DE69637179T2

DE69637179T2 - Angiostatinfragmente und verfahren für deren verwendung

Info

Publication number: DE69637179T2
Application number: DE69637179T
Authority: DE
Inventors: M. Judah Brookline FOLKMAN; Michael S. Winchester O'REILLY; Yihai Cao; Jie Newton Center LIN
Original assignee: Childrens Medical Center Corp
Current assignee: Childrens Medical Center Corp
Priority date: 1995-04-26
Filing date: 1996-04-26
Publication date: 2008-04-10
Anticipated expiration: 2016-04-27
Also published as: CA2219081C; PL323256A1; HUP9800784A2; EP0824546B1; WO1996035774A3; JPH11508228A; CZ334097A3; AU5579596A; CA2219081A1; NZ307044A; MX9708217A; ATE368051T1; JP3787157B2; HUP9800784A3; EP0824546A2; NO974943D0; HK1002457A1; BR9608326A; DE69637179D1; ES2292174T3

Description

Erfindungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Endothelinhibitoren, die reversibel die Proliferation von Endothelzellen inhibieren, welche als Angiostatine bezeichnet werden. Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung Angiostatin-Proteine, die aus Körperflüssigkeiten wie Blut oder Urin isoliert werden können, oder die durch rekombinante, enzymatische oder chemische Verfahren synthetisiert werden können. Das Angiostatin ist in der Lage, Angiogenese-verwandte Erkrankungen zu inhibieren und angiogene Prozesse zu modulieren. Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung diagnostische Tests und Kits für die Angiostatin-Messung, histochemische Kits zur Lokalisierung von Angiostatin, DNA-Sequenzen, die Angiostatin kodoeren und molekulare Proben, um die Angiostatin-Biosynthese zu überwachen, Antikörper, die für das Angiostatin spezifisch sind, die Entwicklung von Peptidagonisten und -antagonisten gegen den Angiostatin-Rezeptor, Antiangiostatin-Rezeptor-spezifische Antikörperagonisten und -antagonisten und zytotoxische Mittel, die an Angiostatin-Peptide gebunden sind.
Hintergrund der Erfindung
So wie er hier verwendet wird, bedeutet der Begriff „Angiogenese" die Generierung neuer Blutgefäße in einem Gewebe oder Organ. Unter normalen physiologischen Bedingungen erfahren Menschen oder Tiere nur in sehr spezifischen beschränkten Situationen eine Angiogenese. Beispielsweise wird die Angiogenese normalerweise bei der Wundheilung, bei der fötalen und embryonalen Entwicklung und der Bildung des Corpus luteum, Endometrium und der Placenta beobachtet. Der Begriff „Endothelium" meint eine dünne Schicht flacher Epithelzellen, die seröse Höhlen, Lymphgefäße und Blutgefäße auskleiden.
Sowohl die kontrollierte als auch die unkontrollierte Angiogenese laufen vermutlich in gleicher Weise ab. Endothelzellen sind Pericyten, die von einer Basalmembran umgeben sind und bilden kapilläre Blutgefäße. Angiogenese beginnt durch den Abbau der Basalmembran durch Enzyme, die von Endothelzellen und Leukocyten freigesetzt werden. Die Endothelzellen, die das Lumen der Blutgefäße auskleiden, durchdringen dann die Basalmembran. Angiogene Stimulationsfaktoren induzieren die Endothelzellen dazu, durch die aufgebrochene Basalmembran zu migrieren. Die migrierenden Zellen bilden einen „Spross" des Parentalblutgefäßes, wobei die Endothelzellen Mitose durchlaufen und proliferieren. Die Endothel-Sprossen verschmelzen miteinander, um kapilläre Schlaufen zu bilden, welche das neue Blutgefäß erzeugen.
Eine permanente, nicht regulierte Angiogenese tritt bei einer Vielzahl von Krankheitsstadien, Tumormetastasen und bei dem abnormen Wachstum von Endothelzellen auf, und unterstützt die pathologischen Schädigungen, die bei diesen Zuständen gesehen werden. Die verschiedenen pathologischen Erkrankungsstadien, in denen eine nicht regulierte Angiogenese vorliegt, sind als Angiogenese-abhängige oder Angiogenese-assoziierte Erkrankungen gruppiert worden.
Die Hypothese, dass Tumorwachstum Angiogenese-abhängig ist, wurde zuerst 1971 vorgeschlagen (Folkman J., Tumor angiogenesis: Therapeutic implications., N. Engl. Jour. Med. 285: 1182-1186, 1971). In einfacher Form gesagt, bedeutet dies: „Sobald ein Tumor-„Beginn” aufgetreten ist, muss jeder Anstieg der Tumorzellpopulation ein Anstieg an neuen Kapillaren, die in dem Tumor konvergieren, vorangehen." Tumor-„Beginn” wird derzeit so verstanden, dass es eine prävasculäre Änderung des Tumorwachstums anzeigt, bei dem eine Population an Tumorzellen, die einige wenige Kubikmillimeter Volumen einnehmen und nicht einige wenige Millionen Zellen überschreiten, mit vorhandenen Wirtsmikrogefäßen überleben können. Die Expansion des Tumorvolumens über dieses Stadium hinaus benötigt die Induzierung neuer kapillärer Blutgefäße. Beispielsweise wären pulmonäre Micrometastasen in dem frühen prävasculären Stadium in Mäusen nicht nachweisbar, außer durch Hochleistungsmikroskopie anhand histologischer Schnitte.
Beispiele für indirekte Beweise, die dieses Konzept unterstützen, schließen ein:

(1) Die Wachstumsrate von Tumoren, die in subkutane transparente Kammern in Mäusen implantiert sind, ist langsam und linear, bevor die Neovascularisierung beginnt, und schnell und nahezu exponentiell nach der Neovascularisierung (Algire G.H. et al. Vascular reactions of normal and malignant tumors in vivo. I. Vascular reactions of mice to wounds and to normal and neoplastic transplants. J. Natl. Cancer Inst. 6: 73-85, 1945).
(2) Tumoren, die in isolierten perfundierten Organen gezüchtet werden, in denen Blutgefäße nicht proliferieren, sind auf 1-2 mm³ beschränkt, aber sie expandieren schnell um das ungefähr 1.000-Fache dieses Volumens, wenn sie in Mäuse transplantiert werden, und neovascularisiert werden. (Folkman J. et al., Tumor behavior in isolated perfused Organs: In vitro growth and metastasis of biopsy material in rabbit thyroid and canine intestinal segments. Annals of Surgery 164: 491-502, 1966)
(3) Tumorwachstum in der avasculären Cornea schreitet langsam und in einer linearen Form voran, aber es ändert sich in exponentielles Wachstum nach der Neovascularisierung. (Grimbrone, M. A. Jr. et al., Tumor growth and neovascularization: An experimental model using the rabbit cornea. J. Natl. Cancer Institute 52: 41-427, 1974)
(4) Tumoren, die in wässriger Flüssigkeit der hinteren Kammer des Kaninchenauges suspendiert sind, bleiben überlebensfähig, nicht vascularisiert und in der Größe auf unter 1 mm³ begrenzt. Sobald sie in das Gefäßbett der Iris implantiert werden, werden sie neovascularisiert und wachsen schnell und erreichen innerhalb von 2 Wochen 16.000 Mal ihr Originalvolumen. (Grimbone M.A. Jr. et al., Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization. J. Exp. Med. 136: 261-276)
(5) Wenn Tumoren in die Chorioallantoinmembran des Hühnerembryos implantiert werden, wachsen sie während einer avasculären Phase von über 72 Stunden langsam, aber sie überschreiten einen mittleren Durchmesser von 0,93 + 0,29 mm nicht. Eine schnelle Tumorexpansion tritt innerhalb von 24 Stunden nach dem Beginn der Neovascularisierung auf, und am Tag 7 erreichen diese vascularisierten Tumore einen mittleren Durchmesser von 8,0 + 2,5 mm. (Knighton D., Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British J. Cancer, 35: 347-356, 1977)
(6) Vasculäre Gruppierungen von Metastasen in der Kaninchenleber weisen eine Heterogenität in der Größe der Metastasen auf, aber sie zeigen einen relativ gleichförmigen Ausgangspunkt der Größe, bei dem die Vascularisierung vorhanden ist. Tumoren sind im Allgemeinen bis zu 1 mm im Durchmesser avasculär, aber sie werden über diesen Durchmesser hinausgehend neovascularisiert. (Lien W. et al., the blond supply of experimental liver metastases. II. A microcirculatory study of normal and tumor vessels of the liver with the use of perfused silicone rubber. Surgery 68: 334-340, 1970)
(7) In transgenen Mäusen, die Carcinome in den Betazellen der Pancreasinseln entwickeln, sind die prävasculären hyperplastischen Inseln auf eine Größe von unter 1 mm begrenzt. Im Alter von 6-7 Wochen sind 4-10 % der Inseln neovascularisiert, und aus diesen Inseln entstehen größere vascularisierte Tumoren von mehr als dem 1.000-Fachen des Volumens der prävasculären Inseln. (Folkman J. et al., Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature 339: 58-61, 1989)
(8) Ein spezifischer Antikörper gegen VEGF (vasculärer Endothelwachstumsfaktor) reduziert die Dichte der Mikrogefäße und verursacht die „signifikante oder dramatische" Inhibierung des Wachstums dreier menschlicher Tumoren, die von VEGF als ihrem einzigen Mediator der Angiogenese (in Nacktmäusen) abhängen. Der Antikörper inhibiert nicht das Wachstum der Tumorzellen in vitro. (Kim K.J. et al., Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo. Nature 362: 841-844, 1993)
(9) Ein monoklonaler anti-bFGF Antikörper verursacht 70 % Inhibierung des Wachstums eines Maustumors, welcher von der Sekretion von bFGF als seinem einzigen Mediator der Angiogenese abhängt. Der Antikörper inhibiert das Wachstum der Tumorzellen in vitro nicht. (Hori A. et al., Suppression of solid tumor growth by immunoneutralizing monoclonal antibody against human basic fibroblast growth factor. Cancer Research, 51: 6180-6184, 1991)
(10) Intraperitoneale Injektion von bFGF verstärkt das Wachstum eines Primärtumors und dessen Metastasen durch die Stimulierung des Wachstums der kapillären Endothelzellen im Tumor. Die Tumorzellen selbst haben keine Rezeptoren für bFGF, und bFGF ist kein Mitogen für die Tumorzellen in vitro. (Gross J.L. et al., Modulation of solid tumor growth in vivo by bFGF. Proc. Amer. Assoc. Canc. Res. 31: 79, 1990)
(11) Ein spezifischer Angiogeneseinhibitor (AGM-1470) inhibiert das Tumorwachstum und die Metastasen in vivo, ist aber bei der Inhibierung der Tumorzellenproliferation in vitro viel weniger wirksam. Er inhibiert die vasculäre Endothelzellproliferation halb-maximal bei einer 4 log niedrigeren Konzentration als er die Tumorzellproliferation inhibiert. (Ingber D. et al., Angioinhibins: Synthetic analogues of fumagillin which inhibit angiogenesis and suppress tumor growth. Nature, 48: 555-557, 1990). Es gibt auch indirekte klinische Hinweise, dass das Tumorwachstum Angiogenese-abhängig ist.
(12) Menschliche Retinoblastome, die in den Glaskörper metastasieren, entwickeln avasculäre Sphäroide, die auf weniger als 1 mm³ beschränkt sind, trotz der Tatsache, dass sie lebensfähig sind und ³H-Thymidin einschließen (wenn sie aus dem entkernten Auge entfernt werden und in vitro analysiert werden).
(13) Karzinome des Eierstocks metastasieren in die Peritonealmembran als winzige avasculäre weiße Körner (1-3 mm³). Diese Implantate wachsen selten stärker, bis einer oder mehrere davon neovascularisiert werden.
(14) Die Intensität der Neovascularisierung beim Brustkrebs (Weidner N. et al., Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive breast carcinoma. N. Engl. J. Med. 324: 1-8, 1991, und Weidner N. et al., Tumor angiogenesis: A new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma, J. Natl. Cancer Inst. 84: 1875-1887, 1992) und beim Prostatakrebs (Weidner N., Carroll P.R., Flax J., Blumenfeld W., Folkman J. Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive protate carcinoma. American Journal of Pathology, 143 (2): 401-409, 1993) korreliert stark mit dem Risiko der weiteren Metastasierung.
(15) Metastasen des menschlichen Hautmelanoms sind vor der Neovascularisierung selten. Der Beginn der Neovascularisierung führt zu einer erhöhten Dicke der Läsion und einem erhöhten Risiko der Metastasierung. (Srivastava A. et al., The prognostic significance of tumor vascularity in intermediate thickness (0,76-4,0 mm thick) skin melanoma. Amer. J. Pathol. 133: 419-423, 1988)
(16) Beim Blasenkrebs ist das Niveau des angiogenen Peptids bFGF im Urin ein sensitiverer Indikator des Status und des Ausmaßes der Erkrankung als die Zytologie. (Nguyen M. et al., Elevated levels of an angiogeneic peptide, basic fibroblast growth factor, in urine of bladder cancer patients. J. Natl. Cancer Inst. 85: 241-242, 1993)

