DE69029415T2

DE69029415T2 - Osteogenische Wachstumfaktoren, die aus sich regenerierendem Knochenmark identifiziert werden

Info

Publication number: DE69029415T2
Application number: DE69029415T
Authority: DE
Inventors: Itai A Bab; Dan Gazit; John W Jacobs; Gideon A Rodan; Mohinder K Sardana
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 1989-02-23
Filing date: 1990-02-21
Publication date: 1997-04-03
Anticipated expiration: 2010-02-22
Also published as: EP0384731B1; EP0384731A3; EP0384731A2; DE69029415D1; CA2010660C; JPH07103156B2; CA2010660A1; JPH02282396A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Es ist gut bekannt, daß nach einer Knochenmarksentfernung eine osteogenische Phase auftritt, in welcher Trabekel des ursprünglichen Knochens das Blutgerinnsel ersetzen und den Markraum füllen. Die Trabekel sind danach einer osteoklastischen Resorption unterworfen, welche dem Auftreten von regeneriertem normalen Knochenmark vorausgeht. Eine osteogenische Reaktion besteht nicht nur lokal in der Markhöhle, sondern es findet eine Stimulation der Knochenbildung in kortikalen Osteonen und eine Steigerung der Osteo- und Chondrogenese an entfernten Stellen des Skeletts statt. Beobachtungen an den Condylen des Unterkiefers während der osteogenischen Phase der postablationalen Heilung von Knochenmark des Schienbeins legten nahe, daß die gesteigerte Osteogenese aus einem Zuwachs sowohl der Anzahl als auch der Aktivität von Osteoblasten resultierte. Es wurde vorgeschlagen, daß ein Faktor oder Faktoren, welche lokal durch das sich regenerierende Knochenmark hergestellt werden, die periphere osteogenische Antwort nach ihrer Freisetzung in den Blutkreislauf vermitteln; Bab I. et al., (1988) Endocrinology 123:345; Bab I. et al., (1985) Calcif Tissue Int 37:551.
Die US-A-4 434 094 beschreibt ein Verfahren zur teilweisen Reinigung eines osteogenischen Faktors aus entmineralisierten Knochenpartikeln durch Fraktionierung mittels Anionenaustauschchromatographie unter Verwendung von DEAE-Cellulose bei pH 7. Der teilweise gereinigte osteogenische Faktor wurde als ein Proteinisolat von ### 30 000 Dalton gewonnen.
Die vorliegende Erfindung weist nach, daß sich regenerierendes Knochenmark eine Wachstumsfaktor-Aktivität mit einer Wirkung auf osteogenische Zellen herstellt. Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein neues osteogenisches Wachstums-Polypeptid bereit, welches aus sich regenerierendem Knochenmark identifiziert wurde, das (i) eine stimulierende Wirkung auf osteoblastische Zellen besitzt und (ii) die in vivo-Knochenbildung fördert.
Das neue osteogenische Wachstums-Polypeptid der vorliegenden Erfindung weist Sequenzhomologie zu Histon H4, einem 102 Aminosäuren großen Protein, und zu einem Fragment von Histon H4 auf; Kayne P.S. et al., (1988) Cell 55:27-39; Knarchenho E.P. et al., (1987) Biull. Eksp. Biol. Med. 103.(4):418-420. Die Druckschriften offenbaren jedoch nicht Polypeptide innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung und offenbaren keine der biologischen Eigenschaften der Polypeptide der vorliegenden Erfindung.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt ein neu isoliertes, biochemisch reines Polypeptid (oder Polypeptide) zur Verfügung, welches (i) eine stimulierende Wirkung auf osteoblastische Zellen besitzt und das (ii) die in vivo-Knochenbildung fördert. Die vorliegende Erfindung stellt ein biochemisch reines Polypeptid (OGP) der Formel:
Ala-Leu-Lys-Arg-Gln-Gly-Arg-Thr-Leu-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly
oder eine homologe Verbindung, isoforme Verbindung oder eine Variante davon bereit, wobei die homologe Verbindung, isoforme Verbindung oder Variante eine stimulatorische Wirkung auf osteoblastische Zellen und auf die in vivo-Knochenbildung hat, ein Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 2600 aufweist und eine Aminosäuresequenz hat, die zu mindestens 40 % in bezug auf OGP konserviert ist. Dieses Polypeptid wurde aus sich regenerierendem Knochenmark identifiziert. Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Isolierung des Polypeptids aus sich regenerierendem Knochenmark zur Verfügung. Die Polypeptide der Erfindung sind verwendbar, um die Knochenbildung zu steigern. Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind auch in pharmazeutischen Zusammensetzungen, als Screening-Werkzeuge und bei der Verhinderung, Prophylaxe, Therapie und Behandlung von Krankheiten verwendbar, die Knochenschäden, Knochenverlust und verminderte Knochenbildung, oder andere Befunde beinhalten, welche durch eine gesteigerte Knochenbildung verbessert würden.

BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die Figur 1 zeigt eine C1/C8-Umkehrphasen-Chromatographie von GFA (Wachstumsfaktor- Aktivität), welche durch Kationenaustauschchromatographie erhalten wurde. Die ausgezogene Linie repräsentiert DNA-Syntheseraten in ROS 17/2-Zellkulturen. Die Daten sind gemittelte Zähleinheiten pro Minute aus dreifach angesetzten Kulturen. Alle Fraktionen in der Peak- Region sowie alle anderen Datenpunkte wiesen eine Standardabweichung SD < 10 % vom Mittelwert auf Die gepunktete Linie steht für den Proteingehalt.
Die Figur 2 zeigt die Wirkung von sOGP auf die Mineralauflagerungsrate (MAR) bei kortikoendostealen (a) und metaphyseal-trabekulären (b) Oberflächen des Schienbeins von Ratten. Die Daten sind Mittelwerte ± SD (Standardabweichung) von Messungen in 4 (100 und 300 pg-Gruppen) oder 5 (andere Gruppen) Ratten, an einem Schienbein pro Tier.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Das osteogenische Wachstums-Polypeptid ("OGP") ist ein biochemisch reines Polypeptid, das aus sich regenerierendem Knochenmark identifiziert wurde und eine stimulierende Wirkung auf osteoblastische Zellen und die in vivo-Knochenbildung hat. OGP, wie hier verwendet, ist definiert, native Polypeptide, synthetische Polypeptide, alle homolgen, isoformen oder genetischen Varianten, und alle anderen Varianten, einzuschließen. Das Molekulargewicht von OGP liegt im Bereich von etwa 500 bis 2600, vorzugsweise von etwa 1000 bis 1600, und weiter bevorzugt von etwa 1525.
OGP wurde aus mit sich regenerierendem (oder heilenden) Knochenmark konditioniertem Medium (HBMCM) zu drei unterschiedlichen Stufen aufgereinigt, wobei die Stufen 1 und 2A eine teilweise Reinheit besitzen, und die Stufe 2B apparente Homogenität aufweist.
Die Erfindung identifiziert ein Polypeptid von 14 Resten als einen wirksamen Stimulator der Knochenbildung. Das native OGP wurde aus Kulturmedien, welche durch osteogenisches Gewebe konditioniert waren, das aus Ratten-Schienbeinen während der post-ablationalen Markregeneration erhalten wurde, (HBMCM) isoliert und zur Homogenität gereinigt. Das Reinigungsverfahren bestand aus Chromatographie und Auswählen von chromatographischen Fraktionen, die biologische Aktivität zeigten, einschließlich Größenausschluß-, Heparin- Sepharose-, Ionenaustausch- und Umkehrphasenchromatographie.
Im Anschluß an das Demonstrieren seiner mitogenen Aktivität wurde das gereinigte Polypeptid OGP einem automatisierten Edman-Abbau für eine Aminosäure-Sequenzanalyse unterzogen. Ein synthetisches Polypeptid von identischer Sequenz wurde durch Festphasen- Peptidsynthese hergestellt. Das synthetische Polypeptid OGP (sOGP) wurde getestet und man stellte fest, daß es eine stimulatorische Wirkung auf osteoblastische Zellen aufweist. Bei täglicher intravenöser Injektion in erwachsene Ratten von etwa 200-250 g, förderte sOGP die Knochenbildung (gemessen als Mineralauflagerungsrate) bei Dosierungen von etwa 1 pg/Ratte/Tag bis etwa 1 µg/Ratte/Tag.
Die Daten legen nahe, daß OGP ein einzelnes Polypeptid von identifizierter Sequenz ist, jedoch besteht die Möglichkeit von homologen, isoformen oder genetischen Varianten von OGP entweder innerhalb oder außerhalb der zellulären Umgebung. Diese Erfindung umfaßt alle derartigen homologen, isoformen oder genetischen Varianten von OGP, vorausgesetzt jede hat eine Wirkung auf osteoblastische Zellen und auf die in vivo-Knochenbildung. Polypeptide, welche Homologe von OGP sind, schließen spezifisch diejenigen ein, welche eine Aminosäuresequenz besitzen, die zu mindestens etwa 40 % in bezug auf die in der Tabelle A dargestellte Aminosäuresequenz konserviert ist, vorzugsweise zu mindestens etwa 60 % konserviert ist, und weiter bevorzugt zu mindestens etwa 75 % konserviert ist.
Der Durchschnittsfachmann wird verstehen, daß andere Varianten von OGP innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind. Dies schließt besonders jegliche Varianten ein, welche sich von dem isolierten oder synthetisierten OGP lediglich durch konservative Aminosäuresubstitution unterscheiden. Viele solche konservative Aminosäuresubstitutionen sind als Serien in Taylor, W.R., J. Mol. Biol. 188, 233 (1986) dargestellt. OGP, oder Fragmente davon, schließt in dieser Anmeldung beliebige derartige Variationen in der Aminosäuresequenz ein, ob durch konservative Aminosäuresubstitution, Deletion oder andere Verfahren, vorausgesetzt daß das Polypeptid nach der Reinigung eine stimulatorische Wirkung auf osteoblastische Zellen und auf die in vivo-Knochenbildung zeigt. Die Fragmente von OGP können kleine Peptide mit so kleinen Sequenzen wie 6 oder mehr Aminosäuren sein, wobei die Sequenzen diejenigen sind, welche in der Tabelle A offenbart werden.
Die Aminosäuresequenz von OGP ist die folgende:

Tabelle A

Ala-Leu-Lys-Arg-Gln-Gly-Arg-Thr-Leu-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly
Für den Durchschnittsfachmann wird es leicht offensichtlich sein, daß aus der Aminosäuresequenz von OGP großer Nutzen gezogen werden kann. Zum Beispiel können Oligonucleotidsonden aus der Aminosäuresequenz konstruiert werden und verwendet werden, um nach den für OGP codierenden CDNA-Klonen zu screenen. Diese OGP-cDNA(s) enthaltenden Klone können verwendet werden, um mRNA durch Transkription herzustellen, welche dann translatiert und exprimiert werden kann. Dieses Vorgehen mit OGP kann eingesetzt werden, um große Mengen von OGP gentechnisch herzustellen oder die Genetik von OGP zu untersuchen, um dessen zelluläre Rolle bei der Knochenbildung kennenzulernen.
Darüber hinaus können synthetische Polypeptide hergestellt werden, um die pharmakologischen Eigenschaften von OGP zu vervollkommnen. Diese synthetischen Peptide können durch die Technik der Festphasen-Peptidsynthese hergestellt werden, die von Merrifield entwickelt wurde ("Solid-Phase Peptide Synthesis", Advances in Enzymology, 32:221-296, 1969); G. Barnay & R.B. Merrifield "Solid-Phase Peptide Synthesis", The Peptides, Band 2, Hrsg.: E. Gross & J. Merenhole (1980). Dieses Verfahren beruht auf der Strategie, daß der Carboxyterminus des Peptids kovalent mit einem festen Träger verknüpft ist. Die gewünschte Peptidsequenz wird durch schrittweises Ankoppeln von einzelnen Aminosäuren an eine vom Carboxyl- zum Aminoterminus wachsende Peptidekette hergestellt. Die Kopplung wird typischerweise durch Aktivieren der Carboxylgruppe der Aminosäure, die an das Harz angeknüpft wird, erreicht, bei welcher andere potentiell reaktive Gruppen blockiert sind. Im Anschluß an die Anfügung einer Aminosäure an die wachsende Polypeptidkette, und vor einer weiteren Kettenverlängerung, wird typischerweise eine Schutzgruppe entfernt. Weil jede Aminosäure durch nahezu dieselbe Folge von Reaktionen gekoppelt wird, wird die Notwendigkeit komplizierter Strategien in der Synthese minimiert. Die Löslichkeit stellt keinen größeren Problempunkt während der Synthese dar, da das Peptid an einen festen Träger geknüpft ist. Dieses Verfahren ist schnell, und es kann einfach angewandt werden. Es ist für die Synthese von mehreren Analogen mit aminoterminalen Substitutionen sehr bequem, da eine einzelne Synthese nahe dem Aminoterminus in mehrere Richtungen abgezweigt werden kann, wodurch viele Analoga erzeugt werden, welche lediglich in der aminoterminalen Region variieren.
Zusätzlich dazu kann die Aminosäuresequenz verwendet werden, um Polypeptide herzustellen, welche als Nachweismittel bzw. Screen oder Werkzeug für die Identifizierung von nicht-peptidartigen Molekülen, die eine stimulierende Wirkung auf osteoblastische Zellen und die in vivo-Knochenbildung zeigen, verwendet werden können.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung finden auch Verwendung für die Stimulation der Knochenbildung in Fällen von Osteoporose (oder Osteopenie jeglicher Ätiologie), Bruch- Reparatur, Heilung von Knochenschäden oder -Wunden, Implantanten innerhalb von Knochen und Knochenergänzung und bei anderen Befunden, welche eine gesteigerte Knochenbildung erfordern.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können für die Behandlung oder Verhinderung von Krankheiten, die eine Verminderung der Knochenbildung beinhalten, sowie der anderen obenstehend erörterten Befunde in phannazeutische Zusammensetzungen eingeschlossen werden.
Die Größe einer prophylaktischen oder therapeutischen Dosis eines Polypeptids dieser Erfindung wird natürlich je nach der Patientengruppe (Alter, Geschlecht usw.), der Beschaffenheit oder der Schwere des zu behandelnden Befundes und dem jeweiligen Polypeptid dieser Erfindung und dessen Verabreichungsweg schwanken. Im allgemeinen liegt der tägliche Dosierungsbereich für eine die Knochenbildung steigernde Anwendung innerhalb des Bereichs von etwa 4 pg bis etwa 5 µg pro kg Körpergewicht eines Säugers.
Es kann jeglicher geeignete Verabreichungsweg angewandt werden, um einen Säuger, insbesondere einen Menschen, mit einer wirksamen Dosierung eines Polypeptids dieser Erfindung zu versorgen. Zum Beispiel können die orale, rektale, topische, parenterale, okulare, nasale, sublinguale, buccale, intravenöse Verabreichung und dergleichen angewandt werden. Die Dosierungsformen schließen Tabletten, Pastillen, Dispersionen, Suspensionen, Lösungen Kapseln, Cremes, Salben, Aerosole und dergleichen ein. Die Dosierungsformen schließen auch implantierte Vorrichtungen mit langsamer Freisetzung, die spezifisch für diesen Zweck ausgelegt sind, und andere Formen von Implantaten, die modifiziert sind, um zusätzlich auf diese Weise zu wirken, ein.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen ein Polypeptid dieser Erfindung als einen aktiven Bestandteil oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, und können ebenfalls einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und gegebenenfalls andere therapeutische Bestandteile enthalten. Der Begriff "pharmazeutisch annehmbare Salze" betrifft Salze, die aus pharmazeutisch annehmbaren nicht-toxischen Basen einschließlich anorganischen Basen und organischen Basen hergestellt werden. Die Zusammensetzungen schließen Zusammensetzungen ein, welche für die orale, rektale, ophthalmische, pulmonäre, nasale, sublinguale, dermale, topische oder parenterale (einschließlich subkutane, submucosolare, intramuskuläre, intravenöse und intra-arterielle) Verabreichung geeignet sind, obwohl der geeignetste Weg in einem beliebigen gegebenen Fall von der Natur und der Schwere der behandelten Befunde und von der Natur des aktiven Bestandteils abhängig sein wird. Sie können bequemerweise in der Form von Dosierungseinheiten dargeboten und mittels jeglichem der auf dem Fachgebiet der Pharmazie gut bekannten Verfahren hergestellt werden.
Für die Verabreichung durch Inhalation werden die Polypeptide der vorliegenden Erfindung geeigneterweise in der Form einer Aerosol-Sprühnebelausführung aus Druckbehältem oder einem Zerstäuber, oder als Pulver, das in Form einer Patrone, aus welcher die Pulverzusammensetzung mit Hilfe einer geeigneten Vorrichtung inhaliert werden kann, zubereitet werden kann, abgegeben. Das bevorzugte Abgabesystem für die Inhalation ist ein Aerosol für Inhalation einer abgemessenen Dosis (MDI), welches als eine Suspension oder Lösung in Fluorkohlenstoff-Treibmitteln zubereitet werden kann.
Geeignete topische Zubereitungen schließen transdermale Vorrichtungen, Aerosole, Cremes, Salben, Lotionen, Einstäubpulver und dergleichen ein.
In der praktischen Anwendung kann ein Polypeptid dieser Erfindung als der aktive Bestandteil in inniger Beimischung mit einem pharmazeutischen Träger gemäß herkömmlichen pharmazeutischen Compoundiertechniken vereinigt werden. Der Träger kann in Abhängigkeit von der für die Verabreichung gewünschten Form der Herstellung eine breite Vielfalt von Formen einnehmen, z.B. oral oder parenteral (einschließlich intravenös und intra-arteriell). Bei der Herstellung der Zusammensetzungen für eine orale Dosierungsform kann jegliches der gewöhnlichen pharmazeutischen Medien verwendet werden, wie zum Beispiel Wasserglykole, Öle, Alkohole, Geschmacksstoffe, Konservierungsstoffe, Färbemittel und dergleichen im Falle von oralen flüssigen Zubereitungen, wie zum Beispiel Suspensionen, Elexieren und Lösungen; oder Träger, wie Stärken, Zucker, mikrokristalline Cellulose, Verdünnungsmittel, Granulationsmittel, Gleitmittel, Bindemittel, Zerfallsmittel und dergleichen im Falle von oralen festen Zubereitungen, wie zum Beispiel Pulvern, Kapseln und Tabletten. Aufgrund der Einfachheit ihrer Verabreichung stellen Tabletten und Kapseln die vorteilhafteste orale Dosierungseinheitsform dar, wobei in diesem Fall offensichtlich feste pharmazeutische Träger angewandt werden. Falls gewünscht, können Tabletten durch Standardtechmken mit Zucker überzogen oder darmlöslich überzogen werden.
Zusätzlich zu den obenstehend dargestellten gewöhnlichen Dosierungsformen können die Polypeptide dieser Erfindung auch durch Mittel und/oder Abgabevorrichtungen kontrollierter Freisetzung verabreicht werden.
Für die orale Verabreichung geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können als diskrete Einheiten, wie Kapseln, Kachets oder Tabletten, welche jeweils eine vorherbestimmte Menge des aktiven Bestandteils enthalten, als ein Pulver oder Granulat oder als Lösung oder Suspension in einer wäßrigen Flüssigkeit, einer nicht-wäßrigen Flüssigkeit, einer Öl-in-Wasser-Emulsion oder einer Wasser-in-Öl-Flüssigkeitsemulsion dargeboten werden. Derartige Zusammensetzungen können durch jegliches der Verfahren der Pharmazie hergestellt werden, aber alle Verfahren schließen den Schritt des Assoziierens des aktiven Bestandteils mit dem Träger, welcher eine oder mehrere notwendige Bestandteile umfaßt, ein. Im allgemeinen werden die Zusammensetzungen durch gleichmäßiges und inniges Mischen des aktiven Bestandteils mit flüssigen Trägern oder feinteiligen festen Trägern oder beidem, und danach, falls notwendig, Formen des Produkts in die gewünschte Darbietungsform hergestellt. Zum Beispiel kann eine Tablette durch Kompression oder Formen hergestellt werden, gegebenenfalls mit einem oder mehreren akzessorischen Bestandteil(en). Gepreßte Tabletten können durch Kompression in einer geeigneten Maschine hergestellt werden, wobei der aktive Bestandteil in einer rieselfähigen Form, wie Pulver oder Granulat, gegebenenfalls mit einem Bindemittel, Gleitmittel, inerten Verdüunungsmittel, oberflächenaktiven Mittel oder Dispersionsmittel gemischt wird. Geformte Tabletten können durch Formen in einer geeigneten Maschine hergestellt werden, wobei eine Mischung der pulverisierten Verbindung mit einem inerten Verdünnungsmittel befeuchtet wird.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht als Einschränkung angegeben.

