JP2003515319A - パブロ、すなわちＢｃｌ−ｘＬと相互作用するポリペプチド、およびそれに関連する使用 - Google Patents

パブロ、すなわちＢｃｌ−ｘＬと相互作用するポリペプチド、およびそれに関連する使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、少なくとも部分的には、Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメインを含むポリペプチド、パブロポリペプチドの新規なＢｃｌ-ｘＬ結合ドメイン、かかるポリペプチドをコードする核酸分子、およびその使用に関する。例えば、かかるポリペプチドおよび核酸分子は、特に神経細胞のアポトーシスを調節するのに、ならびに細胞死の調節から利益を得ることができる障害の治療または予防に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、パブロ、Ｂｃｌ-ｘＬと相互作用するポリペプチド、およびそれに
関連する使用に関する。
【０００２】 （背景技術） アポトーシスは、ある種の分化細胞タイプ、例えば、造血細胞系の細胞、なら
びに他の体細胞および胚細胞の量および分布を制御するのに関係している。アポ
トーシスは、最初は、細胞収縮、膜の気泡発生、およびの細胞***において最高
点に到達するクロマチン濃縮により特徴付けられる細胞死の形態学的パターンと
して記載された(カー(Kerr)ら,1972年,ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・キ
ャンサー(Br. J. Cancer),26:239)。アポトーシスを受ける細胞は、ヌクレオソ
ーム間のＤＮＡ開裂の特徴的パターンを示す(ワイリー(Wyllie),1980年,インタ
ーナショナル・レビューズ・オブ・サイトロジー(Int. Rev. Cytol.),69:251；
アブラムズ(Abrams)ら,1993年,ディベロップメント(Development),177:29)。
【０００３】 アポローシスを調節する際に関係するタンパクｂｃｌ-２をコードする同定す
べき最初の遺伝子は、染色体の切断点ｔ(１４；１８)を有するＢ細胞リンパ腫か
らクローン化され(ツジモトら,1984年,サイエンス(Science),226:1097)、アポト
ーシスに対する細胞感受性を阻害することが示された(コリー(Cory),1994年,フ
ィロソフィカル・トランザクションズ・オブ・ザ・ロイヤル・ソサイエティ・オ
ブ・ロンドン・シリーズＢ・バイオロジカル・サイエンシズ(Philos. Trans. R.
Soc. Lond. B. Biol. Sci.)345:289)。ｂｃｌ-２に対して相同性を有するいく
つかの遺伝子、例えば、以下のものが引き続いて特徴付けられた：ＧＭ-ＣＳＦ
またはＬＰＳに応答してマクロファージで急速に誘発される８０アミノ酸タンパ
クをコードするａ１(リン(Lin)ら,1993年,ジャーナル・オブ・イムノロジー(J.
Immunol.),151,1979-1988)；マクロファージ分化を受ける骨髄細胞系の初期応答
遺伝子であるｍｃｌ-１(コゾパス(Kozopas)ら,1993年,プロシーディングズ・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッ
ド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),90:3516-3520)；
およびアポトーシスを増強しうるｂｃｌ-２相同物であるｂａｋ(チッテンデンら
(Chittenden),1995年,ネイチャー(Nature),374:733；キーファー(Kiefer)ら,199
5年,ネイチャー(Nature),374:736)。ｂｃｌ-２遺伝子産物と相互作用し、および
/または構造的に関係する他のタンパクも同定されている。例えば、Ｂｃｌ-ｘＬ
およびＢｃｌ-ｘＳ(ボイシ(Boise)ら,1993年,セル(Cell),74:597)；Ｃｅｄ-９(
ヴォークス(Vaux)ら,1992年,サイエンス(Science),258:1955)および２つのＤＮ
Ａウイルスタンパク、すなわちエプスタイン-バーウイルス(Epstein-Barr virus
)のＬＭＷ５-ＨＬおよびＢＨＲＦ-１である。
【０００４】 ｂｃｌ-ｘ遺伝子産物は、Ｂｃｌ-２タンパクファミリーに密接に関係しており
、やはり細胞をアポトーシスから保護する。Ｂｃｌ-ｘの欠損したマウスの分析
は、神経系および造血系の発生の間に未成熟な細胞の生存可能性を支持すること
を示唆する(モトヤマ(Motoyama)ら,1995年,サイエンス(Science),267,1506-1510
；マ(Ma)ら,1995年,プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA),92:4763-4767)。ヒトｂｃｌ-ｘをさらにスプライシ
ングすると、少なくとも２つの異なるｂｃｌ-ｘ ｍＲＮＡ種、すなわちｂｃｌ-
ｘＬおよびｂｃｌ-ｘＳが得られる。大きい方のｂｃｌ-ｘ ｍＲＮＡの優勢なタ
ンパク産物(２３３アミノ酸)、すなわちＢｃｌ-ｘＬは、成長因子の分泌中止に
より細胞死を阻害し(ボイシ(Boise)ら,1993年,セル(Cell),74,597-608)、その遺
伝子組換え(transgenic)発現は胸腺細胞の成熟化を変化させて成熟した胸腺細胞
の数を増加させる(カオ(Chao)ら,1995年,ジャーナル・オブ・エクスペリメンタ
ル・メディスン(J. Exp. Med.),182,821-828；グリロット(Grillot)ら,1995年,
ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン(J. Exp. Med.),182,1973-
1983)。他方、Ｂｃｌ-ｘＳは、細胞死を阻害するＢｃｌ-２の能力を阻害し、細
胞をアポトーシス的な細胞死に対してより感受性にする。付加的なネズミのＢｃ
ｌ-ｘイソ型は、Ｂｃｌ-ｘβおよびＢｃｌ-ｘΔＴＭと命名され、同定されてい
る。βイソ型はニューロンのアポトーシスを阻害し(ゴンザレス-ガルシア(Gonza
lez-Garcia)ら,1995年,プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),92:4304-4308)、ΔＴＭイソ型はＢ細胞のアポト
ーシスを阻害しうる(ファング(Fang)ら,前出)。
【０００５】 ＢＣＬ-２ファミリーのタンパクは、かくして前アポトーシスおよび抗アポト
ーシスメンバーから構成される(ファロー(Farrow)およびブラウン(Brown),1996
年,カレント・オピニオン・イン・ジェネティックス・アンド・デヴェロップメ
ント(Curr. Opin. Genet. Dev.)6:45)。Ｂｃｌ-２関連タンパクは、Ｂｃｌ-２相
同性１〜４(ＢＨ１〜４)ドメインと命名された４つの保存領域内に集中した相同
性を共有している。両親媒性のαらせんであるＢＨ３は、前アポトーシスファミ
リーメンバーにとって特に重要である(コーズマイヤー(Korsmeyer),1999年,キャ
ンサー・リサーチ(Cancer Res.),1:1693s-1700s；チッテンデン(Chittenden)ら,
1995,エンボ・ジャーナル(EMBO J),14:5589)。前アポトーシス分子は、ＢＨ３に
おいてのみＢｃｌ-２ファミリーに対して相同性を有する。Ｂｃｌ-ｘＬのＢＨ１
、ＢＨ２およびＢＨ３ドメインにより形成される疎水性の裂け目は、Ｂｃｌ-ｘ
ＬとＢＨ３含有デスアゴニストとの相互作用の原因である(ミン(Minn)ら,エンボ
・ジャーナル(EMBO J),1999年,2月1日;18(3):632-43)。
【０００６】 正常な発生に役割を果たすことに加えて、アポトーシスは病理学的な状態、例
えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)および
脊髄性筋萎縮症に関係している(例えば、パッサー(Passer)ら,ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.),1999年8月20日;274:24007を
参照)。さらに、細胞のアポトーシスを調節する能力は、望ましくない細胞増殖
、例えば、ガン細胞の増殖を制御するのに価値がある。かくして、アポトーシス
を調節することができる薬剤の同定は、研究および治療の用途において細胞の増
殖、分化および/またはアポトーシスを制御するのに有用である。
【０００７】 （発明の開示） 本発明は、少なくとも部分的には、パブロおよびそれから誘導されるポリペプ
チドがＢｃｌ-ｘＬと相互作用し、それゆえ、様々な細胞過程、特に神経細胞過
程を調節するのに調節薬として有用である。
【０００８】 従って、ある態様では、本発明は、ａ）単離された哺乳動物Ｂｃｌ-ｘＬ結合
ドメインをコードするヌクレオチド配列；ここで、該単離された哺乳動物Ｂｃｌ
-ｘＬ結合ドメインはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインと７
０％のアミノ酸配列同一性を有する；ｂ）単離された哺乳動物Ｂｃｌ-ｘＬ結合
ドメインをコードするヌクレオチド配列；ここで、該ヌクレオチド配列は、６Ｘ
ＳＳＣ中、４５℃で、その後、０.２Ｘ ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中、５０〜６５
℃で、１回またはそれ以上の洗浄により、Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメインをコードす
るＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すヌクレオチド配列の相補体にハイグリダイズする
；ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す単離された哺乳動物Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメイ
ンをコードするヌクレオチド配列；からなる群から選択されるヌクレオチド配列
を含有する単離された核酸分子を提供する。
【０００９】 ある具体例では、単離されたＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
２のほぼアミノ酸４１９〜５５９またはほぼアミノ酸４２９〜５５９に示すアミ
ノ酸配列からなる。別の具体例では、単離されたＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインがＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のほぼアミノ酸４３６〜４８９に示すアミノ酸配列からなる
。
【００１０】 ある具体例では、単離された哺乳動物Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメインが神経細胞の
アポトーシスを調節する。
【００１１】 ある具体例では、核酸分子が融合タンパクをコードする。
【００１２】 ある態様では、本発明は、ａ）単離された哺乳動物Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメイン
を含有するポリペプチド；ここで、該単離されたＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインはＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すパブロＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインと少なくとも７０％
の同一性を有するアミノ酸配列からなる；ｂ）Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメインを含有
するポリペプチド；ここで、該Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：２に示すパブロＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインと少なくとも７０％の同一性を有す
るアミノ酸配列からなる；ただし、該ポリペプチドは全長パブロポリペプチドで
はない；ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインを含有する
ポリペプチド；からなる群から選択される単離されたポリペプチドに関する。
【００１３】 別の態様では、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す単離されたＢｃｌ-ｘ
Ｌ結合ドメインを含有するポリペプチドに関する。別の具体例では、Ｂｃｌ-ｘ
Ｌ結合ドメインに対して、保存的アミノ酸置換が行われている。
【００１４】 別の態様では、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す単離されたＢｃｌ-ｘ
Ｌ結合ドメインからなるポリペプチドに関する。
【００１５】 ある具体例では、単離されたＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
２のほぼアミノ酸４１９〜５５９またはほぼアミノ酸４２９-５５９からなる。
別の具体例では、単離されたＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
のほぼアミノ酸４３６〜４８９からなる。
【００１６】 ある具体例では、単離されたＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインが神経細胞のアポトー
シスを調節する。
【００１７】 別の態様では、本発明は、単離されたＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインからなる第１
のポリペプチドと第２の非パブロポリペプチドを含有する融合タンパクに関する
。
【００１８】 別の態様では、本発明は、Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメインをコードするＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１の部分にアンチセンスである単離された核酸分子に関する。
【００１９】 さらに別の具体例では、本発明は、請求項１の核酸分子を含有するベクターに
関する。
【００２０】 さらに別の具体例では、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す異種パブロポ
リペプチドまたは単離されたＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインを安定に発現する神経細
胞系に関する。
【００２１】 さらなる態様では、本発明は、少なくとも１種の遺伝子組換えパブロタンパク
をコードする導入遺伝子(transgene)と、該少なくとも１種の遺伝子組換えパブ
ロタンパクの発現を導く少なくとも１個のプロモーター要素とを含有する非ヒト
形質転換動物に関する。
【００２２】 ある具体例では、パブロタンパクがヒトパブロである。
【００２３】 ある具体例では、非ヒト形質転換動物がマウスである。
【００２４】 ある具体例では、少なくとも１個のプロモーター要素が組織特異的な発現を導
く。
【００２５】 ある具体例では、プロモーター要素が主として神経細胞における発現を導く。
【００２６】 ある具体例では、少なくとも１個のプロモーターがＴｈｙ１.２プロモーター
およびニューロン特異的なエノラーゼプロモーターからなる群から選択される。
【００２７】 ある具体例では、遺伝子組換えパブロタンパクが切形または変形パブロタンパ
クを含有する。
【００２８】 ある具体例では、遺伝子組換えパブロタンパクがパブロの優性阻害突然変異体
である。
【００２９】 ある具体例では、形質転換動物が調節可能な発現系を含有する。
【００３０】 ある具体例では、調節可能な発現系が導入遺伝子のプロモーター要素にテトラ
サイクリン感受性トランスアクチベータータンパクと該テトラサイクリン感受性
トランスアクチベータータンパクの少なくとも１個の認識部位配列とを含有する
テトラサイクリン依存性発現系である。さらなる具体例では、テトラサイクリン
感受性トランスアクチベータータンパクがさらに転写リプレッサードメインを含
有する。
【００３１】 ある具体例では、転写リプレッサードメインがＫＲＡＢドメインである。
【００３２】 別の態様では、本発明は、パブロの機能発現が動物で起こらないように内生パ
ブロタンパクが欠失または変更されているゲノムを含有する非ヒト形質転換動物
に関する。
【００３３】 別の態様では、本発明は、パブロポリペプチドまたはそのＢｃｌ-ｘＬ結合ド
メインの活性を調節することからなる、細胞のアポトーシスを調節する方法に関
する。
【００３４】 別の態様では、本発明は、パブロポリペプチドまたはそのＢｃｌ-ｘＬ結合ド
メインの発現を調節することからなる、細胞のアポトーシスを調節する方法に関
する。
【００３５】 別の態様では、本発明は、患者の細胞におけるパブロの発現または活性を調節
することにより、患者の神経系障害を治療することからなる、患者の神経系障害
を治療する方法に関する。
【００３６】 別の態様では、本発明は、 Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメインを発現する細胞を試験化合物と接触させ、 Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメインの活性を調節する試験化合物の能力を測定すること
により、アポトーシスを調節するＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインの能力を調節する化
合物を同定することからなる、 アポトーシスを調節するＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインの能力を調節する化合物を
同定する方法に関する。
【００３７】 さらに別の態様では、本発明は、 Ｂｃｌ-ｘｌ結合ドメインを含有する細胞非含有混合物を試験化合物と接触さ
せ、 Ｂｃｌ-ｘＬと相互作用するＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインの能力を調節する試験化
合物の能力を測定することにより、Ｂｃｌ-ｘＬと相互作用するＢｃｌ-ｘＬ結合
ドメインの能力を調節する化合物を同定することからなる、 Ｂｃｌ-ｘＬと相互作用するＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインの能力を調節する化合物
を同定する方法に関する。
【００３８】 （発明を実施するための形態） 本発明は、少なくとも部分的には、パブロタンパクおよびそれから誘導された
新規なポリペプチドがＢｃｌ-ｘＬと相互作用して、アポトーシス、特に神経細
胞のアポトーシスを調節するという発見に基づいている。パブロＢｃｌ-ｘＬ結
合ドメインが特徴付けられている。さらに、パブロは、ＢＨ３ドメイン以外のド
メインを介してＢｃｌ-ｘＬと相互作用することが立証された最初の前アポトー
シスポリペプチドである。
【００３９】 本発明のこれらおよび他の態様は、以下でさらに詳細に説明する。
【００４０】 Ｉ．定義 ここで用いるように、「パブロ」(Pablo)なる用語は、前アポトーシスＢｃｌ-
ｘＬ(pro-apoptotic Bcl-xL)結合タンパクを意味する。パブロのヌクレオチド配
列およびアミノ酸配列は、すでにナガセ(Nagase)らにより同定され(ＤＮＡリサ
ーチ(DNA Research)(1996年)3:321-324)、その文献ではＫＩＡＡ０２６９と呼ば
れている。パブロのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示され、パブロ
のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されている。パブロポリペプチドは
パブロ活性を有する新規なＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインを含有する。ここで用いる
ように、「パブロ活性」または「パブロポリペプチドの活性」なる用語は、神経
細胞などの細胞のアポトーシスを調節する能力を包含する。ある具体例では、パ
ブロ活性は、標準的な技術に従ってインビボまたはインビトロで測定されるよう
に、パブロ応答性の細胞またはパブロ結合相手に対してパブロポリペプチドまた
はその部分により発揮される活性を意味する。ある具体例では、パブロ活性は、
パブロ-標的分子との関連などの直接的な活性である。ここで用いるように、「
標的分子」または「結合相手」は、パブロタンパクが天然で結合または相互作用
することにより、パブロ媒介機能が達成される分子である。好ましくは、パブロ
ポリペプチドと相互作用する結合相手は、Ｂｃｌ-ｘＬ分子である。
【００４１】 ここで用いるように、「アポトーシス」なる用語は、当該分野で公知の技術を
用いて特徴付けることができるプログラムされた細胞死を包含する。アポトーシ
ス細胞死は、例えば、細胞収縮、膜の気泡発生、および細胞***において最高点
に到達するクロマチン濃縮により特徴付けることができる。アポトーシスを受け
る細胞は、また、ヌクレオソーム間のＤＮＡ開裂の特徴的パターンを示す。ここ
で用いるように、「アポトーシスを調節すること」なる用語は、神経細胞などの
細胞のプログラムされた細胞死を調節することを包含する。ここで用いるように
、「アポトーシスを調節する」なる用語は、細胞のアポトーシスの上方調節また
は下方調節のいずれかを包含する。アポトーシスの調節は、以下でさらに詳しく
考察するが、様々な障害、例えば、神経学的な障害を改善するのに有用である。
【００４２】 ここで用いるように、「Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメイン」なる用語は、Ｂｃｌ-ｘＬ
ポリペプチドと相互作用し、好ましくはＢＨ３ドメインと有意なアミノ酸配列相
同性を有しないドメインを包含する。ここで用いるように、「ＢＨ３ドメイン」
は、アミノ酸配列Ｌｅｕ-Ａｌａ-Ｇｌｎ-Ｘａａ１-Ｇｌｙ-Ａｓｐ-Ｘａａ２-Ｍ
ｅｔ-Ａｓｐ(ここで、Ｘａａ１はＩｌｅまたはＶａｌ、Ｘａａ２はＧｌｎまたは
Ｓｅｒ)(例えば、米国特許第5,955,593号を参照)を有するドメインを包含する。
好ましいＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインは、哺乳動物、例えば、ヒトのものである。
好ましいＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインは、細胞、好ましくは神経細胞のアポトーシ
スを調節する。Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメインは、約５０、７０、９０、１２０、１
３０、１４０または１５０個のアミノ酸を含有することができる。Ｂｃｌ-ｘＬ
結合には、最少数のコアアミノ酸残基が必要であると考えられるが、付加的なア
ミノ酸残基は、最大のＢｃｌ-ｘＬ結合活性に必要とされ、例えば、Ｂｃｌ-ｘＬ
ポリペプチドとの付加的な接触残基を提供するか、あるいはコアＢｃｌ-ｘＬ結
合ドメインを安定化するか、あるいはＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインとＢｃｌ-ｘＬポ
リペプチドとの複合体を安定化することにより機能する。好ましいＢｃｌ-ｘＬ
結合ドメインは、長さが約１２０〜１５０アミノ酸残基である。より好ましくは
、Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメインは、長さが約１３０〜１４０アミノ酸である。好ま
しくはＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す。好ましいＢｃ
ｌ-ｘＬ結合ドメインは、ポリペプチド、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す
ポリペプチドのカルボキシル末端に位置する。好ましいＢｃｌ-ｘＬ結合ドメイ
ンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のほぼアミノ酸４２０、４４０または４５０〜ほぼ
アミノ酸４７０、４８０、５００、５２０、５４０または５６０を含有すること
ができる。ある具体例では、パブロＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２のアミノ酸４４５〜５５９またはアミノ酸５２２〜５５９から構成され
ない。別の具体例では、パブロＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：２のほぼアミノ酸４１９〜ほぼアミノ酸５５９またはほぼアミノ酸４２９〜ほ
ぼアミノ酸５５９を含有する。実施例７に示すように、ほぼアミノ酸４１８〜ほ
ぼアミノ酸５５９のアミノ酸配列を含有するパブロのカルボキシル末端ドメイン
は優性阻害(dominant negative)突然変異体として作用して、パブロのアポトー
シス活性を抑制する。好ましい具体例では、パブロＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインは
、ほぼアミノ酸４３６〜ほぼアミノ酸４８３を含有する。
【００４３】 Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメインに関して、「単離されたＢｃｌ-ｘＬ結合ドメイン」
なる用語は、パブロなどの全長Ｂｃｌ-ｘＬ結合分子を含有するアミノ酸残基か
ら単離または分離されたドメインを包含する。例えば、単離されたパブロＢｃｌ
-ｘＬ結合ドメインをコードする核酸分子は、パブロタンパクのＢｃｌ-ｘＬ結合
ドメインをコードするパブロ核酸分子の部分からなる。同様に、単離されたパブ
ロＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインは、Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメインのアミノ酸残基を含有
するパブロポリペプチドの部分からなる。かかる単離されたＢｃｌ-ｘＬ結合ド
メインは、それらが誘導されるパブロ分子の残部から分離される(例えば、分子
のアミノ末端アミノ酸から分離されるか、あるいは分子のアミノ末端アミノ酸を
コードするヌクレオチドから分離される)。かかる単離されたＢｃｌ-ｘＬ結合ド
メインおよびパブロＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインは、次いで、付加的なヌクレオチ
ドまたはアミノ酸配列、例えば、ベクター配列、または融合タンパクなどと組み
合わせるか、あるいは連結することができる。
【００４４】 「単離された」核酸分子は、核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離さ
れるものである。例えば、ゲノムＤＮＡに関しては、「単離された」なる用語は
、ゲノムＤＮＡが天然で関連する染色体から分離された核酸分子を包含する。好
ましくは、「単離された」核酸分子は、核酸分子が誘導される生物のゲノムＤＮ
Ａにおいて、天然で核酸分子に隣接する配列(すなわち、核酸分子の５'末端およ
び３'末端に位置する配列)が存在しない。例えば、様々な具体例では、単離され
たパブロ核酸分子は、核酸が誘導される細胞のゲノムＤＮＡにおいて、天然で核
酸分子に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０.５ｋｂまた
は０.１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有することができる。さらに、「単離
された」核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ分子は、組換え技術で製造された場合には
、他の細胞物質または培地を実質的に含有せず、あるいは化学的に合成された場
合には、化学的な前駆体や他の化学物質を実質的に含有しないことができる。「
単離された」パブロ核酸分子は、しかし、ゲノムＤＮＡにおいて、通常はパブロ
配列に隣接しない他のヌクレオチド配列に連結しうる(例えば、パブロヌクレオ
チド配列はベクター配列に連結しうる)。ある好ましい具体例では、「単離され
た」核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ分子は、また、他の細胞物質を含有しない。し
かし、他の細胞物質を含有しないパブロ核酸分子が「単離された」と見なされる
必要はない(例えば、他の哺乳動物ＤＮＡから分離され、細菌細胞に挿入された
パブロＤＮＡ分子は、依然として「単離された」を見なされる)。
【００４５】 ここで用いるように、「単離されたタンパク」または「単離されたポリペプチ
ド」とは、細胞から単離されるか、または組換えＤＮＡ技術により製造された場
合には、他のタンパク、ポリペプチド、細胞物質および培地を、あるいは化学的
に合成された場合には、化学的な前駆体または他の化学物質を、実質的に含有し
ないタンパクまたはポリペプチドを意味する。「単離された」または「精製され
た」タンパクまたはその生物学的に活性な部分は、パブロタンパクが誘導される
細胞または組織源由来の細胞物質または他の汚染タンパクを実質的に含有せず、
あるいは化学的に合成される場合には、化学的な前駆体または他の化学物質を実
質的に含有しない。「細胞物質を実質的に含有しない」なる表現はパブロタンパ
クの調製物を包含するが、この調製物では、それが分離または組換え的に製造さ
れる細胞の細胞成分からタンパクが分離されている。ある具体例では、「細胞物
質を実質的に含有しない」なる表現は、(乾燥重量により)約３０％未満の非パブ
ロタンパク(ここでは、「汚染タンパク」とも呼ばれる)、より好ましくは約２０
％未満の非パブロタンパク、さらにより好ましくは約１０％未満の非パブロタン
パク、最も好ましくは約５％未満の非パブロタンパクを有するパブロタンパクの
調製物を包含する。パブロタンパクまたはその生物学的に活性な部分が組換え的
に製造される場合、それは、また、好ましくは培地を実質的に含有しない。すな
わち、培地は、タンパク調製物の容量の約２０％未満、より好ましくは約１０％
未満、最も好ましくは約５％未満に相当する。
【００４６】 「化学的な前駆体または他の化学物質を実質的に含有しない」なる表現はパブ
ロタンパクの調節物を包含するが、この調節物では、タンパクの合成に関係する
化学的な前駆体または他の化学物質からタンパクが分離されている。ある具体例
では、「化学的な前駆体または他の化学物質を実質的に含有しない」なる表現は
、(乾燥重量により)約３０％未満の化学的な前駆体または非パブロ化学物質、よ
り好ましくは約２０％未満の化学的な前駆体または非パブロ化学物質、さらによ
り好ましくは約１０％未満の化学的な前駆体または非パブロ化学物質、最も好ま
しくは約５％未満の化学的な前駆体または非パブロ化学物質を有するパブロタン
パクの調節物を包含する。
【００４７】 ここで用いるように、「神経細胞」なる用語は、神経細胞(すなわち、ニュー
ロン、例えば、単極性、双極性または多極性ニューロン)および神経細胞前駆体
およびグリア細胞(例えば、希突起膠細胞、シュワン細胞および星状細胞などの
マクログリアまたはミクログリア)およびグリア細胞前駆体を包含する。好まし
い具体例では、本発明に用いる神経細胞は、中枢神経系または末梢神経系から得
られる哺乳動物、例えば、ヒト細胞である。神経前駆体細胞は、また、本発明の
方法を実施するのに用いることができる。ここで用いるように、「神経前駆体」
なる用語は、神経幹細胞および神経前駆細胞などの未分化の神経細胞を意味する
。ここで用いるように、「神経幹細胞」なる用語は、増殖することができ、適当
な条件下で神経前駆細胞に分化する能力を有する付加的な神経幹細胞を生じるこ
とができる未分化の神経細胞を意味する。ここで用いるように、「神経前駆細胞
」なる用語は、神経幹細胞から誘導され、適当な条件下で神経細胞に分化する未
分化の神経細胞を意味する。「神経前駆体」なる用語は、また、神経細胞に分化
するように誘発される全能性細胞(例えば、初期段階の胚に由来する、それらの
発生能力が制限されない細胞)を包含する。かかる前駆体細胞は、神経細胞の起
源として用いることができる。すなわち、本発明に用いる神経細胞は、かかる前
駆体細胞から誘導することができる。ここで用いるように、(前駆体細胞に関し
て)「誘導された」なる用語は、全能性幹細胞および多能性幹細胞から発生また
は分化し、または先祖として有する細胞を意味する。神経前駆体細胞、例えば、
神経幹細胞および/または神経前駆細胞を得る方法は、当該分野で公知である。
例えば、PCT公開第WO95/12665号(1995年5月11日付で公開)；PCT公開第WO97/0204
9号(1997年1月23日付で公開)；米国特許第5,753,506号(これらの内容は出典を示
すことにより本明細書の一部をなす)に記載のように得られた神経幹細胞および
神経前駆細胞を用いて、本発明に用いる細胞を得ることができる。
【００４８】 ここで用いるように、「パブロ活性または発現を調節する」なる用語は、細胞
におけるパブロ活性またはパブロ発現(例えば、転写または翻訳のレベルで)の上
方調節および下方調節を包含する。
【００４９】 タンパクおよび核酸分子に言及する場合の「ファミリー」なる用語は、 共通の構造的ドメインまたはモチーフを有し、かつここに定義される十分なアミ
ノ酸配列またはヌクレオチド配列の相同性を有する２個またはそれ以上のタンパ
クまたは核酸分子を意味することを意図する。かかるファミリーメンバーは、天
然に存在するか、あるいは存在しないことができ、同一または異なる種のいずれ
かに由来することができる。例えば、ファミリーはヒト起源の最初のタンパクな
らびにヒト起源の他の異なるタンパクを含有することができるか、あるいは非ヒ
ト起源の相同物を含有することができる。ファミリーのメンバーは、また、共通
の機能的特性を有しうる。
【００５０】 ここで用いるように、「未処理」なる用語は、例えば、酵母２ハイブリッドア
ッセイを用いて検出することができる分子間の検出可能な相互作用を包含するこ
とを意味する。相互作用なる用語は、また、分子間の「結合」相互作用を包含す
ることを意味する。相互作用は、天然では、タンパク-タンパクまたはタンパク-
核酸でありうる。
【００５１】 ここで用いるように、「天然に存在する」核酸分子は、天然に存在するヌクレ
オチド配列を有する(例えば、天然のタンパクをコードする)ＲＮＡまたはＤＮＡ
分子を意味する。
【００５２】 ここで用いるように、「アンチセンス」核酸は、タンパクをコードする「セン
ス」核酸に相補的な、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的な、ｍＲ
ＮＡ配列に相補的な、あるいは遺伝子のコード鎖に相補的な、ヌクレオチド配列
を含有する。
【００５３】 従って、アンチセンス核酸分子は、センス核酸分子に水素結合することができ
る。
【００５４】 ここで用いるように、「コード領域」なる用語がアミノ酸残基に翻訳されるコ
ドンを含有するヌクレオチド配列の領域を意味するのに対し、「非コード領域」
なる用語はアミノ酸に翻訳されないヌクレオチド配列の領域(例えば、５'および
３'非翻訳領域)を意味する。
【００５５】 ここで用いるように、「ベクター」なる用語は、それが連結する別の核酸分子
を輸送することができる核酸分子を意味する。あるタイプのベクターは「プラス
ミド」であり、付加的なＤＮＡセグメントに連結される環状二本鎖ＤＮＡループ
を意味する。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ここで、付加的
なＤＮＡセグメントはウイルスゲノムに連結される。ある種のベクターは、それ
らが導入された宿主細胞における自律性の複製を行うことができる(例えば、細
菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他の
ベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入により
宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さ
らに、ある種のベクターは、機能的に作用するように連結された遺伝子の発現を
導くことができる。かかるベクターは、ここでは、「組換え発現ベクター」また
は単に「発現ベクター」と呼ばれる。一般的に、組換えＤＮＡ技術における有用
な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。本明細書では、「プラ
スミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に用いられるベクター
の形態であるので、交換可能なように用いる場合がある。しかし、本発明は、か
かる他の形態の発現ベクター、例えば、等価な機能を果たすウイルスベクター(
例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス)
を包含することを意図する。
【００５６】 ここで用いるように、「宿主細胞」なる用語は、本発明の核酸分子、例えば、
本発明の組換え発現ベクターが導入されている細胞を意味することを意図する。
「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」なる用語は、ここでは、交換可能なよう
に用いる。かかる用語は、特定の被験体細胞だけでなく、かかる細胞の子孫また
は潜在的な子孫をも意味すると理解されるべきである。突然変異または環境の影
響により世代を継承する際に、ある種の変化が起こるので、かかる子孫は、実際
には、親細胞を同一ではないかもしれないが、依然として、ここで用いる用語の
範囲内に包含される。好ましくは、宿主細胞は哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞
である。特に好ましい具体例では、それは神経細胞である。
【００５７】 ここで用いるように、「異種ＤＮＡ」または「異種核酸」は、それが存在する
ゲノムの一部として天然には存在しないＤＮＡ、それが天然に存在するゲノムと
は異なるゲノムの位置(複数も可)に見出されるＤＮＡ、または、天然で通常は連
結されていないＤＮＡに機能的に作用するように連結されているＤＮＡ(すなわ
ち、異種プロモーターに機能的に作用するように連結されている遺伝子)を包含
する。異種ＤＮＡは、天然では、その位置に存在しないか、あるいはそれが導入
された細胞にとって内生的ではなく、別の細胞から得られたものである。異種Ｄ
ＮＡは同一の種または異なる種に由来することができる。ある具体例では、それ
は哺乳動物、例えば、ヒトである。それが発現される細胞にとって異種または外
来であると当業者が認識し、または考えるＤＮＡは、ここでは、異種ＤＮＡなる
用語に包含される。対照的に、内生なる用語は、核酸に関して用いられるが、宿
主細胞にとって自生のＤＮＡ、すなわち導入されたのではなく、生物の細胞また
はゲノムに天然に存在する(すなわち、分子生物学の技術により変更も導入もさ
れていない)ＤＮＡを包含する。
【００５８】 「異種タンパク」、「組換えタンパク」および「外生タンパク」なる用語は、
本明細書中で交換可能なように用いられ、組換えＤＮＡ技術により製造されるポ
リペプチドを意味する。ここで、一般的には、ポリペプチドをコードするＤＮＡ
は、適当な発現ベクターに挿入され、次いで、これを用いて宿主細胞を形質転換
して、異種タンパクを製造する。すなわち、ポリペプチドは異種核酸から発現さ
れる。
【００５９】 ここで用いるように、「形質転換動物」とは、この動物の細胞の１個またはそ
れ以上が「導入遺伝子」を含有する、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好
ましくはマウスを意味する。「導入遺伝子」なる用語は、形質転換動物が発生す
る細胞のゲノムに組み込まれ、成熟した動物のゲノムに残存し、例えば、形質転
換動物の１種またはそれ以上の細胞タイプまたは組織中でコードされた遺伝子産
物の発現を導く外生ＤＮＡを意味する。
【００６０】 ここで用いるように、「相同組換え動物」とは、この動物の発生の前に、内生
遺伝子とこの動物の細胞(例えば、この動物の胚細胞)中に導入された外生ＤＮＡ
分子との間における相同組換えにより内生遺伝子が変更されている、あるタイプ
の形質転換非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスを意味する
。
【００６１】 ここで用いるように、「抗体」なる用語は、免疫グロブリン分子および免疫グ
ロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原を結合(免疫反応)する抗
原結合部位を含有する分子、例えば、ＦａｂおよびＦ(ａｂ')２フラグメント、
単鎖抗体、細胞内抗体、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、または他のフラグメントを包含するこ
とを意図する。好ましくは、本発明の抗体は、パブロ分子に特異的にまたは実質
的に特異的に結合する。「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組
成物」なる用語は、ここで用いるように、抗原の特定のエピトープと免疫反応す
ることができる１種だけの抗原結合部位を含有する抗体分子の集団を意味するの
に対し、「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体組成物」なる用語
は、特定の抗原と反応することができる多種の抗原結合部位を含有する抗体分子
の集団を意味する。モノクローナル抗体組成物は、かくして典型的には、それが
免疫反応する特定の抗原に対して単一の結合親和性を示す。
【００６２】 ここで用いるように、「パブロ関連障害」なる用語は、パブロ活性または発現
の調節から利益を得る障害を包含する。ある具体例では、パブロ関連障害は、パ
ブロ活性または発現の調節から利益を得る神経系の障害である。パブロ関連障害
の例としては、細胞死の増加または細胞死の減少から利益を得る中枢神経系また
は末梢神経系の障害が挙げられる。例示的な障害としては、急性および慢性の神
経変性障害、例えば、卒中、アルツハイマー病、アルツハイマー病に関連する痴
呆症(例えば、ピック病)、パーキンソン病および他のびまん性レビー小体病、ハ
ンチントン病、脊髄性筋萎縮症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、進行性核
上性麻痺、癲癇およびヤコブ-クロイツフェルト病；精神医学的障害、例えば、
うつ病、精神***性障害、コルサコフ精神病、躁病、不安障害または恐怖性障害
；学習または記憶障害、例えば、健忘症または加齢性記憶喪失；および神経学的
障害、例えば、片頭痛が挙げられる。パブロ関連障害のさらなる例としては、望
ましくない細胞増殖を伴う障害、例えば、がん、特に中枢神経系または末梢神経
系のがんが挙げられる。
【００６３】 II．パブロまたはその一部をコードする単離された核酸分子 本発明の方法を実施する際には、様々な薬剤を用いて、細胞中におけるパブロ
の活性および/または発現を調節することができる。ある具体例では、薬剤はパ
ブトポリペプチドまたはその一部をコードする核酸分子である。かかる核酸分子
は、以下でさらに詳しく説明する。
【００６４】 パブロポリペプチドの分析は、パブロポリペプチドのＣ末端の約１３０個のア
ミノ酸におけるパブロとＢｃｌ-ｘＬとの相互作用を調節するタンパクの領域を
同定した。従って、ある態様では、本発明は、Ｂｃｌ-ｘＬ分子と相互作用する
パブロポリペプチドの一部をコードする核酸分子に関する。
【００６５】 ある特定のタンパクのアミノ酸配列と、このタンパクをコードすることができ
るヌクレオチド配列との間には、(以下に示す)遺伝コードで定義されるように、
公知の明確な対応性が存在する。同様に、ある特定の核酸分子のヌクレオチド配
列と、そのヌクレオチド分子によりコードされるアミノ酸配列との間には、遺伝
コードにより定義されるように、公知の明確な対応性が存在する。
【００６６】 遺伝コード アラニン(Ala、A) GCA、GCC、GCG、GCT アルギニン(Arg、R) AGA、ACG、CGA、CGC、CGG、CGT アスパラギン(Asn、N) AAC、AAT アスパラギン酸(Asp、D) GAC、GAT システイン(Cys、C) TGC、TGT グルタミン酸(Glu、E) GAA、GAG グルタミン(Gln、Q) CAA、CAG グリシン(Gly、G) GGA、GGC、GGG、GGT ヒスチジン(His、H) CAC、CAT イソロイシン(Ile、I) ATA、ATC、ATT ロイシン(Leu、L) CTA、CTC、CTG、CTT、TTA、TTG リジン(Lys、K) AAA、AAG メチオニン(Met、M) ATG フェニルアラニン(Phe、F) TTC、TTT プロリン(Pro、P) CCA、CCC、CCG、CCT セリン(Ser、S) AGC、AGT、TCA、TCC、TCG、TCT トレオニン(Thr、T) ACA、ACC、ACG、ACT トリプトファン(Trp、W) TGG チロシン(Tyr、Y) TAC、TAT バリン(Val、V) GTA、GTC、GTG、GTT 終結シグナル(末端) TAA、TAG、TGA
【００６７】 遺伝コードの重要でよく知られた特徴は、その重複性である。それにより、タ
ンパクを製造するのに用いるアミノ酸の大部分については、１個より多くのコー
ドヌクレオチドトリプレットを採用しうる(上記)。それゆえ、数多くの異なるヌ
クレオチド配列が与えられたアミノ酸配列をコードしうる。かかるヌクレオチド
は、すべての生物において同じアミノ酸配列の産生をもたらすので、機能的には
等価であるとみなされる(ある種の生物はいくつかの配列を他のものより効率的
に翻訳しうるが)。さらに、時々、プリンまたはピリミジンのメチル化変異体が
与えられたヌクレオチド配列に見出される場合がある。かかるメチル化は、トリ
ヌクレオチドコドンと対応するアミノ酸との間のコーディング関係に影響を与え
ない。
【００６８】 上記のことを考慮すれば、本発明のパブロポリペプチド(またはその一部)をコ
ードするＤＮＡまたはＲＮＡ分子のヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分
子をアミノ酸配列に翻訳するのに遺伝コードを用いて、パブロアミノ酸配列を誘
導するのに用いることができる。同様に、パブロアミノ酸配列に対して、パブロ
タンパクをコードすることができる対応のヌクレオチド配列は、遺伝コード(そ
の重複性ゆえに、与えられたアミノ酸配列に対して多数の核酸配列を生成する)
から推定することができる。かくして、パブロヌクレオチド配列に関するここで
の説明および/または開示は、また、ヌクレオチド配列によりコードされるアミ
ノ酸配列に関する説明および/または開示を包含するとみなすべきである。同様
に、ここでのパブロアミノ酸配列に関する説明および/または開示は、また、こ
のアミノ酸配列をコードすることができるすべての可能なヌクレオチド配列に関
する説明および/または開示を包含するとみなすべきである。本発明のある態様
は、パブロタンパクまたはその生物学的に活性な部分をコードする単離された核
酸分子、ならびに、パブロをコードする核酸(例えば、パブロｍＲＮＡ)を同定す
るのにハイブリダイゼーションプローブとして用いるのに十分な核酸断片および
パブロ核酸分子の増幅または変異処理のためのＰＣＲプライマーとして用いる断
片に関する。パブロ核酸分子、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すものの使用
を考察する際には、かかる核酸分子ならびに全長パブロ核酸分子の断片を用いる
ことができると理解される。ここで用いるように、「核酸分子」なる用語は、Ｄ
ＮＡ分子(例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ)およびＲＮＡ分子(例えば、ｍ
ＲＮＡ)、およびヌクレオチド類似物を用いて生成したＤＮＡまたはＲＮＡの類
似物を包含することを意図する。核酸分子は一本鎖または二本鎖であることがで
きるが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００６９】 本発明の核酸分子、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列を有す
る核酸分子またはその一部は、標準的な分子生物学的技術およびここに与えられ
る配列情報を用いて単離することができる。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の核
酸配列の全部または一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、パブ
ロ核酸分子は、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術(例え
ば、サムブルック，ジェイ(Sambrook, J.)、フリッツ，イー・エフ(Fritsh, E.F
.)およびマニアティス，ティー(Maniatis, T.)、モレキュラー・クローニング：
ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、第
２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor La