WO 95/29242 offenbart DNA-Sequenzen, die Angiostatin kodieren, welche einem 1-4 Kringelfragment von Plasminogen entsprechen. DNA-Sequenzen, die die Kringel-Regionen 1, 2, 3, 1-2 oder 2-3 kodieren, sind nicht erwähnt.
Daher ist es klar, dass Angiogenese eine Hauptrolle bei der Metastasierung von Krebs spielt. Wenn diese angiogene Aktivität unterdrückt oder eliminiert werden könnte, dann würde der Tumor, obwohl er vorhanden ist, nicht wachsen. Im Krankheitsstadium könnte die Prävention der Angiogenese die Schädigung abkehren, die durch die Invasion des neuen mikrovasculären Systems verursacht worden ist. Therapien, die auf eine Kontrolle des Angiogeneseprozesses ausgerichtet sind, könnten zu einer Außerkraftsetzung oder Abschwächung dieser Erkrankung führen.
Was daher notwendig ist, ist eine Zusammensetzung und ein Verfahren, die das unerwünschte Wachstum von Blutgefäßen inhibieren, insbesondere in Tumoren. Ebenfalls benötigt wird ein Verfahren zum Nachweisen, Messen und Lokalisieren der Zusammensetzung. Die Zusammensetzung sollte in der Lage sein, die Aktivität endogener Wachstumsfaktoren in prämetastasierenden Tumoren zu überwinden, und die Bildung von Kapillaren in den Tumoren verhindern, wodurch das Wachstum der Tumoren inhibiert wird. Die Zusammensetzung, Fragmente der Zusammensetzung und Antikörper, die für die Zusammensetzung spezifisch sind, sollten auch in der Lage sein, die Bildung von Kapillaren in Angiogeneseprozessen zu modulieren, wie beispielsweise bei der Wundheilung und der Reproduktion. Die Zusammensetzung und das Verfahren zur Inhibierung der Angiogenese sollten vorzugsweise nicht toxisch sein und wenige Nebenwirkungen hervorrufen. Ebenfalls benötigt wird ein Verfahren zum Nachweisen, Messen und Lokalisieren der Bindungsstellen der Zusammensetzung, wie auch der Stellen der Biosynthese der Zusammensetzung. Die Zusammensetzung und die Fragmente der Zusammensetzung sollten in der Lage sein, an andere Moleküle, sowohl für radioaktive und auch nicht-radioaktive Markierungszwecke, konjugiert zu werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliende Erfindung wird durch die Ansprüche definiert.
Erfindungsgemäß werden Zusammensetzungen und Verfahren bereitgestellt, die bei der Modulierung der Angiogenese wirksam sind, und die nicht erwünschte Angiogenese inhibieren, insbesondere die Angiogenese, die mit Tumorwachstum zusammenhängt. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Protein, welches als „Angiostatin" bezeichnet worden ist, welches durch seine Fähigkeit definiert wird, die Angiogeneseaktivität endogener Wachstumsfaktoren, wie bFGF in vitro zu überwinden, und durch seine Aminosäuresequenzhomologie und strukturelle Ähnlichkeit mit einem inneren Teil des Plasminogens, welches ungefähr bei der Plasminogen-Aminosäure 98 beginnt. Angiostatin umfasst ein Protein mit einem Molekulargewicht von zwischen ungefähr 38 Kilodalton und 45 Kilodalton, wie durch reduzierende Polyacrylamidgelelectrophorese bestimmt wird, und mit einer Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen ähnlich der eines Fragments des murinen Plasminogens ist, welches bei der Aminosäure Nr. 98 eines intakten murinen Plasminogenmoleküls (SEQ ID Nr. 2) beginnt.
Die Aminosäuresequenz von Angiostatin variiert leicht zwischen den Spezies. Beispielsweise ist beim menschlichen Angiostatin die Aminosäuresequenz im Wesentlichen ähnlich der Sequenz des oben beschriebenen murinen Plasminogenfragments, obwohl eine aktive menschliche Angiostatin-Sequenz entweder bei der Aminosäure Nr. 97 oder 99 der intakten menschlichen Plasminogenaminosäuresequenz beginnen kann. Des Weiteren haben Fragmente vom menschlichen Plasminogen ähnliche antigene Wirkung, wie in einem Maus-Tumor-Modell gezeigt worden ist. Es ist verständlich, dass die Anzahl an Aminosäuren in dem aktiven Angiostatin-Molekül variieren kann, und dass alle Aminosäuresequenzen, die eine Endothel-inhibierende Wirkung haben, als in die vorliegende Erfindung eingeschlossen angesehen werden.
Die vorliegende Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die in den Ansprüchen 1-13 definiert ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zur Behandlung von Erkrankungen und von Prozessen, die durch unerwünschte und nicht kontrollierte Angiogenese vermittelt werden, indem an einen Menschen oder ein Tier eine Zusammensetzung verabreicht wird, die ein im Wesentlichen gereinigtes Angiostatin oder Angiostatin-Derivat in einer Dosierung umfasst, die ausreicht, um die Angiogenese zu inhibieren. Die vorliegende Erfindung ist besonders nützlich zur Behandlung oder zur Unterdrückung des Wachstums von Tumoren. Die Verabreichung von Angiostatin an einen Menschen oder ein Tier mit prävascularisierten, metastasierenden Tumoren wird das Wachstum oder die Expansion dieser Tumore verhindern.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch DNA-Sequenzen, die Angiostatin-Fragmente kodieren, Expressionsvektoren, die DNA-Sequenzen enthalten, welche Angiostatin-Fragmente kodieren, und Zellen, welche einen oder mehrere Expressionsvektoren enthalten, die DNA-Sequenzen enthalten, die Angiostatin kodieren. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner gentherapeutische Verfahren, in denen DNA-Sequenzen, die Angiostatin kodieren, in einen Patienten eingeschleust werden, um in vivo die Angiostatin-Niveaus zu modifizieren.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch diagnostische Verfahren und Kits zum Nachweis und der Messung von Angiostatin in biologischen Flüssigkeiten und Geweben zur Lokalisierung von Angiostatin in Geweben und Zellen. Das diagnostische Verfahren und der Kit können in jeder dem normalen Fachmann auf dem Gebiet bekannten Form vorliegen. Die vorliegende Erfindung beschreibt auch Antikörper, die für das Angiostatin-Molekül spezifisch sind und Teile davon sowie Antikörper, die die Bindung von Antikörpern inhibieren, welche für Angiostatin spezifisch sind. Diese Antikörper können polyklonale Antikörper oder monoklonale Antikörper sein. Die Antikörper, die für Angiostatin spezifisch sind, können in diagnostischen Kits verwendet werden, um das Vorhandensein und die Menge an Angiostatin nachzuweisen, welches diagnostisch oder prognostisch für das Auftreten oder das Wiederauftreten von Krebs oder anderen Erkrankungen ist, welche durch Angiogenese vermittelt werden. Antikörper, die für Angiostatin spezifisch sind, können auch an einen Menschen oder ein Tier verabreicht werden, um den Menschen oder das Tier gegen Angiostation passiv zu immunisieren, wodurch die angiogene Inhibierung reduziert wird.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch diagnostische Verfahren und Kits zum Nachweisen des Vorhandenseins und der Menge von Antikörpern, die ein Angiostatin in Körperflüssigkeiten binden. Das diagnostische Verfahren und der Kit können in jeder Form vorliegen, die gewöhnlichen Fachleuten in dem Gebiet gut bekannt sind.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch Antiangiostatin-Rezeptorspezifische Antikörper, die an den Angiostatin-Rezeptor binden, und das entsprechende Signal an die Zelle übermitteln, und als Agonisten oder Antagonisten wirken.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch Angiostatin-Proteinfragmente und Analoga, die isotopisch oder mit anderen Molekülen oder Proteinen zur Verwendung im Nachweis und der Visualisierung von Angiostatin-Bindungsstellen durch Techniken, die einschließen, aber nicht beschränkt sind auf, Positronenemissionstomographie, Autoradiographie, Durchflusscytometrie, Radiorezeptorbindungstests und Immunhistochemie verwendet werden können.
Diese Angiostatin-Proteine und Analoga dienen auch als Agonisten und Antagonisten des Angiostatin-Rezeptors, wodurch sie die biologische Wirkung von Angiostatin verstärken oder blockieren. Solche Peptide werden bei der Isolierung des Angiostatin-Rezeptors verwendet.
Die vorliegende Erfindung schließt auch Angiostatin-Fragmente für therapeutische und Forschungszwecke ein. Weiter werden Angiostatin-Fragmente mit pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten und gegebenenfalls mit Verbindungen zur verzögerten Freisetzung oder Zusammensetzungen, die biologisch abbaubare Polymere und therapeutische Zusammensetzungen zu bilden, zusammengegeben.
Die vorliegende Erfindung beschreibt molekulare Sonden der Ribonucleinsäure oder Desoxiribonucleinsäure, die bei der Transkription und Translation von Angiostatin beteiligt sind. Diese molekularen Sonden stellen Mittel zum Nachweis und der Messung der Angiostatin-Biosynthese in Geweben und Zellen bereit.
Demgemäß ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die ein Angiostatin-Fragment umfasst.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen und Prozessen bereitzustellen, die durch Angiogenese vermittelt werden.
Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Zusammensetzung zur Behandlung von Erkrankungen und Prozessen bereitzustellen, die durch Angiogenese vermittelt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Hämangiome, feste Tumoren, solide Tumoren, das Blut übertragende Tumoren, Leukämien, Metastasierung, Telangiectasia, Psoriasis, Scleroderma, pyogene Granulome, Myocardangiogenese, Morbus Crohn, Plaqueneovascularisierung, coronare Kollaterale, cerebrale Kollaterale, arteriovenose Fehlbildungen, Ischämische Angiogenese in Gliedern, corneale Erkrankungen, Rubeose, neovasculäre Glaucome, diabetische Retinopathie, retrolentale Fibroplasie, Arthritis, diabetische Neovascularisierung, maculare Degeneration, Wundheilung, Magengeschwür, Heliobacter verwandte Erkrankungen, Frakturen, Keloide, Vasculogenese, Hämatopoiese, Ovulation, Menstruation, Placentabildung und Cat Scratch Fever.
Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung zur Behandlung und Unterdrückung des Wachstums eines Krebses bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Angiostatin-Fragmente durch direkte Injektion DNA, die Angiostatin-Fragmente kodiert, in einen Menschen oder ein Tier, welches solche Angiostatin-Fragmente benötigt, bereitzustellen.
Es ist noch ein weiters Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Therapie bei Krebs bereitzustellen, die minimale Nebenwirkungen hat.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung liegt darin, ein Verfahren zur gezielten Verabreichung von Angiostatin-verwandten Zusammensetzungen an spezifische Stellen bereitzustellen.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist das Bereitstellen von Zusammensetzungen und Methoden, die für die Gentherapie zur Modulierung angiogener Prozesse nützlich sind.
Diese und andere Ziele, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach Beurteilung der folgenden detaillierten Berschreibung der offenbarten Ausführungsformen und der angehängten Ansprüche deutlich.
Kurze Beschreibung der Figuren.
1 zeigt SEQ ID Nr. 1, die Aminosäuresequenz des vollständigen murinen Plasminogens.
2 zeigt die Anfangssequenz des Angiostatins der Maus (SEQ ID Nr. 2) und vergleicht die murine Sequenz mit den entsprechenden menschlichen (SEQ ID Nr. 3), Rhesusaffen- (SEQ ID Nr. 4), Schweine- (SEQ ID Nr. 5) und Rinder- (SEQ ID Nr. 6) Plasminogenproteinfragmenten. Die Maus- Sequenz wird zuerst aufgelistet, gefolgt vom Menschen, Rhesusaffen, Schwein und Rind.
3 zeigt den BrdU-Markierungsindex von Tumorzellen in der Lunge in Gegenwart oder Abwesenheit eines Primärtumors.
4 zeigt eine Matrigel-Analyse des Einflusses eines primären Lewis Lungentumors der bFGF-gesteuerten Angiogenese in vivo.
5 zeigt eine Dosis-Reaktionskurve des Serums, das aus Mäusen stammt, die ein Lewis-Lungencarcinom (LLC-Low) tragen, gegenüber Serum normaler Mäuse. Rinderkapillar-Endothelzellen wurden in einem bFGF-vermittelten 72-Stunden Proliferationstest untersucht.
6 zeigt, dass sowohl gering und stark metastasierende Tumoren endothel-mitogene Wirkung in ihren Aszites enthalten, aber nur die wenig metastasierende Tumorlinie endothel-inhibierende Wirkung im Serum aufweist.
7 zeigt ein C4-Umkehrphasen-Chromatographie-Profil teilweise gereinigten Serums oder Urins aus Tumor-tragenden Tieren.
8 zeigt Oberflächen-Lungenmetastasen nach einer 13-tägigen Behandlung von Mäusen mit intaktem Plasminogenmolekül, der aktiven Fraktion der Lysinbindungsstelle I Präparation menschlichen Plasminogens, konzentriertem Urin aus Tumor-tragenden Mäusen und konzentriertem Urin normaler Mäuse.
9 zeigt das Lungengewicht nach einer 13-tägigen Behandlung von Mäusen mit intaktem Plasminogenmolekül des menschlichen Plasminogen, der aktiven Fraktion des Lysin-Bindestelle-I-Präparats, konzentriertem Urin von Tumor-tragenden Mäusen und konzentriertem Urin normaler Mäuse.
10 ist eine schematische Darstellung des pTrcHis-Vektors.
11 stellt einen Immunoblot von durch E. coli exprimiertem menschlichem Angiostatin aus einer 10 l hochskalierten Fermentierung, welche mit einem monoklonalen Antikörper gegen die menschliche Plasminogen-Kringel-Region 1-3 untersucht wurde. Der Pfeil zeigt, das rekombinante menschliche Angiostatin. A) zeigt rekombinantes Angiostatin, das mit 0,2 M Aminocaprylsäure eluierte; B) zeigt die letzte Waschung mit 1 × PBS der Lysinsäule und C) zeigt das gereinigte Lysat der aufgebrochenen Zellen.
12 ist ein Graph, der die prozentuale Inhibierung der wachsenden Rinderkapillarendothelzellen als Funktion der Verdünnung der Ausgangslösung zeigt; A1, A2, B1, B2 und E sind rekombinante Klone, die menschliche Angiostatin-Antiangiogenese aufweisen; C1-, C2-, D1- und D2-Kontrollen sind Negativkontrollklone, die nur den Vektor ohne die menschliche DNA-Sequenz enthalten, welche Angiostatin kodiert.
13 zeigt die inhibitorische Wirkung auf die Proliferation bei Rinderkapillarendothelzellen in vitro durch rekombinantes menschliches Angiostatin.
14 zeigt den Wachstumsproliferationsindex und den Apoptoseindex nach Entfernung des Primärtumors und der Behandlung mit Salzlösung oder einem Fumagillinanalogon mit anti-angiogener Wirkung.
15 zeigt die Inhibierung des Wachstums eines T241 Primärtumors in Mäusen durch Behandlung mit menschlichem Angiostatin in vivo durch eine einzelne Injektion von 40 mg/kg/Tag.
16 zeigt die Inhibierung des Wachstums eines LLC-LM Primärtumors in Mäusen durch Behandlung mit menschlichem Angiostatin in vivo zu zwei Dosen von 40 mg/kg pro Dosis (80 mg/kg/Tag).
17 zeigt die Wirkung der Entfernung eines primären Lewis-Lungencarcinom-Tumors auf das Wachstum von dessen Lungenmetastasen.
18 zeigt die Wachstumsproliferation und den Apoptoseindex nach Tumorresektion.
19 zeigt die Wirkung der Verabreichung des Angiostatin-Proteins an Mäuse mit implantierten T241 Fibrosarcomzellen auf das Gesamt-Tumorvolumen als Funktion der Zeit.
20 zeigt die Wirkung der Verabreichung des Angiostatin-Proteins an Mäuse mit implantierten Lewis-Lungencarcinom (LM)-Zellen auf das gesamte Tumorvolumen als Funktion der Zeit.
21 zeigt die Wirkung der Verabreichung des Angiostatin-Proteins an Mäuse mit implantierten Reticulum-Zellsarcomzellen auf das Gesamt-Tumorvolumen als Funktion der Zeit.
22 zeigt die Wirkung der Verabreichung des Angiostatin-Proteins an immundefiziente SCID-Mäuse mit implantierten menschlichen Prostatacarcinom PC-3-Zellen auf das gesamte Tumorvolumen als Funktion der Zeit über einen 24-Tage Zeitraum.
23 zeigt die Wirkung der Verabreichung des Angiostatin-Proteins an immundefiziente SCID-Mäuse mit implantierten menschlichen Brustcarcinom MDA-MB-Zellen auf das Gesamttumorvolumen als Funktion der Zeit über einen 24-Tage Zeitraum.
24 ist eine schematische Darstellung der Klonierung der Maus-DNA-Sequenz, die für das Maus-Angiostatin-Protein kodiert, welches aus Maus-Plasminogen cDNA stammt. Das Maus-Angiostatin umfasst die Mausplasminogen-Kringel-Region 1-4. PCR bedeutet Polymerase-Kettenreaktion; P1 ist der 5'-End-Oligonucleotidprimer für die PCR; P2 ist der 3'-End-Oli gonucleotidprimer für PCR; SS kennzeichnet die Signalsequenz; ATG ist der Translations-Initiationscodon; TAA ist der Translations-Stopcodon; HA stellt einen Hämagglutininepitop-Anhang dar (YPYDVPDYASL); K1, K2, K3 und K4 stellen Mausplasminogen-Kringel-Regionen 1, 2, 3 bzw. 4 dar. CMV ist der Cytomegalievirus-Promotor; T7 ist der Bakteriophagen-Promotor; PA stellt Präaktivierungspeptide dar und SP6 ist der Sp-6-Promotor.
25 stellt die Anzahl an Zellen als Funktion der Tage nicht-transfizierter Zellen (mock) dar; Zellen transfiziert mit dem Vektor alleine ohne die DNA-Sequenz, die für Angiostatin kodiert (Vektor 5), und zwei Angiostatin-exprimierende Klone (AST 31 und AST 37). Reihe (a) stellt die Ergebnisse der Transfektion von T241-Zellen dar, Reihe (b) stellt die Ergebnisse der LL2-Zellen dar.
26 zeigt die Ergebnisse mit Kulturmedium, das aus E. coli-Zellen stammt, die den Angiostatin-Klon enthalten, auf die Zellanzahl. Nicht transfizierte Zellen (mock) sind Kontrollzellen, die mit dem Vektor alleine transfiziert wurden, ohne die DNA-Sequenz, die für Angiostatin kodiert (Vektor 5), und drei Angiostatin-exprimierende Klone (AST 25, AST 31 und AST 37). Reihe (a) stellt die Ergebnisse der Inkubation von Kulturmedium aus der Kontrolle (mock) und einen Angiostatin-Klon (exprimierend und nicht exprimierend) auf die Zellzahl dar. Reihe (b) stellt die Ergebnisse der Inkubation von Kulturmedium der Kontrolle (mock), Vektor allein (Vektor 6) und Angiostatin-Klonen, die Maus-Angiostatin exprimieren, bezogen auf die Zellzahl dar. Reihe (c) stellt die Ergebnisse der Inkubation von gereinigtem Kulturmedium der Kontrolle (mock) und der Angiostatin-Klone, die Maus-Angiostatin exprimieren, auf die Zellzahl dar, wobei das Kulturmedium über eine Lysin-Sepharose-Säule gereinigt wurde, um Lysin-bindende Bestandteile zu erhalten.
27 zeigt die Wirkung des Gesamt-Tumorvolumens als Funktion der Dauer der Implantierung von T241-Fibrosarcomzellen in Mäusen dar, wenn die Fibrosarcomzellen mit einem Vektor transfiziert worden sind, der eine DNA-Sequenz enthält, welcher für das Angiostatin-Protein kodiert, und der Vektor in der Lage ist, das Angiostatin-Protein zu exprimieren. „Nicht transfiziert" stellt nicht veränderte T241 Fibrosarcomzellen dar, die in Mäuse implantiert wurden. „Vektor 6" stellt T241-Fibrosarcomzellen dar, die allein mit dem Vektor transfiziert wurden, der keine DNA-Sequenz enthält, welche für das Angiostatin-Protein kodiert, welches in Mäuse implantiert wurde. „Klon 25, Klon 31 und Klon 37" stellen drei Angiostatin-herstellende Klone der T241-Fibrosarcomzellen, welche in Mäuse implantiert wurden, dar, die mit einem Vektor transfiziert wurden, der die DNA-Sequenz enthält, die für das Angiostatin-Protein kodiert.
28 zeigt eine schematische Darstellung der Struktur von menschlichem Plasminogen und dessen Kringelfragmenten. Menschliches Plasminogen ist a einzelkettiges Protein mit 791 Aminosäuren mit einer Stelle für die N-gebundene Glycosylierung an Asn²⁸⁹. Die Nicht-Protease-Region des menschlichen Plasminogens, welche aus den 561 N-terminalen Aminosäuren besteht, welche in fünf getrennten Domänen vorliegen, die als Kringel bezeichnet werden, sind als Kreise gezeigt (K1, K2, K3, K4 und K5), zusammen mit den Proteinen, die diese Strukturen trennen. Jeder dreifach Disulfid-gebundene Kringel enthält 80 Aminosäuren. Angiostatin deckt die ersten vier dieser Kringeldomänen ab (K1-4). Kringel 1-3 (K1-3) und Kringel 4 (K4) werden durch einen Verdau des menschlichen Plasminogens mit Elastase gewonnen. Der Rest der Kringelfragmente sind rekombinante Proteine, die in E. coli exprimiert werden. SS = Signalsequenz. PA = Präaktivierungsprotein.
29 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse der gereinigten, rekombinanten und nativen Kringel-Fragmente von Plasminogen unter reduzierenden Bedingungen. (A) Einzelne rekombinante Kringel-Fragmente, die aus E. coli-Bakterien-Lysaten gereinigt wurden, wurden auf ein 15 % SDS-Gel geladen, gefolgt von einer Färbung mit Coomassie-Blue. Ungefähr 5 μg jedes Proteins wurden pro Spur aufgetragen. (Spur 2 = Kringel 1 (K1); Spur 3 = Kringel 2 (K2); Spur 4 = Kringel 3 (K3); Spur 5 = Kringel 4 (K4); Spur 1 = Molekulargewichts-Marker). (B) Gereinigte große Kringel-Fragmente wurden mit Coomassie-Blue gefärbt. Kringel 1-4 (Spur 2) und Kringel 1-3 (Spur 3) wurden durch einen Verdau menschlichen Plasminogens mit Elastase gewonnen und mittels Lysin-Sepharose-Chromatographie gereinigt. Ein rekombinantes Fragment der Kringel 2-3 (Spur 4) wurde in E. coli exprimiert und in vitro zurückgefaltet. Die Molekulargewichts-Marker sind auf der linken Seite (Spur 1) angegeben.
30 zeigt die Inhibierung der Endothelzellproliferation durch rekombinante individuelle Kringel-Fragmente des Angiostatins. Kringel-Fragmente wurden an Rinder-Kapillar-Endothelzellen in Gegenwart von 1 ng/ml bFGF für 72 Stunden getestet. (A) Anti-Endothelzellproliferations-Wirkungen von zwei Lysin-bindenden Kringel, rK1 und rK4. Der hochaffine Lysin-bindende Kringel K1 (-o-) inhibierte die BCE-Zellproliferation in einer Dosisabhängigen Weise. Der mittelmäßig affine Lysin-bindende Kringel, K4 (-•-), zeigte nur leichte inhibitorische Wirkung bei hohen Konzentrationen. (B) Inhibierung der BCE-Zellproliferation durch nicht Lysin-bindende K2 und K3.
Sowohl K2 (-∎-) als auch K3 (-☐-) inhibierten die BCE-Zellproliferation in einer Dosis-abhängigen Weise. Die Daten stellen den Durchschnitt +/– Standardabweichung von drei Untersuchungen dar.
31 zeigt die Anti-Endothel-Proliferations-Wirkung großer Kringel-Fragmente von Angiostatin. Proteolytische Fragmente, K1-4 (Angiostatin) (-o-) und K1-3 (-∎-) inhibierten die BCE-Zellproliferation in Dosis-abhängiger Weise. Rekombinante K2-3 (-•-)-Fragmente wiesen eine weniger starke Inhibierung auf als die von K1-3 und K1-4. Die Daten stellen den Mittelwert von drei Bestimmungen (+/– Standardabweichung) als Prozentsatz der Inhibierung dar.
32 zeigt die additive inhibitorische Wirkung vom rekombinanten Kringel 2 und Kringel 3. (A) Das intakte Fragment rK2-3 (siehe auch 31) wies eine geringe inhibitorische Wirkung allein bei der Konzentration von 320 nM auf. Bei der gleichen Konzentration wurde eine additive Inhibierung beobachtet, wenn mutierte Fragmente von rK2 Cystein, welches an Position 169 durch Serin ersetzt wurde) und K3 (Cystein ersetzte Serin an Position 297) zusammen an BCE-Zellen getestet wurden. Jeder Wert stellt den Mittelwert +/– Standardabweichung von dreifachen Untersuchungen dar. (B) Schematische Struktur und Aminosäuresequenz von K2 und K3. Eine Zwischen-Ketten-Kringel-Disulfidverbindung wurde zuvor als zwischen Cystein¹⁶⁹ von K2 und Cystein²⁹⁷ von K3 vorliegend beschrieben (Söhndel, S., Hu, C.-K., Marti, D., Affolter, M., Schaller, J., Llinas, M., und Rickli, E. E. (1996) Biochem. im Druck).
33 zeigt die Inhibierung der Endothelproliferation durch kombinatorische Kringel-Fragmente. Der Test wurde mit einer Konzentration von 320 nM jedes Kringel-Fragments durchgeführt. Die Werte stellen den Mittelwert von drei Bestimmungen (+/– Standardabweichung) als Prozentsatz der Inhibierung dar. (A) Inhibitorische Wirkungen von Fragmenten durch Kombination zahlreicher individueller Kringel. (B) Kombinatorische inhibitorische Wirkung kombinierter Kringel-Fragmente.
34 zeigt die inhibitorische Wirkung von Angiostatin auf Endothelzellen nach Reduzierung und Alkylierung. (A) SDS-PAGE-Analyse der reduzierten (Spur 2) und nicht reduzierten (Spur 1) Formen von menschlichem Angiostatin. Gereinigtes menschliches Angiostatin wurde mit DTT reduziert, gefolgt von der Alkylierung des Proteins mit einer überschüssigen Menge an Jodacetamid. Die behandelten Proben wurden dialysiert und an BCE-Zellen getestet. (B) Inhibierung der BCE-Zellproliferation durch reduzierte und nicht reduzierte Formen von Angiostatin bei Konzentrationen von 320 nM. Die Daten stellen den Mittelwert der Inhibierung +/– Standardabweichung bei dreifacher Ausführung dar.
35 zeigt eine Aminosäuresequenzanlagerung der vermuteten Kringel-Domänen des menschlichen Angiostatins dar. Die Sequenzen der vier Kringel-Domänen wurden anhand ihrer konservierten Cysteine aneinander gelagert. Identische und konservierte Aminosäuren sind schattiert. Die eingekasteten Aminosäuren in Kringel 4 zeigen die positiv geladenen doppelten Lysine, die neben den konservierten Cysteinresten 22 und 80 liegen.
36 zeigt die Lysin-bindenden Eigenschaften und die Reaktivität des exprimierten Angiostatins.
36A zeigt ein Coomassie-gefärbtes Gel (40 μl Beladung).
36B zeigt einen Immunoblot (20 μl Beladung) eines ähnlichen Gels. Spur 1 zeigt Kulturlösung aus Schüttelkultur-Flaschen induzierter Kulturen, welche Angiostatin bei ungefähr 50 kD und einige wenige andere Proteine zeigen. Kulturlösung von induzierten Kulturen wird 1:1 mit Puffer verdünnt und direkt auf Lysin-Sepharose geladen. Spur 2 zeigt die ungebundene Fraktion, die durch die Lysinsäule ronn. Das gesamte Angiostatin-Protein, das durch P. pastoris exprimiert wurde, bindet an die Lysinsäule. Spur 3 zeigt die spezifische Eluierung mit 0,2 M Aminocaprylsäure, was zeigt, dass durch P. pastoris exprimiertes Angiostatin-Protein Lysin bindet und in einem einzelnen Schritt bis zur Homogenität über eine Lysinsepharose gereinigt werden kann. Ferner wird das P. pastoris exprimierte Angiostatin-Protein durch ein konformational abhängigen monoklonalen Antikörper (VAP) erkannt, welche gegen die Kringel 1 bis 3 generiert worden ist.
37 zeigt P. pastoris exprimiertes Angiostatin-Protein, das als Doublette erkannt wird, welche bei 49 kD und 51,5 kD auf denaturierten, nicht reduzierten SDS-PAGE Coomassie-gefärbten Gelen migriert. Die Entferung der einzigen N-gebundenen Komplexkette vom exprimierten Angiostatin-Protein mit N-Glycanase, welche für stark Mannose-haltige Strukturen spezifisch ist, führt zu einer einzelnen Bande von 49,5 kD. Panel A und Panel B zeigen ein Coomassie-gefärbtes Gel und ein Immunoblot eines ähnlichen Gels. Spur 1 zeigt gereinigtes P. pastoris exprimiertes Angiostatin-Protein. Spur 2 zeigt ein gereinigtes P. pastoris exprimiertes Angiostatin-Protein, das unter Verdauungsbedingungen ohne N-Glycanase inkubiert worden ist. Spur 3 zeigt gereinigtes, von P. pastoris exprimiertes Angiostatin-Protein, das mit N-Glycanase verdaut wurde.
38A zeigt 4 μg des gereinigten P. pastoris exprimierten Angiostatin-Proteins als Doublette auf einem Coomassie-Gel.
38B zeigt, dass das gereinigte rekombinante BCE-Proliferation inhibiert. Die BCE-Testzellzahlen, welche nach 72 Stunden gewonnen wurden, sind gezeigt, in Gegenwart (•) oder Abwesenheit (o) von bFGF, und in Gegenwart von bFGF mit PBS als Kontrolle (Δ), und in Gegenwart von bFGF mit P. pastoris exprimiertem Angiostatin-Protein (Δ).
38C zeigt, dass die Inhibierung Dosis-abhängig ist.
39 zeigt durch P. pastoris exprimiertes gereinigtes Angiostatin, welches systemisch (subkutan) an Mäuse mit Primärtumoren verabreicht worden ist.
39A und 39B zeigen die Anzahl an Metastasen bzw. die Lungengewichte der Mäuse, die täglich mit Salzlösung oder P. pastoris exprimiertem Angiostatin oder mit vom Plasminogen stammendem Angiostatin-Protein behandelt worden sind. Im Gegensatz zu den Lungen der Mäuse, die mit Salzlösung behandelt worden sind, waren die Lungen der Mäuse, die mit P. pastoris exprimiertem Angiostatin-Protein oder mit Plasminogen-Derivat-Angiostatin-Protein behandelt worden sind, nicht vaskularisiert und Metastasen wurden wirksam unterdrückt.
40 zeigt, dass die Lungen der Mäuse, die mit P. pastoris exprimiertem Angiostatin behandelt wurden, durch die Mikrometastasen pink wurden, während die Lungen der Salz-Kontrollgruppe vollständig mit vaskularisierten Metastasen bedeckt waren.
41 zeigt eine reduzierende Polyacrylimidgel-Elektrophorese-Fotographie (SDS-PAGE) des rekombinanten Maus-Angiostatins bei verschiedenen Stadien der Reinigung und Aggregierung mittels Nickel-Affinitätssäulenchromatographie (Spuren 1-3 zeigen die Waschschritte der Einschlusskörper, Spur 4 zeigt die unlösliche Fraktion in Harnstoff, Spur 5 die Ausgangsmaterialien der Affinitätssäule, Spur 6 den Säulendurchfluss, Spur 7 das eluierte Angiostatin).
42 zeigt die Wirkung der Verabreichung von aggregiertem rekombinantem Maus-Angiostatin an Rinderkappillar-Endothelzellen.
43 zeigt die der Verabreichung von 2 mg/kg/Tag Aggregat Angiostatin bei Mäusen, denen das Lewis-Lungencarzinom inokuliert wurde, Wirkung auf das Tumorvolumen.
44 zeigt die Wirkung der Verabreichung von 10 mg/kg/Tag Aggregat Angiostatin bei Mäusen, denen das Lewis-Lungencarzinom inokuliert worden ist, auf das Tumorvolumen.
Detaillierte Beschreibung
Die vorliegende Erfindung beschreibt Zusammensetzungen und Verfahren zum Nachweis und die Behandlung von Erkrankungen und Prozessen, die durch Angiogenese vermittelt werden oder damit zusammenhängen. Die Zusammensetzung ist ein Angiostatin-Fragment oder eine Zusammenstellung von Angiostatin-Fragmenten, welches aus Körperflüssigkeiten isoliert werden kann, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Serum, Urin und Aszitesflüssigkeit, oder durch chemische oder biologische Verfahren synthetisiert wird (z. B. Zellkultur, rekombinante Genexpression, Peptidsynthese und in vitro enzymatische Katalyse von Plasminogen oder Plasmin, um das aktive Angiostatin hervorzubringen). Rekombinante Techniken schließen Genamplifikationen aus DNA-Quellen ein, indem die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet wird, und die Genamplifikation aus RNA-Quellen unter Verwendung von Reverse Transkriptase/PCR. Angiostatin inhibiert das Wachstum von Blutgefäßen in Geweben, wie in unvascularisierte oder vascularisierte Tumore.