BEISPIEL 1 (REINIGUNG ZUR STUFE 1)

MATERIALIEN

Reagenzien für den Assay auf alkalische Phosphatase-Aktivität, Collagenase vom Typ I, Trypsin, Sojabohnen-Trypsininhibitor-Agarose (STI), BGJ-Medium (Fitton-Jackson- Modifikation), Vitamin C, Rinderpankreas-Insulin und humanes Serumalbumin wurden von der Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erworben. F-10 (Ham)-Medium (Nährstoffmischung), fötales Kälberserum (FCS), Dulbeccos PBS und Penicillin-Streptomycin-Lösung wurden von Gibco (Chagrin Falls, OH) erhalten. [Methyl-³H]-thymidin ([³H]TdR) (5mCi/mmol) stammte vom Nuclear Research Center (Negev, Israel). Sephadex G-25, Sephadex G-75 und Heparin-Sepharose CL-6B wurden von Pharmacia (Uppsala, Schweden) bezogen. Millipore-Membranen waren von Scheicher & Schuell (Dassel, West-Deutschland). Plättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF) wurde von Biomedical Technologies (Stroughton, MA) erworben und humanes rekombinantes Interleukin I-a (IL1) von Cistrone (Pine Brook, NJ). Alle anderen Chemikalien waren analysenrein und wurden von Merck AG (Darmstadt, West-Deutschland) bezogen. Gewebekulturschalen wurden von Nunc (Roskilde, Dänemark) erhalten. Polyklonales Antiserum aus Kaninchen gegen PDGF wurde von Dr. C. H. Heldin (Universität Uppsala, Schweden) zur Verfügung gestellt.

METHODEN

Herstellung von mit heilendem Knochenmark konditioniertem Medium (HBMCM)

Schienbein-Knochenmark wurde aus je einem Körperglied von 400 g schweren männlichen Ratten des Stamms der Hebrew University (Sabra, Israel) wie früher beschrieben entnommen; Bab, I., et al., (1985) Calcif Tissue Int 37:551. Kurz gesagt, wurde ein Loch von 2 mm Durchmesser in den Schaft in einer Höhe unterhalb der proximalen Wachstumsplatte gebohrt. Danach wurde Gewebe aus dem Markraum mit einer Polyethylen-Kanüle entfernt, welche durch das Loch eingeführt und an eine Hochleistungs-Ansaugvorrichtung angeschlossen war. Die behandelten Knochen wurden nach 10 Tagen freipräpariert und die Schäfte wurden in Längsrichtung gespalten, um den Markraum freizulegen. Das heilende Gewebe wurde dann von der endostealen Seite der Rinde entfernt, mit reichlichen Mengen an serumfreiem F-10- Medium, das mit 1 % (v/v) Penicillin-Streptomycin supplementiert war, gewaschen und 24 Stunden lang in demselben Medium (Gewebe aus einem Körperglied / 1 ml Medium) bei 37ºC in 5 % CO&sub2;-Luft inkubiert. Das Medium wurde dann abgesammelt und 30 Minuten lang bei 25 000 x g zentrifugiert, und der Überstand wurde durch eine Millipore-Membran mit 0,45 µm Porengröße filtriert. Die Präparation wurde als Roh-HBMCM bezeichnet; ihr Proteingehalt betrug 3-8 mg/ml. Um kaltes bzw. nicht-radioaktives Thymidin, Bestandteile des Gewebekulturmediums und andere Verunreinigungen von niedrigem Molekulargewicht zu entfernen, wurde das Roh-HBMCM einer Gelfiltration auf einer mit 5 mM Ammoniumacetat äquilibrierten Sephadex G-25-Säule unterzogen. In Standardexperimenten wurden 6 oder 35 mg Protein auf eine PD-10- bzw. 2,6 x 70 cm-Säule aufgetragen. Die Fraktionen wurden mit 5 mM Ammoniumacetat eluiert und diejenigen, welche Protein im Hohlraumvolumen enthielten, wurden vereinigt, lyophilisiert und bei -70ºC aufbewahrt. Für weitere Experimente wurden die Proben aufgetaut und in PBS gelöst.

Nachweisen der Wachstums-fördernden Aktivität auf osteoblastische Zellen

Wachstumsfaktor-Aktivität (GFA) wurde nachgewiesen, indem die Wirkungen auf die DNA- Synthese in einer Kultur von osteoblastischen Ratten-Osteosarkom-Zellen (ROS 17/2) untersucht wurden. Stammkulturen von ROS 17/2-Zellen wurden in F-10-Medium mit 10 % FCS gehalten. Um den mitogenen Effekt von verschiedenen Präparationen zu untersuchen, wurden konfluente Kulturen trypsinisiert, und 2 x 10&sup4; Zellen in 2 cm² großen Kulturvertiefungen (16 mm-Mehrfachvertiefungs-Schalen) in F-10-Medium eingeimpft und bei 37ºC in CO&sub2;-Luft inkubiert. Während der ersten 6 Stunden wurde das Medium mit 2 % FCS supplementiert, um die Zellverankerung zu verbessern. Dem wurde mit einer 18 Stunden langen Inkubation in serumfreiem Medium gefolgt, welches die als Proteinlösung in PBS zugesetzte Testpräparation enthielt. Um die DNA-Syntheseraten zu bestimmen, wurde die Kulturen mit [³H]TdR, 1,5 mCi/Vertiefimg, über die letzten 2 Stunden der Inkubationsdauer gepulst. Der Puls wurde durch zweimaliges Waschen mit eiskalter 10%iger (w/v) Trichloressigsäure und mit Ethanol- Ether (3:1, v/v) beendet. Nachdem die Zellschicht getrocknet war, wurde das in Trichloressigsäure unlösliche Material in 0,2 M NaOH gelöst und dessen Gesamtradioaktivität wurde durch Flüssigkeits-Szintillations-Spektrometrie abgeschätzt. Die Daten wurden als Wachstumsfaktor-Einheiten (GFU, growth factor units) ausgedrückt. Da das Wachstum der ROS- Zellen serumabhängig ist, wurde 1 U als die halbe Wirkung von 10 % FCS in einem gegebenen Experiment definiert. Die Zellzahl wurde in Schwesterkulturen bestimmt, welche den Testpräparationen 48 Stunden lang ausgesetzt wurden. Dies wurde nach Trypsinisieren unter Verwendung eines Hämocytometers mit fixiertem Volumen durchgeführt. Die Daten wurden als Anzahl von Zellen pro Kulturvertiefung ausgedrückt.

