Untereinheit (C) oder "β-core"- Fragment (D) inkubiert wurden.
Spur 1: Molekulargewichtsmarker; Spur 2: nicht vorbehandelte Probe; Spur 3: Probe vorbehandelt mit u-hCG (40 ug/ml).
Fig. 2: zeigt das Resultat eines Zymogramms der Typ I Kollagenase aus Clostridium histolyticum, inkubiert im Kollagenase-Puffer allein (A) oder unter Hinzufügung von r-hCG (B). Die lytische Bande in Gegenwart von r-hCG war viel weniger ausgeprägt als im Kollagenase-Puffer allein.
Spur 1: Molekulargewichtsmarker; Spur 2: Thrombin (25 U); Typ I Kollagenase (5 ug).
Fig. 3a: zeigt das experimentelle Wachstum von KS IMM-Zellen (mit MG), inokuliert in Nacktmäuse, als Kontrollen (erstes Experiment).
Fig. 3b: zeigt das experimentelle Wachstum von KS IMM-Zellen (mit MG), inokuliert in Nacktmäuse, behandelt mit 1 ug/Maus hCG "β-core" (erstes Experiment).
Fig. 4a: zeigt das experimentelle Wachstum von KS IMM-Zellen (mit MG), inokuliert in Nacktmäuse, als Kontrollen (zweites Experiment).
Fig. 4b: zeigt das experimentelle Wachstum der KS IMM-Zellen (mit MG), inokuliert in Nacktmäuse, behandelt mit der β-Untereinheit 7,8 ug/Maus.
Fig. 4c: zeigt das experimentelle Wachstum von KS IMM-Zellen (mit MG), inokuliert in Nacktmäuse, behandelt mit r-hCG 12,5 ug/Maus.
Fig. 5a: zeigt das experimentelle Wachstum von KS IMM-Zellen (drittes Experiment), inokuliert in Nacktmäuse, behandelt mit r-hCG oder hCG "β-core"; insbesondere ist der Unterschied beim Wachstum bis zum 13. Tal; nach der Inokulation dargestellt.
Fig. 5b: zeigt das experimentelle Wachstum von KS IMM-Zellen (drittes Experiment), inokuliert in Nacktmäuse, behandelt mit r-IhCG oder hCG "β-core"; insbesondere zeigt die Figur, daß das Tumorwachstum ähnlich in Kontroll- und behandelten Gruppen voranschritt.
Fig. 6a: zeigt das experimentelle Wachstum von KS IMM-Zellen, inokuliert in Nacktmäuse bei Kontrollen, was die Progression des Tumors am 13. Tag anzeigt.
Fig. 6b: zeigt das experimentelle Wachstum von KS IMM-Zellen, inokuliert in Nacktmäuse, behandelt mit r-hCG 16 ug/Maus, was die Progression des Tumors am 13. Tag anzeigt.
Fig. 6c: zeigt das experimentelle Wachstum von KS IMM-Zellen, inokuliert in Nacktmäuse, behandelt mit hCG "β-core" 5 ug/Maus, was die Progression des Tumors am 13. Tag anzeigt.
Fig. 7: zeigt die Resultate der zymographischen Analysen von 5 Zellinien, entweder in Abwesenheit (-) oder in Gegenwart (+) von r-hCG, hinzugefügt zum Kollagenaseverdau-Puffer bei der Konzentration von 16 ug/ml.
Spur a: Überstand von KS-IST XX Zellen (5 ug Gesamtprotein)
Spur b: Überstand von KS-IST XXVI Zellen (5 ug)
Spur c: Überstand von synovialen Sarkom-Zellen (5 ug)
Spur d. Überstand von KS IMM-Zellen (10 ug)
Spur e: Überstand von MRC5-Zellen (10 ug)
Spur mw: Molekulargewichtsmarker
Die Pfeile links indizieren die elektrophonetische Mobilität der Gelatinase A (A) und der Gelatinase B (B).

Ausführungsbeispiele

Die Beispiele mit Tumorzellen sind nur zum Zwecke der Illustration dargestellt.

Ausführungsbeispiel 1: r-hCG, hCG β-Untereinheit und "β-core"-Fragment inhibieren in vitro Typ IV Kollagenase, produziert durch Kaposi-Sarkomzellen.

