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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue Nucleinsäuresequenzen, welche für Polypeptide
codieren, die zu einer Gruppe gehören, die Ameline genannt wird.
Diese Polypeptidsequenzen umfassen Tetrapeptiddomänen, die
mit Zelloberflächenerkennung
in Zusammenhang gebracht werden. Mögliche Anwendungen der Amelinsequenz
betreffen die Diagnose von Störungen
von Hartgewebebildung und die Herstellung des Amelinproteins oder
von Fragmenten davon, welche dann als Matrixbestandteile oder Zellerkennungsmarkierungen
bei der Bildung von Biomaterialien dienen können. Die Erfindung betrifft
außerdem
Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen
enthalten, zur Herstellung des Proteins, Organismen, die die Expressionsvektoren
enthalten, Verfahren zum Herstellen des Polypeptids, Zusammensetzungen,
die die Polypeptide umfassen, und Verfahren zum Behandeln verschiedener
Hartgewebekrankheiten oder -störungen.
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STAND DER
TECHNIK
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In
Knochen, Dentin und anderen Geweben assemblieren Typ I-Collagen
oder ähnliche
Proteine in eine fibrilläre
Matrix, welche in manchen Fällen
als Gerüst
für den
Einbau von Mineralkristallen dient. Die benachbarten Zellen etablieren
spezifische Kontakte zur Matrix, welche durch Wechselwirkungen zwischen
Domänen in
extrazellulären
Proteinen, wie beispielsweise Collagen, und Rezeptoren der Zelloberfläche, beispielsweise Integrinen,
vermittelt werden. Peptiddomänen,
welche bei diesen Kontakten beteiligt sind, sind in einigen extrazellulären Proteinen
identifiziert worden (Yamada & Kleinman,
1992). Im Schmelz ist kein strukturelles Netzwerk gefunden worden,
welches vergleichbar ist mit den Collagenfasern von Knochen, Knorpel
und Dentin. Außerdem
sind in den Schmelz-Matrix-Proteinen keine Sequenzsegmente identifiziert
worden, welche sein Verankern an Zelladhäsionsmoleküle vermitteln könnte. Die
Schmelzproteine Amelogenin und Enamelin enthalten keine solchen
Proteindomänen.
Der Mineralgehalt von neu abgelagertem Schmelz ist um die 15% der Gesamtmasse
und nimmt später,
unter Abbau der Proteine, auf 95% zu (Robinson et al., 1988).
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Zwei
vorherrschende Gruppen von Proteinen sind im Schmelz identifiziert
worden: Enameline und Amelogenine (Termine et al., 1980). Proteinfragmente
in reifem Schmelz sind einem der Enameline, Tuftelin, welches mittels
Antikörpern
zwischen den Schmelzprismen lokalisiert worden ist, ähnlich.
Die cDNA-Sequenz, die Tuftelin entspricht, ist bestimmt worden,
und es wurde spekuliert, dass dieses Protein eine Funktion bei der Mineralisierung
von Schmelz haben könnte
(Deutsch et al., 1991). Die Bedeutung der restlichen, bisher beschriebenen
Enameline für
die Schmelzbildung ist strittig, weil die Hauptproteinspezies identisch
mit Proteinen aus dem Blutstrom ist (Strawich & Glimcher, 1990). Es wird immer noch
diskutiert, ob Amelogenin, das häufigste
Schmelzprotein, ein Gerüst
für die
Schmelz-Matrix bereitstellt (Simmer et al., 1994).
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Teilsequenzen
von zufällig
ausgewählten
cDNA-Klonen aus einer Ratten-in-situ-Bibliothek sind früher zusammengetragen
worden (Matsuki et al., 1995), von welchen manche Homologie zu Sequenzen
der Erfindung zeigen. Aus den Teilsequenzen wurde kein Leserahmen
vorgeschlagen. Es wurde nicht angegeben, ob Polypeptide von diesen
Sequenzen codiert sind, und es wurde kein Vorschlag bezüglich einer
möglichen
Funktion solcher Polypeptide angegeben.
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Nicht-Amelogenin-Proteine
sind in unreifem Schweine-Schmelz identifiziert worden (Uchida et
al., 1995). Ein 15 kDa-Protein hatte eine N-terminale Aminosäuresequenz
(VPAFPRQPGTHGVASL-) mit keiner Homologie zu zuvor bekannten Schmelzproteinen.
Es wurde vorgeschlagen, dass die Nicht-Amelogenine eine neue Familie
von Schmelzproteinen umfassen, jedoch wurde ihre Funktion nicht
vorgeschlagen. Die Proteine sind nicht vollständig sequenziert worden und
ihre Gene sind nicht bekannt.
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WO
89/08441 betrifft eine Zusammensetzung zur Verwendung beim Induzieren
von Binden zwischen Teilen von lebendem mineralisiertem Gewebe,
bei welcher der aktive Bestandteil aus einem Vorläufer von Zahnschmelz,
der sogenannten Schmelz-Matrix, stammt. Die Zusammensetzung induziert
Binden durch Ermöglichen
der Regeneration von mineralisiertem Gewebe. Der aktive Bestandteil
einer Proteinfraktion ist dadurch charakterisiert, dass er ein Molekulargewicht
von bis zu etwa 40.000 kDa aufweist, jedoch wird kein einziges Protein
identifiziert.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Obwohl
Proteine von mineralisierten Matrizen oft in hohen Mengen hergestellt
werden, verhindert ihre schlechte Löslichkeit eine direkte Analyse.
Im Zahnschmelz tritt ein physiologischer Abbau von Matrixproteinen im
Verlauf des Mineralerwerbs während
der Reifungsphase auf und stellt eine zusätzliche Schwierigkeit für die Analyse
der Matrixproteine dar. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Überlegung,
dass, weil die Matrix-bildenden Zellen die entsprechenden Proteine
in hohen Mengen synthetisieren, sie eine hohe Kopienzahl der mRNAs
enthalten sollten. Dementsprechend kann Sequenzanalyse der vorherrschenden
mRNA-Arten der Matrixbildenden Zellen einen Teil des Problems umgehen
und dabei helfen, gewisse Proteinbestandteile der Matrix zu untersuchen.
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Diese Überlegungen
initiierten die Vorgehensweise, die genommen wurde, welche zur Entdeckung der
neuen Amelin-mRNA-Sequenzen, der Basis für die vorliegende Erfindung,
führten.
Kurz beschrieben wurde eine genetische Bibliothek konstruiert, die
Sequenzen der mRNA-Arten
sich entwickelnder Zähne
enthielt. Individuelle Sequenzen wurden aus einzelnen bakteriellen
Klonen erhalten und für
in situ-Hybridisierungsexperimente histologischer Schnitte durch
sich entwickelnde Zähne
verwendet. Sequenzen, die in Zellen, die Hartgewebematrix bilden,
z.B. Ameloblasten, detektiert wurden, wurden bestimmt und verwendet,
um Sequenz-Datenbanken zu befragen. Die meisten der so ausgewählten Sequenzen
waren in den Datenbanken repräsentiert,
aber zwei Sequenzen, die nun die Amelinsequenzen genannt werden,
waren es nicht. Diese zwei Varianten einer neuen mRNA-Sequenz werden
zu hohen Leveln in Ratten-Ameloblasten während der Bildung der Schmelz-Matrix
exprimiert. Die Sequenzen enthalten offene Leserahmen für 407 bzw.
327 Aminosäurereste.
Die codierten Proteine, welche Ameline genannt wurden, sind reich
an Prolin-, Leucin- und Glycin-Resten und enthalten die Peptiddomäne Asp-Gly-Glu-Ala, eine Integrin-Erkennungssequenz,
in Kombination mit anderen Domänen,
die mit Zelloberflächen
wechselwirken. Die Sequenzen, die für die C-terminalen 305 Aminosäurereste,
d.h. Aminosäuren
102–407
in SEQ ID NO: 2 mit Aminosäuren
19–324
in SEQ ID NO: 4 codieren, der 3'-nicht-translatierte
Teil und eine Mikrosatelliten-Wiederholung bei der nicht-translatierten
5'-Region sind in beiden
mRNA-Varianten identisch. Die verbleibenden 5'-Regionen enthalten 338 Nucleotide,
die auf die lange Variante beschränkt sind (Nucleotide 12-349
in SEQ ID NO: 1), 54 gemeinsame Nucleotide und 46 Nucleotide, die
nur in der kurzen Variante vorhanden sind (Nucleotid 66-111 in SEQ
ID NO: 3). Vierzehn Nucleotide haben das Potential, für 5 Aminosäuren beider
Proteine in unterschiedlichen Leserahmen zu codieren (Nucleotide
390–403
in SEQ ID NO: 1 und 52–65
in SEQ ID NO: 3). Der Leserahmen der längeren Variante beinhaltet
Codonen für
ein typisches N-terminales Signalpeptid. Die Eigenschaften der Amelin-mRNA-Sequenzen
zeigen an, dass Amelin ein Bestandteil der Schmelz-Matrix ist, und
die einzigen Proteine, welche bisher in Zusammenhang mit Bindungswechselwirkungen
zwischen der Ameloblasten-Oberfläche und
ihrer extrazellulären
Matrix gebracht worden sind.
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Es
wird erwogen, dass die Amelinpeptide oder Teile davon unter Verwendung
der hierin beschriebenen Sequenzinformation, entweder chemisch oder
durch Translation mit der Hilfe von Expressionsvektoren synthetisiert
werden können.
Es wird ferner erwogen, dass diese Peptide zu dem Design von medizinischen Geräten zur
Reparatur von Zähnen
oder Knochen beitragen können.
Die Peptide können
außerdem
mit künstlichem
Implantatmaterial zu dem Zweck kombiniert werden, die Biokompatibilität des Materials
zu verbessern. Menschliche Amelin-mRNA- oder -Gensequenzen können bei
der Diagnose von genetisch vererbten Störungen bei der Hartgewebebildung
helfen.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG
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Um
Sequenzinformationen über
extrazelluläre
Matrixproteine zu erhalten, welche auf eine direkte Weise schwierig
zu analysieren sein können,
wurde eine cDNA-Bibliothek in dem Bakteriophagen λ konstruiert, der
das mRNA-Repertoire Matrix-bildender Zellen enthielt. Die Amelin-RNA-Sequenzen
wurden auf die folgende Weise selektiert:
Replika-Plaque-Lifts
wurden durchgeführt
und an Amelogenin- bzw. Collagen-Oligos, wie in Beispiel 4 beschrieben,
hybridisiert. Plaques, die ein relativ starkes Hybridisierungssignal
mit cDNA, aber kein Signal mit den Oligos aufwiesen, wurden weiter
analysiert, wobei angenommen wurde, dass sie Sequenzen enthielten, welche
häufig
in cDNA repräsentiert
waren, aber unterschiedlich zu Amelogenin und Collagen waren. Fünfundzwanzig
dieser positiven Phagenklone wurden zu Bluescript-Plasmiden umgeformt.
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Ribosonden
(„riboprobes") wurden für in situ-Hybridisierungen
synthetisiert, um die Sequenzen zu identifizieren, welche in Matrix-bildenden
Zellen exprimiert wurden, d.h. welche bei Matrixproduktion und Mineralisierung
von wachsenden Mahlzähnen
beteiligt sein können.
Rat ten im Alter von 4 Tagen wurden ausgewählt, weil die Konzentration
von Amelogenin-RNA, einbezogen in die Herstellung von Schmelz-Matrix,
um diese Zeit herum am höchsten
ist. 1 zeigt die Ergebnisse, die mit
einer Amelinsonde erhalten wurden (siehe Beispiel 4 und 1a),
im Vergleich zu der Reaktion von Amelogenin-RNA (1b)
und Collagen-RNA (1c). Amelin- und Amelogenin-RNA
wurden im inneren Schmelz-Epithel detektiert, welches Ameloblasten in
der sekretorischen Phase enthält.
