JP2002510209A

JP2002510209A - インビボで血管形成を調節することができるプラスミノーゲンのクリングルドメイン１−５

Info

Publication number: JP2002510209A
Application number: JP50549599A
Authority: JP
Inventors: イイハイ、カオ
Original assignee: カロリンスカイノベイションズアクチボラゲット
Priority date: 1997-06-26
Filing date: 1998-06-26
Publication date: 2002-04-02
Also published as: EP1001985A1; CA2295925A1; AU7951798A; WO1999000420A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、内皮細胞増殖を制御することができるタンパク質、ならびにその使用に関する。本発明のタンパク質は、分子量が約５０〜６０kDa、好ましくは約５５kDaであり、プラスミノーゲン分子のＬｙｓ７８〜Ａｒｇ５３０からなるプラスミノーゲン断片の配列と実質的に同じであるアミノ酸配列を有する。

Description

【発明の詳細な説明】インビボで血管形成を調節することができるプラスミノーゲンのクリングルドメイン１−５発明の分野本発明は、新規の内皮細胞増殖インヒビターに関する。このインヒビターは、血管形成関連疾患の阻害および血管形成プロ七スの調節において極めて強力である。さらに本発明は、本発明のインヒビターを血管形成性疾患を有するヒトまたは動物に投与することにより、これらを治療する方法に関する。背景本明細書において用語「血管形成」は、組織または臓器への新しい血管の形成を意味し、内皮細胞増殖が関与する。正常な生理学的条件下では、ヒトまたは動物は非常に特異的な限定された状況でのみ血管形成をする。例えば血管形成は通常、創傷治癒、胎児および胚成長、黄体、子宮内膜、および胎盤の形成で観察される。用語「内皮細胞」は、漿液腔、リンパ管、および血管の内側をおおう平面的な上皮細胞の薄い層を意味する。制御された血管形成と制御されていない血管形成の両方も、同様の方法で進行すると考えられている。基底膜に囲まれた内皮細胞と周皮細胞は、毛細血管を形成する。血管形成は、内皮細胞および白血球から放出される酵素による基底膜の侵食で始まる。血管の内腔をおおう内皮細胞は次に、基底膜から***する。血管形成刺激物質は、侵食された基底膜中を移動するように内皮細胞を誘導する。移動する細胞は、親血管から「芽」を出し、ここで内皮細胞は細胞***し増殖する。内皮細胞芽は互いに融合して毛細血管係蹄を形成し、新しい血管を作り出す。種々の病状、癌転移、および内皮細胞による異常増殖で、持続性の無秩序な血管形成が起き、これらの症状でみられる病的傷害を維持する。無秩序な血管形成が存在する多様な病状は、血管形成依存性または血管形成関連疾患として分類されている。腫瘍の増殖が血管形成依存性であるという仮説は、１９７１年に初めて提唱された（ジェイ・フォークマン（ＦｏｌｋｍａｎＪ．），腫瘍血管形成：治療的意味（Ｔｕｍｏｒａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２８５：１１８２−１１８６、１９７１）。最も単純に以下のように記載されている：「いったん腫瘍の「生着」が起きると、腫瘍細胞集団が増加するには、腫瘍の上に集合する新しい毛細管が毎回増加しなければならない。」。腫瘍の「生着」は現在、腫瘍増殖の血管前の段階であって、数立方ミリメートルの容量を占めるが数百万を超えない腫瘍細胞の集団が、既存の宿主微小血管上で生存できる段階であると、理解されている。この段階を超える腫瘍の容量の拡大には、新しい毛細血管の誘導が必要である。例えばマウスの初期血管前段階の肺微小転移巣は、組織学的切片についての高分解能顕微鏡によってしか検出できないであろう。この考え方を支持する間接的な証拠の例としては以下のものがある：（１）マウスの皮下透明室に移植された腫瘍の増殖速度は、血管新生前は遅く直線的であり、血管新生後には速く指数的である（ジー・エィチ・アルギレ（ＡｌｇｉｒｅＧＨ）ら、インビボでの正常および悪性腫瘍の血管反応Ｉ．創傷ならびに正常および新生物移植に対するマウスの血管反応：ＪＮａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．６：７３−８５，１９４５）。（２）血管が増殖せず単離され潅流された臓器中で増殖した腫瘍は１〜２mm³ に制限されるが、マウスに移植して血管新生がおきると急速に拡大し、この１０００倍以上になる（ジェイ・フォークマン（ＦｏｌｋｍａｎＪ）ら、単離され潅流された臓器中での腫瘍の挙動：ウサギ甲状腺およびイヌ小腸切片での生検材料のインビトロの増殖と転移。ＡｎｎａｌｓｏｆＳｕｒｇｅｒｙ１６４：４９１−５０２，１９６６）。（３）無血管角膜中の腫瘍の増殖は徐々にかつ直線的に進行するが、血管新生後は指数的増殖に変化する（エム・エー・ギンブロン（Ｇｉｍｂｒｏｎｅ，Ｍ．Ａ．）ら、腫瘍増殖と血管新生：ウサギ角膜を用いる指数モデル。Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ５２：４１−４２７，１９７４）。（４）ウサギの眼の前眼房の眼水中に懸濁された腫瘍は生存し、無血管であり、１mm³未満のサイズに制限される。これらはいったん紅彩血管床に移植されると、血管が新生し急速に増殖し、２週間以内に元の容量の１６，０００倍に達する（エム・エー・ギンブロン（Ｇｉｍｂｒｏｎｅ，ＭＡ）ら、血管新生の妨害によるインビボでの腫瘍の休眠、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３６：２６１−２７６）。（５）腫瘍は、ヒヨコ胚の漿尿膜に移植されると７２時間未満の無血管段階中は徐々に増殖するが、平均直径０．９３＋０．２９mmを超えない。血管新生の開始２４時間後に急速な腫瘍拡大が起き、７日目までにこれらの血管形成腫瘍は平均直径８．０＋２．５mmに達する（ディー・クナイトン（ＫｎｉｇｈｔｏｎＤ）、ヒヨコ胚の無血管段階と血管段階、ＢｒｉｔｉｓｈＪ．Ｃａｎｃｅｒ，３５：３４７−３５６，１９７７）。（６）ウサギ肝臓の転移の血管の特徴は転移のサイズに不均一性を示すが、血管新生が存在するサイズについては比較的均一なカットオフ点を示す。腫瘍は直径０mmまでは一般的に無血管性であるが、この直径を超えると血管新生が起きる（ダブリュー・リエン（ＬｉｅｎＷ．）ら、実験的肝転移の血管供給．II．潅流シリコーンゴムを用いる肝臓の正常なおよび腫瘍血管の微小循環試験、Ｓｕｒｇｅｒｙ６８：３３４−３４０，１９７０）。（７）膵島のベータ細胞で癌が発生するトランスジェニックマウスにおいて、血管形成前過形成小島はサイズが１1mm³未満に制限される。６〜７週令で、小島の４〜１０％は血管が新生し、これらの小島から血管新生前小島の容量より１０００倍以上大きな血管新生腫瘍が発生する（ジェイ・フォークマン（ＦｏｌｋｍａｎＪ．）ら、過形成から新生物への移行の間の血管形成の誘導、Ｎａｔｕｒｅ３３９：５８−６１，１９８９）。（８）ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）に対する特異抗体は微小血管密度を減少させ、血管形成（ヌードマウスの）の唯一のメディエーターとしてＶＥＧＦに依存する３っのヒト腫瘍の増殖を「有意にまたは劇的に」阻害する。この抗体は、インビトロで腫瘍細胞の増殖を阻害しない（ケー・ジェイ・キム（ＫｉｍＫＪ）ら、血管内皮増殖因子誘導性の血管形成の阻害はインビボの腫瘍増殖を抑制する、Ｎａｔｕｒｅ３６２：８４１−８４４，１９９３）。（９）抗ｂＦＧＦモノクローナル抗体は、血管形成の唯一のメディエーターとしてｂＦＧＦの分泌に依存するマウス腫瘍の増殖の７０％阻害を引き起こす。この抗体は、インビトロで腫瘍細胞の増殖を阻害しない（エー・ホリ（ＨｏｒｉＡ）ら、ヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子に対する免疫中和性モノクローナル抗体による固形腫瘍増殖の抑制、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，５１：６１８０ −６１８４，１９９１）。（１０）ｂＦＧＦの腹腔内注入は、腫瘍中の毛細管内皮細胞の増殖を刺激することにより原発性腫瘍の増殖とその転移を増強する。腫瘍細胞自体はｂＦＧＦの受容体が欠如し、ｂＦＧＦはインビトロで腫瘍細胞の***促進因子ではない（ジェイ・エル・グロス（ＧｒｏｓｓＪＬ）ら、ｂＦＧＦＧによるインビボでの固形腫瘍増殖の調節、Ｐｒｏｃ．Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．３１：７９，１９９０）。（１１）特異的血管形成インヒビター（ＡＧＭ−１４７０）は、インビボで腫瘍増殖と転移を阻害するが、インビトロでは腫瘍細胞増殖の阻害はあまり活発ではない。これは、腫瘍細胞増殖を阻害する濃度より４対数低い濃度で血管性内皮細胞増殖を最大の半分阻害する（ディー・イングバー（Ｉｎｇｂｅｒ，Ｄ）ら、アナイオインヒビン（Ａｎａｉｏｉｎｈｉｂｉｎｓ）：血管形成を阻害し腫瘍増殖を抑制するフマギリン（ｆｕｍａｇｉｌｌｉｎ）の合成類似体、Ｎａｔｕｒｅ４８：５５５−５５７，１９９０）。また、腫瘍増殖は血管形成依存性であるという間接的な臨床的証拠がある。（１２）硝子体に対して転移性であるヒトの網膜芽細胞腫は、生存活性があり³ Ｈ−チミジンを取り込むという事実にもかかわらず１mm³未満に制限される無血管性スフェロイドになる（摘出された目から取り出しインビトロで分析した時）。（１３）卵巣癌は小さい無血管性白色の種子（１〜３mm³）として腹膜に転移する。これらの移植物は、その１つまたはそれ以上が血管新生されるまでめったに増殖しない。（１４）乳癌の血管新生の強度（エヌ・ウェイドナー（ＷｅｉｄｎｅｒＮ）ら、腫瘍血管形成は侵襲性乳癌の転移と相関する、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２４：１−８，１９９１、およびエヌ・ウェイドナー（ＷｅｉｄｎｅｒＮ）ら、腫瘍血管形成：初期乳癌における新しい有意なかつ独立の予知指標、ＪＮａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．８４：１８７５−１８８７，１９９２）と、前立腺癌（エヌ・ウェイドナー（ＷｅｉｄｎｅｒＮ）、ピー・アール・キャロル（ＣａｒｒｏｌｌＰＲ）、ジェイ・フラックス（ＦｌａｘＪ）、ダブリュー・ブルメンフェルト（ＢｌｕｍｅｎｆｅｌｄＷ）、ジェイ・フォークマン（ＦｏｌｋｍａｎＪ．）、腫瘍血管形成は侵襲性前立腺癌の転移と相関する、ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ，１４３（２）：４０１−４０９，１９９３）は、将来の転移のハイリスクと高度に相関する。（１０）ヒト皮膚黒色腫の転移は、血管新生前はまれである。血管新生の開始により、病変の厚さが増し転移のリスクが上昇する（エー・スリヴァスタヴァ（ＳｒｉｖａｓｔａｖａＡ）ら、中間の厚さ（０．７６〜４．０mmの厚さ）の皮膚黒色腫の腫瘍血管の予知的意味、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３３：４１９−４２３，１９８８）。（１６）膀胱癌では、血管形成ペプチド（ｂＦＧＦ）の尿レベルは、細胞学より高感度の疾患の状態と程度の指標である（エム・グエン（ＮｇｕｙｅｎＭ）ら、膀胱癌患者の尿中の血管形成ペプチドである塩基性繊維芽細胞増殖因子のレベルの上昇．Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．８５：２４１−２４２，１９９３）。すなわち血管形成は、癌の転移において主要な役割を果たすことは明らかである。この血管形成活性が抑制もしくは排除されればまたは制御および調節されれば、腫瘍は存在しても増殖しないであろう。病気の時は血管形成を防止することにより、新しい微小血管系の侵襲により引き起こされる傷害を避けることができるであろう。血管形成プロセスの制御を目的とする治療は、これらの疾患の排除または緩和を引き起こすであろう。従って本発明の分野において、内皮細胞増殖（例えば、特に腫瘍への血管の好ましくない増殖）を阻害する組成物および方法に対する強いニーズがある。またそのような組成物を検出し、測定し、かつ局在化するための方法に対する強いニーズがある。そのような組成物は、転移前腫瘍における内因性増殖因子の活性を克服し、腫瘍における毛細血管の形成を防止し、こうして腫瘍の増殖を阻害することができるであろう。さらにこの組成物、組成物の断片および組成物に対する特異抗体は、他の血管形成プロセス（例えば、創傷治癒および生殖）における毛細血管の形成を調節することができるであろう。当然ながら血管形成を阻害するための組成物と方法は、好ましくは非毒性であり、ほとんど副作用を引き起こさない。また組成物の結合部位または組成物の生合成の部位を検出し、測定しかつ局在化するための方法が必要とされる。この組成物および組成物の断片は、放射性および非放射性標識のために、他の分子に結合することができる。