boratory)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press)、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバ
ー(Cold Spring Harbor)、1989年に記載のように)を用いて単離することができ
る。
【００７０】 さらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の全部または一部を包含する核酸分子は、ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１の配列に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマ
ー各々を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により単離することができる。
【００７１】 本発明の核酸は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを鋳型および適当な
オリグヌクレオチドプライマーとして用いて、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って
増幅することができる。このように増幅された核酸は、適当なベクターにクロー
ン化され、ＤＮＡ配列分析により特徴付けることができる。さらに、パブロブク
レオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術により、例え
ば、自動化ＤＮＡシンセサイザーを用いて、調製することができる。
【００７２】 好ましい具体例では、本発明の単離された核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
に示す核酸配列を含有する。
【００７３】 別の好ましい具体例では、本発明の単離された核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１に示すヌクレオチド配列またはその一部の相補体である核酸分子を含有する
。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１に示すヌクレオチド配列に十分に相補的なものであるので、ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１に示すヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、そ
れゆえ安定な二本鎖を形成する。
【００７４】 さらに別の好ましい具体例では、本発明の単離された核酸分子は、ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１に示すヌクレオチド配列(例えば、全長のヌクレオチド配列)または
このヌクレオチド配列のいずれかの一部(例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１により
コードされるＢｃｌ-ｘＬ結合ドメイン)に対して、少なくとも約５０％、５５％
、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％
またはそれ以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含有する。
【００７５】 さらに、本発明の核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の核酸配列の一部、例え
ば、プローブもしくはプライマーとして用いることができる断片またはパブロド
メインの生物学的に活性な部分をコードする断片だけを含有することができる。
パブロ遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列は、他のパブロフ
ァミリーメンバー、ならびに他の種に由来するパブロファミリー相同物を同定お
よび/またはクローニングするのに用いるように設計されたプローブおよびプラ
イマーの生成を可能にする。プローブ/プライマーは、典型的には、実質的に精
製されたオリグヌクレオチドを含有する。ある具体例では、オリゴヌクレオチド
は、ストリンジェントな条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のセンス配列またはＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の天然に存在する対立変異体または突然変異体の少なくとも
約１２または１５個、好ましくは約２０または２５個、より好ましくは約３０、
３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７５または１００個の保存ヌクレ
オチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含有する。別の具体例で
は、本発明の核酸分子は、長さが少なくとも約４００、４５０、５００、５５０
、６００、６５０、７００、７５０、８００、９００、１０００または１１００
ヌクレオチドであり、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の核酸分子またはその相補体にハイブリダイズするヌクレオ
チド配列を含有する。
【００７６】 別の具体例では、本発明の核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の少なくとも約
１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、
１０００または１１００連続ヌクレオチドを含有する。
【００７７】 他の具体例では、本発明の核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の少なくとも約
３００、４００、５００、６００、７００、８００または少なくとも約９００ヌ
クレオチドを含有する核酸分子と少なくとも７０％の同一性、より好ましくは８
０％の同一性、さらにより好ましくは９０％の同一性を有する。
【００７８】 パブロヌクレオチド配列に基づくプローブは、同一または相同なタンパクをコ
ードする転写物またはゲノム配列を検出するのに用いることができる。好ましい
具体例では、プローブは、さらに、それに結合する標識基を含有する。例えば、
標識基は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子とすることが
できる。かかるプローブは、パブロタンパクをミス発現する(misexpress)細胞ま
たは組織、特に神経細胞または組織を、例えば、患者の細胞試料中における、パ
ブロをコードする核酸のレベルを測定することにより同定する、例えば、パブロ
ｍＲＮＡレベルを検出するか、あるいはゲノムパブロ遺伝子が突然変異または欠
失されているかどうかを決定するための診断試験キットの一部として用いること
ができる。
【００７９】 「パブロタンパクの生物学的に活性な部分」をコードする核酸断片は、パブロ
生物学的活性(例えば、Ｂｃｌ-ｘＬに結合する能力)を有するポリペプチドをコ
ードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列の一部を単離し、パブロタン
パクのコードされた部分を(例えば、インビトロでの組換え発現により)発現させ
、パブロタンパクの発現された部分をの活性を評価することにより調製すること
ができる。
【００８０】 遺伝コードの縮重性ゆえにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と異なり、かくしてＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１によりコードされるものと同じパブロタンパクをコードする核酸
分子は、本発明により包含される。従って、別の具体例では、本発明の単離され
た核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列を有するタンパクをコ
ードするヌクレオチド配列を有する。
【００８１】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すパブロヌクレオチド配列に加えて、パブロタンパ
クのアミノ酸配列の変化をもたらすＤＮＡ配列多形性が集団(例えば、ヒト集団)
内に存在することは、当業者により認識される。パブロ遺伝子のかかる遺伝学的
多形性は、天然の対立遺伝子変異により、集団内の個体間に存在しうる。ここで
用いるように、「遺伝子」および「組換え遺伝子」なる用語は、パブロタンパク
、好ましくは哺乳動物パブロタンパクをコードするオープンリーディングフレー
ムを含有し、さらに、非コード調節配列およびイントロンを含有することができ
る核酸分子を意味する。かかる天然の対立遺伝子変異は、機能的および非機能的
パブロタンパクの両方を包含し、典型的には、パブロ遺伝子のヌクレオチド配列
における１〜５％の相違をもたらすことができる。天然の対立遺伝子変異の結果
であり、パブロタンパクの機能的活性を変化させないパブロ遺伝子のヌクレオチ
ド変異のいずれかおよび全部ならびに得られたアミノ酸多形性は、本発明の範囲
内にあると意図される。
【００８２】 さらに、他のパブロファミリーメンバーをコードし、かくしてＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１のパブロファミリー配列と異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、
本発明の範囲内にあると意図される。さらに、異なる種に由来するパブロタンパ
クをコードし、かくしてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のパブロ配列と異なる核酸配列を
有する核酸分子は、本発明の範囲内にあると意図される。
【００８３】 本発明のパブロ分子の天然の対立変異体および相同物に対応する核酸分子は、
例えば、ここに開示したｃＤＮＡまたはその一部をハイブリダイゼーションプロ
ーブとして用いて、標準的なハイブリダイゼーション技術に従って、ここに開示
したパブロ核酸に対するそれらの相同性に基づいて単離することができる。例え
ば、パブロＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の全部または一部をハイブリダイゼ
ーションプローブとして用い、かつ標準的なハイブリダイゼーション技術(例え
ば、サムブルック，ジェイ(Sambrook, J.)、フリッツ，イー・エフ(Fritsh, E.F
.)およびマニアティス，ティー(Maniatis, T.)、モレキュラー・クローニング：
ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、第
２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor La
boratory)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press)、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバ
ー(Cold Spring Harbor)、1989年に記載のように)を用いて、ヒトゲノムＤＮＡ
ライブラリーから単離することができる。さらに、パブロ遺伝子の全部または一
部を包含する核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列に基づいて設計されたオ
リグヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により単離するこ
とができる。例えば、ｍＲＮＡは細胞から(例えば、カイルウィン(Chirgwin)ら(
1979年)、バイオケミストリー(Biochemistry)18:5294-5299のグアニジニウム-チ
オシアネート抽出法により)単離することができ、ｃＤＮＡは逆転写酵素(例えば
、モロニー(Moloney)ＭＬＶ逆転写酵素(ギブコ(Gibco)/BRL(メリーランド州べセ
ズダ)から入手可能)；またはＡＭＶ逆転写酵素(セイカガク・アメリカ，インク(
Seikagaku America, Inc.)(フロリダ州セントピーターズバーグ)から入手可能))
を用いて調製することができる。ＰＣＲ増幅の合成オリグヌクレオチドプライマ
ーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すヌクレオチド配列に基づいて設計することが
できる。本発明の核酸分子は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを鋳型および適当な
オリゴヌクレオチドプライマーとして用いて、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って
増幅することができる。こうして増幅された核酸は、適当なベクターにクローン
化し、ＤＮＡ配列分析により特徴付けることができる。さらに、パブロヌクレオ
チド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術により、例えば、
自動ＤＮＡシンセサイザーを用いて、調製することができる。
【００８４】 別の具体例では、本発明の単離された核酸分子は、数学的アルゴリズムを用い
て、共有されるヌクレオチド配列の同一性に基づいて同定することができる。か
かるアルゴリズムは、以下でより詳しく概説する(例えば、第III節を参照)。
【００８５】 別の具体例では、本発明の単離された核酸分子は、長さが少なくとも１５、２
０、２５、３０またはそれ以上のヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件
下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列またはその相補体を含有する核
酸分子にハイブリダイズする。他の具体例では、核酸分子は、長さが少なくとも
３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５
０、５００、５５０または６００ヌクレオチドである。ここで用いるように、「
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」なる用語は、互いに少なくと
も３０％、４０％、５０％または６０％相同なヌクレオチド配列が典型的には互
いにハイブリダイズし続けるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記載す
ることを意図される。好ましくは、この条件は、互いに少なくとも約７０％、よ
り好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％ま
たは９０％相同な配列が典型的には互いにハイブリダイズし続けるようなもので
ある。かかるストリンジェントな条件は、当該分野で公知であり、カレント・プ
ロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Current Protocols in Molecu
lar Biology),ジョン・ワイリー・アンド・サンズ(John Wiley & Sons),ニュー
ヨーク(1989年),6.3.1-6.3.6に見出すことができる。ストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、６Ｘ塩化ナトリウム/クエン
酸ナトリウム(ＳＳＣ)、約４５℃でハイブリダイゼーション、次いで、０.２Ｘ
ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃で１回またはそれ以上の洗浄である。
好ましくは、ストリンジェントな条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列または
その相補体にハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、天然に存在す
る核酸分子に対応する。
【００８６】 ここで用いるように、「天然に存在する」核酸分子は、天然に存在する(例え
ば、天然のタンパクをコードする)ヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮ
Ａ分子を意味する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すパブロヌクレオチド配列に加え
て、パブロのヌクレオチドまたはアミノ酸配列におけるわずかな変化をもたらす
ＤＮＡ配列多形性が集団内に存在しうることは、当業者により認識される。バプ
ロ遺伝子におけるかかる遺伝学的多形性は、天然の対立遺伝子変異により、集団
内の個体間に存在しうる。かかる天然の対立遺伝子変異は、典型的には、遺伝子
のヌクレオチド配列における１〜２％の相違をもたらすことができる。天然の対
立遺伝子変異の結果であり、パブロポリペプチドの機能的活性を変化させないパ
ブロのかかるヌクレオチド変異および得られたアミノ酸多形性は、本発明の範囲
内にあると意図される。
【００８７】 集団に存在しうるパブロ配列の天然に存在する対立変異体に加えて、わずかな
変化が、突然変異により、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列に
導入され、それにより、パブロタンパクの機能的活性を変化させることなく、コ
ードされたタンパクのアミノ酸配列の変化をもたらすことは当業者がさらに認識
する。例えば、「非必須」アミノ酸残基におけるアミノ酸置換をもたらすヌクレ
オチド置換は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列に行いうる。「非必須」アミノ酸残
基は、パブロ分子の機能的活性を変化させることなく、パブロ核酸分子の野生型
配列(例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列)から変更することができる。非必須
であり、それゆえ、置換を受けやすい例示的な残基は、パブロ関連分子のアミノ
酸整列を行い、保存されない残基を決定することにより、当業者により同定する
ことができる。かかる残基は、保存されていないので、より置換を受けやすい。
【００８８】 従って、本発明の別の態様は、パブロ活性に必須でないアミノ酸残基の変化を
含有するパブロタンパクをコードする核酸分子に関する。かかるパブロタンパク
は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と異なっているが、依然として固有の
パブロ活性を保持する。パブロタンパクの非天然変異体をコードする単離された
核酸分子は、１個またはそれ以上のアミノ酸置換、付加または欠失がコードされ
たタンパクに導入されるように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列に１
個またはそれ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することにより生
成させることができる。突然変異は、標準的な技術、例えば、部位特異的な突然
変異およびＰＣＲ媒介性の突然変異により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に導入するこ
とができる。好ましくは、保存的なアミノ酸置換は、１個またはそれ以上の非必
須アミノ酸残基において行われる。「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸残基
が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。同様の側鎖を
有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。例えば、塩基
性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アルパ
ラギン酸、グルタミン酸)、非帯電極性側鎖(例えば、グリシン、アルパラギン、
グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば
、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、
メチオニン、トリプトファン)、β-枝分かれ側鎖(例えば、トレオニン、バリン
、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリ
プトファン、ヒスチジン)である。かくして、パブロの非必須アミノ酸残基は、
好ましくは同じ側鎖ファミリー由来の別にアミノ酸残基で置き換えられる。
【００８９】 あるいは、別の具体例では、突然変異は、パブロコード配列の全部または一部
に沿って、例えば、飽和突然変異誘発法により、無作為に導入することができ、
得られた突然変異体は、ＤＮＡに結合し、および/または転写を活性化するそれ
らの能力についてスクリーニングして、機能的活性を保持する突然変異体を同定
することができる。突然変異誘発に続いて、コードされたパブロ突然変異体タン
パクは、宿主細胞中で組換え的に発現することができ、突然変異体タンパクの機
能的活性は、パブロ活性を評価する当該分野で利用可能なアッセイを用いて測定
することができる。
【００９０】 本発明のさらに別の態様は、パブロ融合タンパクをコードする単離された核酸
分子に関する。かかる核酸分子は、非パブロタンパク、ポリペプチドまたはペプ
チドをコードする第２のヌクレオチド配列に機能的に作用するように連結された
パブロ活性を有する全長パブロタンパク、ポリペプチドまたはペプチドをコード
する第１のヌクレオチド配列を少なくとも含有し、標準的な組換えＤＮＡ技術に
より調製することができる。
【００９１】 好ましい具体例では、突然変異体パブロタンパクは、１）Ｂｃｌ-ｘＬに結合
し、および/または２）好ましくは神経細胞、例えば、中枢神経系または末梢神
経系の細胞のアポトーシスを調節する能力についてアッセイすることができる。
【００９２】 上記のパブロタンパクをコードする核酸分子に加えて、本発明の別の態様は、
それにアンチセンスな単離された核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸分子
は、タンパクをコードする「センス」核酸分子に相補的な、例えば、二本鎖ｃＤ
ＮＡ配列のコード鎖に相補的またはｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を
含有する。従って、アンチセンス核酸分子は、センス核酸分子に水素結合するこ
とができる。アンチセンス核酸分子は、全パブロコード鎖またはその一部のみに
相補的であることができる。ある具体例では、アンチセンス核酸分子は、パブロ
をコードする核酸配列のコード鎖の「コード領域」にアンチセンスである。「コ
ード領域」なる用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含有するヌクレオチ
ド配列の領域を意味する。別の具体例では、アンチセンス核酸分子は、パブロを
コードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」にアンチセンスであ
る。「非コード領域」なる用語は、アミノ酸に翻訳されないコード領域に隣接す
る５'および３'配列を意味する(すなわち、５'および３'非翻訳領域とも呼ばれ
る)。
【００９３】 ここに開示したパブロをコードするコード鎖配列が与えられれば、本発明のア
ンチセンス核酸分子は、ワトソン(Watson)およびクリック(Crick)の塩基対合の
規則に従って設計することができる。アンチセンス核酸分子は、パブロｍＲＮＡ
の全コード領域に相補的であることができるが、より好ましくは、パブロｍＲＮ
Ａのコードまたは非コード領域の一部のみにアンチセンスであるオリゴヌクレオ
チドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、パブロｍＲＮＡの翻
訳開始部位を囲む領域に相補的であることができる。アンチセンスオリゴヌクレ
オチドは、例えば、長さが約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、
４５または５０であることができる。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で
公知の方法を用いた化学的合成および酵素的連結反応を用いて構築することがで
きる。例えば、アンチセンス核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は
、天然に存在するヌクレオチドを用いて、あるいは分子の生物学的安定性を増大
させ、またはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成された二本鎖の物理的
安定性を増大させるように設計された様々に修飾したヌクレオチドを用いて(例
えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いるこ
とができる)、化学的に合成することができる。アンチセンス核酸を生成するの
に用いることができる修飾されたヌクレオチドの例としては、５-フルオロウラ
シル、５-ブロモウラシル、５-クロロウラシル、５-ヨードウラシル、ヒポキサ
ンチン、キサンチン、４-アセチルシトシン、５-(カルボキシヒドロキシメチル)
ウラシル、５-カルボキシメチルアミノメチル-２-チオウリジン、５-カルボキシ
メチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-Ｄ-ガラクトシルケオシン
、イノシン、Ｎ６-イソペンテニルアデニン、１-メチルグアニン、１-メチルイ
ノシン、２,２-ジメチルグアニン、２-メチルアデニン、２-メチルグアニン、３
-メチルシトシン、５-メチルシトシン、Ｎ６-アデニン、７-メチルグアニン、５
-メチルアミノメチルウラシル、５-メトキシアミノメチル-２-チオウラシル、β
-Ｄ-マンノシルケオシン、５'-メトキシカルボキシメチルウラシル、５-メトキ
シウラシル、２-メチルチオ-Ｎ６-イソペンテニルアデニン、ウラシル-５-オキ
シ酢酸(ｖ)、ヴィブトキソシン(wybutoxosine)、シュードウラシル(pseudouraci
l)、ケオシン(queosine)、２-チオシトシン、５-メチル-２-チオウラシル、２-
チオウラシル、４-チオウラシル、５-メチルウラシル、ウラシル-５-オキシ酢酸
メチルエステル、ウラシル-５-オキシ酢酸(ｖ)、５-メチル-２-チオウラシル、
３-(３-アミノ-３-Ｎ-２-カルボキシプロピル)ウラシル、(ａｃｐ３)ｗおよび２
,６-ジアミノプリンが挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアン
チセンス配向でサブクローン化されている発現ベクターを用いて、生物学的に製
造することができる(すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下
でさらに説明される関心のある標的核酸に対してアンチセンス配向である)。
【００９４】 本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、患者に投与し、またはその場
で生成され、それらはパブロタンパクをコードする細胞ｍＲＮＡおよび/または
ゲノムＤＮＡとハイブリダイスし、またはそれに結合し、それにより、タンパク
の発現を、例えば、転写および/または翻訳を阻害することにより、阻害する。
ハイブリダイゼーションは、従来のヌクレオチド相補性により、安定な二本鎖を
形成することができ、また、例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸
分子の場合には、二重らせんの主要な溝における特異的な相互作用によることが
できる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位にお
ける直接的な注射が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択され
た細胞を標的とするように修飾した後、全身的に投与することができる。例えば
、全身的投与の場合、アンチセンス分子は、選択された細胞表面上に発現された
受容体または抗原の特異的に結合するように、例えば、細胞表面の受容体または
抗原に結合するペプチドまたは抗体にアンチセンス核酸分子を連結することによ
り、修飾することができる。アンチセンス核酸分子は、また、ここに記載したベ
クターを用いて、細胞に送達することができる。アンチセンス分子の十分な細胞
内濃度を達成するには、アンチセンス核酸分子が強いｐｏｌIIまたはｐｏｌIII
プロモーターの制御下に置かれるベクター構築物が好ましい。
【００９５】 さらに別の具体例では、本発明のアンチセンス核酸分子は、α-アノマー核酸
分子である。α-アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリ
ッド(ここで、通常のβ-ユニットとは反対に、鎖は互いに平行に伸びている(ゴ
ルティエ(Gaultier)ら,(1987年),ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic A
cids Res.),15:6625-6641)を形成する。アンチセンス核酸分子は、また、２'-ｏ
-メチルリボヌクレオチド(イノウエ(Inoue)ら,(1987年),ヌクレイック・アシッ
ズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.),15:6131-6148)またはキメラＲＮＡ-ＤＮＡ
類似物(イノウエ(Inoue)ら,(1987年),フェブス・レターズ(FEBS Lett.),215:327
-330)を含有することができる。
【００９６】 さらに別の具体例では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボ
ザイムは、相補的な領域を有する一本鎖核酸、例えば、ｍＲＮＡを開裂すること
ができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒的ＲＮＡ分子である。かくして、リ
ボザイム(例えば、ハンマーヘッド型リボザイム(ハッセルホフ(Haselhoff)およ
びゲルラッハ(Gerlach),(1988年),ネイチャー(Nature),334:585-591に記載))は
、パブロｍＲＮＡ転写物を触媒的に開裂し、それにより、パブロｍＲＮＡの翻訳
を阻害するのに用いることができる。パブロをコードする核酸に対する特異性を
有するリボザイムは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列に基づいて設計
することができる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、パブロをコードす
るｍＲＮＡにおいて開裂されるべきヌクレオチド配列に相補的であるテトラヒメ
ナ(Tetrahymena)Ｌ-１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築することができる。例え
ば、チェク(Cech)ら、米国特許第4,987,071号；およびチェク(Cech)ら、米国特
許第5,116,742号を参照。あるいは、パブロｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子のプールか
ら特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒的ＲＮＡを選択するのに用いるこ
とができる。例えば、バーテル，ディー(Bartel, D.)およびソスタック，ジェイ
・ダブリュー(Szostak, J.W.),(1993年),サイエンス(Science),261:1411-1418を
参照。
【００９７】 あるいは、遺伝子発現は、パブロの調節領域(例えば、パブロプロモーターお
よび/またはエンハンサー)に相補的なヌクレオチド配列を標的として、標的細胞
中におけるパブロ遺伝子の転写を防止する三重らせん構造を形成することにより
阻害することができる。一般的には、ヘレン，シー(Helene, C.),(1991年),アン
チキャンサー・ドラッグ・デサイン(Anticancer Drug Des.),6(6):569-84；ヘレ
ン，シー(Helene, C.)ら,(1992年),アナルズ・オブ・ザ・ニューヨーク・アカデ
ミー・オブ・サイエンシズ(Ann. N.Y. Acad. Sci.),660:27-36；およびマーヘル
，エル・ジェイ(Maher, L.J.),(1992年),バイオアッセイズ(Bioassays),14(12):
807-15を参照。
【００９８】 さらに別の具体例では、本発明のパブロ核酸分子は、塩基部分、糖部分または
ホスフェートバックボーンにおいて、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼー
ションまたは溶解度を向上させるために修飾することができる。例えば、核酸分
子のデオキシリボースホスフェートバックボーンは、ペプチド核酸を生成するよ
うに修飾することができる(ハイラップ，ビー(Hyrup B)ら,(1996年),バイオオー
ガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー(Bioorganic & Medicinal Chem
istry),4(1):5-23を参照)。ここで用いるように、「ペプチド核酸」または「Ｐ
ＮＡ」なる用語は、デオキシリボースホスフェートバックボーンがシュードペプ
チドバックボーンにより置き換えられ、４つの天然の核酸塩基だけが保持される
核酸擬似物、例えば、ＤＮＡ擬似物を意味する。ＰＮＡの天然バックボーンは、
低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的なハイブリダイゼー
ションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、ハイラッ
プ，ビー(Hyrup B)ら,(1996年),前出；ペリー-オキーフ(Perry-O'Keefe)ら,プロ
シーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ(Pro
c. Natl. Acad. Sci.),93:14670-675に記載されていように、標準的な固相ペプ
チド合成プロトコルを用いて行うことができる。
【００９９】 パブロ核酸分子のＰＮＡは、治療および診断用途に用いることができる。例え
ば、ＰＮＡは、例えば、転写または翻訳の停止を誘発し、または複製を阻害する
ことにより、遺伝子発現の配列特異的な調節のためのアンチセンス薬または抗遺
伝子薬として用いることができる。パブロ核酸分子のＰＮＡは、また、他の酵素
(例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ(ハイラップ，ビー(Hyrup B)ら,(1996年),前出))と
組み合わせて用いる場合には、「人工制限酵素」として；またはＤＮＡ配列決定
もしくはハイブリダイゼーション用のプローブもしくはプライマーとして(ハイ
ラップ，ビー(Hyrup B)ら,(1996年),前出；ペリー-オキーフ(Perry-O'Keefe)ら,
前出)、(例えば、ＰＮＡ特異的ＰＣＲクランピングにより)遺伝子の単一塩基対
突然変異の分析に用いることができる。
【０１００】 別の具体例では、パブロのＰＮＡは、ＰＮＡに脂肪親和性もしくは他のヘルパ
ー基を結合させることにより、ＰＮＡ-ＤＮＡキメラの形成により、または、リ
ポソームもしくは当該分野で公知の薬物送達に関する他の技術の使用により、(
例えば、それらの安定性または細胞の取り込みを増強するために)修飾すること
ができる。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な性質を併せ持つパブロ核酸分子
のＰＮＡ-ＤＮＡキメラを生成させることができる。かかるキメラは、ＤＮＡ認
識酵素(例えば、ＲＮＡｓｅＨおよびＤＮＡポリメラーゼ)がＤＮＡ部分と相互作
用することを可能にするが、ＰＮＡ部分は高い結合親和性および特異性を与える
。ＰＮＡ-ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング、核酸塩基間の結合数、および配
向によって選択された適当な長さのリンカーを用いて連結することができる(ハ
イラップ，ビー(Hyrup B)ら,(1996年),前出)。ＰＮＡ-ＤＮＡキメラの合成は、
ハイラップ，ビー(Hyrup B)ら,(1996年),前出およびフィン，ピー・ジェイ(Finn
, P.J.)ら,(1996年),ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.),
24(17):3357-63に記載されているように行うことができる。例えば、ＤＮＡ鎖は
、標準的なホスホロアミダイトカップリング化学を用いて、固形の支持体上で合
成することができ、修飾したヌクレオシド類似物、例えば、５'-(４-メトキシト
リチル)アミノ-５'-デオキシ-チミジンホスホロアミダイトは、ＰＮＡとＤＮＡ
の５'末端との間として用いることができる(マグ，エム(Mag, M.)ら,(1989年),
ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acid Res.),17:5973-88)。次いで
、ＰＮＡモノマーは、段階的にカップリングさせて、５'ＰＮＡセグメントと３'
ＤＮＡセグメントとを有するキメラ分子を製造する(フィン，ピー・ジェイ(Finn
, P.J.)ら,(1996年),前出)。あるいは、キメラ分子は、５'ＤＮＡセグメントお
よび３'ＰＮＡセグメントを用いて合成することができる(ピーターサー，ケイ・
エイチ(Peterser, K.H.)ら,(1975年),バイオオーガニック・アンド・メディシナ
ル・ケミストリー・レターズ(Bioorganic Med. Chem. Lett.),5:1119-11124)。
【０１０１】 他の具体例では、オリゴヌクレオチドは、(例えば、インビボで宿主細胞受容
体を標的とするための)ペプチド、または細胞膜 (例えば、レットシンガー(Lets
inger)ら,(1989年),プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Pro
c. Natl. Acad. Sci. US.),86:6553-6556；ルメートル(Lemaitre)ら,(1987年),
プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci
. USA),84:648-652；PCT公開第WO88/09810号)または血液-脳関門(例えば、PCT公
開第WO89/10134号)を通過する輸送を容易にする薬剤などの他の追加されるグル
ープを包含しうる。加えて、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション-
トリガード(hybridization-triggered)開裂剤(例えば、クロール(Krol)ら,(1988
年),バイオ-テクニークズ(Bio-Techniques),6:958-976を参照)または挿入剤(例
えば、ゾン(Zon),(1988年),ファーマコロジカル・リサーチ(Pharm. Res.),5:539
-549)を用いて修飾することができる。このために、オリゴヌクレオチドは、別
の分子(例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション-トリガード架橋剤、輸送剤
、またはハイブリダイゼーション-トリガード開裂剤)に結合させてもよい。
【０１０２】 アンチセンスポリヌクレオチドは、トランスフェクション細胞または形質転換
細胞における異種発現カセットから製造してもよい。あるいは、アンチセンスポ
リヌクレオチドは、インビトロでの培地中またはインビボでの循環系もしくは間
質液中の外部環境に投与される可溶性オリゴヌクレオチドを含有してもよい。外
部環境に存在する可溶性アンチセンスポリヌクレオチドは、細胞質への接近を得
て、特異的なｍＲＮＡ種の翻訳を阻害することが示されている。
【０１０３】 III．単離されたパブロタンパク、その断片、および抗パブロ抗体 別の具体例では、パブロ活性または発現を調節するのに用いることができる薬
剤は、パブロタンパクおよびその生物学的に活性な部分、ならびに抗パブロ抗体
を惹起するための免疫原として用いるのに適当なポリペプチド断片である。ある
具体例では、天然のパブロタンパクは、標準的なタンパク精製技術を用いた適当
な精製スキームにより、細胞または組織源から単離することができる。別の具体
例では、パブロタンパクは組換えＤＮＡ技術により製造される。組換え発現に代
えて、パブロタンパクまたはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を用い
て、化学的に合成することができる。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すよう
なパブロタンパクの使用を考察する際には、全長パブロポリペプチドではないか
かるタンパクの断片、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すＢｃｌ-ｘＬ結合ド
メイン、ならびに全長パブロタンパクを用いることができると理解される。
【０１０４】 本発明の別の態様は、単離されたパブロタンパクに関する。好ましくは、パブ
ロタンパクは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１によりコードされるアミノ酸配列またはそ
の一部を含有する。別の好ましい具体例では、タンパクはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
のアミノ酸配列またはその一部を含有する。他の具体例では、タンパクは、ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列またはその一部、例えば、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２に示すＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインと、少なくとも５０％、少なくとも６０
％のアミノ酸同一性、より好ましくは７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは
８０％、さらにより好ましくは９０％または９５％のアミノ酸同一性を有する。
パブロポリペプチド分子の好ましい部分は生物学的に活性である。すなわち、Ｂ
ｃｌ-ｘＬに結合し、および/または細胞、好ましくは神経細胞、例えば、中枢神
経系または末梢神経系の細胞のアポトーシスを調節する能力を有するパブロペプ
チドの一部をコードする。
【０１０５】 パブロタンパクの生物学的に活性な部分は、パブロタンパクのアミノ酸配列に
十分相同であり、またはそれから誘導されるアミノ酸配列(例えば、それはパブ
ロタンパクの変形体)を含有するペプチドを包含する。かかるペプチドは、全長
パブロタンパクより少ないアミノ酸を包含し(例えば、パブロの切形体であり)、
パブロタンパクの少なくとも１つの活性を示す。関連する具体例では、パブロタ
ンパクの生物学的に活性な部分は、パブロの優性阻害突然変異体である。ここで
用いるように、「優性阻害突然変異体」なる用語は、細胞に導入して発現させた
場合に、対応する無変形の内生タンパクの活性を抑制または破壊することができ
るタンパクの変形(例えば、切形または突然変異)体を包含する。
【０１０６】 ２つのアミノ酸または２つの核酸配列の％同一性を決定するために、最適な比
較の目的で配列を整列させる(例えば、最適な整列のために、第１および第２の
アミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができる)
。好ましい具体例では、比較の目的で整列させる参照配列の長さは、参照配列の
長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なく
とも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少
なくとも７０％、８０％または９０％である。次いで、対応する位置にある残基
を比較して、一方の配列が他方の配列の対応する位置と同じ残基で占有されてい
る場合には、これらの分子はその位置で同一である。２つの配列間の％同一性は
、それゆえ、２つの配列により共有される同一位置の数の関数である(すなわち
、％同一性＝同一位置の数／位置の全数×１００)。２つの配列間の％同一性は
、２つの配列の最適な整列のために導入されるギャップの数および各ギャップの
長さを考慮して、配列により共有される同一位置の数の関数である。ここで用い
るように、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と
等価である。
【０１０７】 配列の比較および２つの配列間の％同一性の決定は、数学的なアルゴリズムを
用いて達成することができる。配列の比較に利用される数学的なアルゴリズムの
非限定的な例は、カーリン(Karlin)およびアルトシュール(Altschul),(1990年),
プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci
. USA),87:2264のアルゴリズムであり、カーリン(Karlin)およびアルトシュール
(Altschul),(1993年),プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(P
roc. Natl. Acad. Sci. USA),90:5873のように修正された。かかるアルゴリズム
は、アルトシュール(Altschul)ら,(1990年),ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジー(J. Mol. Biol.),215:403のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプロ
グラム(バージョン２.０)に組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチ
は、本発明の核酸分子に相同なオリゴヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡ
ＳＴプログラムスコア＝１００、ワード長＝１２で行うことができる。ＢＬＡＳ
Ｔタンパクサーチは、本発明のタンパク分子に相同なアミノ酸配列を得るために
、ＸＢＬＡＳＴプログラムスコア＝５０、ワード長＝３で行うことができる。比
較の目的のギャップを設けた整列を得るために、ギャップド(Gapped)ＢＬＡＳＴ
を、アルトシュール(Altschul)ら,(1997年),ヌクレイック・アシッズ・リサーチ
(Nucleic Acids Research),25(17):3389に記載されているように利用することが
できる。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合には
、各々のプログラム(例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ)のデフォルトパ
ラメーターを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照。配列
の比較に利用される別の好ましい非限定的なアルゴリズムは、マイヤーズ(Myers
)およびミラー(Miller),カビオス(CABIOS),(1989年)のアルゴリズムである。か
かるアルゴリズムは、ＧＣＧ配列整列ソフトウェアパッケージの一部であるＡＬ
ＩＧＮプログラム(バージョン２.０)に組み込まれている。アミノ酸配列を比較
するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギ
ャップ長さペナルティ１２およびギャップペナルティ４を用いることができる。
【０１０８】 タンパク配列の整列に利用される数学的なアルゴリズムの別の非限定的な例は
、リップマン(Lipman)-ピアソン(Pearson)アルゴリズム(リップマン(Lipman)お
よびピアソン(Pearson),(1985年),サイエンス(Science),227:1435)である。リッ
プマン(Lipman)-ピアソン(Pearson)アルゴリズムを用いる場合、ＰＡＭ２５０重
み残基表、ギャップ長さペナルティ１２、ギャップペナルティ４およびクットプ
ル(Kutple)２を用いることができる。核酸配列の整列に利用される数学的なアル
ゴリズムの好ましい非限定的な例は、ウィルブール(Wilbur)-リップマン(Lipman
)アルゴリズム(ウィルブール(Wilbur)およびリップマン(Lipman),(1983年), プ
ロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・
オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci.
