DE69635081T2

DE69635081T2 - Schmelz-Matrix betreffende Polypeptide

Info

Publication number: DE69635081T2
Application number: DE69635081T
Authority: DE
Inventors: Radim Cerny; Ivan Slaby; Lars Hammarström; Tilmann Wurtz; Dan Cheng FONG
Original assignee: Biora AB
Current assignee: Biora AB
Priority date: 1995-07-13
Filing date: 1996-06-26
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2016-06-27
Also published as: CA2226570A1; WO1997002730A3; AU715247B2; AU6134596A; PL324518A1; IL122884A0; EP0837880B1; DE69635081D1; CN1196086A; NO980122D0; WO1997002730A2; NO980122L; JPH11510377A; EP0837880A2; ATE302214T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Nucleinsäuresequenzen, welche für Polypeptide codieren, die zu einer Gruppe gehören, die Ameline genannt wird. Diese Polypeptidsequenzen umfassen Tetrapeptiddomänen, die mit Zelloberflächenerkennung in Zusammenhang gebracht werden. Mögliche Anwendungen der Amelinsequenz betreffen die Diagnose von Störungen von Hartgewebebildung und die Herstellung des Amelinproteins oder von Fragmenten davon, welche dann als Matrixbestandteile oder Zellerkennungsmarkierungen bei der Bildung von Biomaterialien dienen können. Die Erfindung betrifft außerdem Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen enthalten, zur Herstellung des Proteins, Organismen, die die Expressionsvektoren enthalten, Verfahren zum Herstellen des Polypeptids, Zusammensetzungen, die die Polypeptide umfassen, und Verfahren zum Behandeln verschiedener Hartgewebekrankheiten oder -störungen.
STAND DER TECHNIK
In Knochen, Dentin und anderen Geweben assemblieren Typ I-Collagen oder ähnliche Proteine in eine fibrilläre Matrix, welche in manchen Fällen als Gerüst für den Einbau von Mineralkristallen dient. Die benachbarten Zellen etablieren spezifische Kontakte zur Matrix, welche durch Wechselwirkungen zwischen Domänen in extrazellulären Proteinen, wie beispielsweise Collagen, und Rezeptoren der Zelloberfläche, beispielsweise Integrinen, vermittelt werden. Peptiddomänen, welche bei diesen Kontakten beteiligt sind, sind in einigen extrazellulären Proteinen identifiziert worden (Yamada & Kleinman, 1992). Im Schmelz ist kein strukturelles Netzwerk gefunden worden, welches vergleichbar ist mit den Collagenfasern von Knochen, Knorpel und Dentin. Außerdem sind in den Schmelz-Matrix-Proteinen keine Sequenzsegmente identifiziert worden, welche sein Verankern an Zelladhäsionsmoleküle vermitteln könnte. Die Schmelzproteine Amelogenin und Enamelin enthalten keine solchen Proteindomänen. Der Mineralgehalt von neu abgelagertem Schmelz ist um die 15% der Gesamtmasse und nimmt später, unter Abbau der Proteine, auf 95% zu (Robinson et al., 1988).
Zwei vorherrschende Gruppen von Proteinen sind im Schmelz identifiziert worden: Enameline und Amelogenine (Termine et al., 1980). Proteinfragmente in reifem Schmelz sind einem der Enameline, Tuftelin, welches mittels Antikörpern zwischen den Schmelzprismen lokalisiert worden ist, ähnlich. Die cDNA-Sequenz, die Tuftelin entspricht, ist bestimmt worden, und es wurde spekuliert, dass dieses Protein eine Funktion bei der Mineralisierung von Schmelz haben könnte (Deutsch et al., 1991). Die Bedeutung der restlichen, bisher beschriebenen Enameline für die Schmelzbildung ist strittig, weil die Hauptproteinspezies identisch mit Proteinen aus dem Blutstrom ist (Strawich & Glimcher, 1990). Es wird immer noch diskutiert, ob Amelogenin, das häufigste Schmelzprotein, ein Gerüst für die Schmelz-Matrix bereitstellt (Simmer et al., 1994).
Teilsequenzen von zufällig ausgewählten cDNA-Klonen aus einer Ratten-in-situ-Bibliothek sind früher zusammengetragen worden (Matsuki et al., 1995), von welchen manche Homologie zu Sequenzen der Erfindung zeigen. Aus den Teilsequenzen wurde kein Leserahmen vorgeschlagen. Es wurde nicht angegeben, ob Polypeptide von diesen Sequenzen codiert sind, und es wurde kein Vorschlag bezüglich einer möglichen Funktion solcher Polypeptide angegeben.
Nicht-Amelogenin-Proteine sind in unreifem Schweine-Schmelz identifiziert worden (Uchida et al., 1995). Ein 15 kDa-Protein hatte eine N-terminale Aminosäuresequenz (VPAFPRQPGTHGVASL-) mit keiner Homologie zu zuvor bekannten Schmelzproteinen. Es wurde vorgeschlagen, dass die Nicht-Amelogenine eine neue Familie von Schmelzproteinen umfassen, jedoch wurde ihre Funktion nicht vorgeschlagen. Die Proteine sind nicht vollständig sequenziert worden und ihre Gene sind nicht bekannt.
WO 89/08441 betrifft eine Zusammensetzung zur Verwendung beim Induzieren von Binden zwischen Teilen von lebendem mineralisiertem Gewebe, bei welcher der aktive Bestandteil aus einem Vorläufer von Zahnschmelz, der sogenannten Schmelz-Matrix, stammt. Die Zusammensetzung induziert Binden durch Ermöglichen der Regeneration von mineralisiertem Gewebe. Der aktive Bestandteil einer Proteinfraktion ist dadurch charakterisiert, dass er ein Molekulargewicht von bis zu etwa 40.000 kDa aufweist, jedoch wird kein einziges Protein identifiziert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Obwohl Proteine von mineralisierten Matrizen oft in hohen Mengen hergestellt werden, verhindert ihre schlechte Löslichkeit eine direkte Analyse. Im Zahnschmelz tritt ein physiologischer Abbau von Matrixproteinen im Verlauf des Mineralerwerbs während der Reifungsphase auf und stellt eine zusätzliche Schwierigkeit für die Analyse der Matrixproteine dar. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Überlegung, dass, weil die Matrix-bildenden Zellen die entsprechenden Proteine in hohen Mengen synthetisieren, sie eine hohe Kopienzahl der mRNAs enthalten sollten. Dementsprechend kann Sequenzanalyse der vorherrschenden mRNA-Arten der Matrixbildenden Zellen einen Teil des Problems umgehen und dabei helfen, gewisse Proteinbestandteile der Matrix zu untersuchen.
Diese Überlegungen initiierten die Vorgehensweise, die genommen wurde, welche zur Entdeckung der neuen Amelin-mRNA-Sequenzen, der Basis für die vorliegende Erfindung, führten. Kurz beschrieben wurde eine genetische Bibliothek konstruiert, die Sequenzen der mRNA-Arten sich entwickelnder Zähne enthielt. Individuelle Sequenzen wurden aus einzelnen bakteriellen Klonen erhalten und für in situ-Hybridisierungsexperimente histologischer Schnitte durch sich entwickelnde Zähne verwendet. Sequenzen, die in Zellen, die Hartgewebematrix bilden, z.B. Ameloblasten, detektiert wurden, wurden bestimmt und verwendet, um Sequenz-Datenbanken zu befragen. Die meisten der so ausgewählten Sequenzen waren in den Datenbanken repräsentiert, aber zwei Sequenzen, die nun die Amelinsequenzen genannt werden, waren es nicht. Diese zwei Varianten einer neuen mRNA-Sequenz werden zu hohen Leveln in Ratten-Ameloblasten während der Bildung der Schmelz-Matrix exprimiert. Die Sequenzen enthalten offene Leserahmen für 407 bzw. 327 Aminosäurereste. Die codierten Proteine, welche Ameline genannt wurden, sind reich an Prolin-, Leucin- und Glycin-Resten und enthalten die Peptiddomäne Asp-Gly-Glu-Ala, eine Integrin-Erkennungssequenz, in Kombination mit anderen Domänen, die mit Zelloberflächen wechselwirken. Die Sequenzen, die für die C-terminalen 305 Aminosäurereste, d.h. Aminosäuren 102–407 in SEQ ID NO: 2 mit Aminosäuren 19–324 in SEQ ID NO: 4 codieren, der 3'-nicht-translatierte Teil und eine Mikrosatelliten-Wiederholung bei der nicht-translatierten 5'-Region sind in beiden mRNA-Varianten identisch. Die verbleibenden 5'-Regionen enthalten 338 Nucleotide, die auf die lange Variante beschränkt sind (Nucleotide 12-349 in SEQ ID NO: 1), 54 gemeinsame Nucleotide und 46 Nucleotide, die nur in der kurzen Variante vorhanden sind (Nucleotid 66-111 in SEQ ID NO: 3). Vierzehn Nucleotide haben das Potential, für 5 Aminosäuren beider Proteine in unterschiedlichen Leserahmen zu codieren (Nucleotide 390–403 in SEQ ID NO: 1 und 52–65 in SEQ ID NO: 3). Der Leserahmen der längeren Variante beinhaltet Codonen für ein typisches N-terminales Signalpeptid. Die Eigenschaften der Amelin-mRNA-Sequenzen zeigen an, dass Amelin ein Bestandteil der Schmelz-Matrix ist, und die einzigen Proteine, welche bisher in Zusammenhang mit Bindungswechselwirkungen zwischen der Ameloblasten-Oberfläche und ihrer extrazellulären Matrix gebracht worden sind.
Es wird erwogen, dass die Amelinpeptide oder Teile davon unter Verwendung der hierin beschriebenen Sequenzinformation, entweder chemisch oder durch Translation mit der Hilfe von Expressionsvektoren synthetisiert werden können. Es wird ferner erwogen, dass diese Peptide zu dem Design von medizinischen Geräten zur Reparatur von Zähnen oder Knochen beitragen können. Die Peptide können außerdem mit künstlichem Implantatmaterial zu dem Zweck kombiniert werden, die Biokompatibilität des Materials zu verbessern. Menschliche Amelin-mRNA- oder -Gensequenzen können bei der Diagnose von genetisch vererbten Störungen bei der Hartgewebebildung helfen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Um Sequenzinformationen über extrazelluläre Matrixproteine zu erhalten, welche auf eine direkte Weise schwierig zu analysieren sein können, wurde eine cDNA-Bibliothek in dem Bakteriophagen λ konstruiert, der das mRNA-Repertoire Matrix-bildender Zellen enthielt. Die Amelin-RNA-Sequenzen wurden auf die folgende Weise selektiert:
Replika-Plaque-Lifts wurden durchgeführt und an Amelogenin- bzw. Collagen-Oligos, wie in Beispiel 4 beschrieben, hybridisiert. Plaques, die ein relativ starkes Hybridisierungssignal mit cDNA, aber kein Signal mit den Oligos aufwiesen, wurden weiter analysiert, wobei angenommen wurde, dass sie Sequenzen enthielten, welche häufig in cDNA repräsentiert waren, aber unterschiedlich zu Amelogenin und Collagen waren. Fünfundzwanzig dieser positiven Phagenklone wurden zu Bluescript-Plasmiden umgeformt.