先行技術上記目的のための組成物としてプラスミノーゲン（アンギオスタチンとも呼ぶ）の最初の４つのクリングル領域（ｎｏｓ．１−４）を使用することが示唆されている。しかし内皮細胞増殖に対するアンギオスタチンの阻害作用は小さすぎて満足できない。ヒト患者の薬剤として使用される時、アンギオスタチンが有効であるためにはキログラム単位で投与しなければならず、これはもちろん実用的には使用の大きな制限となる。もう１つの欠点は、その作用が小さいことによる製造の必要量であり、これは製品を非常に高価なものにする。すなわちアンギオスタチンの発見にもかかわらず、上記目的を満足する組成物に対する大きなニーズがある。発明の要約本発明の目的は、上記ニーズを満足することである。これは本発明により達成され、本発明は、インビトロで内皮細胞増殖をそしてインビボ測定法で血管形成を調節または制御（例えば阻害）することができるタンパク質に関する。本発明はまた、そのようなタンパク質をコードする任意の核酸に関する。本発明の種々のさらなる面を、図面を参照してさらに詳細に説明する。図面の簡単な説明図１は、模式的にかつゲルで精製したタンパク質分解性ヒトクリングル１−５（Ｋ１−５）断片を示す。図２Ａ−Ｂは、Ｋ１−５の抗内皮細胞増殖活性を示し、２Ｃ−Ｄは、毛細血管内皮細胞増殖の阻害を示す。図３は、Ｋ１−５処理した内皮細胞の形態を示す。図４は、アンギオスタチンとＫ５による内皮細胞増殖の相乗的抑制を示す。図５は、ヒヨコ胚の漿尿膜（ＣＡＭ）に及ぼす本発明のＫ１−５の抗血管形成作用を示す。図６は、本発明のＫ１−５による原発性腫瘍増殖の抑制を、Ｋ１−５で処理したマウスを食塩水で処理したマウスと比較して示す。図７は、抗ｖＷＦ抗体を用いる腫瘍組織切片の免疫組織学的染色による微小血管転移の検出を示す。発明の詳細な説明第１の面において本発明は、請求の範囲第１項で定義されるタンパク質に関する。一般に本発明のタンパク質は、配列番号１に開示されるヒトクリングル１− ５と配列番号２に開示されるマウスクリングル１−５が共通に有するアミノ酸配列の少なくとも約５０％からなる。より具体的な実施態様において本発明のタンパク質は、配列番号１と２が共通に有するアミノ酸配列の約６０〜７０％、およびより具体的にはその配列の基本的にすべてを含んでなる。１つの具体的な実施態様において本発明のタンパク質は、ヒトアミノ酸配列の必須部分からなり、別の実施態様において本発明のタンパク質は、基本的にすべてのマウスアミノ酸配列からなる。本発明のタンパク質のすべての実施態様において、類似体およびその機能的断片が包含されることを理解されたい。１つの実施態様において本発明のタンパク質は、非還元ボリアクリルアミドゲル電気泳動で測定する時、約５０〜約６５キロダルトンの分子量を有する。分子量は特に、分子がグリコシル化されているかどうかに依存し、グリコシル化はまたどのように産生されたかに依存する。本発明の分子は、プラスミノーゲン分子のＬｙｓ７８〜Ａｒｇ５３０からなるプラスミノーゲン断片と実質的に同じアミノ酸配列を示す。文献では、プラスミノーゲンが開始し終了するアミノ酸の本体について議論されている。しかし本発明において本発明の分子の最も重要な特徴は、これが本明細書に記載の有利な血管形成性を有することである。すなわち本発明の分子が似ている配列はＬｙｓ７７またはＬｙｓ７８で開始し、対応してＡｒｇ５２９またはＡｒｇ５３０で終わる。本発明の好適な実施態様は分子であり、これはより具体的には、約５０〜約６０キロダルトン、好ましくは約５３〜約５７キロダルトン、および最も好ましくは約５５キロダルトンの分子量を有する。上記の広い定義によるプラスミノーゲン断片（すなわちアミノ酸配列Ｌｙｓ７８〜Ａｒｇ５３０からなる）は、プラスミノーゲンの最初の５つのクリングルドメインを含むため、Ｋ１−５とも呼ばれる。第５のドメインが存在することはすでに知られていたが、この分野の専門家の一般的な意見では、クリングルｎｏ．５はアンギオスタチンの血管形成性に寄与または共有していないというものである。すなわちプラスミノーゲンの領域１〜５のすべてからなる断片は、以前は内皮細胞の増殖阻害に関して全体として試験されていない。本発明者は、そのような新しい断片、またはそのような断片と実質的に同じ配列を示す分子についての非常に有望な結果を開示することができ、これは従来のアンギオスタチン組成物と比較すると、きわめて驚くべきことに本発明において非常に優れている。上記利点に加えて、本発明の分子はまた先行技術の分子より大きいため、より好ましい。その結果本発明の分子は、より安定であり、従って薬剤および薬剤組成物として使用するのにより好ましい。本発明は、プラスミノーゲン断片は、ヒトプラスミノーゲン、マウスプラスミノーゲン、ウシプラスミノーゲン、アカゲサルプラスミノーゲンおよびブタプラスミノーゲンよりなる群から選択される断片と類似である、上記で定義した分子に関する。本発明の分子またはタンパク質は、インビトロ測定法で内皮細胞増殖を阻害することができる。本発明のタンパク質の好適な実施態様において、このタンパク質は、配列番号１の基本的にすべての配列、またはその任意の機能性断片もしくは類似体を含む。別の実施態様において本タンパク質は、配列番号２の基本的にすべての配列、またはその任意の機能性断片もしくは類似体を含む。この機能は、本発明によってプラスミノーゲンのＫ１−５と関連するとされている、有利な内皮細胞増殖制御性に関する。本発明の別の目的は、Ｋ１−５のような本発明の分子の薬剤としての使用である。さらに本発明はまた、内皮細胞増殖を調節（例えば阻害）するために、例えば血管形成関連症状または疾患、例えば腫瘍増殖（例えば癌）、糖尿病などの治療用薬剤の製造のために上記分子を使用することに関する。従って本発明はまた、本発明の分子ならびに１つまたはそれ以上の薬剤学的に許容される担体および／または賦形剤を含む、薬剤組成物または獣医薬剤組成物に関する。この組成物は、予防および／または治療のための投与方法（例えば、非経口、局所的、経口または表面的投与）に応じて、種々の単位投与型で投与される。例えば経口投与に適した単位投与型には、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤およびトローチ剤がある。水性担体（例えば、緩衝化食塩水）のような多くの担体が使用できる。これらの溶液は、好ましくない物質は混入していない。この組成物はまた、生理学的条件に近づけるのに必要な薬剤学的に許容される補助物質（例えば、ｐＨ調整剤および緩衝化剤、毒性調整剤など、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなど）を含有してもよい。非経口投与される組成物については、例えばレミントンの薬剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ）、第１５版、マックパブリシングカンパニー（ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ）、イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）、ペンシルバニア州（１９８０）を参照されたい。本発明の組成物または調製物は、はるかに低い用量で投与してもよく、従ってその使用は既知のアンギオスタチン組成物より優れている。従ってアンギオスタチンの使用と比較する時、Ｋ１−５を含む薬剤調製物の使用は、必要量が少ないため投与が容易であり、この少用量のために薬剤が安価になる。本発明のある実施態様において、組成物は、癌転移を阻害することができる分子またはタンパク質を含む。内皮細胞増殖の阻害のための本発明の分子の半最大濃度（ＥＣ５０）は約５０pMであり、これと比較してアンギオスタチンのＥＣ５０は１３０ nMである。すなわち本発明の組成物の作用とアンギオスタチンの作用の間には５００〜１０００倍の差があり、これは顕著であり、かつ驚くべきことである。プラスミノーゲン、アンギオスタチンの最初の４つのクリングルドメインの阻害作用を個別におよび組合せて評価すると、最も強力な内皮細胞増殖阻害は、クリングル領域４をアンギオスタチンから除去した時に得られた（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，ｖｏｌ２７１，Ｎｏ４６：「ヒトアンギオスタチンのクリングルドメイン」、カオ（Ｃａｏ）らを参照されたい）。すなわちこの分野の一般的意見では、このタンパク質からクリングルｎｏ４を除去すると、より強力な断片が得られるであろうというものである。しかし驚くべきことに本発明者らは、以前は不活性であると考えられていたプラスミノーゲンのクリングル５が作用を示すのみでなく、新しい分子は他のアンギオスタチン断片の作用を低下させることが知られているクリングル４を含有することを証明した。前述のように本発明の分子は、おそらく存在するプロテアーゼや他の酵素に対するより強い耐性のために、先行技術の化合物よりヒトまたは動物の体内でより安定である。すなわちこれは半減期がより長く、これが投与頻度を低減させ投与用量を低減することができるため有利である。すなわち本発明のＫ１−５調製物は、これで治療される患者にとってより便利であり、また先行技術のアンギオスタチンまたはＫ５化合物より安価である。本発明の別の目的は、本発明の分子をコードする核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡである。そのような配列に相補的なｃＤＮＡ配列も包含される。すなわち本発明のさらなる目的は、厳密性条件下で上記で定義した核酸の１つに特異的にハイブリダイズする核酸である。本発明に関連して用語「特異的にハイブリダイズする」とは、その配列がＤＮＡまたはＲＮＡの複合体中で存在する時、厳密性条件下での特定のヌクレオチド配列のみへの分子の結合、２本鎖形成またはハイブリダイゼーションを意味する。本発明に関連して用語「厳密性時条件」とは、プローブが標的配列にハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしない条件を意味する。厳密性条件は配列依存性であり、異なる状況により異なるであろう。当業者は、本発明に関連して適切な条件を容易に選択することができるであろう。一般的に厳密性条件は、規定のイオン強度とｐＨで、特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。典型的には厳密性条件は、ヌクレオチドの長さに依存して、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン未満（例えば約０．０１〜１．０Ｍ）であり、ｐＨが約７．０〜８．３であり、温度が約３０℃〜６０℃である条件である。厳密性条件はまた、不安定化物質（例えば、ホルムアミド）を加えることにより達成される。本発明のそのようなヌクレオチドは、上記定義に従い任意の長さである。本発明の核酸は、インビトロ法（例えば、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）など）によりクローン化または増幅することができる。広範なクローニングおよびインビトロ増幅法が当業者に公知であり、例えばバーガーとキンメル（ＢｅｒｇｅｒａｎｄＫｉｍｍｅｒ）、分子クローニング法の指針（ＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１５２アカデミックプレス社（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＩｎｃ．）、サンジエゴ、カリホルニア州（バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）；サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）、モレキュラークローニング−実験室マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）、第１〜３版、コールドスプリングハーバーラボラトリー（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールドスプリングハーバープレス（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ）、ニューヨーク州；分子生物学の現代のプロトコール（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）、エフ・エム・アウスベル（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、現代のプロトコール（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ）；カシオン（Ｃａｓｈｉｏｎ）ら、米国特許第５０１７４７８号；およびカー（Ｃａｒ）、ヨーロッパ特許第０２４６８６４号を参照されたい。別の面において本発明は、本発明の核酸によりコードされるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に関する。そのような分子の一般的な調製法は、使用に関する後記セクションでさらに開示される。本発明の別の面は、本発明のタンパク質、ポリペプチドまたはタンパク質に対して作成した抗体である。