USA),80:726)である。ウィルブール(Wilbur)-リップマン(Lipman)アルゴリズム
を用いる場合、ウィンドウ２０、ギャップペナルティ３、クットプル(Kutple)３
を用いることができる。リップマン(Lipman)-ピアソン(Pearson)アルゴリズムお
よびウィルブール(Wilbur)-リップマン(Lipman)アルゴリズムは、例えば、ＤＮ
ＡＳＴＡＲ配列分析ソフトウェアパッケージの一部であるＭＥＧＡＬＩＧＮプロ
グラム(例えば、バージョン３.１.７)に組み込まれている。
【０１０９】 配列分析の付加的なアルゴリズムは当該分野で公知であり、トレッリ(Torelli
)およびロボッティ(Robotti),(1994年),コンピューテイショナル・アンド・アプ
ライド・バイオサイエンス(Comput. Appl. Biosci.),10:3に記載されているＡＤ
ＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ；ならびにピアソン(Pearson)およびリップマン(Lipm
an),(1988年),ピーナス(PNAS),85:2444に記載されているＦＡＳＴＡが挙げられ
る。
【０１１０】 好ましい具体例では、２つのアミノ酸配列間の％同一性は、ＧＣＧソフトウェ
アパッケージのＧＡＰプログラムを用い、ブロサム(Blosum)６２マトリックスま
たはＰＡＭ２５０マトリックス、ギャップの重み１６、１４、１２、１０、８、
６または４、長さの重み１、２、３、４、５または６を用いて決定される。さら
に別の好ましい具体例では、２つのヌクレオチド配列間の％同一性は、ＧＣＧソ
フトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ、ＣＭＰ
マトリックス、ギャップの重み４０、５０、６０、７０または８０、長さの重み
１、２、３、４、５または６を用いて決定される。
【０１１１】 タンパクの整列は、ジーンワークス(Geneworks)包括的タンパク整列プログラ
ム(例えば、バージョン２.５.１)を用い、ギャップを開くコストを５に設定し、
ギャップを長くするコストを５に設定し、最小対角長さを４に設定し、最大対角
オフセットを１３０に設定し、コンセンサスカットオフを５０％に設定し、Ｐａ
ｍ２５０マトリックスを利用して行うことができる。
【０１１２】 本発明の核酸およびタンパク配列は、さらに、例えば、他のファミリーメンバ
ーまたは関連配列を同定するために一般のデータベースに対してサーチを行う「
問い合わせ配列」(query sequence)として用いることができる。かかるサーチは
、アルトシュール(Altschul)ら,(1990年),ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー(J. Mol. Biol.),215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプロ
グラム(バージョン２.０)を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド
サーチは、本発明のパブロ核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、Ｎ
ＢＬＡＳＴプログラムを用い、スコア＝１００、ワード長＝１２で行うことがで
きる。ＢＬＡＳＴタンパクサーチは、本発明のパブロタンパク分子に相同なアミ
ノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラムを用い、スコア＝５０、ワード
長＝３で行うことができる。比較の目的でギャップド整列を得るために、ギャッ
プドＢＬＡＳＴは、アルトシュール(Altschul)ら,(1997年),ヌクレイック・アシ
ッズ・リサーチ(Nucleic Acids Research),25(17):3389-3402に記載されている
ように利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴプログラ
ムを利用する場合には、各々のプログラム(例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬ
ＡＳＴ)のデフォルトパラメーターを用いることができる。例えば、本発明のヌ
クレオチド配列は、デフォルトＢｌａｓｔｎマトリックス１-３を用い、ギャッ
プペナルティをエグジステンス(existence)１１およびエクステンション(extens
ion)１に設定して分析することができる。本発明のアミノ酸配列は、デフォルト
セッティング、すなわちブロサム(Blosum)６２マトリックスを用い、ギャップペ
ナルティをエグジステンス(existence)１１およびエクステンション(extension)
１に設定して分析することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照。
【０１１３】 本発明は、また、パブロキメラまたは融合タンパクを提供する。ここで用いる
ように、パブロ「キメラタンパク」または「融合タンパク」は、非パブロポリペ
プチドに機能的に作用するように連結されたパブロポリペプチドを含有する。「
パブロポリペプチド」はパブロポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有するポ
リペプチドを意味するのに対し、「非パブロポリペプチド」はパブロタンパクに
実質的に相同でないタンパク(例えば、パブロタンパクと異なり、かつ同一また
は異なる生物から誘導されるタンパク)に対応するアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを意味する。パブロ融合タンパク内で、パブロポリペプチドは、パブロタ
ンパクの全部または一部に対応することができる。好ましい具体例では、パブロ
融合タンパクは、パブロタンパクの少なくとも１つの生物学的に活性な部分、例
えば、Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメインを含有する。融合タンパク内で、「機能的に作
用するように連結された」なる用語は、パブロポリペプチドおよび非パブロポリ
ペプチドが互いにインフレーム(in-frame)で融合していることを示すことを意図
する。非パブロポリペプチドは、パブロポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融
合することができる。
【０１１４】 例えば、ある具体例では、融合タンパクは、パブロメンバー配列がＧＳＴ配列
のＣ末端に融合しているＧＳＴ-パブロメンバー融合タンパクである。別の具体
例では、融合タンパクは、パブロメンバーヌクレオチド配列がｐＣＥＰ４-ＨＡ
ベクター(ヘルシャー，アール・エフ(Herrscher, R.F.)ら,(1995年),ジーンズ・
アンド・ディベロップメント(Genes Dev.),9:3067-3082)などのベクターに、パ
ブロメンバー配列がインフルエンザ赤血球凝集素エピトープタグにインフレーム
で融合するように挿入されているパブロ-ＨＡ融合タンパクである。かかる融合
タンパクは、組換えパブロメンバーの精製を容易にすることができる。
【０１１５】 組換え技術により製造される融合タンパクおよびペプチドは、タンパクまたは
ペプチドを含有する細胞および培地の混合物から分泌および単離すればよい。あ
るいは、タンパクまたはペプチドは細胞質的に保持されているので、細胞を採取
し、溶解し、タンパクを単離すればよい。細胞培養物は、典型的には、宿主細胞
、培地および他の副産物を含有する。細胞培養に適当な培地は当該分野で公知で
ある。タンパクおよびペプチドは、タンパクおよびペプチドを生成物ための当該
分野で公知の技術を用いて、細胞培養物の培地、宿主細胞、またはその両方から
単離することができる。宿主細胞をトランスフェクトし、タンパクおよびペプチ
ドを精製する技術は、当該分野で公知である。
【０１１６】 好ましくは、本発明のパブロ融合タンパクは、標準的な組換えＤＮＡ技術によ
り製造される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片を、従
来の技術に従って、例えば、連結用の平滑末端または食い違い(stagger-ended)
末端、適当な末端を与えるための制限酵素消化、適当な付着末端の導入、望まし
くない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的な連結
を採用することにより、インフレームで連結する。別の具体例では、融合遺伝子
は、自動化ＤＮＡシンセサイザーを含む従来の技術により合成することができる
。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２つの連続する遺伝子断片間に相補的
な突出部分を生じるアンカープライマーを用いて実施することができる。これら
の遺伝子断片は、引き続いて、キメラ遺伝子配列を生成するためにアニールし、
再増幅することができる(例えば、カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラ
ー・バイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology),アウスベル(Ausu
bel)ら編,ジョン・ワイリー・アンド・サンズ(John Wiley & Sons)：1992年を参
照)。さらに、すでに融合部分(例えば、ＧＳＴポリペプチドまたはＨＡエピトー
プタグ)をコードする多くの発現ベクターが市販されている。パブロをコードす
る核酸分子は、かかる発現ベクターに、融合部分がパブロタンパクにインフレー
ムで連結されるようにクローン化することができる。
【０１１７】 別の具体例では、融合タンパクは、そのＮ末端に異種シグナル配列を含有する
パブロタンパクである。ある種の宿主細胞(例えば、哺乳動物宿主細胞)では、パ
ブロの発現および/または分泌は、異種シグナル配列の使用により増大させるこ
とができる。本発明のパブロ融合タンパクは、医薬組成物に配合し、インビボで
患者に投与することができる。パブロ融合タンパクの使用は、障害、例えば、が
んまたはアルツハイマー病の治療に治療上有用でありうる。さらに、本発明のパ
ブロ融合タンパクは、患者に抗パブロ抗体を産生させる免疫原として用いること
ができる。
【０１１８】 好ましくは、本発明のパブロキメラまたは融合タンパクは、標準的な組換えＤ
ＮＡ技術により製造される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮ
Ａ断片を、従来の技術に従って、例えば、連結用の平滑末端または食い違い(sta
gger-ended)末端、適当な末端を与えるための制限酵素消化、適当な付着末端の
導入、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および
酵素的な連結を採用することにより、インフレームで連結する。別の具体例では
、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡシンセサイザーを含む従来の技術により合成する
ことができる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２つの連続する遺伝子断
片間に相補的な突出部分を生じるアンカープライマーを用いて実施することがで
きる。これらの遺伝子断片は、引き続いて、キメラ遺伝子配列を生成するために
アニールし、再増幅することができる(例えば、カレント・プロトコルズ・イン
・モレキュラー・バイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology),ア
ウスベル(Ausubel)ら編,ジョン・ワイリー・アンド・サンズ(John Wiley & Sons
)：1992年を参照)。さらに、すでに融合部分(例えば、ＧＳＴポリペプチド)をコ
ードする多くの発現ベクターが市販されている。パブロをコードする核酸分子は
、かかる発現ベクターに、融合部分がパブロタンパクにインフレームで連結され
るようにクローン化することができる。
【０１１９】 本発明は、また、パブロ作動薬(擬似物)またはパブロ拮抗薬として機能するパ
ブロタンパクの変異体に関する。パブロタンパクの変異体は、突然変異誘発法、
例えば、パブロタンパクの離散的点突然変異または切頭化(truncation)により生
成させることができる。パブロタンパクの作動薬は、天然に存在する形態のパブ
ロタンパクの生物学的活性と実質的に同じ活性またはその部分集合を保持するこ
とができる。パブロタンパクの拮抗薬は、天然に存在する形態のパブロタンパク
の活性の１つまたはそれ以上を、例えば、パブロタンパクの細胞活性を競合的に
調節することにより阻害することができる。かくして、特異的な生物学的効果は
、限定された機能を有する変異体で治療することにより誘起することができる。
ある具体例では、天然に存在する形態のタンパクの生物学的活性の部分集合を有
する変異体による患者の治療は、天然に存在する形態のパブロタンパクによる治
療に対して、患者の副作用が少ない。
【０１２０】 ある具体例では、本発明は、酸化、還元または当該分野で公知の他の誘導方法
によってパブロの少なくとも１個のアミノ酸残基を修飾することにより形成しう
るパブロの誘導体に関する。
【０１２１】 ある具体例では、パブロ作動薬(擬似物)またはパブロ拮抗薬として機能するパ
ブロタンパクの変異体は、パブロタンパクの突然変異体、例えば、切頭化突然変
異体の組み合わせライブラリーをパブロタンパク作動薬または拮抗薬活性につい
てスクリーニングすることにより同定することができる。ある具体例では、パブ
ロ変異体の変化に富んだライブラリーは、核酸レベルでの組み合わせ突然変異誘
発法により生成され、変化に富んだ遺伝子ライブラリーによりコードされる。パ
ブロ変異体の変化に富んだライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの
混合物を遺伝子配列に、潜在的なパブロ配列の縮重した集合が個々のポリペプチ
ドとして、あるいはパブロ配列の集合を含有するより大きい融合タンパク(例え
ば、ファージディスプレイ用)の集合として発現可能であるように、酵素的に連
結することにより製造することができる。縮重したオリゴヌクレオチド配列から
潜在的なパブロ変異体のライブラリーを製造するのに用いることができる様々な
方法が存在する。縮重した遺伝子配列の化学的な合成は自動的ＤＮＡシンセサイ
ザーで行うことができ、次いで、合成遺伝子は適当な発現ベクターに連結される
。遺伝子の縮重した集合の使用は、潜在的なパブロ配列の所望の集合をコードす
る配列の全部を１つの混合物で提供することを可能にする。縮重したオリゴヌク
レオチドを合成する方法は当該分野で公知である(例えば、ナラング，エス・エ
イ(Narang, S.A.),(1983年),テトラヘドロン(Tetrahedron),39:3；イタクラ(Ita
kura)ら,(1984年),アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー(Annu. Re
v. Biochem.),53:323；イタクラ(Itakura)ら,(1984年),サイエンス(Science),19
8:1056；イケ(Ike)ら,(1983年),ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucleic Ac
id Res.),11:477を参照)。
【０１２２】 加えて、パブロタンパクをコードする配列の断片のライブラリーは、パブロタ
ンパクの変異体のスクリーニングおよび引き続く選択のためにパブロ断片の変化
に富んだ集団を生成するのに用いることができる。ある具体例では、コード配列
断片のライブラリーは、パブロコード配列の二本鎖ＰＣＲ断片を、切断(nicking
)が１分子あたりわずか約１回起こる条件下、ヌクレアーゼで処理し、二本鎖Ｄ
ＮＡを変性し、ＤＮＡを復元して異なる切断産物からセンス/アンチセンス対を
含むことができる二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼで処理することによ
り、再形成された二本鎖から一本鎖部分を除去し、得られた断片ライブラリーを
発現ベクターに連結することにより生成させることができる。この方法により、
様々なサイズのパブロタンパクのＮ末端、Ｃ末端および内部断片をコードする発
現ライブラリーを誘導することができる。
【０１２３】 点突然変異または切頭化により作成された組み合わせライブラリーの遺伝子産
物をスクリーニングするために、およびｃＤＮＡライブラリーを選択された性質
を有する遺伝子産物についてスクリーニングするために、いくつかの技術が当該
分野で公知である。かかる技術は、パブロタンパクの組み合わせ突然変異誘発法
により生成させた遺伝子ライブラリーの急速なスクリーニングに適用可能である
。大きい遺伝子ライブラリーをスクリーニングするのに、高処理量分析に適した
最も広く用いられている技術としては、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製
可能な発現ベクターにクローン化し、適当な細胞を得られたベクターのライブラ
リーで形質転換し、組み合わせ遺伝子を、所望の活性の検出が、その産物が検出
された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で発現させること
が挙げられる。ライブラリーにおける機能的な突然変異体の頻度を増強する新し
い技術である循環的調和(recursive ensemble)突然変異誘発(ＲＥＭ)を、パブロ
変異体を同定するスクリーニングアッセイと組み合わせて用いることができる(
アーキン(Arkin)およびユアヴァン(Yourvan),(1992年),プロシーディングズ・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッ
ド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),89:7811-7815；
デルグレイブ(Delgrave)ら,(1993年),プロテイン・エンジニアリング(Protein E
ngineering),6(3):327-331)。
【０１２４】 ある具体例では、細胞に基づくアッセイは、変化に富んだパブロライブラリー
を分析するのに活用することができる。例えば、発現ベクターのライブラリーは
、パブロを普通に合成し分泌する細胞系にトランスフェクトすることができる。
次いで、トランスフェクトされた細胞は、パブロおよび特定の突然変異体パブロ
が分泌されるように培養し、細胞の上澄み液中のパブロ活性に対する突然変異体
の発現の効果は、例えば、数多くの酵素的アッセイのいずれかにより検出するこ
とができる。次いで、プラスミドＤＮＡはパブロ活性の阻害または増強について
評価する細胞から回収することができ、個々のクローンはさらに特徴付ける。
【０１２５】 天然に存在するアミノ酸だけからなるパブロポリペプチドに加えて、パブロペ
プチド擬似物も提供される。ペプチド類似物は、鋳型ペプチドの性質に類似した
性質を有する非ペプチド薬物として医薬品産業で通常用いられる。これらのタイ
プの非ペプチド化合物は、「ペプチド擬似物」(peptide mimetics)または「ペプ
チド擬似物」(peptidomimetics)と呼ばれ(フォーシェ，ジェイ(Fauchere, J.),(
1986年),アドバンシズ・イン・ドラッグ・リサーチ(Adv. Drug Res.),15:29；ヴ
ェーバー(Veber)およびフライジンガー(Freidinger),(1985年),ジャーナル・オ
ブ・メディシナル・ケミストリー(J. Med. Chem.),30:1229；これらは出典を示
すことにより本明細書の一部をなす)、通常、コンピューターによる分子モデリ
ングの助けを借りて開発される。治療上有用なペプチドに構造上類似したペプチ
ド擬似物は、等価な治療または予防効果を生じるのに用いてもよい。一般的には
、ペプチド擬似物は、ヒトパブロなどの典型例のポリペプチド(すなわち、生物
学的または薬理学的な活性を有するポリペプチド)に構造上類似しているが、当
該分野で公知の方法およびさらに以下の文献に記載の方法により、所望により、
-ＣＨ２ＮＨ-、-ＣＨ２Ｓ-、-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ＝ＣＨ-(シスおよびトラン
ス)、-ＣＯＣＨ２-、-ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２-および-ＣＨ２ＳＯ-からなる群から選
択される結合で置き換えられる１個またはそれ以上のペプチド結合を有する：ス
パトラ，エイ・エフ(Spatola, A.F.),「ケミストリー・アンド・バイオケミスト
リー・オブ・アミノ・アシッズ・ペプチズ・アンド・プロテインズ(Chemistry a
nd Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins)」,ビー・ウェイン
スタイン(B. Weinstein)編,マルセル・デッカー(Marcel Dekker),ニューヨーク,
第267頁(1983年)；スパトラ，エイ・エフ(Spatola, A.F.),ベガ・データ(Vega D
ata),(1983年3月),第１巻第３刷,「ペプチド・バックボーン・モディフィケイシ
ョン(Peptide Backbone Modifications)」(一般的総説)；モーリー，ジェイ・エ
ス(Morley, J.S.),トレンズ・イン・ファーマコロジカル・サイエンシズ(Trends
Pharm Sci),(1980年),第463-468頁(一般的総説)；ハドソン，ディー(Hudson, D
.)ら,インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・アンド・プロテイン
・リサーチ(Int J Pept Prot Res),(1979年),14:177-185(-ＣＨ２ＮＨ-、ＣＨ２ ＣＨ２-)；スパトラ，エイ・エフ(Spatola, A.F.)ら,ライフ・サイエンス(Life
Sci),(1986年),38:1243-1249(-ＣＨ２Ｓ)；ハン，エム・エム(Hann, M.M.),ジャ
ーナル・オブ・ザ・ケミカル・ソサイエティ・パーキン・トランザクションＩ(J
Chem Soc Perkin Trans I),(1982年),307-314(-ＣＨ-ＣＨ-、シスおよびトラン
ス)；アルムクイスト，アール・ジー(Almquist, R.G.)ら,ジャーナル・オブ・メ
ディシナル・ケミストリー(J Med Chem),(1980年),23:1392-1398(-ＣＯＣＨ２-)
；ジェニングズ-ホワイト，シー(Jennings-White, C.)ら,テトラヘドロン・レタ
ーズ(Tetrahedron Lett),(1982年),23:2533(-ＣＯＣＨ２-)；セルケ，エム(Szel
ke, M.)ら,欧州出願第EP45665号,(1982年),CA:97:39405(1982年)(-ＣＨ(ＯＨ)Ｃ
Ｈ２-)；ホラディ，エム・ダブリュー(Holladay, M.W.)ら,テトラヘドロン・レ
ターズ(Tetrahedron Lett),(1983年),24:4401-4404(-Ｃ(ＯＨ)ＣＨ２-)；および
フルビー，ヴイ・ジェイ(Hruby, V.J.),ライフ・サイエンス(Life Sci),(1982年
),31:189-199(-ＣＨ２-Ｓ-)；各々は出典を示すことにより本明細書の一部をな
す。特好ましい非ペプチド結合は-ＣＨ２ＮＨ-である。かかるペプチド擬似物は
、ポリペプチドの具体例より有意な利点を有しうる。例えば、より経済的な生産
性、高い化学的安定性、薬理学的な性質(半減期、吸収、効能、効力など)の増強
、特異性の変化(例えば、生物学的な活性のスペクトルが広い)、抗原性の減少な
どである。ペプチド擬似物の標識化は、通常、定量的な構造-活性データおよび/
または分子モデリングにより予測されるペプチド擬似物の非干渉部分への、直接
的またはスペーサー(例えば、アミド基)を介した、１種またはそれ以上の標識の
共有結合を必要とする。かかる非干渉位置は、一般的には、ペプチド擬似物が結
合して治療効果を生じる巨大分子との直接的な接触を形成しない位置である。ペ
プチド擬似物の誘導体化(例えば、標識化)は、ペプチド擬似物の所望の生物学的
または薬理学的活性を実質的に干渉すべきでない。
【０１２６】 パブロアミノ酸配列の１個またはそれ以上のアミノ酸の同じタイプのＤアミノ
酸(例えば、Ｌ-リジンに代えてＤ-リジン)による系統的な置換は、より安定なペ
プチドを生成するのに用いうる。加えて、パブロアミノ酸配列または実質的に同
一の配列変化を含有する不自然なペプチドは、当該分野で公知の方法(リゾ(Rizo
)およびギエラッシュ(Gierasch),(1992年),アニュアル・レビュー・オブ・バイ
オケミストリー(Ann. Rev. Biochem.),61:387；出典を示すことにより本明細書
の一部をなす)により、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を
形成することができる内部システイン残基を付加することにより、生成させても
よい。
【０１２７】 ここで同定したパブロポリペプチドのアミノ酸配列は、当業者がパブロペプチ
ド配列およびその配列変異体に対応するポリペプチドを製造することを可能にす
る。かかるポリペプチドは、パブロペプチド配列(しばしば、より大きいポリペ
プチドの一部として)をコードするポリヌクレオチドの発現により、原核生物ま
たは真核生物の宿主細胞中で産生させうる。あるいは、かかるペプチドは、化学
的な方法で合成してもよい。組換え宿主中における異種タンパクの発現、ポリペ
プチドの化学的な合成、およびインビトロでの翻訳のための方法は当該分野で公
知であり、さらに、マニアティス(Maniatis)ら,モレキュラー・クローニング：
ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning：A Laboratory Manual),(19
89年),第２版,コールド・スプリングろ・ハーバー(Cold Spring Harbor),ニュー
ヨーク；バーガー(Berger)およびキンメル(Kimmel),メソッズ・イン・エンザイ
モロジー(Methods in Enzymology),第152巻,ガイド・ツー・モレキュラー・クロ
ーニング・テクニークズ(Guide to Molecular Cloning Techniques),(1987年),
アカデミック・プレス，インク(Academic Press, Inc.),カルフォルニア州サン
ディエゴ；メリフィールド，ジェイ(Merrifield, J.),(1969年),ジャーナル・オ
ブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ(J. Am. Chem. Soc.),91:501；チ
ャイケン，アイ・エム(Chaiken, I.M.),(1981年),シー・アール・シー・クリテ
ィカル・レビューズ・イン・バイオケミストリー(CRC Crit. Rev. Biochem.),11
:255；カイザー(Kaiser)ら,(1989年),サイエンス(Science),243:187；メリフィ
ールド，ビー(Merrifield, B.),(1986年),サイエンス(Science),232:342；ケン
ト，エス・ビー・エイチ(Kent, S.B.H.),(1988年),アニュアル・レビュー・オブ
・バイオケミストリー(Ann. Rev. Biochem.),57:957；およびオフォード，アー
ル・イー(Offord, R.E.),(1980年),セミシンセティック・プロテインズ(Semisyn
thetic Proteins),ワイリー・パブリッシング(Wiley Publishing)；これらは出
典を示すことにより本明細書の一部をなす。
【０１２８】 ペプチドは、典型的には、直接的な化学的合成により製造され、例えば、パブ
ロ/パブロ結合タンパク(例えば、Ｂｃｌ-ｘＬ)相互作用の作動薬または拮抗薬と
して用いられる。ペプチドは、非ペプチド部分を共有結合によりＮ末端および/
またはＣ末端に結合させて、修飾されたペプチドとして製造することができる。
いくつかの好ましい具体例では、カルボキシ末端もしくはアミノ末端またはその
両方が化学的に修飾される。末端のアミノ基およびカルボキシル基の最も一般的
な修飾は、それぞれアセチル化およびアミド化である。アシル化(例えば、アセ
チル化)またはアルキル化(例えば、メチル化)などのアミノ末端修飾、アミド化
などのカルボキシル末端修飾、ならびに他の末端修飾(例えば、環化)を本発明の
様々な具体例に組み込んでもよい。ある種のアミノ末端および/またはカルボキ
シル末端修飾および/またはコア配列に対するペプチド伸長は、有利な物理学的
、化学的、生化学的および薬理学的性質、例えば、増強された安定性、増大した
効能および/または効力、血清プロテアーゼに対する耐性、望ましい薬物動力学
的な性質などを与えることができる。ペプチドは、疾患を治療するのに、例えば
、患者の細胞集団のアポトーシスの過程を変化させることにより、治療的にもち
いてもよい。
【０１２９】 単離されたパブロタンパクまたはその一部もしくは断片は、また、ポリクロー
ナルおよびモノクローナル抗体調製物に関する標準的な技術を用いて、パブロを
結合する抗体を生成させるのに免疫原として用いることができる。全長パブロタ
ンパクを用いることができるか、あるいは本発明は免疫原として用いるパブロの
抗原性ペプチド断片を提供する。パブロの抗原性ペプチドは、少なくとも８個の
アミノ酸残基を含有し、このペプチドに対して生じた抗体がパブロと特異的な免
疫複合体を形成するようにパブロのエピトーブを包含する。好ましくは、抗原性
ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１５
個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸残基、最
も好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸残基を含有する。
【０１３０】 あるいは、パブロポリペプチドの抗原性ペプチド断片は、免疫原として用いる
ことができる。パブロポリペプチドの抗原性ペプチド断片は、典型的には、ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列の少なくとも８個のアミノ酸残基を含有し
、このペプチドに対して生じた抗体がパブロ分子と免疫複合体を形成するように
パブロポリペプチドのエピトープを包含する。抗原性ペプチドにより包含される
好ましいエピトープは、タンパクの表面に位置するパブロの領域、例えば、親水
性領域である。ある具体例では、抗体はパブロ分子に実質的に特異的に結合する
。別の具体例では、抗体はパブロポリペプチドに特異的に結合する。
【０１３１】 好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも約１０個のアミノ酸残基、より好
ましくは少なくとも約１５個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも
約２０個のアミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも約３０個のアミノ酸残基を
含有する。抗原性ペプチドにより包含される好ましいエピトープは、タンパクの
表面に位置し、かつパブロポリペプチドに独特なパブロポリペプチドの領域、例
えば、親水性領域である。ある具体例では、かかるエピトープは、マウスまたは
ヒトなどのある種に由来するパブロタンパクに特異的であることができる(すな
わち、種を越えて保存されないパブロポリペプチドの領域に及ぶ抗原性ペプチド
が免疫原として用いられる；かかる保存されない残基は、ここに提供したような
整列を用いて決定することができる)。タンパク標準的な疎水性分析は、親水性
領域を同定するのに行うことができる。ある具体例では、ほぼアミノ酸４３６〜
ほぼアミノ酸４５１を含有するペプチド断片を免疫原として用いることができる
。
【０１３２】 パブロ免疫原は、典型的には、適当な被験体(例えば、ウサギ、ヤギ、マウス
または他の哺乳動物)を免疫原で免疫することにより、抗体を調製するのに用い
られる。適当な免疫原性調製物は、例えば、組換え発現されたパブロタンパクま
たは化学的に合成されたパブロペプチドを含有することができる。調製物は、さ
らに、フロイントの完全または不完全アジュバントなどのアジュバントまたは同
様の免疫刺激剤を含有することができる。免疫原性パブロ調製物による適当な被
験体の免疫化は、ポリクローナル抗パブロ抗体応答を誘発する。
【０１３３】 従って、本発明の別の態様は、抗パブロ抗体の使用に関する。ポリクローナル
抗パブロ抗体は、適当な被験体をパブロ免疫原で免疫することにより、上記のよ
うに調製することができる。免疫された被験体の抗パブロ抗体価は、標準的な技
術により、例えば、固定化されたパブロポリペプチドを用いた酵素結合免疫吸着
法(ＥＬＩＳＡ)で、経時的にモノターすることができる。必要なら、パブロポリ
ペプチドに対して生じた抗体分子は、哺乳動物から(例えば、血液から)単離し、
さらに、ＩｇＧ画分を得るタンパクＡクロマトグラフィーなどの公知の技術によ
り精製することができる。免疫後の適当な時間に、例えば、抗パブロ抗体価が最
高であるとき、抗体産生細胞を被験体から得て、コーラー(Kohler)およびミルス
テイン(Milstein)(1975年,ネイチャー(Nature),256:495-497)(また、ブラウン(B
rown)ら,(1981年),ジャーナル・オブ・イムノロジー(J. Immunol.),127:539-46
；ブラウン(Brown)ら,(1980年),ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー(J. Biol. Chem.),225:4980-83；イェー(Yeh)ら,(1976年),ピーナス(PNAS),
76:2927-31；およびイェー(Yeh)ら,(1982年),インターナショナル・ジャーナル
・オブ・キャンサー(Int. J. Cancer),29:269-75を参照)により最初に記載され
たハイブリドーマ技術、ごく最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(コズボール(
Kozbor)ら,(1983年),イムノロジー・トゥデイ(Immunol Today),4:72)、ＥＢＶ-
ハイブリドーマ技術(コール(Cole)ら,(1985年),モノクローナル・アンチボディ
ーズ・アンド・キャンサー・テラピィー(Monoclonal Antibodies and Cancer Th
erapy),アラン・アール・リス，インク(Alan R. Liss, Inc.),第77-96頁)または
トリオーマ技術などの標準的な技術によりモノクローナル抗体を調製するのに用
いることができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマを製造する技術は公知で
ある(一般的には、アール・エイチ・ケネス(R.H. Kenneth),モノクローナル・ア
ンチボディーズ：ア・ニュー・ディメンジョン・イン・バイオロジカル・アナリ
シス(Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses),プレ
ナム・パブリッシング・コーポレーション(Plenum Publishing Corp.),ニューヨ
ーク,ニューヨーク(1980年)；イー・エイ・ラーナー(E.A. Lerner),(1981年),エ
ール・ジャーナル・オブ・バイオロジー・アンド・メディスン(Yale J. Biol. M
ed.),54:387-402；エム・エル・ゲフター(M.L. Gefter)ら,(1977年),ソマティッ
ク・セル・ジェネティックス(Somatic Cell Genet.),3:231-36を参照)。簡単に
は、不死化細胞系(典型的には、骨髄腫)は上記のようにパブロ免疫原で免疫した
哺乳動物に由来するリンパ球(典型的には、脾臓細胞)に融合させ、得られたハイ
ブリドーマ細胞の培養上澄み液をスクリーニングして、パブロポリペプチドに特
異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
【０１３４】 抗パブロモノクローナル抗体を生成させる目的には、リンパ球と不死化細胞系
とを融合させるのに用いられる多くの公知のプロトコルのいずれかを適用するこ
とができる(例えば、ジー・ガルフレ(G. Galfre)ら,(1977年),ネイチャー(Natur
e),266:55052；ゲフター(Gefter)ら,ソマティック・セル・ジェネティックス(So
matic Cell Genet.),前出；ラーナー(Lerner),エール・ジャーナル・オブ・バイ
オロジー・アンド・メディスン(Yale J. Biol. Med.),前出；ケネス(Kenneth),
モノクローナル・アンチボディーズ(Monoclonal Antibodies),前出,を参照)。さ
らに、やはり有用であるかかる方法の多くの変法が存在することを当業者は認識
している。典型的には、不死化細胞系(例えば、骨髄腫細胞系)は、リンパ球と同
じ哺乳動物種から誘導される。例えば、ネズミのハイブリドーマは、本発明の免
疫原性調製物で免疫したマウスに由来するリンパ球を不死化したマウス細胞系と
融合することにより作成することができる。好ましい不死化細胞系は、ヒポキサ
チン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培地(「ＨＡＴ」培地)に感受性
を有するマウス骨髄腫細胞系である。標準的な技術に従って、数多くの骨髄種細
胞系のいずれか、例えば、Ｐ３-ＮＳ１/１-Ａｇ４-１、Ｐ３-ｘ６３-Ａｇ８.６
５３またはＳｐ２/Ｏ-Ａｇ１４骨髄腫系を融合パートナーとして用いればよい。
これらの骨髄種系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ＡＴＣ
Ｃ)(メリーランド州ロックビル)から利用可能である。典型的には、ポリエチレ
ングリコール(「ＰＥＧ」)を用いて、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞をマウス脾
臓細胞に融合させる。次いで、融合から生じたハイブリドーマ細胞を、未融合の
骨髄腫細胞および非生産的に融合した骨髄腫細胞を死滅させるＨＡＴ培地を用い
て選択する(未融合の脾臓細胞は形質転換されていないので数日後に死滅する)。
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば、標準的
なＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ハイブリドーマ培養物の上澄み液をパブロ分子
を結合する抗体についてスクリーニングすることにより検出される。
【０１３５】 モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する別法として、モノク
ローナル抗パブロ抗体は、組換え組み合わせ免疫グロブリンライブラリー(例え
ば、抗体ファージディスプレイライブラリー)をパブロでスクリーニングして、
それにより、パブロポリペプチドを結合する免疫グロブリンライブラリーメンバ
ーを単離することにより、同定し単離することができる。ファイジディスプレイ
ライブラリーを生成させスクリーニングするキットは市販されている(例えば、
ファルマシア(Pharmacia)のリコンビナント・ファージ・アンチボディ・システ
ム(Recombinant Phage Antibody System)、カタログNo.27-9400-01；およびスト
ラタジーン(Stratagene)のサーフザップ・ファージ・ディスプレイ・キット(Sur
fZAPTM Phage Display Kit)、カタログNo.240612)。加えて、抗体ディスプレイ
ライブラリーを生成しスクリーニングする際に用いるのに特に適した方法および
試薬の例は、例えば、ラドナー(Ladner)ら、米国特許第5,223,409号；カン(Kang
)ら、国際公開第WO92/18619号；ダウアー(Dower)ら、国際公開第WO91/17271号；
ウィンター(Winter)ら、国際公開第WO92/20791号；マークランド(Markland)ら、
国際公開第WO92/15679号；ブライトリング(Breitling)ら、国際公開第WO93/0128
8号；マカファーティ(McCafferty)ら、国際公開第WO92/01047号；ギャラード(Ga
rrard)ら、国際公開第WO92/09690号；ラドナー(Ladner)ら、国際公開第WO90/028
09号；フックス(Fuchs)ら,(1991年),バイオ/テクノロジー(Bio/Technology),9:1
370-1372；ヘイ(Hay)ら,(1992年),ヒューマン・アンチボディーズ・アンド・ハ
イブリドーマズ(Hum Antibod Hybridomas),3:81-85；ヒューズ(Huse)ら,(1989年
),サイエンス(Science),246:1275-1281；グリフィス(Griffiths)ら,(1993年),エ
ンボ・ジャーナル(EMBO J),12:725-734；ホーキンス(Hawkins)ら,(1992年),ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J Mol Biol),226:889-896；クラー
クソン(Clarkson)ら,(1991年),ネイチャー(Nature),352:624-628；グラム(Gram)
ら,(1992年),ピーナス(PNAS),89：3576-3580；ギャラード(Garrad)ら,(1991年),
バイオ/テクノロジー(Bio/Technology),9:1373-1377；ホーゲンブーム(Hoogenbo
om)ら,(1991年),ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nuc Acid Res),19:4133-41
37；バルバスら,(1991年),ピーナス(PNAS),88:7978-7982；およびマカファーテ
ィ(McCafferty)ら,ネイチャー(Nature),(1990),348:552-554に見出すことができ
る。
【０１３６】 加えて、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作成することができる、ヒト部分
と非ヒト部分とを含有するキメラおよびヒューマナイズモノクローナル抗体など
の組換え抗パブロ抗体は本発明の範囲内にある。かかるキメラおよびヒューマナ
イズモノクローナル抗体は、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術により、例えば
、ロビンソン(Robinson)ら、国際特許公開PCT/US86/02269；アキラ(Akira)ら、
欧州特許出願第184,187号；タニグチ，エム(Taniguchi, M.)、欧州特許出願171,
496；モリソン(Morrison)ら、欧州特許出願第173,494号；ノイバーガー(Neuberg
er)ら、PCT出願第WO86/01533号；キャビリ(Cabilly)ら、特許出願第4,816,567号
；キャビリ(Cabilly)ら、欧州特許出願第125,023号；ベター(Better)ら,(1988年
),サイエンス(Science),240:1041-1043；リュー(Liu)ら,(1987年),ピーナス(PNA
S),84:3439-3443；リュー(Liu)ら,(1987年),ジャーナル・オブ・イムノロジー(J
. Immunol.),139:3521-3526；サン(Sun)ら,(1987年),ピーナス(PNAS),84:214-21
8；ニシムラ(Nishimura)ら,(1987年),キャンサー・リサーチ(Canc. Res.),47:99
9-1005；ウッド(Wood)ら,(1985年),ネイチャー(Nature),314:446-449；およびシ
ョー(Shaw)ら,(1988年),ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャンサー・イン
スティチュート(J. Natl Cancer Inst.),80:1553-1559；モリソン，エス・エル(
Morrison, S.L.),(1985),サイエンス(Science),229:1202-1207；オイ(Oi)ら,(19
86年),バイオテクニークズ(BioTechniques)4:214；ウィンター(Winter)、米国特
許出願第5,225,539号；ジョーンズ(Jones)ら,(1986年),ネイチャー(Nature),321
:552-525；ヴェルヘーヤン(Verhoeyan)ら,(1988年),サイエンス(Science),239:1
534；およびバイドラー(Beidler)ら,(1988年),ジャーナル・オブ・イムノロジー
(J. Immunol.)141:4053-4060に記載された方法を用いて、産生することができる
。
【０１３７】 加えて、米国特許第5,565,332号に開示されているものなどの標準的なプロト
コルに従って、ヒト型化抗体を作成することができる。別の具体例では、当該分
野で公知の技術を用いて、例えば、米国特許第5,565,332号、第5,871,907号また
は第5,733,743号に記載されているように、特異的結合対メンバーのポリペプチ
ド鎖および複製可能な遺伝子ディスプレイパッケージの成分の融合をコードする
核酸分子を含有するベクターと、単一結合対メンバーの第２ポリペプチド鎖をコ
ードする核酸分子を含有するベクターとの間の組換えにより、抗体鎖または特異
的結合対メンバーを製造することができる。
【０１３８】 抗パブロ抗体(例えば、モノクローナル抗体)は、アフィニティークロマトグラ
フィーまたは免疫沈降法などの標準的な技術により、パブロポリペプチドを単離
するのに用いることができる。抗パブロ抗体は、細胞からの天然のパブロポリペ
プチドの精製および宿主細胞で発現された組換え的に製造されたパブロポリペプ
チドの精製を容易にすることができる。さらに、抗パブロ抗体は、(例えば、細
胞溶解物または細胞上澄み液中の)パブロタンパクを検出するのに用いることが
できる。検出は、抗体を検出可能な物質にカップリングする(すなわち、物理的
に連結する)ことにより容易にしうる。従って、ある具体例では、本発明の抗パ
ブロ抗体は、検出可能な物質で標識される。検出可能な物質の例としては、様々
な酵素、補綴グループ、蛍光材料、ルミネセンス材料および放射活性材料が挙げ
られる。適当な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホス
ファターゼ、β-ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げら
れ、適当な補綴グループ複合体の例としては、ストレプトアビジン/ビオチンお
よびアビジン/ビオチンが挙げられ、適当な蛍光材料の例としては、ウンベリフ
ェロン、フルオロセイン、フルオロセインイソシアネート、ローダミン、ジクロ
ロトリアジニルアミンフルオロセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリ
ンが挙げられ、ルミネセンス材料の例としては、ルミノールが挙げられ、適当な
放射活性材料の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられ
る。
【０１３９】 抗パブロ抗体は、また、 (ａ)動物を免疫原性パブロタンパク、またはパブロポリペプチドに独特なその
免疫原性部分で免疫し、 (ｂ)パブロタンパクに特異的に結合する動物抗体を単離する、 ことを包含する方法により得ることができる。
【０１４０】 従って、ある具体例では、抗パブロ抗体は、例えば、細胞内で用いて、タンパ
ク活性を阻害することができる。細胞内のタンパク機能を阻害するための細胞内
抗体の使用は、当該分野で公知である(例えば、カールソン，ジェイ・アール(Ca
rlson, J.R.),(1988年),モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Mol.