Ribosonden („riboprobes") wurden für in situ-Hybridisierungen synthetisiert, um die Sequenzen zu identifizieren, welche in Matrix-bildenden Zellen exprimiert wurden, d.h. welche bei Matrixproduktion und Mineralisierung von wachsenden Mahlzähnen beteiligt sein können. Rat ten im Alter von 4 Tagen wurden ausgewählt, weil die Konzentration von Amelogenin-RNA, einbezogen in die Herstellung von Schmelz-Matrix, um diese Zeit herum am höchsten ist. 1 zeigt die Ergebnisse, die mit einer Amelinsonde erhalten wurden (siehe Beispiel 4 und 1a), im Vergleich zu der Reaktion von Amelogenin-RNA (1b) und Collagen-RNA (1c). Amelin- und Amelogenin-RNA wurden im inneren Schmelz-Epithel detektiert, welches Ameloblasten in der sekretorischen Phase enthält. Die Collagensonde markierte hauptsächlich die Odontoblasten, die peripher in der Mesenchym-Pulpa lokalisiert sind, sowie Osteoblasten im Alveolarknochen. Es wurde deshalb geschlussfolgert, dass Amelin zur Bildung der Schmelz-Matrix beitragen kann. Vierzehn cDNA-Inserts, welche zu Sonden führten, die ein positives in situ-Hybridisierungssignal in den Zahnstrukturen aufwiesen, wurden partiell sequenziert. Die Sequenzfragmente wurden verwendet, um für ihre Identifizierung die Genbank- und EMBL-Datenbank abzufragen bzw. zu durchsuchen. Zwei bisher neue Sequenzen waren nicht vertreten.
Um die Sequenz der gesamten Amelin-mRNA zu bestimmen, wurde die Zahn-cDNA-Bibliothek mit einem Oligonucleotid, abgeleitet von den anfänglichen Amelinsequenzen, die oben beschrieben sind, durchmustert, und es wurden sechs zusätzliche Inserts, die sich im Bereich zwischen 0,5 und 2 kb Länge bewegen, isoliert. Sequenzanalyse zeigte, dass alle 7 Klone Sequenzen darstellten, die dem 3'-mRNA-Anteil entsprachen. Jedoch wurden zwei verschiedene 5'-Regionen in den zwei längsten Inserts gefunden, die Amelin 1 und Amelin 2 spezifizierten (2). Um eine Volllängensequenzrepräsentation zu erhalten, wurde aus Rattenmahlzähnen eine „random-primed"-Bibliothek konstruiert und mit zwei verschiedenen Oligonucleotiden, abgeleitet von individuellen 5'-Enden der zwei Varianten (unterstrichen in 2) durchmustert. 5 Klone wurden isoliert, die mit dem 5'-Teil von Amelin 2 hybridisieren, und 13 Klone, die vom 5'-Teil von Amelin 1 abgeleitet sind. Die Sequenzanalyse bestätigte die vorherigen Ergebnisse und erweiterte die Sequenzen beider Varianten, nun die Amelin 1- und Amelin 2-Sequenzen genannt und im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 3 gezeigt. Beide 5'-mRNA-Sequenzen endeten in einer Polypurin-Wiederholung von maximal 100 × (AG) (Daten nicht gezeigt). Wenn man die AG-Wiederholung am 5'-Ende und den Poly-A-Schwanz am 3'-Ende berücksichtigt, waren die kombinierten Sequenzen (2) nicht kürzer als die mRNAs, bestimmt durch Northern Blotting (siehe unten). Die Sequenzanalyse der Klone, erhalten von der „polyT-primed"-cDNA-Bibliothek deckte eine unerwartete 3'-Variantion stromabwärts des Poly-A-Additionssignals AATAAA (Doppelunterstreichung) auf. In manchen Klonen wurde der Poly A-Schwanz 15 Nucleotide stromabwärts, wie erwartet, beobachtet, aber in anderen in einem größeren Abstand von bis zu 79 Nucleotiden. Die Sequenz in 2 zeigt die Variante mit der am weitesten entfernten Polyadenylierungsstelle. Alle Variationen wurden stromabwärts des Stoppcodons lokalisiert.
Beide cDNA-Sequenzvarianten zeigten einen einzelnen langen offenen Leserahmen (2). Stoppcodonen im Leserahmen („in-frame") sind zwischen dem Poly(AG) und dem offenen Leserahmen vorhanden, und folglich erscheint es nicht wahrscheinlich, dass das Poly(AG) oder proximale Sequenzen für Protein codieren. Der Leserahmen von Amelin 1 beginnt 84 Nucleotide stromabwärts von der Poly(AG)-Wiederholung. Die ersten 86 Aminosäuren werden von einer Sequenz codiert, welche in Amelin 2 nicht vorhanden ist. Die Aminosäuren 87 bis 99 von Amelin 1 werden von einer Sequenz codiert, welche Amelin 1 und Amelin 2 gemeinsam ist. Jedoch kann diese Sequenz nicht für das Amelin 2-Protein codieren. Obwohl sie ein ATG-Codon beinhaltet, würde ein Stoppcodon im Leserahmen lediglich ein Heptapeptid ermöglichen. Das nächste ATG, welches mit dem Stoppcodon des Heptapeptids überlappt, beginnt den längsten Sequenzabschnitt, der für Amelin 2 codiert. Faszinierenderweise codieren seine ersten 14 Nucleotide für sowohl Amelin 1 als auch Amelin 2 in unterschiedlichen Leserahmen (schattiert in 2). Die folgenden 46 Nucleotide, welche für 15 Aminosäuren von Amelin 2 codieren, sind in der Amelin 1-RNA nicht vorhanden. Dieses „Insert" in Amelin 2-RNA resultiert in der Synchronisierung beider Leserahmen, so dass die letzten 305 Aminosäurereste beiden Proteinen gemeinsam sind. Im Insert von Amelin 2 gibt es ein ATG-Codon im Leserahmen, welches als ein alternativer Translationsstart dienen könnte. In diesem Fall wäre Amelin 2 5 Aminosäuren kürzer und es gäbe keinen Sequenzabschnitt, der zwei Leserahmen codiert. Der längste mögliche offene Leserahmen enthält Codonen für 407 Aminosäurereste für Amelin 1 und 324 Reste für Amelin 2.
Seit dem Einreichen der ersten Anmeldung sind die Ergebnisse der Sequenzierung überprüft worden und einige Änderungen durchgeführt worden. Die Sequenz für Amelin 1 ist wie folgt geändert worden: Nucleotid Nr. 132 ist von einem G in ein C umgeändert worden, was in keinem Aminosäureaustausch resultierte. Nucleotid 191 ist von einem G in ein A umgeändert worden, was in einem Austausch von Arg33 zu Gln33 resultierte. Nucleotid 200 ist von einem G in ein C umgeändert worden, was in einem Austausch von Gly36 zu Ala36 resultierte. Nucleotid Nr. 617 ist von einem G in ein C umgeändert worden, was in einem Austausch von Gly105 zu Ala175 resultierte. Nucleotid Nr. 809 ist von einem G in ein C umgeändert worden, was in einem Austausch von Gly239 zu Ala239 resultierte. Nucleotid 976 ist von einem C in ein G umgeändert worden, was in einem Austausch von Pro295 zu Ala295 resultierte. Nucleotid Nr. 1649 ist von einem C in ein A umgeändert worden, was in keinem Aminosäureaustausch resultierte. Die Sequenz für Amelin 2 ist wie folgt korrigiert worden: Nucleotid Nr. 326 ist von einem G in ein C umgeändert worden, was in einem Austausch von Gly92 zu Ala92 resultierte. Nucleotid Nr. 518 ist von einem G in ein C umgeändert worden, was in einem Austausch von Gly156 zu Ala156 resultierte. Nucleotid Nr. 685 ist von einem C in ein G umgeändert worden, was in einem Austausch von Pro212 zu Ala212 resultierte. Nucleotid Nr. 1358 ist von einem C in ein A umgeändert worden, was in keinem Aminosäureaustausch resultierte.
Um die Größe der Amelintranskripte abzuschätzen, wurde Northern Blot-Analyse an Gesamt-RNA, präpariert aus Mahlzähnen 4 Tage alter Ratten, durchgeführt (3, Spur a). Die DIG-markierte Amelin-cRNA-Sonde hybridisierte an eine 2,2 kb- sowie an eine 1,9 kb-RNA-Bande. Die Amelin-1- und Amelin-2-mRNAs sind, wie durch cDNA-Sequenzanalyse bestimmt, 2,3 und 2,0 kb lang, wenn eine Poly(AG)-Wiederholung von 0,2 kb und ein Poly-A-Schwanz von 0,2 kb an die dargestellten Sequenzen addiert werden. Die zwei Bestimmungen entsprechen einander gut, was vorschlägt, dass die Sequenzen die gesamte oder nahezu die gesamte mRNA für Ameline umfassen. Zum Vergleich sind die zwei vorherrschenden mRNAs für Amelogenin, von 1,1 kb und 0,8 kb Länge, gezeigt (3, Spur b). Das Massenverhältnis von Amelin-RNA relativ zu Amelogenin-RNA in Gesamt-RNA von Mahlzähnen wurde durch einen Lösungs-Hybridisierungs-Assay (Mathews et al., 1989) bestimmt. Die Menge von Amelin-RNA war etwa 5% im Vergleich zu Amelogenin-RNA. Der Sequenzvergleich von Amelin 1 und 2 legt nahe, dass die zwei RNAs Spleißvarianten desselben Primärtranskripts sind, weil kein Austausch in den vergleichend angeordneten („aligning") Sequenzteilen gefunden wird.
Die häufigsten Aminosäuren in sowohl Amelin 1 als auch 2 sind Prolin, Glycin und Leucin; in keiner der Sequenzen gibt es Cystein (siehe Tabelle 1 unten). Der Aminoterminus des abgeleiteten Amelin 1-Proteins weist die charakteristische Eigenschaft eines Signalpeptids auf: Reste 14 bis 21 sind hydrophob mit einem Abschnitt von Leucinen (2; Leader, 1979). In der Amelin-2-Sequenz wird kein vergleichbares Motiv beobachtet. Beide Ameline enthalten die Proteindomäne DGEA (Asp-Gly-Glu-Ala) (Aminosäuren 370–373 in Amelin 1 und 287–290 in Amelin 2) (in 2 in einem Kasten angegeben), von welcher zuvor identifiziert worden ist, dass sie eine Erkennungsstelle von Typ I-Collagen für das Zelloberflächen alb2-Integrin ist (Staatz et al., 1991). Zusätzlich ist eine Thrombospondin-ähnliche Zelladhäsionsdomäne mit der Sequenz VTKG (Val-Thr-Lys-Gly) (Aminosäuren 277–280 in Amelin 1 und 194–197 in Amelin 2) (Yamada & Kleinman, 1992) enthalten. Die Gegenwart dieser zwei Domänen zeigt an, dass Ameline Bestandteile der extrazellulären Matrix sind. Die vorhergesagte geringe Löslichkeit der Ameline in Wasserlösungen ist mit diesem Modell konsistent. Die Gegenwart einer Signalsequenz in Amelin 1 festigt die Interpretation als ein sekretorisches Protein. Der Mangel einer Signalsequenz in Amelin 2 bedeutet nicht, dass dieses Protein nicht sezerniert wird. Ein Präzedenz für ein sezerniertes Protein ohne Signalsequenz ist das Hühnerovalbumin, wo interne, nicht-abgespaltene Sequenzen, die gleiche Funktion bereitstellen (diskutiert in Leader, 1979). Zwei weitere Domänen mit vorhergesagter Signifikanz bei der Wechselwirkung mit Zelloberflächen, EKGE (Glu-Lys-Gly-Glu) (Aminosäuren 282–285 in Amelin 1 und 199–202 in Amelin 2) und DKGE (Asp-Lys-Gly-Glu) (Aminosäuren 298–301 in Amelin 1 und 215–218 in Amelin 2) sind in der gleichen Region geclustert. Die Kombination der vier Peptiddomänen, wie in diesem Absatz beschrieben, ist eine Eigenschaft, welche bisher für kein Schmelz-Matrix-betreffendes Protein beschrieben wurde.
Wegen der vorhergesagten geringen Löslichkeit wurde Amelin in E. coli-Zellen als ein Fusionsprotein mit Thioredoxin am aminoterminalen Ende exprimiert. Der 6His-Anhang wurde an das carboxyterminale Ende angefügt und das Protein wurde auf einer in Ni-Säule gereinigt. Das Eluat enthielt ein Hauptfusionsprotein und außerdem einige Peptidfragmente, welche mit Anti-Amelin-Kaninchenserum in Western Blot-Analyse aktiv waren. Das Protein konnte durch Antithioredoxin-Affinitätschromatographie weiter gereinigt werden.