ポリクローナル抗体の産生法は当業者に公知である。簡単に説明すると、免疫原（抗原）好ましくは精製したポリペプチド、適当な担体（例えば、ＧＳＴ、キーホールリンペットヘモシアニンなど）に結合したポリペプチド、または免疫化ベクター（例えば組換えワクシニアウイルス（米国特許第４７２２８４８号を参照されたい））に取り込まれたポリペプチドを、アジュバントと混合し、この混合物で動物を免疫する。免疫原調製物に対する動物の免疫応答を、試験血液を採取し目的のポリペプチドに対する反応性の力価を測定することにより追跡する。免疫原に対する抗体の適当に高い力価が得られたら、動物から血液を採取し血清を調製する。必要な場合は、ポリペプチドに対して反応性の抗体をさらに濃縮するために抗血清のさらなる分画を行う（例えば、コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）（１９９１）免疫学の現代のプロトコール（ＣｕｒｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、ワイリー／グリーン（Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ）、ニューヨーク州；およびハーローとレーン（ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ）（１９８９）抗体；実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ）、ニューヨーク州を参照されたい）。ある場合には、種々の哺乳動物宿主（例えば、マウス、齧歯類、霊長類、ヒトなど）からモノクローナル抗体を調製することが好ましい。そのようなモノクローナル抗体を調製するための方法の説明は、例えばスタイテス（Ｓｔｉｔｅｓ）ら（編）基礎および臨床免疫学（ＢａｓｉｃａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）（第４版）、ランゲメディカルパブリケーションズ（ＬａｎｇｅＭｅｄｌｃａｌＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ロスアルトス（ＬｏｓＡｌｔｏｓ）、カリホルニア州、およびこれらの中で引用されている文献を参照されたい；ハーローとレーン（ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ）、前述；ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）（１９８６）、モノクローナル抗体：原理と実際（ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ）（第２版）、アカデミックプレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）、ニューヨーク、ニューヨーク州；およびコーラーとミルシュタイン（ＫｏｈｌｅｒａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ）（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７を参照されたい。さらなる目的は、遺伝子治療ならびにそのような遺伝子治療法における上記で定義した分子の使用である。本発明の方法は、哺乳動物の細胞を本発明のポリペプチドまたは抗体を発現するベクターでトランスフェクションすることが関与してもよい。このトランスフェクションはインビボまたはエクスビボであってもよい。エクスビボトランスフェクションは、細胞を生物に再注入することにより行うことが適している。他の方法は、哺乳動物（例えばヒト）に、本発明のポリペプチドと薬剤学的に許容される賦形剤および／または担体とを含む組成物の治療上有効量を投与することを含む。遺伝子治療法の総説については、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：８０８−８１３；ナーベルとフェルグナー（ＮａｂｅｌａｎｄＦｅｌｇｎｅｒ）（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ１１：２１１ −２１７；ミタニとカスキー（ＭｉｔａｎｉａｎｄＣａｓｋｅｙ）（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ１１：１６２−１６６；ムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ９２６−９３２；ディロン（Ｄｉｌｌｏｎ）（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ１１：１６７−１７５；ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ３５７：４５５−４６０；バンブルント（ＶａｎＢｒｕｎｔ）（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６（１０）：１１４９−１１５４；ビグネ（Ｖｉｇｎｅ）（１９９５）ＲｅｓｔｏｒａｔｉｖｅＮｅｕｒｏｌｏｇｙａｎｄＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ８：３５−３６；クレマーとペリコデット（ＫｒｅｍｅｒａｎｄＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ）（１９９５）ＢｒｉｔｉｓｈＭｅｄｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ５１（１）３１−４４；ハッダダ（Ｈａｄｄａｄａ）ら（１９９５）微生物学と免疫学の現代のトピック（ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、ドエーファーとベーム（ＤｏｅｒｆｌｅｒａｎｄＢｏｅｈｍ）（編）スプリンガー−フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ハイデルベルグ、ドイツ；およびユー（Ｙｕ）ら、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｈｙ（１９９４）１：１３−２６を参照されたい。本発明のさらなる目的は、内皮細胞増殖、特に血管形成により仲介される疾患とプロセスの治療法を提供することである。治療されるそのような疾患の１つは癌である。従い本発明は、血管形成性疾患を有するヒトまたは動物の治療法であって、非還元性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定する時約５０〜６５キロダルトンの分子量を有し、プラスミノーゲン分子のＬｙｓ７８〜Ａｒｇ５３０からなるプラスミノーゲン断片のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する分子またはタンパク質を、該ヒトまたは動物に投与することを特徴とする上記方法に関する。好適な実施態様において本タンパク質は、約５０〜６５キロダルトン、好ましくは約５３〜５７キロダルトン、最も好ましくは約５５キロダルトンの分子量を有する。本発明の方法は、ヒトプラスミノーゲン、マウスプラスミノーゲン、ウシプラスミノーゲン、アカゲサルプラスミノーゲンおよびブタプラスミノーゲンよりなる群から選択されるプラスミノーゲン断片と実質的に同じ分子を使用してもよい。すなわち本発明は、プラスミノーゲンのクリングル１−５のタンパク質分子類似体ならびにその使用法を包含する。従って以前は既知のアンギオスタチン分子に加えられた新しい部分は、プラスミノーゲンのクリングルｎｏ５であり、これは別に後述する。従来の試験では、プラスミノーゲンのクリングルｎｏ５はある阻害作用のみを有することを示した（本出願人により１９９６年１２月１２日に出願された米国特許出願第０８／７６３５２８号を参照されたい。これは本特許の出願時には秘密であり、従って本明細書に参照される）。しかしＫ５単独の作用は、本発明の分子の作用より数百倍弱い。さらに本発明の分子の内皮細胞増殖阻害作用は、Ｋ１−４とＫ−５の作用を単に加えたものよりはるかに優れている。本発明はまた、体液中の阻害性ペプチドの有無を検出するための、および内皮細胞増殖を制御するためにそのような化合物の治療上有効量が必要な患者に、ペプチドまたはそのペプチドに特異的に結合する抗体を投与するための、診断法および治療法を包含する。さらに阻害性ペプチドは、ペプチドの阻害作用を軽減する化合物について試験するために、すなわち内皮細胞増殖の阻害を克服または反転することができる増殖因子または他の化合物についてスクリーニングするために、インビトロで増殖している内皮細胞培養物とともに使用してもよい。すなわち本発明の別の面は、本発明の核酸、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドが使用されるスクリーニング測定法である。一般的な免疫測定法の総説は、例えばＭｅｔｈｏｄｓｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ、第３７巻；細胞生物学における抗体（ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ）、アサイ（Ａｓａｉ）編、アカデミックプレス社（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＩｎｃ）、ニューヨーク（１９９３）；基礎および臨床免疫学（ＢａｓｉｃａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）（第７版）、スタイテスとター（ＳｔｉｔｅｓａｎｄＴｅｒｒ）ら（編）（１９９１）を参照されたい。免疫測定法は競合的または非競合的でもよい。すなわち本発明はまた、同じ機能を示すが分子量が小さいためより好ましい、Ｋ１−５の代替物として有用な分子の検出を目的としたスクリーニング測定法を包含する。すなわち本発明の方法は、Ｋ１−５と同じ標的に結合し、従って同等の治療作用を示すペプチドまたはポリペプチドまたはさらにはタンパク質の検出を目的とする。本発明の方法により検出されるペプチドまたはポリペプチドまたはさらにはタンパク質もまた、本発明の範囲内にあり、従って本発明のさらなる面は、本発明好ましくは配列番号１と配列番号２により規定されるＫ１−５と同じ受容体に結合するペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。本発明のさらに別の目的は、生物学的液体試料（例えば体液または組織）中のインヒビターの存在および／または量を検出するための、診断法または予防法または測定法、およびキットを提供することである。さらに本発明はまた、本明細書で規定されるインヒビターの局在化のための組織学的キットに関する。本発明の別の目的は、インヒビターの生合成と分解を追跡するための分子プローブ、本発明のインヒビターに特異的な抗体、該インヒビターのウイルスに対するペプチドアゴニストとアンタゴニストの開発、抗インヒビター受容体特異抗体アゴニストとアンタゴニスト、およびインヒビターに結合した細胞障害性物質を提供することである。本発明のさらに別の目的は、特に限定されないが、血管腫、固形腫瘍、白血病、転移、毛細血管拡張症、乾癬、強皮症、血管拡張性肉芽腫、心筋血管形成、プラーク血管新生、冠状側枝、脳側枝、動静脈形成異常、虚血性四肢血管形成、角膜疾患、皮膚潮紅、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、後水晶体線維形成症、関節炎、糖尿病血管新生、黄斑変性、創傷治癒、消化性潰瘍、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）関連疾患、骨折、ケロイド、脈管形成、造血、***、月経、胎盤形成、および猫ひっかき熱を含む血管形成により仲介される疾患およびプロセスを治療するための方法と組成物を提供することである。本発明の別の目的は、癌の増殖を治療または抑制するための組成物を提供することである。本発明の目的は、インビボまたはインビトロで本発明のインヒビターを産生する酵素の産生または活性を調節または模倣する化合物を提供することである。本発明のさらなる目的は、そのような治療を必要とするヒトまたは動物にインヒビターＤＮＡを直接注入することにより、インヒビターまたは抗インヒビター抗体を提供することである。本発明の目的は、体液中のインヒビターに特異抗体の存在を検出および定量するための方法を提供することである。本発明の別の目的は、癌の検出または予防のための方法を提供することである。本発明の別の目的は、インビボおよびインビトロでインヒビター結合部位を視覚化または定量するための組成物を提供することである。本発明のさらに別の目的は、インヒビター生合成の検出と定量で使用するための組成物を提供することである。本発明のさらに別の目的は、副作用の小さい癌の治療法、例えば上記で定義した分子を利用する遺伝子治療法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、本発明の内皮細胞増殖インヒビターまたは細胞障害性物質に結合したインヒビターペプチド断片を含む組成物を提供することである。