Cell. Biol.),8:2638-2646；バイオッカ，エス(Biocca, S.)ら,(1990年),エンボ
・ジャーナル(EMBO J.),9:101-108；ヴェルゲ，ティー・エム(Werge, T.M.)ら,(
1990年),フェブス・レターズ(FEBS Letters),274:193-198；カールソン，ジェイ
・アール(Carlson, J.R.),(1993年),プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オ
ブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),90:7427-7428；マラスコ，ダブリ
ュー・エイ(Marasco, W.A.)ら,(1993年),プロシーディングズ・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ
・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),90:7889-7893；ビオッカ，エ
ス(Biocca, S.)ら,(1994年),バイオ/テクノロジー(Bio/Technology),12:396-399
；チェン，エス-ワイ(Chen, S-Y)ら,(1994年),ヒューマン・ジーン・テラピー(H
uman Gene Therapy),5:595-601；デュアン，エル(Duan, L)ら,(1994年),プロシ
ーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ
・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)
,91:5075-5079；チェン，エス-ワイ(Chen, S-Y)ら,(1994年),プロシーディング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナ
イテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),91:5932-5
936；ビアリ，アール・アール(Beerli, R.R.)ら,(1994年),ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.),269:23931-23936；ビアリ，ア
ール・アール(Beerli, R.R.)ら,(1994年),バイオケミカル・アンド・バイフィジ
カル・リサーチ・コミュニケーション(Biochem. Biophys. Res. Commun.),204:6
66-672；ムハシカール，エイ・エム(Mhashilkar, A.M.)ら,(1995年),エンボ・ジ
ャーナル(EMBO J.),14:1542-1551；リチャードソン，ジェイ・エイチ(Richardso
n, J.H.)ら,(1995年),プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(P
roc. Natl. Acad. Sci. USA),92:3137-3141；マラスコ(Marasco)らによるPCT公
開第WO94/02610号；およびデュアンらによるPCT公開第WO95/03832号)。
【０１４１】 ある具体例では、抗体鎖をコードする組換え発現ベクターは、このベクターを
細胞に導入すると、抗体鎖が細胞の細胞内小室中に機能的な抗体として発現され
るような形態で調製される。本発明の阻害方法に従ってパブロ活性を阻害するに
は、パブロタンパクを特異的に結合する細胞内抗体を細胞の細胞質で発現させる
。細胞内抗体発現ベクターを調製するために、関心のある標的タンパク(例えば
、パブロ)に特異的な抗体鎖をコードする抗体の軽鎖および重鎖ｃＤＮＡを、典
型的にはパブロタンパクに特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドー
マから単離する。抗パブロモノクローナル抗体または組換え抗パブロモノクロー
ナル抗体を分泌するハイブリドーマは、上記のように調製することができる。パ
ブロタンパクに特異的なモノクローナル抗体がいったん同定されれば(例えば、
ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体または組合せライブラリー由来の組換
え抗体)、このモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは標準
的な分子生物学の技術により単離される。ハイブリドーマ由来の抗体としては、
例えば、ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡライブラリースクリーニングにより、軽鎖お
よび重鎖ｃＤＮＡを得ることができる。ファージディスプレイライブラリー由来
などの組換え抗体としては、軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、ライブラ
リースクリーニング工程の間に単離されるディスプレイパッケージ(例えば、フ
ァージ)から回収することができる。ＰＣＲプライマーまたはｃＤＮＡライブラ
リープローブを調製することができる抗体の軽鎖および重鎖の遺伝子のヌクレオ
チド配列は当該分野で公知である。例えば、多くのこのような配列が、カバット
，イー・エイ(Kabat, E.A.)ら,(1991年),シークエンシズ・オブ・プロテインズ
・オブ・イムノロジカル・インタレスト(Sequences of Proteins of Immunologi
cal Interest),第５版,米国保健福祉省,ＮＩＨ刊行物第91-3242号および「Ｖベ
ース」ヒト生殖細胞系配列データベースに開示されている。
【０１４２】 いったん得られれば、抗体の軽鎖および重鎖の配列は、標準的な方法を用いて
、組換え発現ベクターにクローン化される。軽鎖および重鎖の細胞質発現を可能
にするために、軽鎖および重鎖の疎水性リーダーをコードするヌクレオチド配列
が除去される。細胞内抗体発現ベクターは、いくつかの異なる形態のうちの１つ
で細胞内抗体をコードすることができる。例えば、ある具体例では、ベクターは
、全長の抗体が細胞内で発現されるように、全長の抗体の軽鎖および重鎖をコー
ドする。別の具体例では、ベクターは、全長の軽鎖をコードするが、Ｆａｂ断片
が細胞内で発現されるように、重鎖のＶＨ/ＣＨ１領域だけをコードする。最も
好ましい具体例では、ベクターは単鎖の抗体(ｓｃＦＶ)をコードする。ここで、
軽鎖および重鎖の可変領域は、フレキシブルなペプチドリンカー(例えば、(Ｇｌ
ｙ４Ｓｅｒ)３)により連結され、単鎖分子として発現される。細胞のパブロ活性
を阻害するために、抗パブロ細胞内抗体をコードする発現ベクターは、ここで考
察するように、標準的なトランスフェクション方法により、細胞内に導入される
。
【０１４３】 IV．組換え発現ベクターおよび宿主細胞 本発明の別の態様は、パブロタンパク(またはその一部)をコードする核酸を含
有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本発明の組換え発現ベクタ
ーは、宿主細胞で核酸を発現させるのに適当な形態で、本発明の核酸を含有する
。このことは、組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に機能的に作用
するように連結される、発現に用いるべき宿主細胞に基づいて選択された１個ま
たはそれ以上の調節配列を含有することを意味する。組換え発現ベクター内で、
「機能的に作用するように連結された」とは、関心のあるヌクレオチド配列が、
(例えば、インビトロでの転写/翻訳系内で、またはベクターが宿主細胞に導入さ
れる場合には宿主細胞内で)ヌクレオチド配列の発現を可能にするように、調節
配列に連結されることを意味することを意図する。「調節配列」なる用語は、プ
ロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シ
グナル)を包含することを意図する。かかる制御配列は、例えば、グーデル(Goed
dle)；ジーン・エクスプレッション・テクノロジー：メソッズ・イン・エンザイ
モロジー１８５(Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185)、ア
カデミック・プレス(Academic Press)、カリフォルニア州サンジエゴ(1990年)に
記載されている。調節配列としては、多くのタイプの宿主細胞内でヌクレオチド
配列の構成的発現を導くもの、および、ある種の宿主細胞内でのみヌクレオチド
配列(例えば、組織特異的な調節配列)の発現を導くものが挙げられる。発現ベク
ターの設計が形質転換すべき宿主細胞の選択、所望タンパクの発現のレベルなど
の因子に依存することができることは、当業者により認識される。本発明の発現
ベクターは、宿主細胞内で導入し、それにより、ここに記載した核酸によりコー
ドされる、融合タンパクまたはペプチドを含めて、タンパクまたはペプチド(例
えば、パブロタンパク、パブロタンパクの突然変異体形態、融合タンパクなど)
を製造することができる。
【０１４４】 本発明の組換え発現ベクターは、原核生物または真核生物の細胞におけるパブ
ロタンパクまたはタンパク断片の発現用に設計することができる。例えば、パブ
ロタンパクは、イー・コリ(E. coli)などの細菌細胞、昆虫細胞(バキュロウイル
ス発現ベクターを用いて)、酵母細胞または哺乳動物細胞で発現させることがで
きる。適当な宿主細胞は、さらに、グーデル(Goeddle)；ジーン・エクスプレッ
ション・テクノロジー：メソッズ・イン・エンザイモロジー１８５(Gene Expres
sion Technology:Methods in Enzymology 185)、アカデミック・プレス(Academi
c Press)、カリフォルニア州サンジエゴ(1990年)に考察されている。あるいは、
組換え発現ベクターは、インビトロで、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およ
びＴ７ポリメラーゼを用いて、転写し翻訳することができる。
【０１４５】 原核生物におけるタンパクの発現は、融合または非融合タンパクの発現を導く
構成的または誘発可能なプロモーターを含有するベクターを用いて、イー・コリ
ー(E. coli)で行われるのが最も多い。融合ベクターは、そこのコードされるタ
ンパクに、通常は組換えタンパクのアミノ末端に数多くのアミノ酸を付加する。
かかる融合ベクターは、典型的には、３つの目的に役立つ：１）組換えタンパク
の発現を増大させること；２）組換えタンパクの溶解性を増大させること；およ
び３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより、組換え
タンパクの精製に役立つこと。しばしば、融合発現ベクターでは、タンパク分解
開裂部位が融合部分と組換えタンパクとの接合部に導入され、融合タンパクの精
製に引き続いて融合部分からの組換えタンパクの分離を可能にする。かかる酵素
およびそれらの同種認識配列としては、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロ
キナーゼが挙げられる。典型的な融合発現ベクターとしては、それぞれグルタチ
オンＳ-トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、マルトースＥ結合タンパクまたはタンパ
クＡを標的の組換えタンパクに融合する、ｐＧＥＸ(ファルマシア・バイオテッ
ク・インク(Pharmacia Biotech Inc)；スミス，ディー・ビー(Smith, D.B.)およ
びジョンソン，ケイ・エス(Johnson, K.S.),(1988年),ジーン(Gene),67:31-40)
、ｐＭＡＬ(ニュー・イングランド・バイオラボズ(New England Biolabs),マサ
チューセッツ州ベヴァリー)およびｐＲＩＴ５(ファルマシア(Pharmacia)、ニュ
ージャージー州ピスカタウェイ(Piscataway))が挙げられる。
【０１４６】 精製された融合タンパクは、パブロ活性アッセイ(例えば、以下で詳細に説明
する直接アッセイまたは競合アッセイ)または、例えば、パブロタンパクに特異
的な抗体を生成するのに利用することができる。
【０１４７】 適当な誘発可能な非融合イー・コリ(E. coli)発現ベクターの例としては、ｐ
Ｔｒｃ(アマン(Amann)ら,(1988年),ジーン(Gene),69:301-315)およびｐＥＴ１１
ｄ(スタディア(Studier)ら,ジーン・エクスプレッション・テクノロジー：メソ
ッズ・イン・エンザイモロジー１８５(Gene Expression Technology:Methods in
Enzymology 185)、アカデミック・プレス(Academic Press)、カリフォルニア州
サンジエゴ(1990年)60-89)が挙げられる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発
現は、ハイブリッドｔｒｐ-ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラ
ーゼ転写に依存する。ｐＥＴ１１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、同時発現
されたウイルスＲＮＡポリメラーゼ(Ｔ７ｇｎ１)により媒介されるＴ７ｇｎ１０
-ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは
、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下でＴ７ｇｎ１遺伝子を有する内在プロ
ファージ由来の宿主株ＢＬ２１(ＤＥ３)またはＨＭＳ１７４(ＤＥ３)により供給
される。
【０１４８】 イー・コリ(E. coli)における組換えタンパク発現を最大にするある方法は、
組換えタンパクをタンパク分解的に開裂させる能力が低下した宿主細菌中でタン
パクを発現させることである(ゴッテスマン，エス(Gottesman, S.)ら、ジーン・
エクスプレッション・テクノロジー：メソッズ・イン・エンザイモロジー１８５
(Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185)、アカデミック・プ
レス(Academic Press)、カリフォルニア州サンジエゴ(1990年)119-128)。別の方
法は、発現ベクターに挿入すべき核酸の核酸配列を、各アミノ酸の個々のコドン
がイー・コリ(E. coli)で優先的に利用されるものであるように変更することで
ある(ワダ(Wada)ら,(1992年),ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acid
s Res.),20:2111-2118)。本発明の核酸配列のかかる変更は、標準的なＤＮＡ合
成技術により行うことができる。
【０１４９】 別の具体例では、パブロ発現ベクターは酵母の発現ベクターである。酵母エス
・セリビサエ(S. cerivisae)における発現用ベクターの例としては、ｐＹｅｐＳ
ｅｃ１(バルダリ(Baldari)ら,(1987年),エンボ・ジャーナル(Embo J.),6:229-23
4)、ｐＭＦａ(クリャン(Kurjan)およびヘルスコビッツ(Herskowitz),(1982),セ
ル(Cell),30:933-943)、ｐＪＲＹ８８(シュルツ(Schultz)ら,(1987年),ジーン(G
ene),54:113-123)、ｐＹＥＳ２(インビトロジェン・コーポレーション(Invitrog
en Corporation),カリフォルニア州サンジエゴ)およびｐｉｃＺ(インビトロジェ
ン・コーポレーション(Invitrogen Corporation),カリフォルニア州サンジエゴ)
が挙げられる。
【０１５０】 あるいは、パブロタンパクは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫
細胞で発現することができる。培養された昆虫細胞(例えば、Ｓｆ９細胞)でタン
パクを発現させるのに利用可能なバキュロウイルスとしては、ｐＡｃ系列(スミ
ス(Smith)ら,(1983年),モレキュラー・セル・バイオロジー(Mol. Cell Biol.),3
:2156-2165)およびｐＶＬ系列(ラックロー(Lucklow)およびサマーズ(Summers),(
1989年),ヴィロロジー(Virology),170:31-39)が挙げられる。
【０１５１】 さらに別の具体例では、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて、哺
乳動物細胞で発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８(シ
ード，ビー(Seed, B.),(1987年),ネイチャー(Nature),329:840)およびｐＭＴ２
ｐＣ(カウフマン(Kaufman)ら,(1987年),エンボ・ジャーナル(EMBO J.),6:187-19
5)が挙げられる。哺乳動物細胞で用いる場合、発現ベクターの制御機能は、ウイ
ルス制御要素により与えられることが多い。例えば、通常用いられるプロモータ
ーは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウ
イルス４０から誘導される。原核細胞および真核細胞の両方に対する他の適当な
発現系としては、サムブルック，ジェイ(Sambrook, J.)、フリッツ，イー・エフ
(Fritsh, E.F.)およびマニアティス，ティー(Maniatis, T.)、モレキュラー・ク
ローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory
Manual)、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spri
ng Harbor Laboratory)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プ
レス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、ニューヨーク州コールド・スプ
リング・ハーバー(Cold Spring Harbor)、1989年の第16章および第17章を参照。
【０１５２】 別の具体例では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞タイプにおいて
優先的に核酸の発現を導くことができる(例えば、組織特異的な調節要素を用い
て核酸を発現させる)。組織特異的な調節配列は当該分野で公知である。適当な
組織特異的なプロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター(
肝臓特異的；ピンカート(Pinkert)ら,(1987年),ジーンズ・アンド・ディベロッ
プメント(Genes Dev.),1:268-277)、リンパ球様特異的プロモーター(カラム(Cal
ame)およびイートン(Eaton),(1988年),アドバンシズ・イン・イムノロジー(Adv.
Immunol.),43:235-275)、特にＴ細胞受容体のプロモーター(ウィノト(Winoto)
およびバルチモア(Baltimore),(1989年),エンボ・ジャーナル(EMBO J.),8:729-7
33)および免疫グロブリン(バネルジ(Banerji)ら,(1983年),セル(Cell),33:729-7
40；クイーン(Queen)およびバルチモア(Baltimore),(1983年),セル(Cell),33:74
1-748)、ニューロン特異的なプロモーター(例えば、ニューロフィラメントプロ
モーター；バーン(Byrne)およびラドル(Ruddle),(1989年),プロシーディングズ
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイ
テッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),86:5473-547
7)、膵臓特異的プロモーター(エドルンドら,(1985),サイエンス(Science),230:9
12-916)および乳腺特異的プロモーター(例えば、乳漿プロモーター；米国特許第
4,873,316号および欧州出願公開第264,166号)が挙げられる。発生上調節される
プロモーター、例えば、ネズミｈｏｘプロモーター(ケッセル(Kessel)およびグ
ラス(Gruss),(1990年),サイエンス(Science),249:374-379)およびα-フェトプロ
テインプロモーター(キャンペス(Campes)およびティルマン(Tilghman),(1989年)
,ジーンズ・アンド・ディベロップメント(Genes Dev.),3:537-546)もまた包含さ
れる。
【０１５３】 あるいは、パブロポリペプチドは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて、
昆虫細胞で発現することができる。培養された昆虫細胞(例えば、Ｓｆ９細胞)に
おけるタンパクの発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃ
系列(スミス(Smith)ら,(1983年),モレキュラー・セル・バイオロジー(Mol. Cell
Biol.),3:2156-2165)およびｐＶＬ系列(ラックロー，ブイ・エイ(Lucklow, V.A
.)およびサマーズ，エム・ディー(Summers, M.D.),(1989年),ヴィロロジー(Viro
logy),170:31-39)が挙げられる。
【０１５４】 さらに別の具体例では、本発明の核酸分子は、哺乳動物発現ベクターを用いて
、哺乳動物細胞で発現させる。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＭｅｘ-
ＮｅｏＩ、ｐＣＤＭ８(シード，ビー(Seed, B.),(1987年),ネイチャー(Nature),
329-840)およびｐＭＴ２ＰＣ(カウフマン(Kaufman)ら,(1987年),エンボ・ジャー
ナル(EMBO J.),6:187-195)が挙げられる。哺乳動物で用いる場合、発現ベクター
の制御機能は、ウイルス調節要素により与えられることが多い。例えば、通常用
いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイル
スおよびシミアンウイルス４０から誘導される。
【０１５５】 さらに、哺乳動物細胞に用いる誘発可能な調節系は、当該分野で公知であり、
例えば、遺伝子発現が重金属(例えば、メイヨー(Mayo)ら,(1982年),セル(Cell),
29:99-108；ブリンスター(Brinster)ら,(1982年),ネイチャー(Nature),296:39-4
2；サール(Searle)ら,(1985年),モレキュラー・セル・バイオロジー(Mol. Cell.
Biol.),5:1480-1489を参照)、熱ショック(例えば、ノーエル(Nouer)ら、(1991
年)、ヒート・ショック・レスポンス(Heat Shock Response)中、ノーエル，エル
(Nouer, L.)、シー・アール・シー(CRC)、フロリダ州ボカラトン、第167-220頁
を参照)、ホルモン(例えば、リー(Lee)ら,(1981年),ネイチャー(Nature),294:22
8-232；ハインズ(Hynes)ら,(1981年),プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オ
ブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),78:2038-2042；クロック(Klock)ら
,(1987年),ネイチャー(Nature),329:734-736；イスラエル(Israel)およびカウフ
マン(Kaufman),(1989年),ニュークリア・アシッズ・リサーチ(Nucl. Acids Res.
),17:2589-2604；およびPCT公開第WO93/23431号を参照)、ＦＫ５０６-関連分子(
例えば、PCT公開第WO94/18317を参照)またはテトラサイクリン(ゴッセン，エム(
Gossen, M.)およびビュジャード，エイチ(Bujard, H.),(1992年),プロシーディ
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・
ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),89:55
47-5551；ゴッセン，エム(Gossen, M.)ら,(1995年),サイエンス(Science),268:1
766-1769；PCT公開第WO94/29442号およびPCT公開第WO96/01313号)で調節される
系である。従って、別の具体例では、本発明は、パブロＤＮＡが機能的に作用す
るように誘発可能な真核生物プロモーターに連結され、それにより、真核細胞に
おけるパブロタンパクの発現を可能にする組換え発現ベクターを提供する。
【０１５６】 本発明は、さらに、発現ベクターにアンチセンス配向でクローン化された本発
明のＤＮＡ分子を含有する組換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分
子は、パブロｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の(ＤＮＡ分子の
転写による)発現を可能にする方法で、機能的に作用するように調節配列に連結
される。アンチセンス配向でクローン化された核酸に機能的に作用するように連
結された、様々な細胞タイプにおけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続発現を導く
調節配列、例えば、ウイルスプロモーターおよび/またはエンハンサーを選択す
ることができ、また、アンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的または細胞タイ
プ特異的な発現を導く調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベク
ターは、アンチセンス核酸が高効率の調節領域の制御下に製造され、その活性が
ベクターを導入した細胞タイプにより測定することができる、組換えプラスミド
、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態とすることができる。アンチセンス
遺伝子を用いた遺伝子発現の調節に関する考察については、ワイントラウブ，エ
イチ(Weintraub, H.)ら,遺伝分析の分子ツールとしてのアンチセンスＲＮＡ,レ
ビューズ-トレンズ・イン・ジェネティックス(Reviews-Trends in Genetics),第
１巻(1),1986年を参照。
【０１５７】 本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞
に関する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」なる用語は、ここでは交換可
能に用いられる。かかる用語は、特定の被験体細胞だけでなく、かかる細胞の子
孫または潜在的な子孫をも意味すると理解されるべきである。突然変異または環
境の影響により世代を継承する際に、ある種の変化が起こるので、かかる子孫は
、実際には、親細胞を同一ではないかもしれないが、依然として、ここで用いる
用語の範囲内に包含される。
【０１５８】 宿主細胞は、原核細胞または真核細胞とすることができる。例えば、パブロタ
ンパクは、イー・コリ(E. coli)などの細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳動
物細胞(例えば、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)またはＣＯＳ細胞)
で発現することができる。他の適当な宿主細胞は当該分野で公知である。
【０１５９】 ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術により、
原核細胞または真核細胞に導入することができる。ここで用いるように、「形質
転換」および「トランスフェクション」なる用語は、宿主細胞に外来核酸(例え
ば、ＤＮＡ)を導入するための様々な当該分野で認識されている技術、例えば、
リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ-デキストラン-媒介性ト
ランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションなどを意
味することを意図する。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするの
に適当な方法は、サムブルック(Sambrook)ら(モレキュラー・クローニング：ア
・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、第２
版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Labo
ratory)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press)、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー
(Cold Spring Harbor)、1989年)および他の実験室マニュアルに見出すことがで
きる。
【０１６０】 哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションの場合、用いた発現ベクターおよ
びトランスフェクション技術に依存して、わずかな画分の細胞だけが外来ＤＮＡ
をそれらのゲノムに組み込みうることが知られている。これらの組込み体を同定
し選択するために、選択可能なマーカー(例えば、構成物質に対する耐性)をコー
ドする遺伝子が、一般的に、関心のある遺伝子と共に宿主細胞に導入される。好
ましい選択可能なマーカーとしては、薬物(例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシ
ンおよびメトトレキサート)に対する耐性を付与するものが挙げられる。選択可
能なマーカーをコードする核酸は、パブロタンパクをコードするものと同じベク
ターで宿主細胞に導入することができるし、別のベクターで導入することができ
る。導入された核酸で安定にトランスフェクトした細胞は、薬物選択により同定
することができる(例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存
するが、他の細胞は死滅する)。
【０１６１】 パブロで安定にトランスフェクトした神経細胞の場合、かかる系は、例えば、
ＰＣ１２Ｔｅｔ-Ｏｆｆ細胞系(クローンテック(Clontech)から市販されている；
カリフォルニア州パロアルト)を用いて、パブロ遺伝子が誘発可能なように作成
することができる。例えば、発現された遺伝子の調節は、テトラサイクリン応答
要素(ＴＲＥ)を含むプロモーター配列の制御下における第１の「調節」プラスミ
ド(ｔｅｔ制御されたトランスアクチベーター(ｔＴＡ)を含有)および第２の「調
節」プラスミド(パブロを含有)の二重の安定な発現により達成することができる
。市販されている調節プラスミドは、ネオマイシン選択用に構築されたベクター
中に存在するが、これは応答ベクターが第２の選択可能なマーカーを含むように
構築されることを必要とする。かかる細胞系の構築は、添付の実施例により詳し
く説明されている。かかる方法を用いて、パブロ発現は、薬剤、例えば、テトラ
サイクリンまたはテトラサイクリン関連化合物(例えば、ドキシサイクリン)の存
在下でターンオフし、薬剤、例えば、テトラサイクリンが培地に加えられない場
合にターンオンすることができる。このタイプの細胞系の構築は、それが通常は
毒性である細胞内でのパブロの安定な発現を可能にする。
【０１６２】 本発明の宿主細胞、例えば、培養している原核または真核宿主細胞は、パブロ
タンパクを製造する(すなわち、発現させる)のに用いることができる。従って、
本発明は、さらに、本発明の宿主細胞を用いてパブロタンパクを製造する方法を
提供する。ある具体例では、この方法は、(パブロタンパクをコードする組換え
発現ベクターが導入されている)本発明の宿主細胞をパブロタンパクが製造され
るように適当な培地で培養することを包含する。別の具体例では、この方法は、
さらに、培地または宿主細胞からパブロタンパクを単離することを包含する。
【０１６３】 本発明のある種の宿主細胞は、また、非ヒト形質転換動物を製造するのに用い
ることができる。例えば、ある具体例では、本発明の宿主細胞は、パブロをコー
ドする配列が導入されている受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、か
かる宿主細胞は、外生パブロ配列がそれらのゲノムに導入されている非ヒト形質
転換動物または内生パブロ配列が変更されている相同組換え動物を作成するのに
用いることができる。かかる動物は、パブロポリペプチドの機能および/または
活性を研究するのに、および、パブロ活性の調節物質を同定および/または評価
するのに有用である。ここで用いるように、「形質転換動物」は、この動物の細
胞の１個またはそれ以上が導入遺伝子を含有する、非ヒト動物、好ましくは哺乳
動物、より好ましくはラットまたはマウスなどのげっ歯類である。形質転換動物
の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生
類などが挙げられる。導入遺伝子は、形質転換動物が発生する細胞のゲノムに組
み込まれ、成熟した動物のゲノム中に残存し、それにより、形質転換動物の１種
またはそれ以上の細胞タイプまたは組織におけるコードされた遺伝子産物の発現
を導く外生ＤＮＡである。ここで用いるように、「相同組換え動物」は、この動
物の発生の前に、内生遺伝子とこの動物の細胞(例えば、この動物の胚細胞)中に
導入された外生ＤＮＡ分子との間における相同組換えにより内生パブロ遺伝子が
変更されている、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスを意
味する。
【０１６４】 本発明の形質転換動物は、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイル
ス感染により、パブロをコードする核酸を受精卵母細胞の雄性前核に導入し、こ
の卵母細胞を偽妊娠の雌養育動物で発生させることにより作成することができる
。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のパブロ配列またはその一部は、導入遺伝子として非ヒ
ト動物のゲノムに導入することができる。あるいは、パブロ遺伝子の非ヒト相同
物、例えば、マウスまたはラットのパブロ遺伝子を導入遺伝子として用いること
ができる。あるいは、パブロ遺伝子相同物、例えば、別のパブロファミリーメン
バーは、(上でさらに説明した)ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のパブロファミリーｃＤＮ
Ａに対するハイブリダイゼーションに基づいて単離し、導入遺伝子として用いる
ことができる。かかる形質転換系は、パブロタンパクの発生的およびホメオスタ
シス的な役割を解明するために、パブロに導かれたリード化合物の効力を試験し
、ならびに内生パブロ機能を干渉するのに有用である。
【０１６５】 イントロン配列およびポリアデニレーションシグナルは、また、導入遺伝子に
含められ、導入遺伝子の発現の効率を上昇させることができる。組織特異的な調
節配列は、パブロ導入遺伝子に機能的に作用するように連結され、パブロタンパ
クの発現を特定の細胞、例えば、ＣＮＳまたはニューロンに導くことができる。
遺伝子導入パブロ発現に有用な組織特異的なプロモーターの例としては、Ｔｈｙ
１.２プロモーター(例えば、キャロニ(Caroni),(1997年),ジャーナル・オブ・ニ
ューロサイエンス・メソッズ(J. Neurosci. Methods),71:3-9；ゴードン(Gordon
)ら,(1987年),セル(Cell),50:445-452；ヴァイダル(Vidal)ら,(1990年),ジーン
ズ・アンド・ディベロップメント(Genes and Development),5:1136-1148)および
ニューロン特異的なエノラーゼプロモーター(ＮＳＥ；例えば、フォルス-ペッタ
ー(Forss-Petter)ら,(1990年),ニューロン(Neuron),5:187-197；チェン(Chen)ら
,(1998年),モレキュラー・ファーマコロジー(Mol. Pharmacology),54:495-503)
が挙げられる。あるいは、意図的に調節可能な発現系を用いて、形質転換系にお
けるパブロ発現を所望の時点で誘発または抑制してもよい。これは、例えば、遺
伝子導入発現の可能な発生上の致死効果を回避するのに有用である。例えば、テ
トラサイクリン依存性の発現系が成功裏に採用されている(例えば、フルス(Furt
h)ら,(1994年),ピーナス(PNAS),91:9302-9306；ゴッセン(Gossen)ら,(1995年),
サイエンス(Science),268:1766-1769；米国特許第5,992,927号、第5,866,755号
、第5,859,310号を参照；また、http://www.clontech.com/tet/を参照)。これら
の系の変更も開発されている。例えば、リプレッサードメインをトランスアクチ
ベーターに融合させることができる。例えば、デューシュル(Deuschle)ら,(1995
年),モレキュラー・セル・バイオロジー(Mol. Cell. Biol.),15:1907-1941を参
照。
【０１６６】 胚操作およびマイクロインジェクションにより形質転換動物、特にマウスなど
の動物を作成する方法は、当該分野では普通になってきており、例えば、米国特
許第4,736,866号および第4,870,009号(共にレーダー(Leder)らによる)、米国特
許法第4,873,191号(ワグナー(Wagner)らによる)およびホーガン，ビー(Hogan, B
.)、マニピュレーティング・ザ・マウス・エンブリオ(Manipulating the Mouse
Embryo)、(コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press)、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバ
ー(Cold Spring Harbor)、1986年)に記載されている。同様の方法は、他の形質
転換動物の製造に用いられる。形質転換始祖動物は、そのゲノム中におけるパブ
ロ導入遺伝子の存在および/または動物の組織もしくは細胞中におけるパブロｍ
ＲＮＡの発現に基づいて同定することができる。次いで、形質転換始祖動物は、
導入遺伝子を有する付加的な動物を繁殖させるのに用いることができる。さらに
、パブロタンパクをコードする導入遺伝子を有する形質転換動物は、さらに、他
の導入遺伝子を有する他の形質転換動物に交配することができる。
【０１６７】 相同組換え動物を作成するには、欠失、付加または置換が導入され、それによ
り、パブロ遺伝子が変更され、例えば、機能的に破壊されているパブロ遺伝子の
少なくとも一部を含有するベクターを調製する。例えば、マウスのパブロ遺伝子
は、マウスゲノムにおける内生パブロ遺伝子を変更するのに適当な相同組換えベ
クターを構築するのに用いることができる。好ましい具体例では、ベクターは、
相同組換えにより、内生パブロ遺伝子が機能的に破壊される(すなわち、もはや
機能的なタンパクをコードしない；「ノックアウト」ベクターとも呼ばれる)よ
うに設計される。あるいは、導入遺伝子は、形質転換動物内で過剰発現されると
、競合により内生パブロの活性を排除する、パブロ遺伝子の優性阻害突然変異体
である。好ましくは、優性阻害形態のパブロは、パブロ分子のテイル部分を含有
し、またはそれからなる。あるいは、ベクターは、相同組換えにより、内生パブ
ロ遺伝子が突然変異または変更されるが、依然として機能的なタンパクをコード
するように設計することができる(例えば、上流調節領域を変更し、それにより
内生パブロタンパクの発現を変更することができる)。相同組換えベクターにお
いて、パブロ遺伝子の変更された部分は、その５'および３'末端に、パブロ遺伝
子の付加的な核酸配列が隣接しており、ベクターの有する外生パブロ遺伝子と胚
性幹細胞中の内生パブロ遺伝子との間に相同組換えが生じることを可能にする。
付加的な隣接するパブロ核酸配列は、内生遺伝子との成功裏の相同組換えに十分
な長さである。典型的には、数キロ塩基の(５'および３'末端の両方で)隣接する
ＤＮＡがベクターに含められる(例えば、相同組換えベクターの説明については
、トーマス，ケイ・アール(Thomas, K.R.)およびカペッチ，エム・アール(Capec
chi, M.R.),(1987年),セル(Cell),51:503を参照)。ベクターは、(例えば、エレ
クトロポレーションにより)胚性幹細胞系に導入され、導入されたパブロ遺伝子
が内生パブロ遺伝子と相同組換えされている細胞を選択する(例えば、リー，イ
ー(Li, E.)ら,(1992年),セル(Cell),69:915を参照)。次いで、選択された細胞は
、動物(例えば、マウス)の胚盤胞に注入され、集合キメラを形成する(例えば、
ブラッドリー，エイ(Bradley, A.)ら,テラトカルシノーマズ・アンド・エンブリ
オニック・ステム・セルズ：ア・プラクティカル・アプローチ(Teratocarcinoma
s and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach)、イー・ジェイ・ロバー
トソン(E.J. Robertson)編、(IRL、オックスフォード、1987年)、第113-152頁を
参照)。次いで、キメラ胚は、適当な偽妊娠の雌養育動物に移植し、胚を出産ま
で至らせることができる。胚細胞に相同組換えＤＮＡを有する子孫は、導入遺伝
子の生殖細胞系伝達により動物の全部の細胞が相同組換えＤＮＡを含有する動物
を繁殖させるのに用いることができる。相同組換えベクターおよび相同組換え動
物を構築する方法は、さらに、ブラッドリー，エイ(Bradley, A.),(1991年),カ
レント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー(Current Opinion in Biotechn
ology),2:823-829およびPCT国際公開第WO90/11354号(ル・ムレック(Le Mouellec
)らによる)；第WO91/01140号(スミシーズ(Smithies)らによる)；第WO92/0968号(
ジルストラ(Zijlstra)らによる)；およびWO93/04169(バーンズ(Berns)らによる)
に記載されている。所望のノックアウトは、また、市販されている(例えば、テ
キサス州ザ・ウッドランズ(The Woodlands)のレキシコン・ジェネティックス(Le
xicon Genetics)の「オムニバンク」(OmniBank)；例えば、http://www.lexgen.c
omを参照)単一位置突然変異の胚性幹細胞のライブラリーから容易に同定するこ
とができる。
【０１６８】 上記に加えて、相同組換えに関する当該分野で公知の他のアプローチを本発明
に適用することができることを当業者は認識している。酵素支援部位特異的組込
系は当該分野で公知であり、第２の標的ＤＮＡ分子の予め決められた位置にＤＮ
Ａ分子を組み込むのに適用することができる。かかる酵素支援組込系の例として
は、Ｃｒｅリコンビナーゼ-ｌｏｘ標的系(例えば、バウボニス，ダブリュー(Bau
bonis, W.)およびザウアー，ビー(Sauer, B.),(1993年),ニュクリアー・アシッ
ズ・リサーチ(Nucl. Acids Res.),21:2025-2029；およびフクシゲ，エス(Fukush
ige, S.)およびザウアー，ビー(Sauer, B.),(1992年),プロシーディングズ・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッ
ド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),89:7905-7909に
記載されている)およびＦＬＰリコンビナーゼ-ＦＲＴ標的系(例えば、ダン，デ
ィー・ティー(Dang, D.T.)およびペリモン，エヌ(Perrimon, N.),(1992年),ディ
ベロップメンタル・ジェネティクス(Dev. Genet.),13:367-375；およびフィーリ
ング，エス(Fiering, S.)ら,(1993年),プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・
オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),90:8469-8473に記載されている)
が挙げられる。テトラサイクリンで調節される誘発可能な相同組換え系(例えば
、PCT公開第WO94/29442号およびPCT公開第WO96/01313号に記載されている)を用
いることもできる。
【０１６９】 例えば、別の具体例では、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択され
た系を含有する形質転換非ヒト動物を製造することができる。かかる系の一例は
、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ/ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ/
ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の説明については、例えば、ラクソ(Lakso)ら,(1992
年),プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad.