Die Collagensonde markierte hauptsächlich die Odontoblasten, die
peripher in der Mesenchym-Pulpa lokalisiert sind, sowie Osteoblasten
im Alveolarknochen. Es wurde deshalb geschlussfolgert, dass Amelin
zur Bildung der Schmelz-Matrix
beitragen kann. Vierzehn cDNA-Inserts, welche zu Sonden führten, die
ein positives in situ-Hybridisierungssignal in den Zahnstrukturen
aufwiesen, wurden partiell sequenziert. Die Sequenzfragmente wurden
verwendet, um für
ihre Identifizierung die Genbank- und EMBL-Datenbank abzufragen bzw. zu durchsuchen.
Zwei bisher neue Sequenzen waren nicht vertreten.
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Um
die Sequenz der gesamten Amelin-mRNA zu bestimmen, wurde die Zahn-cDNA-Bibliothek mit einem
Oligonucleotid, abgeleitet von den anfänglichen Amelinsequenzen, die
oben beschrieben sind, durchmustert, und es wurden sechs zusätzliche
Inserts, die sich im Bereich zwischen 0,5 und 2 kb Länge bewegen,
isoliert. Sequenzanalyse zeigte, dass alle 7 Klone Sequenzen darstellten,
die dem 3'-mRNA-Anteil
entsprachen. Jedoch wurden zwei verschiedene 5'-Regionen in den zwei längsten Inserts
gefunden, die Amelin 1 und Amelin 2 spezifizierten (2).
Um eine Volllängensequenzrepräsentation
zu erhalten, wurde aus Rattenmahlzähnen eine „random-primed"-Bibliothek konstruiert
und mit zwei verschiedenen Oligonucleotiden, abgeleitet von individuellen
5'-Enden der zwei
Varianten (unterstrichen in 2) durchmustert.
5 Klone wurden isoliert, die mit dem 5'-Teil von Amelin 2 hybridisieren, und
13 Klone, die vom 5'-Teil
von Amelin 1 abgeleitet sind. Die Sequenzanalyse bestätigte die
vorherigen Ergebnisse und erweiterte die Sequenzen beider Varianten,
nun die Amelin 1- und Amelin 2-Sequenzen genannt und im Sequenzprotokoll
als SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 3 gezeigt. Beide 5'-mRNA-Sequenzen endeten
in einer Polypurin-Wiederholung von maximal 100 × (AG) (Daten nicht gezeigt).
Wenn man die AG-Wiederholung am 5'-Ende und den Poly-A-Schwanz am 3'-Ende berücksichtigt,
waren die kombinierten Sequenzen (2) nicht
kürzer
als die mRNAs, bestimmt durch Northern Blotting (siehe unten). Die
Sequenzanalyse der Klone, erhalten von der „polyT-primed"-cDNA-Bibliothek deckte eine unerwartete
3'-Variantion stromabwärts des
Poly-A-Additionssignals
AATAAA (Doppelunterstreichung) auf. In manchen Klonen wurde der
Poly A-Schwanz 15
Nucleotide stromabwärts,
wie erwartet, beobachtet, aber in anderen in einem größeren Abstand
von bis zu 79 Nucleotiden. Die Sequenz in 2 zeigt
die Variante mit der am weitesten entfernten Polyadenylierungsstelle.
Alle Variationen wurden stromabwärts
des Stoppcodons lokalisiert.
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Beide
cDNA-Sequenzvarianten zeigten einen einzelnen langen offenen Leserahmen
(2). Stoppcodonen im Leserahmen („in-frame") sind zwischen dem
Poly(AG) und dem offenen Leserahmen vorhanden, und folglich erscheint
es nicht wahrscheinlich, dass das Poly(AG) oder proximale Sequenzen
für Protein
codieren. Der Leserahmen von Amelin 1 beginnt 84 Nucleotide stromabwärts von
der Poly(AG)-Wiederholung. Die ersten 86 Aminosäuren werden von einer Sequenz
codiert, welche in Amelin 2 nicht vorhanden ist. Die Aminosäuren 87
bis 99 von Amelin 1 werden von einer Sequenz codiert, welche Amelin
1 und Amelin 2 gemeinsam ist. Jedoch kann diese Sequenz nicht für das Amelin
2-Protein codieren. Obwohl sie ein ATG-Codon beinhaltet, würde ein
Stoppcodon im Leserahmen lediglich ein Heptapeptid ermöglichen.
Das nächste
ATG, welches mit dem Stoppcodon des Heptapeptids überlappt,
beginnt den längsten
Sequenzabschnitt, der für Amelin
2 codiert. Faszinierenderweise codieren seine ersten 14 Nucleotide
für sowohl
Amelin 1 als auch Amelin 2 in unterschiedlichen Leserahmen (schattiert
in 2). Die folgenden 46 Nucleotide, welche für 15 Aminosäuren von
Amelin 2 codieren, sind in der Amelin 1-RNA nicht vorhanden. Dieses „Insert" in Amelin 2-RNA resultiert
in der Synchronisierung beider Leserahmen, so dass die letzten 305
Aminosäurereste
beiden Proteinen gemeinsam sind. Im Insert von Amelin 2 gibt es
ein ATG-Codon im Leserahmen, welches als ein alternativer Translationsstart
dienen könnte.
In diesem Fall wäre
Amelin 2 5 Aminosäuren
kürzer
und es gäbe
keinen Sequenzabschnitt, der zwei Leserahmen codiert. Der längste mögliche offene
Leserahmen enthält
Codonen für
407 Aminosäurereste
für Amelin
1 und 324 Reste für
Amelin 2.
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Seit
dem Einreichen der ersten Anmeldung sind die Ergebnisse der Sequenzierung überprüft worden und
einige Änderungen
durchgeführt
worden. Die Sequenz für
Amelin 1 ist wie folgt geändert
worden: Nucleotid Nr. 132 ist von einem G in ein C umgeändert worden,
was in keinem Aminosäureaustausch
resultierte. Nucleotid 191 ist von einem G in ein A umgeändert worden,
was in einem Austausch von Arg33 zu Gln33 resultierte. Nucleotid
200 ist von einem G in ein C umgeändert worden, was in einem
Austausch von Gly36 zu Ala36 resultierte. Nucleotid Nr. 617 ist
von einem G in ein C umgeändert
worden, was in einem Austausch von Gly105 zu Ala175 resultierte.
Nucleotid Nr. 809 ist von einem G in ein C umgeändert worden, was in einem Austausch
von Gly239 zu Ala239 resultierte. Nucleotid 976 ist von einem C
in ein G umgeändert
worden, was in einem Austausch von Pro295 zu Ala295 resultierte.
Nucleotid Nr. 1649 ist von einem C in ein A umgeändert worden, was in keinem
Aminosäureaustausch
resultierte. Die Sequenz für
Amelin 2 ist wie folgt korrigiert worden: Nucleotid Nr. 326 ist
von einem G in ein C umgeändert
worden, was in einem Austausch von Gly92 zu Ala92 resultierte. Nucleotid
Nr. 518 ist von einem G in ein C umgeändert worden, was in einem
Austausch von Gly156 zu Ala156 resultierte. Nucleotid Nr. 685 ist
von einem C in ein G umgeändert
worden, was in einem Austausch von Pro212 zu Ala212 resultierte.
Nucleotid Nr. 1358 ist von einem C in ein A umgeändert worden, was in keinem
Aminosäureaustausch
resultierte.
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Um
die Größe der Amelintranskripte
abzuschätzen,
wurde Northern Blot-Analyse an Gesamt-RNA, präpariert aus Mahlzähnen 4 Tage
alter Ratten, durchgeführt
(3, Spur a). Die DIG-markierte Amelin-cRNA-Sonde
hybridisierte an eine 2,2 kb- sowie an eine 1,9 kb-RNA-Bande. Die Amelin-1-
und Amelin-2-mRNAs sind, wie durch cDNA-Sequenzanalyse bestimmt,
2,3 und 2,0 kb lang, wenn eine Poly(AG)-Wiederholung von 0,2 kb
und ein Poly-A-Schwanz von 0,2 kb an die dargestellten Sequenzen
addiert werden. Die zwei Bestimmungen entsprechen einander gut,
was vorschlägt,
dass die Sequenzen die gesamte oder nahezu die gesamte mRNA für Ameline
umfassen. Zum Vergleich sind die zwei vorherrschenden mRNAs für Amelogenin,
von 1,1 kb und 0,8 kb Länge,
gezeigt (3, Spur b). Das Massenverhältnis von
Amelin-RNA relativ zu Amelogenin-RNA in Gesamt-RNA von Mahlzähnen wurde
durch einen Lösungs-Hybridisierungs-Assay
(Mathews et al., 1989) bestimmt. Die Menge von Amelin-RNA war etwa
5% im Vergleich zu Amelogenin-RNA. Der Sequenzvergleich von Amelin
1 und 2 legt nahe, dass die zwei RNAs Spleißvarianten desselben Primärtranskripts
sind, weil kein Austausch in den vergleichend angeordneten („aligning") Sequenzteilen gefunden
wird.
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Die
häufigsten
Aminosäuren
in sowohl Amelin 1 als auch 2 sind Prolin, Glycin und Leucin; in
keiner der Sequenzen gibt es Cystein (siehe Tabelle 1 unten). Der
Aminoterminus des abgeleiteten Amelin 1-Proteins weist die charakteristische
Eigenschaft eines Signalpeptids auf: Reste 14 bis 21 sind hydrophob
mit einem Abschnitt von Leucinen (2; Leader,
1979). In der Amelin-2-Sequenz wird kein vergleichbares Motiv beobachtet.
Beide Ameline enthalten die Proteindomäne DGEA (Asp-Gly-Glu-Ala) (Aminosäuren 370–373 in
Amelin 1 und 287–290
in Amelin 2) (in 2 in einem Kasten angegeben),
von welcher zuvor identifiziert worden ist, dass sie eine Erkennungsstelle
von Typ I-Collagen für
das Zelloberflächen
alb2-Integrin ist (Staatz et al., 1991). Zusätzlich ist eine Thrombospondin-ähnliche
Zelladhäsionsdomäne mit der
Sequenz VTKG (Val-Thr-Lys-Gly) (Aminosäuren 277–280 in Amelin 1 und 194–197 in
Amelin 2) (Yamada & Kleinman,
1992) enthalten. Die Gegenwart dieser zwei Domänen zeigt an, dass Ameline
Bestandteile der extrazellulären
Matrix sind. Die vorhergesagte geringe Löslichkeit der Ameline in Wasserlösungen ist
mit diesem Modell konsistent. Die Gegenwart einer Signalsequenz
in Amelin 1 festigt die Interpretation als ein sekretorisches Protein.
Der Mangel einer Signalsequenz in Amelin 2 bedeutet nicht, dass
dieses Protein nicht sezerniert wird. Ein Präzedenz für ein sezerniertes Protein
ohne Signalsequenz ist das Hühnerovalbumin,
wo interne, nicht-abgespaltene Sequenzen, die gleiche Funktion bereitstellen
(diskutiert in Leader, 1979). Zwei weitere Domänen mit vorhergesagter Signifikanz
bei der Wechselwirkung mit Zelloberflächen, EKGE (Glu-Lys-Gly-Glu) (Aminosäuren 282–285 in
Amelin 1 und 199–202
in Amelin 2) und DKGE (Asp-Lys-Gly-Glu)
(Aminosäuren
298–301
in Amelin 1 und 215–218 in
Amelin 2) sind in der gleichen Region geclustert. Die Kombination
der vier Peptiddomänen,
wie in diesem Absatz beschrieben, ist eine Eigenschaft, welche bisher
für kein
Schmelz-Matrix-betreffendes Protein beschrieben wurde.
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Wegen
der vorhergesagten geringen Löslichkeit
wurde Amelin in E. coli-Zellen als ein Fusionsprotein mit Thioredoxin
am aminoterminalen Ende exprimiert. Der 6His-Anhang wurde an das
carboxyterminale Ende angefügt
und das Protein wurde auf einer in Ni-Säule gereinigt. Das Eluat enthielt
ein Hauptfusionsprotein und außerdem
einige Peptidfragmente, welche mit Anti-Amelin-Kaninchenserum in
Western Blot-Analyse aktiv waren. Das Protein konnte durch Antithioredoxin-Affinitätschromatographie
weiter gereinigt werden.