KS-IMM ist eine immortalisierte Zellinie, abgeleitet aus einem HIV-negativen, humanen Kaposi-Sarkom.
KS-IMM Zellen wurden bei einer Konfluenz von 80% in DMEM, ergänzt durch 10% FCS aufgezogen und dann für 24 Stunden in FCS-freiem DMEM inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde das konditionierte Medium gesammelt, zentrifugiert für 5 Minuten bei 1000 rpm, 1 : 5 mit 99% Ethanol verdünnt und bei -20 Cº für mindestens 2 Stunden gelagert.
Ethanol-präzipitierte Proteine wurden bei 10000 rmp für 20 Minuten bei 4ºC gesammelt und getrocknet.
Die präzipitierten Proteine wurden in 0,1 Volumen von 40 mM Tris-HCl, pH 7,5 gelöst. Die Gesamtproteinkonzentration wurde durch die Methode von Bradford mit einem kommerziell erhältlichen Kit (Bio-Rad) unter Verwendung von BSA als Standard bestimmt.
Um die Kollagenaseaktivität, sekretiert durch KS-IIVIMM Zellen, im konditionierten Medium zu überprüfen, wurden die präzipitierten Proteine der Zymographie unterzogen.
Vier Proteinproben, jeweils 10 ug, wurden unter nicht-reduzierenden und nichtdenaturierenden Bedingungen auf ein 7% SDS-PAGE-Ott, enthaltend 0,1% Gelatine (Stetler-Stevenson et al., 1989) geladen. Am Ende dieses elektrophoretischen Laufs wurde das Gel für eine Stunde mit 2,5% Triton X-100 gewaschen, um SDS zu entfernen, in vier Stücke geschnitten, jeweils eine Probe enthaltend, und für die Dauer von 18 Stunden bei 37ºC in 40 mM Tris-HCl, 0,2 M NaCl, 10 mM CaCl&sub2;, pH 7,4 (Kollagenase- Puffer) in Abwesenheit und in Gegenwart von 20 ug/nil r-hCG oder 10 ug/ml hCG-β- Untereinheit bzw. 5 ug/ml "β-core"-Fragment inkubiert.
Die Gelstücke wurden dann mit einer Lösung markiert: 1.0% Essigsäure, 50% Methanol und 12,5% einer Lösung 1% Coommassie Brilliant Blue (CBB) für eine Stunde und entfärbt mit 7,5% Essigsäure, 25% Methanol.
Die Kollagenaseaktivität wurde durch eine weiße Bande über einem blauen Hintergrund nachgewiesen. Die Resultate sind in Fig. 1 dargestellt.

Ausführungsbeispiel 2: r-hCG inhibiert in vitro Typ I Kollagenase

Zwei Proben der Typ I Kollagenase aus Clostridium hissolyticum (Sigma code C 0130), jeweils 5 ug, wurden der Zymographie unterzogen, wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben. Am Ende des elektrophoretischen Laufs wurde das Gel in zwei Stücke geschnitten, inkubiert ohne und mit 20 ug/ml r-hCG und, wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, weiterbehandelt. Die Resultate sind in Fig. 2 dargestellt.

Ausführungsbeispiel 3: r-hCG, seine β-Untereinheit und sein "β-core"-Fragment inhibieren in vivo den Angiogenese-Prozeß.

Materialien und Methoden

Tiere

C57/BL/6 Mäuse und 37 (CD-1)BR Nacktmäuse wurden von Charles River (Calco, Como, Italien) erhalten.

Reagenzien

Matrigel, ein Extrakt des murinen Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Tumors, aufgezogen in C57BL/6 Mäusen, wurde, wie zuvor beschrieben, hergestellt (Kleinman et al., 1986).
Kurz gesagt, wurde das EHS Tumormaterial mit einem Polytron-Homogenisierer in einem kochsalzhaltigen Puffer (3,4 M NaCl, 50 mM Tris pH 7,4, 4 mM EDTA mit 2 mM N-Ethylmaleimid) homogenisiert.
Das Homogenat wurde durch Zentrifugation vom Überstand abgetrennt und diese Vorgehensweise dreimal wiederholt. Der verbleibende Niederschlag wurde in zwei mol/l Harnstoff (2 M Harnstoff, 50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl) über Nacht solubilisiert.
Der Überstand wurde durch Zentrifugation gereinigt und ausgiebig gegen Tris- Kochsalzlösung und schließlich gegen Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) dialysiert. Das sich hieraus ergebende Material, Matrigel, ist reich an Basalmembrankomponenten (Laminin, Kollagen IV, Nidogen und Perlecan) mit geringen Mengen an Wachstumsfaktoren (Siegal et al., 1993). Das verwendete Heparin war Clarisco (Shwarz Pharma S.p.A., San Grato-Lodi, Italien).