本発明の別の目的は、インヒビター関連組成物の特定の位置への標的化供給法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、内皮細胞増殖の調節、例えば血管形成プロセスの遺伝子治療法に有用な組成物および方法を提供することである。本発明のこれらおよび他の目的、特徴および利点は、開示された実施態様および添付の請求の範囲の以下の詳細な説明を検討すれば明らかになるであろう。図面の詳細な説明図１タンパク質分解性ヒトＫ１−５断片（Ａ）Ｇｌｕ¹プラスミノーゲンをウロキナーゼ活性化プラスミンで消化して、ヒトプラスミノーゲンのＫ１−５断片を得た。プラスミンの切断部位は、Ｎ− 末端の２つの陽性に荷電したＬｙｓ７６（７７）とＬｙｓ７７（７８）、およびＣ −末端のＡｒｇ５２９（５３０）とＬｙｓ５３０（５３１）である。Ｌｙｓ７７〜Ａｒｇ５２９の間の領域を含有するＫ１−５断片をリジン−セファロースクロマトグラフィーにより精製し、次にセファデックスＧ−７５カラムにより精製した。（Ｂ）精製したＫ１−５を１０〜１５％ＳＤＳ勾配ポリアクリルアミドゲルで分析した。分子量標準物質をキロダルトンで左に示す。図２抗内皮細胞増殖活性と毛細血管内皮細胞増殖の阻害ヒトプラスミノーゲンのプラスミン消化から精製したＫ１−５を、既に記載されている（カオ（Ｃａｏ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２９４６１− ２９４６７，１９９６；カオ（Ｃａｏ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、印刷中、１９９７）ように、７２時間増殖測定法で１ng/mlのｂＦＧＦの存在下でウシ毛細血管内皮（ＢＣＥ）細胞について測定した。ＢＳＥ細胞に対するＫ１ −５の阻害活性を低濃度（０．２〜１０nM）および（Ｂ）高濃度（２０nM〜３２０nM）で試験した。（Ｃ）ＢＣＥ細胞に対するＫ１−５の半最大阻害は、約５０ pMで観察された。（Ｄ）阻害作用は可逆的である。調整培地からＫ１−５を除去した後、内皮細胞は１ng/mlのｂＦＧＦを含有する新鮮なＤＭＥＭ培地中で増殖することができる。図３Ｋ１−５処理した内皮細胞の形態種々の濃度のＫ１−５の存在下で、対照細胞（Ａ）と比較してＢＣＥ細胞の増殖を停止させた（Ｂ−Ｄ）。これらのデータは、高濃度のＫ１−５は内皮細胞に対して毒性ではないことを示唆する。図４アンギオスタチンとＫ５による内皮細胞増殖の相乗的抑制純粋なヒトアンギオスタチン（Ｋ１−４）とクリングル５(Ｋ５)をタンパク質分解性断片として得た。これら２つの内皮細胞インヒビターを、１ng/mlの塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）で刺激したウシ毛細血管内皮（ＢＣＥ）細胞に、別々にまたは一緒に加えた。１nMの濃度でアンギオスタチンは内皮細胞阻害を示さなかった。クリングル５は内皮細胞増殖を約５０％阻害した。アンギオスタチンとＫ５を一緒にＢＣＥ細胞に加えると、細胞増殖の約９５％の抑制が検出され、両方の断片が相乗的に内皮細胞増殖を阻害することを示していた。図５ヒヨコ胚の漿尿膜（ＣＡＭ）に及ぼすＫ１−５の血管形成作用既に記載されている（カオ（Ｃａｏ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２，２０６９−２０７７，１９９５）ように、種々の用量のＫ１−５を含有するメチルセルロースディスクを６日令の胚のＣＡＭに移植した。ＣＡＭの総数に対する無血管性ゾーンを有するＣＡＭの数を、パーセントとして示す。リン酸緩衝化生理食塩水を陰性対照として使用した。図６Ｋ１−５による原発性腫瘍増殖の抑制約１×１０⁶マウスＴ２４１線維肉腫細胞を、６週間令のＣ５７Ｂ１６／Ｊマウスのそれぞれの皮下に移植した。マウスを、１００μｌのＰＢＳまたは１００ μｌのＰＢＳ中の２．５mg/kg/日のＫ１−５で毎日一回全身的に処理した。（Ａ）Ｋ１−５処理マウスと対照マウスを処理の２０日目に写真を撮った。（Ｂ）腫瘍の容量をデジタルカリパーで測定し、幅×長さ×０．５２の一般的式に従って計算した。データは平均値（±ＳＥＭ）を示す。図７抗ｖＷＦ抗体を用いる腫瘍組織切片の免疫組織学的染色による微小血管密度の検出（Ａ）ＰＢＳで処理した対照腫瘍切片。（Ｂ）と（Ｃ）Ｋ１−５処理腫瘍切片。（Ｄ）高視野での腫瘍組織切片の微小血管の定量。本発明の有利な使用本発明において、内皮細胞増殖の阻害、血管形成の調節、および不要な血管形成（特に腫瘍増殖に関連する血管形成）の阻害に有効な組成物と方法が提供される。本発明は、クリングル１−５としてヒトプラスミノーゲンから得られる約４５２アミノ酸配列として性状解析されるタンパク質内皮細胞増殖インヒビターを含む。インヒビターのアミノ酸配列は、種間で少し異なる。活性インヒビター分子中のアミノ酸の数は変動し、内皮細胞阻害活性を有するすべての密接な相同的なアミノ酸配列は本発明に包含されると考えられることを理解されたい。本発明は、インビトロ測定法で内皮細胞増殖を阻害することができるヒトプラスミノーゲンの約クリングル１−５を含む組成物を、好ましくない内皮細胞増殖を有するヒトまたは動物に投与することにより、好ましくないかつ制御できない内皮細胞増殖により仲介される疾患およびプロセス（例えば血管形成）を治療するための方法と組成物を提供する。好ましくは単離されたタンパク質は少なくとも純度約８０％であり、さらに好ましくは少なくとも純度約９０％であり、さらに好ましくは少なくとも純度約９０％である。本発明は、腫瘍の治療またはその増殖の抑制に特に有用である。血管新生前の転移腫瘍を有するヒトまたは動物へのインヒビターの投与は、腫瘍の増殖または拡大を防止するのに有用である。本発明はまた、内皮細胞増殖インヒビターをコードするＤＮＡ配列、内皮細胞増殖インヒビターをコードするＤＮＡ配列を含有する発現ベクター、および該インヒビターをコードするＤＮＡ配列を含有する１つまたはそれ以上の発現ベクターを含有する細胞を包含する。本発明はまた、内皮細胞増殖インヒビターをコードするＤＮＡ配列を患者に導入してインビボのインヒビターレベルを修飾する、遺伝子治療法を包含する。本発明はまた、生物学的流体および組織中の内皮細胞増殖インヒビターの検出と測定のための、および組織と細胞中のインヒビターの局在化のための、診断法とキットを包含する。この診断法とキットは、当業者に公知の任意の構成でよい。本発明はまた、内皮細胞増殖インヒビターに特異的な抗体およびその部分、かつ内皮細胞増殖インヒビターに特異的な抗体の結合を阻害する抗体とを包含する。これらの抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。内皮細胞増殖インヒビターに特異的な抗体は、血管形成により仲介される癌または他の疾患の発生または再発の診断または予知的である、インヒビターの存在と量を検出するための診断キットで使用することができる。内皮細胞増殖インヒビターに特異的な抗体はまたヒトまたは動物に投与して、インヒビターに対してヒトまたは動物を受動的に免疫し、こうして血管形成阻害を低減することができる。本発明はまた、体液中の内皮細胞増殖インヒビターに結合する抗体の存在と量を検出するための、診断法とキットを包含する。この診断法とキットは、当業者に公知の任意の構成でよい。本発明はまた、インヒビターの受容体に結合し、適切なシグナルを細胞に伝達し、かつアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する、抗インヒビター受容体特異抗体を包含する。本発明はまた、特に限定されないが、陽電子放射断層撮影法、オートラジオグラフィー、フローサイトメトリー、放射受容体結合測定法、および免疫組織学を含む方法を用いて、インヒビター結合部位の検出と視覚化で使用される他の分子またはタンパク質でアイソトープで標識することができるインヒビターペプチド断片および類似体を包含する。これらのインヒビターペプチドおよび類似体はまた、インヒビター受容体でアゴニストおよびアンタゴニストとして作用し、こうして内皮細胞増殖インヒビターの生物活性を増強または阻止する。このようなペプチドは、インヒビターに特異的に結合することができる受容体分子の単離で使用される。本発明はまた、治療および研究応用のために細胞障害性物質に結合した、内皮細胞増殖インヒビター、インヒビター断片、インヒビターに特異的な抗血清、およびインヒビター受容体アゴニストおよび受容体アンタゴニストを包含する。さらに、インヒビター、その断片、これに特異的な抗血清、インヒビター受容体アゴニストおよびインヒビター受容体アンタゴニストは、薬剤学的に許容される賦形剤と組合わされ、かつ除放性化合物または組成物（例えば生体分解性ポリマーおよびマトリックス）と随時組合わされて、治療用組成物を形成する。本発明は、内皮細胞増殖インヒビターの転写と翻訳に関与するリボ核酸およびデオキシリボ核酸の分子プローブを包含する。これらの分子プローブは、組織および細胞中のインヒビター生合成を検出および測定するのに有用である。インヒビターは、プラスミノーゲン（例えばヒトプラスミノーゲン）から単離されるか、または化学的方法もしくは生物学的方法により合成される（例えば、細胞培養、組換え遺伝子発現、ペプチド合成およびプラスミノーゲンまたはプラスミンのインビトロ酵素的触媒により活性インヒビターを産生する）。組換え法は、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）を使用するＤＮＡ供給源からの遺伝子増幅、逆転写酵素／ＰＣＲを使用するＲＮＡ供給源からの遺伝子増幅を含む。本発明はまた、内皮細胞増殖インヒビターをコードするＤＮＡ配列を含有するベクターを含む組成物（ここでベクターは細胞中に存在する時インヒビターを発現することができる）、ベクターを含有する細胞を含む組成物（ここでベクターは、インヒビター断片またはその類似体をコードするＤＮＡ配列を含有し、ベクターは細胞中に存在する時インヒビターを発現することができる）、およびヒトまたはヒトでない動物にベクターを含有する細胞を移植することを含む方法（ここでベクターは、インヒビターをコードするＤＮＡ配列を含有し、ベクターは細胞中に存在する時インヒビターを発現することができる）を包含する。本明細書においてインヒビターアミノ酸および核酸配列について使用される時、用語「実質的に類似」または「実質的に相同的」とは、内皮細胞増殖阻害活性と約５５kDaの分子量とを有するアミノ酸配列を意味し、これはまた、本明細書に開示の特異的なＮ−末端アミノ酸配列または分子量約５５kDaを有する内皮細胞増殖インヒビターをコードする核酸配列を有するタンパク質と高度の配列相同性を有し、本明細書に開示の特異的なＮ−末端アミノ酸配列を有するタンパク質と高度の相同性を有する。高度の相同性とは、少なくとも約８０％のアミノ酸の相同性、好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸の相同性、およびより好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸の相同性を意味する。本明細書で使用される用語「内皮細胞阻害活性」とは、一般的に血管形成を阻害する分子の能力を意味し、例えば繊維芽細胞増殖因子の存在下で培養中のウシ毛細血管内皮細胞の増殖を阻害する能力を意味する。本発明はまた、癌のような疾患の診断または予防を目的とした体液および組織中のインヒビターの検出を含む。本発明はまた、細胞および組織中のインヒビター結合部位および受容体の検出を含む。本発明はまた、インヒビターの産生を刺激し、および／または単離したインヒビターまたは好ましい精製インヒビター、またはインヒビターアゴニストもしくはアンタゴニスト、および／またはインヒビター特異的抗血清もしくはインヒビター特異的抗血清に対する抗血清を、患者に投与することにより、特に限定されないが関節炎および腫瘍を含む血管形成性疾患およびプロセスを治療または防止する方法を含む。さらなる治療法は、細胞障害性物質に結合した、インヒビター、その生物活性断片、インヒビター類似体、インヒビター特異的抗血清、またはインヒビター受容体アゴニストおよびアンタゴニストの投与を含む。従ってインヒビターに特異的に結合する抗体を使用する受動抗体療法を使用して、血管形成依存性プロセス（例えば生殖、発生、および創傷治癒と組織修復）を調節することができる。さらにインヒビター特異抗体のＦab領域に対する抗血清を投与して、内因性インヒビター特異的抗血清がインヒビターに結合する能力を阻止することができる。本発明はまた、インヒビターをコードする遺伝子が患者中で制御される遺伝子治療を包含する。遺伝子産物タンパク質の発現のために細胞にＤＮＡを移動または供給する種々の方法（遺伝子治療とも呼ばれる）は、インビボでの哺乳動物体細胞への遺伝子輸送、エヌ・ヤング（Ｎ．Ｙａｎｇ）、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．１２（４）：３３５−３５６（１９９２）（これは参照することにより本明細書の一部とする）に開示されている。遺伝子治療法は、エクスビボまたはインビボ治療法で使用するための体細胞または生殖細胞へのＤＮＡ配列の取り込みを包含する。