Antikörper gegen das Amelinprotein sind erzeugt („raised") worden. Kaninchen wurden mit Amelin-Thioredoxin-Fusionsprotein immunisiert und Immunserum durch Affinitätschromatographie an Amelin-Fusionsprotein, gekoppelt an CNBr-aktivierte Sepharose, gereinigt. Eine weitere Reinigung könnte über Thioredoxin-gekoppelte Sepharose erreicht werden. Diese Antikörper sind beispielsweise für die immunohistochemische Lokalisierung von Amelin in Rattenzähnen verwendet worden.
Außerdem wurde die Gegenwart von Amelin in Zahnextrakt ermittelt. Ratten-Mahlzähne wurden in Na-Carbonatpuffer, pH 10,8, 1 mM EDTA + Proteaseinhibitoren homogenisiert. Der Überstand von Rohextrakt wurde durch Western-Blotting mit Anti-Amelin-Thioredoxin-Immunserum analysiert. Zwei Banden, die zu zwei Amelinvarianten korrespondierten, wurden detektiert. Rohextrakt wurde ferner auf einer Sephadex G-100-Säule chromatographiert. Fraktionen, die zu Molekulargewichten von Amelinen korrespondierten, wurden konzentriert und präparativer Elektrophorese unterzogen. Nach Elektroelution werden die Banden nun durch N-terminale Sequenzanalyse identifiziert. Im Falle, dass eine der Banden Amelin ist, wird der in vivo-Transformationsstart bestimmt.
Die Expression der Amelinsequenz während verschiedener Entwicklungsstufen des Zahns wurde durch Untersuchen der Oberkiefer von 2, 5, 10, 15, 20 und 25 Tage alten Sprague-Dawley-Ratten untersucht. Es wurde gefunden, dass in in situ-Hybridisierungsexperimenten Amelin-mRNA konkomittierend mit mRNA auftritt, d.h. während der Elongation der Ameloblasten zu Beginn des sekretorischen Stadiums. In späteren Stadien weisen Amelogenin- und Amelin-mRNA stark unterschiedliche Hybridisierungsmuster auf. Amelogenin-mRNA verschwindet in einem großen Ausmaß in dem Reifungsstadium, wobei nur geringe Mengen in einem späteren Stadium gereifter Ameloblasten verbleiben, wobei diese Beobachtung in Einklang mit den Funden von Wurtz et al. (1995) ist. Das mit der Amelin-Sonde erhaltene Signal war jedoch während des Reifungsstadiums der Ameloblasten nicht oder nur in kleinem Ausmaß reduziert.
Funktional unterscheiden sich die zwei Stadien darin, dass während der Reifungsphase keine Schmelz-Matrix abgelagert wird. Jedoch scheinen Mineralien („mineral") in beiden Phasen abgelagert zu werden, weil der neu abgelagerte Schmelz schon Mineralien enthält. Wenn man diese Ereignisse mit dem Auftreten der jeweiligen mRNAs korreliert, ist es möglich, dass Amelin beim Mineralisierungsprozess beteiligt ist. Die Amelin-mRNA-Sequenz codiert, wie oben beschrieben, für ein Protein, welches Zellbindungsdomänen enthält, was darauf hindeutet, dass es außerdem oder alternativ an der Bindung der Ameloblasten an die Schmelzoberfläche beteiligt ist.
Amelinprotein kann als eine Proteinase wirken. Dies wurde getestet, indem die Hauptfusionsproteinbande aus dem Acrylamidgel ausgeschnitten und elektroeluiert wurde. Nach Übernachtinkubation bei Raumtemperatur erschien das Fusionsprotein als 3 Banden. Die Kontrollinkubation bei 4°C ergab nur eine Bande. Dies deutete darauf hin, dass bei der höheren Temperatur Abbau stattfindet. Weitere Experimente sind erforderlich, um zu bestimmen, ob Amelin tatsächlich als eine Proteinase wirkt.
Die vorliegende Erfindung stellt Nucleinsäuresequenzen bereit, welche für Proteine mit einer spezifischen Kombination von Zellbindungsdomänen codieren. Die Proteine sind Bestandteile von Hartgewebe-Matrizen und vermitteln den Kontakt zur Zelloberfläche. Die Proteincodierende Sequenz ist in 2 dargestellt. Sie erstreckt sich von Nucleotidpositionen 95 bis 1361. Die neue Kombination von Zellbindungsdomänen belegt die Nucleotidpositionen 969 bis 1259. Die einzelnen Bindungsdomänen können in der vorliegenden Form kombiniert werden oder im Zusammenhang unterschiedlicher Aminosäureumgebungen gezeigt werden oder in Polymere von Nicht-Protein-Art inkorporiert werden. Sowohl die Nucleinsäuresequenzen als auch die abgeleiteten Peptidsequenzen können verwendet werden als, erstens, Werkzeuge für die künstliche Expression von Amelinprotein gemäß Standardverfahren (Ausubel et al., 1994) und, zweitens, als Information für die chemische Synthese von Peptiden. Die Sequenzen können verwendet werden, um diagnostische Kriterien für die Identifikation von Störungen bei der Hartgewebebildung zu etablieren, und können als Mittel für die Produktion von Biomaterialien bei der Gewebetechnik („tissue engineering") verwendet werden. Zusätzlich dazu liefert die Erfindung Expressionsvektoren, welche die beanspruchten Sequenzen stromabwärts von einem Transkriptionspromotor positioniert enthalten, sowie Verfahren zur Produktion und Isolierung von Amelin, welche auf der Verwendung der Expressionsvektoren basieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft alle Schmelz-Matrix-betreffenden Polypeptide, welche wenigstens ein Sequenzelement enthalten, welches das Verankern des Polypeptids an Zelladhäsionsmoleküle vermitteln kann.
Mit dem Ausdruck „Schmelz-Matrix-betreffendes Polypeptid" ist, in seinem breitesten Aspekt, ein Polypeptid gemeint, welches ein Schmelz-Matrix-Protein ist und ein synthetisch hergestelltes Protein mit ähnlichen Eigenschaften, d.h., welches fähig ist, Kontakt zwischen Schmelz und einer Zelloberfläche zu vermitteln, wie im Folgenden in weiterem Detail beschrieben.
In der vorliegenden Beschreibung und den vorliegenden Ansprüchen umfasst der Ausdruck „Polypeptid" sowohl kurze Peptide mit eine Länge von wenigstens zwei Aminosäureresten und höchstens zehn Aminosäureresten, als auch Oligopeptide (11–100 Aminosäurereste) sowie Proteine (die funktionale Einheit, umfassend wenigstens ein Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid, welches chemisch dadurch modifiziert werden kann, dass es glykosyliert wird, dass es mit Lipid versehen („lipidated") wird oder dass es prostetische Gruppen umfasst). Die Definition von Polypeptiden umfasst außerdem native Formen von Peptiden/Proteinen in Tieren einschließlich Menschen sowie rekombinante Proteine oder Peptide in irgendeiner Art von Expressionsvektoren, welche beliebige Arten von Wirt transformieren, und außerdem chemisch synthetisierte Peptide.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide, welche Amelin-Proteine genannt worden sind, unterscheiden sich von den bekannten Schmelz-Matrix-Proteinen Amelogenin und Enamelin darin, dass sie wenigstens ein Sequenzelement enthalten, welches das Verankern des Polypeptids an Zelladhäsionsmoleküle vermitteln kann. Insbesondere enthalten sie ein Sequenzelement, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Tetrapeptiden DGEA (Asp-Gly-Glu-Ala), VTKG (Val-Thr-Lys-Gly), EKGE (Glu-Lys-Gly-Glu) und DKGE (Asp-Lys-Gly-Glu).
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind Polypeptide, die die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 aufweisen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Nucleinsäurefragmente, die Polypeptide codieren, welche fähig sind, Kontakt zwischen Schmelz und Zelloberfläche zu vermitteln. Mit dem Ausdruck „Nucleinsäure" ist ein Polynucleotid hohen Molekulargewichts gemeint, welches entweder als DNA oder RNA vorkommen kann und entweder einzelsträngig oder doppelsträngig sein kann.
Obwohl Nucleinsäurefragmente, welche ein Polypeptid codieren, das Aminosäurereste 1 bis 407 von SEQ ID NO: 2 umfasst, bevorzugte Ausführungsformen sind, betrifft die Erfindung außerdem ein Nucleinsäurefragment, das ein Polypeptid codiert, das eine Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt, oder ein Analogon oder eine Variante davon, wobei ein Nucleotid oder Codon substituiert, insertiert, addiert oder umgeordnet worden ist, aufweist.
Mit dem Ausdruck „ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz, gezeigt in SEQ ID NO: 2, oder ein Analogon oder eine Variante davon aufweist" ist/sind ein Polypeptid gemeint, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 aufweist, sowie Polypeptide gemeint, die Analoga oder Varianten der Sequenz aufweisen, welche produziert werden, wenn ein Nucleinsäurefragment der Erfindung in einem geeigneten Expressionssystem exprimiert wird, und welche fähig sind, Kontakt zwischen Schmelz und Zelloberfläche zu vermitteln, z.B. gezeigt durch ein Testsystem, umfassend extrazelluläre Matrix und Matrix-bildende Zellen in Gewebekultur. Eine konzentrationsabhängige biologische Aktivität der Polypeptide wird durch die Zugabe von Polypeptidfragmenten getestet. Wenn die Fragmente in der Lage sind, den Kontakt zwischen dem extrazellulären Matrix-Protein und den Zellen auszukompetitieren („competing out"), dann werden die Zellen, gezeigt durch mikroskopische Inspektion, von der Matrix abgelöst werden. Von kultivierten Zellen ist bekannt, dass sie an Fibronectin, Osteopontin, Collagen, Laminin und Vironectin anhaften. Zellbindungsaktivität wird durch die RGD-Zellanheftungsdomäne des Proteins vermittelt. Amelin enthält alternative Zellbindungsdomänen DGEA und VTKG. Zellanheftung kann z.B. durch Beschichten von Zellkulturschalen mit Amelin, BSA oder Fibronectin gemessen werden. Gebundene LTMR-Ratten-Osteosarkomzellen können durch Messen endogener N-Acetyl-β-D-hexosaminidase quantifiziert werden.
Das Analogon oder die Variante wird folglich ein Polypeptid sein, welches nicht exakt die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, aufweist, welches aber nach wie vor fähig ist, Kontakt zwischen Schmelz und Zelloberfläche, wie oben definiert, zu vermitteln. Im Allgemeinen werden solche Polypeptide Polypeptide sein, welche z.B. in einem gewissen Ausmaß in der Aminosäurezusammensetzung oder den post-translationalen Modifikationen, z.B. Glykosylierung oder Phosphorylierung, im Vergleich zu den in den Beispielen beschriebenen Amelinproteinien variieren.
Der Ausdruck „Analogon" oder „Variante" wird folglich in dem vorliegenden Zusammenhang verwendet, um ein Protein oder Polypeptid einer ähnlichen Aminosäurezusammensetzung oder -sequenz wie die charakteristischen Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 2 anzuzeigen, abgeleitet von den Amelinproteinen, wie in den Beispielen beschrieben, die geringfügige Variationen erlauben, die die Aminosäuresequenz verändern, z.B. Deletionen, Austausch oder Insertionen von Aminosäuren oder Kombinationen davon, um Amelinproteinanaloga zu erzeugen. Diese Modifikationen können interessante und verwendbare neue Eigenschaften des Analogons ergeben. Das analoge Polypeptid oder Protein kann von einem Tier oder einem Menschen stammen oder kann teilweise oder vollständig synthetischen Ursprungs sein. Das Analogon kann außerdem durch die Verwendung rekombinanter DNA-Techniken abgeleitet sein.