Sci. USA),89:6232-6236を参照。組換え系の別の例は、サッカロミセス・セレ
ビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)のＦＬＰリコンビナーゼ系である(オ・ゴ
ーマン(O'Gorman)ら,(1991年),サイエンス(Science),251:1351-1355)。ｃｒｅ/
ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を用いて導入遺伝子の発現を調節するのであれば、Ｃ
ｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパクの両方をコードする導入遺伝子を
含有する動物が必要とされる。かかる動物は、「二重」形質転換動物の構築によ
り、例えば、一方は選択されたタンパクをコードする導入遺伝子を含有し、他方
はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含有する２頭の形質転換動物をかけ
合わせることにより、提供することができる。
【０１７０】 ここに記載した非ヒト形質転換動物のクローンは、また、ウィルムート，アイ
(Wilmut, I.)ら,(1997年),ネイチャー(Nature),385:810-813およびPCT国際公開
第WO97/07668号および第WO97/07669号に記載の方法に従って製造することができ
る。簡単には、形質転換動物に由来する細胞、例えば、体細胞を単離し、成長サ
イクルを脱し、Ｇ０期に入るように誘発することができる。次いで、休止細胞は
、例えば、電気パルスの使用により、休止細胞が単離される同じ種の動物に由来
する除核卵母細胞に融合させることができる。次いで、再構築された卵母細胞は
、桑実胚または胚胞に発達させた後、偽妊娠の雌養育動物に移す。この雌養育動
物から生まれた子は、細胞、例えば、体細胞が単離される動物のクローンである
。
【０１７１】 Ｖ．本発明の使用および方法 パブロ活性または発現を調節する薬剤(例えば、ここに記載した核酸分子、タ
ンパク、タンパク相同物、および抗体)は、以下の方法の１つまたはそれ以上に
用いることができる：ａ）治療の方法、例えば、アポローシス、好ましくは神経
細胞のアポトーシスを上方調節または下方調節；ｂ）スクリーニングアッセイ；
ｃ）予知医学(例えば、診断アッセイ、予後アッセイ、モニタリング臨床試験、
または薬理遺伝学)。本発明の単離された核酸分子は、以下でさらに説明するよ
うに、例えば、パブロタンパクを発現させるのに(例えば、遺伝子治療への応用
における宿主細胞の組換え発現ベクターにより)、パブロｍＲＮＡ(例えば、生物
学的試料における)またはパブロ遺伝子の遺伝学的変化を検出するのに、また、
パブロ活性を調節するのに用いることができる。パブロタンパクは、また、パブ
ロインヒビターの過少または過剰産生により特徴付けられる障害を治療するのに
用いることができる。加えて、パブロタンパクは、天然に存在するパブロ結合タ
ンパクをスクリーニングするのに、パブロ活性を調節する薬物または化合物をス
クリーニングするのに、ならびにパブロの調節から利益を得る、例えば、パブロ
タンパクの過少もしくは過剰産生、または、パブロ野生型タンパクに比べて減少
した活性もしくは異常な活性を有するパブロタンパク形態の産生により特徴付け
られる障害を治療するのに用いることができる。さらに、本発明の抗パブロ抗体
は、パブロタンパクを検出および単離するのに、パブロタンパクの生物学的利用
能を調節するのに、およびパブロ活性を調節するのに、例えば、アポトーシスを
調節するのに用いることができる。好ましい具体例では、本発明の方法、例えば
、パブロなどの検出、調節は、神経細胞、例えば、中枢神経系または末梢神経系
の細胞で行われる。
【０１７２】 Ａ．パブロを調節する方法： 本発明は、例えば、パブロ発現および/または活性を調節する薬剤を同定する
目的で、細胞中のパブロを調節する方法、ならびに、異常なパブロ発現もしくは
活性に関連する障害またはパブロ活性の調節から利益を得る障害の危険性のある
(または感受性のある)または障害を有する患者を治療する予防および治療方法の
両方を提供する。
【０１７３】 本発明のさらに別の態様は、細胞中のパブロ発現および/または活性を調節す
る方法に関する。本発明の調節方法は、細胞を、パブロ発現および/または活性
を調節する薬剤と接触させ、細胞中のパブロ発現および/または活性を調節させ
ることを必要とする。この薬剤は、細胞中のパブロタンパクの活性を調節するこ
とにより、またはパブロ遺伝子の転写もしくはパブロｍＲＮＡの翻訳を調節する
ことにより作用しうる。
【０１７４】 従って、ある具体例では、この薬剤はパブロ活性を阻害する。阻害剤は、例え
ば、パブロ前アポトーシス活性を直接的に阻害することにより、またはパブロを
阻害的に調節するシグナリング経路を調節することにより機能しうる。別の具体
例では、この薬剤はパブロ活性を刺激する。刺激剤は、例えば、パブロ前アポト
ーシス活性を直接的に刺激することにより、またはパブロ活性の刺激をもたらす
シグナリング経路を調節することにより機能しうる。例示的な阻害薬としては、
アンチセンスパブロ核酸分子(例えば、パブロｍＲＮＡの翻訳を阻害する)、細胞
内抗パブロ抗体(パブロタンパクの活性を阻害する)、およびパブロタンパクの優
性阻害突然変異体(例えば、ここに記載したテイル構築物)が挙げられる。パブロ
タンパクの活性を阻害するのに用いることができる他の阻害剤は、パブロアポト
ーシス活性を阻害する化学化合物である。かかる化合物は、ここに説明したよう
に、かかる化合物を選択するスクリーニングアッセイを用いて同定することがで
きる。付加的にまたは代わりに、パブロアポトーシス活性を阻害する化合物は、
当該分野で公知のアプローチを用いて設計することができる。
【０１７５】 本発明の別の調節方法に従って、パブロ活性は、細胞を刺激剤と接触させるこ
とにより、細胞中で刺激される。かかる刺激剤の例としては、活性パブロタンパ
ク、および細胞中のパブロ活性を増大させるのに細胞に導入される、パブロをコ
ードする核酸分子が挙げられる。好ましい刺激剤は、パブロタンパクをコード刷
る核酸分子である。ここで、核酸分子は、細胞中における活性パブロタンパクの
発現に適した形態で細胞中に導入される。細胞中でパブロタンパクを発現させる
には、典型的には、ここに説明したように、標準的な分子生物学の技術を用いて
、パブロｃＤＮＡをまず組換え発現ベクターに導入する。パブロｃＤＮＡは、こ
こに説明したように、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を用いた増幅によ
り、または適当なｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより得るこ
とができる。パブロｃＤＮＡの単離または増幅に続いて、ＤＮＡ断片は、ここに
説明したように、標準的な方法で発現ベクターに導入され、標的細胞にトランス
フェクトされる。パブロタンパクの活性および/または発現を刺激するのに用い
ることができる他の刺激薬剤は、細胞中におけるパブロ活性および/または発現
を刺激する化学化合物、例えば、パブロ前アポトーシス活性を増強する化合物で
ある。かかる化合物は、ここに詳細に説明したように、かかる化合物を選択する
スクリーニングアッセイを用いて同定することができる。
【０１７６】 本発明の調節方法は、インビトロで(例えば、細胞を薬剤で培養することによ
り、または薬剤を培養中の細胞に導入することにより)、あるいはインビボで(例
えば、薬剤を患者に投与することにより、または薬剤を患者の細胞に導入するこ
とにより、例えば、遺伝子治療により)、行うことができる。インビトロで調節
方法を実施するには、細胞を標準的な方法により患者から得て、インビトロで本
発明の調節剤と共にインキュベートして(すなわち、培養して)、細胞中のパブロ
活性を調節することができる。
【０１７７】 核酸を含有する刺激剤または阻害剤(パブロタンパクをコードする組換え発現
ベクター、アンチセンスＲＮＡ，細胞内抗体または優性阻害インヒビターを含む
)の場合、これらの薬剤は、核酸(例えば、ＤＮＡ)をインビボで細胞に導入する
ための当該分野で公知の方法を用いて、患者の細胞に導入することができる。か
かる方法の例としては、非ウイルス法およびウイルス法が挙げられる。例えば、
【０１７８】 直接感染：裸のＤＮＡは、このＤＮＡを細胞に直接的に注入することにより、
インビボで細胞に導入することができる(例えば、アクサディ(Acsadi)ら,(1991
年),ネイチャー(Nature),332:815-818；ヴォルフ(Wolff)ら,(1990年),サイエン
ス(Science),247:1465-1468)。例えば、ＤＮＡをインビボで細胞に注入する送達
装置(例えば、「遺伝子ガン」)を用いることができる。かかる装置は市販されて
いる(例えば、バイオラッド(BioRad))。
【０１７９】 カチオン性脂質：裸のＤＮＡは、このＤＮＡをカチオン性脂質と複合体化し、
このＤＮＡをカチオン性リポソームにカプセル化することにより、インビボで細
胞に導入することができる。適当なカチオン性脂質製剤の例としては、Ｎ-[-１-
(２,３-ジオレオイルオキシ)プロピル]-Ｎ,Ｎ,Ｎ-トリエチルアンモニウムクロ
リド(ＤＯＴＭＡ)およびモル比１：１の１,２-ジミリスチルオキシ-プロピル-３
-ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(ＤＭＲＩＥ)およびジオレオ
イルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)(例えば、ローガン，ジェイ・
ジェイ(Logan, J.J.)ら,(1995年),ジーン・テラピー(Gene Therapy),2:38-49；
サン，エイチ(San, H.)ら,(1993年),ヒューマン・ジーン・テラピー(Human Gene
Therapy),4:781-788を参照)が挙げられる。
【０１８０】 受容体媒介性のＤＮＡ取り込み：裸のＤＮＡは、また、このＤＮＡをカチオン
(例えば、ポリリジン)に複合体化し、これを細胞表面受容体のリガンドにカップ
リングさせることにより、インビボで細胞に導入することができる(例えば、ウ
ー，ジー(Wu, G.)およびウー，シー・エイチ(Wu, C.H.),(1988年),ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.),263:14621；ウィルソン
(Wilson)ら,(1992年),ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Bi
ol. Chem.),267:963-967；および米国特許第5,166,320号を参照)。ＤＮＡ-リガ
ンド複合体の受容体への結合は、受容体媒介性のエンドサイトーシスによりＤＮ
Ａの取り込みを容易にする。天然でエンドソームを破壊し、それにより、物質を
細胞質内に放出するアデノウイルスのキャプシッドに連結したＤＮＡ-リガンド
複合体は、細胞内リソソームによる複合体の分解を回避するのに用いることがで
きる(例えば、キュリール(Curiel)ら,(1991年),プロシーディングズ・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ス
テイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),88:8850；クリスチアー
ノ(Cristiano)ら,(1993年),プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメ
リカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),90:2122-2126を参照)。
【０１８１】 レトロウイルス：不完全なレトロウイルスは、遺伝子治療の目的で遺伝子移入
に用いるために十分に特徴付けられている(総説については、ミラー，エイ・デ
ィー(Miller, A.D.),(1990年),ブラッド(Blood),76:271)。関心のあるヌクレオ
チド配列をレトロウイルスゲノムに組み込んだ組換えレトロウイルスを構築する
ことができる。加えて、レトロウイルスゲノムの部分は、レトロウイルスの複製
を不完全にするために除去することができる。次いで、複製の不完全なレトロウ
イルスはビリオンにパッケージ化される。これは、標準的な技術により、ヘルパ
ーウイルスの使用を介して、標的細胞を感染させるのに用いることができる。か
かるウイルスを用いて、インビトロまたはインビボで、組換えレトロウイルスを
製造するプロトコルおよび細胞を感染させるプロトコルは、カレント・プロトコ
ルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Current Protocols in Molecular Bi
ology)、アウスユーベル，エフ・エム(Ausubel, F.M.)ら(編)、グリーン・パブ
リッシング・アソシエーツ(Greene Publishing Associates),(1989年),第9.10-9
.14章および他の標準的な実験室マニュアルに見出すことができる。適当なレト
ロウイルスの例としては、当業者に公知のｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥ
Ｍが挙げられる。適当なパッケージ化ウイルス系の例としては、ΨＣｒｉｐ、Ψ
Ｃｒｅ、Ψ２およびΨＡｍが挙げられる。レトロウイルスは、様々な遺伝子をイ
ンビトロおよび/またはインビボで多くの異なる細胞タイプ、例えば、上皮細胞
、内皮細胞、リンパ球、筋原細胞、肝細胞、骨髄細胞などに導入するのに用いら
れている(例えば、エグリティス(Eglitis)ら,(1985年),サイエンス(Science),23
0:1395-1398；ダノス(Danos)およびマリガン(Mulligan),(1988年),プロシーディ
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・
ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),85:64
60-6464；ウィルソン(Wilson)ら,(1988年),プロシーディングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイ
ツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),85:3014-3018；アルメンタ
ーノ(Armentano)ら,(1990年),プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・ア
メリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),87:6141-6145；ヒューバー(Huber)ら,(19
91年),プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA),88:8039-8043；フェリー(Ferry)ら,(1991年),プロシーディングズ
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイ
テッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),88:8377-838
1；チョードリ(Chowdhury)ら,(1991年),サイエンス(Science),254:1802-1805；
ヴァン・ボイゼヘム(van Beusechem)ら,(1992年),プロシーディングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・
ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),89:7640-7644；ケイ(
Kay)ら,(1992年),ヒューマン・ジーン・テラピー(Human Gene Therapy),3:641-6
47；ダイ(Dai)ら,(1992年),プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメ
リカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),89:10892-10895；ヒュー(Hwu)ら,(1993年),
ジャーナル・オブ・イムノロジー(J. Immunol.),150:4104-4115；米国特許第4,8
68,116号；米国特許第4,980,286号；PCT出願第WO89/07136号；PCT出願第WO89/02
468号；PCT出願第WO89/05345号；およびPCT出願第WO92/07573号を参照)。レトロ
ウイルスベクターは、レトロウイルスゲノムが宿主ゲノムに組み込まれて、核酸
が細胞内に安定に導入されるために、標的細胞の分割を必要とする。かくして、
標的細胞の複製を刺激する必要がありうる。
【０１８２】 アデノウイルス：アデノウイルスのゲノムは、それが関心のある遺伝子産物を
コードし発現するが、正常な細胞溶解ウイルスライフサイクルにおいて複製する
その能力に関して不活性化されているように操作することができる。例えば、バ
ークナー(Berkner)ら,(1988年),バイオ・テクニークズ(BioTechniques),6:616；
ローゼンフェルド(Resenfeld)ら,(1991年),サイエンス(Science),252:431-434；
およびローゼンフェルド(Resenfeld)ら,(1991年),セル(Cell),68:143-155を参照
。アデノウイルス株Ａｄタイプ５ｄｌ３２４または他のアデノウイルス株から誘
導される適当なアデノウイルスベクターが当業者に公知である。組換えアデノウ
イルスは、それらが有効な遺伝子送達手段である細胞を分割させる必要がなく、
多種多様の細胞タイプ、例えば、気道上皮(ロゼンフェルド(Rosenfeld)ら,(1992
年),前出)、内皮細胞(レマルチャンド(Lemarchand)ら,(1992年),プロシーディン
グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユ
ナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),89:6482
-6486)、肝細胞(ヘルツ(Herz)およびゲラルド(Gerard),(1993年),プロシーディ
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・
ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),90:28
12-2816)および筋肉細胞(クァンチン(Quantin)ら,(1992年),プロシーディングズ
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイ
テッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),89:2581-258
4)を感染させるのに用いることができる点で有利である。加えて、導入されたア
デノウイルスＤＮＡ(およびそこに含有される外来ＤＮＡ)は、宿主細胞のゲノム
に組み込まれないが、エピソームに残存し、それゆえ、導入されたＤＮＡが宿主
ゲノム(例えば、レトロウイルスＤＮＡ)の組み込まれるようになった場合に挿入
突然変異の結果として生じることができる潜在的な問題を回避する。さらに、外
来ＤＮＡに対するアデノウイルスゲノムの保持能力は、他の遺伝子送達手段に比
べて大きい(８キロ塩基まで)(バークナー(Berkner)ら,前出；ハジ-アーマンド(H
aj-Ahmand)およびグラハム(Graham),(1986年),ジャーナル・オブ・ヴィロロジー
(J. Virol.),57:267)。現在用いられているたいていの複製の不完全なアデノウ
イルスベクターは、ウイルスＥ１およびＥ３遺伝子の全部または一部を欠いてい
るが、アデノウイルス遺伝物質の８０％程度は保持している。
【０１８３】 アデノ関連ウイルス：アデノ関連ウイルス(ＡＡＶ)は、有効な複製および生産
的なライフサイクルに別のウイルス、例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウ
イルスをヘルパーウイルスとして必要とする天然に存在する不完全ウイルスであ
る。(総説については、ムジクツカ(Muzyczka)ら,カレント・トピックス・イン・
マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー(Curr. Topics in Micro. and Im
munol.),(1992年),158:97-129を参照)。それは、また、そのＤＮＡを非分割細胞
に組み込み、高い頻度の安定な組込みを示すいくつかのウイルスのうちの１つで
もある(例えば、フロッテ(Flotte)ら,(1992年),アメリカン・ジャーナル・オブ
・レスピラトリー・セル・アンド・モレキュラー・バイオロジー(Am. J. Respir
. Cell. Mol. Biol.),7:349-356；サマルスキー(Samulski)ら,(1989年),ジャー
ナル・オブ・ヴィロロジー(J. Virol.),63:3822-3828；およびマクローリン(McL
aughlin)ら,(1989年),ジャーナル・オブ・ヴィロロジー(J. Virol.),62:1963-19
73)。３００塩基対ほどのＡＡＶを含有するベクターをパッケージ化し組み込む
ことができる。外生ＤＮＡの空間は、約４.５ｋｂに限られている。トラッチン(
Tratschin)ら,(1985年),モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Mol.
Cell. Biol.),5:3251-3260に記載のものなどのＡＡＶベクターを用いてＤＮＡを
細胞に導入することができる。様々な核酸がＡＡＶベクターを用いて異なる細胞
タイプに導入されている(例えば、ヘルモナート(Hermonat)ら,(1984年),プロシ
ーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ
・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)
,81:6466-6470)；トラッチン(Tratschin)ら,(1985年),モレキュラー・アンド・
セルラー・バイオロジー(Mol. Cell. Biol.),4:2072-2081；ウォンディスフォー
ド(Wondisford)ら,(1988年),モレキュラー・エンドクリノロジー(Mol. Endocrin
ol.)2:32-39；トラッチン(Tratschin)ら,(1984年),ジャーナル・オブ・ヴィロロ
ジー(J. Virol.),51:611-619；およびフロッテ(Flotte)ら,(1993年),ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.),268:3781-3790を参照
)。
【０１８４】 特定の発現ベクター系および核酸を細胞に導入する方法の効率は、当該分野で
習慣的に用いられる標準的なアプローチにより評価することができる。例えば、
細胞に導入されたＤＮＡは、フィルターハイブリダイゼーション技術(例えば、
サザンブロティング)により検出することができ、導入されたＤＮＡの転写によ
り産生されるＲＮＡは、例えば、ノーザンブロッティング、ＲＮａｓｅ保護また
は逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ-ＰＣＲ)により検出することができる
。遺伝子産物は、適当なアッセイにより、例えば、特異的な抗体を用いるなどの
産生タンパクの免疫学的な検出により、または遺伝子産物の機能的活性を検出す
る機能的アッセイにより、検出することができる。
【０１８５】 本発明のパブロ調節剤を治療に用いることができる多種多様な病理学的状態ま
たは障害が存在する。ある具体例では、かかる薬剤は、細胞のアポトーシスを上
方調節、上方調節または下方調節することができる。例えば、ある具体例では、
パブロ発現または活性は、細胞死をもたらす生理学的攻撃の間に細胞中で調節す
ることができる。例えば、パブロ発現は、細胞死をもたらす生理学的攻撃、例え
ば、薬理学的な薬剤の投与、副腎摘出、虚血などの間に調節することができる。
【０１８６】 さらなる具体例では、この方法は、アポトーシスの上方調節から利益を得る障
害に罹患している患者を治療するのに用いることができる。好ましい具体例では
、パブロは、神経細胞のアポトーシスを増強するように、例えば、神経系のがん
細胞のアポトーシスを促進するように調節される。別の具体例では、細胞、好ま
しくは神経細胞のアポトーシスを下方調節するように、例えば、アルツハイマー
病または筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)の患者における神経細胞の生存を促進する
ように調節される(リー，エム(Lee, M.),1999年,ジャーナル・オブ・ニューロパ
シィ・アンド・エクスペリメンタル・ニューロロジー(J. of Neuropath & Exper
. Neurology),58:459；デスジャーディンズ，ピー(Desjardins, P.)およびレド
ウクス，エス(Ledoux, S.),1998年,ニューロサイエンス・レターズ(Neurosci. L
etters.),244:69；ヨシヒサ(Yoshihisa)ら,1998年,ブレイン・リサーチ(Brain R
esearch),780:260)。パブロの変調を治療に用いることができる他の例示的な障
害としては、他の神経系障害が挙げられる。障害なる用語は、パブロ活性および
/または発現の変化から利益を得る正常な状態と様々な疾患状態との両方を包含
することを意図する。
【０１８７】 １．予防法 ある態様では、本発明は、被験体において、パブロ活性および/または発現の
調節から利益を得る疾患または状態、例えば、異常なパブロの発現または活性と
関連する障害を、パブロポリペプチド、またはパブロポリペプチド発現もしくは
少なくとも１種のパブロ活性を調節する薬剤を被験体に投与することにより予防
する方法を提供する。異常なパブロの発現または活性により引き起こされるか、
またはそれが一因である疾患の危険性のある被験体は、例えば、ここに記載した
診断または予後アッセイのいずれか、またはその組合せにより同定することがで
きる。予防剤の投与は、パブロの異常に特徴的な徴候が現れる前に行って、疾患
または障害を防止し、またはその進行を遅延させることができる。パブロの異常
または状態のタイプに依存して、被験体を治療するのに、例えば、パブロポリペ
プチド、パブロ作動薬またはパブロ拮抗薬を用いることができる。適当な薬剤は
、ここに記載したスクリーニングアッセイに基づいて決定することができる。
【０１８８】 ２．治療法 本発明の別の態様は、治療の目的でパブロ発現または活性を調節する方法に関
する。従って、例示的な具体例では、本発明の調節法は、細胞をパブロポリペプ
チドと、またはこの細胞に関連するパブロタンパクの活性の１種もしくはそれ以
上を調節する薬剤と接触させることを必要とする。パブロタンパク活性を調節す
る薬剤は、ここに記載した薬剤、例えば、核酸またはタンパク、パブロタンパク
の天然に存在する標的分子(例えば、パブロ結合タンパク)、パブロ抗体、パブロ
作動薬または拮抗薬、パブロ作動薬または拮抗薬のペプチド擬似物、あるいは他
の小分子とすることができる。ある具体例では、この薬剤は１種またはそれ以上
のパブロ活性を刺激する。かかる刺激剤の例としては、活性なパブロタンパク、
および細胞に導入されているパブロポリペプチドをコードする核酸分子が挙げら
れる。別の具体例では、この薬剤は１種またはそれ以上のパブロ活性を阻害する
。かかる阻害剤の例としては、例えば、アンチセンスパブロ核酸分子、抗パブロ
抗体、およびパブロインヒビターが挙げられる。これらの調節法は、インビトロ
で(例えば、細胞を薬剤と共に培養することにより)、またはインビボで(例えば
、薬剤を被験体に投与することにより)行うことができる。従って、本発明は、
パブロタンパクの調節から利益を得る疾患または障害、例えば、免疫応答の上方
調節または下方調節から利益を得る、またはパブロタンパクまたは核酸分子の異
常な発現または活性により特徴付けられる障害に苦しむ個体を治療する方法を提
供する。ある具体例では、この方法は、パブロ発現または活性を調節する(例え
ば、上方調節または下方調節する)薬剤(例えば、ここに記載したスクリーニング
アッセイにより同定される薬剤)または薬剤の組合せを投与することを必要とす
る。別の具体例では、この方法は、減少したまたは異常なパブロの発現または活
性を補償する療法として、パブロタンパクまたは核酸分子を投与することを必要
とする。
【０１８９】 パブロ活性の刺激は、パブロが異常に下方調節されているか、および/または
上昇したパブロ活性が有益な効果を有するらしい状況に、例えば、細胞のアポト
ーシスを増加させるのが望ましい場合に、例えば、新生組織形成の場合に、例え
ば、がんまたはある種の他の望ましくない増殖、あるいはあるタイプの細胞によ
り因子(例えば、ホルモンまたは成長因子)の過剰産生の場合に、望ましい。同様
に、パブロ活性の阻害は、パブロが異常に上方調節されるか、および/または低
下したパブロ活性が有益な効果を有するらしい状況に、例えば、細胞のアポトー
シスを減少させるのが望ましい場合に、望ましい。パブロ調節が望ましいえりジ
的な状況は、虚血または副腎摘出などのアポトーシスにより特徴付けられる障害
の治療においてである。
【０１９０】 Ｂ．スクリーニングアッセイ 本発明は、パブロタンパクに結合する、すなわち、例えば、パブロ発現または
パブロ活性に対して刺激または阻害効果を有するモデュレーター、すなわち候補
または試験化合物または薬剤(例えば、ペプチド、ペプチ擬似物、小分子または
他の薬物)を同定する方法(ここでは「スクリーニングアッセイ」とも呼ぶ)を提
供する。
【０１９１】 本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能なパラ
レル固相または液相ライブラリー；デコンヴォルーションを必要とする合成的ラ
イブラリー法；「１ビーズ１化合物(one-bead one-compound)」ライブラリー法
；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いた合成的ライブラリー法
を含めて、当該分野で公知の組合せライブライー法に多数のアプローチを用いて
得ることができる。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに
限定されるが、他の４つのアプローチは化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマ
ーまたは小分子のライブラリーにアプローチ可能である(ラム，キー・エス(Lam,
K.S.),(1997年),アンチキャンサー・ドラッグ・デサイン(Anticancer Drug Des
.),12:145)。
【０１９２】 分子ライブラリーの合成法の例は、当該分野で、例えば、デウィット(DeWitt)
ら,(1993年),プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA),90:6909；エルブ(Erb)ら,(1994年),プロシーディングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテ
ッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),91:11422；ズ
ッカーマン(Zuckermann)ら,(1994年),ジャーナル・メディシナル・ケミストリー
(J. Med. Chem.),37:2678；チョー(Cho)ら,(1993年),サイエンス(Science),261:
1303；カレル(Carrell)ら,(1994年),アンゲバンドテ・ヒェミー・インターナシ
ョナル・エディション・イン・イングリッシュ(Angew. Chem. Int. Ed. Engl.),
33:2059；カレル(Carrell)ら,(1994年),アンゲバンドテ・ヒェミー・インターナ
ショナル・エディション・イン・イングリッシュ(Angew. Chem. Int. Ed. Engl.
),33:2061；およびギャロップ(Gallop)ら,(1994年),ジャーナル・オブ・メディ
シナル・ケミストリー(J. Med. Chem.),37:1233に見出すことができる。
【０１９３】 化合物のライブラリーは、溶液(例えば、ホートン(Houghton),(1992年),バイ
オテクニークズ(Biotechniques),13:412-421)、またはビーズ(ラム(Lam),(1991
年),ネイチャー(Nature),354:82-84)、チップ(フォドア(Fodor),(1993年),ネイ
チャー(Nature),364:555-556)、細菌(ラドナー(Ladner),米国特許第5,223,409号
)、胞子(ラドナー(Ladner),米国特許第5,223,409号)、プラスミド(カル(Cull)ら
,(1992年), プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA),89:1865-1869)またはファージ(スコット(Scott)およびスミ
ス(Smith),(1990年),サイエンス(Science),249:386-390；デヴリン(Devlin),(19
90年),サイエンス(Science),249:404-406；クウィルラ(Cwirla)ら,(1990年),プ
ロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・
オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci.