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Antikörper gegen
das Amelinprotein sind erzeugt („raised") worden. Kaninchen wurden mit Amelin-Thioredoxin-Fusionsprotein
immunisiert und Immunserum durch Affinitätschromatographie an Amelin-Fusionsprotein,
gekoppelt an CNBr-aktivierte Sepharose, gereinigt. Eine weitere
Reinigung könnte über Thioredoxin-gekoppelte
Sepharose erreicht werden. Diese Antikörper sind beispielsweise für die immunohistochemische
Lokalisierung von Amelin in Rattenzähnen verwendet worden.
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Außerdem wurde
die Gegenwart von Amelin in Zahnextrakt ermittelt. Ratten-Mahlzähne wurden
in Na-Carbonatpuffer, pH 10,8, 1 mM EDTA + Proteaseinhibitoren homogenisiert.
Der Überstand
von Rohextrakt wurde durch Western-Blotting mit Anti-Amelin-Thioredoxin-Immunserum analysiert.
Zwei Banden, die zu zwei Amelinvarianten korrespondierten, wurden
detektiert. Rohextrakt wurde ferner auf einer Sephadex G-100-Säule chromatographiert.
Fraktionen, die zu Molekulargewichten von Amelinen korrespondierten,
wurden konzentriert und präparativer
Elektrophorese unterzogen. Nach Elektroelution werden die Banden
nun durch N-terminale
Sequenzanalyse identifiziert. Im Falle, dass eine der Banden Amelin
ist, wird der in vivo-Transformationsstart bestimmt.
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Die
Expression der Amelinsequenz während
verschiedener Entwicklungsstufen des Zahns wurde durch Untersuchen
der Oberkiefer von 2, 5, 10, 15, 20 und 25 Tage alten Sprague-Dawley-Ratten untersucht. Es
wurde gefunden, dass in in situ-Hybridisierungsexperimenten Amelin-mRNA
konkomittierend mit mRNA auftritt, d.h. während der Elongation der Ameloblasten
zu Beginn des sekretorischen Stadiums. In späteren Stadien weisen Amelogenin-
und Amelin-mRNA stark unterschiedliche Hybridisierungsmuster auf.
Amelogenin-mRNA verschwindet in einem großen Ausmaß in dem Reifungsstadium, wobei
nur geringe Mengen in einem späteren
Stadium gereifter Ameloblasten verbleiben, wobei diese Beobachtung
in Einklang mit den Funden von Wurtz et al. (1995) ist. Das mit
der Amelin-Sonde erhaltene Signal war jedoch während des Reifungsstadiums
der Ameloblasten nicht oder nur in kleinem Ausmaß reduziert.
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Funktional
unterscheiden sich die zwei Stadien darin, dass während der
Reifungsphase keine Schmelz-Matrix abgelagert wird. Jedoch scheinen
Mineralien („mineral") in beiden Phasen
abgelagert zu werden, weil der neu abgelagerte Schmelz schon Mineralien
enthält.
Wenn man diese Ereignisse mit dem Auftreten der jeweiligen mRNAs
korreliert, ist es möglich,
dass Amelin beim Mineralisierungsprozess beteiligt ist. Die Amelin-mRNA-Sequenz
codiert, wie oben beschrieben, für
ein Protein, welches Zellbindungsdomänen enthält, was darauf hindeutet, dass
es außerdem
oder alternativ an der Bindung der Ameloblasten an die Schmelzoberfläche beteiligt
ist.
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Amelinprotein
kann als eine Proteinase wirken. Dies wurde getestet, indem die
Hauptfusionsproteinbande aus dem Acrylamidgel ausgeschnitten und
elektroeluiert wurde. Nach Übernachtinkubation
bei Raumtemperatur erschien das Fusionsprotein als 3 Banden. Die
Kontrollinkubation bei 4°C
ergab nur eine Bande. Dies deutete darauf hin, dass bei der höheren Temperatur Abbau
stattfindet. Weitere Experimente sind erforderlich, um zu bestimmen,
ob Amelin tatsächlich
als eine Proteinase wirkt.
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Die
vorliegende Erfindung stellt Nucleinsäuresequenzen bereit, welche
für Proteine
mit einer spezifischen Kombination von Zellbindungsdomänen codieren.
Die Proteine sind Bestandteile von Hartgewebe-Matrizen und vermitteln
den Kontakt zur Zelloberfläche.
Die Proteincodierende Sequenz ist in 2 dargestellt. Sie
erstreckt sich von Nucleotidpositionen 95 bis 1361. Die neue Kombination
von Zellbindungsdomänen
belegt die Nucleotidpositionen 969 bis 1259. Die einzelnen Bindungsdomänen können in
der vorliegenden Form kombiniert werden oder im Zusammenhang unterschiedlicher
Aminosäureumgebungen
gezeigt werden oder in Polymere von Nicht-Protein-Art inkorporiert
werden. Sowohl die Nucleinsäuresequenzen
als auch die abgeleiteten Peptidsequenzen können verwendet werden als,
erstens, Werkzeuge für
die künstliche
Expression von Amelinprotein gemäß Standardverfahren
(Ausubel et al., 1994) und, zweitens, als Information für die chemische
Synthese von Peptiden. Die Sequenzen können verwendet werden, um diagnostische
Kriterien für
die Identifikation von Störungen
bei der Hartgewebebildung zu etablieren, und können als Mittel für die Produktion von
Biomaterialien bei der Gewebetechnik („tissue engineering") verwendet werden.
Zusätzlich
dazu liefert die Erfindung Expressionsvektoren, welche die beanspruchten
Sequenzen stromabwärts
von einem Transkriptionspromotor positioniert enthalten, sowie Verfahren
zur Produktion und Isolierung von Amelin, welche auf der Verwendung
der Expressionsvektoren basieren.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft alle Schmelz-Matrix-betreffenden
Polypeptide, welche wenigstens ein Sequenzelement enthalten, welches
das Verankern des Polypeptids an Zelladhäsionsmoleküle vermitteln kann.
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Mit
dem Ausdruck „Schmelz-Matrix-betreffendes
Polypeptid" ist,
in seinem breitesten Aspekt, ein Polypeptid gemeint, welches ein
Schmelz-Matrix-Protein ist und ein synthetisch hergestelltes Protein
mit ähnlichen
Eigenschaften, d.h., welches fähig
ist, Kontakt zwischen Schmelz und einer Zelloberfläche zu vermitteln, wie
im Folgenden in weiterem Detail beschrieben.
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In
der vorliegenden Beschreibung und den vorliegenden Ansprüchen umfasst
der Ausdruck „Polypeptid" sowohl kurze Peptide
mit eine Länge
von wenigstens zwei Aminosäureresten
und höchstens
zehn Aminosäureresten,
als auch Oligopeptide (11–100
Aminosäurereste)
sowie Proteine (die funktionale Einheit, umfassend wenigstens ein
Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid, welches chemisch dadurch modifiziert
werden kann, dass es glykosyliert wird, dass es mit Lipid versehen
(„lipidated") wird oder dass
es prostetische Gruppen umfasst). Die Definition von Polypeptiden
umfasst außerdem
native Formen von Peptiden/Proteinen in Tieren einschließlich Menschen
sowie rekombinante Proteine oder Peptide in irgendeiner Art von
Expressionsvektoren, welche beliebige Arten von Wirt transformieren,
und außerdem
chemisch synthetisierte Peptide.
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Die
erfindungsgemäßen Polypeptide,
welche Amelin-Proteine genannt worden sind, unterscheiden sich von
den bekannten Schmelz-Matrix-Proteinen Amelogenin und Enamelin darin,
dass sie wenigstens ein Sequenzelement enthalten, welches das Verankern
des Polypeptids an Zelladhäsionsmoleküle vermitteln kann.
Insbesondere enthalten sie ein Sequenzelement, ausgewählt aus
der Gruppe, bestehend aus den Tetrapeptiden DGEA (Asp-Gly-Glu-Ala),
VTKG (Val-Thr-Lys-Gly),
EKGE (Glu-Lys-Gly-Glu) und DKGE (Asp-Lys-Gly-Glu).
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Bevorzugte
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung sind Polypeptide, die die Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 2 aufweisen.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Nucleinsäurefragmente,
die Polypeptide codieren, welche fähig sind, Kontakt zwischen
Schmelz und Zelloberfläche
zu vermitteln. Mit dem Ausdruck „Nucleinsäure" ist ein Polynucleotid hohen Molekulargewichts
gemeint, welches entweder als DNA oder RNA vorkommen kann und entweder
einzelsträngig
oder doppelsträngig
sein kann.
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Obwohl
Nucleinsäurefragmente,
welche ein Polypeptid codieren, das Aminosäurereste 1 bis 407 von SEQ
ID NO: 2 umfasst, bevorzugte Ausführungsformen sind, betrifft
die Erfindung außerdem
ein Nucleinsäurefragment,
das ein Polypeptid codiert, das eine Nucleotidsequenz wie in SEQ
ID NO: 1 gezeigt, oder ein Analogon oder eine Variante davon, wobei
ein Nucleotid oder Codon substituiert, insertiert, addiert oder
umgeordnet worden ist, aufweist.
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Mit
dem Ausdruck „ein
Polypeptid, das die Aminosäuresequenz,
gezeigt in SEQ ID NO: 2, oder ein Analogon oder eine Variante davon
aufweist" ist/sind
ein Polypeptid gemeint, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 aufweist,
sowie Polypeptide gemeint, die Analoga oder Varianten der Sequenz
aufweisen, welche produziert werden, wenn ein Nucleinsäurefragment
der Erfindung in einem geeigneten Expressionssystem exprimiert wird,
und welche fähig
sind, Kontakt zwischen Schmelz und Zelloberfläche zu vermitteln, z.B. gezeigt
durch ein Testsystem, umfassend extrazelluläre Matrix und Matrix-bildende
Zellen in Gewebekultur. Eine konzentrationsabhängige biologische Aktivität der Polypeptide
wird durch die Zugabe von Polypeptidfragmenten getestet. Wenn die
Fragmente in der Lage sind, den Kontakt zwischen dem extrazellulären Matrix-Protein und
den Zellen auszukompetitieren („competing out"), dann werden die
Zellen, gezeigt durch mikroskopische Inspektion, von der Matrix
abgelöst
werden. Von kultivierten Zellen ist bekannt, dass sie an Fibronectin,
Osteopontin, Collagen, Laminin und Vironectin anhaften. Zellbindungsaktivität wird durch
die RGD-Zellanheftungsdomäne
des Proteins vermittelt. Amelin enthält alternative Zellbindungsdomänen DGEA
und VTKG. Zellanheftung kann z.B. durch Beschichten von Zellkulturschalen
mit Amelin, BSA oder Fibronectin gemessen werden. Gebundene LTMR-Ratten-Osteosarkomzellen
können
durch Messen endogener N-Acetyl-β-D-hexosaminidase
quantifiziert werden.
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Das
Analogon oder die Variante wird folglich ein Polypeptid sein, welches
nicht exakt die Aminosäuresequenz,
die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, aufweist, welches aber nach wie
vor fähig
ist, Kontakt zwischen Schmelz und Zelloberfläche, wie oben definiert, zu
vermitteln. Im Allgemeinen werden solche Polypeptide Polypeptide
sein, welche z.B. in einem gewissen Ausmaß in der Aminosäurezusammensetzung
oder den post-translationalen Modifikationen, z.B. Glykosylierung
oder Phosphorylierung, im Vergleich zu den in den Beispielen beschriebenen
Amelinproteinien variieren.
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Der
Ausdruck „Analogon" oder „Variante" wird folglich in
dem vorliegenden Zusammenhang verwendet, um ein Protein oder Polypeptid
einer ähnlichen
Aminosäurezusammensetzung
oder -sequenz wie die charakteristischen Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 2 anzuzeigen,
abgeleitet von den Amelinproteinen, wie in den Beispielen beschrieben,
die geringfügige
Variationen erlauben, die die Aminosäuresequenz verändern, z.B.