Zellüberstände

KS-Spindelzellkulturen wurden zur Herstellung der Überstände verwendet. KS-Zellen wurden im RPMI-1640 Medium, 10% fötales Kälberserum, ergänzt durch Glutamin (300 ug/ml), Heparin (60 mg/500 ml) und ECGS (30 mg/500 ml) aufgezogen.

In vivo Angiogenese

Matrigel (MG, 12 mg/ml), eine rekonstituierte Basalmembran, ist bei 4ºC flüssig und verfestigt sich, sobald subkutan inokuliert, in ein festes Gel unter der Haut der Mäuse.
Die Hinzufügung von Heparin 2500 U/ml und 12 ul der KS-Überstände (20 pl/ml) zu einem Endvolumen von 600 ul führt zu einer starken Angiogenese-Antwort mit einer Neubildung von Gefäßen im Matrigel, keine Reaktion wird durch Matrigel alleine induziert.
Wir haben die Wirkung von hCG und der Derivate durch direkte Hinzufügung zur Matrigel-Mischung vor der Injektion überprüft. Vier Tage nach der Injektion wurden die Tiere geopfert und die Gele gewonnen und gewogen.
Der Hämoglobingehalt wurde als direktes Maß für die Angiogenese gemessen. Die gewonnenen Gele wurden zerstückelt und in Wasser dispergiert, und das freigesetzte Hämoglobin wurde unter Verwendung eines Drabkin Reagens Kits 525 (Sigma) gemessen, die Konzentration wurde aus der Standardkurve berechnet und auf 100 mg des gewonnenen Gels normalisiert.

Das experimentelle Wachstum von KS Zellen in vivo

Vier verschiedene Experimente wurden durchgeführt, unter verschiedenen Bedingungen:
1) KS IMM Zellkulturen wurden in vitro mit "β-core" 0,5 ug/ml für 96 Stunden vor der Injektion in Nacktmäuse vorbehandelt.
Zwei Gruppen von Tieren wurden verwendet; der Kontrollgruppe (8 Mäuse) wurde i.p. physiologische Lösung injiziert, der zweiten (9 Mäuse) wurde 1 ug/30 gr Maus "β- core" 96 Stunden vor der Zellinokulation injiziert.
Die Dosierung von "β-core" im ersten Experiment wurde auf der Basis der Verabreichung beim Menschen berechnet, unter Verwendung von äquivalenten Dosen unter Berücksichtigung des Verhältnisses zwischen dem menschlichen und dem Mäuse- Körpergewicht und der stöchiometrischen Verhältnisse zwischen hCG und "β-core".
Allen Mäusen wurden 5 · 10&sup6; KS IMM Zellen, suspendiert in 250 ul MG, injiziert. Die Behandlungen wurden täglich bis zum Ende des Experiments fortgesetzt.
2) KS IMM wurde in vitro mit 1,6 ug/ml r-hCG oder 1 ug/ml/β-Untereinheit 24 Stunden vor Inokulation in Nacktmäuse vorbehandelt.
Die Tiere (8 in jeder Gruppe) wurden mit physiologischer Lösung oder mit r-hCG 12,5 ug/30 gr Maus oder β-Untereinheit 7,8 ug/30 gr Maus 24 Stunden vor der Inokulation vorbehandelt.
Den Tieren wurden dann s.c. 5 · 106 KS IMM-Zellen ohne MG inokuliert. Für die intraläsionale Behandlung wurden r-hCG 12,5 ug/30 gr Maus alle 48 Stunden oder β- Untereinheit 7,8 ug/30 gr Maus täglich für 3 Wochen verwendet.
Die Kontrollen wurden täglich durch intraläsionale Injektion einer physiologischen Lösung behandelt. Die Dosen wurden auf der Basis der Veröffentlichung von Lunardi- Iskandar et al. (Lunardi-Iskandar et al., 1995) gewählt, in welcher 12,5 ug/30 gr Maus von u-hCG eingesetzt wurden.
Wir haben die gleiche Dosis für r-hCG und die korrespondierende stöchiometrische Dosierung (7,8 ug/30 gr Maus) für die β-Untereinheit verwendet.
3) Zellen und Nacktmäuse wurden nicht vorbehandelt. Den Tieren (8 in jeder Gruppe) wurden s.c. 5 · 10&sup6; KS LMM-Zellen pro 0,2 ml serumfreien Medium plus MG (250 ul, 10 mg/ml) inokuliert.
Die Tiere wurden i.p. mit r-hCG 16 ug/30 gr Maus oder "β-core" 5 ug/30 gr Maus dreimal während der ersten Woche und täglich für die nachfolgenden Wochen behandelt. Dieses Experiment erforderte 21 Tage.
4) Dieses Experiment wurde wie bei 3 durchgeführt, allerdings bei der initialen Phase des Tumorwachstums (13. Tag) abgebrochen.
Wir haben 7 Mäuse für die Kontrollgruppe, 6 für die mit β-Untereinheit 10 ug/Maus behandelte Gruppe und 7 für die mit "β-core" 5 ug/Maus behandelte Gruppe verwendet. Eine der Mäuse, behandelt mit "β-core", starb am 8. Tag nach der Inokulation und wurde für unsere Ergebnisse nicht berücksichtigt; diese Maus zeigte gleichwohl einen schwer tastbaren Tumor.
Am 13. Tag wurden die Tumoren herausgeschnitten, gewogen und für den Angiogenesebefund, gemessen in Form des Hämoglobingehalts, weiterbehandelt.