USA),87:6378-6382；フェリチ(Felici),(1991年),ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.),222:310-310；ラドナー,前出)で与えても
よい。
【０１９４】 薬剤および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプ
ログラムでは、与えられた期間に調査する調節剤の数を最大にするために、高処
理量アッセイが望ましい。例えば、精製または半精製したタンパクを用いて誘導
しうる、細胞を含まない系で行われるアッセイは、試験調節剤により媒介される
分子標的の変更の急速な展開および比較的容易な検出を可能にするようにそれら
を生成することができる点で、「一次」スクリーンとして好ましいことが多い。
さらに、試験調節剤の細胞毒性および/または生物学的利用能の効果は、一般的
には、インビトロ系では無視することができ、アッセイは、その代わりに、主と
して、上流または下流要素との結合親和性の変更に現れうる、分子標的に対する
薬物の効果に注目される。
【０１９５】 ある具体例では、本発明は、パブロタンパクまたはポリペプチドまたはその生
物学的に活性な部分に結合するか、またはその活性を調節する、例えば、Ｂｃｌ
-ｘＬと相互作用するパブロポリペプチドの能力を調節する候補または試験化合
物をスクリーニングするアッセイを提供する。
【０１９６】 被験体のパブロポリペプチドの正常な細胞機能の作動薬または拮抗薬である調
節剤、例えば、パブロ相同物についてスクリーニングするのに、アッセイを用い
ることができる。例えば、本発明は、パブロ活性を有するパブロタンパクを有す
るインジケーター組成物が提供される方法を提供する。次いで、インジケーター
組成物の変化により測定されるパブロ活性に対する試験化合物の効果を測定し、
それにより、パブロタンパクの活性を調節する化合物を同定する。試験化合物の
存在下におけるパブロ活性のレベルの(試験化合物の非存在下で検出されるもの
と比べて)統計的に有意な変化、例えば、低下または上昇は、試験化合物がパブ
ロ調節剤であることを示す。インジケーター組成物は、例えば、細胞または細胞
抽出物とすることができる。ある具体例では、パブロ活性は、添付の実施例で説
明するように評価される。
【０１９７】 本発明の例示的なスクリーニングアッセイでは、関心のある調節剤は、それに
より陽性または陰性に調節されるかどうかによらず、パブロタンパクの上流で機
能しうるインタラクター(interactor)タンパク(その活性のアクチベーターおよ
びリプレッサーの両方を含む)またはパブロタンパクの下流で機能しうるタンパ
クと接触させる。調節剤および上流または下流要素の混合物には、次いで、パブ
ロタンパクを含有する組成物が添加される。パブロとその上流または下流要素と
の相互作用の検出および定量は、パブロとパブロ結合要素との複合体形成を阻害
する(または強化する)調節剤の効力を測定する手段を提供する。
【０１９８】 調節剤の効力は、様々な濃度の試験調節剤を用いて得られるデータから用量-
応答曲線を生成することにより評価することができる。さらに、比較のベースラ
インを与えるために、対照アッセイを行うこともできる。対照アッセイでは、単
離され精製されたパブロタンパクは、パブロ結合要素を含有する組成物に添加さ
れ、複合体の形成は試験調節剤の非存在下で定量する。
【０１９９】 さらに別の具体例では、本発明のアッセイは、パブロタンパクまたはその生物
学的活性部分を試験化合物と接触させ、パブロタンパクまたはその生物学的に活
性な部分に結合する試験化合物の能力を測定する、細胞を含まないアッセイであ
る。パブロタンパクへの試験化合物の結合は、上記のように直接的または間接的
に測定することができる。好ましい具体例では、アッセイは、パブロタンパクま
たはその生物学的に活性な部分を、パブロを結合する公知の化合物と接触させて
、アッセイ混合物を形成し、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させ、パブ
ロタンパクと相互作用する試験化合物の能力を測定することを包含する。ここで
、パブロタンパクと相互作用する試験化合物の能力を測定することは、公知の化
合物と比べて、パブロポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に優先的に
結合する試験化合物の能力を測定することを包含する。
【０２００】 ある具体例では、アッセイは、パブロタンパクまたはその生物学的に活性な部
分を試験化合物と接触させ、パブロタンパクまたはその生物学的に活性な部分の
活性を調節する(例えば、刺激または阻害する)試験化合物の能力を測定する、細
胞を含まないアッセイである。パブロタンパクは、パブロを発現する細胞の溶解
物として、精製または半精製されたポリペプチドとして、または組換え的に発現
されたポリペプチドとして、提供することができる。ある具体例では、細胞を含
まないアッセイ系は、さらに、細胞抽出物または細胞の単離された成分、例えば
、ミトコンドリアを包含する。かかる細胞成分は、当該分野で公知の技術を用い
て単離することができる。好ましくは、細胞を含まないアッセイ系は、さらに、
パブロが相互作用する少なくとも１種の標的分子を包含し、パブロと標的分子と
の相互作用を調節する試験化合物の能力、例えば、Ｂｃｌ-ｘＬ活性がモニター
され、それにより、試験化合物をパブロのモデュレーターとして同定する。パブ
ロタンパクの活性を調節する試験化合物の能力を測定することは、例えば、パブ
ロ標的分子、例えば、Ｂｃｌ-ｘＬに結合するパブロタンパクの能力を、直接的
な結合を測定する上記の方法の１つにより測定することにより達成することがで
きる。パブロ標的分子に結合するパブロタンパクの能力を測定することは、リア
ルタイム生体分子相互作用分析(ＢＩＡ)などの技術を用いて達成することができ
る。ショランダー，エス(Sjolander, S.)およびアーバニクスキー，シー(Urbani
czky, C),(1991年),アナリティカル・ケミストリー(Anal. Chem.),63:2338-2345
およびスザボ(Szabo)ら,(1995年),カレント・オピニオン・イン・ストラクチュ
ラル・バイオロジー(Curr. Opin. Struct. Biol.),5:699-705。ここで用いるよ
うに、「ＢＩＡ」は、生体特異的な相互作用を、反応体(例えば、ＢＩＡコア)の
いずれをも標識することなく、リアルタイムで調べる技術である。表面プラズモ
ン共鳴(ＳＰＲ)の光学的現象における変化を生物学的な分子間のリアルタイム相
互作用の表示として用いることができる。
【０２０１】 さらに別の具体例では、細胞を含まないアッセイは、パブロタンパクまたはそ
の生物学的に活性な部分を、パブロタンパクを結合する公知化合物と接触させ、
アッセイ混合物を形成し、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させ、パブロ
タンパクと相互作用する試験化合物の能力を測定することを包含する。ここで、
パブロタンパクと相互作用する試験化合物の能力を測定することは、パブロ標的
分子に優先的に結合するか、またはその活性を調節するパブロタンパクの能力を
測定することを包含する。
【０２０２】 本発明の細胞を含まないアッセイは、可溶形態および/または膜結合形態のタ
ンパク(例えば、パブロが結合する細胞内ドメインを有するパブロタンパクまた
は受容体)の両方の使用に従う。膜結合形態のタンパクを用いる細胞を含まない
アッセイの場合、膜結合形態のタンパクが溶液中で維持されるように可溶化剤を
利用することが望ましい。かかる可溶化剤の例としては、ｎ-オクチルグルコシ
ド、ｎ-ドデシルグルコシド、ｎ-ドデシルマルトシド、オクタノイル-Ｎ-メチル
グルコアミド、デカノイル-Ｎ-メチルグルコアミド、トリトン(Triton；登録商
標)Ｘ-１００、トリトン(Triton；登録商標)Ｘ-１１４、テシット(Thesit；登録
商標)、イソトリデシルポリ(エチレングリコールエーテル)ｎ、３-[(３-クロラ
ミドプロピル)ジメチルアンモニノ]-１-プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳ)、３
-[(３-クロラミドプロピル)ジメチルアンモニノ]-２-ヒドロキシ-１-プロパンス
ルホネート(ＣＨＡＰＳＯ)、またはＮ-ドデシル＝Ｎ,Ｎ-ジメチル-３-アンモニ
ノ-１-プロパンスルホネートなど非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０２０３】 パブロ標的分子は、タンパクまたはＤＮＡ配列とすることができる。タンパク
-タンパク相互作用の検出を可能にする(例えば、免疫沈降、２ハイブリッドアッ
セイなど)またはＤＮＡ結合タンパクと標的ＤＮＡ配列との相互作用の検出を可
能にする(例えば、電気泳動移動度シフトアッセイ、ＤＮＡｓｅＩフットプリン
ティングアッセイなど)適当なアッセイは当該分野で公知である。試験化合物の
存在下および非存在下でかかるアッセイを行うことにより、これらのアッセイは
パブロと標的分子との相互作用を調節する(例えば、阻害または増強する)化合物
を同定するのに用いることができる。
【０２０４】 パブロ分子のリガンドに結合するか、またはそれと相互作用するパブロタンパ
クの能力を測定することは、例えば、直接的な結合により達成することができる
。直接的な結合アッセイでは、パブロタンパクは、パブロ標的分子へのパブロタ
ンパクの結合が複合体中の標識パブロタンパクを検出することにより測定するこ
とができるように、放射性同位元素または酵素標識と結合させることができる。
例えば、パブロ分子、例えば、パブロタンパクは、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃま
たは３Ｈで直接的または間接的に標識することができ、放射性同位元素は放射能
放出の直接的なカウンティングにより、またはシンチレーションカウンティング
により検出することができる。あるいは、パブロ分子は、例えば、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼで酵素的に標識
することができ、酵素標識は、適当な基質の産物への転換の測定により検出する
ことができる。
【０２０５】 典型的には、パブロまたはその結合タンパクを固定化して、これらタンパクの
一方または両方の複合体化していない形態からの複合体の分離を容易にすると共
に、アッセイの自動化を適応させることが望ましい。候補の薬剤の存在下および
非存在下における上流または下流の結合要素へのパブロの結合は、反応体を含有
するのに適当な容器で達成することができる。例としては、マイクロタイタープ
レート、試験管および微小遠心管が挙げられる。ある具体例では、タンパクがマ
トリックスに結合するのを可能にするドメインを付加する融合タンパクを提供す
ることができる。例えば、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ/パブロ(ＧＳＴ
/パブロ)融合タンパクは、グルタチオンセファロースビーズ(シグマ・ケミカル(
Sigma Chemical)、ミズーリ州セントルイス)またはグルタチオン誘導体化マイク
ロタイタープレートに吸着させることができる。次いで、これらは細胞溶解物、
例えば、３５Ｓ-標識された、および試験調節剤と組合せ、この混合物は複合体
形成に寄与する条件下、例えば、塩およびｐＨについて生理学的条件でインキュ
ベートされる。もっとも、わずかにもう少しストリンジェントな条件が望ましい
こともある。インキュベーション後、ビーズを洗浄して、未結合の標識を除去し
、マトリックスを可溶化し、放射標識を直接的に(例えば、ビーズをシンチラン
トに入れる)、または複合体が引き続いて解離した後の上澄み液中で測定する。
あるいは、複合体をマトリックスから解離させ、ＳＤＳ-ＰＡＧＥで分離し、ビ
ーズ画分に見出されるパブロ結合タンパクのレベルは、標準的な電気泳動技術を
用いてゲルから定量することができる。
【０２０６】 マトリックスにタンパクを可溶化する他の技術は、また、被験体アッセイでの
使用に利用可能である。例えば、パブロまたはその同起源の結合タンパクは、ビ
オチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。例
えば、ビオチニル化されたパブロ分子は、当該分野で公知の技術(例えば、ビオ
チニル化キット、ピアース・ケミカルズ(Pierce Chemicals)、イリノイ州ロック
フォード)を用いて、ビオチン-ＮＨＳ(Ｎ-ヒドロキシ-スクシンイミド)から調製
し、ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート(ピアース・ケミカル(Pierce C
hemical))のウェルに固定化することができる。あるいは、パブロと反応性であ
るが上流または下流要素との結合を干渉しない抗体は、プレートのウェルに誘導
体化することができ、パブロは抗体結合によりウェルに捕捉することができる。
上記のように、パブロ結合タンパクおよび試験調節剤の調製物を、パブロを提示
するプレートのウェル中でインキュベートし、ウェルに捕捉された複合体の量を
定量することができる。ＧＳＴ固定化された複合体について上記したものに加え
て、かかる複合体を検出する例示的な方法としては、パブロ結合要素と反応性で
あるか、またはパブロタンパクと反応性であり、結合要素と拮抗する抗体を用い
た複合体の免疫検出；ならびに、結合要素と関連した酵素活性(固有または外因
性の活性)を検出することに依存する酵素結合アッセイが挙げられる。後者の場
合、酵素はパブロ-ＢＰと化学的に結合するか、またはそれとの融合タンパクと
して提供される。例示するために、パブロ-ＢＰは、西洋ワサビペルオキシダー
ゼと化学的に架橋するか、またはそれと遺伝学的に融合させることができ、この
複合体に捕捉されるタンパクの量は、酵素の発色性物質、例えば、３,３'-ジア
ミノ-ベンゾアジンテトラヒドロクロリドまたは４-クロロ-１-ナフトールを用い
て評価することができる。同様に、タンパクおよびグルタチオン-Ｓ-トランスフ
ェラーゼを含有する融合タンパクを提供することができ、複合体形成は１-クロ
ロ-２,４-ジニトロベンゼンを用いてＧＳＴ活性を検出することにより定量する
ことができる(ハビッグ(Habig)ら,(1974年),ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー(J Biol Chem),249:7130)。
【０２０７】 複合体に捕捉されたタンパクの１つを定量する免疫検出に依存する方法には、
タンパクに対する抗体、例えば、抗パブロ抗体を用いることができる。あるいは
、複合体に検出されるべきタンパクは、パブロ配列に加えて、抗体が容易に(例
えば、市販の起源から)利用可能である第２のタンパクを包含する融合タンパク
の形態で「エピトープタグ化」することができる。例えば、上記のＧＳＴ融合タ
ンパクは、また、ＧＳＴ部分に対する抗体を用いた結合の定量化に用いることが
できる。他の有用なエピトープタグとしては、ｃ-ｍｙｃ由来の１０残基配列を
包含するｍｙｃ-エピトープ(例えば、エリソン(Ellison)ら,(1991),ジャーナル
・バイオロジカル・ケミストリー(J Biol Chem),266:21150-21157)、ならびにｐ
ＦＬＡＧ系(インターナショナル・バイオテクノロジー，インク(International
Biotechnologies, Inc.))またはｐＥＺＺ-タンパクＡ系(ファルマシア(Pharmaci
a)、ニュージャージー州)が挙げられる。
【０２０８】 パブロとその標的分子との間の相互作用を調節する化合物の能力を、反応体の
いすれをも標識することなく、測定することも、また、本発明の範囲内にある。
例えば、マイクロフィジオメーター(microphysiometer)は、パブロまたは標的分
子のいずれかを標識することなく、パブロとその標的分子との相互作用を検出す
るのに用いることができる。マッコンネル，エイチ・エム(McConnell, H.M.)ら,
(1992年),サイエンス(Science),257:1906-1912。ここで用いるように、「マイク
ロフィジオメーター」(例えば、サイトセンサー(Cytosensor))は、光-アドレス
可能な電位差計センサー(ＬＡＰＳ)を用いて、細胞がその環境を酸性化する速度
を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、化合物と受容体との間の
相互作用の表示として用いることができる。
【０２０９】 細胞を含まないアッセイに加えて、本発明により提供されるパブロタンパクの
容易に利用可能な起源は、また、小分子作動薬および/または拮抗薬などを同定
する細胞に基づくアッセイの生成を容易にする。例えば、細胞は、試験薬剤によ
り媒介される標的細胞によるパブロ応答の調節を評価するアッセイを用いて、関
心のある試験調節剤の存在下および非存在下で組換えパブロタンパクを発現また
は過剰発現させることができる。例えば、細胞を含まないアッセイを用いるよう
に、パブロ依存応答の統計学的に有意な変化(増大または減少)を生じる調節剤を
同定することができる。
【０２１０】 パブロの発現に用いることができる組換え発現ベクターは当該分野で公知であ
る(上記の考察を参照)。ある具体例では、発現ベクター内で、パブロをコードす
る配列は、表示細胞におけるパブロの構成的または誘発性の発現を可能にする調
節配列に機能的に作用するように連結される。細胞におけるパブロの構成的また
は誘発性の発現を可能にする組換え発現ベクターの使用は、パブロの活性を増強
または阻害する化合物の同定に好ましい。別の具体例では、発現ベクター内で、
パブロをコードする配列は、内生パブロ遺伝子の調節配列(すなわち、内生遺伝
子に由来するプロモーター調節領域)に機能的に作用するように連結される。パ
ブロ発現が内生調節配列により制御される組換え発現ベクターの使用は、パブロ
の転写発現を増強または阻害する化合物の同定に好ましい。ある具体例では、ア
ッセイは、パブロ標的分子(例えば、Ｂｃｌ-ｘＬまたは別のパブロ細胞内相互作
用分子)を発現する細胞を試験化合物と接触させ、パブロ標的分子の活性を調節
する(例えば、刺激または阻害する)試験化合物の能力を測定することを包含する
セルに基づくアッセイである。パブロ標的分子の活性を調節する試験化合物の能
力を測定することは、例えば、パブロ標的分子またはそのリガンドに結合するか
、またはそれと相互作用するパブロタンパクの能力を測定することにより達成す
ることができる。
【０２１１】 例示的な具体例では、パブロの発現または活性が細胞中で調節され、関心のあ
る読出し(例えば、アポトーシス)に対する調節剤の効果が測定される。ある具体
例では、パブロ発現または活性の調節により転写が変更される遺伝子の調節領域
、例えば、５'隣接プロモーターおよびエンハンサー領域が、容易に検出するこ
とができる遺伝子産物をコードするマーカー(例えば、ルシフェラーゼ)に機能的
に作用するように連結される。
【０２１２】 別の具体例では、パブロ発現のモデュレーターは、細胞を候補化合物と接触さ
せ、細胞中におけるパブロｍＲＮＡまたはタンパクの発現を測定する方法で同定
される。候補化合物の存在下におけるパブロｍＲＮＡまたはタンパクの発現のレ
ベルは、候補化合物の非存在下におけるパブロｍＲＮＡまたはタンパクの発現の
レベルと比較される。次いで、候補化合物は、この比較に基づいて、パブロ発現
のモデュレーターとして同定することができる。例えば、候補化合物の存在下に
おけるパブロｍＲＮＡまたはタンパクの発現がその非存在下におけるより大きい
場合、候補化合物はパブロｍＲＮＡまたはタンパク発現の刺激物質として同定さ
れる。
【０２１３】 好ましい具体例では、パブロ標的分子に結合するか、またはそれと相互作用す
るパブロタンパクの能力を測定することは、パブロまたは標的分子の活性に関す
る読出しを測定することにより達成することができる。例えば、パブロまたは標
的分子の活性は、標的の細胞性第２メッセンジャー(例えば、Ｂｃｌ-ｘＬにより
調節される第２メッセンジャー)の誘発を検出すること、標的、適当な基質の触
媒的/酵素的な活性を検出すること、(検出可能なマーカー、例えば、クロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする核酸に機能的に作用するよ
うに連結された標的応答性の調節要素を含有する)レポーター遺伝子の誘発を検
出すること、または標的で調節される細胞性応答、例えば、アポトーシスを検出
することにより測定することができる。例えば、パブロ標的分子に結合するか、
またはそれと相互作用するパブロタンパクの能力を測定することは、例えば、好
ましくは神経細胞のアポトーシスを調節する化合物の能力を測定することにより
達成することができる。アポトーシスの顕著な特徴はＤＮＡの分解である。この
過程の初期では、この分解はヌクレオソーム間のＤＮＡリンカー領域で生じる。
ＤＮＡ開裂は、二本鎖および一本鎖ＤＮＡの切れ目を与えうる。アポトーシスは
、標準的な技術を用いて、細胞中で測定することができる。例えば、ある細胞集
団のゲノムＤＮＡの分解は、アガロースゲル電気泳動により分析することができ
、また、３Ｈ-チミジンまたは５-ブロモ-２'-デオキシ-ウリジンに基づくＤＮＡ
断片化アッセイを用いることができる。
【０２１４】 個体細胞のアポトーシスを分析するために、アポトーシス細胞は、核のクロマ
チン濃縮および断片化の特徴的な出現ゆえに、微視的に認識されうる。アポトー
シスは、例えば、添付の実施例で説明するように、ヘキスト(Hoechst)染色およ
び核濃縮を有する細胞を探すことにより、個体細胞中で測定することができる。
あるいは、二本鎖および一本鎖ＤＮＡの切れ目は、酵素的な反応で遊離の３'-Ｏ
Ｈ末端を修飾ヌクレオチド(例えば、ビオチン-ｄＵＴＰ、ＤＩＧ-ｄＵＴＰ、フ
ルオレセイン-ｄＵＴＰ)で標識することにより検出することができる。末端のデ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(ＴｄＴ)は、ＤＮＡの３'末端へのデ
オキシリボヌクレオチドの鋳型非依存ポリマー化を触媒する。この方法は、ＴＵ
ＮＥＬ(ＴｄＴ媒介性ｄＵＴＰ-Ｘニック末端標識)と呼ばれる。あるいは、遊離
の３'-ＯＨ基は、ニック翻訳によりＤＮＡポリメラーゼを用いて標識しうる。ト
ンネル染色を用いて、二本鎖ＤＮＡの切れ目を有する細胞を同定することができ
る。標識されたｄＵＴＰを組み込んだ標識された遊離の３'-ＯＨ基は、フローサ
イトメトリーおよび/または蛍光顕微鏡により可視化することができる。これら
のアッセイを行う試薬は、例えば、ロッシェ・モレキュラー・バイオケミカルズ
イ・ユー・エス・エイ(Roche Molecular Biochemicals USA)から利用可能である
(現場細胞死検出キット)。加えて、アネキシン(例えば、アネキシン-Ｖ-アレキ
サ(Annexin-V-AlexaTM 568)；ロッシェ・モレキュラー・バイオケミカルズイ・
ユー・エス・エイ(Roche Molecular Biochemicals USA)から市販されている)を
この目的に用いることができる。アポトーシスを受ける細胞に関連する初期原形
質膜変化の１つは、原形質膜の内部葉状部から外部層へのホスファチジルセリン
の移動であり、それにより、ホスファチジルセリンを細胞の表面に露出させるこ
とである。アネキシン-Ｖは、ホスファチジルセリンに結合するリン脂質結合タ
ンパクであり、細胞表面上のホスファチジルセリンに対するプローブとして用い
ることができる。アネキシン-Ｖは、壊死細胞からアポトーシス細胞を区別する
のにＤＮＡ染色(例えば、ＢＯＢＯＴＭ-１)と組み合せて用いることができる。
【０２１５】 本発明のさらに別の態様では、パブロタンパクまたはその一部は、パブロに結
合するか、またはそれと相互作用し(「パブロ結合タンパク」または「パブロ-ｂ
ｐ」)、パブロ活性に関係する他のタンパクを同定するのに、２ハイブリッドア
ッセイまたは３ハイブリッドアッセイ(例えば、米国特許第5,283,317号；ゼルヴ
ォス(Zervos)ら,(1993年),セル(Cell),72:223-232；マデュラ(Madura)ら,(1993
年),ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.),268:1
2046-12054；バーテル(Bartel)ら,(1993年),バイオテクニークズ(Biotechniques
),14:920-924；イワブチ(Iwabuchi)ら,(1993年),オンコジーン(Oncogene),8:169
3-1696；およびブレント(Brent),WO94/10300を参照)における「餌タンパク」と
して用いることができる。Ｂｃｌ-ｘＬ中における１つのかかる結合タンパク。
かかるパブロ結合タンパクは、また、例えば、パブロ媒介性シグナリング経路の
下流要素として、パブロタンパクまたはパブロ標的によりシグナルの伝播に関係
しているらしい。あるいは、かかるパブロ結合タンパクは、パブロインヒビター
でありうる。
【０２１６】 ２ハイブリッド系は、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインからなるた
いていの転写因子のモジュール性(modular nature)に基づいている。簡単には、
このアッセイは２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物では、パブ
ロタンパクをコードする遺伝子が公知の転写因子(例えば、ＧＡＬ-４)のＤＮＡ
結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方の構築物では、未同定のタ
ンパク(「プレイ(prey)」または「試料」)をコードする、ＤＮＡ配列のライブラ
リーからのＤＮＡ配列が公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に
融合される。「餌」および「プレイ」タンパクがインビボで相互作用して、パブ
ロ依存複合体を形成すれば、転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインは極め
て接近している。この接近は、転写因子に応答性の転写調節部位に機能的に作用
するように連結されたレポーター遺伝子(例えば、ＬａｃＺ)の転写を可能にする
。レポーター遺伝子の発現を検出することができ、機能的な転写因子を含有する
細胞コロニーを単離して、パブロタンパクと相互作用するタンパクをコードする
クローン化遺伝子を得ることができる。
【０２１７】 本発明は、また、(１)パブロおよび転写活性化ドメインを含有する第１ハイブ
リッドタンパクおよび(２)Ｂｃｌ-ｘＬポリペプチドおよびＤＮＡ結合ドメイン
を含有する第２ハイブリッドタンパクを有する２ハイブリッド系、宿主細胞およ
び指示書マニュアルを包含するキットを提供する。あるいは、パブロポリペプチ
ドはＤＮＡ結合ドメインに融合していてもよく、Ｂｃｌ-ｘＬポリペプチドは活
性化ドメインに結合していてもよい。かかるキットは、所望により、第１および
第２ハイブリッドタンパク間の分子間結合を変更する能力について試験する薬剤
のパネルを包含していてもよい。
【０２１８】 本発明は、さらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規な薬
剤に関する。従って、さらに、適当な動物モデルにおいて、ここで説明したよう
に同定された薬剤を用いることは本発明の範囲内である。例えば、ここで説明し
たように同定された薬剤(例えば、パブロ調節剤、アンチセンスパブロ核酸分子
、パブロ特異的な抗体、またはパブロ結合パートナー)を動物モデルに用いて、
かかる薬剤による処理の効力、毒性または副作用を測定することができる。ある
いは、ここで説明したように同定された薬剤を動物モデルに用いて、かかる薬剤
の作用の機構を決定することができる。さらに、本発明は、ここで説明した処理
に対する上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規な薬剤の使用に関
する。
【０２１９】 Ｃ．合理的な薬物設計の方法 パブロおよびパブロ結合ポリペプチド、例えば、Ｂｃｌ-ｘＬポリペプチド、
特にパブロ/Ｂｃｌ-ｘＬヘテロダイマーにおける直接的な接触を形成する部分は
、候補のパブロまたはＢｃｌ-ｘＬ調節剤(例えば、抗新生物薬およびアポトーシ
スの下方調節物質)の合理的な薬物設計に用いることができる。ここで提供した
Ｂｃｌ-ｘＬの結合パートナーとしてパブロを同定することは、実質的に純粋な
パブロ/Ｂｃｌ-ｘＬポリペプチド複合体の製造、およびタンパクＸ線結晶学に用
いることができるコンピューターモデルまたは他の構造分析モデル、例えば、Ｄ
ＯＣＫプログラム(クンツ(Kuntz)ら,(1982年),ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー(J. Mol. Biol.),161:269；クンツ，アイ・ディー(Kuntz ID),(1
992年),サイエンス(Science),257:1078)およびその変形体を可能にする。可能性
のある治療薬物は、かくして提供された構造上の情報に基づいて合理的に設計す
ればよい。ある具体例では、かかる薬物は、パブロポリペプチド：Ｂｃｌ-ｘＬ
ポリペプチド複合体の形成を防止または増強するように設計される。かくして、
本発明は、薬物、例えば、パブロとＢｃｌ-ｘＬとの結合を阻害または促進する
能力を有する薬物を設計するのに用いてもよい。
【０２２０】 Ｄ．検出アッセイ ここで同定したｃＤＮＡ配列の一部または断片(および対応する完全な遺伝子
配列)は、ポリヌクレオチド試薬として多数の方法で用いることができる。例え
ば、これらの配列は、(ｉ)それらの各々の遺伝子を染色体上に地図化し；かくし
て、遺伝病に関連する遺伝子領域を位置付け；(ii)少ない生物学的試料から個体
を同定し(組織タイピング)；(iii)生物学的試料の法医学的同定に役立てるのに
用いることができる。これらの応用は以下で説明する。
【０２２１】 Ｅ．予知医学 本発明は、また、診断アッセイ、予後アッセイ、およびモニタリング臨床試験
が予後(予知)目的で用いられ、それにより、個体を予防的に治療する予知医学の
分野に関する。従って、本発明のある態様は、生物学的試料(例えば、血液、血
清、細胞、組織(好ましくは、神経細胞または組織))に関連して、パブロタンパ
クおよび/または核酸の発現ならびにパブロ活性を測定し、それにより、個体が
異常なパブロの発現または活性に関連する疾患または障害に罹患しているか、ま
たは障害を発生させる危険性があるかどうかを決定するための診断アッセイに関
する。本発明は、また、個体がパブロタンパク、核酸の発現または活性に関連す
る障害を発生させる危険性があるかどうかを決定する予後(または予知)アッセイ
を提供する。例えば、パブロ遺伝子の突然変異は、生物学的試料でアッセイする
ことができる。かかるアッセイは、予後または予知の目的で用い、それにより、
パブロタンパク、核酸の発現または活性により特徴つけられるか、またはそれに
関連する障害の発症前に、個体を予防的に治療することができる。
【０２２２】 本発明の別の態様は、臨床試験において、パブロの発現または活性に対する薬
剤(例えば、薬物、化合物)の影響をモニタリングすることに関する。 これらおよび他の薬剤は、以下でさらに詳しく説明する。
【０２２３】 １．診断アッセイ 生物学的試料中におけるパブロタンパクまたは核酸の有無を検出する例示的な
方法は、試験の被験体から生物学的試料を得て、この生物学的試料を、パブロタ
ンパクをコードするパブロタンパクまたは核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮ
Ａ)を検出することができる化合物または薬剤と、パブロタンパクまたは核酸の
存在が生物学的試料中に検出されるように、接触させることを必要とする。パブ
ロｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出する好ましい薬剤は、パブロｍＲＮＡまた
はゲノムＤＮＡにハイブリダイズすることができる標識された核酸プローブであ
る。核酸プローブは、例えば、パブロ核酸、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の核
酸またはその一部、例えば、長さが少なくとも１５、３０、５０、１００、２５
０または５００ヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下でパブロｍＲＮ
ＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオ
チドとすることができる。本発明の診断アッセイに用いるのに適当な他のプロー
ブは、ここで説明した。
【０２２４】 パブロタンパクを検出するのに好ましい薬剤は、パブロタンパク、好ましくは
検出可能なラベルを有する抗体に結合することができる抗体である。抗体は、ポ
リクローナル、または、より好ましくはモノクローナルとすることができる。未
処理の抗体またはその断片(例えば、ＦａｂまたはＦ(ａｂ')２)を用いることが
できる。プローブまたは抗体に関する「標識された」なる用語は、検出可能な物
質をプローブにカップリングする(すなわち、物理的に連結させる)ことによりプ
ローブまたは抗体の直接的な標識、ならびに直接的に標識される別の試薬との反
応性によるプローブまたは抗体の間接的な標識を包含することを意図する。間接
的なラベリングの例としては、蛍光標識された２次抗体を用いた１次抗体の検出
、蛍光標識されたストレプトアビジンで検出することができるようなビオチンに
よるＤＮＡプローブの末端標識が挙げられる。「生物学的試料」なる用語は、被
験体から単離された組織、細胞および生物学的な流体、ならびに被験体内に存在
する組織、細胞(好ましくは、神経細胞または組織)および流体を包含することを
意図する。すなわち、本発明の検出方法は、生物学的試料中のパブロｍＲＮＡ、
タンパクまたはゲノムＤＮＡをインビトロおよびインビボで検出するのに用いる
ことができる。例えば、パブロｍＲＮＡの検出のためのインビトロでの技術とし
ては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインシトゥ(in situ)ハイブリダ
イゼーションが挙げられる。パブロタンパクの検出のためのインビトロ技術とし
ては、酵素結合免疫吸着法(ＥＬＩＳＡ)、ウェスターンブロット、免疫沈降およ
び免疫蛍光法が挙げられる。パブロゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロ技術
としては、サザーンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、パブロタン
パクの検出のためのインビボ技術としては、被験体に標識された抗パブロ抗体を
導入することを包含する。例えば、抗体は、被験体におけるその存在および位置
が標準的なイメージング技術で検出することができる放射活性なマーカーで標識
することができる。
【０２２５】 ある具体例では、生物学的試料は、試験の被験体に由来するタンパク分子を含
有する。あるいは、生物学的試料は、試験の被験体に由来するｍＲＮＡ分子また
は試験の被験体に由来するゲノムＤＮＡ分子を含有することができる。好ましい
生物学的試料は、被験体から従来の手段で単離される血清試料である。
【０２２６】 別の具体例では、これらの方法は、さらに、対照の被験体から対照の生物学的
試料を得て、この対照試料を、パブロタンパク、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの
存在が生物学的試料中で検出されるように、パブロタンパク、ｍＲＮＡまたはゲ
ノムＤＮＡを検出することができる化合物または薬剤と接触させ、対照試料中に
おけるパブロタンパク、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を、試験試料中にお
けるパブロタンパク、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と比較することを必要
とする。
【０２２７】 本発明は、また、生物学的試料中におけるパブロの存在を検出するためのキッ
トを包含する。例えば、このキットは、生物学的試料中におけるパブロタンパク
またはｍＲＮＡを検出することができる標識された化合物または薬剤；試料中に
おけるパブロの量を測定する手段；および試料中におけるパブロの量を標準と比
較する手段を包含することができる。この化合物または薬剤は適当な容器にパッ
ケージ化することができる。このキットは、さらに、パブロタンパクまたは核酸
を検出するのにキットを用いるための指示書を包含することができる。
【０２２８】 ２．予後アッセイ ここで説明した診断法は、さらに、異常なパブロの発現または活性に関連する
疾患または障害を有するか、あるいはそれを発生させる危険性がある被験体を同
定するのに利用することができる。例えば、ここで説明したアッセイ、例えば、
前記の診断法または以下のアッセイは、パブロタンパク、核酸の発現または活性
に関連する障害を有するか、またはそれを発生させる危険性がある被験体を同定
するのに用いることができる。かくして、本発明は、異常なパブロの発現または
活性に関連する疾患または障害を同定する方法を提供する。ここで、被験体から
試験試料を得て、パブロタンパクまたは核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ)
が検出される。ここで、パブロタンパクまたは核酸の存在は、異常なパブロの発
現または活性に関連する疾患または障害を有するか、またはそれを発生させる危
険性がある被験体について診断的である。ここで用いるように、「試験試料」は
、関心のある被験体から得た生物学的試料を意味する。例えば、試験試料は、生
物学的な流体(例えば、血清)、細胞試料または組織とすることができる。
【０２２９】 さらに、ここで説明した予後アッセイは、被験体が異常なパブロの発現または
活性に関連する疾患または障害を治療する薬剤(例えば、作動薬、拮抗薬、ペプ
チド擬似薬、タンパク、ペプチド、核酸、小分子または他の薬物候補)を服用で
きるかどうかを調べるのに用いることができる。かくして、本発明は、被験体が
異常なパブロの発現または活性に関連する障害のための薬剤で有効に治療できる
かどうかを調べる方法を提供する。ここで、試験試料を得て、パブロタンパクま
たは核酸の発現または活性が検出される(例えば、パブロタンパクまたは核酸の
発現または活性の量は、異常なパブロの発現または活性に関連する障害を治療す
る薬剤を服用することができる被験体について診断的である)。
【０２３０】 本発明の方法は、また、パブロ遺伝子の遺伝学的変化を検出し、それにより、
変化した遺伝子を有する被験体がパブロ遺伝子に関連する障害の危険性があるか
どうかを調べるのに用いることができる。好ましい具体例では、これらの方法は
、被験体に由来する細胞の試料中に、パブロタンパクをコードする遺伝子の完全
性またはパブロ遺伝子の発現ミスに影響を与える少なくとも１つの変化により特
徴付けられる遺伝学的変化の有無を検出することを包含する。例えば、かかる遺
伝学的変化は、１）パブロ遺伝子からの１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠
失；２）パブロ遺伝子への１個またはそれ以上のヌクレオチドの付加；３）パブ
ロ遺伝子の１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換；４）パブロ遺伝子の染色
体配置転換；５）パブロ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルの変化；
６）パブロ遺伝子の異常な修飾、例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異
常な変化；７）パブロ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライ
シングパターンの存在；パブロタンパクの非野生型レベル；９）パブロ遺伝子の
対立遺伝子喪失；および１０）パブロタンパクの不適切な翻訳後修飾のうちの少
なくとも１つの存在を確かめることにより検出することができる。ここで説明し
たように、パブロ遺伝子の変化を検出するのに用いることができる当該分野で公
知の多数のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的試料は、被験体から従来
の手段により単離された組織または血清試料、例えば、神経組織試料である。
【０２３１】 いくつかの具体例では、変化の検出は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣ
Ｒなどのポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)(例えば、米国特許第4,683,195号および
第4,683,202号を参照)における、または連結連鎖反応(ＬＣＲ)(例えば、ランデ
グラン(Landegran)ら,(1988年),サイエンス(Science),241:1077-1080；およびナ
カザワ(Nakazawa)ら,(1994年),プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・ア
メリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),91:360-364を参照)におけるプローブ/プ
ライマーの使用を必要とする。このうち後者は、特にパブロ遺伝子の点突然変異
を検出するのに有用である(例えば、アブラヴァヤ(Abravaya)ら,(1995年),ヌク
レイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.),23:675-682)。この方法は
、患者から細胞の試料を採取する工程、試料の細胞から核酸(例えば、ゲノム、
ｍＲＮＡまたは両方)を単離する工程、核酸試料を、パブロ遺伝子(存在すれば)
のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こる条件下でパブロ遺伝子に特異的に
ハイブリダイズする１種またはそれ以上のプライマーと接触させる工程、および
増幅産物の有無を検出する工程または増幅産物のサイズを検出して、対照試料と
長さを比較する工程を包含することができる。ＰＣＲおよび/またはＬＣＲは、
ここで説明した突然変異を検出するのに用いる技術のいずれかと共に予備増幅工
程として用いるのに望ましいことが予想される。
【０２３２】 別の増幅方法は、自己維持配列複製(グアテッリ，ジェイ・シー(Guatelli, J.
C.)ら,(1990年),プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc.
Natl. Acad. Sci. USA),87:1874-1878)、転写増幅系(クウォー，デイ・ワイ(Kw
oh, D.Y.)ら,(1989年),プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),86:1173-1177)、Ｑ-βレプリカーゼ(リザルディ
，ピー・エム(Lizardi, P.M.)ら,(1988年),バイオ-テクノロジー(Bio-Technolog
y),6:1197)または他の任意の核酸増幅法、次いで、当業者に公知の技術を用いて
増幅分子の検出を包含する。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に少ない
数で存在すれば、かかる分子の検出に特に有用である。
【０２３３】 別の具体例では、試料細胞に由来するパブロ遺伝子の突然変異は、制限酵素開
裂パターンの変化により同定することができる。例えば、試料および対照ＤＮＡ
が単離され、(所望により)増幅され、１種またはそれ以上の制限エンドヌクレア
ーゼで消化され、断片の長さサイズがゲル電気泳動により調べられ、比較される
。試料と対照ＤＮＡとの間における断片の長さサイズの差は、試料ＤＮＡにおけ
る突然変異を示す。さらに、配列特異的なリボチーム(例えば、米国特許第5,498
,531号)の使用は、リボチーム開裂部位の発生または喪失による特異的な突然変
異の存在について評価するのに用いることができる。
【０２３４】 他の具体例では、パブロにおける遺伝学的な突然変異は、試料および対照の核
酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを、数百または数千のオリゴヌクレオチドプロ
ーブを含有する高密度アレイにハイブリダイズさせることにより同定することが
できる(クローニン，エム・ティー(Cronin, M.T.)ら,(1996年),ヒューマン・ミ
ューテーション(Human Mutation),7:244-255；コーザル，エム・ジェイ(Kozai,
M.J.)ら,(1996年),ネイチャー・メディスン(Nature Medicine),２:753-759)。例
えば、パブロにおける遺伝学的突然変異は、クローニン，エム・ティー(Cronin,
M.T.)ら(前出)に記載の光生成ＤＮＡプローブを含有する二次元アレイで同定す
ることができる。簡単には、プローブの第１ハイブリダイゼーションアレイを用
いて、試料および対照中のＤＮＡの長いストレッチを通じてスキャンして、配列
重複プローブの線形アレイを作成することにより配列間の塩基変化を同定するこ
とができる。この工程は点突然変異の同定を可能にする。この工程は、検出され
るすべて変異体または突然変異体に相補的なより小さい特別化されたプローブア
レイによる特異的な突然変異体の特徴付けを可能にする第２のハイブリダイゼー
ションアレイが続く。各突然変異体アレイは、平行なプローブの組から構成され
る。一方は野生型遺伝子に相補的であり、他方は突然変異体の遺伝子に相補的で
ある。
【０２３５】 さらに別の具体例では、当該分野で公知の様々な配列決定反応のいずれかを用
いて、パブロ遺伝子を直接的に配列決定し、試料パブロの配列を対応の野生型(
対照)配列と比較することにより突然変異を検出することができる。配列決定反
応の例としては、マキサム(Maxam)およびギルバート(Gilbert)((1977年)プロシ
ーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ
・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)
,74:560)またはサンガー((1977年)プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ
・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),74:5463)により開発された技術に基
づくものが挙げられる。診断アッセイ((1995年)バイオテクニークズ(Biotechniq
ues),19:448)を行う際に、質量分析法による配列決定(例えば、PCT国際公開第WO
94/16101号；コーエン(Cohen)ら,(1996年),アドバンシズ・イン・クロマトグラ
フィー(Adv. Chromatogr.),36:127-162；およびグリフィン(Griffin)ら,(1993年
),アプライド・バイオケミストリー・アンド・バイオテクノロジー(Appl. Bioch
em. Biotechnol.),38:147-159を参照)を含めて、様々な自動化配列決定法のいず
れかを利用することができることも意図される。
【０２３６】 パブロ遺伝子における突然変異を検出する他の方法としては、開裂剤からの保
護を用いて、ＲＮＡ/ＲＮＡまたはＲＮＡ/ＤＮＡヘテロ二本鎖における不一致塩
基を検出する方法(ミエルス(Myers)ら,(1985年),サイエンス(Science),230:1242
)が挙げられる。一般的には、「不一致開裂」に関する当該分野での技術は、野
生型パブロ配列を含有する(標識された)ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織試料から得
た可能性のある突然変異体ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることによ
り形成されたヘテロ二本鎖を提供することにより開始する。これらの二本鎖は、
例えば、対照鎖と試料鎖との間における塩基対の不一致により存在する、二本鎖
の一本鎖領域を開裂させる薬剤で処理する。例えば、ＲＮＡ/ＤＮＡ二本鎖はＲ
Ｎａｓｅで処理することができ、ＤＮＡ/ＤＮＡハイブリッドは不一致領域を酵
素的に消化するＳ１ヌクレアーゼで処理することができる。他の具体例では、Ｄ
ＮＡ/ＤＮＡまたはＲＮＡ/ＤＮＡ二本鎖は、不一致領域を消化するためにヒドロ
キシルアミンまたは四酸化オスミウムおよびピペリジンで処理することができる
。不一致領域の消化後、得られた材料は、次いで、変性ポリアクリルアミドゲル
上でサイズにより分離され、突然変異の部位を決定する。例えば、コットン(Cot
ton)ら,(1988年),プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc.