Partielle Reinigung von GFA aus HBMCM

Effekt von Hitze

Ein Milliliter große Aliquots HBMCM mit 0,5-1,0 mg Protein wurden bei Raumtemperatur belassen oder 30 oder 60 Minuten lang auf 56ºC erwärmt. Ähnliche Proben wurden auch auf die Stabilität der GFA gegenüber 10 Minuten langem Kochen untersucht. Da festgestellt wurde, daß die GFA gegenüber dem Kochverfahren stabil war (Tabelle 1), wurde ein Kochschritt zur Entfernung von unwesentlichem Protein durch Denaturierung und 45 Minuten lange Zentrifugation bei 25 000 x g angewandt.

Affinitätschromatographie

Eine Heparin-Sepharose-Säule (0,9 x 25 cm Bettvolumen) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet, mit PBS gepackt, und bei Raumtemperatur bei einer Flußrate von 0,6 ml/min von einer Pumpe beschickt. Vorbereitende Experimente unter satzweiser Verwendung von Heparin-Sepharose zeigten, daß beim Gleichgewicht mit 0,15 M NaCl (PBS) die GFA von dem unlöslichen Substrat ungebunden verblieb. So wurde eine 2 ml große Probe mit 30 mg gekochtem HBMCM in PBS auf die Säule geladen und durch Waschen des Betts mit 24 ml PBS eluiert. Das Eluat wurde 24 Stunden lang gegen 5 mM Ammoniumacetat dialysiert, nach Protein untersucht und lyophilisiert.

Gelfiltration

Um den (die) HBMCM-abgeleiteten Faktor(en) weiter zu reinigen, wurden 0,5-6,0 mg/ml Protein, welches aus der Heparin-Sepharose-Säule gewonnen wurde, in 1 ml 5 mM Ammoniumacetat gelöst und auf eine mit derselben Lösung äquilibrierte 1,2 x 54 cm Sephadex G- 75-Säule aufgetragen. Die Proteinproben wurden bei Raumtemperatur unter Verwendung von 5 mM Ammoniumacetat bei einer Flußrate von 0,65 ml/min eluiert. Fraktionen von 1,3 ml wurden auf Protein getestet und lyophilisiert.

Tryptischer Verdau

Um die proteinartige Beschaffenheit des HBMCM-abgleiteten Faktors zu bestätigen, wurden 1 ml große Aliquots HBMCM nach dem Heparin-Sepharose-Schritt mit Trypsin bei 25ºC inkubiert (Verhältnis Trypsin/HBMCM 1:20 w/w). Die Reaktion wurde nach 30 Minuten durch Auftragen der Mischung auf eine Säule von STI (0,4 x 1 cm) gestoppt. Kontrollen bestanden aus ähnlich, aber ohne Trypsin in der Reaktionsmischung, behandelten Proben.

Andere Zell- und Organkulturen

Um die Spezifität des HBMCM-abgeleiteten Faktors auf osteogenische Zellen zu untersuchen, wurden aktive Präparationen hinsichtlich ihrer mitogenen Wirkung auf osteoblastische und nicht-osteoblastische fötale Rattenschädeldach-Zellen (FRC-Zellen) und nicht-osteogenische Ratten-Osteosarkom-Zellen (ROS 25/1) weiter getestet. Die Kulturen wurden einheitlich bei 37ºC in CO&sub2;-Luft gehalten. In allen Experimenten wurden die Testpräparationen als Proteinlösungen in PBS zu den Kulturen gegeben.

ROS-Zellen

ROS 25/1-Zellen wurden kultiviert und unter Verwendung eines, zu dem obenstehend für ROS 17/2-Zellen berichteten ähnlichen, Protokolls getestet.

FRC-Zellen

Aus Scheitelbein-Knochen von 21 Tage alten Rattenföten erhaltene Zellen wurden in Ausgangskulturen eingesetzt. Fünf Zellpopulationen wurden durch aufeinanderfolgenden Verdau mit Collagenase und Trypsin gemäß dem Verfahren, das von Luben et al., (1976) Endocrinology 99:526, beschrieben wurde, getrennt. Zellen aus den Populationen 1-2 und 3-5 wurden vereinigt und als nicht-osteoblastisch bzw. osteoblastisch bezeichnet. Die Zellen wurden in 16 mm-Mehrfachvertiefungs-Schalen bei 3 x 10&sup4; Zellen pro Vertiefung angeimpft und 24 Stunden lang in F-10-Medium, das mit 10 % FCS supplementiert war, wachsen gelassen. Das Medium wurde dann durch eines mit 1 % FCS ersetzt, und nach 24 Stunden wurden die Testpräparation und [³H]TdR, 1,5 mCi/Vertiefung, zugegeben. Der Einbau von [³H]TdR in die DNA und die Zellzahl wurden nach einer Zeitdauer von weiteren 24 Stunden wie obenstehend beschrieben ermittelt.

Fötale Maus-Langknochen

Es wurde verfahren, wie von Soskolne et al., (1986) Bone 7:41, beschrieben. Kurz gesagt, wurden Speichen und Ellen aus 16 Tage alten Föten entfernt und von Muskel- und Weichgewebe freipräpariert. Sie wurden dann in einem chemisch definierten Medium (BGJ, Fitton-Jackson-Modifikation), das mit 150 mg/ml Vitamin C und 4 mg/ml humanem Serumalbumin supplementiert war, kultiviert. Die Phosphatkonzentration wurde auf 1 mM eingestellt. Die Gesamtlänge und die diaphyseale Länge der einzelnen Knochenrudimente wurde am Beginn der Kulturdauer und nach 48 Stunden direkt unter einem Präparationsmikroskop unter Verwendung von Transmissions-Licht gemessen. Eine Verlängerung, entweder insgesamt oder diaphyseal, wurde als die Differenz zwischen diesen Messungen berechnet, und die Ergebnisse wurden als das Verhältnis zwischen mit Wachstumsfaktoren behandelten Knochen und Kontrollen, die nur in einem chemisch definierten Medium herangezogen wurden, ausgedrückt (T/C-Verhältnis).

Alkalische Phosphatase-Aktivität

Für diesen Assay wurde das Medium aus Kulturen von ROS 17/2-Zellen entfernt, und die Zellen wurden mit PBS gewaschen, in destilliertes Wasser abgeschabt und mit Ultraschall behandelt. Die Enzymaktivität wurde mit p-Nitrophenylphosphat als Substrat, wie von Ashton et al., (1984) Calcif Tissue Int 36:83 beschrieben, geassayt. Die Ergebnisse wurden als pro Minute freigesetzte Mikromol p-Nitrophenol / 10&sup6; Zellen, welche in Schwesterkulturen gezählt wurden, ausgedrückt.

Proteingehalt

Protein wurde nach dem Verfahren von Bradford, (1976) Anal. Biochem. 72:248, bestimmt.

Ermittlung der IL1-Aktivität

Die IL1-Aktivität wurde unter Anwendung eines Thymocyten-Proliferations-Assays abgeschätzt, wie von Barak et al., (1986) J. Biol. Response Modifies 5:362, beschrieben wurde.

Assay für PDGF

Anti-PDGF-Antikörper-Neutralisierungs-Experimente wurden mit polyklonalem Antiserum durchgeführt, das in Kaninchen gegen PDGF hergestellt worden war. PDGF oder HBMCM- abgeleitete Präparationen wurden zu ROS 17/2-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von Antikörper zugegeben und hinsichtlich der Auswirkungen auf den [³H]TdR-Einbau untersucht.