遺伝子治療は、遺伝子を置換し、正常なまたは異常な遺伝子機能を増強し、かつ感染症および他の病状と戦うのに機能する。遺伝子治療を用いてこれらの医学的問題を治療する方策は、治療的方策（例えば、欠陥遺伝子を同定し、次に機能性遺伝子を加えて欠陥遺伝子の機能を置換するかまたはわずかに機能性の遺伝子を増強する）、または予防的方策（例えば、遺伝子を産物タンパク質に加えて、これは症状を治療するかまたは組織または臓器が治療法をより受け入れやすくする）を含む。予防的方策の例として、インヒビターをコードする核酸配列を患者に入れ、こうして血管形成の発生を防止するか；または、腫瘍細胞を放射性に対してより感受性にする遺伝子を挿入し、次に腫瘍の放射線照射により、腫瘍細胞の死滅を増やす。インヒビターＤＮＡまたはインヒビター制御配列の輸送のための多くのプロトコールが本発明で企図される。インヒビターに特異的に結合して通常見いだされるもの以外のプロモーター配列、またはインヒビタータンパク質の産生を増加させる他の配列のトランスフェクションもまた、遺伝子治療法として企図される。この技術の例はトランスカリオティック・セラピーズ・インク（ＴｒａｎｓｋａｒｙｏｔｉｃＴｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｉｎｃ）（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）中に見いだされ、相同的組換えを使用して、細胞中のエリスロポエチン遺伝子のスイッチを入れる「遺伝子スイッチ」を挿入する。ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＮｅｗｓ、１９９４年４月１５日を参照されたい。そのような「遺伝子スイッチ」は、通常はインヒビター（またはインヒビター受容体）を発現しない細胞中でインヒビター（またはインヒビター受容体）を活性化するのに使用することができるであろう。遺伝子治療のための遺伝子輸送法は３つの広い範疇に分類される−物理的（すなわち、電気穿孔法、直接遺伝子輸送法、および粒子衝撃法）、化学的（脂質ベースの担体、または他の非ウイルス性ベクター）、および生物学的（ウイルス由来ベクター、および受容体取り込み）。例えばＤＮＡで被覆されたリポソームを含む非ウイルスベクターが使用される。そのようなリポソーム／ＤＮＡ複合体は、患者に直接静脈注射してもよい。リポソーム／ＤＮＡ複合体は肝臓中で濃縮され、そこでマクロファージおよびクプファー細胞にＤＮＡを供給する。これらの細胞は寿命が長く、従って供給されたＤＮＡの長期発現を提供する。さらにベクターまたは遺伝子の「裸の」ＤＮＡを、治療用ＤＮＡの標的供給のために、所望の臓器、組織または腫瘍に直接注入してもよい。遺伝子治療法はまた、供給部位により説明することができる。遺伝子を供給するための基礎的な方法には、エクスビボ遺伝子輸送法、インビボ遺伝子輸送法、およびインビトロ遺伝子輸送法がある。エクスビボ遺伝子輸送法では、患者から細胞を取り、細胞培養で増殖させる。ＤＮＡを細胞にトランスフェクションし、トランスフェクションした細胞の数を拡張し、次に患者に再移植する。インビトロ遺伝子輸送法では、形質転換した細胞は培養して増殖している細胞（例えば組織培養細胞）であり、特定の患者からの特定の細胞ではない。これらの「実験室」細胞をトランスフェクションし、トランスフェクションした細胞を選択し、患者への移植のためにまたは他の用途のために拡張する。インビボ遺伝子輸送法では、細胞が患者中にある時に患者の細胞にＤＮＡを導入する。この方法では、非感染性ウイルスを使用して、患者の部位に患者の遺伝子を供給するかまたは裸のＤＮＡを注入し、遺伝子産物タンパク質が発現される細胞のパーセントによりＤＮＡを取り上げる。さらに本明細書に記載の他の方法（例えば「遺伝子銃」の使用）が、内皮細胞増殖インヒビターＤＮＡまたはインヒビター制御配列のインビトロ挿入のために使用される。遺伝子治療の化学的方法では、脂質ベースの化合物（必ずしもリポソームではない）を使用して、細胞膜を超えてＤＮＡを運ぶ。リポフェクチンまたはサイトフェクチン、陰性に荷電したＤＮＡに結合する脂質ベースの陽性イオンは、複合体を形成し、これは細胞膜を横断し、細胞の内側にＤＮＡを提供する。別の化学的方法では、受容体ベースのエンドサイトーシスを使用し、これは特異的リガンドを細胞表面受容体に結合させ、これを成長させ、細胞膜を横断して運搬する。リガンドはＤＮＡに結合し、全複合体は細胞内に運搬される。リガンド遺伝子複合体は血流中に注入され、次に受容体を有する標的細胞はリガンドに特異的に結合し、リガンド−ＤＮＡ複合体を細胞内に運搬する。多くの遺伝子治療法が、ウイルスベクターを使用して遺伝子を細胞に挿入する。例えばエクスビボ法では改変レトロウイルスベクターを使用して、遺伝子を末梢血および腫瘍浸潤性リンパ球、肝細胞、上皮細胞、筋細胞、または他の体細胞中に導入する。これらの改変細胞は次に患者に導入されて、挿入されたＤＮＡから遺伝子産物を提供する。インビボプロトコール使用して細胞内に遺伝子を挿入するのに、ウイルスベクターがまた使用されている。組織特異的であることが公知の、外来遺伝子、ｃｉｓ作用性制御要素またはプロモーターの直接の組織特異的発現を使用することができる。あるいはこれは、インビボで特定の解剖的構造部位へのＤＮＡまたはウイルスベクターのｉｎｓｉｔｕ送達を使用して行われる。例えばインビボの血管への遺伝子輸送は、選択された部位または動脈壁にインビトロで形質導入した内皮細胞を移植することにより行った。ウイルスは、遺伝子産物を発現した周りの細胞も感染させた。ウイルスベクターは例えばカテーテルによりインビボ部位に直接送達することができ、従ってある領域のみがウイルスに感染されることを可能にし、長期の部位特異的遺伝子発現を提供する。レトロウイルスベクターを使用するインビボの遺伝子輸送はまた、改変ウイルスを臓器につながる血管へ注入することにより、哺乳動物組織および肝臓組織中で証明されている。遺伝子治療プロトコールで使用されているウイルスベクターは、特に限定されないが、レトロウイルス、または他のＲＮＡウイルス（例えばポリオウイルスまたはシンドビスウイルス）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、ワクシニア、および他のＤＮＡウイルスを含む。複製欠陥マウスレトロウイルスベクターは、最も広く使用されている遺伝子輸送ベクターである。マウス白血病レトロウイルスは、核コアタンパク質およびポリメラーゼ（ｐｏｌ）酵素と複合体を形成し、タンパク質コア（ｇａｇ）に入ったかつ宿主の範囲を決定する糖タンパク質エンベロープ（ｅｎｖ）に囲まれた１本鎖ＲＮＡからなる。レトロウイルスのゲノム構造は、５’および３’長い末端反復配列（ＬＴＲ）により囲まれたｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含む。レトロウイルスベクター系は、５’と３’ＬＴＲとパッケージングシグナルを含有する最小ベクターは、ベクターのパッケージング、感染および標的細胞への組み込みに充分であり、ウイルス構造タンパク質はパッケージング細胞株中でｔｒａｎｓで供給されるという事実を利用する。遺伝子輸送のためのレトロウイルスベクターの基本的な利点は、ほとんどのタイプの細胞での効率的な感染と遺伝子発現であり、標的細胞染色体ＤＮＡへの単一のコピーベクター、およびレトロウイルスゲノムの操作の容易さである。アデノウイルスは、コアタンパク質と複合体を形成しキャプシドタンパク質により囲まれた線状の２本鎖ＤＮＡからなる。分子ウイルス学の進歩により、標的細胞にインビボで新規遺伝子配列を形質導入することができるベクターを作成するためにこれらの生物の生物学を利用できるようになった。アデノウイルスベースのベクターは、高レベルで遺伝子産物ペプチドを発現する。アデノウイルスベクターは低力価のウイルスであっても高い感染効率を有する。さらにこのウイルスは無細胞ウイルス粒子として非常に感染性が高く、産生細胞株の注入は必要ではない。アデノウイルスベクターの他の可能性のある利点は、インビボで異種遺伝子の長期発現ができることである。ＤＮＡ供給の機械的方法には、フソゲニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）脂質液胞（例えばリポソームまたは膜融合のための他の液胞）、リポフェクチンのような陽イオン性脂質を取り込んでいるＤＮＡの脂質粒子、ＤＮＡのポリリジン介在移動、ＤＮＡの直接注入（例えば、胚細胞または体細胞へのＤＮＡの微量注入法）、空気で送達されるＤＮＡ被覆粒子（例えば、「遺伝子銃」で使用される金粒子）、および無機化学的アプローチ（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション）を含む。他の方法、リガンド介在遺伝子治療は、ＤＮＡと特異的リガンドと複合体形成させて、リガンド−ＤＮＡ結合体を形成させ、特定の細胞または組織にＤＮＡを向かわせる。筋肉細胞にプラスミドＤＮＡを注入することにより、トランスフェクションされ、マーカー遺伝子の持続性発現をする細胞が高率で得られることが見いだされている。プラスミドのＤＮＡは、細胞のゲノム中に組み込まれても組み込まれなくてもよい。トランスフェクションされたＤＮＡが組み込まれないことは、最終分化した非増殖組織中で長期間、細胞またはミトコンドリアのゲノム中の突然変異性挿入、欠失、または変化を引き起こす恐れがなく、遺伝子産物タンパク質のトランスフェクションと発現を可能にするであろう。特異的細胞への長期の（しかし必ずしも永久性ではない）治療遺伝子の輸送は、遺伝子疾患の治療または予防的使用を提供するであろう。受容体細胞のゲノムで突然変異が起きることなく、ＤＮＡは、遺伝子産物レベルを維持するために周期的に再注入される。外来性のＤＮＡが組み込まれないことは、種々の遺伝子産物を発現する作製体のすべてとともに、１つの細胞内でいくつかの異なる外来性ＤＮＡ作製体の存在を可能にするかも知れない。植物組織を形質転換するのに、粒子介在遺伝子輸送法が最初に使用された。粒子衝撃装置または「遺伝子銃」を用いて機動力を発生させて、標的臓器、組織または細胞の貫通を可能にする高速まで、ＤＮＡ被覆高密度粒子（例えば金またはタングステン）を加速する。粒子衝撃法は、インビトロ系、またはエクスビボもしくはインビボ法で使用して、ＤＮＡを細胞、組織または臓器に導入することができる。遺伝子輸送のための電子穿孔法は、電流を使用して細胞または組織を電子穿孔法介在遺伝子輸送に対して感受性にする。一定の電界強度を有する短い電気パルスを使用して、ＤＮＡ分子が細胞中に貫通できるように膜の透過性を上昇させる。この方法はインビトロ系、またはエクスビボもしくはインビボ法で使用して細胞、組織、または臓器中にＤＮＡを導入することができる。担体介在遺伝子輸送をインビボで使用して、細胞に外来ＤＮＡをトランスフェクションすることができる。担体−ＤＮＡ複合体は、体液または血流中に導入して、次に部位特異的に体の標的臓器または組織に向かわせることが便利である。リポソームとポリ陽イオン（例えば、ポリリジン、リポフェクチンまたはサイトフェクチン）の両方を使用することができる。細胞特異的または臓器特異的リポソームを開発することができ、こうしてリポソームが運搬する外来ＤＮＡが標的細胞により摂取される。ある細胞上の特定の受容体を標的とする免疫リポソームの注入は、受容体を有する細胞へのＤＮＡの挿入の便利な方法として使用することができる。使用されている別の担体系は、インビボの遺伝子輸送のために肝細胞にＤＮＡを運搬するアシアロ糖タンパク質／ポリリジン結合体系である。トランスフェクションされるＤＮＡは、他の種類の担体と複合体を形成し、その結果ＤＮＡは受容体細胞に運搬され、次に細胞質または核質中にとどまる。特異的に操作した液胞複合体中でＤＮＡを担体核タンパク質と結合させて、直接核に運搬することができる。本発明のインヒビターの遺伝子制御は、インヒビターの遺伝子、遺伝子に結合した制御領域、またはその対応するＲＮＡ転写体に結合する化合物を投与して、転写または翻訳の速度を修飾することにより行われる。さらにインヒビターをコードするＤＮＡ配列でトランスフェクションした細胞を患者に投与して、インヒビターのインビボ供給源を提供する。例えば細胞を、インヒビターをコードする核酸配列を含有するベクターでトランスフェクションしてもよい。本明細書において用語「ベクター」とは、特定の核酸配列を含有するかまたはこれと結合する担体を意味し、これは特定の核酸配列を細胞に運搬するのに機能する。ベクターの例には、プラスミドおよび感染性微生物（例えば、ウイルス）、または非ウイルス性ベクター（例えば、リガンド−ＤＮＡ結合体、リポソーム、脂質−ＤＮＡ複合体）がある。内皮細胞増殖インヒビターＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子は、発現列配列に機能的に結合して、インヒビターを発現することができる発現ベクターを形成することが好ましい。トランスフェクションされる細胞は、患者の正常な組織または患者の疾患組織由来でも、または患者以外の細胞でもよい。例えば患者から採取した腫瘍細胞を、本発明のインヒビタータンパク質を発現することができるベクターでトランスフェクションし、患者に再導入することができる。