Deletionen, Austausch oder Insertionen von Aminosäuren oder
Kombinationen davon, um Amelinproteinanaloga zu erzeugen. Diese
Modifikationen können
interessante und verwendbare neue Eigenschaften des Analogons ergeben.
Das analoge Polypeptid oder Protein kann von einem Tier oder einem
Menschen stammen oder kann teilweise oder vollständig synthetischen Ursprungs
sein. Das Analogon kann außerdem
durch die Verwendung rekombinanter DNA-Techniken abgeleitet sein.
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Eine
wichtige Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft folglich ein Polypeptid, bei
welchem wenigstens ein Aminosäurerest
mit einem unterschiedlichen Aminosäurerest substituiert worden
ist und/oder bei welchem wenigstens ein Aminosäurerest deletiert worden ist
oder addiert worden ist, um in einem Polypeptid zu resultieren,
das eine Aminosäuresequenz
umfasst, die verschieden ist von der Aminosäuresequenz, gezeigt in SEQ
ID NO: 2, oder eine Teilsequenz der Aminosäuresequenz, wie im Folgenden
definiert, umfasst, aber im Wesentlichen Amelinaktivität wie oben
definiert aufweist.
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Besonders
wichtige Ausführungsformen
der Erfindung sind das Polypeptid, das die Aminosäurereste 1–407 in
SEQ ID NO: 2 (Amelin 1) enthält.
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Die
Aminosäuresequenzen
SEQ ID NO: 2 sind mit bekannten Aminosäuresequenzen verglichen worden.
Der Grad an Homologie (oder Identität) mit den extrazellulären Matrix-Proteinen, mit welchen
die Homologie am höchsten
ist, Amelogenin und Collagen IV, ist sehr niedrig, 23% bzw. 26%.
Die Identität
ist über
das gesamte Protein verbreitet und nicht auf spezielle Gebiete beschränkt. In
dieser Hinsicht soll angemerkt werden, dass Amelin im Gegensatz
zu Collagen, welches immer durch das wiederholte Dreifachmotiv,
Gly-X-Y, codiert wird, kein wiederholtes Dreifachmotiv enthält. Die
Homologie zu Collagen IV und Amelogenin kann durch den hohen Gehalt
an Prolin in beiden Proteinen bedingt sein. Es scheint folglich,
dass die Amelinproteine nur gemäßigte Ähnlichkeit
mit zuvor bekannten extrazellulären
Proteinen, insbesondere Schmelz-Matrix-Proteinen, aufweisen.
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Durch
Verwendung der in der vorliegenden Anmeldung offenbarten Sequenzen
wird der Fachmann in der Lage sein, die menschliche Version von
Amelin zu detektieren, klonieren, sequenzieren, produzieren und zu
studieren. Ein praktisches Problem ist eine Knappheit des Ausgangsmaterials,
weil das günstige
erhältliche Zahnmaterial
der gezogene oder resezierte Zahn ist, hauptsächlich die dritten Mahlzähne oder
die überflüssigen („super-numerary") Zähne. Die
Ent wicklungsstufe dieser Zähne
ist für
gewöhnlich
eine sehr späte
und deshalb sind die bei der Matrixbildung beteiligten Zellen weit
hinter der sekretorischen Phase oder sind nicht mehr vorhanden.
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Alternativ
kann das Ausgangsmaterial von erhältlichen Gewebekulturen stammen,
wo die extrahierte RNA auf die Gegenwart von Amelin-Boten getestet
wird. Ein positiver Northern Blot wurde im Fall von menschlichen
Osteosarkomzellen (Saos 2-Zellen) erhalten, obwohl die detektierte
Länge positiver
RNA im Vergleich zu Ratten-Amelin-mRNAs beträchtlich kleiner ist.
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Deshalb
wird eine menschliche Osteosarkomzellen(Saos 2-Zellen-)cDNA-Bibliothek
konstruiert, um eine oder mehrere spezifische cDNA(s) zu finden,
die menschliche Versionen von Amelin oder Amelin-ähnlichen
Strukturen repräsentieren
würde(n).
Auf eine ähnliche
Weise können
cDNA-Bibliotheken von den am wenigstens entwickelten Zähnen erzeugt
werden und mit Ratten-Amelin-Sonden oder mit Sonden, erhalten von der
Saos-2-Bibliothek, durchmustert werden.
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Mit
dem Ausdruck „Sequenzhomologie" ist die Sequenzidentität von Aminosäuren in
Segmenten von zwei oder mehreren Aminosäuren bei der Übereinstimmung
hinsichtlich Identität
und Position der Aminosäuren
des Polypeptids gemeint.
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Der
Ausdruck „homolog" ist hier verwendet,
um den Grad an Identität
zwischen der Aminosäuresequenz
eines gegebenen Polypeptids und der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO:
2 gezeigt ist, zu illustrieren. Die mit der Aminosäuresequenz,
die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, zu vergleichende Aminosäuresequenz kann
von einer Nucleotidsequenz, wie z.B. einer DNA- oder RNA-Sequenz, z.B. erhalten durch
Hybridisierung, wie im Folgenden definiert, abgeleitet werden oder
kann durch gewöhnliche
Aminosäure-Sequenzierverfahren erhalten
werden. Der Grad an Homologie wird vorzugsweise bei der Aminosäuresequenz
eines reifen Polypeptids bestimmt, d.h., ohne irgendeine Leader-Sequenz
in Erwägung
zu ziehen. Im Allgemeinen werden nur codierende Regionen verwendet,
wenn man Nucleotidsequenzen vergleicht, um ihre interne Homologie
zu bestimmen.
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In
einem ihrer Aspekte betrifft die Erfindung ein Nucleinsäurefragment,
das ein erfindungsgemäßes Polypeptid,
wie oben definiert, codiert. Insbesondere betrifft die Erfindung
ein Nucleinsäurefragment,
das im Wesentlichen die Sequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist,
umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung offenbart außerdem Nucleinsäurefragmente,
welche mit einem Nucleinsäurefragment
hybridisieren, das die Nucleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID NO: 1,
oder Teile der Sequenzen, welche unter stringenten Bedingungen,
z.B. 5 mM, einwertige Ionen (0,1 × SSC), neutraler pH und 65°C stabil sind,
aufweist.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Analoga der in SEQ
ID NO: 1 gezeigten Nucleotidsequenz, wobei ein Nucleotid oder Codon
substituiert, insertiert, addiert oder umgeordnet worden ist.
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Es
ist gut bekannt, dass kleine Fragmente in PCR-Techniken, wie hierin
beschrieben, verwendbar sind. Solche Fragmente und Teilsequenzen
können,
unter anderen Verwendungen, als Sonden bei der Identifizierung von
mRNA-Fragmenten der Nucleotidsequenz der Erfindung, wie in Beispiel
4 beschrieben, verwendet werden.
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Der
Ausdruck „Analogon" in Bezug auf die
erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragmente
soll ein Nucleinsäurefragment
anzeigen, welches ein Polypeptid codiert, welches dadurch funktionell ähnlich mit
dem von SEQ ID NO: 2 codierten Polypeptid ist, dass das Analogon
in der Lage ist, das Verankern des Polypeptids an Zelladhäsionsmoleküle, wie
durch den oben beschriebenen Test gezeigt, zu ermitteln.
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Es
ist gut bekannt, dass dieselbe Aminosäure von verschiedenen Codonen
codiert werden kann, wobei die Codon-Verwendung unter anderem mit
der Präferenz
des in Frage stehenden Organismus, der die Nucleotidsequenz exprimiert,
in Zusammenhang steht. Folglich können ein oder mehrere Nucleotide
oder Codonen des erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragments
durch andere ausgetauscht werden, welche, wenn exprimiert, in einem
Polypeptid resultieren, das mit dem von dem zur Frage stehenden
Nucleinsäurefragment
codierten Polypeptid identisch oder im Wesentlichen identisch ist.
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Außerdem wird
der Ausdruck „Analogon" im vorliegenden
Zusmmenhang verwendet, um ein Nucleinsäurefragment anzuzeigen, das
eine Aminosäuresequenz
codiert, die ein Amelinähnliches
Polypeptid darstellt, wobei geringfügige Variationen in den Nucleotidsequenzen
erlaubt sind, welche keinen signifikanten nachteiligen Effekt auf
die Fähigkeit
haben, Kontakt zwischen Schmelz und Zelloberfläche zu ermitteln, was durch
oben beschriebenen Test gezeigt wird.
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Mit
dem Ausdruck „signifikant
nachteiliger Effekt" ist
gemeint, dass die Aktivität
des Analogons wenigstens 10%, stärker
bevorzugt wenigstens 20%, noch stärker bevorzugt wenigstens 25%,
wie beispielsweise wenigstens 50% der Befestigungs- oder Ablösungsaktivität von nativem
Amelin, wenn wie oben beschrieben bestimmt, sein sollte. Das analoge
Nucleinsäurefragment
oder die analoge Nucleotidsequenz kann von einem Organismus, wie
beispielsweise einem Tier oder einem Menschen abgeleitet sein oder
kann teilweise oder vollständig
synthetischen Ursprungs sein. Das Analogon kann außerdem durch
die Verwendung rekombinanter DNA-Techniken erlangt werden.
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Ferner
sollen die Ausdrücke „Analogon" und „Teilsequenz" Variationen in der
Sequenz zulassen, wie beispielsweise Substitution, Insertion (einschließlich Introns),
Addition und Umordnung von einem oder mehreren Nucleotiden, wobei
die Variationen keinen wesentlichen nachteiligen Effekt auf das
Polypeptid haben, das von dem Nucleinsäurefragment oder einer Teilsequenz
davon codiert wird.
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Der
Ausdruck „Substitution" soll das Ersetzen
eines oder mehrerer Nucleotide in der vollständigen Nucleotidsequenz mit
einem oder mehreren unterschiedlichen Nucleotiden bedeuten, „Addition" soll die Addition von
einem oder mehreren Nucleotiden an ein beliebiges Ende der vollen
Nucleotidsequenz bedeuten, „Insertion" soll das Einführen eines
oder mehrerer Nuc leotide innerhalb der vollen Nucleotidsequenz bedeuten, „Deletion" soll anzeigen, dass
ein oder mehrere Nucleotide aus der vollen Nucleotidsequenz deletiert
worden sind, ob an einem beliebigen Ende der Sequenz oder bei einem
geeigneten Punkt innerhalb der Sequenz, und „Umordnung" soll bedeuten, dass zwei oder mehrere
Nucleotidreste innerhalb der Nucleinsäure- bzw. Polypeptid-Sequenz
ausgetauscht worden sind. Das Nucleinsäurefragment kann jedoch, bevor
oder nachdem es in den Organismus eingeführt wird, außerdem durch
Mutagenese modifiziert werden.
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Die
Ausdrücke „Fragment", „Sequenz", „Teilsequenz" und „Analogon", wie in der vorliegenden
Beschreibung und den vorliegenden Ansprüchen hinsichtlich erfindungsgemäßer Fragmente,
Sequenzen, Teilsequenzen und Analoga verwendet, sollte natürlich so
verstanden werden, dass es diese Phänomene in ihrer natürlichen
Umgebung nicht umfasst, sondern eher, z.B. in isolierter Form, gereinigter
Form, in vitro-Form oder rekombinanter Form.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung kann die Detektion genetischer Mutationen und/oder
Quantifizierung von Amelin-mRNA erreicht werden, indem RNA aus Zellen
oder Geweben isoliert wird und in cDNA für die nachfolgende Verwendung
in der Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) umgewandelt wird. Der/die PCR-Primer kann/können, basierend
auf einem erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragment,
wie beispielsweise dem in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nucleinsäurefragment,
synthetisiert werden. Dieses Verfahren zur Detektion und/oder Quantifizierung
kann als ein diagnostisches Verfahren zum Diagnostizieren eines
Krankheitszustands, bei welchem eine Amelin-mRNA in höheren oder
niedrigeren Mengen als normal exprimiert wird, verwendet werden.