ERGEBNISSE

Der Effekt von Roh-HBMCM auf die Anzahl und die alkalische Phosphatase-Aktivität von ROS 17/2-Zellen ist nachgewiesen. Bei der höchsten Verdünnung von Roh-HBMCM (1:200) bestand eine 75%ige Verringerung der Zellzahl und ein mehr als zweifacher Zuwachs der Enzymaktivität. Bei geringeren Verdünnungen, 1:100 - 1:10, war die Anzahl von Zellen etwa zweifach höher im Vergleich zu unbehandelten Kulturen, und die alkalische Phosphatase- Aktivität zeigte eine Dosis-abhängige Reduktion.
Als das Roh-HBMCM einer Gelfiltration auf einer Sephadex G-25-Säule unterzogen wurde, wurden etwa 80 % des zugegebenen Proteins in Fraktionen, welche das Hohlraumvolumen umfaßten, gewonnen. Diese Fraktionen enthielten nahezu die gesamte (94 %) aus der Säule eluierte mitogene Aktivität.

Partielle Reinigung der GFA aus HBMCM

Effekt von Hitze auf die GFA

Die Wirkung von Hitze auf die HBMCM-abgeleitete GFA ist in der Tabelle 1 zusammengefaßt. GFU steht für Wachstumsfaktor-Einheiten. 1 U ist als der halbe Effekt von 10 % FCS in demselben Experiment definiert. Tabelle 1 Effekt von Hitze auf die HBMCM-mitogene Aktivität ([³H]TdR-Einbau in DNA) in serumfreier ROS 17/2-Zellkultur
RT, Raumtemperatur
a Die Faktorkonzentration betrug 3,6 mg/ml
b Mittelwert ± SE von vier Wiederholungsversuchs-Kulturvertiefungen
Bei der Erhöhung entweder der Temperatur oder der Expositionszeit bestand eine Zunahme des stimulierenden Effekts von HBMCM auf den [³H]TdR-Einbau in DNA von ROS 17.2- Zellen. Insbesondere kam es zu einem merklichen Anstieg der mitogenen Aktivität nach 10 Minuten langem Kochen; der mitogene Effekt des durch Kochen und Zentrifugation erhaltenen Überstands war ähnlich zu demjenigen von FCS. Die Hälfte des Proteins konnte durch Kochen und Zentrifugation bei einer 8fachen Steigerung der spezifischen Aktivität entfernt werden (Tabelle 2). Die Dosis-Antwort-Beziehung der gekochten Präparation in dem ROS 17/2-Zellassay zeigte eine signifikante GFA bei 0,5-5 mg(Vertiefung bei einer Abnahme bei höheren Dosen. Eine Aktivität der gekochten Präparation wurde ebenfalls bemerkt, als 0,5 mg zu Kulturen einer Vereinigung der FRC-Zellpopulationen 3-5 (osteoblastische Population) zugegeben wurden. Tabelle 2 Partielle Reinigung von HBMCM-abgeleitetem Wachstumsfaktor durch Kochen und Affinitätschromatographie auf Heparin-Sepharose
a Aus 1 ml Roh-HBMCM.

Affinitätschromatographie

Als das gekochte HBMCM auf eine Heparin-Sepharose-Säule geladen wurde, wurden 20 % des aufgetragenen Proteins durch PBS eluiert, wobei das verbleibende Protein gebunden blieb. Die in der durch PBS eluierten Fraktion gewonnene mitogene Aktivität repräsentierte einen 13fachen Zuwachs der spezifischen Aktivität (Tabelle 2). Die Steigerung der GFA nach dem Heparin-Sepharose-Schritt wird auch durch die Dosis-Antwort-Beziehung gezeigt, wobei die Wirkung auf ROS 17/2-Zellen bei 50 ng/Vertiefung offensichtlich war. Die Peak-Stimulation der DNA-Syntheserate wurde bei 0,5 µg/Vertiefung, mit einem Absinken danach, festgestellt. Die unter Verwendung von Heparin-Sepharose erhaltene Präparation wies auch einen beträchtlichen mitogenen Effekt auf osteoblastische FRC-Zellen auf. Als aus der Heparin- Sepharose-Säule gewonnenes Material einem tryptischen Verdau unterzogen wurde, bestand eine mehr als 95%ige Inhibition der HBMCM-abgleiteten GFA (Tabelle 3). Tabelle 3 Effekt von tryptischem Verdau auf die Stimulation der DNA- Synthese von ROS 17/2-Zellen durch HBMCM, welches auf Heparin-Sepharose chromatographiert wurde
a In Abwesenheit von Serum, außer anderweitig angegeben.
b Mittelwert ± SE von vier Wiederholungsversuchs-Kulturvertiefungen.
c Zwei Mikrogramm der durch Heparin-Sepharose-Chromatographie erhaltenen HBMCM- Präparation pro Kultur.
d Zwei Mikrogramm der nach Heparin-Sepharose- und Sojabohnen-Trypsininhibitor (STI)- Agarorse-Chromatographie erhaltenen HBMCM-Präparation pro Kultur.

Gelfiltration auf Sephadex G75

Das Elutionsprofil der GFA von der Sephadex G75-Säule, welches durch die Steigerung des [³H]TdR-Einbaus in DNA von ROS 17/2-Zellen sichtbar gemacht wurde, wurde aufgestellt. Der Großteil des Proteins und etwas mitogene Aktivität eluierten nahe zum Hohlraumvolumen der Säule. Drei größere Aktivitätspeaks eluierten in den Fraktionen 19 bis 38. Bezogen auf die Elutionspositionen der Molekulargewichtsmarker, waren die Schätzungen des Molekulargewichts der drei Peaks 35 000, 19 000 und weniger als 10 000.

Effekt von HBMCM-abgeleiteten Präparationen in anderen Zell- und Organkulturen.

Nicht-osteoblastische ROS 25/1-Zellen sind aus dem gleichen Tumor erhalten worden, wie ROS 17/2-Zellen, aber im Unterschied zu den letzteren exprimieren sie keinen osteoblastischen Phänotyp. HBMCM-abgeleitete Präparationen, insbesondere die nach dem Heparin-Sepharose-Schritt erhaltenen, riefen eine mitogene Antwort in der ROS 25/1- Zellkultur bei ähnlichen Konzentrationen, wie denjenigen, welche auf ROS 17/2-Zellen stimulatorisch waren, hervor. Die Größe der ROS 25/1-Zellantwort war jedoch verglichen mit derjenigen der ROS 17/2-Zellen beträchtlich kleiner. Darüber hinaus besaßen die HBMCM- abgeleiteten Präparationen keinen offensichtlichen Effekt auf die DNA-Syntheseraten von nicht-osteoblastischen FRC-Zellen (Populationen 1-2).
Als gekochtes HBMCM zu einer Organkultur von fötalen Speichen und Ellen zugegeben wurde, bestand eine merkliche dosisabhängige Steigerung des Wachstums, was sich sowohl durch Steigerungen der diaphysealen als auch der insgesamten Elongation ausdrückte. Die höchste Wirkung wurde bei einer Proteinkonzentration von 8 µg/ml festgestellt. Bei dieser Konzentration betrug die Steigerung der diaphysealen und insgesamten Länge etwa 200 % bzw. 250% gegenüber Wachstumsfaktor-freien Kontrollen. Der Unterschied in der Größe der Elongation zwischen Diaphyse und Gesamtrudiment resultierte aus einem gesteigerten Wachstum der knorpeligen epiphysealen Enden. Die höchste Wirkung von gekochtem HBMCM war nahezu zweimal diejenige einer positiven Insulinkontrolle.

Thymocytenproliferations-Assay auf IL1-Aktivität

Die Tabelle 4 zeigt, daß, im Unterschied zu IL1-Präparationen, in Medium mit PHA weder gekochtes HBMCM noch das nach dem Heparin-Sepharose-Schritt erhaltene Derivat den [³H]TdR-Einbau in Thymocyten-DNA stimulierte, was nahe legt, daß der HBMCM- abgeleitete Wachstumsfaktor nicht ähnlich zu IL1 ist. Tabelle 4 Effekt von IL1 und HBMCM-Präparationen auf den Einbau von [³H]TdR in DNA von isolierten murinen Thymocyten
a HBMCM- und IL1-Präparationen wurden in Gegenwart von 10,0 mg/ml PHA getestet.
b Mittelwert ± SE von acht Kulturmikrovertiefungen.
c HBMCM nach dem Heparin-Sepharose-Schritt.
d Aus menschlichen Monocyten.
e Aus Mensch, rekombinant

PDGF-Gehalt

Die Zugabe von polyklonalen Anti-PDGF-Antikörpem zu ROS 17/2-Zellen inhibierte die PDGF-stimulierte Replikation aber verminderte nicht den mitogenen Effekt, der durch mittlere Dosierungen von gekochtem HBMCM und der nach dem Heparin-Sepharose-Schritt erhaltenen Präparation erzeugt wurde. Unter diesen Bedingungen sollte die Gegenwart einer bedeutsamen Menge an PDGF in den HBMCM-abgeleiteten Präparationen zu einer verminderten Steigerung der ROS-Zellproliferation geführt haben, als mit dem Antiserum getestet wurde.