Die vorliegende Erfindung umfasst eine Zusammensetzung, die einen Vektor umfasst, der eine DNA-Sequenz enthält, welche ein Angiostatin-Fragment oder eine Kombination aus Angiostatin-Fragmenten kodiert, wobei der Vektor in der Lage ist, ein Angiostatin-Fragment oder eine Kombination aus Angiostatin-Fragmenten zu exprimieren, wenn er in einer Zelle vorhanden ist, eine Zusammensetzung, die eine Zelle umfasst, die einen Vektor enthält, wobei der Vektor eine DNA-Sequenz enthält, die Angiostatin-Fragmente oder Analoga davon kodiert, wobei der Vektor in der Lage ist, ein Angiostatin-Fragment oder eine Kombination aus Angiostatin-Fragmenten zu exprimieren, wenn er in der Zelle vorhanden ist, und Verfahren umfassend das Implantieren einer Zelle, die einen Vektor enthält, in einen Menschen oder ein nicht-menschliches Tier, wobei der Vektor eine DNA-Sequenz enthält, die ein Angiostatin-Fragment oder eine Kombination aus Angiostatin-Fragmenten kodiert, und wobei der Vektor in der Lage ist, ein Angiostatin-Fragment oder eine Kombination aus Angiostatin-Fragmenten zu exprimieren, wenn er in der Zelle vorhanden ist.
Des Weiteren umfasst die vorliegende Erfindung Angiostatin-Fragmente, welche mit pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten und gegebenenfalls mit Bestandteilen für die verzögerte Freisetzung oder Zusammensetzungen, wie biologisch abbaubare Polymere, zusammen gegeben ist, um therapeutische Zusammensetzungen zu bilden. Zusätzlich beschreibt die Erfindung eine Zusammensetzung, die einen Antikörper umfasst, der spezifisch an Angiostatin bindet, wobei der Antikörper Plasminogen nicht bindet.
Genauer gesagt, beschreibt die vorliegende Erfindung ein Protein ein, das als Angiostatin bezeichnet wird, und das ein Molekulargewicht von ungefähr 38 bis 45 Kilodalton (kD) hat, welches in der Lage ist, die angiogene Wirkung von endogenen Wachstumsfaktoren wie bFGF in vitro zu überwinden. Angiostatin ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von zwischen ungefähr 38 Kilodalton und 45 Kilodalton, wie durch reduzierende Polyacrylamidgel-Elektrophorese bestimmt wurde, und hat eine Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen die des Maus-Plasminogenfragments ist, das an der Aminosäure Nr. 98 des vollständigen Maus-Plasminogenmoleküls beginnt. Der Begriff „im Wesentlichen ähnlich", wenn er in Bezug auf die Angiostatin-Aminosäuresequenzen verwendet wird, bedeutet eine Aminosäuresequenz mit anti-angiogener Wirkung und mit einem Molekulargewicht von ungefähr 38 kD bis 45 kD, welche ebenfalls einen hohen Grad an Sequenzhomologie zum Peptidfragment des Maus-Plasminogens hat, das bei ungefähr der Aminosäure Nr. 98 des Maus-Plasminogens beginnt, und 38 kD bis 45 kD wiegt. Ein hoher Homologiegrad bedeutet, dass mindestens ungefähr 60 % Aminosäure-Homologie, vorzugsweise mindestens ungefähr 70 % Aminosäure-Homologie und mehr bevorzugt mindestens ungefähr 80 % Aminosäurehomologie vorliegen. Der Begriff „Endothel-inhibierende Wirkung", so wie er hier verwendet wird, bedeutet die Fähigkeit eines Moleküls, Angiogenese im Allgemeinen zu inhibieren und beispielsweise das Wachstum von Rinderkapillar-Endothelzellen in Kulturen in Gegenwart von Fibroblasten-Wachstumsfaktor zu inhibieren.
Die Aminosäuresequenz des vollständigen murinen Plasminogen-Moleküls ist in 1 und in SEQ ID Nr. 1 gezeigt. Die Sequenz für Angiostatin beginnt ungefähr an der Aminosäure 98. Wirksames menschliches Angiostatin kann entweder an der Aminosäure 97 oder 99 des intakten menschlichen Plasminogen-Moleküls beginnen. Die Aminosäuresequenz der ersten 339 Aminosäuren von Angiostatin der Maus ist in 2 gezeigt (SEQ ID Nr. 2), und wird mit den Sequenzen der entsprechenden Plasminogen-Peptidfragmente des Menschen (SEQ ID Nr. 3), Rhesusaffen (SEQ ID Nr. 4), Schweins (SEQ ID Nr. 5) und Rinds (SEQ ID Nr. 6) für Plasminogen verglichen. Angesichts der Tatsache, dass diese Sequenzen zu über 50 % ihrer Aminosäuren identisch sind, ist klar, dass die Aminosäuresequenzen des Angiostatins zwischen den Spezies im Wesentlichen ähnlich sind. Die gesamte Zahl der Aminosäuren von Angiostatin ist nicht genau bekannt, aber sie wird durch das Molekulargewicht des aktiven Moleküls definiert. Die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Angiostatins kann in Abhängigkeit von der Art variieren, von der das Plasminogen-Molekül stammt. Daher hat das erfindungsgemäße Angiostatin, obwohl es vom menschlichen Plasminogen stammt, eine leicht verschiedene Sequenz vom Angiostatin haben, das aus der Maus stammt, und dennoch anti-angiogene Wirkung wie in einem Maustumor-Modell gezeigt wird.
Für Angiostatin ist gezeigt worden, dass es in der Lage ist, das Wachstum von Endothelzellen in vitro zu inhibieren. Angiostatin inhibiert das Wachstum von Zelllinien, die aus anderen Zellarten stammen, nicht. Genauer gesagt hat Angiostatin keine Wirkung auf Lewis-Lungencarcinom-Zelllinien, Mink-Lungenepithelium, 3T3 Fibroblasten, Rinderaorta glatte Muskelzellen, retinales Pigmentepithel des Rinds, MDCk-Zellen (Hunde-Nieren-Epithel), WI38-Zellen (fötale menschliche Lungenfibroblasten), EFN-Zellen (fötale Fibroblasten der Maus) und LM-Zellen (Bindegewebszellen der Maus). Endogenes Angiostatin in einer Tumor-tragenden Maus ist wirksam zur Inhibierung von Metastasen bei einer systemischen Konzentration von ungefähr 10 mg Angiostatin/kg Körpergewicht.
Angiostatin hat eine spezifische dreidimensionale Konformation, die durch die Kringel-Region des Plasminogenmoleküls definiert ist (Robbins, K. C., „The Plasminogen-plasmin enzyme system" Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Practice, 2. Ausgab:, hrsg. von Colman, R. W. et al., J. B. Lippincott Company, Seiten 340-357, 1987). Es gibt fünf derartige Kringel-Regionen, die konformationell verwandte Motive sind und in dem NH₂-terminalen Teil des Plasminogenmoleküls wesentliche Sequenzhomologie haben. Die dreidimensionale Konformation von Angostatin umfasst vermutlich die Plasminogen-Kringel-Region 1 bis 3 und einen Teil der Kringel-Region 4. Jede Kringel-Region des Plasminogen-Moleküls enthält ungefähr 80 Aminosäuren und enthält 3 Disulfidbrücken. Dieses Cysteinmotiv ist dafür bekannt, in anderen biologisch wirksamen Proteinen vorhanden zu sein. Diese Proteine schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Prothrombin, Hepatocyten-Wachstumfaktor, Scatter-Factor und Macrophagen-stimulierendes Protein (Yoshimura, T. et al., „Cloning, sequencing, and expression of human macrophage stimulating Protein (SP, MST1) confirms MSP as a member of the family of Kringel Proteins and locates the MSP gene an Chromosome 3" J. Biol. Chem., Vol. 268, Nr. 21, Seiten 15461-15468, 1993). Es wird in Erwägung gezogen, dass jedes isolierte Protein oder Peptid mit einer dreidimensionalen Kringel-artigen Konformation oder einem Cysteinmotiv, das anti-angiogene Aktivität in vivo besitzt, Teil der Erfindung ist.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch den Nachweis von Angiostatin in Körperflüssigkeiten und Geweben zum Zwecke der Diagnose oder Prognose von Erkrankungen wie Krebs ein. Die vorliegende Erfindung beschreibt auch den Nachweis von Angiostatin-Bindungsstellen und Rezeptoren in Zellen und Geweben ein. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Behandlung oder Prävention angiogener Erkrankungen und Prozesse ein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Arthritis und Tumore, indem die Produktion von Angiostatin stimuliert wird, und/oder durch Verabreichung von Angiostatin-Fragmenten an einen Patienten. Zusätzliche Behandlungsverfahren schließen die Verabreichung von Angiostatin-Fragmenten ein, die an zytotoxische Mittel gebunden sind. Es ist verständlich, dass Angiostatin von tierischem oder menschlichen Ursprung sein kann. Angiostatin-Fragmente können auch synthetisch durch eine chemische Reaktion oder mit Hilfe rekombinanter Techniken in Verbindung mit Expressionssystemen hergestellt werden. Angiostatin-Fragmente können auch durch die enzymatische Abspaltung von isoliertem Plasminogen oder Plasmin hergestellt werden, um Peptide zu erzeugen, die anti-angiogene Wirkung haben. Angiostatin kann auch durch Verbindungen hergestellt werden, die die Wirkung der endogenen Enzyme nachahmen, die Plasminogen in Angiostatin spalten. Angiostatin-Produktion kann ebenfalls durch Verbindungen moduliert werden, die die Aktivität von Plasminogen-spaltenden Enzymen beeinflussen.
Die passive Antikörpertherapie unter Verwendung von Antikörpern, die spezifisch an Angiostatin binden, kann verwendet werden, um die Angiogenese abhängigen Prozesse wie Reproduktion, Entwicklung und Wundheilung und Gewebereparatur zu modulieren. Zusätzlich können Antiseren, die gegen Fab-Regionen von Angiostatin-Antikörpern gerichtet sind, verabreicht werden, um an Angiostatin zu binden und mit der Fähigkeit, endogene Angiostatin-Antiseren zu blockieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Gentherapie, wodurch das Gen, das Angiostatin kodiert, in einem Patienten reguliert wird. Zahlreiche Verfahren zum Transferieren oder zur Verabreichung von DNA in Zellen zur Expression eines Genprodukt-Proteins, das sonst als Gentherapie bezeichnet wird, sind offenbart in: Gene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo, N. Yang, Crit. Rev. Biotechn. 12 (4): 335-356 (1992). Die Gentherapie umfasst den Einschluss von DNA-Sequenzen in somatische oder nicht menschliche Keimbahn-Zellen entweder zur Verwendung ex vivo oder in der in vivo Therapie. Die Gentherapie arbeitet so, dass Gene ersetzt werden, normale oder abnormale Genfunktionen gesteigert werden und Infektionserkrankungen und andere Erkrankungen bekämpft werden.
Strategien zur Behandlung dieser medizinischen Probleme mit Hilfe der Gentherapie schließen therapeutische Strategien ein, beispielsweise die Identifizierung eines defekten Gens und dann die Zugabe eines funktionalen Gens, um die Funktion des defekten Gens entweder zu ersetzen oder ein kaum funktionales Gen zu verbessern; oder prophylaktische Strategien, wie beispielsweise die Zuführung eines Gens für das Proteinprodukt, das den Zustand behandeln wird, oder das das Gewebe oder Organ empfindlicher gegenüber eines Behandlungsregime macht. Als ein Beispiel einer prophylaktischen Strategie kann ein Gen wie Angiostatin in einen Patienten gebracht werden und so das Auftreten einer Angiogenese verhindern; oder ein Gen, das Tumorzellen empfindlicher gegenüber der Bestrahlung macht, könnte inseriert werden, und dann würde die Bestrahlung des Tumors die verstärkte Abtötung der Tumorzellen verursachen.
Viele Protokolle für den Transfer der Angiostatin-DNA oder der Angiostatin-regulatorischen Sequenzen werden in dieser Erfindung in Betracht gezogen. Die Transfektion von Promotorsequenzen, die nicht normalerweise spezifisch mit Angiostatin assoziiert gefunden werden, oder andere Sequenzen, die die Produktion von Angiostatin-Protein erhöhen würden, werden ebenfalls als Verfahren der Gentherapie in Betracht gezogen. Ein Beispiel dieser Technologie kann gefunden werden in Transkaryotic Therapies, Inc., in Cambridge, Massachusetts, unter Verwendung der homologen Rekombination, um einen „genetischen Schalter" zu inserieren, der ein Erythropoietingen in Zellen anschaltet. Siehe Genetic Engineering News, 15. April 1995. Solche „genetischen Schalter" können verwendet werden, um Angiostatin (oder den Angiostatin-Rezeptor) in Zellen zu aktivieren, die normalerweise nicht Angiostatin exprimieren (oder den Angiostatin-Rezeptor).
Gentransfer-Verfahren für die Gentherapie fallen in drei breite Kategorien – physisch (z. B. Elektroporation, direkter Gentransfer und Partikelbombardierung), chemisch (Lipid-basierte Träger, oder andere nicht-virale Vektoren) und biologisch (Virus-Vektoren, die von Viren abstammen und Rezeptoraufnahmen). Beispielsweise können nicht-virale Vektoren verwendet werden, welche Liposomen einschließen, die mit DNA beschichtet sind. Solche Liposom/DNA-Komplexe können direkt intravenös in den Patienten injiziert werden. Es wird vermutet, dass die Liposomen/DNA-Komplexe in der Leber konzentriert werden, wo sie die DNA in Macrophagen und Kupferzellen einschleusen. Diese Zellen sind langlebig und stellen dadurch eine Langzeitexpression der verabreichten DNA bereit. Zusätzlich können Vektoren oder die „nackte" DNA des Gens direkt in das gewünschte Organ oder in das Gewebe oder den Tumor für eine gezielte Verabreichung der therapeutischen DNA injiziert werden.
Gentherapeutische Methoden können ebenfalls durch den Verabreichungsort beschrieben werden. Grundsätzliche Wege, um Gene zu verabreichen, schließen den ex vivo Gentransfer, den in vivo Gentransfer und den in vitro Gentransfer ein. Beim ex vivo Gentransfer werden Zellen aus den Patienten entnommen und in Kultur gezüchtet. Die DNA wird in die Zellen transfiziert und die transfizierten Zellen werden in ihrer Zahl expandiert und dann in den Patienten reimplantiert. Im in vitro Gentransfer sind die transformierten Zellen Zellen, die in Kultur gezüchtet werden, wie beispielsweise Gewebekulturzellen und sind nicht besondere Zellen aus einem besonderen Patienten. Diese „Laborzellen" werden transfiziert, die transfizierten Zellen werden ausgewählt und expandiert, um sie entweder in einen Patienten zu implantieren oder für andere Zwecke zu verwenden.
Der in vivo Gentransfer schließt die Einschleusung von DNA in die Zellen des Patienten ein, wenn die Zellen in dem Patienten vorhanden sind. Methoden schließen die Verwendung des viral vermittelten Gentransfers unter Verwendung nicht-infektiöser Viren ein, um das Gen in den Patienten zu bringen, oder die Injizierung nackter DNA an eine Stelle des Patienten, und die DNA wird von einem Prozentsatz an Zellen aufgenommen, in denen das Genprodukt-Protein exprimiert wird. Zusätzlich können die anderen Methoden, die hier beschrieben sind, wie beispielsweise die Verwendung eines „Gen-Gewehrs", für die in vitro Insertion von Angiostatin-DNA oder Angiostatin-regulatorischen Sequenzen verwendet werden.
Chemische Verfahren der Gentherapie können eine auf Lipid basierende Verbindung, die nicht notwendigerweise ein Liposom ist, einschließen, um die DNA über die Zellmembran zu verschiffen. Lipofectine oder Cytofectine, Lipid-basierende positive Ionen, die an negativ geladene DNA binden, bilden einen Komplex, der die Zellmembran überwinden kann und liefern die DNA in das Innere der Zelle ab. Andere chemische Verfahren verwenden die Rezeptor-vermittelte Endozytose, was die Bindung eines spezifischen Liganden an einen Zelloberflächenrezeptor einschließt und die Umhüllung und den Transport desselben über die Zellmembran. Der Ligand bindet an die DNA und der gesamte Komplex wird in die Zelle transportiert. Der Liganden-Genkomplex wird in den Blutfluss injiziert und dann werden die Zielzellen, die den Rezeptor tragen, spezifisch den Liganden binden und den Liganden-DNA-Komplex in die Zelle transportieren.
Viele der Gentherapiemethoden benutzen virale Vektoren, um Gene in Zellen zu inserieren. Beispiele sind veränderte Retrovirusvektoren, die in ex vivo Verfahren verwendet werden, um Gene in periphere und Tumor infiltrierende Lymphozyten, Hepatozyten, Epidermiszellen, Myozyten und andere somatische Zellen einzuschleusen. Diese veränderten Zellen werden dann in den Patienten eingeschleust, um das Genprodukt der inserierten DNA bereitzustellen.
Virale Vektoren sind ebenfalls verwendet worden, um Gene in Zellen einzuschleusen, indem in vivo Protokolle verwendet wurden. Um eine Gewebespezifische Expression fremder Gene zu steuern, können cis-wirkende regulatorische Elemente oder Promotoren, die dafür bekannt sind, dass sie Gewebe-spezifisch sind, verwendet werden. Alternativ dazu kann dies unter Verwendung der in situ-Verabreichung von DNA oder viralen Vektoren an spezifische anatomische Stellen in vivo erreicht werden. Beispielsweise wurde der Gentransfer in Blutgefäße in vivo durch Implantierung in vitro transduzierter Endothelzellen in ausgewählten Stellen der Arterienwände erreicht. Das Virus infizierte umgebende Zellen, welche auch das Genprodukt exprimieren. Ein viraler Vektor kann direkt an die Stelle in vivo, beispielsweise durch einen Katheter, verabreicht werden, was dadurch ermöglicht, dass nur bestimmte Bereiche durch das Virus infiziert werden, und so eine lang andauernde ortsspezifische Genexpression bereitstellen. Der in vivo Gentransfer unter Verwendung von Retrovirusvektoren ist ebenfalls in Brustgewebe und Lebergewebe durch die Injektion eines geänderten Virus in die Blutgefäße nachgewiesen worden, die zu diesen Organen führen.
Virale Vektoren, die für gentherapeutische Protokolle verwendet worden sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Retroviren, andere RNA-Viren, wie Poliovirus oder Sindbisvirus, Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus, Herpesviren, SV 40, Vaccinia und andere DNA-Viren.
Replikationsdefekte Maus-Retrovirus-Vektoren sind die am verbreitetsten verwendeten Gentransfer-Vektoren. Maus-Leukämie-Retroviren bestehen aus einer einzelsträngigen DNA, die mit einem nuklearen Kernprotein und Polymerase (pol)-Enzymen komplexiert ist, welche durch einen Proteinkern (gag) verkapselt sind und durch eine Glycoproteinhülle (env) umgeben sind, die den Wirtsbereich festlegt. Die genomische Struktur von Retroviren schließt die gag-, pol- und env-Gene ein, welche am 5'- und 3'-Ende durch die langen terminalen Wiederholungen (LTR) eingeschlossen sind. Retrovirale Vektorensysteme nutzen die Tatsache aus, dass ein minimaler Vektor, der die 5'- und 3'-LTRs und das Verpackungssignal enthält, ausreichend ist, um eine Verpackung des Vektors sowie die Infektion und Integration in Zielzellen zu ermöglichen, vorausgesetzt, dass die viralen Strukturproteine in der Verpackungszelllinie zur Verfügung gestellt werden. Fundamentale Vorteile der Retrovirus-Vektoren für den Gentransfer schließen eine effiziente Infektion und Genexpression in den meisten Zelltypen ein, präzise Einzelkopie-Vektor-Integration in die chromosomale DNA der Zielzelle und die Leichtigkeit der Manipulierung des retroviralen Genoms.
Das Adenovirus besteht aus linearer doppelsträngiger DNA, die mit Kernproteinen komplexiert ist und von Capsidproteinen umgeben ist. Der Fortschritt der molekularen Virologie hat zu der Fähigkeit geführt, die Biologie dieser Organismen auszunutzen, um Vektoren herzustellen, die in der Lage sind, neue genetische Sequenzen in vivo in Zielzellen zu transduzieren. Auf Adenoviren basierende Vektoren exprimieren Genprodukt-Peptide in großer Menge. Adenovirus-Vektoren besitzen eine hohe Effizienz in der Infektiosität, selbst wenn niedrige Titer des Virus verwendet werden. Zusätzlich ist das Virus als zellfreies Virion vollständig infektiös, so dass die Injektion von produzierenden Zelllinien nicht notwendig ist. Ein weiterer potentieller Vorteil der adenoviralen Vektoren ist die Fähigkeit, eine Langzeitexpression heterologer Gene in vivo zu erzielen.
Mechanische Verfahren der DNA-Verabreichung schließen fusogene Lipidvesikel, wie Liposomen oder andere Vesikel für die Membranfusion, Lipidpartikel der DNA, welche kationische Lipide wie Lipofectin einschließen, Polylysin-vermittelten Transfer von DNA, direkte Injektion von DNA, wie beispielsweise Mikroinjektion von DNA in Keimbahn- oder somatische Zellen, pneumatisch verabreichte DNA-beschichtete Partikel, wie beispielsweise Goldpartikel unter Verwendung des „Gen-Gewehrs", und anorganische chemische Ansätze, wie die Calciumphosphat-Transfektion ein. Ein weiteres Verfahren ist die Liganden-vermittelte Gentherapie, welche die Komplexierung der DNA mit spezifischen Liganden einschließt, um Liganden-DNA-Konjugate zu bilden, um diese DNA zu einer spezifischen Zelle oder einem Gewebe zu dirigieren.
Es ist gefunden worden, dass die Injektion von Plasmid-DNA in Muskelzellen einen hohen Prozentsatz an Zellen hervorbringt, die transfiziert sind, und eine fortgesetzte Expression von Markergenen besitzen. Die DNA des Plasmids kann sich in das Genom der Zellen integrieren oder nicht. Nicht-Integration der transfizierten DNA würde die Transfektion und Expression von Genprodukt-Proteinen in terminal differenzierten, nicht-proliferativen Geweben über einen verlängerten Zeitraum ermöglichen, ohne Angst zu haben, dass Mutations-bedingte Insertionen, Deletion oder Veränderungen im zellulären oder mitochondrialen Genom auftreten. Langzeit, aber nicht notwendigerweise permanenter Transfer therapeutischer Gene in spezifischen Zellen kann Behandlungsformen für genetische Erkrankungen be reitstellen, oder für die prophylaktische Verwendung. Die DNA könnte periodisch re-injiziert werden, um das Niveau des Genprodukts ohne Mutationen, die in Genomen der Empfängerzellen auftreten, zu bewahren. Die Nicht-Integration der endogenen DNA kann die Anwesenheit mehrerer verschiedener exogener DNA-Konstrukte innerhalb einer Zelle ermöglichen, wobei alle der Konstrukte verschiedene Genprodukte exprimieren.
Partikel-vermittelte Gentransfer-Methoden wurden zuerst bei der Transformation von Pflanzengewebe verwendet. Mit einer Vorrichtung zur Partikelbombardierung oder „Gen-Gewehr", wird eine Bewegungskraft erzeugt, um die DNA-beschichteten hochdichten Partikel (wie beispielsweise Gold oder Tungsten) auf eine hohe Geschwindigkeit zu bringen, was das Eindringen in die Zielorgane, Gewebe oder Zellen ermöglicht. Partikelbombardierungen können in in vitro-Systemen verwendet werden, oder durch ex vivo- oder in vivo-Techniken, um DNA in Zellen, Gewebe oder Organe einzuschleusen.
Die Electroporation für den Gentransfer verwendet einen elektrischen Strom, um Zellen oder Gewebe für den Electroporations-vermittelten Gentransfer empfindlich zu machen. Ein kurzer elektrischer Impuls mit einer festgelegten Feldstärke wird verwendet, um die Permeabilität einer Membran in solcher Weise zu erhöhen, dass DNA-Moleküle in die Zellen eindringen können. Diese Technik kann in in vitro-Systemen verwendet werden, oder in ex vivo- oder in in vivo-Techniken, um die DNA in Zellen, Gewebe oder Organe einzuschleusen.
Der Träger-vermittelte Gentransfer in vivo kann verwendet werden, um fremde DNA in Zellen zu transfizieren. Der Träger-DNA-Komplex kann einfach in Körperflüssigkeiten oder den Blutfluss eingeschleust werden und dann ortsspezifisch in das Zielorgan oder Gewebe des Körpers dirigiert werden. Sowohl Liposomen und Polycationen, wie beispielsweise Polylysin, Lipofectine oder Cytofectine können verwendet werden. Liposomen, die zellspezifisch oder organspezifisch sind, können entwickelt werden und dadurch wird die fremde DNA, die durch das Liposom transportiert wird, durch die Zielzellen aufgenommen. Die Injektion von Immunoliposomen, die auf einen spezifischen Rezeptor oder bestimmte Zellen abzielen kann, kann als günstiges Verfahren zur Inserierung von DNA in Zellen verwendet werden, die diesen Rezeptor tragen. Ein weiteres Trägersystem, das verwendet worden ist, ist das Asialoglycoprotein/Polylysin-Konjugatsystem zur Einschleusung von DNA in Hepatocyten beim in vivo-Gentransfer.
Die transfizierte DNA kann ebenfalls mit anderen Arten von Trägern komplexiert werden, so dass die DNA in die Empfängerzelle getragen wird, und dann in dem Cytoplasma oder dem Nucleoplasma bleibt. Die DNA kann an nukleare Träger-Proteine in spezifisch konstruierten Vesikelkomplexen gebunden sein und direkt in den Nucleus getragen werden.
Die Genregulation von Angiostatin kann durch die Verabreichung von Verbindungen erreicht werden, die an das Angiostatin-Gen binden, oder an Kontrollregionen, die mit dem Angiostatin-Gen assoziiert sind, oder an dessen entsprechendes RNA-Transkript, um die Rate der Transkription oder Translation zu modifizieren. Zusätzlich können Zellen, die mit einer DNA-Sequenz transfiziert sind, die Angiostatin kodiert, an einen Patienten verabreicht werden, um eine in vivo-Quelle für Angiostatin bereitzustellen. Beispielsweise können Zellen mit einem Vektor transfiziert werden, der eine Nucleinsäuresequenz enthält, die Angiostatin kodiert.
Der Begriff „Vektor", so wie er hier verwendet wird, bedeutet einen Träger, der spezifische Nucleinsäuresequenzen enthalten oder sich damit verbinden kann, und welcher so wirkt, dass er die spezifischen Nucleinsäuresequenzen in eine Zelle transportiert. Beispiele solcher Vektoren schließen Plasmide und infektiöse Mikroorganismen wie Viren, oder nicht-virale Vektoren wie Liganden-DNA-Konjugate, Liposomen, Lipid-DNA-Komplexe ein. Es kann gewünscht sein, dass ein rekombinantes DNA-Molekül, was eine Angiostatin-DNA-Sequenz umfasst, operativ an eine Expressions-Kontrollsequenz gebunden wird, um einen Expressionsvektor zu bilden, der in der Lage ist, Angiostatin zu exprimieren. Die transfizierten Zellen können Zellen sein, die aus dem normalen Gewebe des Patienten stammen, das erkrankte Gewebe des Patienten oder Zellen, die nicht vom Patienten stammen.
Beispielsweise können Tumorzellen, die aus einem Patienten entfernt wurden, mit einem Vektor transfiziert werden, der in der Lage ist, das Angiostatin-Protein der vorliegenden Erfindung zu exprimieren, und dann in den Patienten wieder eingeschleust werden. Die transfizierten Tumorzellen produzieren Angiostatin-Niveaus in Patienten, die das Wachstum des Tumors inhibieren. Patienten können Menschen sein oder nicht-menschliche Tiere. Zellen können ebenfalls durch einen Nicht-Vektor transfiziert werden, oder durch physische oder chemische Verfahren, welche in dem Fachgebiet bekannt sind, wie beispielsweise Electroporation, Ionoporation oder über ein „Gen-Gewehr". Zusätzlich kann Angiostatin-DNA ohne die Hilfe eines Trägers in einen Patienten direkt injiziert werden. Insbesondere kann Angiostatin-DNA in Haut, Muskel oder Gewebe oder Blut injiziert werden.
Das Gentherapie-Protokoll für die Transfektion von Angiostatin in einen Patienten kann entweder durch die Integration von Angiostatin-DNA in das Genom von Zellen, in Minichromosomen, oder als separate replizierende oder nicht-replizierende DNA-Konstrukte im Zytoplasma oder Nucleoplasma der Zelle verlaufen. Die Angiostatin-Expression kann über einen langen Zeitraum anhalten, oder sie kann periodisch reinjiziert werden, um ein gewünschtes Niveau des Angiostatin-Proteins in der Zelle, dem Gewebe oder dem Organ oder ein vorher bestimmtes Blutniveau zu halten.
Angiostatin kann mit einer HPLC C4-Säule (siehe Tabelle 3) isoliert werden. Das Angiostatin-Protein wird bei 30 bis 35 % in einem Acetonitrilgradienten eluiert. Auf einem Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel-Electrophorese (PAGE)-Gel unter reduzierenden Bedingungen eluierte die Proteinbande mit der Aktivität als einzelner Peak bei ungefähr 38 kD.
Die Erfinder haben gezeigt, dass ein wachsender Primärtumor mit der Freisetzung von spezifischen Inhibitoren der Endothelzell-Proliferation assoziiert ist, einschließlich von Angiostatin, welcher die Angiogenese der Metastase unterdrückt, und dadurch das Wachstum der Metastasen selbst inhibiert. Die Quelle des Angiostatins, das mit dem Primärtumor assoziiert ist, ist nicht bekannt. Die Verbindung kann durch Abbau von Plasminogen durch eine spezifische Protease hergestellt werden, oder Angiostatin könnte durch Expression eines spezifischen Gens, das für Angiostatin kodiert, produziert werden.
Der angiogene Phänotyp von Primärtumoren hängt von der Produktion angiogener Peptide im Überschuss gegenüber Endothelzell-Inhibitoren ab, welche von normalen Zellen hergestellt werden, aber bei denen vermutet wird, dass sie während der Transformierung in eine Neoplasie herunter reguliert werden. Während die Produktion von Angiostatin in einer individuellen Tumorzelle bezogen auf die Produktion durch seinen parentalen Zelltyp herunter reguliert sein kann, kann die gesamte Menge an Inhibitor, die durch den gesamten Tumor hergestellt wird, ausreichend sein, um in den Kreislauf einzudringen und das Endothelwachstum an entfernten Stellen der Mikrometastasen zu unterdrücken. Angiostatin bleibt im Kreislauf für signifikant längere Zeit als die angiogenen Peptide, die von einem Primärtumor freigesetzt werden. So scheinen angiogene Peptide lokal zu wirken, während Angiostatin global wirkt und im Blut mit einer relativ langen Halbwertszeit zirkuliert. Die Halbwertszeit von Angiostatin beträgt ungefähr 12 Stunden bis 5 Tage.
Obwohl nicht gewünscht ist, an die folgenden Hypothesen gebunden zu sein, wird vermutet, dass, wenn ein Tumor angingen wird, dieser ein oder mehrere angiogene Peptide freisetzt (z. B. aFGF, bFGF, VEGF, IL-8, GM-CSF), welche lokal wirken, dass Endothel in der Nachbarschaft des Primärtumors von der extravasculären Richtung avisieren und nicht zirkulieren (oder nur mit kurzer Halbwertszeit zirkulieren). Diese angiogenen Peptide müssen in einer ausreichenden Menge hergestellt werden, um die Wirkung des Endothelzell-Inhibitors (Inhibitoren der Angiogenese) zu überwinden, damit ein Primärtumor kontinuierlich seine Population expandiert. Sobald ein derartiger Primärtumor gut wächst, setzt er kontinuierlich Endothelzell-Inhibitoren in den Kreislauf frei. Nach dieser Hypothese wirken diese Inhibitoren in einer entfernten Distanz vom Primärtumor, und zielen auf das Kapillarendothel einer Metastase in intravasculärer Richtung ab und zirkulieren fortgesetzt. Dadurch, und gerade, wenn eine entfernte Metastase beginnen könnte, die Angiogenese zu iniziieren, kann das Kapillarendothel in seiner Nachbarschaft durch das zufließende Angiostatin inhibiert werden.
Sobald ein Primärtumor eine ausreichende Größe erreicht hat, um Angiostatin zu veranlassen, kontinuierlich in die Zirkulation freigesetzt zu werden, ist es für ein zweites Tumorimplantat (oder eine Micrometastase) schwierig, seine eigene Angiogenese zu iniziieren oder zu steigern. Wenn ein zweites Tumorimplantat (z. B. im subkutanen Raum oder in die Cornea oder intravenös in die Lunge) auftritt, kurz nachdem der Primärtumor implantiert worden ist, wird der Primärtumor nicht in der Lage sein, den Sekundärtumor zu unterdrücken (da die Angiogenese in dem Sekundärtumor bereits im Gange ist). Wenn zwei Tumoren gleichzeitig implantiert werden (z. B. in gegenüberliegende Seiten), können die Inhibitoren einen äquivalenten inhibitorischen Infekt aufeinander auswirken.
Die Angiostatin-Fragmente der vorliegenden Erfindung können