Natl. Acad. Sci. USA),85:4397；サレエバ(Saleeba)ら,(1992年),メソッズ・
イン・エンザイモロジー(Methods Enzymol.),217:286-295を参照。好ましい具体
例では、対照ＤＮＡまたはＲＮＡは検出用に標識することができる。さらに別の
具体例では、不一致開裂反応は、細胞の試料から得たパブロにおける点突然変異
を検出およびマッピングするための定義された系の二本鎖ＤＮＡにおける不一致
塩基対を認識する１種またはそれ以上のタンパク(いわゆる「ＤＮＡ不一致修復
」酵素)を採用する。例えば、イー・コリ(E. coli)のｍｕｔＹ酵素はＧ/Ａ不一
致におけるＡを開裂し、ＨｅＬａ細胞に由来するチミジンＤＮＡグリコシラーゼ
はＧ/Ｔ不一致におけるＴを開裂する(シュー(Hsu)ら,(1994年),カルシノジェネ
シス(Carcinogenesis),15:1657-1662)。例示的な具体例に従って、パブロ配列、
例えば、野生型パブロ配列に基づくプローブは、試験細胞に由来するｃＤＮＡま
たは他のＤＮＡ産物にハイブリダイズさせる。この二本鎖はＤＮＡ不一致修復酵
素で処理し、開裂産物は、存在すれば、電気泳動プロトコルなど検出することが
できる。例えば、米国特許第5,459,039号を参照。
【０２３７】 他の具体例では、電気泳動移動度の変化を用いて、パブロ遺伝子の突然変異を
同定する。例えば、一本鎖コンホメーション多形性(ＳＳＣＰ)を用いて、突然変
異体と野生型の核酸との間の電気泳動移動度の差を検出しうる(オリタ(Orita)ら
,(1989年),プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl.
Acad. Sci. USA),86:2766；また、コットン(Cotton),(1993年),ミューテイショ
ン・リサーチ(Mutat Res),285:125-144；およびハヤシ(Hayashi),(1992年),ジェ
ネティック・アナリシス・テクニークズ・アンド・アプリケーションズ(Genet A
nal Tech Appl),9:73-79を参照)。試料および対照のパブロ核酸の一本鎖ＤＮＡ
断片が変性され、復元される。一本鎖核酸の２次構造は配列によって変化し、得
られた電気泳動移動度の変化は一塩基の変化さえ検出することを可能にする。Ｄ
ＮＡ断片を標識するか、または標識されたプローブで検出してもよい。このアッ
セイの感度は(ＤＮＡよりむしろ)ＲＮＡを用いることにより増強しうる。ここで
、２次構造は配列の変化により敏感である。好ましい具体例では、本方法は、電
気泳動移動度の変化に基づいて二本鎖のヘテロ二本鎖分子を分離するヘテロ二本
鎖分析(キーン(Keen)ら,(1991年),トレンズ・イン・ジェネティクス(Trends Gen
et),7:5)を利用する。
【０２３８】 さらに別の具体例では、変性剤の勾配を含有するポリアクリルアミゲルにおけ
る突然変異体または野生型断片の移動は、変性勾配ゲル電気泳動(ＤＧＧＥ)(マ
イヤーズ(Myers)ら,(1985年),ネイチャー(Nature),313:495)を用いてアッセイさ
れる。ＤＧＧＥを分析の方法として用いる場合、ＤＮＡは、それが完全に変性し
ないことを確かめるために、例えば、ＰＣＲにより約４０ｂｐの高融点のＧＣに
富むＤＮＡのＧＣクランプを付加することにより修飾される。さらなる具体例で
は、変性勾配に代えて温度勾配を用いて、対照および試料ＤＮＡの移動度の差を
同定する。
【０２３９】 点突然変異を検出する他の技術の例としては、選択的なオリゴヌクレオチドハ
イブリダイゼーション、選択的な増幅または選択的なプライマー伸長が挙げられ
るが、それに限定されない。例えば、公知の突然変異が中央に配置されているオ
リゴヌクレオチドプライマーを調製し、次いで、完全な一致が見出される場合だ
けハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、標的ＤＮＡにハイブリダイズ
させればよい(サイキ(Saiki)ら,(1986年),ネイチャー(Nature),324:163；サイキ
(Saiki)ら,(1989年),プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(P
roc. Natl. Acad. Sci. USA),86:6230)。かかる対立遺伝子特異的なオリゴヌク
レオチドは、これらのオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションメンブレン
に付着させ、標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズさせる場合には、ＰＣＲ増
幅された標的ＤＮＡまたは数多くの異なる突然変異にハイブリダイズさせる。
【０２４０】 あるいは、選択的なＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的な増幅技術を本発
明と共に用いてもよい。特異的な増幅にプライマーとして用いられるオリゴヌク
レオチドは、分子の中心に(増幅が示差的ハイブリダイゼーションに依存するよ
うに)(ギブス(Gibbs)ら,(1989年),ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic
Acids Res.),17:2437-2448)、または１つのプライマーの極端な３'末端に(ここ
で、適当な条件下で、不一致がポリメラーゼ伸長を防止または低減することがで
きる)(プロスナー(Prossner)ら,(1993年),ティブテク(Tibtech)11:238)、関心の
ある突然変異を有し得る。加えて、突然変異の領域に新規な制限部位を導入して
、開裂に基づく検出法を創作することが望ましいかもしれない(ガスパリーニ(Ga
sparini)ら,(1992年),モレキュラー・セル・プローブズ(Mol. Cell Probes),6:1
)。いくつかの具体例では、増幅用のＴａｑリガーゼ(バラニー(Barany),(1991年
),プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
ズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. S
ci. USA),88:189)を用いて増幅を行ってもよいことは予想される。かかる場合に
は、５'配列の３'末端に完全な一致が存在する場合にだけ連結が起こり、増幅の
有無を調べることにより特異的な部位における公知の突然変異の存在を検出する
ことを可能にする。
【０２４１】 ここで説明した方法は、例えば、ここで説明した少なくとも１個のプローブ核
酸または抗体試薬を含有するプレパッケージ化診断キットを利用することにより
行いうる。これらの方法は、例えば、パブロ遺伝子が関係する疾患または病気の
徴候または家族の病歴を示す患者を診断する臨床環境に便利に用いうる。
【０２４２】 さらに、パブロが発現される任意の細胞タイプまたは組織は、ここで説明した
予後アッセイに利用してもよい。
【０２４３】 VI．パブロ調節剤の投与 本発明のパブロ調節剤は、Ｔ細胞媒介性免疫応答を増強または抑制する医薬の
インビボ投与に適当な生物学的に適合する形態で被験体に投与される。「インビ
ボ投与に適当な生物学的に適合する形態」により、毒性効果よりタンパクの治療
効果の方がまさっている投与すべきタンパクの形態を意味する。被験体なる用語
は、免疫応答が誘起され得る生きている生物、例えば、哺乳動物を包含すること
を意図する。被験体の例としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、および
それらの形質転換種が挙げられる。ここで説明した薬剤の投与は、治療上活性な
量の薬剤を単独または医薬上許容される担体との組合せを含めて、薬理学的な形
態とすることができる。
【０２４４】 治療上活性な量の本発明の治療組成物の投与は、所望の結果を得るのに有効な
量として、それに必要な用量および期間で定義される。例えば、治療上活性な量
のパブロ調節剤は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに個体にお
いて所望の応答を誘起するペプチドの能力などの因子に従って変化しうる。投与
計画は最適な治療応答を与えるように調節すればよい。例えば、いくつかの分割
量を毎日投与するか、治療状況の急迫性により必要とされるように、投与量を比
例的に減少させてもよい。
【０２４５】 本発明の治療または薬理学的組成物は、当該分野で公知の適当な経路で、例え
ば、静脈内、皮下、筋肉内、経皮的、くも膜下もしくは大脳内、またはエクスビ
ボ処理プロトコルでの細胞への投与で、投与することができる。投与は、注射の
ように急速に行うか、または緩慢な点滴もしくは徐放性製剤の投与のようにある
期間をかけて行うことができる。中枢神経系の組織を治療するのに、投与は脳脊
髄液(ＣＳＦ)への注射または点滴により行うことができる。パブロポリペプチド
を中枢神経系の細胞に投与すべきであると意図される場合、投与は血液-脳関門
を通過するパブロポリペプチドの貫通を促進することができる１種またはそれ以
上の薬剤を用いて行われる。
【０２４６】 パブロは、また、望ましい医薬上または薬力学的な性質を提供する薬剤と連結
または結合させることができる。例えば、パブロは、脳-血液関門を通過する貫
通または輸送を促進する当該分野で公知の物質、例えば、トランスフェリン受容
体に対する抗体にカップリングさせ、静脈内注射により投与することができる。
(例えば、フリデン(Friden)ら、サイエンス(Science),259:373-377,1993年；出
典を示すことにより本明細書の一部をなす)。さらに、パブロはポリエチレング
リコールなどのポリマーに安定に連結させて、溶解性、安定性、半減期の望まし
い性質および他の医薬上有利な性質を得ることができる。(例えば、デイビス(Da
vis)ら,エンザイム・エンジニアリング(Enzyme Eng),4:169-73,1978年；バーン
ハム(Burnham),)アメリカン・ジャーナル・オブ・ホスピタル・ファーマシィ(Am
J Hosp Pharm),51:210-218,1994年；出典を示すことにより本明細書の一部をな
す)。
【０２４７】 さらに、パブロポリペプチドは、細胞のサイトソルへの送達に役立つ組成物と
することができる。例えば、ペプチドは、このペプチドを細胞のサイトソルに送
達することができるリポソームなどの担体部分と結合させてもよい。かかる方法
は当該分野で公知である(例えば、アムセレム(Amselem)ら,ケミストリー・アン
ド・フィジックス・オブ・リピッズ(Chem Phys Lipids),64:219-237,1993；出典
を示すことにより本明細書の一部をなす)。あるいは、パブロポリペプチドは、
このパブロポリペプチドを細胞に送達することができる特定の輸送ペプチドを含
むように修飾するか、またはかかる輸送ペプチドに融合させることができる。加
えて、ポリペプチドはマイクロインジェクション法により細胞に直接送達するこ
とができる。
【０２４８】 組成物は、通常、医薬製剤の形態で採用される。かかる製剤は、医薬品業界で
公知の方法で製造される。ある好ましい製剤は、生理学的食塩水溶液の賦形剤を
利用するが、生理学的濃度の他の非毒性塩、５％グルコース水溶液、滅菌水など
の他の医薬上許容される担体を用いてもよいことは意図される。ここで用いるよ
うに、「医薬上許容される担体」は、任意および全部の溶媒、分散媒、コーティ
ング、抗菌剤および抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤などを包含する。医薬上
活性な物質に対するかかる媒体および薬剤の使用は当該分野で公知である。従来
の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、治療組成物におけ
るその使用は意図される。補助的な活性化合物を組成物に配合することもできる
適当な緩衝剤が組成物中に存在することが望ましいこともある。かかる溶液は、
所望により、凍結乾燥させ、簡易注射用の滅菌水の添加により再構成用の滅菌ア
ンプル中で保存することができる。１次溶媒は水性または非水性とすることがで
きる。パブロは、治療を必要とする組織に移植することができる固形または半固
形の生物学的に適合するマトリックスに配合することもできる。
【０２４９】 担体は、また、製剤のｐＨ、オスモル濃度、粘度、透明度、色、無菌状態、安
定性、溶解の速度、または臭気を変更または維持する他の医薬上許容される補形
剤を含有する。同様に、担体は、やはり、放出もしくは吸収または血液-脳関門
を通過する貫通を変更または維持する他の医薬上許容される補形剤を含有するこ
とができる。かかる補形剤は、単位用量または多数回投与形態での非経口投与用
または連続的または周期的な点滴による直接的な注入用の用量を処方するのに通
常および習慣的に採用される物質である。
【０２５０】 用量の投与は、投与製剤の薬物動力学的パラメーターおよび用いる投与の経路
に依存して反復することができる。
【０２５１】 また、パブロポリペプチドまたはその断片を含有するいくつかの製剤は経口的
に投与すべきと規定される。かかる製剤は、好ましくはカプセル封入され、適当
な担体を用いて固形の剤形に製剤される。適当な担体、補形剤および希釈剤のい
くつかの例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール
、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、
ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、
ゼラチン、シロップ、メチルセルロース、メチル-およびプロピルヒドロキシベ
ンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、水、鉱油などが挙げられる。
これらの製剤は、付加的に、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、保存剤、
甘味剤または香味剤が挙げられる。組成物は、当該分野で公知の方法を採用する
ことにより患者に投与した後、有効成分の急速な、持続的な、または遅延の放出
を提供するように製剤しうる。製剤は、また、タンパク分解を減少させる物質お
よび/または吸収を促進する物質、例えば、界面活性剤を含有することができる
。
【０２５２】 投与の容易性および用量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形に製剤す
ることが特に有利である。ここで用いる単位剤形とは、治療すべき哺乳動物の被
験体に単位の用量として適した物理的に分離した単位を意味する；各単位は所望
の治療効果を生ずるように算出された所定量の活性化合物を必要とされる医薬用
担体と共に含有する。本発明の単位剤形の内訳は指図され、(ａ)活性化合物の独
特の特性および達成されるべき特定の治療効果、ならびに(ｂ)個体の感受性の治
療用としてかかる活性化合物を調合する当該分野で固有の制限に直接依存する。
具体的な投与量は、例えば、患者のおおよその体重もしくは体表面積または占有
されるべき身体空間の体積に従って、当業者により容易に算出することができる
。投与量は、また、選択される特定の投与経路に依存して算出される。治療に適
当な用量を決定するのに必要な計算のさらなる改善は、当業者により習慣的に行
われる。かかる計算は、標的細胞のアッセイ調製においてここに開示した活性を
考えて当業者により過度の実験をせずに行うことができる。正確な用量は標準的
な用量-応答調査に関連して決定される。実際に投与される組成物の量が、治療
すべき状態または状態群、投与すべき組成物の選択、個々の患者の年齢、体重お
よび応答、患者の徴候の重篤度、および選択される投与経路を含む関連する状況
を考えて開業医により決定されることは理解される。
【０２５３】 かかる化合物の毒性および治療効力は、細胞培養物または実験動物について、
標準的な医薬的方法、例えば、ＬＤ５０(集団の５０％に対して致死的な投与量)
およびＥＤ５０(集団の５０％に治療上有効な投与量)を測定する方法により決定
することができる。毒性効果と治療効果との投与量比は治療指数であり、比率Ｌ
Ｄ５０/ＥＤ５０で表すことができる。大きい治療指数を示す化合物が好ましい
。毒性の副作用を示す化合物を用いうる一方、非感染細胞に対する可能性のある
損傷を最少限にし、それゆえ副作用を減少させるために、かかる化合物を患部組
織の部位に向かわせる送達系を設計するように留意すべきである。
【０２５４】 細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトに用いる用量の
範囲を定式化するのに用いることができる。かかる化合物の用量は、好ましくは
毒性を殆どまたは全く伴わないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。用量は
、採用した剤形および利用した投与経路に依存して、この範囲内で変化しうる。
本発明の方法に用いるどの化合物についても、治療上有効な投与量は、まず細胞
培養物アッセイから見積もることができる。投与量は、細胞培養物で決定される
ＩＣ５０(すなわち、徴候の半値阻害を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血
漿濃度範囲を達成するのに動物モデルで定式化しうる。かかる情報は、ヒトに有
用な投与量をより正確に決定するのに用いることができる。血漿中のレベルは、
例えば、高速液体クロマトグラフィーで測定すればよい。
【０２５５】 本発明のある具体例では、パブロポリペプチドは、生物学的に活性な形態のパ
ブロまたはパブロの前駆体、すなわち身体により生物学的に活性なけ形態のパブ
ロに容易に変換されることができる分子を産生することができるベクターまたは
細胞を患者に移植することにより治療的に投与すればよい。あるアプローチでは
、パブロを分泌する細胞は、患者への移植用の半透膜中に封入してもよい。細胞
はパブロもしくはその前駆体を正常に発現する細胞とすることができ、または細
胞はパブロもしくはその生物学的に活性な断片もしくはその前駆体を発現するよ
うに形質転換することができる。患者がヒトである場合、細胞はヒト起源であり
、パブロポリペプチドはヒトパブロであることが好ましい。しかし、ここでの製
剤および方法は、脊椎動物およびヒトへの応用に用いることができ、ここで用い
るように、「患者」または「被験体」なる用語は、ヒトおよび脊椎動物の患者を
包含することを意図する。
【０２５６】 パブロタンパクの発現または活性に対する薬剤(例えば、薬物または化合物)の
影響をモニターすることは、基礎的な薬物スクリーニングだけでなく、臨床試験
においても応用することができる。例えば、パブロ遺伝子発現、タンパクレベル
を上昇させるか、またはパブロ活性を上方調節するために、ここに記載したスク
リーニングアッセイにより決定された薬剤の有効性は、低下したパブロ遺伝子発
現、タンパクレベルを示すか、または下方調節されたパブロ活性を示す被験体の
臨床試験においてモニターすることができる。あるいは、パブロ遺伝子発現、タ
ンパクレベルを低下させるか、またはパブロ活性を下方調節するために、スクリ
ーニングアッセイにより決定された薬剤の有効性は、上昇したパブロ遺伝子発現
、タンパクレベルを示すか、または上方調節されたパブロ活性を示す被験体の臨
床試験においてモニターすることができる。かかる臨床試験では、パブロ遺伝子
、および好ましくは、ある障害に関係している他の遺伝子の発現または活性は、
特定の細胞の表現型の「読出し(read out)」またはマーカーとして用いることが
できる。
【０２５７】 例えば、また、限定するつもりではないが、パブロ活性を調節する薬剤(例え
ば、化合物、薬剤または小分子)で処理することにより細胞中で調節される(例え
ば、ここに記載したスクリーニングアッセイで同定される)遺伝子、例えば、パ
ブロを同定することができる。かくして、パブロ関連障害に対する薬剤の効果を
、例えば、臨床試験で調べるために、細胞を単離し、ＲＮＡを調製し、パブロお
よびパブロ関連障害に関係する他の遺伝子の発現のレベルについて、それぞれ分
析することができる。遺伝子発現のレベル(すなわち、遺伝子発現パターン)は、
ここに記載したノーザンブロット分析もしくはＲＴ-ＰＣＲにより、または産生
されたタンパクの量をここに記載した方法の１つで測定することにより、または
パブロもしくは他の遺伝子の活性のレベルを測定することにより、定量すること
ができる。このようにして、遺伝子発現パターンは、薬剤に対する細胞の生理学
的な応答を示すマーカーとして役立てることができる。従って、この応答状態は
、薬剤を用いた個体の治療前、および治療の間の様々な時点で決定しうる。
【０２５８】 好ましい具体例では、本発明は、薬剤(例えば、作動薬、拮抗薬、ペプチド擬
似薬、タンパク、ペプチド、核酸、小分子、またはここに記載したスクリーニン
グアッセいにより同定される他の薬物候補)による被験体の治療の有効性をモニ
ターする方法を提供する。かかる方法は、(ｉ)薬剤の投与前に被験体から投与前
試料を得る工程；(ii)投与前試料中におけるパブロタンパク、ｍＲＮＡまたはゲ
ノムＤＮＡの発現のレベルを検出する工程；(iii)被験体から１個またはそれ以
上の投与前試料を得る工程；(iv)投与後試料中におけるパブロタンパク、ｍＲＮ
ＡまたはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出する工程；(ｖ)投与前試
料中におけるパブロタンパク、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現または活性の
レベルを投与後試料または試料群中におけるパブロタンパク、ｍＲＮＡまたはゲ
ノムＤＮＡと比較する工程；および(vi)それに応じて被験体への薬剤の投与を変
更する工程を包含する。例えば、薬剤の増大した投与は、パブロの発現または活
性を検出されるより高いレベルに上昇させるのに、すなわち薬剤の有効性を増大
させるのに望ましい。あるいは、薬剤の減少した投与は、パブロの発現または活
性を検出されるより低いレベルに低下させるのに、すなわち薬剤の有効性を減少
させるのに望ましい。かかる具体例に従って、パブロ発現または活性は、観察可
能な表現型応答の非存在下でさえ、薬剤の有効性の指標として用いうる。
【０２５９】 好ましい具体例では、パブロの発現および/または活性の調節から利益を得る
被験体の神経細胞のアポトーシスを調節するパブロ調節剤の能力は、薬剤の投与
後の患者の状態における改善を検出することにより測定することができる。かか
る改善は、患者の具体的な状態に適当な指標を用いて、当業者が容易に測定する
ことができる。患者の状態における変化を測定することにより患者の応答をモニ
ターすることは、増大した危険性および/または損傷を患者に課する生検材料の
採取であった状況で好ましい。
【０２６０】 パブロのレベルは様々な状態で変化しうるし、パブロレベルの定量は臨床上有
用な情報を提供すると思われる。さらに、細胞により発現されるパブロの上昇し
たレベルが生存能力を低下させるその細胞の細胞死調節機構をシフトさせ得るこ
とがここで示されているので、一群の細胞、組織または新生組織形成などの細胞
または細胞群におけるパブロのレベルの測定は、その細胞または細胞群のアポト
ーシス状態に関する有用な情報を提供すると考えられる。加えて、パブロはＢｃ
ｌ-ｘＬと相互作用するので、これらのパブロ相互作用Ｂｃｌ-ｘＬファミリーメ
ンバーの細胞レベルを測定することが望ましいとすることもできる。
【０２６１】 さらに、疾患状態の治療においては、パブロを含有する組成物は外来的に投与
することができ、所望の組織区画または患部組織における血清中のパブロポリペ
プチドのある標的レベルを達成することが望ましいようである。それゆえ、患者
における、または患者から得た組織生検試料を含む生物学的試料におけるパブロ
ポリペプチドのレベルをモニターし、場合によっては、パブロのレベルもモニタ
ーし、また、状況によっては、Ｂｃｌ-ｘＬのレベルもモニターできることが有
利である。従って、本発明は、また、患者由来の試料中におけるパブロの存在を
検出する方法を提供する。
【０２６２】 VII．本発明のキット 本発明の別の態様は、本発明のスクリーニングアッセイ、調節方法または診断
アッセイを実施するためのキットに関する。例えば、本発明のスクリーニングア
ッセイを実施するためのキットは、パブロポリペプチドを含有する細胞、パブロ
ポリペプチド活性を測定する手段、およびパブロ活性の調節物質を同定するキッ
トを用いる指示書を包含することができる。別の具体例では、本発明のスクリー
ニングアッセイを実施するためのキットは、パブロポリペプチドを含有する組成
物、パブロ活性を測定する手段、およびパブロ活性の調節物質を同定するキット
を用いる指示書を包含することができる。
【０２６３】 別の具体例では、本発明は、本発明の調節方法を実施するためのキットを提供
する。このキットは、例えば、適当な担体中に、また、パブロ活性を調節する調
節物質の使用に関する指示書と共に、適当な容器に包装された、本発明の調節剤
(例えば、パブロ阻害剤または刺激剤)を包含することができる。
【０２６４】 本発明の別の態様は、被験体における異常なパブロ発現および/または活性に
関連する障害を診断するためのキットに関する。このキットは、パブロの発現を
測定する試薬(例えば、パブロｍＲＮＡを検出する核酸プローブ、またはパブロ
タンパクの検出のための１個もしくはそれ以上の抗体)、被験体の結果を比較す
るための対照、診断目的のキットを用いるための指示書を包含することができる
。
【０２６５】 すべての引用例、例えば、本明細書(背景を含む)中で引用された文献、発行特
許、公開特許出願の内容は、出典を示すことにより本明細書の一部をなす。本発
明の実施は、特に断らない限り、当該分野の技術範囲内にある、細胞生物学、細
胞培養、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学
の従来技術を採用する。これらの技術は文献に十分に説明されている。例えば、
モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloni
ng A Laboratory Manual)、第２版、サムブルック(Sambrook)、フリッチ(Fritsc
h)およびマニアティス(Maniatis)編(コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)：1989年)；ディー・エ
ヌ・エイ・クローニング(DNA Cloning)、第Ｉ巻および第II巻(ディー・エヌ・グ
ローバー(D.N. Glover)編、1985年)；オリゴヌクレオチド・シンセシス(Oligonu
cleotide Synthesis)(エム・ジェイ・ガイト(M.J. Gait)編、1984年)；マリス(M
ullis)ら、米国特許第4,683,195号；ヌクレイック・アシッド・ハイブリダイゼ
ーション(Nucleic Acid Hybridization)(ビー・ディー・ヘイムズ(B.D. Hames)
およびエス・ジェイ・ヒギンズ(S.J. Higgins)編、1984年)；トランスクリプシ
ョン・および・トランスレイション(Transcription And Translation)(ビー・デ
ィー・ヘイムズ(B.D. Hames)およびエス・ジェイ・ヒギンズ(S.J. Higgins)編、
1984年)；カルチャー・オブ・アニマル・セルズ(Culture Of Animal Cells)(ア
ール・アイ・フレッシュニィ(R.I. Freshney)、アラン・アール・リス，インク(
Alan R. Liss, Inc.)、1987年)；インモービライズド・セルズ・アンド・エンザ
イムズ(Immobilized Cells And Enzymes)(アイ・アール・エル・プレス(IRL Pre
ss)、1986年)；ビー・パーバル(B. Perbal)、ア・プラクティカル・ガイド・ト
ゥ・モレキュラー・クローニング(A Practical Guide To Molecular Cloning)(1
984年)；論文、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods In Enzymology)(ア
カデミック・プレス・インク(Academic Press, Inc.)、ニューヨーク)；ジーン
・トランスファー・ベクターズ・フォア・マンマリアン・セルズ(Gene Transfer
Vectors For Mammalian Cells)(ジェイ・エイチ・ミラー(J.H. Miller)および
エム・ピー・カロス(M.P. Calos)編、1987年、コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory))；メソッズ・イン・エンザイ
モロジー(Methods In Enzymology)、第154巻および第155巻(ウー(Wu)ら編)、イ
ムノケミカル・メソッズ・イン・セル・アンド・モレキュラー・バイオロジー(I
mmunochemical Methods In Cell And Molecular Biology)(メイヤー(Mayer)およ
びウォーカー(Walker)編、アカデミック・プレス(Academic Press)、ロンドン、
1987年)；ハンドブック・オブ・エクスペリメンタル・イムノロジー(Handbook O
f Experimental Immunology)、第Ｉ巻〜第IV巻(ディー・エム・ウィアー(D.M. W
eir)およびシー・シー・ブラックウェル(C.C. Blackwell)編、1986年)；マニピ
ュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ(Manipulating the Mouse Embryo)、(
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor
Laboratory Press)、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)、
ニューヨーク、1986年)。
【０２６６】 典型的な具体例 本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、これらはいかようにも限定す
るものとして解釈すべきではない。
【０２６７】 実施例１．Ｂｃｌ-ｘＬ結合タンパクとしてのパブロの同定 Ｂｃｌ-ｘＬは、ｐＡＳ２-１ベクター中のＧＡＬ４タンパクの結合ドメイン部
分における融合タンパクとして発現された。ヒト脳ライブラリー(成人ヒト脳マ
ッチメーカーｃＤＮＡ；クローンテック(Clontech)製；カタログ＃ＨＬ４００４
ＡＨ、ロット＃５２００８)は、ｐＡＣＴII中のＧＡＬ４タンパクの活性化ドメ
イン部分に対する融合の形態で発現された。Ｂｃｌ-ｘＬとライブラリータンパ
クとの機能的相互作用は、レポーター遺伝子活性の発現を行った。我々が利用し
たレポーター表現型は、ヒスチジン栄養要求性およびβ-ガラクトシダーゼ活性
であった。
【０２６８】 餌として用いたＢｃｌ-ｘＬは、開始コドンからヌクレオチド６５８(ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：３)までのヒトｃＤＮＡであった。これはアミノ酸１〜２１１(ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：４)に相当する。すなわち、膜貫通領域であると考えられる最後
の２２個のアミノ酸は欠失されていた。
【０２６９】 ライブラリーの形質転換およびスクリーニングは、クローンテック(Clontech)
の指示書どおりに実施した。ｈｉｓ-プレートについて増殖が陽性であり、かつ
β-ガラクトシダーゼ活性について陽性であるクローンのうち３つは、すでに同
定されたヒト脳ＥＳＴ：ＫＩＡＡ０２６９(ここでは、パブロ-前アポトーシスＢ
ｃｌ-ｘＬ結合タンパク)の一部をコードした。以下でさらに詳しく説明するよう
に、パブロのほぼ最後の１３０個のアミノ酸(アミノ酸４２９〜５５９)をコード
するこれらクローンのうち２つは、Ｂｃｌ-ｘＬに結合するのに十分であること
が見出された。
【０２７０】 パブロの全オープンリーディングフレームをコードするクローンは、ＫＩＡＡ
０２６９のジーンバンク(GenBank)提出物において報告されたＡＴＧおよび停止
コドン周辺の配列に対して設計されたプライマーを用いて生成された。
【０２７１】 このアッセイで同定されたクローンは、配列決定され、ＫＩＡＡ０２６９ジー
ンバンク(GenBank)提出物(受託番号Ｄ８７４５９)の配列と一致することが確認
された。ＫＩＡＡ０２６９は、ナガセ(Nagase)らにより本来報告され(ディー・
イエヌ・エイ・リサーチ(DNA Research),(1996年),3:321-324)、その文献中でＫ
ＩＡＡ０２６９と呼ばれ、その使用法に言及されるポリペプチドをコードする。
ナガセ(Nagase)およびその同僚は、ＫＩＡＡ０２６９発現配列タグ(ＥＳＴ)断片
ンを脳由来のヒトｃＤＮＡクローンの配列決定を目的としたプロジェクトの一部
として本来同定した。
【０２７２】 パブロは、ＷＡＳＰ(ウィスコット-アルドリッチ症候群タンパク)ファミリー
のタンパク(デリー(Derry)ら,1994年,セル(Cell),78:635；ラメッシュ(Ramesh)
ら,1999年,トレンズ・イン・セル・バイオロジー(Trends Cell Biol.),9:15)の
新規なメンバーである。ＷＡＳＰファミリーは、細胞の細胞骨格の微細繊維成分
の転位に関係していると考えられるアクチン結合タンパクである。様々なＷＡＳ
Ｐファミリーメンバーの組織特異的発現の証拠が存在する。ＫＩＡＡの発現パタ
ーンと同調して、このタンパクはＮ-ＷＡＳＰ(ニューロン特異的なＷＡＳＰファ
ミリーメンバー)(ミキ(Miki)ら,1996年,エンボ(EMBO),15:5326)に最も相同であ
る。ベア(Bear)らによる最近の報告(1998年,ジャーナル・オブ・セル・バイオロ
ジー(J. Cell Biol.),142:1325)は、パブロが粘菌(Dictyostelium)遺伝子ＳＣＡ
Ｒのヒト相同物であることを立証している。別の報告では、マチェスキー(Mache
sky)ら(1998年,カレント・バイオロジー(Curr. Biol.),8:1347)は、Ｓｃａｒ１(
パブロ)がアクチン関連タンパクＡｒｐ２/３(マチェスキー(Machesky)ら,1997年
,バイオケミカル・ジャーナル(Biochem. J.),328:105；マリンズ(Mullins)ら,19
98年,プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA),95:6181)との相互作用によりアクチン細胞骨格を調節することを
報告している。
【０２７３】 ノーザンブロットは、パブロが脳で優先的に発現されるが、精巣および卵巣で
も低いレベルで発現されることを示した。
【０２７４】 この発現パターンは、マウスのパブロ特異的なプライマーを用いたポリメラー
ゼ連鎖反応により確認された。ＦＶＢ/Ｎ成体マウス(４匹の雄および４匹の雌)
由来の組織を用いて、パブロｍＲＮＡは神経組織(海馬、皮質、線条体、前嗅覚
神経、小脳および視床下部)に見出され、肝臓、腎臓、心臓、筋肉、小腸および
胃には検出できないか、またはほとんど検出できない。
【０２７５】 実施例２．パブロ過剰発現は小脳顆粒ニューロンに対して毒性である 小脳顆粒ニューロン(ＣＧＮ)は、リン酸カルシウム・プロフェクチン(ProFect
in；登録商標)・マンマリアン・トランスフェクション・システム(Mammalian Tr
ansfection System)(プロメガ・コーポレーション(Promega Corporation)、ウィ
スコンシン州マジソン)を用い、製造業者の指示書に従って、パブロ-ｅＧＦＰ-
Ｃ２構築物(ｅＧＦＰベクターは、クローンテック(Clontech)から市販されてい
る；カリフォルニア州パロアルト)で一過的にトランスフェクトした。イメージ
は、トランスフェクションの８時間後に、トランスフェクトしたＣＧＮから製造
した。各イメージは、共焦点顕微鏡で取ったニューロンを通る光学的セクション
である。蛍光シグナルはパブロ-ｅＧＦＰ融合構築物から検出した。イメージは
、この８時間の時点で、パブロタンパクが主に原形質膜に局在化していることを
示した。これらの発見は、調べた３０以上のＣＧＮについて典型的であった。こ
のタンパクの２次構造には、それが膜貫通領域を有し、かくして完全な膜タンパ
クであることを示唆することは何も存在しなかった。むしろ、上記のように、細
胞骨格のアクチン成分を関連するタンパクのファミリーと相同性を共有している
。それゆえ、パブロは原形質膜に関連しているが、その中にはない。
【０２７６】 パブロ-ｅＧＦＰ構築物によるトランスフェクションの２４時間後に調製され
たイメージの別のパネルでは、局在化のパターンは、得られたものとは異なって
いた。２４時間の時点で、パブロタンパクは、原形質膜の場所に限定されず、む
しろサイトソル全体に拡散しているように思われた。また、蛍光が拡散している
のに対し、核の局在化が存在するようには思えない。これらの発見は、調べた３
０以上のニューロンについて典型的であった。
【０２７７】 トランスフェクションの約３６時間後に、細胞体は形状が不規則であるように
思われ、神経突起は断片化していた。パブロ分布は細胞全体に拡散し続けたが、
核からは排除された。４８時間までに、全てのｅＧＦＰ陽性ＣＧＮは破片に断片
化した。各培養物において、各時点で、トランスフェクトしていないニューロン
は健康なままであった。
【０２７８】 実施例３．パブロ過剰発現は１次ラット海馬ニューロンにおいて毒性である リン酸カルシウム・プロフェクチン(ProFectin；登録商標)・マンマリアン・
トランスフェクション・システム(Mammalian Transfection System)(プロメガ・
コーポレーション(Promega Corporation)、ウィスコンシン州マジソン)を用いて
、カバーグラス上の１次ラット海馬培養物(１０日間培養中)をトランスフェクト
した。トランスフェクションの約３０時間後、培養物を４％パラホルムアルデヒ
ド中で固定化し、ヘキスト(Hoechst)染色し、スライドガラス上に載せた。ｅＧ
ＦＰ陽性細胞をアポトーシス核について評価した。ｅＧＦＰ空ベクターでトラン
スフェクトした海馬ニューロンの３０％がヘキスト(Hoechst)染色によりアポト
ーシス核を示した(＊ｐ＜０.０１；トランスフェクトしていない場合に比べて)
。これは、トランスフェクトしていない培養物の５％未満と比較される。それゆ
え、トランスフェクション法それ自体は、培養物に損傷を与えると思われる。バ
ックグラウンドのアポトーシスがこのように増大するにもかかわらず、パブロで
トランスフェクトした細胞においては、アポトーシスの有意な増大が見られた。
図１に示すように、トランスフェクションの３０時間後には、パブロでトランス
フェクトしたラット海馬ニューロンの１００％が核濃縮により示されるアポトー
シスを受ける細胞の異常な核の形態を示した(＊＊ｐ＜０.０１；ｅＧＦＰ空ベク