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Außerdem innerhalb
des Umfangs der vorliegenden Erfindung ist ein Diagnosemittel, umfassend
eine Nucleotidsonde, welche in der Lage ist, ein erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragment
zu detektieren, sowie ein Verfahren zum Diagnostizieren von Krankheiten,
bei welchen die Expression von Amelin dereguliert ist, und/oder
Krankheiten, wo das Amelingen mutiert ist, umfassend das Durchführen einer
PCR-Analyse von einer Probe von einem Patienten, von dem vermutet
wird, dass er eine Krankheit hat, wo eine höhere Menge an Amelinprotein
als normalerweise vorliegt, oder eine mutierte Form von Amelin aufweist,
bei welcher die Probe mit einem Diagnosemittel wie oben beschrieben
in Kontakt gebracht wird, was einem beliebigen Nucleinsäurefragment
erlaubt, amplifiziert zu werden, und Bestimmen der Gegenwart irgendwelcher
identischer oder homologer Nucleinsäurefragmente in der Probe.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung außerdem ein Diagnosemittel,
welches ein erfindungsgemäßes Amelin-Polypeptid
umfasst.
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Die
erfindungsgemäßen Polypeptide
können
unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie hergestellt werden.
Eine wichtige Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft ein Expressionssystem, das ein
erfindungsgemäßes Nucleinsäurefragment
umfasst. Insbesondere betrifft die Erfindung einen replizierbaren
Expressionsvektor, welcher ein erfindungsgemäßes Nucleinsäurefragment
trägt und
fähig ist,
die Expression davon zu vermitteln.
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Innerhalb
des Umfangs der vorliegenden Erfindung ist ein Organismus, welcher
ein erfindungsgemäßes Expressionssystem
trägt.
Organismen, die bei diesem Aspekt der Erfindung verwendet werden
können, umfassen
einen Mikroorganismus, wie beispielsweise ein Bakterium der Gattung
Bacillus, Escherichia oder Salmonella, eine Hefe, wie beispielsweise
Saccharomyces oder Pichia, ein Protozoon oder eine Zelle, abgeleitet
von einem multizellulären
Organismus, wie beispielsweise ein Pilz, eine Insektenzelle, eine
Pflanzenzelle, eine Säugerzelle
oder eine Zelllinie. Wenn der Organismus ein Bakterium ist, ist
es bevorzugt, dass das Bakterium von der Gattung Escherichia ist,
z.B. E. coli. Unbeachtet des Typs des verwendeten Organismus wird
das erfindungsgemäße Nucleinsäurefragment
in den Organismus entweder direkt oder mittels eines geeigneten
Vektors eingeführt.
Alternativ können
die Polypeptide in den Säugerzelllinien
durch Einführen
des Nucleinsäurefragments
der Erfindung oder eines Analogons oder einer Teilsequenz davon,
entweder direkt oder mittels eines Expressionsvektors, hergestellt
werden.
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Das
Nucleinsäurefragment
oder ein Analogon oder eine Teilsequenz davon kann außerdem in
einen geeigneten stabilen Expressionsvektor kloniert werden und
dann in eine geeignete Zelllinie gesetzt werden. Die Zellen, die
die gewünschten
Polypeptide produzieren, werden, basierend auf Produktivitätsleveln
unter für den
Vektor und die verwendete Zelllinie geeigneten Bedingungen ausgewählt bzw.
selektiert. Die ausgewählten
bzw. selektierten Zellen werden weiter kultiviert und bilden eine
sehr wichtige und kontinuierliche Quelle der Polypeptide. Der Organismus,
welcher für
die Produktion des erfindungsgemäßen Polypeptids
verwendet wird, kann außerdem
ein höherer
Organismus, z.B. ein Tier, sein.
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Ein
Beispiel eines spezifischen Analogons der erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenz
ist eine DNA-Sequenz, welche die in SEQ ID NO: 1 gezeigte DNA-Sequenz
oder einen Teil davon umfasst, und welche insbesondere für die Expression
in E. coli angepasst ist. Diese DNA-Sequenz ist eine, welche, wenn sie zusammen
mit geeigneten regulatorischen Sequenzen in E. coli eingeführt wird,
in der Expression eines Polypeptids resultiert, welches im Wesentlichen
die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz oder einen Teil davon
aufweist. Folglich umfasst diese DNA-Sequenz spezifische Codonen,
die von E. coli erkannt werden.
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Im
vorliegenden Kontext wird der Ausdruck „Gen" verwendet, um eine Nucleinsäuresequenz
anzuzeigen, welche beim Herstellen einer Polypeptidkette beteiligt
ist, und welche Regionen beinhaltet, die der codierenden Region
vorangehen und folgen (5'-stromaufwärts liegende
und 3'-stromabwärts liegende
Sequenzen) sowie intervenierende Sequenzen, Introns, welche zwischen
einzelnen codierenden Segmenten, Exons, oder in der 5'-stromaufwärts liegenden
oder 3'-stromabwärts liegenden
Region platziert sind, beinhaltet. Die 5'-stromaufwärts liegende Region umfasst
eine regulatorische Sequenz, welche die Expression des Gens kontrolliert,
typischerweise einen Promotor. Die 3'-stromabwärts liegende Region umfasst
Sequenzen, welche bei der Transkriptionstermination des Gens beteiligt
sind, und gegebenenfalls Sequenzen, die für Polyadenylierung des Transkripts
und der 3'-nicht-translatierten
Region verantwortlich sind. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein
Expressionssystem, das ein Nucleinsäurefragment, wie oben beschrieben,
umfasst, das ein erfindungsgemäßes Polypeptid
codiert, wobei das System eine 5'-flankierende
Sequenz umfasst, die in der Lage ist, die Expression des Nucleinsäurefragments
zu vermitteln.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin einen Plasmidvektor, der eine Nucleinsäuresequenz
enthält,
die für
ein erfindungsgemäßes Polypeptid
oder ein hierin definiertes Fusions-Polypeptid codiert. In einer
besonders wichtigen Ausführungsform
kann das Nucleinsäurefragment
der Erfindung oder ein Analogon oder eine Teilsequenz davon oder
ein Fusions-Nucleinsäurefragment
der Erfindung, wie hierin definiert, von einem replizierbaren Expressionsvektor
getragen werden, welcher in der Lage ist, in einem Wirtsorganismus
oder in einer Zelllinie zu replizieren.
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Der
Vektor kann insbesondere ein Plasmid, Phage, Cosmid, Mini-Chromosom
oder Virus sein. In einer interessanten Ausführungsform der Erfindung kann
der Vektor ein Vektor sein, welcher, wenn er in eine Wirtszelle
eingeführt
ist, in das Wirtszellgenom integriert wird.
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In
einem speziellen Aspekt der Erfindung kann das erfindungsgemäße Nucleinsäurefragment
ein weiteres Nucleinsäurefragment
umfassen, das ein Polypeptid codiert, das unterschiedlich zu oder
identisch mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid
ist, und das im Leserahmen an ein Nucleinsäurefragment der in SEQ ID NO:
1 gezeigten Sequenz oder Analoga davon, die ein Amelin-Polypeptid
codieren, mit dem Zweck, ein fusioniertes Polypeptid zu produzieren,
fusioniert ist. Wenn rekombinante DNA-Technologie verwendet wird,
können
die fusionierten Nucleinsäuresequenzen
in einen geeigneten Vektor oder ein geeignetes Genom eingeführt werden.
Alternativ wird eines der Nucleinsäurefragmente in den Vektor
oder das Genom eingeführt,
welcher/welches schon das andere Nucleinsäurefragment enthält. Ein
Fusions-Polypeptid kann außerdem
hergestellt werden, indem die zwei Nucleinsäurefragmente getrennt eingeführt werden
und man der Expression erlaubt, aufzutreten. Der Wirtsorganismus,
welcher eukaryotischen oder prokaryotischen Ursprungs sein kann, wird
unter Bedingungen kultiviert, die Expression der fusionierten Sequenzen
gewährleisten.
Das fusionierte Polypeptid wird dann gereinigt und das erfindungsgemäße Polypeptid
von seinem Fusionspartner unter Verwendung eines geeigneten Verfahrens
getrennt.
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Ein
Aspekt der Erfindung betrifft folglich ein Verfahren zur Herstellung
eines erfindungsgemäßen Polypeptids,
das die folgenden Schritte umfasst:
- (a) Einfügen eines
erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragments
in einen Expressionsvektor,
- (b) Transformieren eines geeigneten Wirtsorganismus mit dem
in Schritt (a) hergestellten Vektor,
- (c) Kultivieren des in Schritt (b) hergestellten Wirtsorganismus
unter für
das Exprimieren des Polypeptids geeigneten Bedingungen,
- (d) Ernten des Polypeptids und
- (e) gegebenenfalls Unterwerfen des Polypeptids einer post-translationalen
Modifikation.
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Innerhalb
des Umfangs der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Verfahren, wie oben
beschrieben, wobei das produzierte Polypeptid mittels eines Verfahrens
isoliert wird, das einen oder mehrere Schritte, wie Affinitätschromatographie,
unter Verwendung von immobilisiertem Amelin-Polypeptid oder Antikörpern, die mit
dem Polypeptid reaktiv sind, und/oder andere chromatographische
und elektrophoretische Verfahren umfasst.
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Das
wie oben hergestellte Polypeptid kann post-translationalen Modifikationen
als Ergebnis thermischer Behandlung, chemischer Behandlung (Formaldehyd,
Glutaraldehyd etc.) oder Enzymbehandlung (Peptidasen, Proteinasen
und Protein-Modifizierungsenzyme) unterzogen werden. Das Polypeptid
kann im Vergleich zu seiner natürlichen
Produktionsumgebung auf eine unterschiedliche Weise prozessiert
werden, wenn es in einem Organismus produziert wird. Als ein Beispiel
wird oft Glykosylierung erreicht, wenn das Polypeptid von einer
Zelle eines höheren
Organismus, wie beispielsweise Hefe, oder vorzugsweise ein Säuger exprimiert wird.
Man findet Glykosylierung normalerweise im Zusammenhang mit Aminosäureresten
Asn, Ser, Thr oder Hydroxylysin. Es kann oder kann nicht vorteilhaft
sein, die Prozessierungscharakteristika, die von dem besagten Wirtsorganismus
verursacht werden, zu entfernen oder zu verändern.
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Im
Anschluss an die erfindungsgemäße Expression
des Polypeptids in einem Organismus oder einer Zelllinie kann das
Polypeptid entweder als solches verwendet werden oder es kann zuerst
aus dem Organismus oder aus der Zelllinie gereinigt werden. Wenn
das Polypeptid als ein sezerniertes Produkt exprimiert wird, kann
es direkt gereinigt werden. Wenn das Polypeptid als ein assoziiertes
Produkt exprimiert wird, kann es die partielle oder vollständige Aufspaltung
des Wirts vor der Reinigung erfordern. Beispiele von Verfahren,
die für die
Reinigung von Polypeptiden eingesetzt werden, sind: (i) Immunopräzipitation
oder Affinitätschromatographie
mit Antikörpern,
(ii) Affinitätschromatographie
mit einem geeigneten Liganden, (iii) andere Chromatographieverfahren,
wie z.B. Gelfiltration, Ionenaustausch oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
oder Derivate irgendwelcher der oben stehenden, (iv) elektrophoretische
Verfahren, wie Polyacrylamidgelelektrophorese, denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese,
Agarosegelelektrophorese und isoelektrische Fokussierung, (v) beliebige
andere spezifische Solubilisierungs- und/oder Reinigungs-Techniken.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein im Wesentlichen
reines Amelin-Polypeptid.
Im vorliegenden Kontext soll der Ausdruck „im Wesentlichen rein" so verstanden werden,
dass er bedeutet, dass das besagte Polypeptid im Wesentlichen frei
von anderen Komponenten, z.B. anderen Polypeptiden oder Kohlehydraten,
ist, welche aus der Produktion und/oder Gewinnung des Polypeptids
stammen können,
oder in anderer Weise zusammen mit dem Polypeptid gefunden werden
können.