(i) Verabreichung an Tumor-tragende Menschen oder Tiere als anti-angiogener Therapie;
(ii) Überwachung im menschlichen oder Tierserum, Urin oder Geweben als prognostische Marker; und
(iii) verwendet werden als die Grundlage, um im Serum und Urin von Krebspatienten auf ähnliche angiostatische Moleküle zu untersuchen.

Es wird als Teil der vorliegenden Erfindung in Erwägung gezogen, dass Angiostatin aus einer Körperflüssigkeit wie Blut oder dem Urin von Patienten isoliert werden kann, oder das Angiostatin durch rekombinante DNA-Verfahren oder synthetische Peptidchemie-Verfahren produziert wird, die gewöhnlichen Fachleuten im Gebiet gut bekannt sind. Protein-Reinigungsverfahren sind in dem Fachgebiet gut bekannt und ein spezifisches Beispiel für ein Verfahren zur Reinigung von Angiostatin oder die Untersu chung der inhibitorischen Wirkung wird in den unten beschriebenen Beispielen bereitgestellt. Die Isolierung von endogenem humanem Angiostatin wird unter Verwendung ähnlicher Techniken erreicht.
Ein Beispiel eines Verfahrens zum Herstellen von Angiostatin unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken bedingt die folgenden Schritte (1) Identifizierung und Reinigung von Angiostatin, wie oben diskutiert, und wie unten genauer beschrieben werden wird, (2) Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz des gereinigten Inhibitors, (3) synthetische Erzeugung von 5'- und 3'-DNA-Oligonucleotidprimern der Angiostatin-Sequenz, (4) Amplifizierung der Angiostatin-Gensequenz unter Verwendung von Polymerase, (5) Inserieren der amplifzierten Sequenz in einen geeigneten Vektor, wie beispielsweise einen Expressionsvektor, (6) Inserieren des Gens, das der Vektor enthält, in einem Mikroorganismus oder ein anderes Expressionssystem, das in der Lage ist, das inhibitorische Gen zu exprimieren, und (7) Isolieren des rekombinant hergestellten Inhibitors. Geeignete Vektoren schließen virale, bakterielle und eukaryontische (wie beispielsweise Hefe) Expressionsvektoren ein. Die oben erwähnten Techniken werden vollständiger beschrieben in Laborhandbüchern, wie beispielsweise „Molecular Cloning: A laboratory Manual", 2. Ausgabe von Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, 1989. Die DNA-Sequenz des menschlichen Plasminogens ist publiziert worden (Browne, M. J. et al., „Expression of recombinant human plasminogen and aglycoplasminogen in HeLa cells", Fibrinolysis Vol. 5 (4), 257-260, 1991) und hier durch Bezugnahme eingeschlossen.
Das Angiostatin-Gen kann ebenfalls aus Zellen oder Gewebe (wie beispielsweise Tumorzellen) isoliert werden, die hohe Konzentrationen an Angiostatin exprimieren, in dem (1) Messenger-RNA aus dem Gewebe isoliert wird, (2) die Reverse Transcriptase verwendet wird, um die entsprechende DNA-Sequenz zu erzeugen, und dann (3) die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit den entsprechenden Primern verwendet wird, um die DNA-Sequenz zu amplifizieren, die für die aktive Angiostatin-Aminosäuresequenz kodiert.
Noch ein weiteres Verfahren zur Herstellung von Angiostatin oder biologisch wirksamen Fragmenten davon ist durch Peptidsynthese. Sobald ein biologisch aktives Fragment von Angiostatin unter Verwendung des Testsystems, das unten genauer beschrieben werden wird, gefunden wird, kann es sequenziert werden, beispielsweise durch automatisierte Peptidsequenzierverfahren. Alternativ dazu kann die DNA-Sequenz unter Verwendung der manuellen oder automatisierten Sequenzverfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, bestimmt werden, sobald das Gen oder die DNA, die für Angiostatin kodiert, isoliert worden ist, beispielsweise durch die oben erwähnten Methoden. Die Nucleinsäuresequenz wiederum stellt Informationen bezüglich der Aminosäuresequenz bereit. Diese kann aus der entsprechenden DNA-Sequenz bestimmt werden, wenn das biologisch wirksame Fragment durch die spezifischen Methoden, wie beispielsweise Trypsinverdau erzeugt wird, oder wenn das Fragment N-terminal sequenziert worden ist, wobei der Rest der Aminosäuresequenz aus der entsprechenden DNA-Sequenz abgeleitet werden kann.
Sobald die Aminosäuresequenz des Peptids bekannt ist, kann das Fragment durch Techniken, die im Fachgebiet gut bekannt sind, synthetisiert werden, wie beispielsweise angegeben in „Solid Phase Peptide Synthesis: A practical Approach" E. Atherton und R. C. Sheppard, IRL Press, Oxford, England. Gleichermaßen können mehrere Fragmente synthetisiert werden, die anschließend miteinander verbunden werden, um größere Fragmente zu bilden. Diese synthetischen Peptidfragmente können ebenfalls mit Aminosäuresubstitutionen an spezifischen Stellen hergestellt werden, um die agonistische und antagonistische Wirkung in vitro und in vivo zu testen. Peptidfragmente, die eine hoch-affine Bindung an Gewebe besitzen, können verwendet werden, um den Angiostatin-Rezeptor mit Affinitätssäulen zu isolieren. Die Isolierung und die Reinigung des Angiostatin-Rezeptors ist ein fundamentaler Schritt in Richtung der Aufklärung des Mechanismus der Wirkung von Angiostatin. Die Isolierung eines Angiostatin-Rezeptors und die Identifizierung von Angiostatin-Agonisten und -Antagonisten wird die Entwicklung von Medikamenten erleichtern, um die Aktivität des Angiostatin-Rezeptors zu modulieren, dem endgültigen Weg zur biologischen Aktivität. Die Isolierung des Rezeptors ermöglicht die Konstruktion von Nucleotidsonden, um die Stelle und die Synthese des Rezeptors unter Verwendung von in situ und Lösungs-Hybridisierungstechniken zu überwachen. Des Weiteren kann das Gen des Angiostatin-Rezeptors isoliert werden, in einen Expressionsvektor eingeschlossen werden und in Zellen transfiziert werden, beispielsweise in die Tumorzellen eines Patienten, um die Fähigkeit des Zelltyps zu erhöhen, des Gewebes oder des Tumors, Angiostatin zu binden und die lokale Angiogenese zu inhibieren.
Angiostatin ist wirksam in der Behandlung von Erkrankungen oder Prozessen, die durch Angiogenese vermittelt werden oder diese einschließen. Die vorliegende Erfindung betrifft das Verfahren zur Behandlung von Angiogenese-vermittelten Erkrankungen, mit einer wirksamen Menge eines biologisch wirksamen Angiostatin-Fragments, oder Kombinationen aus Angiostatin-Fragmenten, die gemeinsam die angiogene Wirkung besitzen. Die Angiogenese-vermittelten Erkrankungen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, solide Tumoren, im Blut vorhandene Tumoren, wie beispielsweise Leukämien, Tumormetastasen, benigne Tumoren, beispielsweise Hämangiome, akustische Neurome, Neurofibrome, Trachome und pyogene Granulome; rheumatoide Arthritis, Psoriasis, oculare angiogene Erkrankungen, beispielsweise diabetische Retinopathie, Retinopathie der Prematurity, maculare Degeneration, Abstoßung bei der Hornhauttransplantation, neovasculäre Glaucome, retrolentale Fibroplasie, Rubeose, Osler-Webber-Syndrom, Myocardangiogenese, Plaque-Neovascularisierung, Telangiectasia, hämophile Gelenke, Angiofibrome und Wundgranulierung. Angiostatin ist nützlich bei der Behandlung von Erkrankungen einer überschüssigen oder nicht normalen Stimulierung von Endothelzellen. Diese Erkrankungen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, intestinale Adhäsion, Morbus Crohn, Atherosclerose, Scleroderma und hypertrophische Narben, d. h. Keloide. Angiostatin kann als Mittel zur Geburtenkontrolle durch die Verhinderung der Vascularisierung verwendet werden, die für die Einnistung des Embryo benötigt wird. Angiostatin ist nützlich bei der Behandlung von Erkrankungen, die Angiogenese als pathologische Konsequenz aufweisen, wie beispielsweise Cat-Scratch-Disease (Rochele minalia quintosa) und Geschwüre (Helicobacter pylori).
Die synthetischen Peptidfragmente von Angiostatin haben eine Vielzahl von Verwendungen. Das Peptid, das an den Angiostatin-Rezeptor mit hoher Spezifität und Avidität bindet, wird radioaktiv markiert und für die Visualisierung und Quantifizierung von Bindungsstellen unter Verwendung von autoradiographischen und Membranbindungstechniken verwendet. Diese Anwendung stellt wichtige diagnostische und Recherchemittel bereit. Das Wissen der Bindungseigenschaften des Angiostatin-Rezeptors erleichtert die Untersuchung der Transduktionsmechanismen, die mit dem Rezeptor verbunden sind.
Zusätzlich ermöglicht die Markierung von Angiostatin Peptiden mit kurzlebigen Isotopen die Visualisierung von Rezeptorbindungsstellen in vivo unter Verwendung von Positronenemissions-Tomographie oder anderen modernen radiographischen Techniken, um Tumoren mit Angiostatin-Bindungsstellen zu lokalisieren.
Die systematische Substituierung von Aminosäuren durch diese synthetisierten Peptide bringt hoch-affine Peptidagonisten und -antagonisten hervor, die an den Angiostatin-Rezeptor binden, welche die Angiostatin-Bindung an ihren Rezeptor verstärken oder reduzieren. Solche Agonisten werden verwendet, um das Wachstum von Mikrometastasen zu unterdrücken, wodurch die Ausbreitung des Krebs beschränkt wird. Antagonisten gegen Angiostatin werden in Situationen verwendet, bei denen eine nicht-adäquate Vascularisierung stattfindet, um die inhibitorischen Wirkungen von Angiostatin zu blockieren und die Angiogenese zu fördern. Beispielsweise könnte diese Behandlung therapeutische Wirkungen bei der Wundheilung bei Diabetikern haben.
Angiostatin-Peptide werden verwendet, um Affinitätsäulen für die Isolierung des Angiostatin-Rezeptors aus kultivierten Tumorzellen zu entwickeln. Die Isolierung und Reinigung des Angiostatin-Rezeptors wird von der Aminosäuresequenzierung gefolgt. Unter Verwendung dieser Information kann das Gen oder die Gene, die für den Angiostatin-Rezeptor kodieren, identifiziert und isoliert werden. Als nächstes werden klonierte Nucleinsäuresequenzen für die Insertion in Vektoren entwickelt, die in der Lage sind, den Rezeptor zu exprimieren. Diese Techniken sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Die Transfektion der Nucleinsäuresequenz (-sequenzen), die den Angiostatin-Rezeptor kodieren, in Tumorzellen und die Expression des Rezeptors durch die transfizierten Tumorzellen steigert die Anfälligkeit dieser Zellen für das endogene oder exogene Angiostatin und senkt dadurch die Rate des metastatischen Wachstums.
Cytotoxische Mittel, wie beispielsweise Ricin, werden an Angiostatin und hoch affine Angiostatin-Peptidfragmente gebunden, wodurch sie ein Mittel für die Zerstörung von Zellen bereitstellen, die Angiostatin binden. Diese Zellen können an vielen Stellen gefunden werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Mikrometastasen und Primärtumore. Peptide werden an cytotoxische Mittel gebunden, und in einer Weise infundiert, die so ausgerichtet ist, dass sie die Verabreichung an den gewünschten Ort maximiert. Beispielsweise werden Ricin-gebundene hochaffine Angiostatin-Fragmente durch eine Kanüle in Gefäße, die die Zielstelle versorgen, oder direkt in das Ziel eingeschleust. Solche Mittel können ebenfalls in einer kontrollierten Weise durch osmotische Pumpen verabreicht werden, die an Infusionskanülen gebunden sind. Eine Kombination von Angiostatin-Antagonisten kann gemeinsam mit Stimulatoren der Angiogenese verabreicht werden, um die Vascularisierung von Gewebe zu verstärken. Dieses Therapieregime stellt ein wirksames Mittel zur Zerstörung von metastasierendem Krebs dar.
Angiostatin-Fragmente können in Kombination mit anderen Zusammensetzungen und Prozeduren zur Behandlung von Erkrankungen verwendet werden. Beispielsweise kann ein Tumor konventionell mit Hilfe der Chirur gie, Bestrahlung und Chemotherapie behandelt werden, und mit Angiostatin-Fragmenten kombiniert werden, und dann können Angiostatin-Fragmente -anschließend an den Patienten verabreicht werden, um die Ruhe der Micrometastasen zu verlängern und das Wachstum jedes restlichen Primärtumors zu stabilisieren und zu inhibieren. Zusätzlich werden Angiostatin-Fragmente oder Kombinationen daraus mit pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten zusammengegeben und gegebenenfalls mit einer Matrix für die verzögerte Freisetzung, wie beispielsweise biologisch abbaubare Polymere, um therapeutische Zusammensetzungen zu bilden.
Eine Matrix für die verzögerte Freisetzung, die hier verwendet wird, ist eine Matrix, die aus Materialien besteht, für gewöhnlich Polymeren, die durch enzymatische oder Säure-/Basehydrolyse oder durch Auflösung abbaubar sind. Sobald sie in den Körper inseriert sind, wird auf die Matrix durch Enzyme und Körperflüssigkeiten eingewirkt. Die Matrix für die verzögerte Freisetzung wird vorzugsweise aus biologisch kompatiblen Materialien ausgewählt, wie beispielsweise Liposomen, Polylactin (Polymilchsäure), Polyglycolid (Polymer der Glycolsäure), Polylactid-co-glycolid (Co-Polymer aus Milchsäure und Glycolsäure), Polyanhydriden, Poly(ortho)ester, Polypeptiden, Hyaluronsäure, Collagen, Chondroitinsulfat, Carbonsäuren, Fettsäuren, Phospholipiden, Polysacchariden, Nucleinsäuren, Polyaminosäuren, Aminosäuren, wie beispielsweise Phenylalanin, Tyrosin, Isoleucin, Polynucleotiden, Polyvinylpropylen, Polyvinylpyrrolidon und Silicon. Eine bevorzugt biologisch abbaubare Matrix ist eine Matrix aus entweder Polylactid, Polyglycolid oder Polylactid-co-glycolid (Co-Polymere aus Milchsäure und Glycolsäure).
Die Angiogenese-modulierende therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann ein Feststoff, eine Flüssigkeit oder ein Aerosol sein und kann durch irgendeinen bekannten Verabreichungsweg verabreicht werden. Beispiele für feste therapeutische Zusammensetzungen schließen Pillen, Cremes und implantierbare Dosierungseinheiten ein. Pillen können oral verabreicht werden, die therapeutischen Cremes können topisch verabreicht werden. Die implantierbare Dosierungseinheit kann lokal verabreicht werden, beispielsweise an einer Tumorstelle, oder sie kann für die systemische Freisetzung der therapeutischen Angiogenese modulierenden Zusammensetzung implantiert werden, beispielsweise subkutan. Beispiele für eine Flüssigzusammensetzung schließen Formulierungen ein, die für die subkutane, intravenöse, intraarterielle Injektion angepasst sind, und Formulierungen für die topische und intraokulare Verabreichung. Beispiele für Aerosolformulie rungen schließen Inhalationsformulierungen für die Verabreichung in die Lungen ein.
Die erfindungsgemäßen Angiostatin-Fragmente können ebenfalls verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, die spezifisch für den Inhibitor sind und für dessen Rezeptor. Die Antikörper können entweder polyklonale Antikörper oder monoklonale Antikörper sein. Diese Antikörper, die spezifisch an Angiostatin oder Angiostatin-Rezeptoren binden, können in diagnostischen Verfahren und Kits verwendet werden, die gewöhnlichen Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, um Angiostatin oder Angiostatin-Rezeptoren in einer Körperflüssigkeit oder in Gewebe nachzuweisen oder zu quantifizieren. Ergebnisse aus diesen Tests können verwendet werden, um das Auftreten oder das Wiederauftreten von Krebs oder anderen Angiogen-vermittelten Erkrankungen vorherzusagen oder zu diagnostizieren.
Die Angiostatin-Fragmente der vorliegenden Erfindung können ebenfalls in einem diagnostischen Verfahren und einem Kit verwendet werden, um Antikörper nachzuweisen und zu quantifizieren, die in der Lage sind, Angiostatin zu binden. Diese Kits werden den Nachweis von zirkulierenden Angiostatin-Antikörpern erlauben, was die Ausbreitung von Mikrometastasen in Gegenwart von Angiostatin anzeigt, welche von Primärtumoren in situ freigesetzt werden. Patienten, die solche zirkulierenden Anti-Angiostatin-Antikörper haben, können möglicherweise leichter mehrere Tumore und Krebse entwickeln, und können möglicherweise eher ein Wiederauftreten von Krebs nach Behandlungen oder Remissionsperioden aufweisen. Die Fab-Fragmente dieser Anti-Angiostatin-Antikörper können als Antigene verwendet werden, um Anti-Angiostatin-Fab-Fragment-Antiseren herzustellen, die verwendet werden können, um Anti-Angiostatin-Antikörper zu neutralisieren. Ein derartiges Verfahren würde das Entfernen von zirkulierendem Angiostatin durch Anti-Angiostatin-Antikörper reduzieren, wodurch die Angiostatin-Niveaus, die zirkulieren, effizient erhöht werden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Blockierung der Wirkung von überschüssigem endogenem Angiostatin. Dies kann durch passive Immunisierung eines Menschen oder eines Tiers mit Antikörpern gemacht werden, die für das nicht gewünschte Angiostatin in dem System spezifisch sind. Diese Behandlung kann wichtig sein bei der Behandlung von abnormaler Ovulation, Menstruation und Plazentabildung sowie der Vasculogenese. Dies stellt ein nützliches Mittel zur Untersuchung der Wirkung der Angiostatin-Entfernung auf metastatische Prozesse bereit. Das Fab-Fragment der Angiostatin-Antikörper enthält die Bindungsstelle für Angiostatin. Dieses Frag ment wird aus Angiostatin-Antikörpern unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Techniken isoliert. Die Fab-Fragmente von Angiostatin-Antiseren werden als Antigene verwendet, um die Herstellung von Fab-Fragment-Antiserum zu erzeugen. Die Infusion dieses Antiserums gegen die Fab-Fragmente von Angiostatin hindert Angiostatin daran, an Angiostatin-Antikörper zu binden. Der therapeutische Nutzen wird durch die Neutralisierung der endogenen Anti-Angiostatin-Antikörper erreicht, indem die Bindung von Angiostatin an die Fab-Fragmente von Anti-Angiostatin blockiert wird. Die Nettowirkung dieser Behandlung ist die Erleichterung der Fähigkeit des endogenen zirkulierenden Angiostatins, die Zielzellen zu erreichen, wodurch die Ausbreitung von Metastasen vermindert wird.
Es ist klar, dass die vorliegende Erfindung beabsichtigt, Derivate der Angiostatin-Fragmente einzuschließen, die Endothel-inhibierende Wirkung aufweisen. Die vorliegende Erfindung schließt Derivate biologisch wirksamer Fragmente des Angiostatin-Proteins ein. Diese schließen Proteine mit Angiostatin-Aktivität ein, die Aminosäuresubstitution haben, oder die Zucker oder andere Moleküle an die funktionalen Gruppen der Aminosäure angehängt haben.
Die Proteinfragmente mit Angiostatin-Aktivität, die oben beschrieben wurde, können als isolierte und im Wesentlichen gereinigte Proteine und Proteinfragmente in pharmazeutisch annehmbaren Formulierungen unter Verwendung von Formulierungsverfahren bereitgestellt werden, die für gewöhnlich den Fachleuten bekannt sind. Diese Formulierungen können durch Standardrouten verabreicht werden. Im Allgemeinen können die Kombinationen durch topische, transdermale, intraperitoneale, intracraniale, intracerebroventriculäre, intracerebrale, intravaginale, intraunterine, orale, rectale oder parenterale (z. B. intravenöse, intraspinale, subkutane oder intramuskuläre) Wege verabreicht werden. Zusätzlich können die Angiostatin-Fragmente in biologisch abbaubare Polymere eingeschlossen werden, was die verzögerte Freisetzung der Verbindung ermöglicht, wobei die Polymere in der Nähe implantiert werden, wo die Medikamentenverabreichtung gewünscht wird, beispielsweise an der Stelle eines Tumors, oder sie so implantiert werden, dass das Angiostatin langsam systemisch freigesetzt wird. Osmotische Minipumpen können ebenfalls verwendet werden, um eine kontrollierte Freisetzung von hohen Konzentrationen von Angiostatin durch Kanülen an dem Ort von Interesse bereitzustellen, wie beispielsweise direkt in das metastatische Wachstum oder in die vasculäre Zufuhr des Tumors. Die biologisch abbaubaren Polymere und ihre Verwendung sind beispielsweise im Detail beschrieben in Brem et al., J. Neurosurg. 74: 441-446 (1991), welcher hier durch Bezugnahme vollständig eingeschlossen ist.
Die Dosierung der erfindungsgemäßen Angiostatinfragmente hängt von dem Krankheitsstadium oder dem Zustand der zu behandeln ist und anderen klinischen Faktoren, wie beispielsweise dem Gewicht und dem Zustand des Menschen oder des Tiers und der Verabreichungsroute der Verbindung ab. Zur Behandlung von Menschen oder Tieren können ungefähr 0,5 mg/kg bis 500 mg/kg der Angiostatinfragmente verabreicht werden. Abhängig von der Halbwertszeit des Angiostatin-Fragments in dem besonderen Tier oder Menschen kann das Angiostatin-Fragment zwischen mehreren Malen pro Tag bis einmal pro Woche verabreicht werden. Es ist klar, dass die vorliegende Erfindung Anwendung sowohl für die Verwendung beim Menschen als auch in der Veterinärmedizin hat. Die erfindungsgemäßen Methoden ziehen einzelne wie auch mehrfache Verabreichungen in Erwägung, welche entweder gleichzeitig oder über verlängerte Zeiträume verabreicht werden.
Die Angiostatin-Fragmente enthaltenden Formulierungen schließen solche ein, die für orale, rektale, ophthalmische (einschließlich intravitreale oder intracamerale), nasale, topische (einschließlich buccal und sublingual), intrauterine, vaginale oder parenterale (einschließlich subkutane, intraperitoneale, intramuskuläre, intravenöse, intradermale, intracranielle, intratracheale und epidurale) Verabreichungen verwendet werden. Die Angiostatin-Fragment-Formulierungen können in günstiger Weise in Einheitsdosierungsformen vorliegen und können durch konventionelle pharmazeutische Techniken hergestellt werden. Solche Techniken schließen den Schritt des In-Verbindung-Bringens des wirksamen Inhaltsstoffs und der pharmazeutischen Träger oder Exzipienten ein. Im Allgemeinen werden die Formulierungen durch gleichmäßiges und eng ineinander und In-Kontakt-Bringen des wirksamen Inhaltsstoffs mit Flüssigträgern oder fein verteilten festen Trägern oder beiden und dann, falls notwendig, das Formen des Produkts hergestellt.
Die Formulierungen, die für die parenterale Verabreichung geeignet sind, schließen wässrige und nicht wässrige sterile Injektionslösungen ein, welche Anti-Oxidationsmittel, Puffer, Bacteriostatica und Lösstoffe enthalten, die die Formulierung isotonisch mit Blut des beabsichtigten Empfängers machen; und wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen, die Suspensionsmittel und Verdickungsmittel einschließen. Die Formulierungen können in Einheitsdosierungs- und Mehrfachdosierungsbehältern vorliegen, beispielsweise in versiegelten Ampullen und Phiolen, und sie können in einem gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zustand gelagert werden, der nur die Zugabe des sterilen Flüssigträgers notwendig macht, beispielsweise Wasser für Injektionen, direkt vor der Verwendung. Nicht vorbereitete Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Körnern und Tabletten der zuvor beschriebenen Art hergestellt werden.
Bevorzugte Einheitsdosierungsformulierungen sind solche, die eine tägliche Dosierung oder Einheit, eine tägliche Subdosierung oder einen geeigneten Anteil davon des zu verabreichenden Inhaltsstoffs enthalten. Es sollte klar sein, dass zusätzlich zu den Inhaltsstoffen, insbesondere den oben erwähnten, die erfindungsgemäßen Formulierungen andere Mittel einschließen können, die konventionellerweise im Fachgebiet verwendet werden, wobei die Art der jeweiligen Formulierung in Betracht gezogen wird. Gegebenenfalls können cytotoxische Mittel enthalten sein, oder in anderer Form mit Angiostatin-Proteinen kombiniert werden, oder biologisch funktionale Peptidfragmente davon, um eine Doppeltherapie für den Patienten bereitzustellen.
Angiogenese inhibierende Proteine der vorliegenden Erfindung können in standardisierten mikrochemischen Anlagen synthetisiert werden und mittels HPLC und Massenspectrophotometrie auf die Reinheit getestet werden. Die Verfahren für die Peptidsynthese, HPLC-Reinigung und Massenspectrophotometrie sind Fachleuten auf dem Gebiet allgemein geläufig. Angiostatin-Peptide und Angiostatin-Rezeptorenpeptide werden ebenfalls in rekombinanten Coli- oder Hefeexpressionssystemen hergestellt und mittels Säulenchromatographie gereinigt.