ターでトランスフェクトした場合に比べて)。
【０２７９】 実施例４．パブロ過剰発現はＰＣ１２細胞において毒性である。 パブロを発現する安定なＰＣ１２細胞系は、ＰＣ１２テット-オフ(Tet-Off)細
胞系(クローンテック(Clontech)から市販されている；カリフォルニア州パロア
ルト)を用いて調製した。テット(Tet)調節された安定に発現するニューロン細胞
の世代に用いるべきプラスミドを構築した。発現された遺伝子の調節は、テトラ
サイクリン応答要素(ＴＲＥ)を包含するプロモーターの制御下における、テット
(tet)制御トランスアクチベーター(ｔＴＡ)を含有する第１の「調節」プラスミ
ドおよび関心のある遺伝子(この場合は、パブロ)を含有する第２の「応答」プラ
スミドの二重安定発現によりもたらされる。市販されている調節プラスミドは、
ネオマイシン選択について操作されたベクター中に存在する。このことから、第
２の選択可能なマーカーを包含するように応答ベクターを構築する必要がある。
応答プラスミドの構築用の出発材料は、ｐｃＤＮＡ３.１(−)Ｚｅｏ(例えば、ht
tp://www.invitrogen.com/vecgif/pcdna3.1zeo.gifを参照)であった。このベク
ターはゼオチン選択可能であるが、構成的に活性なＣＭＶプロモーターを含有す
る。それゆえ、構築の第１工程は、ＭｎｕＩ(プロモーターの上流)およびＮｈｅ
Ｉ(プロモーターの下流；また、ポリリンカーの最も上流部位)での消化によるこ
のプロモーターの除去である。得られた不適合末端の平滑化およびプラスミドを
再環化するための連結により、プロモーターのないベクターが得られた。第２工
程は、ＴＲＥの挿入であった。この要素は、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩでの消化
によりｐＴＲＥ(例えば、http://www.clontech.com/clontech/vectros/pTRE.htm
l)から４５０ｂｐ断片として取り出した。プロモーターのないベクターを同様に
切断し、ＴＲＥ挿入物を導入して、ＴＲＥの制御下でパブロ遺伝子を収容するの
に適当なＴＲＥ駆動応答ベクターが得られた。このベクターは、ある程度限定さ
れたポリリンカーを有するが、利用可能な部位としてＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩお
よびＨｉｎｄIIIだけを有する。パブロは、ＢａｍＨＩ部位にクローン化した。
パブロ発現は、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン関連の化合物(例えば
、ドキシサイクリン)の存在下でターンオフされ、テトラサイクリンを培養培地
に加えない場合にターンオンされた。このベクターの構築は、通常はそれが毒性
である細胞中におけるパブロの安定な発現を可能にする。
【０２８０】 トランスフェクションについては、簡単には、添加物(１０％ウマ血清、５％
ウシ胎児血清、抗生物質(１００Ｕ/ｍｌペニシリンＧナトリウムおよび１００μ
ｇ/ｍｌ硫酸ストレプトマイシン)および２ｍＭ Ｌ-グルタミン)を有するＤＭＥ
Ｍ中で細胞を培養した。約４８時間後、添加物および１００μｇ/ｍｌのＧ４１
８(ギブコ・ビー・アール・エル(Gibco BRL))を含有するＤＭＥＭに培地を変更
した。細胞を広げて、Ｇ４１８濃度を５０μｇ/ｍｌに低下させた。
【０２８１】 ドキシサイクリンを含有する培地に細胞を移し、プロメガ・プロフェクチン(P
romega Profectin)(ＣａＰＯ４)システムを用い、製造業者の指示書に従って、
全長パブロ遺伝子(約５０μｇのＤＮＡ)を含有する構築物で細胞をトランスフェ
クトした。約１６時間後、細胞を洗浄し、添加物およびドキシサイクリンを含有
するＤＭＥＭ中に再懸濁した。約４８時間後、ゼオチンを含有するＤＭＥＭにい
れた。
【０２８２】 安定に形質転換されたＰＣ１２-パブロ細胞の異種集団を４８時間誘発するか
、または誘発しなかった。生存可能な細胞は、これらの培養物中のＭＴＳ(セル
タイター９６アクエアス(Cell titer 96 Aqueous)；プロメガ(Promega))減少活
性を測定することにより検出した。このアッセイは、テトラゾリウム塩、ＭＴＳ
[３-(４,５-ジメチルチアゾール-２-イル)-５-(３-カルボキシメトキシフェニル
)-２-(４-スルホフェニル)-２Ｈ-テトラゾリウム、内部塩]の、組織培養培地に
可溶であり、付加的な処理(１〜３)なしに９６ウェルアッセイプレート中、直接
４９０ｎｍで測定されるホルマザン生成物への細胞転換に基づいている。吸光度
は、培養中の生きている細胞の数に正比例する。データは４９０ｎｍにおける光
学密度として与えられ、より大きい光学密度を有する培養物は、より生存可能な
細胞を含有する。図２に示すように、３７℃で９０分間インキュベートした後、
誘発していない(＋Ｄｏｘ)培養物はＯＤ４９０ｎｍが０.５１７であった。比較
により、パブロ発現を誘発した培養物のＯＤ４９０ｎｍは０.２０９であった。
【０２８３】 ヘキスト(Hoechst)染色データは、パブロに誘発された細胞死がアポトーシス
的な死であることを示唆している。また、図１に示すように、パブロは、そのＢ
ｃｌ-ｘＬ結合活性ゆえに、２ハイブリッドスクリーンで同定された。それゆえ
、パブロに誘発される細胞死を低減するＢｃｌ-ｘＬの能力を調べた。安定な異
種ＰＣ１２-パブロ集団をＢｃｌ-ｘＬ-ｅＧＦＰ(緑色蛍光タンパク)またはｅＧ
ＦＰ空ベクターを一過的にトランスフェクトした。同時に、パブロ発現は、培養
培地からのドキシサイクリンの除去により誘発された。図３はトランスフェクシ
ョン/誘発の４８時間後にｅＧＦＰ＋であったＰＣ１２細胞の百分率を示す。Ｂ
ｃｌ-ｘｌをトランスフェクトした培養物中における細胞の約１４％がｅＧＦＰ
＋であった。ｅＧＦＰ空ベクターをトランスフェクトした培養物中における細胞
のわずか２.７％がｅＧＦＰ＋であった。トランスフェクション効率のこの明白
な可変性は、ｅＧＦＰをトランスフェクトした細胞の約４０％がアポトーシスを
受けていたという事実により説明される。対照的に、Ｂｃｌ-ｘＬ-ｅＧＦＰをト
ランスフェクトした細胞のわずか３.５％がトランスフェクション/誘発の４８時
間後にアポトーシス核を示した。(図４を参照)。それゆえ、ｅＧＦＰ空ベクター
の明白な低いトランスフェクション効率は、４８時間前の時点における細胞の死
によるものらしい。
【０２８４】 実施例５．パブロ過剰発現はＨＥＫ２９３細胞に毒性ではない リン酸カルシウム・プロフェクチン(ProFectin；登録商標)・マンマリアン・
トランスフェクション・システム(Mammalian Transfection System)(プロメガ・
コーポレーション(Promega Corporation)、ウィスコンシン州マジソン)を用いて
、ＨＥＫ２９３細胞をパブロ-ｅＧＦＰ-Ｃ２構築物でトランスフェクトした。２
９３細胞の共焦点イメージをトランスフェクションの４８時間後に調べた。この
時点で、細胞および核の形態は正常であり、細胞死の証拠は存在しなかった。パ
ブロの分布は、細胞質に拡散しており、核には存在しなかった。調べた時点(８
、２４、４８時間)のいずれでも、初期の時点でＣＧＮに見られた原形質膜への
特異的な局在化は存在しなかった。
【０２８５】 表１は、６ウェルプレート中のＨＥＫ２９３細胞にパブロ-ｅＧＦＰ-Ｃ２をト
ランスフェクトした３つの別々の実験からのデータを要約している。対照として
、いくつかの培養物に空ｅＧＦＰベクターをトランスフェクトし、その他はトラ
ンスフェクトをしないままであった。これらの実験では、パブロ過剰発現の毒性
を、引き続く傷害(この場合は、スタウロスポリン(ＳＴＳ))による傷つき易さに
対するパブロ過剰発現の効果と同様に調べた。濃縮した核を有する細胞の百分率
を図５に示し、ＧＦＰ＋細胞の百分率を図６に示す。図５はトランスフェクショ
ンの４８時間後における２９３細胞のヘキスト(Hoechst)染色により明らかにな
った濃縮した核の百分率を示す。ＣＨＩ-二乗分析により、パブロをトランスフ
ェクトされた培養物-対-ｅＧＦＰ培養物において、濃縮した核の統計学的に有意
な増加はなかった。また、スタウロスポリンによる細胞喪失の倍増は、トランス
フェクトしていない培養物におけるスタウロスポリンの効果を比較する場合より
、パブロをトランスフェクトした培養物の方が激しいようには見えない。図６は
トランスフェクション効率が３つのトランスフェクトしたグループでほぼ等しか
ったことを示す。トランスフェクションの４８時間後に濃縮した核を有するＧＦ
Ｐ＋細胞の百分率を図７に示す。図７はｅＧＦＰ陽性細胞の核を特に見たデータ
を報告する。また、ｅＧＦＰ単独とパブロ-ｅＧＦＰ融合構築物との間に差はな
い。簡単には、パブロは単独で発現した場合に毒性ではなく、スタウロスポリン
傷害の毒性を増強しなかった。
【０２８６】
【表１】
【０２８７】 ニューロン細胞および非ニューロン細胞に対するパブロトランスフェクション
の効果を図８に示す。この図に示すように、ニューロン細胞で優先的に発現され
ることに加えて、パブロは、その活性がニューロン細胞特異的であると思われる
。
【０２８８】 また、神経細胞および非神経細胞におけるパブロ毒性データの要約を表IIに示
す。この表は、ｅＧＦＰ空ベクターまたはパブロをコードする核酸分子を含有す
るベクターをトランスフェクションした２４時間後にアポトーシス的な核の百分
率を示す。これらのデータは、パブロが試験した神経細胞では有意に前アポトー
シス的であるが(ｐ＜０.０１)、非ニューロン細胞ではアポトーシス的でないこ
とを示す。
【０２８９】
【表２】
【０２９０】 実施例６．パブロのＢｃｌ-ｘＬ結合領域の同定 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、これらの実験に用いた全長パブロのアミノ酸配列を
示す。Ｂｃｌ-ｘＬ酵母２ハイブリッドスクリーンで単離されたクローンのうち
３個は、パブロｃＤＮＡの一部を含有していた。クローンのうち２個は、ほぼ最
後の１３０個のアミノ酸をコードしていた。クローンのうち１個は、最後の２１
３個のアミノ酸をコードしていた。このことは、Ｂｃｌ-ｘＬに結合するパブロ
の能力は、ほぼアミノ酸４２９〜５５９からＣ末端の１３０個のアミノ酸に含ま
れることを示唆している。
【０２９１】 これらの結果は、Ｃ末端の１４２個のアミノ酸、すなわちアミノ酸４１８〜５
５９を欠くパブロの欠失突然変異体(Δ１４２)を構築することにより確認した。
パブロ(Δ１４２)を構築するために、既存のパブロ-ｅＧＦＰ融合ベクターおよ
び次の２つのプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。 １）tagaattc atg ccg cta gtg aaa aga aac atc g (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７) ２）taggatcc acc ttg tgg gag tgg atg aac tgg (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８) プライマー１は、ＡＴＧ開始コドンの直ぐ５'側にＥｃｏＲＩ部位を有する５'正
方向プライマーである。プライマー２は、(ＡＴＧ開始後)パブロヌクレオチド＃
１２５４の直ぐ３'側にＢａｍＨＩ部位を有する３'逆方向プライマーである。こ
れら２つのプライマーは、パブロのアミノ酸１〜４１８をコードする断片を与え
る。このＰＣＲ断片は、ｐＣＲ２.１-ＴＯＰＯ(インビトロジェン(Invitrogen)
；カタログ＃Ｋ４５００-０１)にクローン化した。これのＥｃｏＲＩ-ＢａｍＨ
Ｉ消化はパブロΔ１４２遺伝子を与え、これはｐＥＧＦＰ-Ｃ２(リーディングフ
レーム番号２におけるＧＦＰのＣ末端に接続されたパブロのＮ末端を有する；ク
ローンテック(Clontech)、カタログ＃６０８３-１)のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ
Ｉ部位にクローン化した。適当なプライマーを用いて、全パブロΔ１４２構築物
を配列決定し、確認した。ヌクレオチド配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示し、ア
ミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示す。
【０２９２】 ラット小脳顆粒ニューロンに全長パブロ；パブロΔ１４２；およびｅＧＦＰ空
ベクターを一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの８時間後、
２４時間後、および４２時間後に、培養物を４％パラホルムアルデヒドで固定化
し、ヘキスト(Hoechst)染色した。ＧＦＰ蛍光細胞由来の核をアポトーシス的ま
たは正常として評価した。この実験の結果を図９に示す。この図はパブロタンパ
クのほぼアミノ酸４１８〜５５９がそのアポトーシス活性の原因であることを立
証している。
【０２９３】 パブロの第２欠失突然変異体を調製した。これは、このタンパクにおける７０
個のカルボキシ末端アミノ酸を欠く、すなわちアミノ酸４９０〜５５９を欠失し
ている。この構築物は、神経細胞毒性を引き起こすのに、全長パブロタンパクの
約５０％程度有効である。
【０２９４】 Δ１４２突然変異体(神経細胞毒性を示さない)とΔ７０突然変異体(最大毒性
の約５０％を示す)とにおける欠失部位間の領域、すなわちアミノ酸４３６〜４
８９は、パブロとＷＡＶＥ２とＷＡＶＥ３との間において大きく相違する領域で
あり、これらの結果に基づいて、パブロのＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインを含有しう
る。
【０２９５】 実施例７．３つのパブロ欠失構築物の活性の比較 Δ１４２およびΔ７０構築物に加えて、カルボキシ末端の１４２個のアミノ酸
(パブロのほぼアミノ酸４１８〜５５９)だけを含有する構築物、すわなちテイル
構築物を調製した。Δ１４２構築物およびΔ７０構築物は、ＷＨ-ＷＡＳＰ-相同
ドメインならびに酸性ドメインを欠いている(例えば、スエツユ，エス(Suetsuyu
, S.)ら,1999年,バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミ
ュニケーションズ(Biochem. Biophys. Res. Comm.),260:296-302に示されている
)。テイル構築物は、塩基性ドメイン、ポリプロリンドメインを欠いているが、
Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメインＷＡＳＰ相同ドメインおよび酸性ドメインを含有する
。これらの構築物の略図を図１４に示す。
【０２９６】 図１５は、パブロ全長およびΔ７０構築物がラット小脳顆粒ニューロン培養物
に対して毒性であるが、Δ１４２およびテイル構築物は毒性でないことを示して
いる。図１６は、ＰＣ１２細胞において行った同時トランスフェクションを要約
している。図１７に示す４つのトランスフェクションを行い、トランスフェクト
した細胞の生存を時間と共にモニターした。図１６は、全長パブロ過剰発現から
生じる期待された毒性を示している。Δ１４２構築物の同時トランスフェクショ
ンは、毒性を弱めることはできなかった。このトランスフェクションにおけるア
ポトーシスは発症速度が遅かったが、それにもかかかわらず、全長パブロ単独に
匹敵するレベルに到達した。対照的に、パブロとテイル構築物の同時トランスフ
ェクションは、パブロ媒介性アポトーシスの殆ど完全な弱化をもたらした。この
研究からの我々の結論は、テイル構築物はパブロの前アポトーシス活性を低下さ
せる優性阻害様式で作用することができるということである。
【０２９７】 実施例８．抗パブロ抗体の調製およびウェスタンブロット パブロポリペプチドの断片(ＧＩＲＰＳＳＰＶＴＶＬＡＬＡＨＰ)をペプチド抗
原として用いて、ウサギポリクローナル抗パブロ抗体を調製した。ポリクローナ
ル抗血清をアフィニティ精製し、ウェスタンブロットに用いた。抗体はラット脳
のいくつかの領域(線状体、皮質、小脳および海馬)からの溶解物に対して試験し
、ラットパブロタンパクを認識し、単一のバンドが適当な分子量で可視化された
。同じ分子量のバンドが試験した２つのニューロン細胞系(ＰＣ１２およびＳＹ
５Ｙ)で見られた。試験した３つの非ニューロン細胞系(ＨＥＫ２９３；ＣＨＯ；
およびＣＯＳ)では、有意なパブロタンパクは検出可能ではない。
【０２９８】 実施例９．ヒトパブロの遺伝子導入過剰発現 ニューロン特異的な様式で全長ヒトパブロタンパクを発現させるための形質転
換モデルは、パブロタンパクの前アポトーシス作用を確認するのに有用である。
かかるモデルは、さらに、アポトーシスを調節するリード化合物の効力を試験す
る手段を提供する。アポトーシス因子の過剰発現の可能な胚致死性を回避するた
めに、テトラサイクリン依存発現系(例えば、フルス(Furth)ら,(1994年),ピーナ
ス(PNAS),91:9302-9306；ゴッセン(Gossen)ら,(1995年),サイエンス(Science),2
68:1766-1769を参照)を利用する調節可能な発現系を用いた。ここで用いるよう
に、「調節可能な発現系」なる用語は、タンパクの発現を調節する系を包含する
。形質転換モデルを作成するために、系の成分は別個の形質転換マウス系におい
て確立し、次いで交配によって１つの系にまとめる。
【０２９９】 ｈパブロまたはｈパブロ-ＧＦＰのｃＤＮＡを有する形質転換構築物は、ＴＲ
Ｅプロモーター(テトラサイクリン応答要素)の管理下で作成した。ＴＲＥは、通
常、７個のタンデム配置したトランスアクチベーター認識部位(「ｔｅｔＯ」部
位)を含有する。第２の導入遺伝子構築物は、ＣＮＳ特異的マウスＴｈｙ１プロ
モーター(例えば、カロニ(Caroni),(1997年),ジャーナル・ニューロサイエンス
・メソッズ(J. Neurosci. Methods),71:3-9；ゴードン(Gordon)ら,(1987年),セ
ル(Cell),50:445-452；ヴィダル(Vidal)ら,(1990年),ジーンズ・アンド・デベロ
ップメント(Genes and Development),5:1136-1148を参照)の管理下でシステムト
ランスアクチベーター(ｔＴＡ)のｃＤＮＡを組み込んだ。Ｔｈｙ１遺伝子の５'
および３'非翻訳領域(ＵＴＲ)は、この構築物のｔＴＡ ｃＤＮＡに隣接しており
、かくして転写物に安定性を与える。あるいは、より制限的なニューロン特異的
なプロモーターを用いて、ｔＴＡの発現を導いてもよい。例えば、ニューロン特
異的なエノラーゼプロモーター(ＮＳＥ；例えば、フォルス-ペッター(Forss-Pet
ter)ら,(1990年),ニューロン(Neuron),5:187-197；チェン(Chen)ら,(1998年),モ
レキュラー・ファーマコロジー(Mol. Pharmacology),54:495-503を参照)である
。
【０３００】 次いで、ＴＲＥ-パブロ構築物およびニューロン特異的ｔＴＡ構築物を有する
形質転換動物を交配させて、両方の導入遺伝子座を１つのゲノムに移す。得られ
た動物は、調節可能な条件下(すなわち、パブロがテトラサイクリン欠乏条件下
で発現されるように)、ＣＮＳでパブロを過剰発現する。テトラサイクリンまた
はその類似物(例えば、アンヒドロテトラサイクリン、ドキシサイクリンまたは
シアノテトラサイクリン)は、腹腔内注射も選択肢であるが、通常、動物の餌お
よび水に投与される。
【０３０１】 実施例１０．ヒトパブロの優性阻害突然変異体の遺伝子導入過剰発現 パブロタンパクの優性阻害突然変異体を用いることにより、内生パブロ機能が
破壊されている形質転換モデルを作成した。破壊は、通常、優性阻害突然変異体
系で、パートナーおよび/または基質を結合するための突然変異体と内生タンパ
クとの間の競合により達成される。かかるモデルの作成は、細胞死をもたらす生
理学的な攻撃(例えば、虚血、薬理学的な薬剤、副腎摘出)の間のパブロ機能を評
価する際に役立つ。ｈパブロの１４２個のカルボキシ末端アミノ酸は、かかる優
性突然変異体(「パブロ-ｄｍ」)を表す。パブロ-ｄｍをコードするｃＤＮＡは、
ＣＮＳ特異的マウスＴｈｙ１.２プロモーターの管理下で導入遺伝子構築物に導
入された。Ｔｈｙ１.２遺伝子の５'および３'非翻訳領域(ＵＴＲ)は、この構築
物のパブロ-ｄｍ ｃＤＮＡに隣接している。この構築物を用いて作成された形質
転換動物系は、この構築物をＣＮＳ全体で構成的に発現する。
【０３０２】 この形質転換モデルの調節可能なバージョンも作成された。これは、前の実施
例に記載したテトラサイクリン依存発現系の変更バージョンを用いて達成した。
このバージョンでは、Ｔｈｙ２.１プロモーターは、ｔｅｔＯ認識部位の１つを
包含するように修飾された。これは、短いｔｅｔＯ配列をＴｈｙ１.２プロモー
ターにおける−２７０位のＳｍａ部位または−３６０位のＢｇｌII部位に挿入す
ることにより達成した。このＴｈｙ１.２/ｔｅｔＯプロモーターを用いて、形質
転換動物におけるパブロ-ｄｍの発現を導いた。第２の形質転換構築物は、非修
飾Ｔｈｙ１.２プロモーターの管理下で修飾されたｔＴＡトランスアクチベータ
ーをコードする。ｔＴＡトランスアクチベーターのｃＤＮＡは、Ｋｉｄ-１遺伝
子のＫＲＡＢリプレッサードメインを包含し、かくして、ｔＴＡ-ＫＲＡＢをコ
ードするように修飾された。ＫＲＡＢリプレッサードメインは、ｔｅｔＯ認識部
位に(ｔＴＡタンパクに対するその融合により)繋いだ場合に、隣接するＴｈｙ２
.１プロモーターの転写を抑制することができる。類似のｔＴＡ-ＫＲＡＢ系は、
例えば、ドイシュール(Deuschle)ら,(1995年),モレキュラー・アンド・セルラー
・バイオロジー(Mol. Cell. Biol.),15:1907-1914に記載されている。Ｋｉｄ-１
ＫＲＡＢドメインは、例えば、エルザー(Elser)ら,(1997年),JBC,272:27908-27
912に考察されている。
【０３０３】 これらの構築物の両方を用いて、２つの形質転換動物系を作成し、交配して、
両方の遺伝子座を１つの系にまとめた。得られた系は、テトラサイクリン依存様
式で(例えば、テトラサイクリンの存在下での発現)、ＣＮＳにおいてパブロ-ｄ
ｍ突然変異体を過剰発現する。
【０３０４】 実施例１１．パブロの形質転換ノックアウト 内生パブロ機能が除去されている動物系(「ノックアウト」モデル)の作成は、
パブロが発生において果たす役割を理解する手段を提供する。さらに、パブロ機
能を欠く生存可能な動物は、副作用を評価するのにパブロ機能に向けられたリー
ド化合物を試験するのに用いることができる。パブロノックアウトは、クローン
バンク(オムニバンク(OmniBank)；レキシコン・ジェネティックス(Lexicon Gene
tics)、テキサス州ザ・ウッドランズ；例えば、http://www.lexgen.comを参照)
中で適切な欠失を有する胚性幹細胞だけを同定することにより作成された。かか
る胚性幹細胞は、代理母の動物中に移した場合に、パブロの形質転換ノックアウ
トを提供する。
【０３０５】 等価物 当業者は、ここに記載した本発明の特定の具体例に対する多くの等価物を認識
し、ごく普通の実験だけを用いて確かめることができる。かかる等価物は、上記
特許請求の範囲に包含されることを意図する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、トランスフェクションの３０時間後に、パブロをトラン
スフェクトさせたラット海馬ニューロンの１００％が、空ベクター(ｅＧＦＰ)を
トランスフェクトさせた細胞と比べて、濃縮した核により証拠付けられる(＊＊
ｐ＜０.０１)異常な核形態を示したことを立証する。
【図２】 図２は、パブロを発現しないＰＣ１２細胞が生存可能であるのに
対し、パブロ発現が誘発されたＰＣ１２細胞(ＤＯＸなし)はより生存可能でない
ことを示す。
【図３】 図３は、トランスフェクション/誘発の４８時間後にグリーン蛍
光タンパク(ＧＦＰ＋)について陽性であったパブロを発現するＰＣ１２細胞の百
分率を示す。データはｅＧＦＰベクター単独をトランスフェクトさせたパブロ発
現細胞(ｅＧＦＰ)またはｅＧＦＰベクター＋Ｂｃｌ-ｘＬをトランスフェクトさ
せたパブロ発現細胞(Ｂｃｌ-ｘＬ)について示されている。
【図４】 図４は、Ｂｃｌ-ｘＬを含有するｅＧＦＰベクターをトランスフ
ェクトさせたパブロ発現ＰＣ１２細胞(Ｂｃｌ-ｘＬ)のわずか３.５％がトランス
フェクション/誘発の４８時間後にアポトーシス核を示したことを示す。
【図５】 図５は、ｅＧＦＰベクター単独を発現する細胞と比べて、パブロ
を発現する２９３個の細胞(パブロ単独)における濃縮した核の統計学的に有意な
増加がないことを示す。
【図６】 図６は、図５におけるベクター単独またはベクター＋パブロを受
容する２９３個の細胞がおおよそ同じ効率でトランスフェクトされたことを示す
。
【図７】 図７は、図５におけるベクター単独またはベクター＋パブロを受
容する２９３個の細胞のうち、ＧＦＰ＋細胞だけを測定した場合に、濃縮した核
を有する細胞の百分率はほぼ同じであることを示す。
【図８】 図８は、パブロのトランスフェクションがニューロン細胞のアポ
トーシスを引き起こすが、非ニューロン細胞ではアポトーシスを引き起こさない
ことを示す。
【図９】 図９は、ｅＧＦＰ空ベクター、ｅＧＦＰベクターのパブロΔ１４
２突然変異体または全長パブロ-ｅＧＦＰ構築物をトランスフェクトさせた生存
可能なＧＦＰ陽性ニューロンの百分率を示す。
【図１０】 図１０は、Ｂｃｌ-ｘＬ ΔＴＭ構築物のヌクレオチド配列を示
す。
【図１１】 図１１は、酵母２-ハイブリッドスクリーンにおいてベイトと
して用いたＢｃｌ-ｘＬのアミノ酸配列を示す。
【図１２】 図１２は、パブロΔ１４２突然変異体のヌクレオチド配列を示
す。
【図１３】 図１３は、パブロΔ１４２突然変異体のアミノ酸配列を示す。
【図１４】 図１４は、パブロΔ１４２、Δ７０およびテイル構築物を示す
図である。
【図１５】 図１５は、パブロ全長およびΔ７０構築物がラット小脳粒状ニ
ューロン培養物に対して毒性であるのに対し、Δ１４２およびテイル構築物は毒
性でないことを示す。
【図１６】 図１６は、全長パブロの発現および様々なパブロ欠失構築物の
同時トランスフェクションから生じる期待された毒性を示す。
【図１７】 図１７は、図１６に示すデータを得るために行った同時トラン
スフェクションの要約である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 21/02 Ａ６１Ｐ 25/16 ４Ｈ０４５ 25/00 25/28 25/16 Ｃ０７Ｋ 14/47 25/28 19/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｑ 1/02 19/00 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｎ 5/10 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｍ 33/50 33/566 33/53 Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 キャスリーン・エイチ・ヤング アメリカ合衆国18940ペンシルベニア州ニ ュータウン、ソサイエティ・プレイス1706 番 (72)発明者 アンドリュー・ウッド アメリカ合衆国18940ペンシルベニア州ニ ュータウン、リードーンズ・ドライブ2051 番 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA40 BA11 BB50 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 4B024 AA01 AA11 CA04 DA02 FA02 HA17 4B063 QA18 QR80 QS12 4B065 AA90 AB01 BA02 CA46 4C084 AA01 AA02 AA07 AA13 BA01 BA08 BA22 BA23 CA17 CA18 NA14 ZA012 ZA022 ZA162 ZA942 4H045 AA10 AA30 CA40 EA21 EA50

Claims (34)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ａ）単離された哺乳動物Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメインをコード
    するヌクレオチド配列；ここで、該単離された哺乳動物Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメイ
    ンはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインと７０％のアミノ酸
    配列同一性を有する； ｂ）単離された哺乳動物Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメインをコードするヌクレオチド
    配列；ここで、該ヌクレオチド配列は、６Ｘ ＳＳＣ中、４５℃で、その後、０.
    ２Ｘ ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃で、１回またはそれ以上の洗浄に
    より、Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメインをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すヌク
    レオチド配列の相補体にハイグリダイズする； ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す単離された哺乳動物Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメイ
    ンをコードするヌクレオチド配列； からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含有する単離された核酸分子。
  2. 【請求項２】 単離されたＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
    ２のほぼアミノ酸４１９〜５５９またはほぼアミノ酸４２９〜５５９に示すアミ
    ノ酸配列からなる請求項１の単離された核酸分子。
  3. 【請求項３】 単離されたＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
    ２のほぼアミノ酸４３６〜４８９に示すアミノ酸配列からなる請求項１の単離さ
    れた核酸分子。
  4. 【請求項４】 前記単離された哺乳動物Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメインが神経細
    胞のアポトーシスを調節する請求項１の単離された核酸分子。
  5. 【請求項５】 前記核酸分子が融合タンパクをコードする請求項１の単離さ
    れた核酸分子。
  6. 【請求項６】 ａ）単離された哺乳動物Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメインを含有す
    るポリペプチド；ここで、該単離されたＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインはＳＥＱ ＩＤ
    ＮＯ：２に示すパブロＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインと少なくとも７０％の同一性を
    有するアミノ酸配列からなる； ｂ）Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメインを含有するポリペプチド；ここで、該Ｂｃｌ-ｘ
    Ｌ結合ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すパブロＢｃｌ-ｘＬ結合ドメイ
    ンと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる；ただし、該ポリ
    ペプチドは全長パブロポリペプチドではない； ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインを含有するポリペ
    プチド； からなる群から選択される単離されたポリペプチド。
  7. 【請求項７】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す単離されたＢｃｌ-ｘＬ結合ド
    メインを含有するポリペプチド。
  8. 【請求項８】 保存的アミノ酸置換が行われている請求項７のポリペプチド
    。
  9. 【請求項９】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す単離されたＢｃｌ-ｘＬ結合ド
    メインからなるポリペプチド。
  10. 【請求項１０】 前記単離されたＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインがＳＥＱ ＩＤ
    ＮＯ：２のほぼアミノ酸４１９〜５５９またはほぼアミノ酸４２９-５５９から
    なる請求項６のポリペプチド。
  11. 【請求項１１】 単離されたＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
    ：２のほぼアミノ酸４３６〜４８９からなる請求項６の単離された核酸分子。
  12. 【請求項１２】 前記単離されたＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインが神経細胞のア
    ポトーシスを調節する請求項６のポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 単離されたＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインからなる第１のポリ
    ペプチドと第２の非パブロポリペプチドを含有する融合タンパク。
  14. 【請求項１４】 Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメインをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
    ：１の部分にアンチセンスである単離された核酸分子。
  15. 【請求項１５】 請求項１の核酸分子を含有するベクター。
  16. 【請求項１６】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す異種パブロポリペプチドまた
    は単離されたＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインを安定に発現する神経細胞系。
  17. 【請求項１７】 少なくとも１種の遺伝子組換えパブロタンパクをコードす
    る導入遺伝子と、該少なくとも１種の遺伝子組換えパブロタンパクの発現を導く
    少なくとも１個のプロモーター要素とを含有する非ヒト形質転換動物。
  18. 【請求項１８】 パブロタンパクがヒトパブロである請求項１７の形質転換
    動物。
  19. 【請求項１９】 非ヒト形質転換動物がマウスである請求項１７の形質転換
    動物。
  20. 【請求項２０】 少なくとも１個のプロモーター要素が組織特異的な発現を
    導く請求項１７の形質転換動物。
  21. 【請求項２１】 プロモーター要素が主として神経細胞における発現を導く
    請求項２０の形質転換動物。
  22. 【請求項２２】 少なくとも１個のプロモーターがＴｈｙ１.２プロモータ
    ーおよびニューロン特異的なエノラーゼプロモーターからなる群から選択される
    請求項２０の形質転換動物。
  23. 【請求項２３】 遺伝子組換えパブロタンパクが切形または変形パブロタン
    パクを含有する請求項１７の形質転換動物。
  24. 【請求項２４】 遺伝子組換えパブロタンパクがパブロの優性阻害突然変異
    体である請求項１８の形質転換動物。
  25. 【請求項２５】 調節可能な発現系を含有する請求項１７の形質転換動物。
  26. 【請求項２６】 調節可能な発現系が導入遺伝子のプロモーター要素にテト
    ラサイクリン感受性トランスアクチベータータンパクと該テトラサイクリン感受
    性トランスアクチベータータンパクの少なくとも１個の認識部位配列とを含有す
    るテトラサイクリン依存性発現系である請求項２５の形質転換動物。
  27. 【請求項２７】 テトラサイクリン感受性トランスアクチベータータンパク
    がさらに転写リプレッサードメインを含有する請求項２６の形質転換動物。
  28. 【請求項２８】 転写リプレッサードメインがＫＲＡＢドメインである請求
    項２７の形質転換動物。
  29. 【請求項２９】 パブロの機能発現が動物で起こらないように内生パブロタ
    ンパクが欠失または変更されているゲノムを含有する非ヒト形質転換動物。
  30. 【請求項３０】 パブロポリペプチドまたはそのＢｃｌ-ｘＬ結合ドメイン
    の活性を調節することからなる、細胞のアポトーシスを調節する方法。
  31. 【請求項３１】 パブロポリペプチドまたはそのＢｃｌ-ｘＬ結合ドメイン
    の発現を調節することからなる、細胞のアポトーシスを調節する方法。
  32. 【請求項３２】 患者の細胞におけるパブロの発現または活性を調節するこ
    とにより、患者の神経系障害を治療することからなる、患者の神経系障害を治療
    する方法。
  33. 【請求項３３】 Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメインを発現する細胞を試験化合物と
    接触させ、 Ｂｃｌ-ｘＬ結合ドメインの活性を調節する試験化合物の能力を測定すること
    により、アポトーシスを調節するＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインの能力を調節する化
    合物を同定することからなる、 アポトーシスを調節するＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインの能力を調節する化合物を
    同定する方法。
  34. 【請求項３４】 Ｂｃｌ-ｘｌ結合ドメインを含有する細胞非含有混合物を
    試験化合物と接触させ、 Ｂｃｌ-ｘＬと相互作用するＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインの能力を調節する試験化
    合物の能力を測定することにより、Ｂｃｌ-ｘＬと相互作用するＢｃｌ-ｘＬ結合
    ドメインの能力を調節する化合物を同定することからなる、 Ｂｃｌ-ｘＬと相互作用するＢｃｌ-ｘＬ結合ドメインの能力を調節する化合物
    を同定する方法。
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