トランスフェクションした腫瘍細胞は患者中で、腫瘍の増殖を阻害するレベルのインヒビターを産生する。患者はヒトでもまたはヒトでない動物でもよい。さらに担体の助けを借りることなく、インヒビターＤＮＡを患者直接注入してもよい。特にインヒビターＤＮＡは、皮膚、筋肉または血液中に注入される。インヒビター発現が長時間続くか、またはインヒビターＤＮＡを周期的に投与して、細胞、組織もしくは臓器または生物学的流体中のインヒビタータンパク質の所望のレベルを維持してもよい。以下の仮説に拘束される意図はないが、腫瘍が血管形成性になるとき、１つまたはそれ以上の血管形成性ペプチド（例えば、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦなど）を放出し、これは局所的に作用し、細胞外の方向から原発性腫瘍の近辺の内皮細胞を標的とし、循環しない（または短い半減期で循環する）と考えられる。これらの血管形成性ペプチドは、原発性腫瘍がその集団を拡張し続けるために、内皮細胞インヒビター（血管形成のインヒビター）の作用を克服するのに充分な量で産生される必要がある。原発性腫瘍がいったん順調に増殖すると、これは循環流中に内皮細胞インヒビターを放出し続ける。この仮説に従うと、これらのインヒビターは原発性腫瘍からは遠いところで作用し、血管内の方向から転移の毛細血管内皮細胞を標的とし、循環し続ける。すなわちちょうど遠くの転移が血管形成を開始する時、近辺の毛細血管内皮細胞は入ってくるインヒビターにより阻害される。本発明の適切な内皮細胞増殖インヒビターの産生は、（１）本明細書に記載され図で例示されるインヒビターを同定し精製する工程、（２）精製したインヒビターのＮ−末端アミノ酸配列を決定する工程、（３）インヒビター配列の５’および３’ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーを合成で作成する工程、（４）ポリメラーゼを使用してインヒビター遺伝子配列を増幅する工程、（５）増幅した配列を適当なベクター（例えば発現ベクター）中に挿入する工程、（６）インヒビター遺伝子を発現することができる微生物または他の発現系に、ベクターを含有する遺伝子を挿入する工程、および（７）組換え法で産生したインヒビターを単離する工程、を含む組換えＤＮＡ法を使用して行われる。適切なベクターには、ウイルス、細菌および真核生物（例えば酵母）発現ベクターがある。上記方法は、「モレキュラークローニング：実験室マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）」、第２版、サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、コールドスプリングハーバープレス（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ）、１９８９（これは参照することにより本明細書の一部とする）のような実験室マニュアルに記載されている。インヒビターまたはその生物活性断片を産生するためのさらに別の方法は、ペプチド合成である。インヒビターのアミノ酸配列は、例えば自動ペプチド配列決定法により決定することができる。あるいは、例えば上記方法によりインヒビターをコードする遺伝子またはＤＮＡ配列がいったん単離されると、当該分野で公知の用手的または自動化配列法を使用してＤＮＡ配列を決定することができる。次に核酸配列は、アミノ酸配列に関する情報を与える。いったんペプチドのアミノ酸配列がわかると、「固相ペプチド合成：実用的アプローチ（ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ）」、イー．アサートンとアール・シー・シェパード（Ｅ．ＡｔｈｅｒｔｏｎａｎｄＲ．Ｃ．Ｓｈｅｒｐｐａｒｄ）、アイアールエルプレス（ＩＲＬＰｒｅｓｓ）、オックスフォード、イングランド、に例示されるような当該分野で公知の方法により、ペプチド断片を合成することができる。複数の断片を合成して、次にこれらを互いに結合させてより大きい断片を形成することができる。これらの合成ペプチド断片はまた、インビトロおよびインビボのアゴニストおよびアンタゴニスト活性について試験するために、特定の位置のアミノ酸置換を用いて作成することができる。組織に対して高親和性結合をするペプチド断片を使用して、親和性カラム上のインヒビターに結合する受容体を単離することができる。本インヒビターは、内皮細胞増殖により仲介されるかまたはこれが関与する疾患またはプロセス（例えば血管形成）の治療に有効である。本発明は、有効量のインヒビター、またはその生物活性のある断片、またはまとめて抗血管形成活性を有するインヒビター断片もしくはインヒビターアゴニストおよびアンタゴニストの組合せによる、血管形成介在疾患の治療法を含む。血管形成介在疾患は、特に限定されないが、固形腫瘍；白血病のような血液由来腫瘍；腫瘍転移；良性腫瘍、例えば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫；リウマチ様関節炎；乾癬；眼血管形成性疾患、例えば糖尿病網膜症、末熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、後水晶体線維形成症、皮膚潮紅；オスラー-ウェーバー症候群；心筋血管形成；プラーク血管形成；毛細血管拡張症；血友病性関節；血管線維腫；および創傷顆粒形成がある。インヒビターは、内皮細胞の過剰または異常刺激の疾患の治療に有用である。これらの疾患には、特に限定されないが、腸管癒着症、動脈硬化症、強皮症、および肥厚性瘢痕（すなわち、ケロイド）がある。インヒビターは、胚の着床に必要な血管新生を防ぐことにより避妊薬として使用することができる。インヒビターは、病的結果として血管形成を有する疾患、例えば、猫ひっかき病（ロシェレマナリアクイントーサ（Ｒｏｃｈｅｌｅｍｉｎａｌｉａｑｕｉｎｔｏｓａ））および潰瘍（ヘリコバクター・ピローリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ））の治療に有用である。インヒビターの合成ペプチド断片は多くの用途がある。高特異性とアヴィディティでインヒビターに結合することができる受容体に結合するペプチドは放射能標識し、オートラジオグラフィーと膜結合法を用いて結合部位の視覚化と定量に利用される。さらに短命アイソトープでインヒビターまたはそのペプチド断片を標識すると、陽電子放射断層撮影法、またはインヒビター結合部位を用いて腫瘍を局在化するための他の現代的放射線法を使用して、インビボで受容体結合部位の視覚化が可能になる。細胞障害物質（例えばリシン）はインヒビターおよびその高親和性ペプチド断片に結合され、こうしてインヒビターに結合する細胞の破壊のための手段を提供する。これらの細胞は多くの位置（特に限定されないが、微小転移巣および原発性腫瘍）で見つかる。細胞障害物質に結合したペプチドは、所望の位置への送達を最大にするように設計される。例えば標的部位に供給する血管中にカニューレを介してまたは直接標的に供給してもよい。そのような物質はまた、注入カニューレに結合した浸透圧ポンプにより制御された方法で供給される。インヒビターアンタゴニストの組合せを血管形成の刺激物質と同時に加えて、組織の血管形成を上昇させてもよい。この治療法は、転移性癌を破壊するための有効な手段を提供する。インヒビターは、疾患の治療のために他の組成物および方法と組合せ使用される。例えば腫瘍は、インヒビターと組合せて従来のように手術、放射線照射または化学療法により治療し、次に患者にインヒビターを投与して微小転移巣の休止状態を延長させ、残存する原発性腫瘍の増殖を阻害する。さらにインヒビター、その断片、インヒビター特異的抗血清、インヒビター受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、またはこれらの組合せを、薬剤学的に許容される賦形剤とともにかつ随時除放性マトリックス（例えば、生体分解性ポリマー）と組合せて、治療用組成物を形成させる。本明細書において除放性マトリックスとは、酵素的または酸／塩基加水分解または溶解により分解される物質（通常ポリマー）から作成されたマトリックスである。いったん体内に挿入されると、このマトリックスは酵素や体液の作用を受ける。除放性マトリックスは好ましくは、リポソーム、ポリラクチド（ポリ乳酸）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチドｃｏ−グリコリド（乳酸とグリコール酸の共重合体）、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖、核酸、ポリアミノ酸、アミノ酸（例えばフェニルアラニン、チロシン、イソロイシン）、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドンおよびシリコーンのような生体適合性材料から選択される。好適な生体分解性マトリックスは、ポリラクチド、ポリグリコリド、またはポリラクチドｃｏ−グリコリド（乳酸とグリコール酸の共重合体）のいずれか１つのマトリックスである。本発明の血管形成調節性治療用組成物は、固体、液体、またはエアゾルでもよく、任意の既知の投与経路により投与される。固体の治療用組成物の例には、丸剤、クリーム剤、および移植可能な投与単位を含む。丸剤は、経口的に投与され、治療用クリーム剤は局所的に投与される。移植可能な投与単位は局所的（例えば、腫瘍部位）に投与されるか、または治療用血管形成調節組成物の全身性放出のために、例えば皮下に移植される。液体組成物の例には、皮下、静脈内、動脈内注入に適した製剤、および局所的および眼内投与用の製剤がある。エアゾル製剤の例には、肺への投与のための吸入製剤がある。本発明のインヒビタータンパク質はまた、インヒビターとその受容体に特異的な抗体を作成するために使用することができる。この抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。インヒビターまたはインヒビター受容体に特異的に結合するこれらの抗体は、体液または組織中のインヒビターレベルまたはインヒビター受容体レベルを検出または定量することが当業者に公知の診断法およびキットで使用することができる。これらの試験の結果を使用して、癌および他の血管形成介在疾患の発症または再発を診断または予測することができる。インヒビターはまた、インヒビターに結合することができる抗体を検出および定量するための診断法およびキットの開発に使用することができる。これらのキットは、循環性のインヒビター特異抗体の検出を可能にする。そのような循環性抗インヒビター抗体を有する患者は、複数の腫瘍および癌によりかかりやすく、治療後または緩解期間後により癌が再発しやすい。これらの抗体のＦab断片を抗原として使用して、抗インヒビター抗体を中和するために使用することができる抗インヒビター特異的Ｆab断片抗血清を作成することができる。このような方法は、抗インヒビター抗体により循環性インヒビターの除去を低減させ、こうして循環性インヒビターレベルを有効に上昇させる。本発明の別の面は、過剰の内因性インヒビターの作用を阻止する方法である。これは、系の好ましくないインヒビターに特異的な抗体を用いて、ヒトまたは動物を受動免疫することにより行われる。この治療は、異常***、月経および胎盤形成、および脈管形成を治療するのに重要である。これは、転移プロセスに及ぼすインヒビター除去の作用を調べるための有用な手段を提供する。インヒビター特異抗体のＦab断片は、インヒビターの結合部位を含有する。この断片は、当業者に公知の方法を使用してインヒビター特異抗体から単離される。インヒビター特異的抗血清のＦab断片は、抗Ｆab断片血清を作成するための抗原として使用される。インヒビターに特異的なＦab断片に対するこの抗血清の注入は、インヒビターがインヒビター抗体に結合するのを防止する。Fab断片または抗インヒビターへのインヒビターの結合をブロックすることにより、内因性抗インヒビター抗体が和され治療的利点が得られる。この治療の真の作用は、内因性循環インヒビターが標的細胞に到達する能力を促進し、こうして転移の拡散を低減させることである。本発明は、内皮細胞増殖インヒビター活性を有するインヒビターの任意の誘導体を含むことを企図することを理解されたい。本発明は、全インヒビタータンパク質、インヒビタータンパク質の誘導体、およびインヒビタータンパク質の生物活性のある断片を含む。これらは、アミノ酸置換またはアミノ酸官能基に結合した糖もしくは他の分子を有する、インヒビター活性を有するタンパク質を含む。本発明はまた、インヒビターおよびインヒビター受容体をコードする遺伝子、ならびにこれらの遺伝子により発現されるタンパク質を含む。上記のインヒビター活性を有するタンパク質およびタンパク質断片は、単離したおよび実質的に精製したタンパク質およびタンパク質断片として、薬剤学的に許容される製剤中で、当業者に公知の調製法を使用して提供される。これらの製剤は標準的な経路により投与することができる。一般的に組合せ物は、局所的、経皮的、腹腔内、頭蓋内、脳室内、脳内、膣内、子宮内、経口、直腸内、または非経口（例えば、静脈内、脊髄内、皮下または筋肉内）経路により投与される。