Eine wichtige Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft folglich ein Polypeptid, bei welchem wenigstens ein Aminosäurerest mit einem unterschiedlichen Aminosäurerest substituiert worden ist und/oder bei welchem wenigstens ein Aminosäurerest deletiert worden ist oder addiert worden ist, um in einem Polypeptid zu resultieren, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die verschieden ist von der Aminosäuresequenz, gezeigt in SEQ ID NO: 2, oder eine Teilsequenz der Aminosäuresequenz, wie im Folgenden definiert, umfasst, aber im Wesentlichen Amelinaktivität wie oben definiert aufweist.
Besonders wichtige Ausführungsformen der Erfindung sind das Polypeptid, das die Aminosäurereste 1–407 in SEQ ID NO: 2 (Amelin 1) enthält.
Die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 2 sind mit bekannten Aminosäuresequenzen verglichen worden. Der Grad an Homologie (oder Identität) mit den extrazellulären Matrix-Proteinen, mit welchen die Homologie am höchsten ist, Amelogenin und Collagen IV, ist sehr niedrig, 23% bzw. 26%. Die Identität ist über das gesamte Protein verbreitet und nicht auf spezielle Gebiete beschränkt. In dieser Hinsicht soll angemerkt werden, dass Amelin im Gegensatz zu Collagen, welches immer durch das wiederholte Dreifachmotiv, Gly-X-Y, codiert wird, kein wiederholtes Dreifachmotiv enthält. Die Homologie zu Collagen IV und Amelogenin kann durch den hohen Gehalt an Prolin in beiden Proteinen bedingt sein. Es scheint folglich, dass die Amelinproteine nur gemäßigte Ähnlichkeit mit zuvor bekannten extrazellulären Proteinen, insbesondere Schmelz-Matrix-Proteinen, aufweisen.
Durch Verwendung der in der vorliegenden Anmeldung offenbarten Sequenzen wird der Fachmann in der Lage sein, die menschliche Version von Amelin zu detektieren, klonieren, sequenzieren, produzieren und zu studieren. Ein praktisches Problem ist eine Knappheit des Ausgangsmaterials, weil das günstige erhältliche Zahnmaterial der gezogene oder resezierte Zahn ist, hauptsächlich die dritten Mahlzähne oder die überflüssigen („super-numerary") Zähne. Die Ent wicklungsstufe dieser Zähne ist für gewöhnlich eine sehr späte und deshalb sind die bei der Matrixbildung beteiligten Zellen weit hinter der sekretorischen Phase oder sind nicht mehr vorhanden.
Alternativ kann das Ausgangsmaterial von erhältlichen Gewebekulturen stammen, wo die extrahierte RNA auf die Gegenwart von Amelin-Boten getestet wird. Ein positiver Northern Blot wurde im Fall von menschlichen Osteosarkomzellen (Saos 2-Zellen) erhalten, obwohl die detektierte Länge positiver RNA im Vergleich zu Ratten-Amelin-mRNAs beträchtlich kleiner ist.
Deshalb wird eine menschliche Osteosarkomzellen(Saos 2-Zellen-)cDNA-Bibliothek konstruiert, um eine oder mehrere spezifische cDNA(s) zu finden, die menschliche Versionen von Amelin oder Amelin-ähnlichen Strukturen repräsentieren würde(n). Auf eine ähnliche Weise können cDNA-Bibliotheken von den am wenigstens entwickelten Zähnen erzeugt werden und mit Ratten-Amelin-Sonden oder mit Sonden, erhalten von der Saos-2-Bibliothek, durchmustert werden.
Mit dem Ausdruck „Sequenzhomologie" ist die Sequenzidentität von Aminosäuren in Segmenten von zwei oder mehreren Aminosäuren bei der Übereinstimmung hinsichtlich Identität und Position der Aminosäuren des Polypeptids gemeint.
Der Ausdruck „homolog" ist hier verwendet, um den Grad an Identität zwischen der Aminosäuresequenz eines gegebenen Polypeptids und der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, zu illustrieren. Die mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, zu vergleichende Aminosäuresequenz kann von einer Nucleotidsequenz, wie z.B. einer DNA- oder RNA-Sequenz, z.B. erhalten durch Hybridisierung, wie im Folgenden definiert, abgeleitet werden oder kann durch gewöhnliche Aminosäure-Sequenzierverfahren erhalten werden. Der Grad an Homologie wird vorzugsweise bei der Aminosäuresequenz eines reifen Polypeptids bestimmt, d.h., ohne irgendeine Leader-Sequenz in Erwägung zu ziehen. Im Allgemeinen werden nur codierende Regionen verwendet, wenn man Nucleotidsequenzen vergleicht, um ihre interne Homologie zu bestimmen.
In einem ihrer Aspekte betrifft die Erfindung ein Nucleinsäurefragment, das ein erfindungsgemäßes Polypeptid, wie oben definiert, codiert. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Nucleinsäurefragment, das im Wesentlichen die Sequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, umfasst.
Die vorliegende Erfindung offenbart außerdem Nucleinsäurefragmente, welche mit einem Nucleinsäurefragment hybridisieren, das die Nucleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID NO: 1, oder Teile der Sequenzen, welche unter stringenten Bedingungen, z.B. 5 mM, einwertige Ionen (0,1 × SSC), neutraler pH und 65°C stabil sind, aufweist.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Analoga der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nucleotidsequenz, wobei ein Nucleotid oder Codon substituiert, insertiert, addiert oder umgeordnet worden ist.
Es ist gut bekannt, dass kleine Fragmente in PCR-Techniken, wie hierin beschrieben, verwendbar sind. Solche Fragmente und Teilsequenzen können, unter anderen Verwendungen, als Sonden bei der Identifizierung von mRNA-Fragmenten der Nucleotidsequenz der Erfindung, wie in Beispiel 4 beschrieben, verwendet werden.
Der Ausdruck „Analogon" in Bezug auf die erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragmente soll ein Nucleinsäurefragment anzeigen, welches ein Polypeptid codiert, welches dadurch funktionell ähnlich mit dem von SEQ ID NO: 2 codierten Polypeptid ist, dass das Analogon in der Lage ist, das Verankern des Polypeptids an Zelladhäsionsmoleküle, wie durch den oben beschriebenen Test gezeigt, zu ermitteln.
Es ist gut bekannt, dass dieselbe Aminosäure von verschiedenen Codonen codiert werden kann, wobei die Codon-Verwendung unter anderem mit der Präferenz des in Frage stehenden Organismus, der die Nucleotidsequenz exprimiert, in Zusammenhang steht. Folglich können ein oder mehrere Nucleotide oder Codonen des erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragments durch andere ausgetauscht werden, welche, wenn exprimiert, in einem Polypeptid resultieren, das mit dem von dem zur Frage stehenden Nucleinsäurefragment codierten Polypeptid identisch oder im Wesentlichen identisch ist.
Außerdem wird der Ausdruck „Analogon" im vorliegenden Zusmmenhang verwendet, um ein Nucleinsäurefragment anzuzeigen, das eine Aminosäuresequenz codiert, die ein Amelinähnliches Polypeptid darstellt, wobei geringfügige Variationen in den Nucleotidsequenzen erlaubt sind, welche keinen signifikanten nachteiligen Effekt auf die Fähigkeit haben, Kontakt zwischen Schmelz und Zelloberfläche zu ermitteln, was durch oben beschriebenen Test gezeigt wird.
Mit dem Ausdruck „signifikant nachteiliger Effekt" ist gemeint, dass die Aktivität des Analogons wenigstens 10%, stärker bevorzugt wenigstens 20%, noch stärker bevorzugt wenigstens 25%, wie beispielsweise wenigstens 50% der Befestigungs- oder Ablösungsaktivität von nativem Amelin, wenn wie oben beschrieben bestimmt, sein sollte. Das analoge Nucleinsäurefragment oder die analoge Nucleotidsequenz kann von einem Organismus, wie beispielsweise einem Tier oder einem Menschen abgeleitet sein oder kann teilweise oder vollständig synthetischen Ursprungs sein. Das Analogon kann außerdem durch die Verwendung rekombinanter DNA-Techniken erlangt werden.
Ferner sollen die Ausdrücke „Analogon" und „Teilsequenz" Variationen in der Sequenz zulassen, wie beispielsweise Substitution, Insertion (einschließlich Introns), Addition und Umordnung von einem oder mehreren Nucleotiden, wobei die Variationen keinen wesentlichen nachteiligen Effekt auf das Polypeptid haben, das von dem Nucleinsäurefragment oder einer Teilsequenz davon codiert wird.
Der Ausdruck „Substitution" soll das Ersetzen eines oder mehrerer Nucleotide in der vollständigen Nucleotidsequenz mit einem oder mehreren unterschiedlichen Nucleotiden bedeuten, „Addition" soll die Addition von einem oder mehreren Nucleotiden an ein beliebiges Ende der vollen Nucleotidsequenz bedeuten, „Insertion" soll das Einführen eines oder mehrerer Nuc leotide innerhalb der vollen Nucleotidsequenz bedeuten, „Deletion" soll anzeigen, dass ein oder mehrere Nucleotide aus der vollen Nucleotidsequenz deletiert worden sind, ob an einem beliebigen Ende der Sequenz oder bei einem geeigneten Punkt innerhalb der Sequenz, und „Umordnung" soll bedeuten, dass zwei oder mehrere Nucleotidreste innerhalb der Nucleinsäure- bzw. Polypeptid-Sequenz ausgetauscht worden sind. Das Nucleinsäurefragment kann jedoch, bevor oder nachdem es in den Organismus eingeführt wird, außerdem durch Mutagenese modifiziert werden.
Die Ausdrücke „Fragment", „Sequenz", „Teilsequenz" und „Analogon", wie in der vorliegenden Beschreibung und den vorliegenden Ansprüchen hinsichtlich erfindungsgemäßer Fragmente, Sequenzen, Teilsequenzen und Analoga verwendet, sollte natürlich so verstanden werden, dass es diese Phänomene in ihrer natürlichen Umgebung nicht umfasst, sondern eher, z.B. in isolierter Form, gereinigter Form, in vitro-Form oder rekombinanter Form.
In einer Ausführungsform der Erfindung kann die Detektion genetischer Mutationen und/oder Quantifizierung von Amelin-mRNA erreicht werden, indem RNA aus Zellen oder Geweben isoliert wird und in cDNA für die nachfolgende Verwendung in der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) umgewandelt wird. Der/die PCR-Primer kann/können, basierend auf einem erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragment, wie beispielsweise dem in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nucleinsäurefragment, synthetisiert werden. Dieses Verfahren zur Detektion und/oder Quantifizierung kann als ein diagnostisches Verfahren zum Diagnostizieren eines Krankheitszustands, bei welchem eine Amelin-mRNA in höheren oder niedrigeren Mengen als normal exprimiert wird, verwendet werden.
Außerdem innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung ist ein Diagnosemittel, umfassend eine Nucleotidsonde, welche in der Lage ist, ein erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragment zu detektieren, sowie ein Verfahren zum Diagnostizieren von Krankheiten, bei welchen die Expression von Amelin dereguliert ist, und/oder Krankheiten, wo das Amelingen mutiert ist, umfassend das Durchführen einer PCR-Analyse von einer Probe von einem Patienten, von dem vermutet wird, dass er eine Krankheit hat, wo eine höhere Menge an Amelinprotein als normalerweise vorliegt, oder eine mutierte Form von Amelin aufweist, bei welcher die Probe mit einem Diagnosemittel wie oben beschrieben in Kontakt gebracht wird, was einem beliebigen Nucleinsäurefragment erlaubt, amplifiziert zu werden, und Bestimmen der Gegenwart irgendwelcher identischer oder homologer Nucleinsäurefragmente in der Probe. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung außerdem ein Diagnosemittel, welches ein erfindungsgemäßes Amelin-Polypeptid umfasst.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie hergestellt werden. Eine wichtige Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Expressionssystem, das ein erfindungsgemäßes Nucleinsäurefragment umfasst. Insbesondere betrifft die Erfindung einen replizierbaren Expressionsvektor, welcher ein erfindungsgemäßes Nucleinsäurefragment trägt und fähig ist, die Expression davon zu vermitteln.
Innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung ist ein Organismus, welcher ein erfindungsgemäßes Expressionssystem trägt. Organismen, die bei diesem Aspekt der Erfindung verwendet werden können, umfassen einen Mikroorganismus, wie beispielsweise ein Bakterium der Gattung Bacillus, Escherichia oder Salmonella, eine Hefe, wie beispielsweise Saccharomyces oder Pichia, ein Protozoon oder eine Zelle, abgeleitet von einem multizellulären Organismus, wie beispielsweise ein Pilz, eine Insektenzelle, eine Pflanzenzelle, eine Säugerzelle oder eine Zelllinie. Wenn der Organismus ein Bakterium ist, ist es bevorzugt, dass das Bakterium von der Gattung Escherichia ist, z.B. E. coli. Unbeachtet des Typs des verwendeten Organismus wird das erfindungsgemäße Nucleinsäurefragment in den Organismus entweder direkt oder mittels eines geeigneten Vektors eingeführt. Alternativ können die Polypeptide in den Säugerzelllinien durch Einführen des Nucleinsäurefragments der Erfindung oder eines Analogons oder einer Teilsequenz davon, entweder direkt oder mittels eines Expressionsvektors, hergestellt werden.
Das Nucleinsäurefragment oder ein Analogon oder eine Teilsequenz davon kann außerdem in einen geeigneten stabilen Expressionsvektor kloniert werden und dann in eine geeignete Zelllinie gesetzt werden. Die Zellen, die die gewünschten Polypeptide produzieren, werden, basierend auf Produktivitätsleveln unter für den Vektor und die verwendete Zelllinie geeigneten Bedingungen ausgewählt bzw. selektiert. Die ausgewählten bzw. selektierten Zellen werden weiter kultiviert und bilden eine sehr wichtige und kontinuierliche Quelle der Polypeptide. Der Organismus, welcher für die Produktion des erfindungsgemäßen Polypeptids verwendet wird, kann außerdem ein höherer Organismus, z.B. ein Tier, sein.
Ein Beispiel eines spezifischen Analogons der erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenz ist eine DNA-Sequenz, welche die in SEQ ID NO: 1 gezeigte DNA-Sequenz oder einen Teil davon umfasst, und welche insbesondere für die Expression in E. coli angepasst ist. Diese DNA-Sequenz ist eine, welche, wenn sie zusammen mit geeigneten regulatorischen Sequenzen in E. coli eingeführt wird, in der Expression eines Polypeptids resultiert, welches im Wesentlichen die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz oder einen Teil davon aufweist. Folglich umfasst diese DNA-Sequenz spezifische Codonen, die von E. coli erkannt werden.
Im vorliegenden Kontext wird der Ausdruck „Gen" verwendet, um eine Nucleinsäuresequenz anzuzeigen, welche beim Herstellen einer Polypeptidkette beteiligt ist, und welche Regionen beinhaltet, die der codierenden Region vorangehen und folgen (5'-stromaufwärts liegende und 3'-stromabwärts liegende Sequenzen) sowie intervenierende Sequenzen, Introns, welche zwischen einzelnen codierenden Segmenten, Exons, oder in der 5'-stromaufwärts liegenden oder 3'-stromabwärts liegenden Region platziert sind, beinhaltet. Die 5'-stromaufwärts liegende Region umfasst eine regulatorische Sequenz, welche die Expression des Gens kontrolliert, typischerweise einen Promotor. Die 3'-stromabwärts liegende Region umfasst Sequenzen, welche bei der Transkriptionstermination des Gens beteiligt sind, und gegebenenfalls Sequenzen, die für Polyadenylierung des Transkripts und der 3'-nicht-translatierten Region verantwortlich sind. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Expressionssystem, das ein Nucleinsäurefragment, wie oben beschrieben, umfasst, das ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, wobei das System eine 5'-flankierende Sequenz umfasst, die in der Lage ist, die Expression des Nucleinsäurefragments zu vermitteln.
Die Erfindung betrifft weiterhin einen Plasmidvektor, der eine Nucleinsäuresequenz enthält, die für ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder ein hierin definiertes Fusions-Polypeptid codiert. In einer besonders wichtigen Ausführungsform kann das Nucleinsäurefragment der Erfindung oder ein Analogon oder eine Teilsequenz davon oder ein Fusions-Nucleinsäurefragment der Erfindung, wie hierin definiert, von einem replizierbaren Expressionsvektor getragen werden, welcher in der Lage ist, in einem Wirtsorganismus oder in einer Zelllinie zu replizieren.
Der Vektor kann insbesondere ein Plasmid, Phage, Cosmid, Mini-Chromosom oder Virus sein. In einer interessanten Ausführungsform der Erfindung kann der Vektor ein Vektor sein, welcher, wenn er in eine Wirtszelle eingeführt ist, in das Wirtszellgenom integriert wird.
In einem speziellen Aspekt der Erfindung kann das erfindungsgemäße Nucleinsäurefragment ein weiteres Nucleinsäurefragment umfassen, das ein Polypeptid codiert, das unterschiedlich zu oder identisch mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid ist, und das im Leserahmen an ein Nucleinsäurefragment der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz oder Analoga davon, die ein Amelin-Polypeptid codieren, mit dem Zweck, ein fusioniertes Polypeptid zu produzieren, fusioniert ist. Wenn rekombinante DNA-Technologie verwendet wird, können die fusionierten Nucleinsäuresequenzen in einen geeigneten Vektor oder ein geeignetes Genom eingeführt werden. Alternativ wird eines der Nucleinsäurefragmente in den Vektor oder das Genom eingeführt, welcher/welches schon das andere Nucleinsäurefragment enthält. Ein Fusions-Polypeptid kann außerdem hergestellt werden, indem die zwei Nucleinsäurefragmente getrennt eingeführt werden und man der Expression erlaubt, aufzutreten. Der Wirtsorganismus, welcher eukaryotischen oder prokaryotischen Ursprungs sein kann, wird unter Bedingungen kultiviert, die Expression der fusionierten Sequenzen gewährleisten. Das fusionierte Polypeptid wird dann gereinigt und das erfindungsgemäße Polypeptid von seinem Fusionspartner unter Verwendung eines geeigneten Verfahrens getrennt.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft folglich ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, das die folgenden Schritte umfasst:

(a) Einfügen eines erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragments in einen Expressionsvektor,
(b) Transformieren eines geeigneten Wirtsorganismus mit dem in Schritt (a) hergestellten Vektor,
(c) Kultivieren des in Schritt (b) hergestellten Wirtsorganismus unter für das Exprimieren des Polypeptids geeigneten Bedingungen,
(d) Ernten des Polypeptids und
(e) gegebenenfalls Unterwerfen des Polypeptids einer post-translationalen Modifikation.

Innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Verfahren, wie oben beschrieben, wobei das produzierte Polypeptid mittels eines Verfahrens isoliert wird, das einen oder mehrere Schritte, wie Affinitätschromatographie, unter Verwendung von immobilisiertem Amelin-Polypeptid oder Antikörpern, die mit dem Polypeptid reaktiv sind, und/oder andere chromatographische und elektrophoretische Verfahren umfasst.
Das wie oben hergestellte Polypeptid kann post-translationalen Modifikationen als Ergebnis thermischer Behandlung, chemischer Behandlung (Formaldehyd, Glutaraldehyd etc.) oder Enzymbehandlung (Peptidasen, Proteinasen und Protein-Modifizierungsenzyme) unterzogen werden. Das Polypeptid kann im Vergleich zu seiner natürlichen Produktionsumgebung auf eine unterschiedliche Weise prozessiert werden, wenn es in einem Organismus produziert wird. Als ein Beispiel wird oft Glykosylierung erreicht, wenn das Polypeptid von einer Zelle eines höheren Organismus, wie beispielsweise Hefe, oder vorzugsweise ein Säuger exprimiert wird. Man findet Glykosylierung normalerweise im Zusammenhang mit Aminosäureresten Asn, Ser, Thr oder Hydroxylysin. Es kann oder kann nicht vorteilhaft sein, die Prozessierungscharakteristika, die von dem besagten Wirtsorganismus verursacht werden, zu entfernen oder zu verändern.
Im Anschluss an die erfindungsgemäße Expression des Polypeptids in einem Organismus oder einer Zelllinie kann das Polypeptid entweder als solches verwendet werden oder es kann zuerst aus dem Organismus oder aus der Zelllinie gereinigt werden. Wenn das Polypeptid als ein sezerniertes Produkt exprimiert wird, kann es direkt gereinigt werden. Wenn das Polypeptid als ein assoziiertes Produkt exprimiert wird, kann es die partielle oder vollständige Aufspaltung des Wirts vor der Reinigung erfordern. Beispiele von Verfahren, die für die Reinigung von Polypeptiden eingesetzt werden, sind: (i) Immunopräzipitation oder Affinitätschromatographie mit Antikörpern, (ii) Affinitätschromatographie mit einem geeigneten Liganden, (iii) andere Chromatographieverfahren, wie z.B. Gelfiltration, Ionenaustausch oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie oder Derivate irgendwelcher der oben stehenden, (iv) elektrophoretische Verfahren, wie Polyacrylamidgelelektrophorese, denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese, Agarosegelelektrophorese und isoelektrische Fokussierung, (v) beliebige andere spezifische Solubilisierungs- und/oder Reinigungs-Techniken.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein im Wesentlichen reines Amelin-Polypeptid. Im vorliegenden Kontext soll der Ausdruck „im Wesentlichen rein" so verstanden werden, dass er bedeutet, dass das besagte Polypeptid im Wesentlichen frei von anderen Komponenten, z.B. anderen Polypeptiden oder Kohlehydraten, ist, welche aus der Produktion und/oder Gewinnung des Polypeptids stammen können, oder in anderer Weise zusammen mit dem Polypeptid gefunden werden können. Die Reinheit eines Proteins kann beispielsweise mittels SDS-Gelelektrophorese bewertet werden.
Eine hohe Reinheit des erfindungsgemäßen Polypeptids kann vorteilhaft sein, wenn das Polypeptid in einer Zusammensetzung verwendet werden soll. Außerdem, bedingt durch seine hohe Reinheit, kann das im Wesentlichen reine Polypeptid für die meisten Zwecke in einer niedrigeren Menge als das Polypeptid einer konventionell niedrigeren Reinheit verwendet werden.
In einem Aspekt der Erfindung kann das Polypeptid von einer geeigneten Zelllinie erhalten werden, welche ein erfindungsgemäßes Polypeptid exprimiert. Außerdem kann ein erfindungsgemäßes Polypeptid durch die gut bekannten Verfahren der Flüssig- oder Festphasen-Peptidsynthese unter Benutzung des sukzessiven Koppelns der einzelnen Aminosäuren der Polypeptidsequenz hergestellt werden. Alternativ kann das Polypeptid durch das Koppeln einzelner Aminosäuren, die Fragmente der Polypeptidsequenz bilden, synthetisiert werden, welche später gekoppelt werden, um in dem gewünschten Polypeptid zu resultieren. Diese Verfahren stellen folglich einen anderen interessanten Aspekt der Erfindung dar.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention von Paradontalerkrankung, wobei das Verfahren Verabreichen einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptids an einen Patienten mit Bedarf davon umfasst. Es wird erwogen, dass das erfindungsgemäße Polypeptid bei der Zementbildung mitwirken wird und folglich das Verankern des Periodontal-Ligaments verbessern wird.