Gelatine-Zymographie

Die Gelatine-Zymographen, verwendet, um die Typ IV Kollagenasen zu visualisieren, die auch eine charakteristische Gelatinase-Aktivität (Gelatinase A und B) haben, wurden nach Heussen and Dowdle (Heussen und Dowdle, 1980) mit geringfügigen Modifikationen erstellt.
SDS-PAGE Gel (7%), enthaltend co-polymerisierte Gelatine bei einer Endkonzentration von 0,6 mg/ml oder 0,06% w/v, wurde bereitgestellt. Die Proteinproben (10 ug für KS IMM und MRC5-Zellinien und 5 ug für KS Spindel-Zellinien und synoviale Sarkom Zellinien) wurden in 40 mM Tris, pH 7,5 wieder gelöst und in SDS-PAGE Gel (7%), enthaltend co-polymerisierte Gelatine (0,1%), elektrophoretisch aufgetrennt.
Nach der Elektrophorese wurde das Gel viermal (jeweils 30 Minuten) in 2,5% Triton X100 gewaschen, um das SDS zu beseitigen, in kleine identische Teile geschnitten und für die Dauer von 18 Stunden bei 37ºC in 40 mM Tris, 200 mM NaCl, 10 mM CaCl&sub2; Puffer, pH 7,4 entweder in Abwesenheit (-) oder in Gegenwart (+) von r-hCG 16 ug/ml inkubiert.
Nach dem Verdau wurde das Gel mit einer Lösung gefärbt: 10% Essigsäure, 50% Methanol und 12,5% einer Lösung von 1% Coommassie brilliant blue für eine Stunde und entfärbt mit 7,5% Essigsäure und 20% Methanol.
Die enzymverdauten Bereiche wurden als weiße Banden gegen den blauen Hintergrund identifiziert.

Ergebnisse

r-hCG und β-Untereinheit inhibieren die Angiogenese-Antwort in Matrigel (MG) Schwämmen

In diesem experimentellen Modell kann MG allein als Negativkontrolle verwendet werden, während KS-Überstände in Gegenwart von Heparin die Positivkontrolle darstellen, da sie die Neovaskularisierung in das Gel induzieren.
Die Hinzufügung von hCG zu MG, enthaltend KS-Überstände und Heparin, reduzierte die Bildung von neuen Blutgefäßen. Der inhibitorische Effekt wurde auch durch die Messung des Hämoglobingehalts beurteilt.
Vier Tage nach der MG-Injektion wurden die Tiere geopfert und die Gele zur Bewertung der Angiogenese extrahiert.
Hier berichten wir von Resultaten des ersten Experiments; r-hCG 16 ug/ml und die β- Untereinheit 10 ug/ml wurden getestet. Die Daten sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.

hCG und Derivate reduzieren das experimentelle Wachstum von KS Zellen in vivo in der Anfangsphase durch die Kontrolle des Angiogenese-Prozesses.