さらにインヒビターは、化合物の持続性放出を可能にする生体分解性ポリマー中に取り込まれ、ポリマーは薬剤送達が好ましい部位（例えば、腫瘍部位）の近傍に移植されるか、またはインヒビターがゆっくり全身性に放出されるように移植される。カニューレを介して目的の分子に高濃度のインヒビターを制御送達するために（例えば、転移増殖巣中に直接、または腫瘍への血管供給中に）浸透圧ミニポンプを使用してもよい。生体分解性ポリマーおよびその使用は、例えばブレム（Ｂｒｅｍ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７４：４４１−４４６（１９９１）（これはその全体を参照することにより本明細書の一部とする）中に詳述されている。本発明のインヒビターの投与量は、治療すべき症状または状態に依存し、ヒトまたは動物の体重や健康状態のような他の臨床的症状、および化合物の投与経路に依存する。ヒトまたは動物を治療するためには、約５mg/kg/日を毎日一回投与すると、腫瘍増殖が５０％以上抑制される。同じ投与量では、アンギオスタチンは何の作用もない。特定の動物またはヒトでのインヒビターの半減期に依存して、インヒビターは１日に数回〜週に一回で投与することができる。本発明はヒトおよび獣医目的の使用も有することを理解されたい。本発明の方法は、同時にまたは長期間にわたって、単回ならびに複数回投与を企図する。本インヒビター製剤は、経口、直腸、眼（硝子体内または眼房内を含む）、鼻内、局所的（頬内および舌下を含む）、子宮内、膣内、または非経口（皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮内、頭蓋内、気管内、および硬膜外）投与に適したものを含む。インヒビター製剤は、単位投与型で提供することが便利であり、従来の薬剤学的方法により調製される。そのような方法は、活性成分と薬剤担体または賦形剤を一緒にする工程を含む。一般に製剤は、活性成分と液体担体または微細固体担体またはその両方とを均一および密接に一緒にし、次に必要であれば、生成物を成形して調製される。非経口投与に適した製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤を含有してもよい水性および非水性無菌注射溶液、および製剤を目的の受容体の血液と等張にする溶質；および懸濁剤や濃化剤を含有してもよい水性および非水性無菌懸濁剤がある。製剤は単位投与容器または複数回投与容器（例えば、密封したアンプルおよびバイアル）で提供してもよく、凍結乾燥状態で保存され、使用直前に無菌液体担体（例えば注射水）を添加するのみでよい。即時注射溶液および懸濁液は、前記した種類の無菌散剤、顆粒剤および錠剤から調製してもよい。好適な単位投与製剤は、投与される成分の１日の用量または単位、１日の分割用量、またはその適当な割合を含有するものである。上記した成分以外に本発明の製剤は、目的のタイプの製剤に関して当該分野で常用される他の物質を含有してもよいことを理解されたい。場合により細胞障害物質を取り込むか、またはインヒビタータンパク質またはその機能性ペプチド断片と組合せて、患者に２重治療法を提供してもよい。本発明の血管形成阻害性ペプチドは、標準的微小化学設備で合成することができ、純度をＨＰＬＣと質量スペクトル法によりチェックすることができる。ペプチド合成法、ＨＰＬＣ精製法および質量スペクトル法は、当業者に公知である。インヒビターペプチドおよびインヒビター受容体ペプチドはまた、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または酵母発現系で産生され、カラムクロマトグラフィーで精製される。無傷のインヒビター分子の異なるペプチド断片は、特に限定されないが以下を含むいくつかの応用で使用するために合成することができる：特異的抗血清の開発のための抗原として、インヒビター結合部位で活性なアゴニストおよびアンタゴニストとして、インヒビターに結合する細胞の標的死滅のための細胞障害物質に結合したかまたはこれと組合わされるペプチドとして。これらのペプチドを構成するアミノ酸配列は、分子の外部領域上のその位置に基づき選択され、抗血清への結合に利用できる。インヒビターのアミノ末端およびカルボキシ末端ならびに分子の中間領域は、合成される断片の間で別々に示される。ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）、ブルークハーベンプロテイン（ＢｒｏｏｋｈａｖｅｎＰｒｏｔｅｉｎ）、スイス−プロット（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）、およびピーアイアール（ＰＩＲ）のようなタンパク質配列データベースを使用して、これらのペプチド配列を既知の配列と比較して、配列相同性の可能性を調べる。この情報は、他の分子と高度の配列相同性を示す配列の排除を促進し、こうしてインヒビターに対する抗血清、アゴニストおよびアンタゴニストの開発において高い特異性に対する可能性を上昇させる。インヒビターおよびインヒビター由来ペプチドは、標準的方法を使用して他の分子に結合させることができる。インヒビターのアミノ末端とカルボキシ末端の両方は、チロシンとリジン残基を含有し、多くの方法を用いてアイソトープでおよび非アイソトープで、例えば常法（チロシン残基−クロラミンＴ、ヨードゲン、ラクトペルオキシダーゼ；リジン残基−ボルトンハンター試薬）を用いて標識することができる。これらの結合法は当業者に公知である。あるいはチロシンまたはリジンを、これらの残基を持たない断片に加えて、ペプチド上の各アミノ基およびヒドロキシル基の標識を促進する。結合法は、アミノ酸上の利用できる官能基（特に限定されないが、アミノ、スルフヒドリル、カルボキシル、アミド、フェノール、およびイミダゾール基を含む）に基づいて選択される。これらの結合をさせるのに使用される種々の試薬には特に、グルタルアルデヒド、ジアゾ化ベンジジン、カルボジイミド、およびｐ−ベンゾキノンがある。インヒビターペプチドは種々の応用のために、アイソトープ、酵素、担体タンパク質、細胞障害物質、蛍光分子、発光性、生物発光性化合物、および他の化合物に化学的に結合される。結合反応の効率は、特異的反応に適した異なる技術を使用して決定される。例えば¹²⁵Ｉを用いるインヒビターペプチドの放射能標識は、クロロミンＴと高比活性のＮａ¹²⁵Ｉを使用して行われる。反応はメタ重亜硫酸ナトリウムを用いて停止させ、混合物をディスポのカラムで脱塩する。標識ペプチドをカラムから溶出し、画分を集める。各画分からアリコートを取り、ガンマカウンターで放射能を測定する。こうして未反応のＮａ¹²⁵Ｉが標識インヒビターペプチドから分離される。最も高い比放射活性を有するペプチド断片を、以後の使用（例えばインヒビター抗血清に結合する能力の分析）のために保存する。ペプチド結合の他の応用は、ポリクローナル抗血清の産生である。例えばリジン残基を含有するインヒビターペプチドは、グルタルアルデヒドを使用して、精製したウシ血清アルブミンに結合される。反応の効率は、放射能標識ペプチドの取り込みを測定することにより決定される。未反応グルタルアルデヒドとペプチドを透析により分離する。結合体を以後の使用のために保存する。インヒビターに特異的な抗血清、インヒビター類似体、インヒビターのペプチド断片およびインヒビター受容体を作成することができる。ペプチド合成と精製後、当業者に公知の確立された技術を使用してモノクローナルとポリクローナル抗血清の両方を作成する。例えばポリクローナル抗血清は、ウサギ、ヒツジ、ヤギまたは他の動物で作成してもよい。担体分子（例えばウシ血清アルブミン）に結合したインヒビターペプチドまたはインヒビター自体はアジュバント混合物と組合せ、乳化させ、背中、首、横腹、および時に足蹠上の複数の部位の皮下に注入する。追加注入を定期的な間隔で行う（例えば、２〜４週間毎）。注入の約７〜１０日後に例えば膨張後耳の端の静脈から静脈穿刺により血液試料を得る。血液試料を４℃で一晩凝固させ、約２４００ｇで４℃で約３０分間遠心分離する。血清を採取し、アリコートを取り、４℃で保存してすぐ使用するかまたは後の分析に使用する。ポリクローナル抗血清の作成からのすべての血清試料またはモノクローナル抗血清の産生からの培地試料を、抗体力価について分析する。いくつかの手段（例えば、ドットブロットおよび密度分析、およびプロテインＡ、第２抗血清、冷エタノールまたは活性炭−デキストランを使用する放射能標識ペプチド−抗体複合体の沈殿、次にガンマカウンターで活性の測定）により力価を確立する。最も高力価の抗血清はまた、市販の親和性カラムで精製する。インヒビターペプチドを親和性カラム中のゲルに結合させる。抗血清試料をカラムに通すと、抗インヒビター抗体はカラムに結合して残る。次にこれらの抗体を溶出し、集め、力価と特異性について測定評価する。最も高力価のインヒビター特異的抗血清を試験して以下を確立する：ａ）最も高い抗原の特異的結合と最も低い非特異結合が得られるような最適の抗血清希釈、ｂ）標準的排除曲線で上昇する量のインヒビターペプチドに結合する能力、ｃ）関連種の関連ペプチドおよびタンパク質との交差反応性の可能性、ｄ）血漿、尿、組織および細胞培養培地の抽出物中のインヒビターペプチドを検出する能力。インヒビターの測定のためのキットおよびインヒビター受容体もまた、本発明の一部として企図される。最も高い力価と特異性を有し血漿、尿、組織および細胞培養培地の抽出物中のインヒビターペプチドを検出することができる抗血清をさらに調べて、インヒビターの迅速で信頼性のある高感度かつ特異性の高い測定と局在化のための使いやすいキットを確立する。これらの測定キットは、特に限定されないが、以下の技術を含む：競合的および非競合的測定法、ラジオイムノアッセイ、生物発光および化学発光測定法、蛍光測定法、サンドイッチ測定法、免疫放射測定法、ドットブロット法、酵素結合測定法（ＥＬＩＳＡを含む）、マイクロタイタープレート法、尿または血液の迅速モニタリングのための抗体被覆ストリップ法またはディップスティック法、および免疫組織化学的方法。各キットについて測定法の範囲、感度、正確度、信頼性、特異性および再現性を確立する。排除または活性の標準曲線上の２０％、５０％、および８０％の点の測定内および測定間変動を確立する。研究および診療所で一般的に使用される測定キットの１つの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）キットである。インヒビターＲＩＡを以下に例示する。放射ヨード化がうまくいきインヒビターまたはインヒビターペプチドを精製した後に、最も高い力価を有する抗血清をいくつかの希釈で、適当な緩衝系中で比較的一定量の放射能（例えば１０，０００cpm）を有するチューブに加える。非特異結合を定量するために、他のチューブは緩衝液または免疫前血清を含有する。４ ℃で２４時間インキュベーション後、プロテインＡを加え、チューブをボルテックス混合し、室温で９０分間インキュベートし、約２０００〜２５００ｇで４℃ で遠心分離して、標識抗原に結合した抗体の複合体を沈殿させる。吸引して上清を除去し、ペレット中の放射能をガンマカウンターで計測する。非特異結合を引いた後に標識ペプチドの約１０％〜４０％に結合する抗血清希釈をさらに解析する。次に、放射能標識ペプチドと抗血清を含有するチューブに、既知量のペプチドを加えて、抗血清の開発に使用したインヒビターペプチドの希釈範囲（約０．１ pg〜１０ng）を評価する。さらにインキュベーション（例えば２４〜４８時間）後、プロテインＡを加え、チューブを遠心分離し、上清を除去し、ペレット中の放射能を計測する。非標識インヒビターペプチド（標準物質）による放射能標識インヒビターペプチドの排除が、標準曲線を与える。いくつかの濃度の他のインヒビターペプチド断片、異なる種からのインヒビター、および同族のペプチドを測定チューブに加え、インヒビター抗血清の特異性を解析する。種々の組織の抽出物（特に限定されないが、原発性および続発性腫瘍、ルイス肺癌、インヒビター産生細胞の培養物、胎盤、子宮、および脳、肝増殖、および小腸のような他の組織）を調製する。組織抽出物の凍結乾燥またはスピードバック（ＳｐｅｅｄＶａｃ）後、測定緩衝液を加え、異なるアリコートをＲＩＡチューブに入れる。インヒビター産生細胞の抽出物は、標準曲線に平行の排除曲線を与え、インヒビターを産生しない組織の抽出物はインヒビターから放射能標識インヒビターを排除しない。さらに、ルイス肺癌を有する動物からの尿、血漿および髄液を、増加する量で測定チューブに加える。平行の排除曲線は、組織および体液中のインヒビターを測定するためのインヒビター測定法の有用性を示している。インヒビターを含有する組織抽出物は、アリコートを逆相ＨＰＬＣに付すことによりさらに特性を解析できる。溶出液画分を集め、スピードバック（ＳｐｅｅｄＶａｃ）で乾燥し、ＲＩＡ緩衝液で復元し、インヒビターＲＩＡで分析する。インヒビター免疫反応性の最大量は、インヒビターの溶出位置に対応する画分中に存在する。測定キットは、説明書、抗血清、インヒビターまたはインヒビターペプチド、およびおそらく放射能標識インヒビター、および／または結合したインヒビター −インヒビター抗体複合体の沈殿のための試薬を提供する。キットは腫瘍があるかまたは無い動物およびヒト生物学的流体および組織抽出物中のインヒビターの測定に有用である。組織および細胞中のインヒビターの局在化に、別のキットが使用される。