Die Verwendung von Amelinprotein im Zusammenhang künstlicher lokaler Knochenbildung wird durch die Gegenwart von Amelin-RNA-Sequenzen in knochenbildenden Zellen angezeigt: Eine Größenvariante der Amelin-RNA, die die oben definierten Kriterien erfüllt, wurde in Knochengewebe aus Ratten-Femur sowie -Calvaria durch Northern Blots entdeckt. In situ-Hybridisierung mit Amelinsonden lokalisierte diese RNA an Osteoblasten in Verbindung mit wachsendem Knochen. Außerdem exprimierten Ratten-Calvaria-Zellen, welche in Gewebekultur Knochen bilden, die Knochenvariante von Amelin-RNA während der Knochenbildungsperiode (C. Brandsten, C. Christersson und T. Wurtz, unveröffentlicht).
Die Gegenwart von Amelin-RNA-Sequenzen in natürlichen und experimentellen knochenbildenden Systemen zeigt eine Rolle des Amelinproteins bei der Knochenbildung an. Es ist denkbar, dass extern zugegebene Amelinpeptide die Knochenbildung sowohl in vitro als auch in medizinischen Anwendungen beschleunigen oder modulieren.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Reparatur einer Läsion in einem Zahn, wobei das Verfahren das Verabreichen einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptids in Kombination mit geeignetem Füllmaterial an einen Patienten, der dessen bedarf, umfasst.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Verbinden zweier Knochenelemente und ein Verfahren, ein Implantat effizient in einen Knochen zu inkorporieren. In diesem Zusammenhang kann das Polypeptid zusammen mit einem Carrier bzw. Träger, wie im Detail unten beschrieben, verabreicht werden. Außerdem könnte das erfindungsgemäße Polypeptid in einem Verfahren zum Fördern oder Hervorrufen der Mineralisation von hartem Gewebe, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Knochen, Schmelz, Dentin und Zement, verwendet werden.
Ferner betrifft die Erfindung außerdem ein Verfahren zum Verbessern der Biokompatibilität einer Implantatvorrichtung oder einer transkutanen Vorrichtung, z.B. auf eine ähnliche Weise wie in US 4,578,079 beschrieben, wobei das Verfahren das Beschichten der Implantatvorrichtung mit einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptids umfasst, wodurch z.B. Muskel- oder Ligament-Befestigung an das Implantat ermöglicht wird.
Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Verankern von Epithel an einer Hartgewebeoberfläche, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Schmelz, Dentin oder Zement, in Verbindung mit einem Zahnimplantat, durch Verabreichen des erfindungsgemäßen Polypeptids. Überdies betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Verhindern von Epithelwachstum in Verbindung mit Zahnimplantation, wobei das Verfahren das Verabreichen einer prophylaktisch wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptids an einen Patienten, der dessen bedarf, umfasst, wodurch z.B. verhindert wird, dass Epithel in das Periodontal-Ligament wächst.
Ein sehr wichtiger Aspekt der Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, umfassend ein Amelin-Polypeptid und ein physiologisch annehmbares Exzipiens. Die Zusammensetzung kann ein gereinigtes rekombinantes Polypeptid der Erfindung umfassen. Insbesondere, jedoch nicht ausschließlich, betrifft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, geeignet für topische Applikation, z.B. Applikation auf die Mucosaoberflächen des Mundes.
Erfindungsgemäße Zusammensetzungen, die für topische Verabreichung geeignet sind, können Einreibemittel, Gele, Lösungen, Suspensionen, Pasten, Sprays, Puder, Zahnpasten und Mundwasser sein.
Die vorliegende Erfindung umfasst eine Zahnpasta, hergestellt durch Vermischen des erfindungsgemäßen Polypeptids mit einer Zahnpastazubereitung, z.B. von der Art, die gewöhnlich als kommerzielle Zahnpasten erhältlich sind, welche auf einer regulären Basis für die Prävention von z.B. Periodontitis verwendet werden kann.
Eine Zahnpasta wird gewöhnlich Poliermittel, oberflächenaktive Substanzen, Geliermittel und andere Exzipientien, wie beispielsweise Aromastoffe und Färbemittel, enthalten. Das Poliermittel kann ausgewählt sein aus jenen, welche gegenwärtig zu diesem Zweck in Dentalzubereitungen eingesetzt werden. Geeignete Beispiele sind wasserunlösliches Natrium- oder Kaliummetaphosphat, hydriertes oder wasserfreies Dicalciumphosphat, Calciumpyrophosphat, Zirkoniumsilicat oder Gemische davon. Insbesondere nützliche Poliermittel sind verschiedene Formen von Siliciumdioxid. Das Poliermittel ist im Allgemeinen fein verteilt, mit einer Teilchengröße kleiner als 10 μm, beispielsweise 2–6 μm. Das Poliermittel kann in einer Menge von 10–99 Gew.-% der Zahnpasta eingesetzt werden. Typischerweise werden die Zahnpastazubereitungen 20–75% des Poliermittels enthalten.
Ein geeigneter oberflächenaktiver Stoff ist normalerweise in den Zahnpastazubereitungen enthalten. Das oberflächenaktive Mittel ist typischerweise ein wasserlösliches synthetisches or ganisches Nicht-Seifen-Detergens. Geeignete Detergentien sind die wasserlöslichen Salze von: höheren Fettsäure-Monoglycerid-Monosulfaten (beispielsweise hydriertes Kokosnussfettsäure-Monoglycerid-Natriummonosulfat); höheren Alkylsulfaten (beispielsweise Natriumlaurylsulfat); Alkylarylsulfonaten (beispielsweise Natriumdodecylbenzolsulfonate); und höheren Alkylsulfoacetaten (beispielsweise Natriumlaurylsulfoacetat). Zusätzlich können gesättigte höher aliphatische Acylamide von niederaliphatischen Aminocarbonsäuren eingesetzt werden, die 12–16 Kohlenstoffatome im Acylrest aufweisen, und bei welchen der Aminosäureanteil abgeleitet ist von den niederaliphatischen Monoaminocarbonsäuren, die 2–6 Kohlenstoffatome aufweisen, wie beispielsweise Fettsäureamide von Glycin, Sarcosin, Alanin, 3-Aminopropanolsäure und Valin, insbesondere die N-Lauryl-, Myristoyl- und Palmitoylsarcosinat-Verbindungen. Konventionelle nichtionische oberflächenaktive Stoffe können außerdem, wenn gewünscht, mit eingeschlossen werden.
Die oberflächenaktiven Materialien sind im Allgemeinen in einer Menge von etwa 0,05–10 Gew.-%, typischerweise etwa 0,5–5 Gew.-%, der Zahnpastazubereitung vorhanden.
Typischerweise werden die Flüssigkeiten der Zahnpasta hauptsächlich Wasser, Glycerin, Sorbitol, Propylenglykol oder Gemische davon umfassen. Ein vorteilhaftes Gemisch ist Wasser und Glycerin, vorzugsweise mit Sorbitol. Ein Geliermittel, wie z.B. natürliche und synthetische Gummi und gummiähnliche Materialien, z.B. Irish Moss oder Natriumcarboxymethylcellulose, können verwendet werden. Andere Gummis, welche verwendet werden können, sind Tragantgummi, Polyvinylpyrrolidon und Stärke. Sie werden gewöhnlich in einer Menge bis etwa 10 Gew.-%, typischerweise etwa 0,5–5 Gew.-%, der Zahnpasta verwendet.
Der pH einer Zahnpasta ist im Wesentlichen neutral, wie beispielsweise ein pH von etwa 6–8. Wenn erforderlich, kann eine geringe Menge eines pH-regulierenden Mittels, z.B. eine geringe Menge einer Säure, wie beispielsweise Citronensäure, oder eines alkalischen Materials zugesetzt werden.
Die Zahnpasta kann außerdem andere Materialien, wie beispielsweise lösliches Saccharin, Aromaöle (z.B. Öle aus grüner Minze, Pfefferminze, Wintergrün), Färbemittel oder Weißmacher (z.B. Titandioxid), Konservierungsstoffe (z.B. Natriumbenzoat), Emulgatoren, Silikone, Alkohol, Menthol und Chlorophyllverbindungen (z.B. Natriumkupferchlorophyllin) enthalten.
Der Gehalt des erfindungsgemäßen Polypeptids in der Zahnpasta der obigen Art oder der unterhalb diskutierten Arten wird normalerweise in einem Bereich von 1–20 Gew.-%, berechnet am Gewicht der gesamten Zahnpastazusammensetzung, wie beispielsweise im Bereich von 5–20 Gew.-%, insbesondere etwa 10–20 Gew.-%, wie beispielsweise 12–18 Gew.-%, sein. Die letzteren Bereiche sind insbesondere für Zahnpasten angezeigt, welche für die Behandlung von Gingivitis und Paradontose verwendet werden. Es ist jedoch außerdem interessant, Zahnpasten bereitzustellen, die einen niedrigeren Gehalt des erfindungsgemäßen Polypeptids aufweisen, welche oft hauptsächlich an präventive oder prophylaktische Zwecke angepasst sein werden. Für solche Zwecke können Polypeptidgehaltsbereiche von etwa 0,1 bis etwa 5 Gew.-% interessant sein.
Eine spezielle Art von Zahnpasta sind Zahnpasten, welche im Wesentlichen klare Gele sind. Solche Zahnpasten können entweder überhaupt keine Poliermittel enthalten oder können das Poliermittel in so fein verteilter Form enthalten, dass die Gele nach wie vor im Wesentlichen klar erscheinen werden. Solche Gel-Zahnpastaarten können entweder per se verwendet werden oder können mit Zahnpasten kombiniert werden, die Poliermittel, wie oben diskutiert, enthalten.
Die Inkorporation des erfindungsgemäßen Polypeptids in eine Zahnpastazubereitung und andere Dental- oder Oral-Zubereitungen kann auf viele unterschiedliche Weisen durchgeführt werden. Oft wird es bevorzugt sein, eine Suspension des erfindungsgemäßen Polypeptids zu bilden und die Amelinsuspension mit den anderen Zubereitungsbestandteilen in Pastenform zu kombinieren. Alternativ kann trockenes Amelinpulver mit den anderen Zubereitungskomponenten vermischt werden, entweder zuerst mit den trockenen Zubereitungsbestandteilen und anschließend mit flüssigen oder halbflüssigen Zubereitungsbestandteilen, oder Amelinpulver kann per se in eine ansonsten fertig gestellte Zubereitung inkorporiert werden. Im Allgemeinen ist es bevorzugt, dass das Amelinpulver zusammen mit dem Poliermaterial oder Zahnputzmittel zugegeben wird.
Während die Inkorporation von Amelin oder anderen wasserunlöslichen oder schwer wasserlöslichen Polypeptidanaloga am besten durchgeführt wird, indem man die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Polypeptids in Erwägung zieht, werden Überlegungen bei Zahnpasten oder Zahnputzmittel oder anderen Zubereitungen, die hierin diskutiert sind, normalerweise extrem einfach sein und werden für gewöhnlich in der Zugabe des Amelin-Polypeptids zu der Zubereitung oder zu Bestandteilen davon in entweder trockener gelöster oder suspendierter Form bestehen.
Die topische Verabreichung kann eine Verabreichung auf oder nahe an die Teile des Körpers sein, die die pathologischen Veränderungen präsentieren, z.B. auf einen äußeren Teil des Körpers, wie beispielsweise eine Mucosaoberfläche des Mundes. Die Applikation kann ein einfaches Aufschmieren der Zusammensetzung sein oder sie kann eine beliebige Vorrichtung involvieren, die zum Verstärken der Kontaktetablierung zwischen der Zusammensetzung und den pathologischen Läsionen geeignet ist. Die Zusammensetzungen können imprägniert werden in oder verteilt werden auf Pads, Pflastern, Bändern, Gaze, Schwammmaterialien, Baumwollstücken etc. Gegebenenfalls kann eine Form der Injektion der Zusammensetzung in die oder nahe der Läsionen eingesetzt werden.