Die Reinheit eines Proteins kann beispielsweise mittels SDS-Gelelektrophorese
bewertet werden.
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Eine
hohe Reinheit des erfindungsgemäßen Polypeptids
kann vorteilhaft sein, wenn das Polypeptid in einer Zusammensetzung
verwendet werden soll. Außerdem,
bedingt durch seine hohe Reinheit, kann das im Wesentlichen reine
Polypeptid für
die meisten Zwecke in einer niedrigeren Menge als das Polypeptid
einer konventionell niedrigeren Reinheit verwendet werden.
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In
einem Aspekt der Erfindung kann das Polypeptid von einer geeigneten
Zelllinie erhalten werden, welche ein erfindungsgemäßes Polypeptid
exprimiert. Außerdem
kann ein erfindungsgemäßes Polypeptid durch
die gut bekannten Verfahren der Flüssig- oder Festphasen-Peptidsynthese unter
Benutzung des sukzessiven Koppelns der einzelnen Aminosäuren der
Polypeptidsequenz hergestellt werden. Alternativ kann das Polypeptid
durch das Koppeln einzelner Aminosäuren, die Fragmente der Polypeptidsequenz
bilden, synthetisiert werden, welche später gekoppelt werden, um in
dem gewünschten
Polypeptid zu resultieren. Diese Verfahren stellen folglich einen
anderen interessanten Aspekt der Erfindung dar.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung
und/oder Prävention
von Paradontalerkrankung, wobei das Verfahren Verabreichen einer
therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptids
an einen Patienten mit Bedarf davon umfasst. Es wird erwogen, dass
das erfindungsgemäße Polypeptid
bei der Zementbildung mitwirken wird und folglich das Verankern
des Periodontal-Ligaments verbessern wird.
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Die
Verwendung von Amelinprotein im Zusammenhang künstlicher lokaler Knochenbildung
wird durch die Gegenwart von Amelin-RNA-Sequenzen in knochenbildenden
Zellen angezeigt: Eine Größenvariante
der Amelin-RNA, die die oben definierten Kriterien erfüllt, wurde
in Knochengewebe aus Ratten-Femur sowie -Calvaria durch Northern
Blots entdeckt. In situ-Hybridisierung
mit Amelinsonden lokalisierte diese RNA an Osteoblasten in Verbindung
mit wachsendem Knochen. Außerdem
exprimierten Ratten-Calvaria-Zellen, welche in Gewebekultur Knochen
bilden, die Knochenvariante von Amelin-RNA während der Knochenbildungsperiode (C.
Brandsten, C. Christersson und T. Wurtz, unveröffentlicht).
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Die
Gegenwart von Amelin-RNA-Sequenzen in natürlichen und experimentellen
knochenbildenden Systemen zeigt eine Rolle des Amelinproteins bei
der Knochenbildung an. Es ist denkbar, dass extern zugegebene Amelinpeptide
die Knochenbildung sowohl in vitro als auch in medizinischen Anwendungen
beschleunigen oder modulieren.
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Ferner
betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Reparatur einer Läsion in
einem Zahn, wobei das Verfahren das Verabreichen einer wirksamen
Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptids
in Kombination mit geeignetem Füllmaterial
an einen Patienten, der dessen bedarf, umfasst.
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Die
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Verbinden zweier Knochenelemente
und ein Verfahren, ein Implantat effizient in einen Knochen zu inkorporieren.
In diesem Zusammenhang kann das Polypeptid zusammen mit einem Carrier
bzw. Träger,
wie im Detail unten beschrieben, verabreicht werden. Außerdem könnte das
erfindungsgemäße Polypeptid
in einem Verfahren zum Fördern
oder Hervorrufen der Mineralisation von hartem Gewebe, ausgewählt aus
der Gruppe, bestehend aus Knochen, Schmelz, Dentin und Zement, verwendet
werden.
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Ferner
betrifft die Erfindung außerdem
ein Verfahren zum Verbessern der Biokompatibilität einer Implantatvorrichtung
oder einer transkutanen Vorrichtung, z.B. auf eine ähnliche
Weise wie in
US 4,578,079 beschrieben,
wobei das Verfahren das Beschichten der Implantatvorrichtung mit
einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptids umfasst, wodurch
z.B. Muskel- oder Ligament-Befestigung an das Implantat ermöglicht wird.
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Außerdem betrifft
die Erfindung ein Verfahren zum Verankern von Epithel an einer Hartgewebeoberfläche, ausgewählt aus
der Gruppe, bestehend aus Schmelz, Dentin oder Zement, in Verbindung
mit einem Zahnimplantat, durch Verabreichen des erfindungsgemäßen Polypeptids. Überdies
betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Verhindern von Epithelwachstum
in Verbindung mit Zahnimplantation, wobei das Verfahren das Verabreichen
einer prophylaktisch wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptids
an einen Patienten, der dessen bedarf, umfasst, wodurch z.B. verhindert
wird, dass Epithel in das Periodontal-Ligament wächst.
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Ein
sehr wichtiger Aspekt der Erfindung betrifft eine Zusammensetzung,
umfassend ein Amelin-Polypeptid und ein physiologisch annehmbares
Exzipiens. Die Zusammensetzung kann ein gereinigtes rekombinantes
Polypeptid der Erfindung umfassen. Insbesondere, jedoch nicht ausschließlich, betrifft
die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, geeignet für topische
Applikation, z.B. Applikation auf die Mucosaoberflächen des
Mundes.
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Erfindungsgemäße Zusammensetzungen,
die für
topische Verabreichung geeignet sind, können Einreibemittel, Gele,
Lösungen,
Suspensionen, Pasten, Sprays, Puder, Zahnpasten und Mundwasser sein.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst eine Zahnpasta, hergestellt durch
Vermischen des erfindungsgemäßen Polypeptids
mit einer Zahnpastazubereitung, z.B. von der Art, die gewöhnlich als
kommerzielle Zahnpasten erhältlich
sind, welche auf einer regulären
Basis für
die Prävention
von z.B. Periodontitis verwendet werden kann.
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Eine
Zahnpasta wird gewöhnlich
Poliermittel, oberflächenaktive
Substanzen, Geliermittel und andere Exzipientien, wie beispielsweise
Aromastoffe und Färbemittel,
enthalten. Das Poliermittel kann ausgewählt sein aus jenen, welche
gegenwärtig
zu diesem Zweck in Dentalzubereitungen eingesetzt werden. Geeignete Beispiele
sind wasserunlösliches
Natrium- oder Kaliummetaphosphat, hydriertes oder wasserfreies Dicalciumphosphat,
Calciumpyrophosphat, Zirkoniumsilicat oder Gemische davon. Insbesondere
nützliche
Poliermittel sind verschiedene Formen von Siliciumdioxid. Das Poliermittel
ist im Allgemeinen fein verteilt, mit einer Teilchengröße kleiner
als 10 μm,
beispielsweise 2–6 μm. Das Poliermittel
kann in einer Menge von 10–99
Gew.-% der Zahnpasta eingesetzt werden. Typischerweise werden die
Zahnpastazubereitungen 20–75%
des Poliermittels enthalten.
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Ein
geeigneter oberflächenaktiver
Stoff ist normalerweise in den Zahnpastazubereitungen enthalten. Das
oberflächenaktive
Mittel ist typischerweise ein wasserlösliches synthetisches or ganisches
Nicht-Seifen-Detergens. Geeignete Detergentien sind die wasserlöslichen
Salze von: höheren
Fettsäure-Monoglycerid-Monosulfaten
(beispielsweise hydriertes Kokosnussfettsäure-Monoglycerid-Natriummonosulfat); höheren Alkylsulfaten
(beispielsweise Natriumlaurylsulfat); Alkylarylsulfonaten (beispielsweise
Natriumdodecylbenzolsulfonate); und höheren Alkylsulfoacetaten (beispielsweise
Natriumlaurylsulfoacetat). Zusätzlich
können
gesättigte
höher aliphatische
Acylamide von niederaliphatischen Aminocarbonsäuren eingesetzt werden, die 12–16 Kohlenstoffatome
im Acylrest aufweisen, und bei welchen der Aminosäureanteil
abgeleitet ist von den niederaliphatischen Monoaminocarbonsäuren, die
2–6 Kohlenstoffatome
aufweisen, wie beispielsweise Fettsäureamide von Glycin, Sarcosin,
Alanin, 3-Aminopropanolsäure
und Valin, insbesondere die N-Lauryl-, Myristoyl- und Palmitoylsarcosinat-Verbindungen.
Konventionelle nichtionische oberflächenaktive Stoffe können außerdem,
wenn gewünscht,
mit eingeschlossen werden.
-
Die
oberflächenaktiven
Materialien sind im Allgemeinen in einer Menge von etwa 0,05–10 Gew.-%,
typischerweise etwa 0,5–5
Gew.-%, der Zahnpastazubereitung vorhanden.
-
Typischerweise
werden die Flüssigkeiten
der Zahnpasta hauptsächlich
Wasser, Glycerin, Sorbitol, Propylenglykol oder Gemische davon umfassen.
Ein vorteilhaftes Gemisch ist Wasser und Glycerin, vorzugsweise
mit Sorbitol. Ein Geliermittel, wie z.B. natürliche und synthetische Gummi
und gummiähnliche
Materialien, z.B. Irish Moss oder Natriumcarboxymethylcellulose,
können
verwendet werden. Andere Gummis, welche verwendet werden können, sind
Tragantgummi, Polyvinylpyrrolidon und Stärke. Sie werden gewöhnlich in
einer Menge bis etwa 10 Gew.-%, typischerweise etwa 0,5–5 Gew.-%,
der Zahnpasta verwendet.
-
Der
pH einer Zahnpasta ist im Wesentlichen neutral, wie beispielsweise
ein pH von etwa 6–8.
Wenn erforderlich, kann eine geringe Menge eines pH-regulierenden
Mittels, z.B. eine geringe Menge einer Säure, wie beispielsweise Citronensäure, oder
eines alkalischen Materials zugesetzt werden.
-
Die
Zahnpasta kann außerdem
andere Materialien, wie beispielsweise lösliches Saccharin, Aromaöle (z.B. Öle aus grüner Minze,
Pfefferminze, Wintergrün),
Färbemittel
oder Weißmacher
(z.B. Titandioxid), Konservierungsstoffe (z.B. Natriumbenzoat),
Emulgatoren, Silikone, Alkohol, Menthol und Chlorophyllverbindungen
(z.B. Natriumkupferchlorophyllin) enthalten.
-
Der
Gehalt des erfindungsgemäßen Polypeptids
in der Zahnpasta der obigen Art oder der unterhalb diskutierten
Arten wird normalerweise in einem Bereich von 1–20 Gew.-%, berechnet am Gewicht
der gesamten Zahnpastazusammensetzung, wie beispielsweise im Bereich
von 5–20
Gew.-%, insbesondere etwa 10–20 Gew.-%,
wie beispielsweise 12–18
Gew.-%, sein. Die letzteren Bereiche sind insbesondere für Zahnpasten
angezeigt, welche für
die Behandlung von Gingivitis und Paradontose verwendet werden.
Es ist jedoch außerdem
interessant, Zahnpasten bereitzustellen, die einen niedrigeren Gehalt
des erfindungsgemäßen Polypeptids
aufweisen, welche oft hauptsächlich
an präventive
oder prophylaktische Zwecke angepasst sein werden. Für solche
Zwecke können
Polypeptidgehaltsbereiche von etwa 0,1 bis etwa 5 Gew.-% interessant
sein.
-
Eine
spezielle Art von Zahnpasta sind Zahnpasten, welche im Wesentlichen
klare Gele sind. Solche Zahnpasten können entweder überhaupt
keine Poliermittel enthalten oder können das Poliermittel in so
fein verteilter Form enthalten, dass die Gele nach wie vor im Wesentlichen
klar erscheinen werden. Solche Gel-Zahnpastaarten können entweder
per se verwendet werden oder können
mit Zahnpasten kombiniert werden, die Poliermittel, wie oben diskutiert,
enthalten.