このインヒビター免疫組織化学キットは、説明書、インヒビター抗血清、およびおそらく阻止血清とフルオレセインイソチオシアネートのような蛍光分子または１次抗血清を視覚化するのに使用される他の試薬に結合した２次抗血清を提供する。免疫組織化学技術は、当業者に公知である。このインヒビター免疫組織化学キットは、光学顕微鏡および電子顕微鏡の両方を使用して組織切片および培養細胞中のインヒビターの局在化を可能にする。これは研究および臨床目的に使用される。例えば腫瘍を生検するかまたは集めて、組織切片をミクロトームで切断してインヒビター産生部位を調べる。この情報は癌の検出と治療において診断およびおそらく治療目的に有用である。インヒビター生合成の部位を視覚化する別の方法では、インヒビターメッセンジャーＲＮＡを探索するためのｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションで使用される核酸を放射能標識する。同様にインヒビター受容体は免疫組織化学法により局在化、視覚化、および定量される。本発明をさらに以下の例により例示するが、これらは決して本発明の範囲を限定するものと理解してはならない。それより本明細書の説明を読んだ後は、その種々の他の実施態様、修飾および同等の例が当業者には明らかであると理解すべきである。例１方法１．ヒトプラスミノーゲンからのクリングル１−５（Ｋ１−５）の調製既に記載されている（カオ（Ｃａｏ）ら、１９９６、ＪＢＣ，２７１，２９４６１−２９４６７）ようにリジン−セファロースクロマトグラフィーにより、プールしたヒト血漿からヒトプラスミノーゲンを調製した。精製したヒトプラスミノーゲンをアルカリ性溶液中でインキュベートした。消化した混合物をリジン− セファロースカラムにのせ、Ｋ１−５を０．２５ε−アミノカプロン酸勾配により溶出した。Ｋ１−５画分をセファクリル−Ｓ２００カラム（２．５×７０）でさらに精製して微量のプラスミノーゲン混入を除去した。ＳＤＳゲル電気泳動により分子量は５５，０００ダルトンであることを証明した。微量配列決定により、Ｋ１−５はプラスミノーゲンＬｙｓ７７〜Ａｒｇ５２９に対応する断片からなることが明らかになった。２．内皮細胞増殖測定法ウシの毛細血管内皮細胞を、１０％熱不活性化ＢＣＳと３ng/ml組換えヒトｂＦＧＦを有するＤＭＥＭ中で維持した。細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシンの０．０５％溶液中に分散した。ＤＭＥＭ、１０％ＢＣＳ、１％抗生物質で細胞懸濁液を作成し、血球計算器で計測した後、濃度を２５，０００細胞／mlに調整した。細胞を、ゼラチン化した２４ウェル培養プレート（０．５ml/ウェル）に蒔き、１４時間インキュベートした（３７℃、１０％二酸化炭素中）。培地を０．２５mlのＤＭＥＭ、５％ＢＣＳで交換し、異なる濃度の試料を適用した。２０分間のインキュベーション後、培地とｂＦＧＦを各ウェルに加えて、最終容量０．５ mlのＤＭＥＭ、５％ＢＣＳ、１％抗生物質および１ng/ml ｂＦＧＦを得た。７２時間インキュベーション後、細胞をトリプシンに分散し、ヘマタール（Ｈｅｍａｔａｌｌ）中に再懸濁し、コールターカウンターで計測した。例２１．ヒトプラスミノーゲンからのＫ１−５の調製：既に記載されている（カオ（Ｃａｏ）ら、１９９６、ＪＢＣ，２７１，２９４６１−２９４６７）ようにリジン−セファロースクロマトグラフィーにより、プールしたヒト血漿からヒトプラスミノーゲンを調製した。４mlのグリシン緩衝液（ｐＨ１０．５）中の約４０mgのプラスミノーゲンを、固定化ウロキナーゼ活性化プラスミン（１０モルのプラスミノーゲン／１モルのプラスミン）で２５℃で２４時間インキュベートした。消化した混合物をリジン−セファロースカラム（１．０×３０cm）にのせ、Ｋ１−５を０．２５Ｅ−アミノカプロン酸勾配により溶出した。Ｋ１−５画分をセファデックスＧ−７５カラム（２．５×９０）でさらに精製した。ＳＤＳゲル電気泳動により分子量は５５，０００ダルトンであることを証明した。微量配列決定により、Ｋ１−５はプラスミノーゲンＬｙｓ７７（７８）〜Ａｒｇ５２９（５３０）に対応する断片からなることが明らかになった。２．内皮細胞増殖測定法：ウシの毛細血管内皮細胞を、１０％熱不活性化ＢＣＳ、抗生物質および３ng/m l組換えヒトｂＦＧＦを有するＤＭＥＭ中で維持した。細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシンの０．０５％溶液中に分散した。ＤＭＥＭ、１０％ＢＣＳ、１％抗生物質で細胞懸濁液を作成し、血球計算器で計測した後、濃度を２５，０００細胞／mlに調整した。細胞を、ゼラチン化した２４ウェル培養プレート（０．５ml／ウェル）に蒔き、１４時間インキュベートした（３７℃、１０％二酸化炭素中）。培地を０．２５mlのＤＭＥＭ、５％ＢＣＳで交換し、異なる濃度の試料を適用した。２０分間のインキュベーション後、培地とｂＦＧＦを各ウェルに加えて、最終容量０．５mlのＤＭＥＭ、５％ＢＣＳ、１％抗生物質および１ng/mlｂＦＧＦを得た。７２時間インキュベーション後、細胞をトリプシンに分散し、ヘマタール（Ｈｅｍａｔａｌｌ）中に再懸濁し、コールターカウンターで計測した。３．ヒヨコ胚の漿尿膜測定法（ＣＡＭ）：３日令の白色レッグホーンの受精卵を割り、無傷の黄味を有するヒヨコ胚を１００×２０mmプラスチックシャーレに広げた。３％二酸化炭素中で３７℃で３日間インキュベーション後、１０μgのＫ１−５を含有するメチルセルロースのディスクを、各胚のＣＡＭの上に置いた。４８時間インキュベーション後、胚とＣＡＭを実体鏡により無血管ゾーンの形成について分析した。４．マウスの腫瘍試験：雄の６週令のＣ５７Ｂ１６／Ｊマウスを腫瘍試験に使用した。対数期で増殖しているマウスＴ２４１線維肉腫細胞（１×１０⁶）を採取し、ＰＢＳ中に再懸濁し、１００μｌの容量で各動物の背側正中線の皮下に移植した。各処理群と対照群で３匹のマウスを使用した。１００μｌのＰＢＳまたは１００μｌのＫ１−５の皮下注射を腫瘍細胞の注射の少し後に開始し、１日一回で合計２０日間続けた。２４時間後腫瘍が見えて存在した。２４時間後原発性腫瘍が存在した。所定の日に原発性腫瘍をデジタルカリパーでブラインドで測定した。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年９月１７日（１９９９．９．１７）【補正内容】請求の範囲１．インビトロで内皮細胞増殖を調節しインビボで血管形成を調節することができ、プラスミノーゲン分子のＬｙｓ７８〜Ａｒｇ５３０の配列の少なくとも約４１０、好ましくは少なくとも約４３５、および最も好ましくは４５３の連続的アミノ酸を含有し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定する時、分子量が約５０〜約６０、好ましくは約５３〜５７、および最も好ましくは約５５キロダルトンである、単離されたタンパク質、またはその類似体。２．血管形成を阻害することができる、請求の範囲第１項記載のタンパク質。３．配列番号１に開示されたアミノ酸配列の基本的にすべてを含み、かつヒト由来である、請求の範囲第１項または第２項に記載のタンパク質。４．配列番号２に開示されたアミノ酸配列の基本的にすべてを含み、かつマウス由来である、請求の範囲第１項または第２項に記載のタンパク質。５．請求の範囲第１〜４項までのいずれか１項に記載のタンパク質またはその機能性断片もしくは類似体の、薬剤としての使用。６．血管形成関連疾患または障害（例えば、癌または糖尿病）の治療用薬剤の製造のための、請求の範囲第１〜４項までのいずれか１項に記載のタンパク質またはその機能性断片もしくは類似体の使用。７．請求の範囲第１〜４項までのいずれか１項に記載のタンパク質またはその機能性断片もしくは類似体と、１つまたはそれ以上の薬剤学的に許容される担体および／または賦形剤とを含んでなる薬剤組成物または獣医薬剤組成物。８．請求の範囲第１〜４項までのいずれか１項に記載のタンパク質またはその機能性断片もしくは類似体をコードする核酸、またはその任意の変種。９．厳密性条件下で請求の範囲第８項記載の核酸に特異的にハイブリダイズする核酸。１０．請求の範囲第１〜４項までのいずれか１項に記載のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に対して作成された抗体。１１．請求の範囲第８項または９項に記載の核酸、請求の範囲第１〜４項までのいずれか１項に記載のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、または請求の範囲第１０項記載の抗体が使用される、スクリーニング測定法。１２．請求の範囲第８項または９項に記載の核酸、請求の範囲第１〜４項までのいずれか１項に記載のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、または請求の範囲第10項記載の抗体が使用される、診断および予知方法。１３．請求の範囲第１２項記載の方法を実施するためのキット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 49/00 Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 3/10 9/00 9/00 17/00 17/00 27/00 27/00 29/00 29/00 35/00 35/00 43/00 １０１ 43/00 １０１１７１１７１Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＣ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＧ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/47 (31)優先権主張番号９７０３０５７−１ (32)優先日平成９年８月25日(1997．8．25) (33)優先権主張国スウェーデン（ＳＥ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．インビトロで内皮細胞増殖を調節しインビボで血管形成を調節することができ、配列番号１または配列番号２に開示された配列の少なくとも約５０％を含んでなるアミノ酸を有する、単離されたタンパク質、またはその類似体。２．プラスミノーゲン分子のＬｙｓ７８〜Ａｒｇ５３０の配列を含んでなる、請求の範囲第１項記載のタンパク質、またはその機能性断片もしくは類似体。３．ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定する時、分子量が約５０〜約６０キロダルトン、好ましくは約５３〜５７キロダルトン、および最も好ましくは約５５キロダルトンである、請求の範囲第１項または第２項に記載のタンパク質、またはその機能性断片もしくは類似体。４．血管形成を阻害することができる、請求の範囲第１〜３項までのいずれか１項に記載のタンパク質、またはその機能性断片もしくは類似体。５．配列番号１に開示されたアミノ酸配列の基本的にすべてを含み、かつヒト由来である、請求の範囲第１〜４項までのいずれか１項に記載のタンパク質、またはその機能性断片もしくは類似体。６．配列番号２に開示されたアミノ酸配列の基本的にすべてを含み、かつマウス由来である、請求の範囲第１〜４項までのいずれか１項に記載のタンパク質、またはその機能性断片もしくは類似体。７．請求の範囲第１〜６項までのいずれか１項に記載のタンパク質またはその機能性断片もしくは類似体の、薬剤としての使用。８．血管形成関連疾患または障害（例えば、癌または糖尿病）の治療用薬剤の製造のための、請求の範囲第１〜６項までのいずれか１項に記載のタンパク質またはその機能性断片もしくは類似体の使用。９．請求の範囲第１〜６項までのいずれか１項に記載のタンパク質またはその機能性断片もしくは類似体と、１つまたはそれ以上の薬剤学的に許容される担体および／または賦形剤とを含んでなる薬剤組成物または獣医薬剤組成物。１０．請求の範囲第１〜６項までのいずれか１項に記載のタンパク質またはその機能性断片もしくは類似体をコードする核酸、またはその任意の変種。１１．厳密性条件下で請求の範囲第１０項記載の核酸に特異的にハイブリダイズする核酸。１２．請求の範囲第１１項記載の核酸によりコードされるペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはその機能性断片もしくは類似体。１３．請求の範囲第１２項記載のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に対して作成された抗体。１４．請求の範囲第１１項または１１項に記載の核酸、請求の範囲第１２項記載のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、または請求の範囲第１３項記載の抗体が使用される、スクリーニング測定法。１５．請求の範囲第１１項または１１項に記載の核酸、請求の範囲第１２項記載のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、または請求の範囲第１３項記載の抗体が使用される、診断および／または予知方法。１６．請求の範囲第１５項記載の方法を実施するためのキット。