Die topischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können 1–80 Gew.-% der aktiven Verbindung, basierend auf dem Gesamtgewicht der Zubereitungen, wie beispielsweise 0,001–25% Gew./Gew. der aktiven Verbindungen, z.B. 0,1–10%, 0,5–5% oder 2–5%, umfassen. Mehr als eine aktive Verbindung kann in die Zusammensetzung inkorporiert werden; d.h. Zusammensetzungen, die Amelinprotein in Kombination mit anderen pharmazeutischen Verbindungen umfassen, sind auch innerhalb des Umfangs der Erfindung. Die Zusammenset zung wird zweckmäßig 1–10 mal am Tag appliziert, abhängig von der Art, dem Schweregrad und der Lokalisierung der Läsionen.
Zur topischen Applikation kann die Zubereitung in Übereinstimmung mit konventioneller pharmazeutischer Praxis formuliert werden, z.B. mit pharmazeutisch annehmbaren Exzipientien, die konventionell für topische Applikationen im Mund verwendet werden. Die Art des in der Zubereitung irgendeiner speziellen Zusammensetzung eingesetzten Vehikels wird von dem für die Verabreichung dieser Zusammensetzung beabsichtigten Verfahren abhängen. Andere Vehikel als Wasser, die in Zusammensetzungen verwendet werden können, können Feststoffe oder Flüssigkeiten, wie beispielsweise Weichmacher, Lösungsmittel, Befeuchtungsmittel, Verdickungsmittel und Pulver einschließen. Es wird erwogen, dass die erfindungsgemäße Zusammensetzung nur aus dem Polypeptid, gegebenenfalls in Mischung mit Wasser, bestehen kann, jedoch kann die Zusammensetzung das Polypeptid auch in Kombination mit einem Carrier, Diluens oder einem Bindemittel, wie beispielsweise Cellulosepolymeren, Agar, Alginat oder Gelatine, enthalten, welches für den zur Frage stehenden Zweck annehmbar ist. Für Dentalverwendung ist es günstig, dass der Carrier oder das Diluens dental annehmbar ist. Es ist derzeit bevorzugt, einen Carrier zu verwenden, der wasserlösliche Polymere umfasst. Nicht-begrenzende Beispiele solcher Polymere sind Natriumcarboxycellulose, mikrokristalline Cellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Methylcellulose, hochmolekulare Polyacrylsäure, Natriumalginat, Propylenglykolalginat, Xanthangummi, Guargummi, Johannisbrotkernmehl, modifizierte Stärke, Gelatine, Pectin oder Kombinationen davon. Nach Inkorporation der aktiven Proteinfraktion können diese wasserlöslichen Polymere gegebenenfalls in Gele oder Filme umgewandelt werden, was in Zusammensetzungen resultiert, welche angesichts ihrer vorteilhaften physikalischen Eigenschaften leicht zu applizieren sind. Die Zusammensetzung kann gegebenenfalls Stabilisatoren oder Konservierungsstoffe mit dem Zweck, die Lagerungsstabilität zu verbessern, enthalten. Ein geeignetes Exzipiens wird ein Alginat, z.B. wie in EP 337967 beschrieben, sein.
Für topische Applikation kann der pH der Zusammensetzung im Prinzip innerhalb eines sehr breiten Bereichs, wie beispielsweise 3–9, sein. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist ein pH von etwa 4 bis 8 bevorzugt. Konventionelle Puffermittel, wie oben beschrieben, können verwendet werden, um den gewünschten pH zu erhalten.
Die Zubereitung der Erfindung kann außerdem andere Additive enthalten, wie beispielsweise Stabilisatoren, Konservierungsstoffe, Lösungsvermittler, Chelatbildner, gelbildende Mittel, pH-Regulatoren, Antioxidantien etc. Weiterhin kann es vorteilhaft sein, Zubereitungen mit modifizierter Freisetzung bereitzustellen, bei welchen die aktive Verbindung in eine Polymermatrix oder Nanopartikel oder Liposomen oder Micellen inkorporiert ist, oder an Ionenaustauscherharzen adsorbiert ist, oder von einem Polymer getragen wird.
Zusammensetzungen können gemäß konventioneller pharmazeutischer Praxis formuliert werden und können sein:
Halbfeste Formulierungen: Gele, Pasten, Gemische.
Flüssige Formulierungen: Lösungen, Suspensionen, „Drenches", Emulsionen.
Wie angezeigt, kann eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ein erfindungsgemäßes Polypeptid selbst oder ein funktionelles Derivat davon oder eine Kombination solcher Verbindungen umfassen. Beispiele geeigneter funktioneller Derivate schließen pharmazeutisch annehmbare Salze, insbesondere jene, die zur Verwendung in einer oralen Umgebung geeignet sind, ein. Beispiele schließen pharmazeutisch annehmbare Salze der Aminofunktion, beispielsweise Salze mit Säuren, die Anionen ergeben, welche, insbesondere in einer oralen Umgebung, pharmazeutisch annehmbar sind. Beispiele schließen Phosphate, Sulfate, Nitrat, Iodid, Bromid, Chlorid, Borat sowie Anionen, abgeleitet von Carbonsäuren einschließlich Acetat, Benzoat, Stearat etc., ein. Andere Derivate der Aminofunktion schließen Amide, Imide, Harnstoffe, Carbamate etc. ein.
Andere geeignete Derivate schließen Derivate der Carboxylgruppe eines erfindungsgemäßen Polypeptids ein, einschließlich Salze, Ester und Amide. Beispiele schließen Salze mit pharmazeutisch annehmbaren Kationen, z.B. Lithium, Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, Zink, Aluminium, Eisen(III), Eisen(II), Ammonium und Niedrig(C_1-6)alkylammoniumsalze ein. Ester schließen Niedrigalkylester ein.
Die Erfindung wird mittels einer Anzahl von Arbeitsbeispielen weiter beschrieben werden, welche nicht als für den Umfang dieser Anmeldung limitierend ausgelegt werden sollten.
Konventionelle Verfahren und Kits wurden verwendet, wenn nichts anderes angegeben ist. Die Kits wurden gemäß der vom jeweiligen Lieferanten gegebenen Instruktionen verwendet. Methodologische Schritte sowie Reagentien, welche hier nicht beschrieben oder erwähnt sind, sind erklärt in: Current Protocols in Molecular Biology, von F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith und K. Struhl; John Wiley, New York (1994).
LEGENDE ZU DEN FIGUREN
1: Lokalisierung von RNA-Sequenzen in wachsenden ersten Mahlzähnen. Oberkiefer von 4 Tage alten Ratten wurden präpariert, fixiert und in Paraffin eingebettet. Distal-mesiale Schnitte durch die Mahlzähne wurden in situ-Hybridisierung unter Verwendung von DIG-markierter RNA, komplementär zu RNA-Sequenzen, hergestellt durch in vitro-Transkription von Bluescript-Plasmiden, unterzogen. 1a: Amelin, 1b: Amelogenin, 1c: Typ I-Collagen.
2: Sequenz von Amelinen 1 und 2. Einige überlappende Sequenzen von beiden Varianten wurden bestimmt und vergleichend angeordnet. Identische Sequenzen sind „face to face" gedruckt. Punkte zeigen Abwesenheit der korrespondierenden Sequenzen von der jeweiligen Variante an. Die längsten offenen Leserahmen sind durch Aminosäurenamen im Ein-Buchstaben-Code skizziert. Der Abschnitt mit zwei codierenden Leserahmen ist schattiert (Nucleotide 390–403). Unterstrichen sind komplementäre Sequenzen (Nucleotide 248–272 und 414–430) zu den Oligos, welche verwendet wurden, um nach Klonen, die die zwei Varianten enthalten, zu durchmustern. Kasten zeigen Konsensus-Sequenzen für Domänen an, die mit Zelloberflä chenproteinen wechselwirken. Das mutmaßliche Adenylierungssignal ist doppelt unterstrichen (Nucleotide 1892–1897).
3: Northern Blot-Analyse von RNA aus Ratten-Mahlzähnen. Die ersten Mahlzähne wurden aus vier Tage alten Ratten präpariert. RNA wurde isoliert. Vier mg pro Spur wurden in einem Agaroseformaldehydgel einer Elektrophorese unterzogen und auf eine Nylonmembran übertragen. Individuelle Spuren wurden an DIG-markierte Amelin (a)- und Amelogenin (b)- Ribosonden hybridisiert. Die Positionen definierter RNA-Fragmente (Gibco BRL) mit ihrer Länge in kb sind am linken Rand angezeigt.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Isolierung von RNA
Drei präparierte wachsende Mahlzähne von 4 Tage- oder 7 Tage-alten Sprague-Dawley-Ratten (B&K Universal, Sollentuna, Schweden) wurden in einem Glas-Glas-Homogenisator in 500 l 4 M Guanidiniumisothiocyanat, 80 mM EDTA (Chomczynski & Sacchi, 1987) unter Verwendung eines kommerziellen Kits (Promega Biotech, RNAgents, Total RNA Isolation System) homogenisiert. Dies wurde von Phenol-Chloroform-Extraktion und zwei Isopropanol-Präzipitationen gefolgt. RNA wurde in 0,2 × SET-Puffer (0,2% Natriumdodecylsulfat, 4 mM Tris-Cl pH 7,5, 2 mM EDTA) gelöst und die Konzentration wurde durch optische Dichtemessungen bestimmt.
BEISPIEL 2
Herstellung von cDNA-Bibliothek
Poly-A-enthaltende RNA (mRNA) wurde mit Hilfe von Oligo-dT, gebunden an Silicatharz (Quiagen Oligotex mRNA Midi Kit) selektiert. Umkehrtranskription wurde am Poly-A-Ende geprimt und doppelsträngige methylierte cDNA wurde in lambda-ZAP-Vektorarme ligiert und in Phagenpartikel verpackt (Stratagene ZAP-cDNA Cloning Kit). Nach Amplifikation und Plattieren wurden Phagenstämme, die häufig exprimierte Sequenzen enthielten, durch Hybridisierung mit einer DIG-markierten Gesamt-cDNA selektiert (siehe unten). Phagen von positiven Plaques wurden isoliert und durch Superinfektion von lambda-ZAP-infizierten Escherichia coli-SOLR-Zellen mit ExAssist-Helferphage in Plasmide umgewandelt. Um eine bessere Repräsentanz der 5'-Enden zu erhalten, wurde außerdem eine Bibliothek mit einer cDNA konstruiert und an Zufallsstellen geprimt (Stratagene Random Unidirectional Linker-Primer). Inserts, die positive in situ-Hybridisierungssignale auf Matrix-bildenden Zellen haben, wurden unter Verwendung von Zyklus-Sequenzieren mit Taq-Polymerase, fluoreszenten Terminatoren und einem semiautomatischen Sequenz-Detektions-System (Applied Biosystems, Tay DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit) sequenziert. Sequenzen wurden mit dem „Wisconsin programm set" (Genetics Computer Group, Inc.) und mit DNAid (Frederic Dardel, [email protected]) analysiert.
BEISPIEL 3
Bibliotheks-Durchmustern
Lambda-Phagen einer Zahn-cDNA-Bibliothek (2 × 10⁶ Klone) aus ersten und zweiten Mahlzähnen sieben Tage alter Ratten wurden plattiert und Plaques wurden an Nitrocellulosemembranen (Schleicher und Schüll) adsorbiert. Replika-Filter wurden an 10 ng/ml cDNA oder an Collagen- und Amelogenin-Oligonucleotide hybridisiert. Die Hybridisierung wurde 15 Stunden lang bei 54°C durchgeführt und die Filter wurden gewaschen und entwickelt (Boehringer Mannheim, The DIG System). Phagen, die Amelogenin, Collagen oder verbleibende, häufig exprimierte Sequenzen enthielten, wurden zweimal re-kloniert („re-cloned") und in Bluescript-Plasmide durch in vivo-Exzision, erreicht durch Superinfektion mit dem ExAssist-Helferphagen (Stratagen) umgewandelt.