Verschiedene Proteinfragmente des intakten Angiostatin-Moleküls können zur Verwendung in verschiedenen Anwendungen synthetisiert werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die folgenden; als Antigene für die Entwicklung spezifischer Antiseren, als Agonisten und Antagonisten, die an Angiostatin-Bindungsstellen wirksam sind, als Peptide, die gebunden werden an oder für das gezielte Abtöten von Zellen, die Angiostatin binden, mit cytotoxischen Mitteln in Kombination verwendet werden. Die Aminosäuresequenzen, die diese Peptide umfassen, werden auf der Grundlage ihrer Position aus den äußeren Bereichen des Moleküls ausgewählt, und sind für die Bindung von Antiseren zugänglich. Die Amino- und Carboxytermini von Angiostatin sowie der Mittelbereich des Moleküls werden getrennt in den Fragmenten, die synthetisiert werden, dargestellt.
Diese Proteinsequenzen werden mit bekannten Sequenzen unter Verwendung von Proteinsequenzdatenbanken, wie GenBank, Brookhaven Protein, SWISS-PROT und PIR verglichen, um potentielle Sequenzhomologien zu bestimmen. Diese Information erleichtert die Eliminierung von Sequenzen, die einen hohen Grad an Sequenzhomologie zu anderen Molekülen aufweisen, wodurch das Potential für eine hohe Spezifität bei der Entwicklung von Antiseren, Agonisten und Antagonisten für Angiostatin verbessert wird.
Angiostatin und von Angiostatin abstammende Proteine können an andere Moleküle unter Verwendung von Standardverfahren gebunden werden. Die Amino- und Carboxytermini von Angiostatin enthalten beide Tyrosin- und Lysinreste und sind isotopisch und nicht-isotopisch durch zahlreiche Techniken markierbar, z. B. durch radioaktive Markierung unter Verwendung von konventionellen Techniken (Tyrinreste-Chloramin T, Indogen, Lactoperoxidase; Lysinrest-Bolton-Hunter-Reagent). Diese Bindungstechniken sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Alternativ dazu wird Tyrosin oder Lysin an Fragmente, die nicht diese Reste aufweisen, angehängt, um die Markierung der reaktiven Amino- und Hydroxylgruppen an dem Peptid zu erleichtern. Die Bindungstechnik wird auf der Grundlage der funktionalen Gruppen ausgewählt, die auf den Aminosäuren verfügbar sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Amino, Sulfhydral, Carboxyl, Amid, Phenol und Imidazol. Zahlreiche Reagenzien, die verwendet werden, um diese Bindungen durchzuführen, schließen unter anderem Glutaraldehyd, diazotisiertes Benzidin, Carbodiimid und p-Benzochinon ein.
Angiostatin-Proteine werden chemisch an Isotope, Enzyme, Trägerproteine, cytotoxische Mittel, Fluoreszenzmoleküle, Chemiluminescenz-, Bioluminescenz- und andere Verbindungen für eine Vielzahl an Anwendungen gebunden. Die Effizienz der Bindungsreaktion wird unter Verwendung verschiedener Techniken bestimmt, die für eine spezifische Reaktion geeignet sind. Beispielsweise wird die radioaktive Markierung eines Angiostatin-Peptids mit ¹²⁵Iod unter Verwendung von Chloramin T und Na¹²⁵I mit hoher spezifischer Aktivität erreicht. Die Reaktion wird durch Natriummetabisulfid beendet, und das Gemisch wird auf Einwegsäulen entsalzt. Das markierte Peptid wird von der Säule eluiert und Fraktionen werden eingesammelt. Aliquote werden aus jeder Fraktion entfernt und die Radioaktivität wird in einem Gamma-Zählgerät gemessen. Auf diese Weise wird das nicht umgesetzte Na¹²⁵I von dem markierten Angiostatin-Peptid abgetrennt. Die Peptidfraktionen mit der höchsten spezifischen Radioaktivität werden für die anschließende Verwendung, beispielsweise die Analyse der Fähigkeit an Angiostatin-Antiseren zu binden, gelagert.
Eine andere Anwendung der Proteinkonjugierung ist die Produktion von polyklonalen Antiseren. Beispielsweise werden Angiostatin-Peptide, die Lysinreste enthalten, an gereinigtes Rinderserumalbumin unter Verwendung von Glutaraldehyd gebunden. Die Effizienz der Reaktion wird durch Messung der Inkorporation des radioaktiv markierten Peptids bestimmt. Nicht umgesetztes Glutaraldehyd und Peptid werden durch Dialyse getrennt. Das Konjugat wird für die anschließende Verwendung gelagert.
Antiserum gegen Angiostatin, Angiostatin-Analoga, Proteinfragmente von Angiostatin und des Angiostatin-Rezeptors können hergestellt werden. Nach der Peptidsynthese und der Reinigung werden sowohl monoklonale und polyklonale Antiseren unter Verwendung etablierter Techniken, die Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind, erzeugt. Beispielsweise können polyklonale Antiseren in Kaninchen, Schafen, Ziegen oder anderen Tieren erzeugt werden. Angiostatin-Peptide, die an ein Trägermolekül gebunden werden, wie beispielsweise Rinderserumalbumin oder Angiostatin selbst, wird mit einem Adjuvanzgemisch kombiniert, emulgiert und subkutan an verschiedenen Stellen auf dem Rücken, dem Nacken, den Seiten und manchmal in die Fußsohlen injiziert. Boost-Injektionen werden in regulären Intervallen, wie beispielsweise alle 2 bis 4 Wochen durchgeführt. Blutproben werden durch Venenpunktion beispielsweise unter Verwendung der kleinen Ohrvenen nach Dilatation ungefähr 7 bis 10 Tage nach jeder Injektion gewonnen. Die Blutproben werden über Nacht bei 4°C verklumpen gelassen und werden bei ungefähr 2.400 X g bei 4°C für ungefähr 30 Minuten zentrifugiert. Das Serum wird entfernt, aliquotiert und bei 4°C für die sofortige Verwendung oder bei –20 bis –90°C für die anschließende Analyse verwendet.
Alle Serumproben für die Erzeugung polyklonaler Antiseren oder Medienproben aus der Produktion der monoklonalen Antiseren werden zur Bestimmung des Antikörpertiters analysiert. Der Titer wird auf verschiedene Weisen etabliert, beispielsweise unter Verwendung von Dot-Blots und Dichteanalysen, und ebenfalls durch die Präzipitierung radioaktiv markierter Peptid-Antikörperkomplexe unter Verwendung von Protein A, sekundären Antiseren, kaltem Ethanol oder Aktivkohle-Dextran, gefolgt von der Aktivitätsmessung mit einem Gamma-Zählgerät. Das Antiserum mit dem höchsten Titer wird ebenfalls auf Affinitätssäulen gereinigt, welche kommerziell erhältlich sind. Angiostatin-Peptide werden an das Gel in der Affinitätssäule gebunden. Antiserumproben werden durch die Säule durchgeleitet und Anti-Angiostatin-Antikörper bleiben an die Säule gebunden. Diese Antikörper werden anschließend eluiert, eingesammelt und für die Bestimmung des Titers und die Spezifität untersucht.
Das Angiostatin-Antiserum mit dem höchsten Titer wird getestet, um das Folgende festzustellen: a) optimale Antiserumverdünnung für die höchste spezifische Bindung des Antigens und niedrigste nicht-spezifische Bindung, b) die Fähigkeit, zunehmende Mengen an Angiostatin-Peptid in einer Standardverdrängungskurve zu binden, c) potentielle Kreuzreaktivität mit verwandten Peptiden und Proteinen, einschließlich Plasminogen und ebenfalls Angiostatin verwandter Spezies feststellen, d) Fähigkeit, Angiostatin-Peptide in Extrakten aus Plasma, Urin, Geweben und Zellkulturmedien nachzuweisen.
Kits zur Messung von Angiostatin und des Angiostatin-Rezeptors werden ebenfalls beschrieben. Antiseren, die den höchsten Titer und Spezifität besitzen und Angiostatin-Peptide in Extrakten aus Plasma, Urin, Geweben und in Zellkulturmedien nachweisen können, werden weiter untersucht, um leicht zu verwendende Kits für die schnelle, zuverlässige, empfindliche und spezifische Messung und Lokalisierung von Angiostatin zu etablieren. Diese Testkits schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, die folgenden Techniken: kompetitive und nicht kompetitive Tests, Radioimmunoassay, Bioluminescenz- und Chemoluminescenztests, fluorometrische Tests, Sandwich-Tests, immunradiometrische Tests, Dot-Blots, enzymgebundene Tests einschließlich ELISA, Mikrotiterplatten, Antikörper-beschichtete Streifen oder Tauchstreifen für die schnelle Überwachung bei Urin oder Blut und Immuncytochemie. Für jeden Kit werden der Bereich, die Sensitivität, die Präzision, die Zuverlässigkeit, die Spezifität und die Reproduzierbarkeit des Tests ermittelt. Eine Variation innerhalb des Tests und Zwischentests wird an den Punkten 20 %, 50 % und 80 % der Standardverdrängungskurve oder Aktivität etabliert.
Ein Beispiel eines Assay-Kits, der für gewöhnlich in der Recherche und in der Klinik verwendet wird, ist ein Radioimmunassay (RIA)-Kit. Ein Angiostatin-RIA wird unten dargestellt. Nach erfolgreicher Radioiodierung und Reinigung von Angiostatin oder eines Angiostatin-Peptids wird das Antiserum, das den höchsten Titer besitzt, in mehreren Verdünnungen in Röhrchen gegeben, die einen relativ konstanten Gehalt an Radioaktivität besitzen, wie beispielsweise 10.000 cpm in einem geeigneten Puffersystem. Andere Röhrchen enthalten Puffer oder präimmunes Serum, um die nicht-spezifische Bindung festzustellen. Nach der Inkubation bei 4°C für 24 Stunden wird Protein A hinzugegeben und die Röhrchen werden gevortexed, bei Raumtemperatur für 90 Minuten inkubiert und bei ungefähr 2.000-2.500 X g bei 4°C zentrifugiert, um die Komplexe des Antikörpers, der an markiertes Antigen gebunden hat, zu präzipitieren. Der Überstand wird durch Absaugen entfernt und die Radioaktivität in den Pellets wird im Gamma-Zählgerät gemessen. Die Antiserumverdünnung, die ungefähr 10 bis 40 % des markierten Peptids nach Abzug der nicht-spezifischen Bindung bindet, wird weiter charakterisiert.
Als nächstes wird ein Verdünnungsbereich (ungefähr 0,1 pg bis 10 ng) des Angiostatin-Peptids, das für die Entwicklung des Antiserum verwendet worden ist, durch Zugabe bekannter Mengen des Peptids zu den Röhrchen, die radioaktiv markiertes Peptid und Antiserum enthalten, ermittelt. Nach einer zusätzlichen Inkubationsdauer, beispielsweise 24 bis 48 Stunden, wird Protein A hinzugegeben und die Röhrchen werden zentrifugiert, der Überstand entfernt und die Radioaktivität im Pellet gemessen. Die Verdrängung der Bindung des radioaktiv markierten Angiostatin-Peptids durch das nicht-markierte Angiostatin-Peptid (Standard) stellt eine Standardkurve bereit. Mehrere Konzentrationen anderer Angiostatin-Peptidfragmente, von Plasminogen, von Angiostatin verschiedener Spezies, und homologer Peptide werden zu dem Teströhrchen hinzugegeben, um die Spezifität des Angiostatin-Antiserums zu kennzeichnen.
Extrakte verschiedener Gewebe, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, primäre und sekundäre Tumore, Lewis-Lungentumor, Kulturen Angiostatin-produzierender Zellen, Placenta, Uterus und anderer Gewebe, wie beispielsweise Hirn, Leber und Darm werden unter Verwendung von Extraktionstechniken, die erfolgreich verwendet worden sind, hergestellt, um Angiostatin zu extrahieren. Nach der Lyophilisierung oder einer Speed-Vac der Gewebeextrakte wird Testpuffer hinzugegeben und verschiedene Aliquots werden in die RIA-Röhrchen gegeben. Die Extrakte bekannter Angiostatin-produzierender Zellen ergeben Verdrändungskurven, die parallel zur Standardkurve sind, wobei Extrakte aus Geweben, die kein Angiostatin herstellen, radioaktiv markiertes Angiostatin von dem Angiostatin-Antiserum nicht verdrängen. Zusätzlich werden Extrakte aus Urin, Plasma und Cerebrospinalflüssigkeit von Tieren mit Lewis-Lungencarzinom zu den Teströhrchen in zunehmenden Mengen hinzugegeben. Parallele Verdrängungskurven zeigen die Brauchbarkeit des Angiostatin-Tests an, um Angiostatin in Geweben und Körperflüssigkeiten zu messen.
Gewebeextrakte, die Angiostatin enthalten, werden zusätzlich dadurch gekennzeichnet, dass Aliquots einer HPLC-Umkehrphase unterzogen werden. Eluatfraktionen werden eingesammelt, in einer Speed-Vac getrocknet, in RIA-Puffer rekonstituiert und in dem Angiostatin-RIA analysiert. Die maximale Menge der Angiostatin-Immunreaktivität findet sich in den Fraktionen, die der Elutionsposition von Angiostatin entspricht.
Der Test-Kit stellt Instruktionen, Antiserum, Angiostatin oder Angiostatin-Peptid und möglicherweise auch radioaktiv markiertes Angiostatin und/oder Reagenzien für die Präzipitierung gebundener Angiostatin-Angiostatin-Antikörperkomplexe bereit. Der Kit ist nützlich für die Messung von Angiostatin in biologischen Flüssigkeiten und Gewebeextrakten von Tieren und Menschen mit und ohne Tumoren.
Ein weiterer Kit wird für die Lokalisierung von Angiostatin in Geweben und Zellen verwendet. Dieser Angiostatin-Immunhistochemie-Kit stellt Instruktionen, Angiostatin-Antiserum und möglicherweise Blockierungsserum und ein sekundäres Antiserum bereit, das an ein Fluoreszenzmolekül, wie beispielsweise Fluoreszinisothiocyanat gebunden ist, oder irgendein anderes Reagens, das zur Visualisierung des Primärantiserums verwendet wird. Immunhistochemietechniken sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Dieser Angiostatin-Immunhistochemie-Kit erlaubt die Lokalisierung von Angiostatin in Gewebeschnitten und kultivierten Zellen sowohl mit Hilfe der Licht- und Elektronenmikroskopie. Er wird sowohl für die Recherche und für klinische Zwecke verwendet. Beispielsweise werden Tumore biopsiert oder eingesammelt und Gewebeschnitte mit einem Microtom geschnitten, um die Stellen der Angiostatin-Produktion zu untersuchen. Solche Informationen sind für diagnostische und möglicherweise therapeutische Zwecke bei dem Nachweis und der Behandlung von Krebs nützlich. Ein anderes Verfahren zur Visualisierung von Stellen der Angiostatin-Biosynthese schließen die radioaktive Markierung von Nucleinsäuren zur Verwendung in der in situ-Hybridisierung ein, um Angiostatin-Messenger-RNA zu sondieren. Gleichermaßen kann der Angiostatin-Rezeptor lokalisiert werden, visualisiert werden und mit Hilfe von immunhistochemischen Techniken quantifiziert werden.
Diese Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele dargestellt, welche nicht so ausgelegt werden sollten, dass sie Beschränkungen des Schutzbereichs der Ansprüche darstellen.
Beispiel 1
Auswahl des Tier-Tumorsystems, bei dem das Wachstum der Metastasen durch den Primärtumor inhibiert wird und nach Entfernung des Primärtumors beschleunigt wird.
Nach dem Durchmustern einer Vielzahl an Maustumoren, die in der Lage sind, ihre eigenen Metastasen zu inhibieren, wurde ein Lewis-Lungencarzinom ausgewählt, bei dem der Primärtumor am wirksamsten die Lungenmetastasierung inhibierte. Syngene sechs Wochen alte männliche C57BI6/J-Mäuse wurden mit 1 × 10⁶ Tumorzellen (subkutan Dorsum) injiziert. Sichtbare Tumore traten zuerst nach 3-4 Tagen auf. Sobald die Tumore ungefähr 1.500 mm³ groß waren, wurden die Mäuse zufallsgemäß in zwei Gruppen aufgeteilt. Der Primärtumor wurde in der ersten Gruppe vollständig ausgeschnitten und in der zweiten Gruppe nach einer Scheinoperation intakt gelassen. Obwohl Tumoren von 500 mm³ bis 3.000 mm³ das Wachstum von Metastasen inhibierten, war 1.500 mm³ der größte Primärtumor, der mit einer hohen Überlebensrate und keinem lokalen Wiederauftreten sicher ausgeschnitten werden konnte.
Nach 21 Tagen wurden alle Mäuse geopfert und einer Autopsie unterworfen. In Mäusen mit einem intakten Primärtumor gab es vier +2 sichtbare Metastasen, verglichen mit fünfzig + 5 Metastasen in den Mäusen, in denen der Tumor entfernt worden ist (p < 0,0001). Diese Daten wurden durch das Lungengewicht bestätigt, welches eng mit der Tumorlast korreliert, wie zuvor gezeigt worden ist. Es gab einen 400 % Anstieg im Lungen-Nassgewicht in den Mäusen, denen die Tumore entfernt worden sind, verglichen mit Mäusen, in denen die Tumore intakt gelassen worden sind (p < 0,0001).
Dieses experimentelle Modell ergab reproduzierbare Daten und das beschriebene Experiment ist reproduzierbar. Dieser Tumor wird als „Lewis-Lungencarzinom – wenig metastasierend" (LLC-Low) bezeichnet. Der Tumor unterdrückte auch Metastasen in nahezu identischer Weise in SCID-Mäusen, denen sowohl die B- und T-Lymphozyten fehlen.
Beispiel 2
Isolierung einer Variante des Lewis-Lungencarzinoma-Tumors, der stark metastasiert, unabhängig davon, ob der Primärtumor entfernt ist.
Eine stark metastasierende Variante des Lewis-Lungencarzinoma entstand spontan aus der LLC-Low-Zelllinie des Beispiels 1 in einer Gruppe der Mäuse und ist gemäß den in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren isoliert worden und wiederholt transplantiert worden. Dieser Tumor (LLC-High) bildet mehr als 30 sichtbare Lungenmetastasen, unabhängig davon, ob der Primärtumor vorhanden ist oder nicht.
Beispiel 3
Größe der Metastasen und die Proliferationsrate von Tumorzellen darin. Wirkung des Primärtumors, der Metastasen inhibiert (LLC-Low).
C57BI16/J-Mäuse wurden in allen Experimenten verwendet. Den Mäusen wurden subkutan LLC-Low-Zellen inokuliert und 14 Tage später wurde der Primärtumor in der Hälfte der Mäuse entfernt. Nach 5, 10 und 15 Tagen, nachdem der Tumor entfernt worden ist, wurden die Mäuse geopfert. Histolo gische Schnitte der Lungenmetastasen wurden gewonnen. Mäuse mit einem intakten Primärtumor hatten Mikrometastasen in der Lunge, die nicht neovascularisiert wurden. Diese Metastasen waren auf einen Durchmesser von 12-15 Zellschichten beschränkt und zeigten keinen signifikanten Größenanstieg, selbst 15 Tage nach der Tumorentfernung. Im Gegensatz dazu zeigten Tiere, denen der Primärtumor entfernt worden war, bereits nach 5 Tagen nach der Operation große vascularisierte Metastasen. Diese Metastasen durchliefen einen weiteren 4-fachen Anstieg im Volumen bis zum 15. Tag, nachdem der Tumor entfernt worden war (wie durch das Lungengewicht und die Histologie wiedergespiegelt wurde). Ungefähr 50 % der Tiere, die den Primärtumor entfernt hatten, starben an den Lungenmetastasen vor dem Ende des Experiments. Alle Tiere mit einem intakten Primärtumor überlebten das Ende des Experiments.
Die Replikationsrate der Tumorzellen innerhalb der Metastasen wurde durch das Zählen der Kernfärbungen mit BrdU bestimmt, welches zuvor in die Mäuse injiziert worden war. Der hohe Prozentsatz an Tumorzellen, die BrdU in kleinen avasculären Metastasen der Tiere mit einem intakten Primärtumor inkorporieren, war äquivalent zu der BrdU-Inkorporation von Tumorzellen in den großen vascularisierten Metastasen der Mäuse, denen der Primärtumor entfernt worden war (3). Dieser Befung lässt vermuten, dass das Vorhandensein eines Primärtumors keinen direkten Effekt auf die Replikationsrate von Tumorzellen bei der Metastase hat.
In 3 zeigt die linke Spur den BrdU-Markierungsindex von Tumorzellen in der Lunge in Gegenwart oder in Abwesenheit eines Primärtumors. Vor der immunhistochemischen Färbung wurden die Schnitte mit 0,2 M HCl für 10 Minuten permeabilisiert und mit 1 μg/ml Proteinase K verdaut (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Deutschland) in 0,2 M Tris-HCl, 2 mM CaCl₂ bei 37°C für 15 Minuten. Der Markierungsindex wurde durch das Zählen des Prozentsatzes positiver Nuclei bei 250-facher Vergrößerung abgeschätzt. Die rechte Spur der 3 stellt die Analyse des gesamten Lungengewichts der Tumore mit Primärtumoren in intakter oder entfernter Form an den Tagen 5, 10 und 15 nach der Operation dar. Die Tiere wurden 6 Stunden nach der intraperitonealen Injektion von BrdU geopfert (0,75 mg/Maus).
Beispiel 4
Inhibierung der Angiogenese in Lungenmetastasen in Gegenwart eines intakten Primärtumors.
Um den Grad der Vascularisierung in Lungenmetastasen zu messen, wurden Gewebe mit Antikörpern gegen von-Willebrand-Faktor gefärbt (einem Endothel- spezifischen Marker, erhältlich von Dako Inc., Carpenteria, CA). Die Metastasen von Tieren mit intakten Tumoren bildeten einen dünnen Ring (8-12 Tumorzellschichten), um die vorhandenen pulmonaren Gefäße. Außer den Endothelzellen der Gefäßauskleidung waren keine oder wenige Zellen positiv für von-Willebrand-Faktor. Im Gegensatz dazu waren die Lungenmetastasen der Tiere 5 Tage nach Entfernung des Primärtumors nicht nur größer, sondern auch durch kapilläre Sprossungen infiltriert, die Endothelzellen enthielten, welche stark von-Willebrand-Faktor positiv waren.
In immunhistochemischen Analysen auf das Vorhandensein von Endothelzellen in Lungenmetastasen hatte eine Lungenmetastase mit einem intakten Primärtumor 19 Tage nach der Inokulation einen Ring aus Tumorzellen um das bereits vorhandene Mikrogefäß in der Lunge. Die Metastase war auf 8 bis 12 Zellschichten begrenzt. Es gab keinen Hinweis auf eine Neovascularisierung um das Mikrogefäß, und dieses enthielt keine neuen Mikrogefäße. Dies war typisch für die maximale Größe einer avasculären präangiogenen Metastase.
In einer immunhistochemischen Analyse von Gewebe, welches 5 Tage, nachdem der Primärtumor herausgeschnitten worden war, eingesammelt wurde (19 Tage nach der Inokulation des Primärtumors), umgab die Metastase ein bereits vorhandenes Gefäß in der Lunge. Im Gegensatz dazu war der Tumor nicht in der Probe neovascularisiert, wo der Primärtumor nicht herausgeschnitten worden war. Das bedeutet, dass ein intakter Primärtumor die Bildung neuer kapillärer Blutgefäße in Metastasen inhibiert, aber die Proliferation von Tumorzellen innerhalb der Metastase wird durch den Primärtumor nicht beeinflusst.
Beispiel 5
Ein Primärtumor inhibiert die Angiogenese eines zweiten Tumors, der in die Maushornhaut implantiert wird. Das Wachstum dieses zweiten Tumors wird inhibiert.
Ein 0,25 bis 0,5 mm² großer Lewis-Lungentumor (LLC-Low) wurde am Tag 0 in die Maushornhaut implantiert (Muthukkaruppan Vr. et al., Angiogenesis in the mouse cornea. Science 205: 1416-1418, 1979). Ein Primärtumor wurde durch Inokulieren von 1 × 10⁶ LLC-Low-Zellen subkutan in den Rücken gebildet, entweder 4 oder 7 Tage vor dem Implantat in die Hornhaut; oder am Tag des Implantats in die Hornhaut; oder 4 oder 7 Tage nach dem Implantat in der Hornhaut. Die Kontrollmäuse erhielten das Hornhautimplantat, aber keinen subkutanen Tumor. Andere Kontrollmäuse erhielten das Hornhautimplantat und 4 Tage vor dem Hornhautimplantat eine Inokulation von LLC-High-Tu morzellen in den Rücken. Die Hornhäute wurden täglich durch eine Schlitzlampen-Stereomikroskopie auf das Wachstum des Hornhauttumors untersucht (gemessen durch ein okulares Mikrometer), und auf das Wachstum neuer Kapillargefäße vom Rand des Hornhautkörpers.
Bei Kontrollmäusen, die keinen primären subkutanen Tumor tragen, entwickelte die Mehrzahl der Hornhäute (6/8) eine Neovascularisierung, die am Tag 6 bis 7 nach dem Implantat in die Hornhaut begann und bis zum Tag 10 anhielt. Am Tag 10 hatten die vascularisierten Hornhauttumore ungefähr ein Viertel des Volumens des gesamten Auges. In Gegenwart des primären subkutanen LLC-Low-Tumors wurden die Hornhautimplantate nicht vascularisiert, wenn der Primärtumor mindestens 4 Tage oder mehr vor dem Hornhautimplantat vorhanden war (Tabelle 1). In Abwesenheit der Neovascularisierung wuchsen die Hornhauttumore langsam als dünne, weiße, avasculäre Scheiben innerhalb der Hornhaut.
Wenn jedoch der Primärtumor nicht bis 4 Tage nach dem Implantat in die Hornhaut implantiert wurde, wurden die Hornhäute vascularisiert und 3/3 Hornhauttumoren wuchsen in ähnlichen Raten wie die nicht Tumor-tragenden Kontrollen. In Gegenwart des primären subkutanen LLC-High-Tumors entwickelte die Mehrheit der Hornhäute (2/3) eine Neovascularisierung, welche am Tag 7 nach dem Implantat in die Hornhaut begann und bis zum Tag 10 anhielt. Am Tag 10 hatten die vascularisierten Hornhauttumore wiederum ungefähr ein Viertel des Volumens des gesamten Auges erreicht. Tabelle 1 Inhibierung der Tumorangiogenese in der Hornhaut durch einen primären subkutanen Tumor (Alle Primärtumoren sind LLC-Low, außer (*), welcher LLC-High ist).