BEISPIEL 2 (REINIGUNG ZUR STUFE 2A)

MATERIALIEN UND METHODEN

Materialien

F-10 (HAM)-Medium (Nährstoffmischung), fötales Kälberserum (FCS), Dulbeccos Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) und Penicillin-Streptomycin-Lösung wurden von Gibco (Chagrin Falls, OH) erhalten. [Methyl-³H]-thymidin ([³H]TdR) (5mCi/mmol) stammte vom Nuclear Research Center (Negev, Israel). Heparin-Sepharose CL-6B wurde von Pharmacia (Uppsala, Schweden) bezogen. Reagenzien fur den Assay auf alkalische Phosphatase wurden von Sigma (St. Louis, MO) und Chemikalien für SDS-PAGE von Bio-Rad (Richmond, CA) erworben. Die transformierenden Wachstumsfaktoren Beta 1 (TGFβ1) und Beta 2 (TGFβ2) wurden von R&D-Systems (Minneapolis, MN) erhalten. Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor I (IGF-I) wurde von Merck, Sharp and Dohme Research Laboratories, Rahway, NJ, erhalten. Alle anderen Chemikalien waren analysenrein und wurden von der Merck AG (Darmstadt, W.-Deutschland) bezogen. Ratten-Osteosarkom (ROS)-Zellen wurden von Dr. G.A. und S.B. Rodan (Merck, Sharp and Dohme Research Laboratories, West Point, PA) erhalten. Gewebekulturschalen wurden von Nunc (Roskilde, Dänemark) erhalten.

Herstellung von mit heilendem Knochenmark konditioniertem Medium (HBMCM)

Konditioniertes Medium wurde aus heilendem Knochenmark hergestellt wie bereits von Bab, I., et al., (1988) Endocrinology 123:345 beschrieben wurde. Kurz gesagt, wurde Gewebe aus dem Markraum von Ratten-Schienbeinen 10 Tage nach einer Entnahme herausgetrennt und 24 Stunden lang in serumfreiem F-10-Medium, das mit 1 % (v/v) Penicillin-Streptomycin supplementiert war, bei 37ºC in 5 % CO&sub2;-Luft inkubiert. Das Medium wurde dann abgesammelt, 10 Minuten lang gekocht, 30 Minuten lang bei 25 000 x g zentrifugiert und durch eine Millipore-Membran mit 0,45 µm Porengröße filtriert.

Zellkulturen

Die Wachstumsfaktor-Aktivität (GFA) wurde durch Untersuchen der Effekte auf die DNA- Synthese in einer Kultur von osteogenischen ROS 17/2-Zellen überprüft. Kurz gesagt, wurden HBMCM-abgeleitete Präparationen und andere Wachstumsfaktoren zu 2 cm² großen Kulturvertiefungen gegeben (16 mm-Mehrfachvertiefungs-Schalen), welche ROS-Zellen in serumfreiem F-10-Medium enthielten. Nach 22 Stunden wurden die Kulturen mit [³H]TdR, 2 µCi/ml, gepulst. Zwei Stunden später wurde die Gesamtradioaktivität von in Trichloressigsäure unlöslichem Material durch Flüssigkeitsszintillations-Spektrometrie bestimmt, und die Daten wurden als Prozentsatz gegenüber unbehandelten Kulturen oder Wachstumsfaktor- Einheiten (GFU) ausgedrückt. Eine Einheit wurde als der halbe Effekt von 10 % fötalem Rinderserum in einem gegebenen Experiment definiert. Um die Spezifität der HBMCM- Derivate auf osteogenische Zellen zu prüfen, wurden einige Präparationen in Kulturen nichtosteogenischer ROS 25/1-Zellen unter Verwendung eines Protokolls, das ähnlich zu dem obenstehend für die ROS 17/2-Zellen beschriebenen war, getestet.

Affinitätschromatographie

Eine Heparin-Sepharose-Säule (0,9 x 25 cm Bettvolumen) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet, mit PBS gepackt und bei Raumtemperatur bei einer Flußrate von 0,5 ml/min von einer Pumpe beschickt. Eine 2 ml große Probe mit 28 mg gekochtem HBMCM in PBS wurde auf die Säule geladen und in zwei Schritten eluiert. Zuerst wurde das Heparin-Sepharose-Bett 200 Minuten lang isokratisch mit PBS gewaschen. Dann wurde ein zweistufiger linearer Gradient von 0,15-1,35 M NaCl in Phosphatpuffer, pH 7,2, durch die Säule gepumpt. Die Gradientengeschwindigkeit betrug 0,015 M/Minute bzw. 0,005 M/Minute während den Stufen I bzw. II. Es wurden Fraktionen von zwei Millilitern aufgefangen und 24 Stunden lang gegen 5 mM Ammoniumacetat dialysiert, nach Protein untersucht und lyophilisiert.

Inaktivierungs-Experimente

Proben von den Heparin-Sepharose-Spitzenaktivitäts-Fraktionen, welche etwa 10 GFU enthielten, wurden in Wasser gelöst und 90 Minuten lang bei 37ºC mit (a) 5 mM Dithiothreitol (DTT); (b) 0,1 M HCl und (c) PBS-Kontrolle reagieren gelassen. Die Reaktionen wurden durch fünfstündige Dialyse gegen 5 mM Ammoniumacetat im Kalten beendet.

Gelelektrophorese

Eine SDS-PAGE wurde in 1,5 mm dicken 10-18 %-Gradientengelen gemäß Laemmli, Nature 227, 680 (1970) durchgeführt.

Alkalische Phosphatase-Aktivität

Für diesen Assay wurden ROS 17/2-Zellen 48 Stunden lang in F-10-Medium herangezogen, welches mit 2 % FBS supplementiert war. Während der letzten 24 Stunden wurden die Zellen mit 10 µg/ml von entweder gekochtem oder nicht-gekochten konditionierten Medium oder 2 µg/ml der Heparin-Sepharose-Spitzenaktivitäts-Fraktionen angeregt. Danach wurde das Medium aus den Kulturen entfernt und die Zellen wurden mit PBS gewaschen, in destilliertes Wasser abgeschabt und mit Ultraschall behandelt. Die Enzymaktivität wurde mit p-Nitrophenylphosphat als Substrat geassayt. Die Ergebnisse wurden als pro Minute freigesetzte Mikromol p-Nitrophenol /10&sup6; Zellen, welche in Schwesterkulturen gezählt wurden, ausgedrückt.

Proteingehalt

Protein wurde nach dem Verfahren von Bradford, Anal. Biochem. 72,248 (1976), bestimmt.

ERGEBNISSE

Das Elutionsprofil der GFA von der Heparin-Sepharose-Säule, welches durch die Steigerung des [³H]TdR-Einbaus in DNA von ROS 17/2-Zellen sichtbar gemacht wurde, wurde erhalten. Tabelle 5 Heparin-Sepharose-Chromatographie von HBMCM-abgeleiteter Wachstumsfaktor-Aktivität: Elutionszeit¹ und maximale Peak- Aktivität²
1 Die Elutionszeit wird getrennt vom Angang jeder Stufe an angegeben.
2 Die nach der Aktivität geassayten Fraktionsproben enthielten 2 mg/ml Protein. Die Daten sind Mittelwerte ± SE (Standardabweichung) von drei Wiederholungsversuchs- Kulturen pro Bedingung.
Drei Haupt-Peaks der Aktivität, AI, AII und AIII, eluierten, als die Säule isokratisch mit PBS gewaschen wurde (Tabelle 5). Die Präparation A-I und insbesondere A-II waren gegenüber der Reduktion mit DTT und der Ansäuerung mit HCl ziemlich stabil (Tabelle 6). Tabelle 6 Stabilität von HBMCM-abgeleiteten GFA-Peaks, welche mittels Heparin-Sepharose-Chromatographie aufgetrennt wurden.
Die Beständigkeit gegenüber Reduktion wurde weiter durch Gelelektrophorese bestätigt, worin sowohl A-I als auch A-II auf reduzierten und nicht-reduzierten Gelen gleich erschienen. A-II enthielt eine nahe an der Gelfront wandernde Komponente und einige weitere Spezies von 60-75 kD. A-I bestand aus mehreren Komponenten im Bereich von 55-90 kD. Als die Säule mit einem NaCl-Konzentrationsgradienten bepumpt wurde, wurden die jeweiligen GFA-Peaks, bezeichnet als B-I, B-II und B-III, bei 0,3, 0,75 bzw. 1,2 M Salz getrennt. Die Präparation B-II wurde durch Reduktion inaktiviert (Tabelle 6) und zeigte auf reduzierten Gelen mehrere 55-80 kD große Banden. Weiterhin enthielten B-I bzw. B-II 14 bzw. 33 kD große Banden. Die in den Präparationen A-III und B-III gewonnene Menge an Protein war für deren Test in den Inaktivierungs- und Elektrophorese-Experimenten ungenügend.
Das konditionierte Medium vor dem Kochen versagte darin, die alkalische Phosphatase von ROS-Zellen zu beeinflußen. Die Präparationen A-II, B-II und B-III stimulierten die Enzymaktivität beinahe um das zweifache. Die höchste stimulierende Wirkung jedoch wurde beobachtet, als HBMCM getestet wurde (300 %).
Nicht-osteogenische ROS 25/1-Zellen sind aus dem gleichen Tumor erhalten worden, wie die ROS 17/2-Zellen, aber im Unterschied zu den letzteren exprimieren sie keinen osteogenischen Phänotyp. Die Präparation A-II versagte darin, den Einbau von [³HJTdR in die DNA von ROS 25/1-Zellen zu stimulieren. A-I zeigte etwas Stimulation, welche jedoch nur 40 % ihrer Wirkung auf ROS 17/2-Zellen ausmachte. B-I besaß einen ahnlichen Effekt auf beide Zelltypen.