Die Inokulation von KS IMM-Zellen subkutan in Nacktmäuse fördert die Bildung eines experimentellen Tumors. Vier Testreihen wurden unter Verwendung dieses experimentellen Modells durchgeführt.
Das erste Experiment erfolgte, indem KS IMM-Zellen mit Matrigel inokuliert wurden. Ein schnelles Tumorwachstum wurde beobachtet. Gleichwohl zeigten die Ergebnisse (Fig. 3) keinen Unterschied zwischen der Kontrollgruppe und der mit "β-core" behandelten Gruppe, weil möglicherweise die intraperitoneale Dosierung (1 ug/Maus) von "β- core" zu niedrig war.
Im zweiten Experiment (Fig. 4) wurden KS IMM-Zellen ohne Matrigel injiziert, um die intraläsionale Inokulation der Substanzen zu überprüfen. Die Abwesenheit von Matrigel rief ein verzögertes und unregelmäßiges Tumorwachstum hervor: In der Kontrollgruppe genauso wie in der mit β-Untereinheit behandelten Gruppe zeigten 4 von 8 Mäusen keine Tumorbildung; in der r-hCG behandelten Gruppe zeigten 2 von 8 Mäusen keine Tumorbildung.
Beim dritten Experiment (Fig. 5 a-b und Fig. 6) wurden, nachdem geeignete allgemeine Bedingungen etabliert waren, r-hCG (16 ug/30 gr Maus, entsprechend 0,5 mg/kg) und "β-core" (5 ug/30 gr Maus) getestet: Eine Reduktion des Tumorwachstums in der initialen Phase wurde in der Tat beobachtet.
In dem folgenden Experiment wurden, unter den gleichen experimentellen Konditionen, r-hCG (16 ug/30 gr Maus) und "β-core" (5 ug/30 gr Maus) getestet. Die Analyse der Tumorproben am 13. Tag bestätigte, daß hCG und Derivate in der Lage sind, die Vaskularisierung der KS-Läsionen in vivo zu kontrollieren, wobei sowohl das Tumorwachstum als auch der Hämoglobingehalt in der initialen Phase reduziert sind (Tabellen 2-3).
Die Hämoglobinmessung wurde auf Tumorproben als ein in vivo Angiogenese- Testsystem durchgeführt.

hCG und Derivate inhibieren teilweise die gelatinolytische Aktivität von MMP2

Die Überstände aus 5 Zellinien (KS IMM Zellinie, KS IST XX Spindelzellinie, abgeleitet aus einem HIV+ Patienten, KS IST XXVI Spindelzellinie, abgeleitet aus einem HIV- Patienten, eine synoviale Sarkom-Zellinie und eine humane MRCS Fibroblasten- Zellinie) wurden auf einer Gelatine-Zymographie analysiert, und zwar in Abwesenheit oder in Gegenwart des Kollagenase-Puffers von hCG und Derivaten.
R hCG (20 ug/ml), β-Untereinheit (10 ug/ml) und das "β-core" Fragment (5 ug/ml), hinzugefügt zum Kollagenase-Puffer, inhibieren vollständig die gelatinolytische Aktivität der 72 kDa Typ IV Kollagenase (MMP2) von KS IMM (Fig. 1); niedrigere Dosierungen (r-hCG 1,6 ug/ml, β-Untereinheit 1 ug/ml und "β-core" 0,5 ug/ml) ergeben eine partielle Inhibition.
Für die anderen untersuchten Zellinien, die größere Mengen an Gelatinase A (KS Spindel-Zellinien und die synoviale Sarkom-Zellinie) produzierten, lag eine teilweise Inhibition durch r-hCG 16 ug/ml vor (Fig. 7). Diese Zellinien erforderten höhere Dosen der Substanzen.