-
Die
Inkorporation des erfindungsgemäßen Polypeptids
in eine Zahnpastazubereitung und andere Dental- oder Oral-Zubereitungen
kann auf viele unterschiedliche Weisen durchgeführt werden. Oft wird es bevorzugt
sein, eine Suspension des erfindungsgemäßen Polypeptids zu bilden und
die Amelinsuspension mit den anderen Zubereitungsbestandteilen in
Pastenform zu kombinieren. Alternativ kann trockenes Amelinpulver
mit den anderen Zubereitungskomponenten vermischt werden, entweder
zuerst mit den trockenen Zubereitungsbestandteilen und anschließend mit
flüssigen
oder halbflüssigen
Zubereitungsbestandteilen, oder Amelinpulver kann per se in eine
ansonsten fertig gestellte Zubereitung inkorporiert werden. Im Allgemeinen ist
es bevorzugt, dass das Amelinpulver zusammen mit dem Poliermaterial
oder Zahnputzmittel zugegeben wird.
-
Während die
Inkorporation von Amelin oder anderen wasserunlöslichen oder schwer wasserlöslichen Polypeptidanaloga
am besten durchgeführt
wird, indem man die physikalischen und chemischen Eigenschaften
des Polypeptids in Erwägung
zieht, werden Überlegungen
bei Zahnpasten oder Zahnputzmittel oder anderen Zubereitungen, die
hierin diskutiert sind, normalerweise extrem einfach sein und werden
für gewöhnlich in der
Zugabe des Amelin-Polypeptids zu der Zubereitung oder zu Bestandteilen
davon in entweder trockener gelöster
oder suspendierter Form bestehen.
-
Die
topische Verabreichung kann eine Verabreichung auf oder nahe an
die Teile des Körpers
sein, die die pathologischen Veränderungen
präsentieren,
z.B. auf einen äußeren Teil
des Körpers,
wie beispielsweise eine Mucosaoberfläche des Mundes. Die Applikation
kann ein einfaches Aufschmieren der Zusammensetzung sein oder sie
kann eine beliebige Vorrichtung involvieren, die zum Verstärken der
Kontaktetablierung zwischen der Zusammensetzung und den pathologischen
Läsionen
geeignet ist. Die Zusammensetzungen können imprägniert werden in oder verteilt
werden auf Pads, Pflastern, Bändern,
Gaze, Schwammmaterialien, Baumwollstücken etc. Gegebenenfalls kann
eine Form der Injektion der Zusammensetzung in die oder nahe der
Läsionen
eingesetzt werden.
-
Die
topischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden
Erfindung können
1–80 Gew.-%
der aktiven Verbindung, basierend auf dem Gesamtgewicht der Zubereitungen,
wie beispielsweise 0,001–25% Gew./Gew.
der aktiven Verbindungen, z.B. 0,1–10%, 0,5–5% oder 2–5%, umfassen. Mehr als eine
aktive Verbindung kann in die Zusammensetzung inkorporiert werden;
d.h. Zusammensetzungen, die Amelinprotein in Kombination mit anderen
pharmazeutischen Verbindungen umfassen, sind auch innerhalb des
Umfangs der Erfindung. Die Zusammenset zung wird zweckmäßig 1–10 mal
am Tag appliziert, abhängig
von der Art, dem Schweregrad und der Lokalisierung der Läsionen.
-
Zur
topischen Applikation kann die Zubereitung in Übereinstimmung mit konventioneller
pharmazeutischer Praxis formuliert werden, z.B. mit pharmazeutisch
annehmbaren Exzipientien, die konventionell für topische Applikationen im
Mund verwendet werden. Die Art des in der Zubereitung irgendeiner
speziellen Zusammensetzung eingesetzten Vehikels wird von dem für die Verabreichung
dieser Zusammensetzung beabsichtigten Verfahren abhängen. Andere
Vehikel als Wasser, die in Zusammensetzungen verwendet werden können, können Feststoffe
oder Flüssigkeiten,
wie beispielsweise Weichmacher, Lösungsmittel, Befeuchtungsmittel,
Verdickungsmittel und Pulver einschließen. Es wird erwogen, dass
die erfindungsgemäße Zusammensetzung
nur aus dem Polypeptid, gegebenenfalls in Mischung mit Wasser, bestehen
kann, jedoch kann die Zusammensetzung das Polypeptid auch in Kombination
mit einem Carrier, Diluens oder einem Bindemittel, wie beispielsweise
Cellulosepolymeren, Agar, Alginat oder Gelatine, enthalten, welches
für den
zur Frage stehenden Zweck annehmbar ist. Für Dentalverwendung ist es günstig, dass
der Carrier oder das Diluens dental annehmbar ist. Es ist derzeit
bevorzugt, einen Carrier zu verwenden, der wasserlösliche Polymere
umfasst. Nicht-begrenzende Beispiele solcher Polymere sind Natriumcarboxycellulose,
mikrokristalline Cellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose,
Methylcellulose, hochmolekulare Polyacrylsäure, Natriumalginat, Propylenglykolalginat,
Xanthangummi, Guargummi, Johannisbrotkernmehl, modifizierte Stärke, Gelatine,
Pectin oder Kombinationen davon. Nach Inkorporation der aktiven
Proteinfraktion können
diese wasserlöslichen Polymere
gegebenenfalls in Gele oder Filme umgewandelt werden, was in Zusammensetzungen
resultiert, welche angesichts ihrer vorteilhaften physikalischen
Eigenschaften leicht zu applizieren sind. Die Zusammensetzung kann
gegebenenfalls Stabilisatoren oder Konservierungsstoffe mit dem
Zweck, die Lagerungsstabilität zu
verbessern, enthalten. Ein geeignetes Exzipiens wird ein Alginat,
z.B. wie in
EP 337967 beschrieben,
sein.
-
Für topische
Applikation kann der pH der Zusammensetzung im Prinzip innerhalb
eines sehr breiten Bereichs, wie beispielsweise 3–9, sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist ein pH von etwa 4 bis 8 bevorzugt. Konventionelle
Puffermittel, wie oben beschrieben, können verwendet werden, um den gewünschten
pH zu erhalten.
-
Die
Zubereitung der Erfindung kann außerdem andere Additive enthalten,
wie beispielsweise Stabilisatoren, Konservierungsstoffe, Lösungsvermittler,
Chelatbildner, gelbildende Mittel, pH-Regulatoren, Antioxidantien
etc. Weiterhin kann es vorteilhaft sein, Zubereitungen mit modifizierter
Freisetzung bereitzustellen, bei welchen die aktive Verbindung in
eine Polymermatrix oder Nanopartikel oder Liposomen oder Micellen
inkorporiert ist, oder an Ionenaustauscherharzen adsorbiert ist,
oder von einem Polymer getragen wird.
-
Zusammensetzungen
können
gemäß konventioneller
pharmazeutischer Praxis formuliert werden und können sein:
Halbfeste Formulierungen:
Gele, Pasten, Gemische.
Flüssige
Formulierungen: Lösungen,
Suspensionen, „Drenches", Emulsionen.
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Wie
angezeigt, kann eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung
ein erfindungsgemäßes Polypeptid
selbst oder ein funktionelles Derivat davon oder eine Kombination
solcher Verbindungen umfassen. Beispiele geeigneter funktioneller
Derivate schließen
pharmazeutisch annehmbare Salze, insbesondere jene, die zur Verwendung
in einer oralen Umgebung geeignet sind, ein. Beispiele schließen pharmazeutisch
annehmbare Salze der Aminofunktion, beispielsweise Salze mit Säuren, die
Anionen ergeben, welche, insbesondere in einer oralen Umgebung,
pharmazeutisch annehmbar sind. Beispiele schließen Phosphate, Sulfate, Nitrat,
Iodid, Bromid, Chlorid, Borat sowie Anionen, abgeleitet von Carbonsäuren einschließlich Acetat,
Benzoat, Stearat etc., ein. Andere Derivate der Aminofunktion schließen Amide,
Imide, Harnstoffe, Carbamate etc. ein.
-
Andere
geeignete Derivate schließen
Derivate der Carboxylgruppe eines erfindungsgemäßen Polypeptids ein, einschließlich Salze,
Ester und Amide. Beispiele schließen Salze mit pharmazeutisch
annehmbaren Kationen, z.B. Lithium, Natrium, Kalium, Magnesium,
Calcium, Zink, Aluminium, Eisen(III), Eisen(II), Ammonium und Niedrig(C1-6)alkylammoniumsalze ein. Ester schließen Niedrigalkylester
ein.
-
Die
Erfindung wird mittels einer Anzahl von Arbeitsbeispielen weiter
beschrieben werden, welche nicht als für den Umfang dieser Anmeldung
limitierend ausgelegt werden sollten.
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Konventionelle
Verfahren und Kits wurden verwendet, wenn nichts anderes angegeben
ist. Die Kits wurden gemäß der vom
jeweiligen Lieferanten gegebenen Instruktionen verwendet. Methodologische
Schritte sowie Reagentien, welche hier nicht beschrieben oder erwähnt sind,
sind erklärt
in: Current Protocols in Molecular Biology, von F. M. Ausubel, R.
Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith und
K. Struhl; John Wiley, New York (1994).
-
LEGENDE ZU
DEN FIGUREN
-
1: Lokalisierung von RNA-Sequenzen in
wachsenden ersten Mahlzähnen.
Oberkiefer von 4 Tage alten Ratten wurden präpariert, fixiert und in Paraffin
eingebettet. Distal-mesiale Schnitte durch die Mahlzähne wurden
in situ-Hybridisierung unter Verwendung von DIG-markierter RNA, komplementär zu RNA-Sequenzen, hergestellt
durch in vitro-Transkription von Bluescript-Plasmiden, unterzogen. 1a:
Amelin, 1b: Amelogenin, 1c:
Typ I-Collagen.
-
2:
Sequenz von Amelinen 1 und 2. Einige überlappende Sequenzen von beiden
Varianten wurden bestimmt und vergleichend angeordnet. Identische
Sequenzen sind „face
to face" gedruckt.
Punkte zeigen Abwesenheit der korrespondierenden Sequenzen von der
jeweiligen Variante an. Die längsten
offenen Leserahmen sind durch Aminosäurenamen im Ein-Buchstaben-Code skizziert.
Der Abschnitt mit zwei codierenden Leserahmen ist schattiert (Nucleotide
390–403).
Unterstrichen sind komplementäre
Sequenzen (Nucleotide 248–272
und 414–430)
zu den Oligos, welche verwendet wurden, um nach Klonen, die die
zwei Varianten enthalten, zu durchmustern. Kasten zeigen Konsensus-Sequenzen
für Domänen an,
die mit Zelloberflä chenproteinen
wechselwirken. Das mutmaßliche
Adenylierungssignal ist doppelt unterstrichen (Nucleotide 1892–1897).
-
3:
Northern Blot-Analyse von RNA aus Ratten-Mahlzähnen. Die ersten Mahlzähne wurden
aus vier Tage alten Ratten präpariert.
RNA wurde isoliert. Vier mg pro Spur wurden in einem Agaroseformaldehydgel
einer Elektrophorese unterzogen und auf eine Nylonmembran übertragen.
Individuelle Spuren wurden an DIG-markierte Amelin (a)- und Amelogenin
(b)- Ribosonden
hybridisiert. Die Positionen definierter RNA-Fragmente (Gibco BRL)
mit ihrer Länge
in kb sind am linken Rand angezeigt.
-
BEISPIELE
-
BEISPIEL 1
-
Isolierung von RNA
-
Drei
präparierte
wachsende Mahlzähne
von 4 Tage- oder 7 Tage-alten Sprague-Dawley-Ratten (B&K Universal, Sollentuna, Schweden)
wurden in einem Glas-Glas-Homogenisator in 500 l 4 M Guanidiniumisothiocyanat,
80 mM EDTA (Chomczynski & Sacchi,
1987) unter Verwendung eines kommerziellen Kits (Promega Biotech,
RNAgents, Total RNA Isolation System) homogenisiert. Dies wurde
von Phenol-Chloroform-Extraktion und zwei Isopropanol-Präzipitationen
gefolgt. RNA wurde in 0,2 × SET-Puffer
(0,2% Natriumdodecylsulfat, 4 mM Tris-Cl pH 7,5, 2 mM EDTA) gelöst und die
Konzentration wurde durch optische Dichtemessungen bestimmt.