DISKUSSION

Während der osteogenischen Phase erzeugt sich regenerierendes Knochenmark eine Wachstums-fördernde Aktivität auf osteogenische Zellen. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, daß die Aktivität in HBMCM in mindestens sechs unabhängige Aktivitäten unterteilt ist, welche durch Heparin-Sepharose-Affinitätschromatographie auftrennbar sind. In ähnlicher Weise wurde gezeigt, daß die aus entmineralisierter Knochenmatrix erhaltene Wachstumsfaktoraktivität aus mehreren proteinartigen Spezies besteht, welche gleichfalls auf Heparin- Sepharose auftrennbar sind. Obwohl die mehrfachen Peaks in dem HBMCM theoretisch aus einem proteolytischen Abbau oder der Aggregation eines Faktors mit einem unterschiedlichen "Träger"-Protein resultieren könnten, ist dies unwahrscheinlich, da (a) der Einschluß von Proteinaseinhibitoren während der Konditionierung des Mediums und der weiteren Verarbeitung das Elutionsprofil von Heparin-Sepharose nicht veränderte (Daten nicht gezeigt) und (b) die Eigenschaften der separaten GFA-Peaks hinsichtlich Stabilität und Zielzell-Wirkung deutlich unterschiedlich sind.

BEISPIEL 3 (STUFE 2B: REINIGUNG UND AMINOSÄURE-SEQUENZIERUNG VON OGP)

MATERIALIEN

F-10 (HAM)-Medium (Nährstoffmischung) und Kanamycinsulfat wurden von Grand Island Biological (Grand Island, NY) erhalten. Fötales Rinderserum (FBS) war von Hazelton/KC Biologicals (Leneta, KS). [Methyl-³H]-thymidin ([³H]TdR) (6,7 Ci/mmol) wurde von New England Nuclear (Boston, Ma.) bezogen. Trans-Epoxysuccinylleucylamido-(4-guanidino)- butan (E64), Leupeptin und Pepstatin waren von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Heparin-Sepharose CL-6B und Sephadex G25 wurden von Pharmacia (Uppsala, Schweden) erhalten. Die Gewebekulturschalen waren das Produkt von Costar (Cambridge, Ma).

METHODEN

Partielle Reinigung von GFA aus HBMCM

HBMCM wurde wie obenstehend beschrieben (Beispiel 1 und 2) hergestellt und durch Kochen und Heparin-Sepharose-Chromatographie unter Verwendung einer Modifikation des in Bab I. et al. (1988) Endocrinology 123:345 berichteten Protokolls teilweise gereinigt. Das HBMCM wurde 10 Minuten lang gekocht und dann bei 25 000 x g 45 Minuten lang in einer gekühlten Zentriflige zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesammelt und mit den folgenden Proteaseinhibitoren supplementiert: 25 µM E64, 25 µM Leupeptin und 5 µM Pepstatin. Dieselbe Mischung von Proteaseinhibitoren wurde auch zu den aus den anschließenden Heparin-Sepharose-, Gelfiltrations- und Ionenaustauschschritten gewonnen Präparationen zugesetzt (siehe nachfolgend).

Affinitätschromatographie

Eine Heparin-Sepharose-Säule (1,6 x 24 cm Bettvolumen) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet, wobei mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), welche bei einer Flußrate von 0,5 ml/min bei 4ºC gepumpt wurde, äquilibriert wurde. Gekochtes HBMCM, welches 100 mg Protein enthielt, wurde durch die Säule laufen gelassen. Die Säule wurde weiter mit 50 ml PBS gewaschen. Das gewonnene konditionierte Medium und PBS wurden dann vereinigt und lyophilisiert. Der Heparin-Sepharose-Schritt wurde wiederholt durchgeführt, um die partiell bearbeitete GFA in fur eine weitere Reinigung ausreichenden Mengen anzusammeln.

Verfolgen der GFA in osteogenischen Zellen

Dies wurde in osteoblastischen ROS-17.2-Zellen wie obenstehend beschrieben (Beispiel 1) durchgeführt, mit der Ausnahme daß Kanamycinsulfat das Penicillin-Streptomycin ersetzte. Die Ergebnisse wurden als GFU oder Prozentsatz gegenüber PBS-Kontrollen ausgedrückt.

Ionenaustauschchromatographie

Um Salze, kaltes (nicht-radioaktives) Thymidin und andere Komponenten des Gewebekulturmediums zu entfernen, wurde die aus der Heparin-Sepharose-Säule gewonnene Präparation in einem kleinen Volumen Wasser gelöst und über eine vorher gepackte Sephadex G25-Säule (PD-10) laufen gelassen. Für die Äquilibrierung der Säule und das Eluieren wurde Armnoniumacetat (5 mM) verwendet. Das Hohlraumvolumen aus mehreren Säulen wurde aufgefangen und Fraktionen, welche GFA in dem ROS 17.2-Zell-Assay zeigten, wurden vereinigt und lyophilisiert.
Für die Ionenaustauschchromatographie wurde 50 mM Natriumacetatpuffer (SAB), pH 5,0, bei 1 ml/1,65 mg Protein zu dem lyophilisierten Material gegeben. Die Mischung wurde bei 10 000 x g 15 Minuten lang zentrifugiert und das Pellet, das etwa 85 % des Proteins in der Mischung enthielt, wurde verworfen. Proben des Überstands mit 0,4-7,0 mg Protein wurden auf einer Mono-S HR 5/5-Schnell-Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC)-Kationenaustauschsäule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) unter Verwendung des Waters 650 Advanced Protein Purification System (Millipore Corporation, Milford, MA) chromatographiert. Die Säule wurde bei einer Flußrate von 1 ml/min in drei Stufen von einer Pumpe beschickt: i. 3 Minuten lang isokratisch mit dem anfänglichen SAB; ii. 30 Minuten linearer Gradient mit 0-1,0 M NaCl in SAB; und iii. 7 Minuten mit 1,0 M NaCl in SAB. 1 ml große Fraktionen wurden gesammelt und Proben mit etwa 30 ng Protein wurden hinsichtlich der GFA geassayt. Die Ergebnisse für jede Fraktion wurden als der Prozentsatz der zugeordneten Kontrollproben ausgedrückt, welche aus den entsprechenden, während eines identischen Durchgangs ohne Laden des Proteins, von der Säule erhaltenen Fraktionen bestanden.

Umkehrphasenchromatographie

Fraktionen aus mehreren Ionenaustauscher-Durchgängen, welche GFA aufzeigten, wurden vereinigt, und 3,2 ml mit einem geschätzten Gesamtproteingehalt von 18 µg wurden auf eine C1/C8-ProRPC HR 5/2-FPLC-Umkehrphasensäule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) geladen. Die Säule wurde mit einem 0 - 100 % Acetonitril-Gradient mit 0,1 % Trifluoracetat (TFA) bei einer Flußrate von 0,5 ml/min eluiert. Die Fraktionen, je 0,5 ml, wurde aufgefangen und in einem Speedvac-Konzentrator (Savant, Farmingdale, NY) getrocknet. Davor wurden 10 µl große Aliquots aus jeder Fraktion getrennt getrocknet, wieder in PBS gelöst und hinsichtlich der GFA geassayt.

Aminosäuresequenzierung

Aus der Umkehrphasen-Säule gewonnene Fraktionen, die eine GFA zeigten, wurden vereinigt und eine Probe mit 30 ng Protein wurde einem automatisierten Edman-Abbau zur Aminosäuresequenzierung in einem Gasphasen-Proteinsequenzierer Modell 470A, ausgerüstet mit einem On-Line-PTH-Analysator, Modell 120A (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) unterzogen.

Proteingehalt

Protein wurde wie obenstehend beschrieben bestimmt (Beispiel 1).