Tag des Augenimplantats 0 0 0 0 0 0 0

Tag des Primärtumor-Implantats –7 –4 –4* 0 keine +4 +7

Anzahl an Mäusen mit neuen Hornhautgefäßen am Tag 10 2/10 0/9 2/3 2/3 6/8 3/3 2/3
Es würde erwartet werden, dass 0/10 Hornhäuten eine Neovascularisierung zeigen, wenn der primäre subkutane LLC-Low Tumor 7 Tage vor dem Augentumorimplantat (d. h. –7) implantiert wird. Jedoch wurden 2 der Tumore (2/10) nekrotisch, da sie zu groß waren (> 3 cm³).
Beispiel 6
Primärer intakter Tumor inhibiert die Angiogenese, die durch ein sekundäres subkutanes Implantat mit basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) induziert wird.
Obwohl die Experimente, die in den Beispielen 4 und 5 beschrieben sind, zeigen, dass ein Primärtumor die Angiogenese in einer sekundären Metastase inhibiert, zeigten diese Studien nicht, ob der Primärtumor: (i) die endotheliale Proliferation direkt inhibiert (oder die Angiogenese), oder (ii) indirekt durch die Herunterregulierung der angiogenen Wirkung der metastasierenden Tumorzellen. Um zwischen diesen zwei Möglichkeiten zu unterscheiden, wurde ein Fokus der subkutanen Angiogenese durch ein Implantat von Matrigel, welcher basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) enthält, induziert (Passaniti A. et al., A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and anit-angiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin and fibroblast growth factor. Lab. Invest. 67: 519, 1992).
Matrigel (ein Extrakt aus Basalmembran-Proteinen), welcher 25 bzw. 50 ng/ml bFGF in Gegenwart von Heparin enthält, wurde subkutan auf der ventralen Oberfläche normaler und Tumor-tragender Mäuse (LLC-Low) injiziert. Die Mäuse wurden 4 Tage später geopfert und die Hämoglobinkonzentration im Gel wurde gemessen, um die Blutgefäßbildung zu quantifizieren. Es ist zuvor gezeigt worden, dass die Anzahl an neuen Gefäßen, die in Matrigel eindringen, mit der Hämoglobinkonzentration korreliert (Folkman J., Angiogenesis and ist inhibitors in „Important Advances in Oncology 1985", VT DeVita, S. Hellman und S. Rosenberg, Hrsg., J. B. Lippincott, Philadelphia 1985). Einige Gele wurden auch für die histologische Untersuchung präpariert. Bei normalen Mäusen waren Matrigel-Pellets, die 50 ng/ml bFGF enthielten, vollständig rot. Sie wurden durch neue Kapillargefäße stark invadiert und enthielten 2,4 g/dl Hämoglobin. Matrigel, dem bFGF fehlte, war durchsichtig und grau und enthielt nur 0,4 g/dl Hämoglobin (ein 6-facher Unterschied). Im Gegensatz dazu enthielt Matrigel von Mäusen mit einem Primärtumor nur 0,5 g/dl (4).
Die nahezu vollständige Inhibierung der Angiogenese in diesem Experiment lässt vermuten, dass das Vorhandensein eines Lewis-Lungenprimärtumors die bFGF induzierte Angiogenese direkt inhibiert.
Beispiel 7
Transfer von Serum aus einem Tumor-tragenden Tier in ein Tier, dem der Primärtumor entfernt worden ist, unterdrückt Metastasen.

In Mäuse wurde ein Lewis-Lungencarzinom, wie oben beschrieben, implantiert. 15 Tage später, wenn die Tumore ungefähr 1.500 mm³ groß waren, wurden die Mäuse zufallsgemäß in vier Gruppen aufgeteilt. In drei Gruppen wurde eine vollständige chirurische Resektion des Primärtumors durchgeführt; in einer Gruppe wurde er an Ort und Stelle gelassen (nach einer chirurgischen Scheinprozedur). Die Mäuse in den drei Resektionsgruppen erhielten dann tägliche intraperitoneale Injektionen an Salzlösung, Serum normaler nicht Tumor-tragender Mäuse oder Serum aus Mäusen mit 1.500 mm³ Lewis-Lungencarzinom. Die Gruppe an Mäusen mit den Tumoren, die intakt gelassen worden waren, enthielten intraperitoneale Salzinjektionen. Alle Mäuse wurden 21 Tage behandelt, worauf die Tiere euthanisiert wurden und die Lungenmetastasen gezählt wurden (Tabelle 2). Tabelle 2

Primärtumor entfernt	Primärtumor intakt
Behandlung (intraperitoneale Injektionen)	Salzlösung	Serum normaler Mäuse	Serum Tumor tragender Mäuse	Salz-Injektionen
Anzahl der Lungenmetastasen	55 ± 5	50 ± 4	7 ± 2	3 ± 1

Diese Ergebnisse wurden durch das Lungengewicht bestätigt. p = < 0,0001 für den Unterschied zwischen den zwei Gruppen [(55 & 50) vs. (7 & 3)].
Ähnliche Ergebnisse sind gewonnen worden, indem Angiostatin aus dem Urin Tumor-tragender Tiere verwendet wurde.
Beispiel 8
Rinderkapillar-Endothel (BCE)-Zelltest
BCE-Zellen wurden nur zwischen den Passagen 9 und 14 verwendet. Am Tag 0 wurden BCE-Zellen auf gelatinisierte (1,5 % Gelatine in PBS bei 37°C, 10 % CO₂ für 24 Stunden und dann mit 0,5 ml PBS gespült) 24-Well-Platten in einer Konzentration von 12.500 Zellen/Well ausplattiert. Die Zellzählung wurde mit Hilfe eines Hämozytometers durchgeführt. Die Zellen wurden in 500 μl DMEM mit 10 % Hitze-inaktiviertem (56°C für 20 Minuten) Rinderkälberserum und 1 % Glutamin-Pen-Strep (GPS) ausplattiert.
BCE-Zellen werden wie folgt gefordert: Das Medium wird entfernt und durch 250 μl DMEM/5 % BCS/1 % GPS ersetzt. Die zu testende Probe wird dann zu den Wells hinzugegeben (die Menge variiert in Abhängigkeit von der zu testenden Probe). Platten werden für ungefähr 10 Minuten in 37°C/10 % CO₂ gestellt. 250 μl DMEM/5 % BCS/1 % GPS mit 2 ng/ml bFGF wird zu jedem Well hinzugegeben. Das endgültige Medium ist 500 μl DMEM/5 % BCS/1 % GPS mit 1 ng/ml bFGF. Die Platte wird für 72 Stunden in den 37°C/10 % CO₂-Inkubator zurückgegeben.
Am Tag 4 werden die Zellen durch Entfernen des Mediums gezählt und dann werden alle Wells trypsinisiert (0,5 ml Trypsin/EDTA) für 2 bis 3 Minuten. Die suspendierten Zellen werden dann in Scintillationsgefäße mit 9,5 ml Hämmetall überführt und unter Verwendung eines Coulter-Counters gezählt. Eine Einheit der Aktivität ist die Menge an Serum, die Angiostatin enthält, welches in der Lage ist, eine halb-maximale Inhibierung der kapillären Endothelproliferation zu erreichen, wenn die Endothelzellen in bFGF 1 ng/ml für 72 Stunden inkubiert werden.
Beispiel 9
Serum von Mäusen, die den gering metastasierenden Lewis-Lungentumor (LLC-Low) tragen, inhibiert die Kapillarendothelzell-Proliferation in vitro.
Rinderkapillar-Endothelzellen wurden mit basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF 1 ng/ml) in einem 72-stündigen Proliferationstest stimuliert. Das Serum der Tumor-tragenden Mäuse, das zu diesen Kulturen hinzugegeben worden war, inhibierte die Endothelzellproliferation in einer Dosis-abhängigen und reversiblen Weise. Normales Serum wirkte nicht inhibitorisch (5). Die Endothelzellproliferation wurde in ähnlicher Weise (bezogen auf die Kontrollen) durch Serum inhibiert, welches aus Tumor-tragenden nu/nu-Mäusen und SCID-Mäusen gewonnen wurde. Nachdem der Primärtumor entfernt worden war, verschwand die Angiostatin-Aktivität aus dem Serum innerhalb von 3-5 Tagen.
Tumor-tragendes Serum inhibierte auch Rinderaorta-Endothelzellen und Endothelzellen, die aus einem spontanen Maus-Hämangioendotheliom stammten (Obeso et al., „Methods in Laboratory Investigation, A Hemangioendothelioma-derived cell line; Its use as a Model for the Study of Endothelial Cell Biology", Lab Invest. 63 (2), S. 259-269, 1990), aber es inhibierte nicht Lewis-Lungentumorzellen, 3T3-Fibroblasten, glatte Aortamuskelzellen, Mink-Lungen-Epithel oder W138-Lungenfibroblasten aus einem menschlichen Fötus.
Beispiel 10
Serum von Mäusen, die einen Lewis-Lungentumor tragen (LLC-High), welcher Metastasen nicht inhibiert, inhibiert die kapillare Endothelzellproliferation in vitro nicht.
Das Serum von Mäusen, die einen Primärtumor aus LLC-High tragen, inhibierte nicht in signifikanter Weise die Proliferation von bFGF-stimulierten Rinderkapillar-Endothelzellen bezogen auf die Kontrollen. Auch wenn dieses Serum den ersten zwei Reinigungsschritten unterworfen wurde (auf Heparin-Sepharose-Chromatographie und Gelfiltration) wurde die Angiostatin-Aktivität in keiner der Fraktionen gefunden.
Beispiel 11
Aszites von Lewis-Lungencarzinom (wenig metastasierend) erzeugt auch Angiostatin-Serum.
Mäuse erhielten intraperitoneale Injektionen entweder von LLC-Low oder LLC-High Tumorzellen (10⁶) und eine Woche später wurde aus jeder der 10-20 Mäuse 1-2 ml blutige Aszites gewonnen. Eine mesenterale Tumorausbreitung wurde beobachtet. Die Mäuse wurden dann euthanisiert. Das Serum wurde durch Herzpunktion gewonnen. Das Serum wurde ebenfalls aus normalen, nicht Tumor-tragenden Mäusen als Kontrolle gewonnen. Serum und Aszites wurden zentrifugiert, um Zellen zu entfernen, und der Überstand wurde an Rinderkapillar-Endothelzellen getestet, die durch bFGF (1 ng/ml) stimuliert worden waren (siehe Beispiel 8). Aszites, das von beiden Tumortypen stammte, stimulierte nach 72 Stunden signifikant die Proliferation der kapillaren Endothelzellen (z. B. 100 % Proliferation) gegenüber den Kontrollen (6). Im Gegensatz dazu inhibierte Serum der wenig metastasierenden Mäuse die Endothelzellproliferation (Inhibierung von 79 % der Kontrollen). Das Serum der stark metastasierenden Linie war zu 200 % stimulatorisch.
Diese Daten zeigen, dass sie Aszitesflüssigkeit der wenig metastasierenden Linie einen Vorzug für den Endothel-Wachstumsstimulator gegenüber Angiostatin enthält. Dieser Zustand ist analog einem soliden Primärtumor. Des Weiteren scheint die Angiostatin-Aktivität im Serum, als wäre sie durch die stimulatorische Aktivität nicht beeinflusst. Dieses Muster ist ähnlich dem des soliden Primärtumors (LLC-Low). Die Aszitesflüssigkeit des stark metastasierenden Tumors (LLC-High) scheint ebenfalls bevorzugt einen Endothelzell-Stimulator zu haben, aber Angiostatin kann in dem Serum nicht identifiziert werden.
Beispiel 12
Fraktionierung von Angiostatin aus Serum mittels Säulenchromatographie und Analyse der Wachstums-inhibitorischen Fraktion mittels SDS-PAGE.
Um die Angiostatine zu reinigen, wurde Serum aus Tumor-tragenden Mäusen gepoolt. Die inhibitorische Wirkung, welche durch den oben beschriebenen in vitro-inhibitorischen Aktivitätstest untersucht wurde, wurde sequenziell unter Verwendung einer Heparinsepharose Biogel A 0,5 mm Agarose und mehreren Zyklen über C4-Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) chromatographisch aufgetrennt. SDS-PAGE der HPLC-Fraktion, welche eine Endothel-inhibitorische Aktivität enthielt, zeigte eine diskrete Bande von anscheinend reduziertem Molekulargewicht von M_r 38.000 Dalton, welches ungefähr 1-Million-fach aufgereinigt wurde (siehe Tabelle 3) auf eine spezifische Aktivität von ungefähr 2 × 10⁷. In verschiedenen Stadien der Reinigung wurden die gepoolten Fraktionen mit spezifischen Antikörpern auf das Vorhandensein bekannter Endothel-Inhibitoren getestet. Plättchenfaktor-4, Thrombospondin oder Transformations-Wachstumsfaktor beta wurden in den teilweise gereinigten oder gereinigten Fraktionen nicht gefunden. Tabelle 3

Spezifische Aktivität (Units*/mg) x-fache Reinigung

Serum 1,69 1

Heparin-Sepharose 14,92 8,8

Bio-gel A 0,5 m 69,96 41,4

HPCL/C4 2 × 10⁷ 1,2 × 10⁶

* Eine Aktivitätseinheit ist die Menge an Serum, die Angiostatin enthält, welche in der Lage ist, eine halb-maximale Inhibierung von kapillären Endothelproliferation zu erzeugen, wenn Endothelzellen für 72 Stunden in 1 ng/ml bFGF inkubiert werden.

Beispiel 13
Fraktionierung von Angiostatin aus dem Urin mittels Säulenchromatographie und Analyse der Wachstums-inhibitorischen Fraktion mittels SDS-PAGE.
Die Reinigung der Endothelzell-Inhibitoren aus dem Serum wird durch das geringe Volumen an Serum behindert, welches aus jeder Maus gewonnen werden kann, und durch die große Menge an Proteinen im Serum.
Der Urin von Tumor-tragenden Mäusen wurde analysiert und es wurde gefunden, dass er einen Inhibitor für die Endothelzell-Proliferation enthält, welcher im Urin der nicht Tumor-tragenden Mäuse und bei Mäusen mit LLC-high Tumoren auch nicht vorhanden ist. Die Reinigung der inhibitorischen Aktivität der Endothelzellen wurde mit der gleichen Strategie durchgeführt, die auch für die Reinigung des Serums durchgeführt wurde (oben beschrieben) (7).
7 zeigt eine C4-Umkehrphasenchromatographie teilweise gereinigten Serums oder Urins aus Tumor-tragenden Tieren. Alle Fraktionen wurden an Rinderkapillar-Endothelzellen mit bFGF in einem 72-stündigen Proliferationstest, wie in Beispiel 8 beschrieben, untersucht. Ein einzelner Peak der Inhibierung wurde in beiden Fällen gesehen, die bei 30-35 % Azetonitril in Fraktion 23 eluieren. SDS-Polyacrylamidgel-Electrophorese der inhibitorischen Fraktion aus dem dritten Zyklus der C4-Umkehrphasen-Chromatographie aus Serum Tumor-tragender Tiere zeigte eine Einzelbande bei ungefähr 38.000 Dalton.
Beispiel 14
Charakterisierung des zirkulierenden Angiostatins.
Die Endothel-Inhibierung wurde gemäß dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren untersucht. Angiostatin wurde mit einer Synchropak HPLC C4-Säule (Synchrom, Inc. Lafayette, IN) isoliert. Der Inhibitor wurde bei 30 bis 35 % Acetonitrilgradient eluiert. Auf einem Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE)-Gel unter reduzierenden Bedingungen (β-Mercaptoethanol (5 % v/v), eluierte die Proteinbande mit Aktivität bei 38 Kilodalton. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen eluierte das Protein mit Aktivität bei 28 Kilodalton. Die Aktivität wird an ähnlichen Punkten gefunden, ob die ursprüngliche Probe aus dem Urin oder aus dem Serum isoliert wurde. Die Aktivität wurde in anderen Banden nicht nachgewiesen.
Die Aktivität, die mit den Banden assoziiert ist, ging verloren, wenn sie erwärmt wurde (100°C für 10 Minuten) oder mit Trypsin behandelt wurde. Wenn die Bande mit Aktivität mit einem Wasser/Chloroform-Gemisch (1:1) extrahiert wurde, wurde die Aktivität nur in der wässrigen Phase gefunden.
Beispiel 15
Aufreinigung der inhibitorischen Fragmente aus menschlichem Plasminogen:
Die Plasminogen-Lysin-Bindungsstelle 1 wurde von Sigma Chemical Company erhalten. Das Präparat ist gereinigtes menschliches Plasminogen nach einem Verdau mit Elastase. Die Lysin-Bindungsstelle 1, die in dieser Weise gewonnen wird, ist eine Population an Peptiden, die in einem Aggregat mindestens die ersten drei Dreifach-Schlaufenstrukturen (Nummern 1 bis 3) in der Plasminogen-Kette (Kringel 1 +2+3) enthalten (Sotrrup-Jensen, L. et al., in Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis. Vol. 3, 191, Davidson, J. F. et al., Hrsg. Rauen Press, New York 1978 und Wiman, B. et al. Biochemica et Biophysica Acta, 579, 142 (1979)). Plasminogen-Lysin-Bindungsstelle 1 (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) wurde in Wasser resuspendiert und auf eine C4-Umkehrphasensäule aufgetragen, die mit HPLC-geeignetem Wasser/0,1 % TFA äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit einem Gradienten aus Wasser/0,1 % TFA zu Acetonitril/0,1 % TFA eluiert und Fraktionen wurden in Polypropylenröhrchen aufgefangen. Ein Aliquot von jeder wurde in einer Speed-Vac verdampft, mit Wasser resuspendiert und auf BCEs in einem Proliferationstest aufgetragen. Dieses Verfahren wurde zweimal mit den inhibitorischen Fraktionen unter Verwendung eines ähnlichen Gradienten für die Eluierung wiederholt. Die inhibitorische Aktivität eluierte im letzten Durchlauf über die C4-Säule bei 30-35 % Acetonitril. SDS-PAGE der inhibitorischen Fraktion zeigte 3 diskrete Banden von einem offensichtlichen reduzierten Molekulargewicht von 40, 42,5 und 45 kd. SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen zeigte 3 Banden mit einem Molekulargewicht von 30, 32,5 beziehungsweise 35 kd.
Beispiel 16
Extraktion der inhibitorischen Aktivität aus SDS-PAGE
Gereinigte inhibitorische Fraktionen aus auf menschlichem Plasminogen basierenden Reinigungen wurden mittels SDS-PAGE unter nicht denaturierenden Bedingungen aufgelöst. Bereiche des Gels, die den Banden entsprechen, die in benachbarten Spuren gefunden werden, welche mit den gleichen Proben beladen wurden, in dem eine Silberfärbung durchgeführt wurde, wurden aus dem Gel ausgeschnitten und in 1 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung bei 4°C für 12 Stunden in Polypropylenröhrchen inkubiert. Der Überstand wurde entfernt und zweimal für 6 Stunden gegen Salzlösung (MWCO = 6-8.000) und zweimal gegen destilliertes Wasser für 6 Stunden dialysiert. Das Dialysat wurde durch Vakuumzentrifugierung verdampft. Das Produkt wurde in Salzlösung resuspendiert und auf Rinderkapillar-Endothelzellen appliziert, welche durch 1 ng/ml basischen Fibroblastenwachstumsfaktor in einem 72 Stunden Test stimuliert worden waren. Das Protein, das aus jeder der drei Banden extrahiert wurde, inhibierte die Kapillar-Endothelzellen.
Beispiel 17
Plasminogen-Fragment-Behandlungsstudien
Mäusen wurden Lewis-Lungencarzinome implantiert und einer Resektion unterzogen, sobald die Tumore 1.500-2.000 mm³ groß waren. Am Tag der Operation wurden die Mäuse zufallsgemäß in 6 Gruppen von jeweils 6 Mäusen aufgeteilt. Die Mäuse erhielten täglich intraperitoneale Injektionen mit den drei gereinigten inhibitorischen Fragmenten des menschlichen Plasminogens, mit gesamtem menschlichen Plasminogen, mit Urin von Tumor-tragenden Mäusen, Urin normaler Mäuse oder Salzlösung. Eine Gruppe der Tumor-tragenden Tiere, die nur ein Scheinverfahren durchlief, wurde mit Salzinjektionen behandelt. Direkt nach der Entfernung des Primärtumors erhalten die Mäuse eine intraperitoneale Injektion von 24 μg (1,2 mg/kg/Tag/Maus) der inhibitorischen Plasminogenfragmente als Beladungsdosis. Dann erhalten sie für die Dauer des Experiments tägliche intraperitoneale Injektionen von 12 μg des inhibitorischen Fragments (0,6 mg/kg/Tag/Maus). Kontrollmäuse erhielten die gleiche Dosis des Gesamtplasminogen-Moleküls nach der Tumorentfernung. Bei den Urinbehandlungen wird der Urin der normalen oder Tumor-tragenden Mäuse filtriert, intensiv dialysiert, lyophilisiert und dann in sterilem Wasser resuspendiert, um eine 250-fache Konzentration zu erhalten. Den Mäusen wurden entweder aus Tumor-tragenden Mäusen oder aus normalen Mäusen in zwei intraperitonealen Injektionen am Tag der Entfernung des Primärtumors als Beladungsdosis 0,8 ml des dialysierten Urinkonzentrats gegeben. Sie erhielten dann für den Ablauf des Experiments tägliche intraperitoneale Injektionen von 0,4 ml des dialysierten und konzentrierten Urins. Die Behandlungen wurden für 13 Tage fortgesetzt, welches der Zeitpunkt war, an dem alle Mäuse geopfert wurden und autopsiert wurden.
Die Ergebnisse der Experimente werden in den 8 und 9 gezeigt. 8 zeigt die oberflächlichen Lungenmetastasen nach der 13-tägigen Behandlung. Die Oberflächen-Lungenmetastasen beziehen sich auf die Anzahl an Metastasen, die in den Lungen der Mäuse bei der Autopsie gesehen werden. Ein Stereomikroskop wurde verwendet, um die Metastasen zu zählen. 8 zeigt die durchschnittliche Anzahl an Oberflächen-Lungenmetastasen, die gezählt wurden sowie die Standardabweichung. Wie gezeigt ist, wies die Mausgruppe mit dem Primärtumor keine Metastasen auf. Die Mäuse, bei denen der Primärtumor resektioniert wurde und die mit Salzlösung behandelt wurden, zeigten ausgedehnte Metastasen. Die Mäuse, die mit dem vom Menschen stammenden Plasminogenfragment behandelt wurden, zeigten keine Metastasen. Die Mäuse, die mit dem gesamten Plasminogen behandelt wurden, zeigten ausgedehnte Metastasen, was andeutet, dass das gesamte Plasminogenmolekül keine Endothel-inhibitorische Wirkung besitzt. Mäuse, die mit dialysiertem und konzentriertem Urin von Tumor-tragenden Mäusen behandelt wurden, zeigten keine Metastasen. Mäuse, die mit dem konzentrierten Urin normaler Mäuse behandelt wurden, zeigten auffällige Metastasen. Wenn das Lungengewicht gemessen wurde, wurden ähnliche Ergebnisse erzielt (9).
Beispiel 18
Aminosäuresequenz des Angiostatins der Maus und des Menschen
Die Aminosäuresequenz von Angiostatin, welches aus dem Mausurin isoliert wurde und Angiostatin, das aus dem menschlichen Lysin-Bindungsstellen 1-Fragment-Präparat isoliert wurde, wurden auf einem Applied Biosystem Model 477A Protein-Sequenziergerät bestimmt. Phenylthiohydantoinaminosäurefraktionen wurden mit einem online-ABI-Modell 120A HPCL identifiziert. Die Aminosäuresequenz, welche von der N-terminalen Sequenz und den Trypsin-Verdaus des Maus- und Menschen-Angiostatins bestimmt wurde, zeigt an, dass die Sequenz des Angiostatins ähnlich der Sequenz ist, die an der Aminosäure Nr. 98 des Maus-Plasminogens beginnt. Das bedeutet, dass die Aminosäuresequenz des Angiostatins ein Molekül ist, das ein Protein mit einem Molekulargewicht von zwischen ungefähr 38 Kilodalton und 45 Kilodalton umfasst, wie durch reduzierende Polyacrylamidgel-Electrophorese bestimmt wurde und einer Aminosäuresequenz besitzt, die im Wesentlichen ähnlich der des Maus-Plasminogenfragments ist, das an der Aminosäure Nr. 98 des intakten Maus-Plasminogenmoleküls beginnt. Die Anfangs-Aminosäuresequenz des Maus-Angiostatin (SEQ ID Nr. 2) ist in 1 gezeigt. Die Länge der Aminosäuresequenz kann etwas länger oder kürzer sein als die, die in 1 gezeigt ist.
Die N-terminale Aminosäureanalyse und die Trypsinverdaus der aktiven Fraktion der menschlichen Lysin-Bindungsstelle 1 (siehe Beispiel 15) zeigt, dass die Sequenz der Fraktion ungefähr an der Aminosäure 97 oder 99 des menschlichen Plasminogens beginnt, und dass das menschliche Angiostatin homolog zum Maus-Angiostatin ist. Die Anfangs-Aminosäuresequenz des menschlichen Angiostatins (beginnend an Aminosäure 98) ist in 2 gezeigt (SEQ ID Nr. 3). Die Aminosäuresequenz des Angiostatins der Maus und des Menschen ist in 2 mit entsprechenden internen Aminosäuresequenzen des Plasminogens anderer Spezies, einschließlich des Schweins-, des Rinds- und des Resusaffen-Plasminogens verglichen, was das Vorhandensein von Angiostatin in diesen Spezies anzeigt.
Beispiel 19
Expression von menschlichem Angiostatin in E. coli.
Der pTrcHisA-Vektor (Invitrogen) (10) wurde verwendet, um eine regulierte Transkription auf hohem Niveau, ausgehend vom trc-Promotor für die verstärkte Translationseffizienz, eukaryontischer Gene in E. coli zu erzielen. Angiostatin wird exprimiert und an einen N-terminalen Nickel-bindenden Histidinschwanz für die Reinigung in einem Schritt unter Verwen dung von Metall-Affinitätsharzen fusioniert. Die Enterokinase-Spaltungs-Erkennungsstelle in dem Fusionspeptid erlaubt die anschließende Entfernung des N-terminalen Histidin-Fudionspeptids vom gereinigten rekombinanten Protein. Das rekombinante menschliche Angiostatin-Protein band an Lysin; es ist kreuzreaktiv mit monoklonalen Antikörpern, die für die Kringel-Region 1, 2 und 3 spezifisch sind, und inhibiert die bFGF-gesteuerte Endothelzellproliferation in vitro.
Um das zu inserierende Stück zu konstruieren, wird das Genfragment, welches menschliches Angiostatin kodiert, aus einer menschlichen Leber-mRNA gewonnen, die umgekehrt transkribiert wird und unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und spezifischer Primer amplifiziert wird. Das Produkt von 1.131 Basenpaaren kodiert Aminosäuren 93 bis 470 des menschlichen Plasminogens. Das amplifizierte Fragment wurde in die XhoI/KpnI-Schnittstelle des pTrcHisA kloniert und das erhaltene Konstrukt in XL-1B (erhältlich von Stratagene) E. coli Wirtszellen transformiert. Ein Kontrollklon, der den Plasmidvektor pTrcHisA alleine enthält, wurde ebenfalls in XL-1B E. coli Wirtszellen transformiert. Dieser Klon wird als Vektor-Kontrollklon bezeichnet. Beide Klone wurden wie unten beschrieben identisch aufgereinigt.
Exprimierende Kolonien wurden in folgender Weise ausgewählt. Kolonienabdrücke von E. coli, die mit dem Gen transformiert sind, welches Angiostatin kodiert, wurden auf IPTG-imprägnierte Nitrozellulosefiltern gezüchtet und auf eine LB-Agarplatte gelegt. Nach der IPTG-Induktion der Expression wurden Kolonien auf Nitrozellulosefiltern lysiert. Die Nitrozelluloseabzüge wurden blockiert, gespült und mit zwei getrennten monoklonalen Antikörpern (mAbs Dcd und Vap; Geschenk von S. G. McCance und F. J. Castellino, University of Notre Dame) getestet, welche spezifische Konformationen von Angiostatin erkennen. Stark exprimierende Kolonien, die durch diese mAbs erkannt wurden, wurden ausgewählt.
Um die optimale Dauer der maximalen Expression zu erkennen, wurden Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach der IPTG-Induktion eingesammelt und wiederholten Einfrier-Auftauzyklen ausgesetzt, gefolgt von einer Analyse mittels SDS-PAGE, Immun-Blotting und dem Untersuchen mit den mAbs Dcd und Vap.
Hiervon wurde der Klon pTrcHisA/HAsH4 ausgewählt. Die Induktion mit IPTG betrug 4 Stunden, worauf das Zellpellet eingesammelt wurde und in 50 mM Tris pH 8,0, 2 mM EDTA, 5 % Glycerol und 200 mg/ml Lysozym resuspendiert wurde und für 30 min. bei 4°C gerührt wurde. Die Aufschlem mung wurde zentrifugiert bei 14.000 Upm für 25 min. und das Pellet wurde in 50 mM Tris pH 8,0, 2 mM EDTA, 5 % Glycerol und 0,1 % DOC resuspendiert. Diese Suspension wurde für 1 h bei 4°C gerührt und dann bei 14.000 Upm für 25 min. zentrifugiert. Die Überstandsfraktion aus diesem Schritt enthält exprimiertes Angiostatin. Das durch E. coli exprimierte menschliche Angiostatin besitzt die physiologische Eigenschaft nativen Angiostatins, d. h. die Fähigkeit, Lysin zu binden. Das durch E. coli exprimierte Angiostatin wurde daher in einem Einzelschritt über eine Lysin-Sepharose (Pharmacia oder Sigma)-Säule gereinigt. Die Eluierung von Angiostatin von der Säule wurde mit 0,2 M Epsilon-Amino-n-caprylsäure pH 7,5 durchgeführt.
Nach diesen Experimenten wurde eine Aufstockung in 10 l Fermentierungsbachtes des Klons pTrcHisA/HAsH4 durchgeführt. Die Zellen, die aus dieser aufgestockten Induktion erhalten wurden, wurden pellettiert und in 50 mM Tris pH 7,5 resuspendiert, bei 10.000 psi unter Kühlung bei 10°C zwischen den Durchläufen aufgebrochen. Das erhaltene Lysat wurde durch Zentrifugieren bei 10.000 Upm für 30 min. bei 4°C geklärt und das exprimierte Angiostatin wurde über eine Lysin-Sepharose (11) isoliert.
Gereinigtes von E. coli exprimiertes menschliches Angiostatin wurde ausgiebig gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert. Das exprimierte menschliche Angiostatin wurde in Medium (DMEM, 5 % BCS, 1 % Gentamycin/Pennicillin/Streptomycin) bis auf eine abgeschätzte Konzentration von 3 μg/ml resuspendiert, und in dem Rinderkapillar-Endothel (BCE)-Zelltest in vitro verwendet, der in Beispiel 8, Seite 39, beschrieben ist. Gleichermaßen wurde der Kontrollklon, der den Vektor alleine enthält, in gleicher Weise wie der Klon pTrcHisA/HAsH4 behandelt. Dieser wurde mit IPTG in identischer Weise induziert und das bakterielle Lysat wurde verwendet, um Lysin zu binden, mit 0,2 M Aminocaprylsäure eluiert, ausgiebig dialysiert und lyophilisiert. Dieses Kontrollpräparat wurde ebenfalls in Medium auf eine geschätzte Konzentration von 3 μg/ml resuspendiert. Die Proben des rekombinanten Angiostatins und der Kontrollen wurden aus verschiedenen Induktions- und Fermentierungsbatches wie auch getrennten Reinigungsläufen gewonnen, und sie wurden alle bei EntreMed, Maryland, kodiert. BCE-Tests wurden mit diesen kodierten Proben in geblindeter Weise beim Children's Hospital, Boston, durchgeführt.
Die Ergebnisse des BCE-Tests mit rekombinantem menschlichem Angiostatin zeigten, dass menschliches Angiostatin, das in E. coli exprimiert wurde, die Proliferation von BCE-Zellen durch bFGF (verwendet zu 1 ng/ml) (12) inhibierte. Der rekombinante Angiostatin-Bestand in Me dium (bei ungefähr 3 μg/ml) wurde zu 1:5, 1:10 und 1:20 Verdünnungen verwendet. Die prozentuale Inhibierung wurde wie folgt berechnet:
Die prozentuale Inhibierung der BCE-Zellproliferation war vergleichbar oder höher als die von Plasminogen, welches von Angiostatin, das von Plasminogen stammt, bei ähnlichen Konzentrationen. Die Ergebnisse eines wiederholten Laufes des BCE-Tests sind in 13 wiedergegeben, wobei eine 1:5 Verdünnung des Bestands des rekombinanten Angiostatins ähnliche prozentuale Inhibierungen wie die ergab, die mit Angiostatin, das aus Plasminogen stammt, gewonnen wurde. 13 zeigt das überraschende Ergebnis, dass menschliches rekombinantes Angiostatin-Protein über 60 % inhibiert und bis zu 75 % der BCE-Proliferation in Kultur.
Beispiel 20
Angiostatin bewahrt den Ruhezustand von Mikrometastasen durch Erhöhung der Apoptoserate.
Nach der subkutanen Inokulation von Lewis-Lungencarzinomzellen (1 × 10⁶) in C57 BL6/J-Mäuse, entwickelten sich Primärtumore von ungefähr 1,5 cm³. Die Tiere wurden entweder einer chirurgischen Entfernung des Primärtumors unterzogen oder eine Scheinoperation. Nach den Tagen 5, 10 und 15 nach dem chirurgischen Eingriff wurden die Tiere geopfert und ihre Lungen wurden für eine histologische Untersuchung präpariert. Die Tiere mit herausoperierten Primärtumoren zeigten eine massive Proliferation der Mikrometastasen verglichen mit scheinoperierten Kontrollen (14). Diese Änderungen waren durch einen signifikanten Anstieg des Lungengewichts begleitet.
Analysen der Tumorzellproliferation, wie durch die Aufnahme der Bromdeoxyuridin (BrdU) gemessen wurde, zeigten keine Unterschiede zwischen den Tieren mit intakten Primärtumoren oder resektionierten Tumoren an den Tagen 5, 9 und 13, was darauf hinweist, dass der Anstieg der Tumormasse nicht durch eine erhöhte Proliferation erklärt werden kann (15). Demgemäß wurde Zelltod in diesen Tieren untersucht. Apoptose, ein Prozess des Zelltods, der unabhängig von Änderungen der Genexpression ist und für die Eliminierung von Zellen während der Entwicklung und in schnell proliferierenden Geweben verantwortlich ist, wie beispielsweise dem Dünndarm, wurde durch immunhistochemisch markierte fragmentierte DNA mit Hilfe der terminalen Deoxinucleotidyltransferase (TdT)-Technik untersucht. Der Apoptoseindex wurde zu jedem Zeitpunkt des Opfers bestimmt. Die Entfernung der Primärtumore verursachte einen statistisch signifikanten Anstieg (ungefähr 3- bis 4-fach) des Apoptoseindexes zu allen untersuchten Zeiten (15).
Unterstützende Hinweise wurden mit einem exogenen Suppressor der Angiogenesedurch Behandlung von Mäusen gewonnen, denen die Primärtumore entfernt worden waren. Diese Substanz, TNP-1470
(O-Chloracetylcarboamoylfumagillol, zuvor bezeichnet als AGM-1470) ist ein Analogon von Fumagillin mit beschriebener anti-angiogener Wirkung. Die subkutane Injektion von TNP-1470 (30 mg/kg alle zwei Tage) rief Ergebnisse hervor, die auffallend ähnlich denen waren, die oben bei Tieren beschrieben wurden, die intakte Primärtumoren hatten. Diese Tiere wiesen, verglichen mit Kontrollen, in die Salzlösung injiziert wurde, ein niedrigeres Lungengewicht auf, einen äquivalenten Proliferationsindex und einen erhöhten Apoptoseindex (16).
Diese Daten zeigen an, dass Metastasen im Ruhezustand bleiben, wenn die Tumorzellproliferation durch eine äquivalente Rate an Zelltod ausgeglichen wird. Die Entfernung des Primärtumors verursacht einen schnellen Anstieg des Wachstums der Metastasen, wahrscheinlich aufgrund der Entfernung von Angiogenese-Inhibitoren (Angiostatin), welche das metastatische Wachstum durch Erhöhung der Apoptose in Tumorzellen kontrollieren. Diese Wirkungen sind ähnlich denen, die nach der Entfernung der Primärtumore und der Verabreichung eines exogenen Inhibitors der Angiogenese gesehen werden. Zusammengefasst lassen diese Daten vermuten, dass der Primärtumor Angiostatin freisetzt, welcher den Ruhezustand der Mikrometastasen aufrecht erhält.
Beispiel 21
Behandlung von Primärtumoren mit Angiostatin in vivo.
Angiostatin wurde aus menschlichem Plasminogen mit einem beschränkten Elastaseverdau, wie in Beispiel 15 oben beschrieben, gereinigt. Angiostatin wurde für die Verabreichung an 6 Wochen alte männliche C57BI6/J-Mäuse in Phosphat-gepufferte Salzlösung resuspendiert. Den Tieren wurden subkutan 1 × 10⁶ Tumorzellen entweder des Lewis-Lungencarzinoms oder des T241-Fibrosarcoms implantiert. Die Behandlung mit Angiostatin wurde nach 4 Tagen begonnen, sobald die Tumore 80-160 mm³ Größe hatten. Die Mäuse erhielten entweder als Einzelinjektion zu 40 mg/kg oder zwei 80 mg/kg Injektionen über intraperitoneale (ip) oder subkutane (sc) Wege Angiosta tin-Injektionen. Die Tiere wurden zu zahlreichen Zeitpunkten bis zu 19 Tage nach der Behandlung geopfert.
Angiostatin, das in einer täglichen Dosis von 40 mg/kg ip verabreicht wurde, rief eine hoch signifikante Inhibierung des Wachstums von T241 Primärtumoren hervor (17). Diese inhibitorische Wirkung auf das Wachstum war offensichtlich innerhalb von 2 Tagen sichtbar und stieg in der Größe über den zeitlichen Verlauf der Studie an. Am Tag 18 hatten die Angiostatin-behandelten Mäuse Tumore, die ungefähr 38 % des Volumens der Salz-injizierten Kontrollen betrugen. Dieser Unterschied war statistisch signifikant (p < 0,001, Studentscher t-Test).
Angiostatin-Behandlung (Gesamtdosis 80 mg/kg/Tag, verabreicht zweimal täglich zu 40 mg/kg ip oder sc) reduzierte ebenfalls signifikant die Wachstumsrate der LLC-LM Primärtumore (17). Diese inhibitorische Wirkung war nach 4 Tagen offenkundig und stieg in der Größenordnung an allen anschließenden Zeitpunkten der Untersuchung an. Am letzten Tag des Experiments (Tag 19) haben die Angiostatin-behandelten Mäuse ein mittleres Tumorvolumen, das nur 20 % der Salz-injizierten Kontrollen hatte, was signifikant verschieden war (p < 0,001, Studentscher t-Test).
In einer weiteren Reihe von Experimenten wurde Angiostatin (50 mg/kg q12h) an Mäuse verabreicht, in die T241-Fibrosarcom, Lewis-Lungencarzinom (LM) oder Reticulum-Sarcomzellen transplantiert wurden. Bei jedem Tumorzelltyp hatten die Mäuse, die Angiostatin erhielten, eine wesentlich geringere Tumorgröße. 19 zeigt, dass beim T241-Fibrosarcom die Angiostatin-behandelten Mäuse ein mittleres Tumorvolumen hatten, das nur 15 % der unbehandelten Mäuse am Tag 24 entsprach. 20 zeigt, dass beim Lewis-Lungencarzinom (LM) die Angiostatin-behandelten Mäuse ein mittleres Tumorvulumen hatten, das nur 13 % der unbehandelten Mäuse am Tag 24 entsprach. 21 zeigt, dass beim Reticulumsarcom die Angiostatin-behandelten Mäuse ein mittleres Tumorvolumen hatten, das nur 19 % der unbehandelten Mäuse am Tag 24 entsprach. Die Daten stellen den Durchschnittswert von 4 Mäusen zu jedem Zeitpunkt dar.
Die Ergebnisse zeigen, dass Angiostatin ein extrem wirksamer Inhibitor des Wachstums von 3 verschiedenen Primärtumoren in vivo ist.
Beispiel 22
Behandlung von aus menschlichen Zellen stammenden Primärtumoren in Mäusen mit Angiostatin in vivo.
Die Wirkung von Angiostatin auf zwei menschliche Tumorzelllinien, das menschliche Prostatacarzinom PC-3 und das menschliche Brustcarzinom MDA-MB wurden untersucht. Immun-defizienten SCID-Mäusen wurden menschliche Tumorzellen implantiert und die Mäuse wurden mit 50 mg/kg Angiostatin über alle 12 Stunden im Wesentlichen wie in Beispiel 21 beschrieben behandelt. Die Ergebnisse zeigen, dass das Angiostatin-Protein der vorliegenden Erfindung ein wirksamer Inhibitor des Zellwachstums menschlicher Tumoren ist. 22 zeigt, dass die Angiostatin-behandelten Mäuse beim menschlichen Prostatacarzinom PC-3 nur 2 % des mittleren Tumorvolumens verglichen mit den unbehandelten Kontrollmäusen am Tag 24 hatten. 23 zeigt, dass die Angiostatin-behandelten Mäuse nur 8 % des mittleren Tumorvolumens verglichen mit den nicht behandelten Kontrollmäusen am Tag 24 beim menschlichen Brustcarzinom MDA-MB hatten.
Beispiel 23
Gentherapie – Effekt der Transfektion des Angiostatin-Gens auf das Tumorvolumen.
Eine 1380 DNA-Sequenz für Angiostatin, das aus Maus-Plasminogen-cDNA stammt (erhalten von der American Type Culture Collection (ATCC)), welches für die Maus-Plasminogen-Aminosäuren 1-460 kodiert, wurde mit Hilfe der PCR generiert und in einen Expressionsvektor inseriert. Der Expressionsvektor wurde in T241-Fibrosarcomzellen transfiziert und die transfizierten Zellen wurden in Mäuse implantiert. Die Kontrollmäuse erhielten entweder nicht-transfizierte T241-Zellen oder T241-Zellen, in die nur der Vektor transfiziert wurde (d. h. nicht Angiostatin-exprimierende transfizierte Zellen). Drei Angiostatin-exprimierende transfizierte Zellklone wurden in dem Experiment verwendet. Das mittlere Tumorvolumen über die Zeit wurde ermittelt. Die Ergebnisse zeigen die überraschenden und dramatischen Reduzierungen des mittleren Tumorvolumens in Mäusen bei Angiostatin-exprimierenden Zellklonen, verglichen mit den nicht-transfizierten und nicht-exprimierenden Kontrollzellen.
Die Maus-DNA-Sequenz, die für Maus-Angiostatin-Protein kodiert, stammt aus der Maus-Plasminogen-cDNA. Das Maus-Angiostatin umfasst Maus-Plasminogen-Kringel-Region 1-4. Das Schema für die Herstellung dieses Klons ist in 24 gezeigt.
Die Maus-Angiostatin-Protein-Klone wurde in T241-Fibrosarcomzellen unter Verwendung von LIPOFECTIN^TM-Transfektionssystem (erhältlich von Life Technologies, Gaithersburg, MD) transfiziert. Das LIPOFECTIN^TM-Reagens ist eine 1:1 (w/w) Liposomenformulierung des cationischen Lipids N-[-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-n,n,n-trimethylammoniumchlorid (DOTMA) und Diolecoylphosphotidylethanolamin (DOPE) in Membran-gefiltertem Wasser.
Das Verfahren für die transiente Transfektion von Zellen ist wie folgt:

1. T241-Zellen werden in 60 cm² Gewebekulturschalen, ausgesät zu ungefähr 1-2 × 10⁵ Zellen in 2 ml des geeigneten Wachstumsmediums supplementiert mit Serum, gezüchtet.
2. Inkubation der Zellen bei 37°C in einem CO₂-Inkubator, bis die Zellen 40-70 % konfluent sind. Das dauert ungefähr 18-24 h, aber die Zeit variiert abhängig vom Zelltyp. Die T241-Tumorzellenkonfluenz betrug ungefähr 70 %.
3. Vorbereitung der folgenden Lösungen in 12 × 75 mm sterilen Röhrchen: Lösung A: für jede Transfektion 5 μg DNA in 100 μl Serum-freiem OPTI-MEM I reduziertem Serum Medium (erhältlich von Life Technologies) (dionisiertes Wasser mit Gewebekulturgrad kann ebenfalls verwendet werden) verdünnen. Lösung B: für jede Transfektion 30 μg Lipofectamin in 100 μl OPTI-MEM Medium verdünnen.
4. Zusammengeben der zwei Lösungen, vorsichtig mischen und inkubieren bei Raumtemperatur für 10-15 min.
5. Zellen zweimal mit Serum-freiem Medium waschen.
6. Für jede Transfektion 0,8 ml Serum-freies Medium zu jedem Röhrchen enthaltend die LIPOFECTIN^TM-Reagens-DNA-Komplexe zugeben. Vorsichtig mischen und den Komplex auf die Zellen schichten.
7. Inkubieren der Zellen für ungefähr 12 h bei 37°C in einem CO₂-Inkubator.
8. Ersetzen des DNA-haltigen Mediums durch 1 mg/ml Selektionsmedium enthaltend Serum und inkubieren der Zellen bei 37°C in einem CO₂-Inkubator für insgesamt 48-72 h.
9. Untersuchung von Zellextrakten auf die Genaktivität bei 48-72 h nach der Transfektion.

Transfizierte Zellen können auf die Expression des Angiostatin-Proteins unter Verwendung von Angiostatin-spezifischen Antikörpern untersucht werden. Alternativ dazu traten ungefähr 10-14 Tage danach G418-resistente Kolonien in dem CMV-Angiostatin-transfizierten T241-Zellen auf. Es wurde auch eine Anzahl an Klonen in den mit dem Vektor allein transfizierten Klonen gesehen, aber nicht in den nicht-transfizierten Klonen. Die G418-resistenten Klone wurden selektiert bezüglich der Expression von Agiostatin, indem ein Immunfluoreszenz-Verfahren verwendet wurde.
Interessanterweise wurde das in vitro-Zellwachstum von T241-Zellen und Lewis-Lungenzellen, die mit Angiostatin transfiziert wurden, nicht inhibiert oder sonst nachteilig beeinflusst, wie in den 25 und 26 gezeigt wird.
27 stellt die Ergebnisse des Transfektionsexperiments dar. Alle drei der Angiostatin-exprimierenden T241-transfizierten Klone produzierten mittlere Tumorvolumina in Mäusen, die im Wesentlichen relativ zum Tumorvolumen in Kontrollmäusen reduziert waren. Das mittlere Tumorvolumen der Mäuse, in die der Klon 37 implantiert wurde, betrug nur 13 % der Kontrolle, während der Klon 31 und der Klon 25 Tumorvolumina von nur 21 % und 34 % der Kontrolltumorvolumina ergab. Diese Ergebnisse zeigen, dass die DNA-Sequenzen, die für Angiostatin kodieren, in Zellen transfiziert werden können, dass die transfizierten DNA-Sequenzen in der Lage sind, Angiostatin-Protein in den implantierten Zellen zu exprimieren, und dass das exprimierte Angiostatin in vivo so funktioniert, dass das Tumorwachstum reduziert ist.
Beispiel 24
Lokalisierung der Angiostatin-Expression in vivo.
Um die Expressionsstelle des Angiostatin-Proteins in vivo zu lokalisieren, wurde gesamte RNA aus verschiedenen Zelltypen, Lewis-Lungencarzinomzellen (Maus), T241-Fibrosarcom (Maus), und Burkitt Lymphomzellen (Mensch) sowohl aus frischen Tumoren oder Zellkulturen nach mehreren Passagen analysiert, um das Vorhandensein von Angiostatin-Transkripten zu bestimmen. Eine Northern-Analyse der Proben zeigte die Abwesenheit jeglichen Signals, was mit der Sequenz aus allen Proben hybridisierte, außer in der normalen Mausleber-RNA, welche ein einzelnes Signal von ungefähr 2,4 kb ergab, welches Maus-Plasminogen entspricht. Die Northern-Analyse der menschlichen Proben zeigte die Abwesenheit jedes Signals, das mit der menschlichen Angiostatin-Sequenz hybridisierte, bei allen Proben, außer der normalen menschlichen Leber-RNA, welche ein einzelnes Signal bei ungefähr 2,4 kb zeigte, was dem menschlichen Plasminogen entspricht.
Eine Reverse Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)-Analyse zeigte die Abwesenheit jedes Produkts in allen Proben, die mit Maus-Angiostatin-Sequenzen untersucht wurden, außer in der normalen Mausleber. Eine RT-PCR-Analyse zeigte die Abwesenheit jedes Produkts in menschlichen Proben, die mit menschlichen Angiostatin-Sequenzen untersucht wurden, außer in der normalen menschlichen Leber (erwartete Größe von 1.050 bp bei der Maus und 1.134 bp beim Menschen).
Daher scheint es, dass Maus-Angiostatin-Transkripte (unter der Annahme der Identität mit den Aminosäuren 97 bis 450 des Maus-Plasminogens) durch alle oben erwähnten Mauseroben nicht hergestellt werden, und dass menschliche Angiostatin-Transkripte (unter der Vermutung einer Identität mit den Aminosäuren 93 bis 470 des menschlichen Plasminogens) nicht in den oben erwähnten menschlichen Proben produziert werden. Die positiven Signale, die in normaler Maus-/Menschenleber gewonnen wurden, stammen aus der Hybridisierung mit Plasminogen.
Beispiel 25
Expression von Angiostatin in Hefe.
Das Genfragment, das die Aminosäuren 93 bis 470 des menschlichen Plasminogens kodiert, wurde in die XhoI/EcoRI-Stelle des PHIL-SI (Invitrogen) kloniert, welcher die sezernierte Expression von Proteinen unter Verwendung des PHO1-Sekretionssignal in der Hefe Pichia pastoris erlaubt. Gleichermaßen wurde das Genfragment, das die Aminosäuren 93 bis 470 des menschlichen Plasminogens kodiert, in die SnaBI/EcoRI-Schnittstelle von pPIC9 (Invitrogen) kloniert, was die sezernierte Expression von Proteinen unter Verwendung des α-Faktor Sekretionssignals in der Hefe Pichia pastoris erlaubt. Die exprimierten menschlichen Angiostatin-Proteine in diesen Systemen haben viele Vorteile gegenüber solchen, die in E. coli exprimiert werden, wie beispielsweise die Proteinprozessierung, die Proteinfaltung und die posttranslationale Modifizierung, einschließlich der Glycosylierung.
Die Expression des Gens in P. pastoris, ist beschrieben in (Sreekrishna, K. et al. (1988) High level expression of heterologous Proteins in methylotropic xeast Pichia pastoris. J. Basic Microbiol. 29 (4): 265-278, und Clare, J. J. et al., (1991) Production of epidermal growth factor in yeast: High-level secretion using Pichia pastoris strains containing multiple gene copies, Gene 105: 205-212.
Beispiel 26
Expression von Angiostatin-Proteinen in transgenen Tieren und Pflanzen.
Transgene Tiere, wie die Familie der Rinder oder Schweine, werden hergestellt, die das Angiostatin-Gentranskript exprimieren. Das transgene Tier exprimiert Angiostatin-Protein beispielsweise in der Milch dieser Tiere. Zusätzlich werden essbare transgene Pflanzen, die das Angiostatin-Gentranskript exprimieren, hergestellt.
Die Konstruktion transgener Tiere, die fremde DNA exprimieren, ist beschrieben in Smith H. Phytochrome transgenics: functional, ecological and biotechnical applications, Semin. Cell. Biol. 1994 5 (5): 315-325, welches durch Bezugnahme hier eingeschlossen ist.
Beispiel 27
Charakterisierung der die Endothelzell-Proliferation inhibierenden Angiostatin-Fragmente
Das folgende Beispiel charakterisiert die Aktivität einzelner und kombinierter Angiostatin-Fragmente. Die Daten legen nahe, dass ein funktionaler Unterschied zwischen den einzelnen Kringel-Strukturen vorhanden ist, und dass starke anti-endotheliale, und daher anti-angiogene Aktivität durch solche Proteinfragmente von Angiostatin erreicht werden kann.
So wie es hier verwendet wird, bedeutet „Angiostatin-Fragment" ein Protein-Derivat von Angiostatin, oder von Plasminogen, mit einer die Endothelzell-Proliferation inhibierenden Wirkung. Angiostatin-Fragmente sind nützlich zur Behandlung von Angingen-vermittelten Erkrankungen oder Bedingungen. Beispielsweise können Angiostatin-Fragmente verwendet werden, um das Tumorwachstum zu unterdrücken oder zu inhibieren. Die Aminosäuresequenz eines solchen Angiostatin-Fragments kann beispielsweise von einem Teil des Maus-Plasminogens (SEQ ID Nr. 1), des Maus-Angiostatins (SEQ ID Nr. 2); des menschlichen Angiostatins (SEQ ID Nr. 3), des Rhesusaffen-Angiostatins (SEQ ID Nr. 4), des Schweine-Angiostatins (SEQ ID Nr. 5) und des Rinder-Angiostatins (SEQ ID Nr. 6) ausgewählt werden, sofern es nicht in dem Zusammenhang, in dem es verwendet wird, anders indiziert ist.
So wie es hier verwendet wird, bedeutet „Kringel 1" ein Protein-Derivat des Plasminogens mit einer Endothelzell-inhibierenden Wirkung oder anti-angiogenen Wirkung, und mit einer Aminosäuresequenz, die eine Sequenz umfasst, die homolog zu Kringel 1 ist, beispielhaft dargegeben, aber nicht beschränkt auf die Maus-Kringel 1 (SEQ ID Nr. 7), menschliche Kringel 1 (SEQ ID Nr. 8), Rhesus-Kringel 1 (SEQ ID Nr. 9), Schwein-Kringel 1 (SEQ ID Nr. 10) und Rind-Kringel 1 (SEQ ID Nr. 11), sofern es nicht anders im Kontext, in dem es verwendet wird, angegeben ist. Maus-Kringel 1 (SEQ ID Nr. 7) entspricht den Aminosäurepositionen 103 bis 181 (inklusive) des Maus-Plasminogens in SEQ ID Nr. 1 und entspricht den Aminosäurepositionen 6 bis 84 (inklusive) des Maus-Angiostatins in SEQ ID Nr. 2. Mensch-Kringel 1 (SEQ ID Nr. 8), Rhesus-Kringel 1 (SEQ ID Nr. 9), Schwein-Kringel 1 (SEQ ID Nr. 10) und Rind-Kringel 1 (SEQ ID Nr. 11) entsprechen den Aminosäurepositionen 6 bis 84 (inklusive) des Angiostatins in SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 bzw. SEQ ID Nr. 6.
So wie es hier verwendet wird, bedeutet „Kringel 2" ein Protein-Derivat des Plasminogens mit einer Endothelzell-inhibierenden Wirkung oder anti-angiogenen Wirkung, und mit einer Aminosäuresequenz, die eine Sequenz umfasst, die homolog zu Kringel 2 ist, beispielhaft dargegeben, aber nicht beschränkt auf die Maus-Kringel 2 (SEQ ID Nr. 12), menschliche Kringel 2 (SEQ ID Nr. 13), Rhesus-Kringel 2 (SEQ ID Nr. 14), Schwein-Kringel 2 (SEQ ID Nr. 15) und Rind-Kringel 2 (SEQ ID Nr. 16), sofern es nicht anders im Kontext, in dem es verwendet wird, angegeben ist. Maus-Kringel 2 (SEQ ID Nr. 12) entspricht den Aminosäurepositionen 185 bis 262 (inklusive) des Maus-Plasminogens in SEQ ID Nr. 1 und entspricht den Aminosäurepositionen 88 bis 165 (inklusive) des Maus-Angiostatins in SEQ ID Nr. 2. Mensch-Kringel 2 (SEQ ID Nr. 13), Rhesus-Kringel 2 (SEQ ID Nr. 14), Schwein-Kringel 2 (SEQ ID Nr. 15) und Rind-Kringel 2 (SEQ ID Nr. 16) entsprechen den Aminosäurepositionen 88 bis 165 (inklusive) des Angiostatins in SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 bzw. SEQ ID Nr. 6.
So wie es hier verwendet wird, bedeutet „Kringel 3" ein Protein-Derivat des Plasminogens mit einer Endothelzell-inhibierenden Wirkung oder anti-angiogenen Wirkung, und mit einer Aminosäuresequenz, die eine Sequenz umfasst, die homolog zu Kringel 3 ist, beispielhaft dargegeben, aber nicht beschränkt auf die Maus-Kringel 3 (SEQ ID Nr. 17), menschliche Kringel 3 (SEQ ID Nr. 18), Rhesus-Kringel 3 (SEQ ID Nr. 19), Schwein-Kringel 3 (SEQ ID Nr. 20) und Rind-Kringel 3 (SEQ ID Nr. 21), sofern es nicht anders im Kontext, in dem es verwendet wird, angegeben ist. Maus-Kringel 3 (SEQ ID Nr. 17) entspricht den Aminosäurepositionen 275 bis 352 (inklusive) des Maus-Plasminogens in SEQ ID Nr. 1 und entspricht den Aminosäurepositionen 178 bis 255 (inklusive) des Maus-Angiostatins in SEQ ID Nr. 2. Mensch-Kringel 3 (SEQ ID Nr. 18), Rhesus-Kringel 3 (SEQ ID Nr. 19), Schwein-Kringel 3 (SEQ ID Nr. 20) und Rind-Kringel 3 (SEQ ID Nr. 21) entsprechen den Aminosäurepositionen 178 bis 255 (inklusive) des Angiostatins in SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 bzw. SEQ ID Nr. 6.
So wie es hier verwendet wird, bedeutet „Kringel 4" ein Protein-Derivat von Plasminogen mit einer Endothelzell-inhibierenden Wirkung oder anti-angiogenen Wirkung und mit einer Aminosäuresequenz, die eine Sequenz umfasst, die homolog zu Kringel 4 ist, beispielhaft dargestellt, aber nicht beschränkt auf die der Maus-Kringel 4, (SEQ ID Nr. 22) und menschlichem Kringel 4 (SEQ ID Nr. 23), soweit es nicht im Zusammenhang, in dem es verwendet wird, anders angegeben ist. Maus-Kringel 4 entspricht (SEQ ID Nr. 22) entspricht den Aminosäurepositionen 377 bis 454 (inklusive) des Maus-Plasminogens in SEQ ID Nr. 1.
So wie es hier verwendet wird, bedeutet „Kringel 2-3" ein Protein-Derivat des Plasminogens mit einer Endothelzell-inhibierenden Wirkung oder anti-angiogenen Wirkung, und mit einer Aminosäuresequenz, die eine Sequenz umfasst, die homolog zu Kringel 2-3 ist, beispielhaft dargegeben, aber nicht beschränkt auf die Maus-Kringel 2-3 (SEQ ID Nr. 24), menschliche Kringel 2-3 (SEQ ID Nr. 25), Rhesus-Kringel 2-3 (SEQ ID Nr. 26), Schwein-Kringel 2-3 (SEQ ID Nr. 27) und Rind-Kringel 2-3 (SEQ ID Nr. 28), sofern es nicht anders im Kontext, in dem es verwendet wird, angegeben ist. Maus-Kringel 2-3 (SEQ ID Nr. 24) entspricht den Aminosäurepositionen 185 bis 352 (inklusive) des Maus-Plasminogens in SEQ ID Nr. 1 und entspricht den Aminosäurepositionen 88 bis 255 (inklusive) des Maus-Angiostatins in SEQ ID Nr. 2. Mensch-Kringel 2-3 (SEQ ID Nr. 25), Rhesus-Kringel 2-3 (SEQ ID Nr. 26), Schwein-Kringel 2-3 (SEQ ID Nr. 27) und Rind-Kringel 2-3 (SEQ ID Nr. 28) entsprechen den Aminosäurepositionen 88 bis 255 (inklusive) des Angiostatins in SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 bzw. SEQ ID Nr. 6.
So wie es hier verwendet wird, bedeutet „Kringel 1-3" ein Protein-Derivat des Plasminogens mit einer Endothelzell-inhibierenden Wirkung oder anti-angiogenen Wirkung, und mit einer Aminosäuresequenz, die eine Sequenz umfasst, die homolog zu Kringel 1-3 ist, beispielhaft dargegeben, aber nicht beschränkt auf die Maus-Kringel 1-3 (SEQ ID Nr. 29), menschliche Kringel 1-3 (SEQ ID Nr. 30), Rhesus-Kringel 1-3 (SEQ ID Nr. 31), Schwein-Kringel 1-3 (SEQ ID Nr. 32) und Rind-Kringel 1-3 (SEQ ID Nr. 33), sofern es nicht anders im Kontext, in dem es verwendet wird, angegeben ist. Maus-Kringel 1-3 (SEQ ID Nr. 29) entspricht den Aminosäurepositionen 103 bis 352 (inklusive) des Maus-Plasminogens in SEQ ID Nr. 1 und entspricht den Aminosäurepositionen 6 bis 255 (inklusive) des Maus-Angiostatins in SEQ ID Nr. 2. Mensch-Kringel 1-3 (SEQ ID Nr. 30), Rhesus-Kringel 1-3 (SEQ ID Nr. 31), Schwein-Kringel 1-3 (SEQ ID Nr. 32) und Rind-Kringel 1-3 (SEQ ID Nr. 33) entsprechen den Aminosäurepositionen 6 bis 255 (inklusive) des Angiostatins in SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 bzw. SEQ ID Nr. 6.
So wie es hier verwendet wird, bedeutet „Kringel 1-2" ein Protein-Derivat des Plasminogens mit einer Endothelzell-inhibierenden Wirkung oder anti-angiogenen Wirkung, und mit einer Aminosäuresequenz, die eine Sequenz umfasst, die homolog zu Kringel 1-2 ist, beispielhaft dargegeben, aber nicht beschränkt auf die Maus-Kringel 1-2 (SEQ ID Nr. 34), menschliche Kringel 1-2 (SEQ ID Nr. 35), Rhesus-Kringel 1-2 (SEQ ID Nr. 36), Schwein- Kringel 1-2 (SEQ ID Nr. 37) und Rind-Kringel 1-2 (SEQ ID Nr. 38), sofern es nicht anders im Kontext, in dem es verwendet wird, angegeben ist. Maus-Kringel 1-2 (SEQ ID Nr. 34) entspricht den Aminosäurepositionen 103 bis 262 (inklusive) des Maus-Plasminogens in SEQ ID Nr. 1 und entspricht den Aminosäurepositionen 6 bis 165 (inklusive) des Maus-Angiostatins in SEQ ID Nr. 2. Mensch-Kringel 1-2 (SEQ ID Nr. 35), Rhesus-Kringel 1-2 (SEQ ID Nr. 36), Schwein-Kringel 1-2 (SEQ ID Nr. 37) und Rind-Kringel 1-2 (SEQ ID Nr. 38) entsprechen den Aminosäurepositionen 6 bis 165 (inklusive) des Angiostatins in SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 bzw. SEQ ID Nr. 6.
So wie es hier verwendet wird, bedeutet „Kringel 1-4" ein Protein-Derivat von Plasminogen mit einer Endothelzell-inhibierenden Wirkung oder anti-angiogenen Wirkung und mit einer Aminosäuresequenz, die eine Sequenz umfasst, die homolog zu Kringel 1-4 ist, beispielhaft dargestellt, aber nicht beschränkt auf die der Maus-Kringel 1-4, (SEQ ID Nr. 39) und menschlichem Kringel 1-4 (SEQ ID Nr. 40), soweit es nicht im Zusammenhang, mit dem es verwendet wird, anders angegeben ist. Maus-Kringel 1-4 entspricht (SEQ ID Nr. 39) entspricht den Aminosäurepositionen 103 bis 454 (inklusive) des Maus-Plasminogens in SEQ ID Nr. 1.
Kringel 1, Kringel 2, Kringel 3, Kringel 4, Kringel 2-3, Kringel 1-3, Kringel 1-2 und Kringel 1-4 Aminosäuresequenzen sind jeweils homolog zu den oben beschriebenen spezifischen Kringel-Sequenzen. Vorzugsweise haben die Aminosäuresequenzen einen Homologiegrad von mindestens 60 % zu den offenbarten Sequenzen, mehr bevorzugt mindestens 70 % und mehr bevorzugt mindestens 80 %. Es sollte klar sein, dass eine Vielzahl an Aminosäure-Substitutionen, Additionen, Deletionen oder andere Modifikationen bei den oben aufgelisteten Fragmenten vorgenommen werden können, um die Endothel-Proliferations-inhibierende Wirkung oder anti-angiogene Wirkung der Angiostatin-Fragmente zu verbessern oder zu modifizieren. Der Begriff „funktionelles Homolog" bedeutet, dass veränderte Sequenzen in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendet werden können, welche Deletionen, Additionen oder Substitutionen verschiedener Reste einschließen, was zu einer Sequenz führt, die das gleiche oder ein funktional äquivalentes Genprodukt kodiert. Das Genprodukt selbst kann Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten innerhalb einer Angiostatin-Sequenz enthalten, welche zu einer stillen Änderung führen, wodurch funktional äquivalente Angiostatin-Proteine hergestellt werden. Solche Aminosäure-Substitutionen können auf der Grundlage der Ähnlichkeit der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobizität, Hydrophilizät und/oder der amphipathischen Natur der betroffenen Reste durchgeführt werden. Beispielsweise schließen negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure ein; positiv geladene Aminosäuren schließen Lysin, Histidin und Arginin ein; Aminosäuren mit nicht geladenen polaren Kopfgruppen mit ähnlichen Hydrophilizitätswerten schließen die Folgenden ein: Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin; und Aminosäuren mit nicht polaren Kopfgruppen schließen Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Phenylalanin, Prolin, Methionin, Tryptophan ein. Solche Modifikationen beabsichtigen nicht, den Bereich und die Bedeutung der Ansprüche zu überschreiten. Beispielsweise sollten die Cysreste C4 im rekombinanten menschlichen Kringel 2 (SEQ ID Nr. 13) und C42 im rekombinanten Kringel 3 (SEQ ID Nr. 18) in Serine mutiert werden, um eine Homodimerisierung durch Bildung von Unter-Kringel-Disulfidbrücken zu vermeiden. Des Weiteren ist klar, dass eine Vielzahl an Aminosäuresubstitutionen, Additionen, Deletionen oder anderen Modifikationen in den oben erwähnten Angiostatin-Fragmenten vorgenommen werden können, welche die Endothelzell-Proliferations-inhibierende Wirkung der Fragmente nicht signifikant ändern, und die daher den Bereich der Ansprüche nicht überschreiten sollen. Unter „nicht signifikant ändern" ist gemeint, dass das Angiostatin-Fragment mindestens 60 %, mehr bevorzugt mindestens 70 % und noch mehr bevorzugt mindestens 80 % der Endothelzell-Proliferations-inhibierenden Wirkung aufweist, wenn sie mit dem nahe liegendsten homologen Angiostatin-Fragment, das hier beschrieben ist, verglichen wird.
Genkonstruktion und Expression
Ein auf PCR basierendes Verfahren wurde verwendet, um die cDNA-Fragmente zu erzeugen, die für Kringel 1 (K1), Kringel 2 (K2), Kringel 3 (K3), Kringel 4 (K4) und Kringel 2-3 (K2-3) des menschlichen Plasminogens (HPg) zu erzeugen. Rekombinantes Kringel 1 (rK1), Kringel 2 (rK2), Kringel 3 (rK3), Kringel 4 (rK4) und Kringel 2-3 (rK2-3) wurden in E. coli exprimiert, wie zuvor beschrieben (Menhart, N., Shel., L. C., Kelly, R. F., und Castellino, F. J. (1991) Biochem. 30, 1948-1957; Marti, D., Schaller, J., Ochensberger, B., und Rickli E. E. (1994) Eur. J. Biochem. 219, 455-462; Söhndel, S., Hu, C.-K., Marti, D., Affolter, M., Schaller, J., Llinas, M. und Rickli, E. E. (1996) Biochem. im Druck; Rejante, M. R., Byeon, I.-J. L., und Llinas, M. (1991) Biochem. 30, 11081-11092). Um eine Homodimerisierung durch Bildung von Inter-Kringel-Disulfidbrücken zu vermeiden, wie in 32B gezeigt ist, wurden die Cysteinreste C169 und rK2 und C297 in rK3 in Serine mutiert, wie in den SEQ ID Nr. 13 und 18 erkannt werden kann, d. h. an den Positionen 4 bzw. 42 (Söhndel, S., Hu, C.-K., Marti, D., Affolter, M., Schaller, J., Llinas, M., und Rickli, E. E. (1996) Biochem. in press). rK3 und rK2-3 enthielten einen N-terminalen Hexa-Histidin-Tag, welcher für die Proteinreinigung verwendet wurde (nicht gezeigt).
Proteolytischer Verdau
Die Fragmente K1-3, K1-4 und K4 wurden durch einen Verdau von Lys-HPg (Abbott Labs) mit Schwein-Elastase (Sigma) hergestellt, wie zuvor beschrieben (Powell, J. R., und Castellino, F. J. (1983) Biochem. 22, 923-927). Kurz gefasst, wurden 1,5 mg Elastase bei Raumtemperatur mit 200 mg menschlichen Plasminogens in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, über Nacht unter Schütteln inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Diisopropyl-fluorphosphat (DFP) (Sigma) in einer finalen Konzentration von 1 mM beendet. Das Gemisch wurde für zusätzliche 30 min. bei Raumtemperatur geschüttelt und über Nacht gegen 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, dialysiert.
Protein-Aufreinigung
Rekombinantes K1 wurde in DH5α E. coli-Bakterienzellen unter Verwendung des pSTII-Plasmidvektors exprimiert. Dieses Protein wurde bis zur Homogenität mittels Chromatographie unter Verwendung von Lysin-Sepharose 4B (Pharmacia) und Mono-Q (BioRad)-Säulen gereinigt. E. coli-Bakterienzellen (Stamm HB101), welche rK2 und rK3 exprimieren, wurden bis zu OD₆₀₀ von ungefähr 0,8 bei 3°C in 2 x VT Medium gezüchtet, welches 100 mg/ml Ampicillin und 25 mg/ml Kanamycin enthält. IPTG (Isopropyl-b-D-thiogalactopyranosid) wurde bis zu einer finalen Konzentration von 1 mM hinzugegeben und die Zellen wurden für zusätzliche 4,5 Stunden bei 37°C gezüchtet, um die Produktion rekombinanter Proteine zu induzieren. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet, und die Pellets wurden bei –80°C gelagert. Die aufgetauten Zelllysate wurden in dem Extraktionspuffer resuspendiert (6 M Guanidinhydrochlorid in 0,1 M Natriumphosphat, pH 8,0). Die Suspension wurde bei 15.000 x g für 30 min. zentrifugiert und b-Mercaptoethanol wurde zu dem Überstand in einer finalen Konzentration von 10 mM zugegeben. Der Überstand wurde dann auf eine Ni² ⁺-NTA-Agarosesäule (1,5 cm × 5 cm) gegeben, welche mit dem Extraktionspuffer prä-äquilibriert war. Die Säule wurde nacheinander mit Extraktionspuffer bei pH 8,0 bzw. pH 6,3 gewaschen. Rekombinantes K2 und K3 wurden mit dem Extraktionspuffer bei pH 5,0 eluiert.
Die proteolytisch gespaltenen Fragmente K1-3, K1-4 und K4 wurden unter Verwendung einer Lysin-Sepharose 4B-Säule (2,5 cm × 15 cm) gereinigt, welche mit 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 äquilibriert war, bis eine Absorption bei 180 nm 0,005 erreicht wurde. Die absorbierten Kringel-Fragmente wurden mit Tris-Puffer eluiert, welcher 20 mM ε-Aminocaprylsäure, pH 8,0, enthält. Die eluierten Proben wurden über Nacht gegen 20 mM Tris-HCl, pH 5,0 dialysiert und wurden auf eine BioRad Mono-S-Säule appliziert, welche mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war. Die Fragmente K4, K1-3 und K1-4 wurden mit 0,20 %, 20-50 % und 50-70 % Schrittgradienten 20 mM Phosphat/1 M KCl, pH 5,0, eluiert. Der meiste Teil der K1-3- und K1-4-Fragmente wurde von der Säule mit 0,5 M KCl eluiert, wie durch SDS-PAGE bestimmt wurde. Alle Fraktionen wurden über Nacht gegen 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, dialysiert. Nach der Dialyse wurden K1-3- und K1-4-Fragmente weiter unter Verwendung einer Heparin-Sepharose-Säule (5 cm × 10 cm) (Sigma) gereinigt, welche mit 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, prä-äquilibriert war. Das K1-3-Fragment wurde mit 350 mM KCl und K1-4 wurde mit der Durchflussfraktion gewonnen. Die gereinigten Kringel-Fragmente wurden auf SDS-Gelen analysiert, gefolgt von einer Silberfärbung, durch Western-Immunblot-Analyse mit Anti-Mensch-K4 und -K1-3 polyclonalen Antikörpern und durch amino-terminale Sequenzanalyse.
In vitro Rückfaltung
Die Rückfaltung von rK2, rK3 und rK2-3 wurde gemäß dem Standardprotokoll (Cleary, S., Mulkerrin, M. G., und Kelley, R. R. (1989) Biochem. 28, 1884-1891) durchgeführt. Die gereinigten Proteine wurden auf pH 8,0 eingestellt, und Dithiotreitol (DTT) wurde bis zu einer finalen Konzentration von 5 mM hinzugegeben. Nach einer Inkubation über Nacht wurde die Lösung mit 4 Volumina 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, enthaltend 1,25 mM reduziertes Glutathion, verdünnt. Nach 1 Stunde Inkubation wurde oxidiertes Glutathion bis zu einer finalen Konzentration von 1,25 mM hinzugegeben und für 6 Stunden bei 4°C inkubiert. Das renaturierte Protein wurde anfangs gegen H₂O für 2 Tage dialysiert und dann für weitere 2 Tage gegen 50 mM Phosphat-gepufferte Salzlösung, pH 8,0. Die Lösung wurde dann auf einer Lysin-Biogel-Säule (2 cm × 13 cm) geladen, welche mit der gleichen Phosphat-gepufferten Salzlösung äquilibriert war. Die Säule wurde mit Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen und das Protein wurde mit Phosphatpuffer eluiert, welches 50 mM 6-AHA enthält (6-Aminohexansäure). Eine Umkehrphasen-HPLC wurde auf einer Aquapor-Butyl-Säule durchgeführt (2,1 × 100 mm, Porengröße 30 nm, 7 mm, Applied Biosystems) und eine Hewlett Packard Flüssigchromatographie wurde mit Acetonitrilgradienten durchgeführt.
Reduzierung und Alkylierung
Die Reduzierung und Alkylierung der Kringel-Fragmente wurde gemäß einem Standardprotokoll durchgeführt (Cao, Y., und Petterson, R. F., (1990) Growth Factors 3, 1013). Ungefähr 20-80 mg gereinigten Proteins in 300-500 ml DME-Medium in Abwesenheit von Serum wurden bei Raumtemperatur mit 50 ml 0,5 M DTT für 15 min. inkubiert. Nach einer Inkubation wurden 30 ml 0,5 M Jodacetamid zu der Reaktion gegeben. Die Proteinlösung wurde bei 4°C über Nacht anfangs gegen 20 Volumina DMEM dialysiert. Die Lösung wurde weiter dialysiert bei 4°C für weitere 4 Stunden gegenüber 20 Volumina frischem DMEM. Nach der Dialyse wurden die Proben auf einem SDS-Gel analysiert und hinsichtlich ihrer inhibitorischen Wirkungen auf die Endothelzell-Proliferation getestet.
Endothel-Proliferations-Test
Rinder-Kapillar-Endothel (BCE)-Zellen wurden isoliert, wie zuvor beschrieben (Folkman, J., Haudenschild, C. C., und Zetter, B. R. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci USA 76, 5217-5121) und in DMEM aufbewahrt, welches mit 10 % Hitze-inaktiviertem Rinder-Kälber-Serum (BCS), Antibiotica und 3 ng/ml rekombinantem menschlichem bFGF (Scios Nova, Mountainview, CA) ergänzt war. Monolager der BCE-Zellen, die in 6-Well-Platten gezüchtet wurden, wurden in einer 0,05 % Trypsin-Lösung dispergiert. Die Zellen wurden mit DMEM resuspendiert, welches 10 % BCS enthält. Ungefähr 12.500 Zellen in 0,5 ml wurden zu jedem Well der gelatinisierten 24-Well-Gewebekulturplatten gegeben, und bei 37°C inkubiert (bei 10 % CO₂) für 24 Stunden. Das Medium wurde durch 500 ml frisches DMEM enthaltend 5 % BCS ersetzt und die Proben der einzelnen oder kombinierten Kringel-Fragmente in dreifacher Form wurden zu jedem Well gegeben. 30 min. nach der Inkubation wurde bFGF bis zu einer finalen Konzentration von 1 ng/ml gegeben. Nach 72 Stunden Inkubation wurden die Zellen abtrypsiniert, in Hematall resuspendiert (Fisher Scientific, Pittsburg, PA) und mit einem Coulter-Counter gezählt.
Reinigung und Charakterisierung des Kringel-Fragments des menschlichen Plasminogens
Die cDNA-Fragmente, die für die einzelnen Kringel (K1, K2, K3 und K4) und die Kringel 2-3 (K2-3) des menschlichen Plasminogens kodieren, wurden durch ein auf PCR beruhendes Verfahren amplifiziert (28). Die PCR-amplifizierten cDNA-Fragmente wurden in einen bakteriellen Expressionsvektor kloniert. Rekombinante Proteine, die durch Escherichia coli exprimiert wurden, wurden in vitro rückgefaltet und bis zu mehr als 98 % Homogenität unter Verwendung der HPLC-gekoppelten Chromatographie gereinigt (29). Unter reduzierten Bedingungen migrierten rekombinante K2, K3 und K4 mit Molekulargewichten von 12-13 kDa (29A, Spuren 2-4), entsprechend den vorhergesagten Molekulargewichten jedes Kringel-Fragments. Rekombinantes K1 migrierte mit einem höheren Molekulargewicht von 17 kDa, welches durch SDS-Gel-Elektrophorese identifiziert wurde. Die Fragmente von K1-4 und K1-3 wurden durch proteolytischen Verdau menschlichen Lys-Plasminogens (Lys-HPg) mit Elastase gewonnen, wie zuvor beschrieben worden ist (Powell, J. R., und Castellino, F. J. (1983) Biochem. 22, 923-927); Brockway, W. J., und Castellino, F. j. (1972) Arch. Biochem. Biophys.). Diese zwei Fragmente (29B, Spuren 1 und 2) mit vorhergesagten Molekulargewichten von 43 kDa bzw. 35 kDa wurden ebenfalls bis zur Homogenität aufgereinigt. Die N-terminale Aminosäuresequenzanalyse der gereinigten Fragmente ergab eine identische Sequenz -YLSE-, gefolgt von der SEQ ID Nr. 30 bzw. SEQ ID Nr. 40 für K1-3 bzw. K1-4. Die N-terminale Sequenz für K4 produzierte -WQD- mit ungefähr 20 % -VQD-, gefolgt von SEQ ID Nr. 23, von denen jede von der erwarteten Sequenz, die bei Valin¹⁷⁶ und Valin¹⁷⁷ des menschlichen Angiostatins (SEQ ID Nr. 3) vorhergesagt wurde, beginnt.
Anti-Endothelzell-Proliferations-Wirkung der individuellen Kringel
In einzelne rekombinante Kringel-Fragmente des Angiostatins wurden auf ihre inhibitorischen Wirkungen an Rinder-Kapillar-Endothel (BCE)-Zellen getestet, welche mit bFGF stimuliert waren. Wie in 30A gezeigt ist, inhibierte rK1 die BCE-Proliferation in Dosis-abhängiger Weise. Die Konzentration von rK1, die für eine 50 % Inhibierung (ED₅₀) benötigt wurde, betrug ungefähr 320 nM (Tabelle 4). Im Gegensatz dazu wies rK4 geringe oder keine inhibitorische Wirkung auf die Endothelzell-Proliferation auf. Rekombinantes K2 und rK4, zwei nicht Lysin-bindende Kringel-Fragmente, ergaben ebenfalls eine Dosis-abhängige Inhibierung der Endothelzell-Proliferation (30B). Jedoch war die inhibitorische Stärke von rK2 wesentlich geringer als von rK1 und rK3 (ED₅₀=460) (30 und Tabelle 4). Es wurde keine Cytotoxizität oder eine kennzeichnende Morphologie, die mit apoptotischen Endothelzellen verbunden ist, wie beispielsweise Abrundung, eine Ablösung oder eine Fragmentierung der Zellen nachgewiesen, selbst nach einer Inkubation mit einer hohen Konzentration dieser Kringel-Fragmente. Diese Daten lassen vermuten, dass die anti-endotheliale Wachstumsaktivität von Angiostatin von den Fragmenten K1, K2 und K3 geteilt wird und weniger von K4. Tabelle 4 Inhibitorische Wirkung auf die Kapillar-Endothelzell-Proliferation