-
BEISPIEL 2
-
Herstellung
von cDNA-Bibliothek
-
Poly-A-enthaltende
RNA (mRNA) wurde mit Hilfe von Oligo-dT, gebunden an Silicatharz
(Quiagen Oligotex mRNA Midi Kit) selektiert. Umkehrtranskription
wurde am Poly-A-Ende
geprimt und doppelsträngige
methylierte cDNA wurde in lambda-ZAP-Vektorarme ligiert und in Phagenpartikel
verpackt (Stratagene ZAP-cDNA Cloning Kit). Nach Amplifikation und
Plattieren wurden Phagenstämme,
die häufig
exprimierte Sequenzen enthielten, durch Hybridisierung mit einer
DIG-markierten Gesamt-cDNA selektiert (siehe unten). Phagen von positiven
Plaques wurden isoliert und durch Superinfektion von lambda-ZAP-infizierten
Escherichia coli-SOLR-Zellen
mit ExAssist-Helferphage in Plasmide umgewandelt. Um eine bessere
Repräsentanz
der 5'-Enden zu
erhalten, wurde außerdem
eine Bibliothek mit einer cDNA konstruiert und an Zufallsstellen
geprimt (Stratagene Random Unidirectional Linker-Primer). Inserts,
die positive in situ-Hybridisierungssignale auf Matrix-bildenden
Zellen haben, wurden unter Verwendung von Zyklus-Sequenzieren mit
Taq-Polymerase, fluoreszenten Terminatoren und einem semiautomatischen
Sequenz-Detektions-System (Applied Biosystems, Tay DyeDeoxy Terminator
Cycle Sequencing Kit) sequenziert. Sequenzen wurden mit dem „Wisconsin
programm set" (Genetics
Computer Group, Inc.) und mit DNAid (Frederic Dardel,
[email protected])
analysiert.
-
BEISPIEL 3
-
Bibliotheks-Durchmustern
-
Lambda-Phagen
einer Zahn-cDNA-Bibliothek (2 × 106 Klone) aus ersten und zweiten Mahlzähnen sieben
Tage alter Ratten wurden plattiert und Plaques wurden an Nitrocellulosemembranen
(Schleicher und Schüll)
adsorbiert. Replika-Filter wurden an 10 ng/ml cDNA oder an Collagen-
und Amelogenin-Oligonucleotide hybridisiert. Die Hybridisierung
wurde 15 Stunden lang bei 54°C
durchgeführt
und die Filter wurden gewaschen und entwickelt (Boehringer Mannheim,
The DIG System). Phagen, die Amelogenin, Collagen oder verbleibende,
häufig
exprimierte Sequenzen enthielten, wurden zweimal re-kloniert („re-cloned") und in Bluescript-Plasmide durch in
vivo-Exzision, erreicht durch Superinfektion mit dem ExAssist-Helferphagen
(Stratagen) umgewandelt.
-
BEISPIEL 4
-
Herstellung
von Sonden für
Hybridisierungsassays
-
cDNA-Sonden
für das
Durchmustern einer Bibliothek wurden aus Poly-A-angereicherter RNA
mit Umkehrtranskriptase (Promega Biotech, Reverse Transcription
System) hergestellt. Dabei wurde eine Nucleotidkonzentration von
0,25 mM, supplementiert mit Digoxygenin (DIG)-dUTP (Boehringer Mannheim) zu 0,1 mM.
-
Zu
den mRNA-Sequenzen komplementäre
RNA-Sonden wurden durch in vitro-Transkription
mittels Phagen T7- oder T3-RNA-Polymerase (Promega Riboprobe Gemini
II Core System, Melton et al., 1984) in Gegenwart von DIG-modifiziertem
UTP (Boehringer Mannheim) synthetisiert. Die DNA-Matrizen, die Amelin (1700
bp) enthielten, waren Bluescript-Plasmide,
abgeleitet von λ-Bakteriophagen
durch in vivo-Exzision. Des Weiteren wurden Amelogenin (700 bp)-
und Typ I-Collagen (850 bp)-Sequenzen durch Restriktionsenzymspaltung
von Bluescript SK-Plasmiden erhalten. Sonden für quantitative RNA-Bestimmungen
wurden mit [35S] anstelle von DIG markiert.
-
Das
Collagen-spezifische Oligonucleotid hatte die Sequenz 5'-CATGTAGGCAATGCTGTTCTT GCAGTGGTAGGTGATGTTCTGGGAGGC-3' (Yamada et al.,
1983) und das Amelogenin-spezifische Oligonucleotid war 5'-ATCCACTTCTTCCCGCTTGGTCTTGTCTGTCGCTGGCCAAGCTTC-3' (Lau et al., 1992).
Sonden wurden durch 3'-Markieren
durch DIG-modifizierten ddUTP durch einer terminale Transferase-Reaktion gemäß einem
Boehringer-Protokoll hergestellt.
-
BEISPIEL 5
-
Northern Blotting
-
Für Northern
Blot-Analyse wurden 15 mg Gesamt-RNA pro Vertiefung von 2 cm Breite
in Gegenwart von 50% Formamid hitzedenaturiert und in einem Agarosegel
mit 2,2 M Formaldehyd, 0,02 M N-Morpholinopropansulfonsäure, 0,05
M Natriumacetat, 1 mM EDTA (Lehrach et al., 1977) einer Elektrophorese
unterzogen. RNA wurde über
Nacht in 20 × SSC
(3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat) auf eine Nylonmembran (Pall Biodyne
B Transfer Membrane) transferiert.
-
Die
Membranen wurden mit UV-Licht quervernetzt und in Streifen geschnitten.
Einzelne Streifen wurden 1 Stunde lang bei 68°C in 50% Formamid, 5 × SSC, 2%
Blocking-Reagens (Boehringer Mannheim), 0,1% N-Lauroylsarcosin,
0,02% Natriumdodecylsulfat (SDS) prähybridisiert und anschließend über Nacht
unter denselben Bedingungen, folgend auf die Zugabe der DIG-markierten cRNA-Sonde
zu 100 ng/ml, hybridisiert. Membranen wurden dann zweimal 2 mal
für 5 Minuten
mit 2 × SSC,
0,1% SDS bei Raumtemperatur und 2 mal 15 Minuten lang bei 68°C mit 0,1 × SSC, 0,1%
SDS, gewaschen. Die Anwesenheit von DIG-markierter RNA wurde via
Phosphatase-gekoppelten Anti-DIG-Antikörperfragmenten (Boehringer
Mannheim, The DIG System) entwickelt.
-
BEISPIEL 6
-
Lösungshybridisierung
-
RNA
von präparierten
Mahlzähnen
wurde an 35S-UTP-markierte komplementäre RNA-Sonden im Überschuss
hybridisiert (Mathews et al., 1989). Reaktionen von 40 l 0,6 M NaCl,
4 mM EDTA, 10 mM Dithiothreitol (DTT), 0,1% SDS, 30 mM Tris-HCl,
pH 7,5 und 25% (Vol./Vol.) Formamid enthielten 20000 cpm Sonde und
unterschiedliche Mengen an Gesamt-RNA. Das Gemisch wurde mit Paraffinöl bedeckt, über Nacht
bei 70°C
inkubiert, mit 1 ml RNAase-Lösung
(40 g RNase A, 2 g RNase T1, Boehringer-Mannheim, 100 g Lachssonden-DNA, Sigma Chemical
Co.) verdünnt
und 1 Stunde lang bei 37°C
verdaut. RNAse-resistente doppelsträngige RNA wurde durch 100 l
Trichloressigsäure
(6 M) präzipitiert,
auf Glasfaserfiltern (Whatman GF/C) gesammelt und in einem Wallac
1409-Flüssigszintillationszähler analysiert.
Standardkurven, wo die Sonden an bekannte Konzentrationen von in
vitro synthetisierten mRNA-Sequenzen hybridisiert wurden, wurden
verwendet, um die Radioaktivität
mit der Menge an hybridisierenden Sequenzen in der Test-RNA in Beziehung
zu setzen.
-
BEISPIEL 7
-
In situ-Hybridisierung
-
Oberkiefer
von Sprague-Dawley-Ratten im Alter von vier Tagen wurden mit 4%
Paraformaldehyd in PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,4 mM KH2PO4) 24 Stunden
lang bei 4°C
fixiert, dehydratisiert und in Paraffin eingebettet. Schnitte von
7 μm Dicke
wurden auf Vectabond-beschichteten (Vektor) Objektträgern befestigt.
Nach dem Entfernen des Paraffins mit Xylol wurden die Proben mit
Proteinase K (20 μg/m1)
30 Minuten lang bei 37°C
behandelt, mit 4% Formaldehyd 5 Minuten lang nach-fixiert, mit Triethanolamin
und Acetanhydrid (2,66 ml Triethanolamin in 200 ml Wasser; 0,5 ml
Acetanhydrid wurde zusammen mit den Objektträgern zugegeben) behandelt und
in 2 × SSC,
50% Formamid 60 Minuten lang bei 42°C eingetaucht. Die Proben wurden
mit 20 μl
0,3 M NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 8,0, 1 mM EDTA, Denhardt-Reagens (Watkins,
1994), 0,1 g/l Dextransulfat, 50% Formamid, enthaltend 0,5 ng/μl RNA-Sonde, überschichtet.
Die Proben wurden mit einem Deckgläschen bedeckt und die Objektträger wurden
in einer feuchten Kammer bei 42°C über Nacht
gehalten, einmal mit 4 × SSC,
dreimal 10 Minuten lang mit 2 × SSC
und dreimal 10 Minuten lang mit 0,1 × SSC bei Raumtemperatur gewaschen.
Die Gegenwart von DIG-markierter RNA-Sonde wurde durch Phosphatase-gekoppelte
Anti-DIG-Antikörperfragmente
(Boehringer Mannheim-Protokoll) deutlich gemacht. Kein Färben der
Probe aufgrund der endogenen Phosphataseaktivität wurde beobachtet.
-
BEISPIEL 8
-
Sequentielle
Expression des Amelingens
-
Unter
Verwendung der in in situ-Hybridisierungstechnik wie in Beispiel
7 beschrieben, wurde die zelluläre
Expression des Amelingens in Ratten im Alter von entweder 20 oder
25 Tagen untersucht. Oberkieferschnitte wurden hergestellt und an
eine Amelin-RNA-Sonde hybridisiert. Zu beiden Entwicklungsstufen
wurde gefunden, dass das Amelingen in Epithelzellen, benachbart
zu der peripheren Oberfläche
neu abgelagerten Dentins im Wurzelzement-bildenden Ende, sowie in
Zellen, die in Mahlzähnen
im zellulären
Zement eingebettet sind, exprimiert wurde. Amelingen-Expression
wurde ferner in sezernierenden Ameloblasten lokalisiert sowie in
der epithelialen Wurzelscheide lokalisiert. Zusätzlich dazu zeigten Schneidezähne von
20 Tage alten Ratten Hinweis auf Amelin-Expression in Manteldentin-sezernierdenden
Odontoblasten, bevor dessen Expression auf differenzierende Ameloblasten
umgeschaltet wurde. In Kombination deuten diese Ergebnisse auf eine
putative Funktion von Amelin in epithelial-mesenchymalen Wechselwirkungen
während
der Zelldifferenzierung von Odontoblasten und Ameloblasten hin und
darauf, dass Amelin eines der Schlüsselproteine sein könnte, das
an den Prozess der Zementogenese gekoppelt ist.
-
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the C-propeptide, is found at the same location in different collagen
genes. Nucl. Acids Res. 11, 2733–2744.
- - WO 89/08441 (Biora AB; veröffentlicht
21. September 1989)
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