ERGEBNISSE

Umkehrphasenchromatographie

Das Elutionsprofil der Umkehrphasenchromatographie ist in der Fig. 1 gezeigt. Protein wurde in zwei kleineren Peaks (Elutionszeit 27 und 36 Minuten) und einem großeren Peak (Elutionszeit 45 Minuten) gewonnen. Ein größerer GFA-Peak wurde nach 19-22 Minuten, einer 27 % Acetonitril entsprechenden Elutionszeit, gewonnen.
Die Aminosäuresequenz des in den mitogenisch aktiven Fraktionen gewonnenen Proteins (Elutionszeit 19-22 Minuten, Fig. 2) ergab ein Peptid von 14 Resten, Molekulargewicht 1523. Es gab keinen Beweis für die Gegenwart anderer kontaminierender Peptide in dieser Präparation. Die Sequenz ist in der Tabelle A gezeigt.

BEISPIEL 4 (BIOLOGISCHE AKTIVITÄT VON SYNTHETISCHEM OGP)

MATERIALIEN

t-Boc-Gly-OCH&sub2;-Pam-Harz, N-Boc-geschützte Aminosäurederivate, N,N-Dicyclohexylcarbodiimid (DDC), 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT), Dusopropylethylamin (DIEA), Trifluoressigsäure (TFA), N,N-Dimethylformamid (DMF) und Dichlormethan (DCM) wurden von Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) erhalten. Fluorwasserstoff (HF) wurde von Matheson (Secacus, NJ) erworben, p-Cresol von Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI) und Sephadex G15F von Pharmacia (Uppsala, Schweden). F-10 (HAM)-Medium (Nährstoffmischung) und Kanamycinsulfat wurden von Grand Island Biological (Grand Island, NY) erhalten und fötales Rinderserum (FBS) stammte von Polysciences Inc. (Warrington, PA). Männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 240-260 g kamen von Taconic Farm, NY. Achromycin (Tetracyclinhydrochlorid) stammte von Lederle (Pearl River, NY) und Terramycin (Oxytetracyclin) von Roerig-Pfizer (New York, NY). Die Bestandteile des Methylmethacrylat-Einbettungsharzes waren das Produkt von Fischer Scientific (Fair Lawn, NJ).

METHODEN

Herstellung von svnthetischem OGP (sOGP)

sOGP wurde mittels des Festphasen-Syntheseverfahrens von Merrifield (1969), Adv. Enzymol. 32:221, unter Verwendung eines automatisierten Peptid-Synthesizers Applied Biosystems Modell 430A (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) synthetisiert. Die Synthese wurde auf 0,5 mmol t-Boc-Gly-OCH&sub2;-Pam-Harz (1 % quervernetzt, 0,78 mmol/g) durchgeführt. Die Aminosäurederivate waren an der α-Aminoflmktion durch t- Butyloxycarbonyl (Boc)-Gruppen geschützt. Der Schutz der Seitenketten war der folgende: Arg (Tos), Lys (2-Cl-Z), Tyr (2-Br-Z) und Thr (O-Bzl). Die Kopplung der Boc-geschützten Derivate von Arg und Gln erfolgte durch das DCC-HOBT-Verfahren von Konig, W. und Geiger, R. (1970) Chem. Ber., 103:788. Alle anderen Aminosäurederivate wurden mittels des DCC-vermittelten vorgeformten symmetrischen und des Anhydrid-Verfahrens von Hagemaier, H. und Frank, H. (1972), Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 353:1973 gekoppelt. Die Kopplung jedes Aminosäurerestes wurde zweimal wiederholt. Das Entschützen des blockierten Aminoterminus erfolgte durch Behandlung mit 60 % TFA in DCM. Die Seitenketten wurden entschützt und das Peptid wurde unter Verwendung des HF-Verfahrens, worin eine Mischung aus 4 ml Anisol und 36 ml flüssigem Fluorwasserstoff 75 Minuten lang bei 0ºC verwendet wurde, vom Harz abgespalten (2,7 g Harz-gebundenes Peptid). Das unreine synthetische Peptid wurde partiell auf einer Sephadex G15F 3 x 35 cm Säule gereinigt, die mit 50 % (v/v) wäßriger Essigsäure eluiert wurde. Die weitere Reinigung wurde auf einer Waters DeltaPrep 3000 Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie-Vorrichtung bewerkstelligt, welche mit einem PrePak 1000-Modul (Millipore Corporation, Milford, MA) ausgestattet war. Die Patrone wurde mit einem 5-33,5 % Acetonitril-Gradienten mit 0,1 % TFA bei einer Flußrate von 100 ml/min bepumpt.

Die Wirkung von sOGP auf Knochen in vivo

sOGP in PBS-Lösung wurde täglich über die Schwanzvene bei 100 µl/Tag/Ratte 8 Tage lang an Ratten verabreicht. Kontrolltiere erhielten PBS allein oder ein Peptid mit der umgekehrten Sequenz von sOGP. Die Ratten wurden zweimal mit Tetracyclin durch intramuskuläre Injektionen von 6 mg Achromycin und Terramycin (in Wasser) an den Tagen 2 bzw. 8 markiert. Die Tiere wurden durch Enthaupten getötet und die Schienbeine wurden separiert und in 70%igem Ethanol fixiert. Die Proben wurden dann dehydratisiert, in Methylmethacrylat eingebettet und 10 µm dicke nicht-dekalzifizierte, ungefärbte Schnitte wurden einer Fluoreszenzmikroskopie unterzogen. Fluoreszenzbilder wurden unter Verwendung eines 480 nm Fluorescein-Filters in einem Microphot-Epifluoreszenzmikroskop (Nikon, Japan), das mit einer SIT-Videokamera (Dage-MTI, Michigan City, IN) ausgerüstet war, welche mit einem interaktiven Magiscan-Bildanalysator (Joyce-Loebl, Gateshead, UK) verbunden war, aufgezeichnet. Messungen an der kortiko-endostealen Oberfläche und der Oberfläche der proximalen metaphysealen Trabekel wurden auf dem Analysatorbildschirm bei 550facher Vergößerung durchgeführt. Die Trennung von Doppelmarkierungen wurde als der Mittelwert von mehreren Messungen zwischen der Mitte der Linien in allen doppelt markierten Zonen in 10 mikroskopischen Feldern bestimmt. Die Mineralauflagerungsrate (MAR) wurde als Mikrometer pro Tag des Zeitraums zwischen den Markierungen ausgedrückt.

ERGEBNISSE

Im Anschluß an 8 intravenöse Injektionen von sOGP zeigten sowohl die kortiko-endostealen als auch die metaphysealen trabekulären Oberflächen des Schienbeins eine erhöhte MAR (Fig. 2). Der wirksame Dosisbereich betrug 0,1-30 ng/Ratte/Tag.

Claims

1. Biochemisch reines Polypeptid (OGP) der Formel:

Ala-Leu-Lys-Arg-Gln-Gly-Arg-Thr-Leu-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly

oder eine homologe Verbindung, isoforme Verbindung oder eine Variante davon, wobei die homologe Verbindung, isoforme Verbindung oder Variante eine stimulatorische Wirkung auf osteoblastische Zellen und auf die in vivo-Knochenbildung hat, ein Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 2600 aufweist und eine Aminosäuresequenz hat, die zu mindestens 40 % in bezug auf OGP konserviert ist.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, welches OGP ist.

3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, welches aus sich regenerierendem Knochenmark erhältlich ist.

4. Polypeptid nach Anspruch 1, welches eine Sequenz von 6 oder mehr Aminosäuren beinhaltet.

5. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 4 mit einem Molekulargewicht von etwa 1000-1600.

6. Mischung, umfassend mehr als ein Polypeptid gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche.

7. Veffahren zur Herstellung eines osteogenischen Wachstumsfaktor-Polypeptids oder einer Mischung davon, wie in einem beliebigen der vorstehenden Ansprüche definiert, welches das Isolieren des/der Polypeptide (s), frei von biochemischen Abfall- bzw. Trümmerprodukten, aus sich regenerierendem Knochenmark umfaßt.

8. Verfahren zum Nachweis von Molekülen mit einer stimulierenden Wirkung auf osteoblastische Zellen und die in vivo-Knochenbildung, welches folgenden umfaßt:

(a) Kontaktieren des Moleküls mit einem Polypeptid oder einer Mischung davon, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 definiert; und

(b) Bestimmen der Wirkung auf osteoblastische Zellen und die in vivo-Knochenbildung im Vergleich zur in Abwesenheit dieses Moleküls vorliegenden Wirkung.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Steigerung der Knochenbildung, welche eine therapeutisch wirksame Menge eines Polypeptids oder einer Mischung davon, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 definiert, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.

10. Polypeptid oder eine Mischung davon, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 definiert, zur Verwendung bei der Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers zur Operation oder Therapie.