BEISPIEL 4
Herstellung von Sonden für Hybridisierungsassays
cDNA-Sonden für das Durchmustern einer Bibliothek wurden aus Poly-A-angereicherter RNA mit Umkehrtranskriptase (Promega Biotech, Reverse Transcription System) hergestellt. Dabei wurde eine Nucleotidkonzentration von 0,25 mM, supplementiert mit Digoxygenin (DIG)-dUTP (Boehringer Mannheim) zu 0,1 mM.
Zu den mRNA-Sequenzen komplementäre RNA-Sonden wurden durch in vitro-Transkription mittels Phagen T7- oder T3-RNA-Polymerase (Promega Riboprobe Gemini II Core System, Melton et al., 1984) in Gegenwart von DIG-modifiziertem UTP (Boehringer Mannheim) synthetisiert. Die DNA-Matrizen, die Amelin (1700 bp) enthielten, waren Bluescript-Plasmide, abgeleitet von λ-Bakteriophagen durch in vivo-Exzision. Des Weiteren wurden Amelogenin (700 bp)- und Typ I-Collagen (850 bp)-Sequenzen durch Restriktionsenzymspaltung von Bluescript SK-Plasmiden erhalten. Sonden für quantitative RNA-Bestimmungen wurden mit [³⁵S] anstelle von DIG markiert.
Das Collagen-spezifische Oligonucleotid hatte die Sequenz 5'-CATGTAGGCAATGCTGTTCTT GCAGTGGTAGGTGATGTTCTGGGAGGC-3' (Yamada et al., 1983) und das Amelogenin-spezifische Oligonucleotid war 5'-ATCCACTTCTTCCCGCTTGGTCTTGTCTGTCGCTGGCCAAGCTTC-3' (Lau et al., 1992). Sonden wurden durch 3'-Markieren durch DIG-modifizierten ddUTP durch einer terminale Transferase-Reaktion gemäß einem Boehringer-Protokoll hergestellt.
BEISPIEL 5
Northern Blotting
Für Northern Blot-Analyse wurden 15 mg Gesamt-RNA pro Vertiefung von 2 cm Breite in Gegenwart von 50% Formamid hitzedenaturiert und in einem Agarosegel mit 2,2 M Formaldehyd, 0,02 M N-Morpholinopropansulfonsäure, 0,05 M Natriumacetat, 1 mM EDTA (Lehrach et al., 1977) einer Elektrophorese unterzogen. RNA wurde über Nacht in 20 × SSC (3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat) auf eine Nylonmembran (Pall Biodyne B Transfer Membrane) transferiert.
Die Membranen wurden mit UV-Licht quervernetzt und in Streifen geschnitten. Einzelne Streifen wurden 1 Stunde lang bei 68°C in 50% Formamid, 5 × SSC, 2% Blocking-Reagens (Boehringer Mannheim), 0,1% N-Lauroylsarcosin, 0,02% Natriumdodecylsulfat (SDS) prähybridisiert und anschließend über Nacht unter denselben Bedingungen, folgend auf die Zugabe der DIG-markierten cRNA-Sonde zu 100 ng/ml, hybridisiert. Membranen wurden dann zweimal 2 mal für 5 Minuten mit 2 × SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur und 2 mal 15 Minuten lang bei 68°C mit 0,1 × SSC, 0,1% SDS, gewaschen. Die Anwesenheit von DIG-markierter RNA wurde via Phosphatase-gekoppelten Anti-DIG-Antikörperfragmenten (Boehringer Mannheim, The DIG System) entwickelt.
BEISPIEL 6
Lösungshybridisierung
RNA von präparierten Mahlzähnen wurde an ³⁵S-UTP-markierte komplementäre RNA-Sonden im Überschuss hybridisiert (Mathews et al., 1989). Reaktionen von 40 l 0,6 M NaCl, 4 mM EDTA, 10 mM Dithiothreitol (DTT), 0,1% SDS, 30 mM Tris-HCl, pH 7,5 und 25% (Vol./Vol.) Formamid enthielten 20000 cpm Sonde und unterschiedliche Mengen an Gesamt-RNA. Das Gemisch wurde mit Paraffinöl bedeckt, über Nacht bei 70°C inkubiert, mit 1 ml RNAase-Lösung (40 g RNase A, 2 g RNase T1, Boehringer-Mannheim, 100 g Lachssonden-DNA, Sigma Chemical Co.) verdünnt und 1 Stunde lang bei 37°C verdaut. RNAse-resistente doppelsträngige RNA wurde durch 100 l Trichloressigsäure (6 M) präzipitiert, auf Glasfaserfiltern (Whatman GF/C) gesammelt und in einem Wallac 1409-Flüssigszintillationszähler analysiert. Standardkurven, wo die Sonden an bekannte Konzentrationen von in vitro synthetisierten mRNA-Sequenzen hybridisiert wurden, wurden verwendet, um die Radioaktivität mit der Menge an hybridisierenden Sequenzen in der Test-RNA in Beziehung zu setzen.
BEISPIEL 7
In situ-Hybridisierung
Oberkiefer von Sprague-Dawley-Ratten im Alter von vier Tagen wurden mit 4% Paraformaldehyd in PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄, 1,4 mM KH₂PO₄) 24 Stunden lang bei 4°C fixiert, dehydratisiert und in Paraffin eingebettet. Schnitte von 7 μm Dicke wurden auf Vectabond-beschichteten (Vektor) Objektträgern befestigt. Nach dem Entfernen des Paraffins mit Xylol wurden die Proben mit Proteinase K (20 μg/m1) 30 Minuten lang bei 37°C behandelt, mit 4% Formaldehyd 5 Minuten lang nach-fixiert, mit Triethanolamin und Acetanhydrid (2,66 ml Triethanolamin in 200 ml Wasser; 0,5 ml Acetanhydrid wurde zusammen mit den Objektträgern zugegeben) behandelt und in 2 × SSC, 50% Formamid 60 Minuten lang bei 42°C eingetaucht. Die Proben wurden mit 20 μl 0,3 M NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 8,0, 1 mM EDTA, Denhardt-Reagens (Watkins, 1994), 0,1 g/l Dextransulfat, 50% Formamid, enthaltend 0,5 ng/μl RNA-Sonde, überschichtet. Die Proben wurden mit einem Deckgläschen bedeckt und die Objektträger wurden in einer feuchten Kammer bei 42°C über Nacht gehalten, einmal mit 4 × SSC, dreimal 10 Minuten lang mit 2 × SSC und dreimal 10 Minuten lang mit 0,1 × SSC bei Raumtemperatur gewaschen. Die Gegenwart von DIG-markierter RNA-Sonde wurde durch Phosphatase-gekoppelte Anti-DIG-Antikörperfragmente (Boehringer Mannheim-Protokoll) deutlich gemacht. Kein Färben der Probe aufgrund der endogenen Phosphataseaktivität wurde beobachtet.
BEISPIEL 8
Sequentielle Expression des Amelingens
Unter Verwendung der in in situ-Hybridisierungstechnik wie in Beispiel 7 beschrieben, wurde die zelluläre Expression des Amelingens in Ratten im Alter von entweder 20 oder 25 Tagen untersucht. Oberkieferschnitte wurden hergestellt und an eine Amelin-RNA-Sonde hybridisiert. Zu beiden Entwicklungsstufen wurde gefunden, dass das Amelingen in Epithelzellen, benachbart zu der peripheren Oberfläche neu abgelagerten Dentins im Wurzelzement-bildenden Ende, sowie in Zellen, die in Mahlzähnen im zellulären Zement eingebettet sind, exprimiert wurde. Amelingen-Expression wurde ferner in sezernierenden Ameloblasten lokalisiert sowie in der epithelialen Wurzelscheide lokalisiert. Zusätzlich dazu zeigten Schneidezähne von 20 Tage alten Ratten Hinweis auf Amelin-Expression in Manteldentin-sezernierdenden Odontoblasten, bevor dessen Expression auf differenzierende Ameloblasten umgeschaltet wurde. In Kombination deuten diese Ergebnisse auf eine putative Funktion von Amelin in epithelial-mesenchymalen Wechselwirkungen während der Zelldifferenzierung von Odontoblasten und Ameloblasten hin und darauf, dass Amelin eines der Schlüsselproteine sein könnte, das an den Prozess der Zementogenese gekoppelt ist.
REFERENZEN

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nucleinsäurefragment, das ein Schmelz-Matrix betreffendes Polypeptid codiert, welches fähig ist, Kontakt zwischen Schmelz und einer extrazelluläre Matrix-bildenden Zelle zu vermitteln, und das eine Nucleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt, oder ein Analogon oder eine Variante davon, wobei ein Nucleotid oder Codon substituiert, insertiert, addiert oder umgeordnet worden ist, aufweist.
Nucleinsäurefragment, das ein Schmelz-Matrix betreffendes Polypeptid codiert, welches fähig ist, Kontakt zwischen Schmelz und einer extrazelluläre Matrix-bildenden Zelle zu vermitteln, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 gezeigt, aufweist.
Replizierbarer Expressionsvektor, der ein Nucleinsäurefragment nach Anspruch 1 oder 2 trägt und fähig ist, die Expression davon zu vermitteln.
Mikroorganismus, ausgewählt aus einem Bakterium, z.B. Escherichia Coli, einer Hefe oder einem Protozoon, umfassend einen Expressionsvektor nach Anspruch 3.
Zelle, ausgewählt aus einer Pilzzelle, einer Insektenzelle, einer Pflanzenzelle, einer Säugerzelle oder einer Zelllinie, umfassend einen Expressionsvektor nach Anspruch 3.
Schmelz-Matrix betreffendes Polypeptid, welches fähig ist, Kontakt zwischen Schmelz und einer extrazelluläre Matrixbildenden Zelle zu vermitteln, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 2 gezeigt, aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 6 in reiner Form.
Zusammensetzung, die ein Polypeptid nach Anspruch 7 und, wahlweise, ein physiologisch annehmbares Exzipiens umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines wie in Anspruch 6 oder 7 definierten Polypeptids, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Einfügen eines wie in Anspruch 1 oder 2 definierten Nucleinsäurefragments in einen Expressionsvektor, (b) Transformieren eines geeigneten Wirtsorganismus mit dem in Schritt (a) hergestellten Vektor, (c) Kultivieren des in Schritt (b) hergestellten Wirtsorganismus unter für das Exprimieren des Polypeptids geeigneten Bedingungen, (d) Ernten des Polypeptids, und (e) gegebenenfalls Unterwerfen des Polypeptids einer posttranslationalen Modifikation.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch 6 oder 7, das Kultivieren eines Mikroorganismus nach Anspruch 3 oder einer Zelle nach Anspruch 4 unter für das Exprimieren des Polypeptids geeigneten Bedingungen und Gewinnung des Polypeptids umfasst.
Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 6 oder 7 zur Herstellung einer Zusammensetzung zum Verbinden zweier Knochenelemente.
Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 6 oder 7 zur Herstellung einer Zusammensetzung zum Fördern oder Hervorrufen der Mineralisation von hartem Gewebe, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Knochen, Schmelz, Dentin und Zement.
Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 6 oder 7 zur Herstellung einer Zusammensetzung zum effektiven Einbauen eines Implantats in einen Knochen.
Verfahren zum Verbessern der Biokompatibilität einer Implantatvorrichtung oder einer transkutanen Vorrichtung, wobei das Verfahren das Beschichten der Implantatvorrichtung mit einer effektiven Menge eines Polypeptids nach Anspruch 6 oder 7 umfasst.
Diagnosemittel, das ein Nucleinsäurefragment nach Anspruch 1 oder 2 oder ein Polypeptid nach Anspruch 6 oder 7 umfasst.