Diskussion

Um die beste Vorgehensweise für die in vivo Testverfahren zu ermitteln, wurden vier Experimente zum experimentellen Wachstum von KS-Zellen in Nacktmäusen durchgeführt, und zwar unter unterschiedlichen Bedingungen. Im ersten Experiment (Fig. 3) wurden KS-Zellen mit MG inokuliert; in dem zweiten (Fig. 4), für problemlose intraläsionale Inokulation von Substanzen, wurde die Zellen ohne MG injiziert.
Beim Vergleich der beiden korrespondierenden Grafiken können wir sehen, daß die Inokulation von KS Zellen mit MG den Beginn des Tumorwachstums begünstigt. Diese Bedingung wurde daher in den folgenden Experimenten beibehalten. Nach dem ersten und dem zweiten Experiment, bei welchen die Vorbehandlung ineffektiv war, wurde die Vorbehandlung nicht wiederholt.
Im dritten Experiment kann eine Reduktion im Wachstum, bis zum 13. Tag nach der Inokulation (Fig. 5a und Fig. 6), beobachtet werden. Der Unterschied in der Größe zwischen Kontrollgruppe und den behandelten Gruppen war signifikant, mit einer Reduktion auf 69% für r-hCG und 57% für "β-core" am 11. Tag und auf 66% für r-hCG und 75% für "β-core" am 13. Tag. Nachfolgend progredierten alle Gruppen in ähnlicher Weise (Fig. 5b).
Ein ähnliches Verhalten ist mit einer anderen anti-angiogenen Substanz, Thrombospondin-1, beobachtet worden (P. Boukamp, 1996).
Um die anti-angiogene Aktivität von hCG und Derivaten zu bestätigen, ist das vierte Experiment (siehe Resultate in den Tabellen 1-3) in der gleichen Weise ausgeführt worden, allerdings unter Opferung der Mäuse in der initialen Phase des Tumorwachstums.
Die Anzahl der Proben in den Tabellen zeigen die Stücke des Tumors, entnommen für die Messung, eines für jedes Tier. Die Analyse des Tumorgewichts und der Hämoglobingehalt in den Tumorproben zeigte an, daß die Inhibition des Tumorwachstums in der Tat mit reduzierter Angiogenese assoziiert war.
Die Resultate der Gelatine-Zymographie bestätigen, daß hohe Dosen der Substanzen für die Inhibition der Metalloprotease-Aktivität notwendig sind. Keine Inhibition der Kollagenaseaktivität, produziert durch KS IMM-Zellen, kann für die Dosierungen beobachtet werden, die in vitro das Wachstum inhibieren (1,6 ug/ml r-hCG, 0,5 ug/ml "β- core"), allerdings kann eine vollständige Inhibition mit einer höheren Dosierung (20 ug/ml r-hCG, 10 ug/ml β-Untereinheit und 5 gg/ml "β-core") erreicht werden. Für die KS Spindel-Zellinien und die synoviale Sarkom-Linie (welche eine größere Menge an MMP2 exprimieren) liegt eine Teilinhibition vor, unter Berücksichtigung der höheren enzymatischen Aktivität. Tabelle 1 Inhibition der Angiogenese induziert in Matrigel durch KS-26 Produkte, gemessen als Absorbanz bei 540 nm Tabelle 2 Inhibition der KS IMM Angiogenese, gemessen als Hämoglobingehalt Tabelle 3 Inhibition des KS IMM Tumorwachstums gemessen als Tumorgewicht

Zitatstellen

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Claims

1. Verwendung von hCG, hCG β-Untereinheit oder eines aktiven Abschnitts oder Derivats davon oder von hCG "β-core" für die Herstellung eines Medikaments zur Prophylaxe und/oder zur Behandlung von nicht Tumorassoziierten Pathologien, bei welchen das Medikament die enzymatische Aktivität der Matrixmetalloprotease (MMP) inhibiert.

2. Verwendung nach Anspruch 1 zur Behandlung von chronischen Entzündungserkrankungen.

3. Verwendung nach Anspruch 1 zur Behandlung von Angiogenese-abhängigen Erkrankungen, wobei die Angiogenese-abhängige Erkrankung korneale Neovaskularisierung, diabetische Retinopathie, neovaskuläres Glaukom, Hämangiom, Psoriasis oder Skleroderma ist.

4. Verwendung nach Anspruch 1 zur Behandlung von multipler Sklerose.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das hCG rekombinant ist.