Fragmente ED₅₀ (nM)

Kringel 1 320

Kringel 2 –

Kringel 3 460

Kringel 4 –

Kringel 2-3 –

Kringel 1-3 70

Kringel 1-4 135
Anti-Endothelzell-proliferative Wirkung von K1-3- und K1-4-Fragmenten
Um die Anti-Endothelzell-proliferative Wirkung kombinierter Kringel-Fragmente zu untersuchen, wurden gereinigte proteolytische Fragmente von menschlichen K1-4, K1-3 und rK2-3 an BCE-Zellen untersucht. Übereinstimmend mit den vorherigen Befunden (O'Reilly, M. S., Holmgren, L., Shing, Y., Chen, C. Rosenthal, R. A., Moses, J., Lane, W. S., Cao, Y., Sage, E. H., und Folkman, J. (1994) Cell 79, 315-328), wurde die BCE-Zellproliferation, wie in 31 gezeigt ist, durch das Angiostatin-artige Fragment K1-4 signifikant inhibiert (ED₅₀=135 nM) (Tabelle 4). ein Anstieg der Anti-Endothel-Wachstumwirkung wurde mit dem K1-3-Fragment (ED₅₀=70 nM) (Tabelle 4) beobachtet. Die Inhibierung der Endothelzell-Proliferation trat in einer Dosis-abhängigen Weise auf. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Entfernung von K4 von Angiostatin die anti-endotheliale Wachstumsaktivität potenziert.
Additive Inhibierung durch rK2 und rK3
Das Fragment rK2-3 wies nur eine geringe inhibitorische Wirkung auf, welche ähnlich der von rK2 allein war (31). Jedoch inhibierten sowohl rK2 als auch rK3 die Endothelzell-Proliferation (30B). Dieser Befund lässt vermuten, dass die inhibitorische Wirkung von K3 in der Struktur K2-3 versteckt ist. Vorhergehende strukturelle Studien zeigten, dass eine Inter-Kringel-Disulfid-Brücke zwischen K2 (Cystein¹⁶⁹) und K3 (Cystein²⁹⁷) des menschlichen Plasminogens vorhanden ist, welche Cystein⁹¹ und Cystein²¹⁹ der SEQ ID Nr. 3 entsprechen (Söhndel, S., Hu, C.-K., Marti, D., Affolter, M., Schaller, J., Llinas, M., und Rickli, E. E. (1996) Biochem. im Druck), siehe 32B. Die inhibitorische Wirkung von rK2 und rK3 in Kombination wurde getestet. Interessanterweise wurde eine additive Inhibierung beobachtet, wenn individuelle rK2- und rK3-Fragmente zusammen zu BCE-Zellen gegeben wurden. Siehe 32A. Diese Ergebnisse implizieren, dass es vorzuzie hen ist, die Interdisulfidbrücke zwischen K2 und K3 zu öffnen, um eine maximal inhibitorische Wirkung von K2-3 zu gewinnen.
Passende Faltung der Kringel-Strukturen ist für die anti-endotheliale Aktivität von Angiostatin benötigt
Um zu untersuchen, ob die Faltung der Kringel-Strukturen für die Anti-Endothel-Proliferations-Aktivität benötigt ist, wurde natives Angiostatin mit DTT reduziert und an Rinder-Kapillar-Endothelzellen getestet. Nach der Reduzierung wurde Angiostatin weiter mit Jodacetamid alkyliert und durch SDS-Gel-Elektrophorese analysiert. Wie in 34A gezeigt ist, migrierte das DTT-behandelte Protein an einer höheren Position mit einem Molekulargewicht von ungefähr 32 kDa (Spur 3), verglichen mit dem nativen Angiostatin mit einem Molekulargewicht von 33 kDa (Spur 1), was vermuten lässt, dass Angiostatin nicht vollständig reduziert wurde. Die anti-proliferative Aktivität von Angiostatin wurde hauptsächlich nach der Reduktion (34B) zunichte gemacht. Aus diesen Ergebnissen schließen wir, dass die korrekte Faltung von Angiostatin durch die Intra-Kringel-Disulfidbrücken bevorzugt ist, um die starke Wirkung auf die Inhibierung der Endothelzell-Proliferation zu bewahren.
Die Aminosäuresequenzanlagerung der Kringel-Domänen des menschlichen Plasminogens zeigt, dass K1, K2, K3 und K4 eine insgesamt identische Architektur und eine bemerkenswerte Sequenzhomologie (56-82 % Identität) aufweisen, wie in 35 erkannt wird. Von diesen Strukturen ist der hoch-affine Lysin-bindende Kringel K1 das am meisten potente inhibitorische Segment bezüglich der Endothelzell-Proliferation. Interessanterweise fehlt dem intermediär affinen Lysin-bindenden Fragment K4 die inhibitorische Aktivität. Diese Daten legen nahe, dass die Lysin-Bindungsstelle der Kringel-Strukturen nicht direkt an der inhibitorischen Wirkung beteiligt sein kann. Die Aminosäurekonservierung und der funktionale Unterschied dieser Kringel-Strukturen stellt ein ideales System bereit, um die Rolle von Mutationen zu studieren, die durch die DNA-Replikation während der Evolution verursacht werden. Ähnliche abweichende Aktivitäten bezüglich der Regulierung der Angiogenese, welche durch eine Gruppe strukturell verwandter Proteine aufgewiesen werden, sind ebenfalls in den -C-X-C-Chemokin- und Prolactin-Wachstumshormonfamilien zu finden (Maione, T. E., Gray, G. S., Petro, A. J., Hunt, A. L., und Donner, S. I. (1990) Science 247, 77-79; Koch, A. E., Polverini, P. J., Kunkel, S. L. Harlow, L. A., DiPietro, L. A., Elner, V. M., Elner, S. J., und Strieter, R. M. (1992) Science 258, 1798-1801.; Cao, Y., Chen, C., Weatherbee, J. A., Tsang, M., und Folkman, J. (1995) J. Exp. Med. 182, 2069-2077; Strieter, R. M., Polverini, P. J., Arenberg, D. A., und Kunkel, S. L. (1995) Shock 4, 155-160; Jackson, D., Volpert, O. V., Bouck, N., und Linzer, D. I. H. (1994) Science 266, 1581-1584).
Eine weitere Sequenzanalyse zeigt, dass K4 zwei positiv geladene Lysinreste nahe den Cysteinen 22 und 78 enthält (35). ¹H Kernmagnetresonanz (NMR)-Analyse zeigt, dass diese 4 Lysine zusammen mit Lysin 57 den Kern einer positiv geladenen Domäne in K4 bildet (Llinas M., nicht veröffentlichte Daten), während andere Kringel-Strukturen eine solche positiv geladene Domäne fehlt. Ob diese Lysin-reiche Domäne am Verlust der inhibitorischen Wirkung von Kringel 4 des menschlichen Plasminogens teilhat, bleibt zu untersuchen. K4 wurde zuvor dahingehend beschrieben, dass es die Proliferation anderer Zelltypen stimuliert und die Freisetzung von intrazellulärem Calcium erhöht (Donate, L. E., Gherardi, E., Srinivasan, N., Sowdhamini, R., Aporicio, S., und Blundell, T. L. (1994) Prot. Sci. 3, 2378-2394). Die Tatsache, dass die Entfernung von K4 aus Angiostatin dessen inhibitorische Wirkung an Endothelzellen potenziert, legt nahe, dass diese Struktur etwas der inhibitorischen Wirkung von K1-3 verhindern kann.
Der Mechanismus, der zugrunde liegt, wie Angiostatin und dessen verwandte Kringel-Fragmente spezifisch das Endothelzell-Wachstum inhibieren, bleibt nicht charakterisiert. Es ist noch nicht klar, ob die Inhibierung durch einen Rezeptor vermittelt wird, der spezifisch auf proliferierenden Endothelzellen exprimiert wird, oder ob Angiostatin durch die Endothelzellen internalisiert wird und anschließend die Zellproliferation inhibiert. Alternativ dazu kann Angiostatin mit einem Endothelzell-Adhäsionsrezeptor wie Integrin a_vb₃ interagieren, die Integrin-vermittelter Angiogenese blockieren (Brooks, P. C., Montgomery, A. M., Rosenfeld, M., Reisfeld, R. A., Hu, T. Klier, G., und Cheresh, D. A. (1994) Cell 79, 1157-1164). Interessanterweise berichteten Friedlander et al. (Friedlander, M., Brooks, P. C., Shaffer, R. W., Kincaid, C. M., Varner, J. A., und Cheresh, D. A. (1995) 270, 1502) kürzlich, dass die in vivo Angiogenese in der Cornea oder in Choriollantoin-Membran-Modellen (induziert durch bFGF und Tumor-Necrose-Faktor) a_vb₃-Integrin-abhängig ist. Jedoch war die Angiogenese, die durch VEGF stimuliert wurde, sowie durch transformierenden Wachstumsfaktor a oder Phorbolester a_vb₅-abhängig. Antikörper gegen die individuellen Integrine blockierten spezifisch einen dieser Wege und ein zyklischer Protein-Antagonist beider Integrine blockte Angiogenese, welche durch jedes Cytokin induziert wurde (Friedlander, M., Brooks, P. C., Shaffer, R. W., Kincaid, C. M., Varner, J. A., und Cheresh, D. A. (1995) 270, 1502). Da bFGF- und VEGF- induzierte Angiogenese durch Angiostatin inhibiert werden, kann es einen gemeinsamen Weg dieser Integrin-vermittelten Angiogenese blockieren.
Eine zunehmende Zahl endogener Angiogenese-Inhibitoren sind in den wenigen letzten Dekaden identifiziert worden (Folkman, J. (1995) N. Engl. J. Med. 333, 1757-1763). Von den neun charakterisierten Endothelzell-Suppressoren sind mehrere Inhibitoren proteolytische Fragmente. Beispielsweise inhibiert das 16 kDa N-terminale Fragment des menschlichen Prolactins die Endothelzell-Proliferation und blockiert die Angiogenese in vivo (Clapp, C., Martial, J. A., Guzman, R. C., Rentierdelrue, F., und Weiner, R. I. (1993) Endorinology 133, 1292-1299). In einem kürzlich veröffentlichten Artikel berichten D'Angelo et al., dass das anti-angiogene 16 kDa N-terminale Fragment die Aktivierung der mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) durch VEGF und bFGF in Kapillar-Endothelzellen inhibierte (D'Angelo, G., Struman, I., Martial, J. und Weiner, R. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 6374-6378). Ähnlich wie beim Angiostatin inhibiert das intakte Elternmolekül Prolactin die Endothelzell-Proliferation nicht, noch ist es ein Angiogenese-Inhibitor. Plättchenfaktor 4 (PF-4) inhibiert die Angiogenese in hoen Konzentrationen (Maione, T. E., Gray, G. S., Petro, A. J., Hunt, A. L., und Donner, S. I. (1990) Science 247, 77-79; Cao, Y., Chen, C., Weatherbee, J. A., Tsang, M., und Folkman, J. (1995) J. Exp. Med. 182, 2069-2077). Jedoch weist das N-terminal verkürzte proteolytisch gespaltene PF-4-Fragment einen 30- bis 50-fachen Anstieg in seiner anti-proliferativen Wirkung gegenüber dem intakten PF-4-Molekül auf (Gupta, S. K., Hassel, T. und Singh, J. P. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 7799-7803). Kleinere Proteinfragmente von Fibronectin, Maus-Epidermis-Wachstumsfaktor und Thrombospondin haben sich ebenfalls als das Endothelzell-Wachstum spezifisch inhibierend gezeigt (Homandberg, G. A., Williams, J. E., Grant, D., Schumacher, B., und Eisenstein, R. (1985) Am. J. Pathol. 120, 327-332; Nelson, J., Allen, W. E., Scott, W. N., Bailie, J. R., Walker, B., McFerran, N. V., und Wilson, D. J. (1995) Cancer Res. 55, 3772-3776; Tolsma, S. S., Volpert, O. V., Good, D. J., Frazer, W. A., Polverini, P. J. und Bouck, N. (1993) J. Cell Biol. 122, 497-511). Die proteolytische Prozessierung eines großen Proteins kann die Konformationsstruktur des Ursprungsmoleküls ändern oder neue Epitope exponieren, die anti-angingen sind. Daher können Proteasen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Angiogenese spielen. Bis heute ist wenig über die Regulierung dieser Proteaseaktivitäten in vivo bekannt.
Die Daten zeigen auch, dass die durch die Disulfidbindung vermittelte Faltung der Kringel-Strukturen in Angiostatin vorzugsweise aufrecht zu er halten ist, um die inhibitorische Wirkung auf das Endothelzell-Wachstum zu bewahren. Kringel-Strukturen, die denen in Plasminogen analog sind, werden auch in einer Vielzahl anderer Proteine gefunden. Beispielsweise hat Apolipoprotein (a) sogar 37 Wiederholungen des Plasminogen-Kringels 4 gefunden (McLean, J. W., Tomlinson, J. E., Kuang, W.-J., Eaton, D. L., Chen, E. Y., Fless, G. M., Scanu, A. M., und Lawn, R. M. (1987) Nature 330, 132-137). Der Amino-terminale Teil von Prothrombin enthält ebenfalls zwei Kringel, die homolog zu denen des Plasminogens sind (Walz, D. A., Hewett-Emmett, D., und Seegers, W. H. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 1969-1973). Urokinase hat gezeigt, dass es Kringel-Strukturen besitzt, die eine umfassende Homologie mit Plasminogen teilen (Gunzler, W. A., J., S. G., Otting, F., Kim, S.-M. A., Frankus, E., und Flohe, L. (1982) Hoppe-Seyler's A. Physiol. Chem. 363, 1155-1165). Zusätzlich hat das Surfactant-Protein B und Hepatocyten-Wachstumsfaktor (HGF) ebenfalls Kringel-Strukturen (Johansson, J., Curstedt, T., und Jörnvall, H. (1991) Biochem. 30, 6917-6921; Lukker, N. A., Presta, L. G., und Godowski, P. J. (1994) Prot. Engin. 7, 895-903).
Beispiel 28
Unterdrückung von Metastasen und der Endothelzell-Proliferation durch Angiostatin-Fragmente
Das folgende Beispiel charakterisiert die Aktivität zusätzlicher Angiostatin-Fragmente. Die Daten legen nahe, dass eine starke anti-endotheliale und Tumor-unterdrückende Wirkung durch solche Proteinfragmente des Angiostatins gewonnen werden kann.
So wie es hier verwendet wird, bedeutet „Kringel 1-4BKLS" ein Proteinderivat des Plasminogens mit Endothelzell-inhibierender Wirkung und mit einer Aminosäuresequenz, die eine Sequenz umfasst, die homolog zum Kringel 1-4BKLS ist, beispielhaft angegeben durch, aber nicht beschränkt auf die vom Maus-Kringel 1-4BKLS (SEQ ID Nr. 41) und menschlichen Kringel 1-4BKLS (SEQ ID Nr. 42), sofern es nicht im Zusammenhang, in dem es verwendet wird, anders angegeben ist. Maus-Kringel 1-4BKLS (SEQ ID Nr. 41) entspricht den Aminosäurepositionen 93 bis 470 (inklusive) des Maus-Plasminogens von SEQ ID Nr. 1. Dieses Beispiel beweist, dass ein „Angiostatin-Fragment" ein Plasminogen-Fragment sein kann und eine Aminosäuresequenz umfasst, die größer als das Angiostatin ist, welches in SEQ ID Nr. 3 beispielhaft angegeben ist, und immer noch therapeutische Endothelzell-Proliferations-inhibierende Wirkung oder anti-angiogene Wirkung haben kann.
Die Kringel 1-4BLKS-Aminosäuresequenz ist homolog zu den spezifischen Kringel 1-4BLKS-Sequenzen, die oben angegeben worden sind. Vorzugsweise ha ben die Aminosäuresequenzen einen Homologiegrad mit den offenbarten Sequenzen von mindestens 60 %, mehr bevorzugt mindestens 70 %, und mehr bevorzugt mindestens 80 %. Es sollte klar sein, dass eine Vielzahl an Aminosäure-Substitutionen, Deletionen und anderen Modifizierungen der oben erwähnten Fragmente gemacht werden können, um die Endothelzell-inhibierende Wirkung der Fragmente zu verbessern oder zu modifizieren. Solche Modifizierungen beabsichtigen nicht, den Bereich und die Bedeutung der Ansprüche zu überschreiten. Des Weiteren ist es klar, dass eine Vielzahl stiller Aminosäure-Substitutionen, Additionen oder Deletionen in den oben identifizierten Kringel-Fragmenten gemacht werden können, welche die Endothelzell-inhibierende Wirkung der Fragmente nicht signifikant ändern, und die daher nicht den Schutzbereich der Ansprüche überschreiten.
Klonierung von Angiostatin in Pichia pastoris
Sequenzen, die Angiostatin kodieren, wurden mittels PCR unter Verwendung der Vent-Polymerase (New England Biolabs) und der Primer # 154 (5'-ATCGCTCGAGCGTTATTTGAAAAGAAAGTG-3') (SEQ ID Nr. 43) und # 151 (5'-ATCGGAATTCAAGCAGGACAACAGGCGG-3') (SEQ ID Nr. 44) amplifiziert, welche die Linker XhoI bzw. EcoRI enthalten und in dem das Plasmid pTrcHis/HAs als Matrize verwendet wurde. Dieses Plasmid enthielt Sequenzen, die die Aminosäuresequenzen, die die Aminosäuren 93 bis 470 des menschlichen Plasminogens (SEQ ID Nr. 42) kodieren, zur Klonierung in die XhoI/EcoRI-Schnittstelle des PHIL-S1 Expressionsvektors unter Verwendung des nativen P. pastoris Sekretionssignals PHO 1. Die gleiche Sequenz wurde auf gleiche Weise unter Verwendung der Primer #156 (5'-ATCGTACGTATTATTTGAAAAGAAAGTG-3') (SEQ ID Nr. 45) und #151 amplifiziert, welche die Linker SnaBI und EcoRI enthalten, zur Klonierung in die SnaBI/EcoRI-Schnittstelle des Expressionsvektors pPlC9 mit dem alpha-Faktor Sekretionssignal. Die Produkte der Amplifikationen wurden Gel-gereinigt, die Linker wurden mit den entsprechenden Enzymen verdaut, und wieder unter Verwendung von Gene-Clean (Bio 101) gereinigt. Diese Genfragmente wurden in die entsprechenden Vektoren ligiert. Die erhaltenen Klone wurden ausgewählt und die Plasmidpräparate der Klone wurden gewonnen und linearisiert, um His⁺ Mut^S und His⁺ Mut⁺ rekombinante Stämme zu erzeugen, wenn sie in den P. pastoris Wirtsstamm GS115 transformiert werden. Die Integration wurde durch PCR bestätigt.
Sowohl His⁺ und His⁺ Mut^S Rekombinante wurden mit Methanol induziert und auf eine hohe Expression an Angiostatin unter Verwendung von Coomassie-gefärbten SDS-PAGE-Gelen und Immunblots unter Verwendung des Maus-monoklonalen Antikörpers gegen die Kringel 1 bis 3 (Castellino, Enzyme Research Laborstories, Inc., South Bend, IN) durchmustert. Aus diesen wurde ein GS115-transformierter P. pastoris-Klon PHIL-S1/HAs18 ausgewählt und phänotypisch als His⁺ Mut^S charakterisiert.
Expression von PHIL-S1/HAs18
Die Expression von Angiostatin aus PHIL-S1/HAs18 war typisch für einen His⁺ Mut^S-Klon. Bei der Induktion in Vakuum-Schüttelkulturflaschen, wurden 1 l der OD₆₀₀-Zellen in 150 ml gepuffertem Methanol-Komplexmedium enthaltend 1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 100 mM Kaliumphosphat pH 6,0, 1,34 % Hefestickstoffbase mit Ammoniumsulfat, 0,00004 % Biotin und 0,5 % Methanol in einer 1 l Vakuumflasche kultiviert. Die Zellen wurden ständig bei 30°C, 250 UpM geschüttelt. Methanol wurde als Batch in 24 Stunden-Intervallen durch Zugabe von absolutem Methanol bis zu einer finalen Konzentration von 0,5 % zugeführt. Nach 120 Stunden wurden die Zellen bei 5.000 UpM für 10 Minuten heruntergeschleudert und die Überstände wurden bei –70°C gelagert, bis sie verwendet wurden.
Reinigung von Angiostatin aus P. pastoris Fermentierflüssigkeit durch Lysinsepharose-Chromatographie
Alle Verfahren wurden bei 4°C durchgeführt. Unbehandelte Fermentie rungflüssigkeit, typischerweise 200 ml, die Angiostatin enthält, wurde durch Zentrifugieren bei 14.000 x g geklärt und durch Centriprep 30 (Amicon) 30 kDa Molekulargewichts-Ausschlussmembranen auf ungefähr ein Viertel des Originalvolumens aufkonzentriert. Ein Volumen 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, wurde zu der aufkonzentrierten Probe hinzugefügt, welche wieder durch Centriprep auf ein Viertel des ursprünglichen Probenvolumens aufkonzentriert wurde. Die Probe wurde wiederum mit Volumen:Volumen 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, verdünnt. 60 g Lysin-Sepharose 4B (Pharmacia) wurden in 500 ml eiskaltem 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, resuspendiert und verwendet, um eine 48 × 100 mm Säule (ungefähr 180 ml gepacktes Volumen) zu bepacken. Die Säule wurde über Nacht mit 7,5 Säulenvolumina (CV) 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, bei einer Fließrate von 1,5 ml/min. gewaschen. Die Probe wurde durch eine Säule bei einer Fließrate von 1,5 ml/min. gepumpt und die Säule wurde mit 1,5 CV 50 mM Natriumphosphat, pH 7,5, bei einer Fließrate von 3 ml/min. gewaschen. Die Säule wurde dann mit 1,5 CV Phosphat-gepufferter Salzlösung, pH 7,4, bei einer Fließrate von 3 ml/min. gewaschen, Angiostatin wurde dann mit 0,2 M ε-Amino-n-caprylsäure, pH 7,4, bei einer Fließrate von 3 ml/min. eluiert. Fraktionen, die eine signifikante Absorption aufwiesen, wurden zusammengegeben und für 24 bis 48 Stunden gegen ionisiertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Eine ty pische Ausbeute aus einer 100 mg Gesamtprotein-Beladung beträgt 10 mg Angiostatin. Die Säulen wurden unter Verwendung von 5 Säulenvolumina 50 mM Natriumphosphat/1 M NaCl, pH 7,5 regeniert.
Rinder-Capillar-Endothelzell-Proliferationstest
Rinder-Capillar-Endothelzellen wurden wie zuvor beschrieben gewonnen. Die Zellen wurden in DMEM, welches 3 mg/ml rekombinantem menschlichen bFGF enthält (Scios Nova, Mountainview, CA), ergänzt mit 10 % Hitze-inaktiviertem Rinderkälberserum, 100 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und 0,25 mg/ml Fungizon (BioWhittaker) in 75 cm² Zellkulturflaschen aufbewahrt. Dieser Test wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt.
Tierstudien
Sechs bis acht Wochen alte männliche C57BI/6J Mäuse (Jackson Laboratories) wurden subkutan mit dem Maus Lewis-Lungencarzinom der niedrig metastasierenden Linie (LLC-LM) (1 × 10⁶ Zellen/Injektion) inokuliert. Ungefähr 14 Tage nach der Implantierung, sobald der Primärtumor 1,5 cm³ erreichte, wurden die Tiere mit Metoxyfluran anästhesiert und die Primärtumoren wurden chirurgisch entfernt. Die Einschnittstelle wurde durch einfache unterbrochene Nähte geschlossen. Die Hälfte der Tiere in dieser Gruppe erhielten eine Beladungsdosis (3 mg/kg auf subkutanem Wege) rekombinantes oder vom Plasminogen stammenden Angiostatin subkutan direkt nach dem chirurgischen Eingriff, gefolgt von täglichen Inokulierungen zu 1,5 mg/kg über 14 Tage. Eine Kontrollgruppe der Mäuse erhielt an jedem Tag für 14 Tage nach dem chirurgischen Eingriff das gleiche Volumen an PBS. Alle Tiere wurden 14 Tage nach der Entfernung des Primärtumors geopfert (28 Tage nach der Tumorimplantierung), die Lungen wurden entfernt und gewogen, und die Oberflächenmetastasen wurden mit dem Stereomikroskop gezählt.
Eigenschaften der rekombinanten menschlichen Angiostatin-Fragmente
Ein Genfragment, das menschliches Angiostatin einschließlich der Kringel 1-4 des menschlichen Plasminogens kodiert, welches insgesamt 26 Cysteine enthält, wurde in der methylotropen Hefe Pichia pastoris exprimiert. P. pastoris exprimiertes Angiostatin bindet Lysin-Sepharose und kann spezifisch mit ε-Aminocaprylsäure eluiert werden. Dies beweist, dass vollständig funktionale ε-Aminocaprylsäure-bindende Kringel, die physische Eigenschaften von Kringel 1- und 4-Plasminogen entsprechen (Sottrup-Jensen, L. et al., Progress in Chemical fibrinolysis and Thrombolysis, Vol. 3 (1978) Ravens Press, N.Y. S. 191) durch P. pastoris exprimiert und sezerniert werden können, und mit Techniken gereinigt werden können, die keine Rückfaltung benötigen (36A und B). Exprimiertes Angiostatin aus P. pastoris wie auch Angiostatin, das durch Elastasespaltung aus Plasminogen gereinigt wurde, wurden durch einen Konformations-abhängigen monoklonalen Antikörper gegen Kringel 1-3 erkannt (Castellino, Enzyme Research Laboratories, Inc., South Bend, IN) (36B). Dieser Antikörper erkennt die reduzierten Formen von Plasminogen oder Angiostatin nicht.
P. pastoris exprimiertes Angiostatin wird als Dublett erkannt, das bei 49 kDa und 51,5 kDa auf denaturierenden nicht reduzierenden Coomassie-gefärbten SDS-PAGE Gelen migriert. P. pastoris exprimierte Proteine werden post-translational an der Mehrzahl der N-gebundenen Glycosilierung vom hoch-Mannosetyp und unwesentlicher O-gebundener Glycosilierung modifiziert. Um die Möglichkeit der Glycosilierung in P. pastoris exprimierten Angiostatins zu untersuchen, haben wir rekombinantes Angiostatin mit Endoglycosidase H verdaut, welche spezifisch für stark Mannose-haltige Strukturen ist, was die 51,5 kDa Bande dazu veranlasste, identisch wie die Bande bei 49 kDa zu migrieren (37A und B). Der O-Glycanase-Verdau mit vorhergehender Neuraminidase-Behandlung, um Sialinsäurereste zu entfernen, änderte das Muster der Migration der Dublette nicht (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, dass durch P. pastoris exprimiertes Angiostatin in zwei Formen exprimiert wird: (1) mit einer N-gebundenen Komplexkette, die wahrscheinlich die Struktur hat:
und (2) ohne irgendeine Glycosilierung.
Inhibierung der Rinder-Capillar-Endothelzellen in vitro
Um zu bestimmen, ob rekombinant exprimiertes Angiostatin das Potential einer anti-angiogenen Wirkung besitzt, wurden BCEs in Gegenwart von bFGF kultiviert, um zu bestimmen, ob die Addition von gereinigtem rekombinantem Angiostatin die Proliferation der BCEs inhibieren würde. Gereinigtes, durch P. pastoris exprimiertes Angiostatin inhibierte die bFGF-gesteuerte Proliferation der Rinder-Endothelzellen in vitro (38B) in Dosis-abhängiger Weise (38C). Bei 1 μg/ml rekombinantem Angiostatin betrug die Inhibierung 80 %. Die 50 % Inhibierung entsprach der, die mit Angiostatin erzielt wurde, welches durch eine Elastasespaltung aus menschlichem Plasminogen stammte.
Unterdrückung von Metastasen in vivo.
Die transplantierbare Maus-LLC (LM)-Linie, bei der Angiostatin zuerst identifiziert wurde, wurde verwendet. Wenn sie subkutan in syngene C57BI/6J-Mäuse implantiert wurden, wuchsen diese Tumoren schnell, und erzeugten innerhalb von 14 Tagen < 1,5 cm³ große Tumoren. Nach der Resektion des Primärtumors wuchsen die Mikrometastasen in den Lungen exponentiell, um die Oberfläche der Lunge vollständig zu bedecken. Die Metastasen sind am Tag 14 nach der Resektion des Primärtumors stark vascularisiert. Wenn der Primärtumor gelassen wird, bleiben die Mikrometastasen ruhig und sind makroskopisch nicht sichtbar. Rekombinantes Angiostatin wurde nach der Resektion des Primärtumors systemisch an Mäuse verabreicht, um die Unterdrückung des Wachstums von Metastasen zu testen. Durch P. pastoris exprimiertes Angiostatin wurde systemisch zu 30 μg/Maus/Tag verabreicht und inhibierte das Wachstum von Metastasen wie durch Skalierung der Oberflächen-Metastasen (39A) und durch das Gesamt-Lungengewicht (39B) quantifiziert wurde. Die Gewichte der Lungen der Mäuse, die die Primärtumoren entfernt hatten, und die tägliche Dosen an rekombinantem Angiostatin oder Angiostatin, welches aus einer Elastasespaltung von Plasminogen stammte, waren vergleichbar mit denen der normalen Mäuse (190 zu 200 mg). Die Lungen der Mäuse, denen die Primärtumore herausgeschnitten worden waren, und die anschließend mit täglichen Dosen an rekombinantem Angiostatin behandelt worden waren, waren pink mit minimalen Anzahlen nicht-vascularisierter Metastasen (40). Im Gegensatz dazu hatten die Mäuse, die nach der Primärtumor-Resektion mit Salzlösung behandelt worden sind, Lungen, die mit vascularisierten Metastasen bedeckt waren (41). Ebenfalls von bemerkenswerter Bedeutung war die Abwesenheit systemischer oder lokaler Toxizität, welche bei der Dosierung und dem Verabreichungsschema, das in dieser Studie verwendet wird, von durch P. pastoris exprimiertes Angiostatin verursacht wird. Es gab in allen behandelten Mäusen keinen Beweis für eine Entzündung oder Blutung.
Angiostatin-Protein, das durch P. pastoris exprimiert wird, besitzt zwei wichtige physikalische Eigenschaften der natürlichen Proteine: (1) Es wird durch einen Konformationas-abhängigen monoklonalen Antikörper erkannt, der gegen die Kringel 1-3 des menschlichen Plasminogens (36B) erzeugt wurde, und (2) es bindet Lysin (36A und B). Diese Eigenschaften zeigen, dass das rekombinante Angiostatin-Protein in einer Konformation exprimiert worden ist, die das native Molekül nachahmt. Durch P. pastoris exprimiertes Angiostatin-Protein inhibiert die Proliferation von Rinder-Capillar-Endothelzellen, welche durch bFGF in vitro stimuliert werden (38).
Wenn es systemisch verabreicht wird, hielt das rekombinante Angiostatin das ansonsten letale metastasierende Lewis-Lungencarzinom in einem unterdrückten Zustand (39A und B und 40).
Präliminäre Daten zeigten die Abwesenheit jedes nachweisbaren Transkripts von Angiostatin in Lewis-Lungentumoren, die frisch aus Mäusen ausgeschnitten wurden oder in LLC-Zellen nach 4 Passagen in der in vitro-Kultur. Plasminogen, welches durch die Leber hergestellt wird, wird in einer stabilen Plasmakonzentration von 1,6 ± 0,2 μM im Blutkreislauf gehalten. Es ist möglich, dass LLC-LM-Tumoren ein Enzym herstellen, welches Plasminogen spaltet, welches gebunden ist oder im Kreislauf vorliegt, um Angiostatin zu produzieren. Alternativ dazu könnten Entzündungszellen, die an die Stelle des Tumors gelockt werden, ein solches Enzym herstellen.
Es ist bemerkenswert, dass sowohl das aus P. pastoris stammende als auch das native menschliche Plasminogen in einer glycosilierten und einer nicht-glycosilierten Form hergestellt wird. Im Fall des menschlichen Plasminogens kann ein einzelnes Iranskript eines einzelnen Gens beide Formen herstellen. Der molekulare Mechanismus der unterschiedlichen post-translationalen Modifizierungen des menschlichen Plasminogens wie auch der, der beim TPA beobachtet wird, sind unbekannt.
Angiostatin wird durch P. pastoris stark exprimiert. Überstände enthalten 10 mg/l des Proteins. Daher sollten die Mengen, welche für klinische Versuche benötigt werden, einfach herzustellen sein und unter Verwendung von Standard-Technologien, die Fachleuten im Gebiet gut bekannt sind, einfach zu reinigen und zu produzieren sein. Die Entwicklung dieses Expressionssystems und die Beweise der in vitro- und in vivo-Aktivität des gereinigten rekombinanten Angiostatins gegen Metastasen bildeten die Grundlage für die Untersuchung der Fähigkeit dieser Fragmente, das Tumorwachstum zu inhibieren und das Leben von Krebspatienten und anderen, die an Angiogen-vermittelten Erkrankungen leiden, zu verlängern.
Beispiel 29
Produktion und Verabreichung von aggregiertem Angiostatin
Dieses Beispiel belegt die Produktion und Verabreichung von Aggregat-Angiostatin, um die Endothelzell-Proliferation und das Tumorwachstum zu inhibieren. Normalerweise wird vermutet, dass rekombinante Proteine, die durch E. coli hergestellt werden, gelöst und rückgefaltet werden müssen (renaturiert, reduziert und alkyliert), um die in vivo-Aktivität zu erzielen. In dem Verfahren geht häufig eine signifikante Menge des Proteins verloren. In diesem Beispiel wird aggregiertes rekombinantes Angiostatin nach der Reinigung hergestellt und direkt, ohne weitere Renaturierung, Reduzierung oder Alkylierung verwendet, um die Angiogenese und das Tumorwachstum zu inhibieren. Daher stellt dieses Beispiel eine überraschend wirksame Maßnahme der Herstellung und Verwendung von Angiostatin bereit. Dieses aggregierte Angiostatin und das Verfahren zur Verabreichung stellt auch ein Weg zur fortgesetzten Freisetzung von Angiostatin bereit, wodurch dessen Effizienz optimiert wird. So wie es hier verwendet wird, bedeutet „Aggregat-Angiostatin" Angiostatin, das im Wesentlichen gereinigt worden ist, aber nicht manuell rückgefaltet worden ist, wie in genaueren Details unten beschrieben werden wird.
Expression von Angiostatin
Das E. coli Expressionssystem, welches den Vorteil hat, schnell, produktiv und kostengünstig zu sein, wurde für die Expression von Maus-Angiostatin verwendet. Zwei Oligoprimer, die eine cDNA-Sequenz von Plasminogen Kringel 1-4 flankieren (Plasminogen-cDNA wurde von ATCC bezogen), wurden für eine auf einer PCR basierenden Strategie entworfen, um das Angiostatin-Expressionssystem zu konstruieren (siehe z. B. Menhart, N., Shel, L. C., Kelly, R. F., und Castellino, F. J. (1991) Biochem. 30, 1948-1957); Marti, D., Schaller, J., Ochensberger, B., und Rickli, E. E. (1994) Eur. J. Biochem. 219, 455-462; Söhndel, S., Hu, C.-K., Marti, D., Affolter, M., Schaller, J., Llinas, M., und Rickli, E. E. (1996) Biochem. im Druck; Rejante, M. R., Byeon, I.-J. L., und Llinas, M. (1991) Biochem. 30, 11081-11092). Das PCR-Produkt wurde in die NcoI- und XhoI-Schnittstellen des pET22-Vektors (Novegen) inseriert, welcher den T7-lac-Promotor und eine Oligohistidinsequenz enthält. Die cDNA wurde dann in E. coli transformiert (Stamm BL21 (DE3)), welche eine chromosomale Kopie des T7 RNA-Polymerasegens unter lacUV5-Kontrolle enthält. Die Expression des rekombinanten Angiostatins wurde durch die Zugabe von IPTG induziert. Das exprimierte Angiostatin akkumulierte als Einschlusskörperchen in den Wirtszellen und bestand typischerweise aus über 40 % des gesamten zellulären Proteins, wie durch eine Coomassie-Blue-Färbung geschätzt wurde.
Die Erfindung zieht in Erwägung, dass rekombinantes Angiostatin oder Fragmente davon, welche aus irgendeiner geeigneten Spezies stammen, in einer Vielzahl von Vektorenwirtssystemen exprimiert werden können, die Fachleuten auf dem Gebiet wohl bekannt sind.
Reinigung und Aggregierung von Angiostatin
Die unlösliche Fraktion der beschallten Wirtszellen, welche die Einschlusskörperchen enthalten, wurden durch Zentrifugieren bei 9.000 UpM für 25 Minuten und wiederholtes Waschen gereinigt. Das erhaltene Produkt enthielt ungefähr 80 % Angiostatin, wie durch Coomassie-Blue-Färbung geschätzt wurde. Die N-terminale Oligohistidin-Domäne des Fusionsproteins machten es möglich, eine günstige und ökonomische Reinigung des rekombinanten Angiostatins mittels Gelier-Affinitäts-Chromatographie in einer Ni² ⁺-NTA Agarosesäule (1,5 cm × 5 cm) unter denaturierenden Bedingungen durchzuführen, in dem die Einschlusskörperchen in 6 mol Harnstoff gelöst werden. Wie in 41, Spur 7, erkannt wird, zeigt das gereinigte Angiostatin eine einzelnen Bande auf einem SDS-PAGE durch Coomassie-Blue-Färbung, mit einer Migrationsrate bei zwischen 45 kD bis 65 kD, und mehr bevorzugt ungefähr 55 kD. Diese Einzelschritt-Chromatographie kann das Protein bis zur wesentlichen Homogenität aufreinigen, jedoch zieht die Erfindung in Erwägung, dass eine Vielzahl anderer Reinigungstechniken, die Fachleuten gut bekannt sind, verwendet werden können, um dieses Produkt zu erhalten.
Das Protein, in seinem Elutionspuffer, wurde dann (15.000 MWCO) gegen Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) für 24 Stunden mit 3 Änderungen des Dialysats bei 4°C dialysiert. Während der Dialyse wurde ein weißes Präzipitat gesehen. Die Probe wurde dann aus dem Dialysebeutel entfernt und das Präzipitat durch Zentrifugieren entfernt. Das Präzipitat wurde dann unter Verwendung eines Vortex in PBS resuspendiert, um eine feine Suspension zur Verwendung in Tiermodellen zu bilden, oder bei –20°C gelagert. Dieses Präzipitat stellte das Aggregat Angiostatin bereit. Alternativ dazu kann beispielsweise 20 mM tris-HCl, pH 7,9/150 mM NaCl, als Dialysepuffer verwendet werden. Die Erfindung zieht in Erwägung, dass entweder mehr oder weniger Dialyse und eine Vielzahl anderer Dialysepuffer verwendet werden können, um eine entsprechende Menge an Aggregat-Angiostatin zu gewinnen, innerhalb von Grenzen, die routinegemäß durch einen Fachmann auf dem Gebiet, im Hinblick auf die vorliegende Offenbarung bestimmbar sind.
In vitro-Tests des Aggregat-Angiostatins
Rinder-Capillar-Endothel (BCE)-Zellen wurden in einem Test, wie in Beispiel 8 dargestellt, verwendet. Die Zellen wurden mit aggregiertem rekombinantem menschlichem Angiostatin gefordert, welches in diesem Beispiel beschrieben, hergestellt worden ist. Die Ergebnisse sind in 42 gezeigt, welche eine signifikante Inhibierung der Endothelzellen zeigte, die dem aggregierten Angiostatin ausgesetzt sind.
In vivo-Tests des Aggregat-Angiostatins
Alle Arbeiten an Tieren wurden in einem Tierstall des Children's Hospital in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Institution durchgeführt.

A. Das aggregierte rekombinante Maus-Angiostatin, das wie in diesem Beispiel beschrieben, hergestellt worden ist, wurde in dem Hühner-CAM-Test getestet (O'Reilly, M. S., Homgren, L., Shing, Y., Chen, C., Rosenthal, R. A., Moses, M., Lane, W. S., Cao, Y., Sage, E. H., und Folkman, J., Cell (1994) 79: 315-328). Bei einer Dosis von 25 μg betrug die Inhibierung der Kapillarbildung 100 % (alle fünf Hühner-CAMs, die getestet wurden, ergaben 2-3+ inhibitorische Zonen). Bei einer Dosis von 100 μg hielt die Inhibierung der Kapillarbildung für 96 Stunden an. Die Wirkung anderer Angiogenese-Inhibitoren und von Plasminogen stammendem Angiostatin sind bekannt dafür, mindestens 48 Stunden anzuhalten. Das lässt vermuten, dass das aggregierte Angiostatin einen Vorteil der fortgesetzten Freisetzung bereitstellt.
B. Ein Lewis-Lungencarzinom wurde in den subkutanen Mittel-Rücken von C57B16-Mäusen inokuliert. Den Mäusen wurden 1 × 10⁶ Zellen in 0,1 lPBS implantiert, welche wie zuvor beschrieben, hergestellt wurden, und sie wurden in Gruppen aus 6 oder weniger in Käfige gegeben. Die Tumoren wurden mit einem „Dialcaliper" gemessen und die Tumorvolumina wurden unter Verwendung der Formel Breite × Breite × Länge × 0,52 bestimmt, und das Verhältnis der behandelten Kontrolltumor-Volumen (T/C) wurde am letzten Zeitpunkt bestimmt.

Nachdem das Tumorvolumen 100-200 mm³ betrug, was ungefähr innerhalb von 3-5 Tagen eintritt, wurden die Mäuse für zwei getrennte Experimente zufallsgemäß ausgewählt. In dem ersten Experiment erhielten die Mäuse alle 24 Stunden 2-3 mg/kg der aggregierten rekombinanten Maus-Angiostatin-Suspension in PBS subkutan an einer Stelle injiziert, die vom Tumor entfernt ist, (n=3 Mäuse/Gruppe). Die Kontrollgruppe erhielt vergleichbare Injektionen an Salzlösung. In dem zweiten separaten Experiment (n=6 Mäuse/Gruppe) erhielten die Testmäuse 10 mg/kg der aggregierten rekombinanten Maus-Angiostatin-Suspension in PBS subkutan an einer Stelle fern vom Tumor alle 24 Stunden injiziert. Die Kontrollgruppe erhielt vergleichbare Injektionen an Salzlösung.
Es wurde keine Toxizität oder ein Gewichtsverlust in irgendeiner der Mäuse, die mit dem aggregierten rekombinanten Angiostatin-Suspension behandelt wurden, bemerkt. In den Mäusen wurde das aggregierte Angiostatin als subkutane Masse nach der Injektion erkannt, welche über einen Zeitraum von mehreren Stunden resorbiert wird. Das legt nahe, dass es graduierlich gelöst wurde und zeigt, dass das aggregierte Angiostatin ein wirksames Mittel zur verzögerten Freisetzung ist. Bei beiden Dosen gab es eine signifikante Inhibierung des Wachstums der Primärtumore des Lewis-Lungencarzinoms in den behandelten Mäusen. Siehe 43 und 44. Die T/C, welche durch Verabreichung von 10/mg/Tag als Einzelinjektion für 19 Tage gewonnen wurde (wenn die Salzlösungs-Kontrolltiere zu sterben begannen und geopfert wurden) beträgt 0,06, welches eine Tumorvolumen-Reduzierung ist, die nach Kenntnis der Erfinder zuvor nie erreicht worden ist.
Die Ergebnisse in vitro und in vivo dieses Beispiels stellen eine vernünftige Grundlage für einen erwarteten Erfolg zur Verwendung der beschriebenen Produkte und Verfahren zur Inhibierung der Endothelzell-Proliferation, Angiogenese und des Tumorwachstums bei Menschen dar. Wenngleich nicht gewünscht ist, durch die Theorie gebunden zu sein, könnte das aggregierte rekombinante Angiostatin, das durch das vorliegende Verfahren hergestellt wird, verschiedene Konformation haben, und daher unterschiedliche physikalische Eigenschaften, als durch Elastase-erzeugtes Angiostatin oder anders gereinigte Proteine, die normalerweise renaturiert werden. Gereinigtes rekombinantes Angiostatin wurde präzipitiert, um eine aggregierte Suspension zu bilden, indem die Proteinlösung gegen ein relativ großes Volumen an Wasser oder Puffer dialysiert wurde. Es wird vermutet, dass dies auftritt, da nicht richtig gefaltetes Protein unlöslich wird und aggregiert. Zuvor wäre nicht erwartet worden, dass ein denaturiertes Aggregat-Protein eine so bemerkenswerte Wirksamkeit in vivo besitzen könnte. Die starke Anti-Tumor-Aktivität, die belegt wird, liegt vermutlich ebenfalls an einer langsamen, aber konstanten Lösung und Freisetzung des aggregierten Proteins aus den subkutanen Stellen. Die Erfindung zieht weiter in Erwägung, dass entweder natürlich auftretendes oder rekombinantes Angiostatin und Angiostatin-Fragmente in dem beschriebenen Verfahren zur Reinigung verwendet werden können, um aggregiertes natürliches und rekombinantes Angiostatin, oder Aggregat-Fragmente des Angiostatins zu erzeugen, die ohne die Notwendigkeit einer Renaturierung für die erfolgreiche Inhibierung der Endothelzell-Proliferation des Tumorwachstums verwendet werden können.
SEQUENZLISTE

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten und ein Angiostatin-Fragment oder eine Kombination von Angiostatin-Fragmenten mit Angiogenese-inhibierender Wirkung in einem Säuger, wobei das Angiostatin-Fragment aus der Gruppe bestehend aus einer Kringel 1 Region, einer Kringel 2 Region, einer Kringel 3 Region, einer Kringel 1-2 Region und einer Kringel 2-3 Region ausgewählt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Angiostatin-Fragment eine Aminosäuresequenz einer Kringel 2-3 Region oder einer Kringel 1-2 Region hat.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Angiostatin-Fragment eine Aminosäuresequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 oder einer Kombination daraus besteht.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Angiostatin-Fragment eine Aminosäuresequenz der Kringel 1 Region hat.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die Kringel 1 Region eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 besteht.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Angiostatin-Fragment eine Aminosäuresequenz der Kringel 2 Region hat.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die Kringel 2 Region eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 und SEQ ID NO: 16 besteht.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Angiostatin-Fragment eine Aminosäuresequenz der Kringel 3 Region hat.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei die Kringel 3 Region eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 und SEQ ID NO: 21 besteht.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine isolierte DNA-Sequenz, die für ein Angiostatin-Fragment oder eine Kombination aus Angiostatin-Fragmenten mit Angiogenese-inhibierender Wirkung in einem Säuger codiert, wobei das Angiostatin-Fragment aus der Gruppe bestehend aus einer Kringel 1 Region, einer Kringel 2 Region, einer Kringel 3 Region, einer Kringel 1-2 Region und einer Kringel 2-3 Region ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das Angiostatin-Fragment oder die Kombination aus Angiostatin-Fragmenten eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 und SEQ ID NO: 38 besteht.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Vektor, wobei der Vektor eine DNA-Sequenz enthält, die ein Angiostatin-Fragment oder eine Kombination aus Angiostatin-Fragmenten mit Endothelzellproliferation-inhibierender Wirkung codiert, wobei dieser Vektor in der Lage ist, dieses Angiostatin-Fragment zu exprimieren, wenn es in einer Zelle vorhanden ist, und wobei dieses Angiostatin-Fragment aus der Gruppe bestehend aus einem Kringel 1 Protein, Kringel 2 Protein, Kringel 3 Protein, Kringel 1-2 Protein und Kringel 2-3 Protein ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei diese DNA-Sequenz ein Angiostatin-Fragment oder eine Kombination aus Angiostatin-Fragmenten codiert, umfassend eine Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 und SEQ ID NO: 38 besteht.
Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13 zur Inhibierung der Endothelzellproliferation oder zur Behandlung einer Angiogenese-vermittelten Erkrankung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Krebs, Arthritis, makularer Degeneration und diabetischer Retinopathie.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Endothelzellproliferation oder zur Behandlung einer Angiogenese-vermittelten Erkrankung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Krebs, Arthritis, makularer Degeneration und diabetischer Retinopathie.