DE69633345T2

DE69633345T2 - Verfahren zur herstellung von rg3 und rg5 ginsenosiden

Info

Publication number: DE69633345T2
Application number: DE69633345T
Authority: DE
Inventors: Man Ki Sungnam-shi PARK; Nak Doo Dongjak-ku KIM; Jeong Hill Kangnam-ku PARK; Jong Moon Songpa-ku KIM; Yeon Su Kwanak-ku KANG; Wang You Songpa-ku KIM
Original assignee: CJ Corp; Ginseng Science Inc
Current assignee: Ginseng Science Inc; CJ CheilJedang Corp
Priority date: 1995-11-22
Filing date: 1996-11-20
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2016-11-21
Also published as: ATE275408T1; EP0873131A1; EP0873131B1; KR100228510B1; DE69633345D1; AU7656396A; JP2000502994A; WO1997018824A1

Description

FACHGEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Rg₃- und/oder Rg₅-Ginsenosid, einem der Saponinbestandteile von Ginseng.
STAND DER TECHNIK
Seit alters her wurde Ginseng weit verbreitet als typischster Nährmittelbestandteil und Tonikum verwendet. Heutzutage wurde über viele wissenschaftliche Ergebnisse über die Bestandteile und pharmakologischen Wirkungen von Ginseng berichtet, wodurch die geheimnisvollen pharmakologischen Wirkungen von Ginseng in die moderne Wissenschaft aufgenommen wurden.
Ginseng wurde allgemein in Form von frischem Ginseng, wie er nach Züchtung geerntet wird, weißen Ginseng, der durch Trocknen des frischen Ginsengs bei normaler Temperatur hergestellt wird, oder rotem Ginseng, der durch Erwärmen des frischen Ginsengs bei 98 bis 100°C hergestellt wird, verwendet. Es wurde erkannt, dass unter Ihnen insbesondere der rote Ginseng eine viel wirksamere pharmakologische Wirkung als weißer Ginseng aufweist. Demzufolge wurden gegenwärtig viele Forschungen über die spezifischen Bestandteile von rotem Ginseng aktiv durchgeführt. Es wurde erwogen, dass die spezifischen Bestandteile während des Verfahrens zur Herstellung von rotem Ginseng hergestellt werden und die ausgezeichnete pharmakologische Wirkung von rotem Ginseng erklären können.
Demzufolge wurde früher eine Anzahl von pharmakologischen Wirkungen beschrieben, die den Ginsengextrakten zugeschrieben werden.
Patent Abstracts of Japan, Band 17, Nr. 270 (C-1063), 1993 und die Japanische Patentanmeldung JP-A-05 009 123 (Isao Kitagawa) beschreiben ein karzinostatisches Mittel, das Rg3-Ginsenosid enthält, das von Panax-Ginseng C. A. Meyer erhalten wird. Es wird behauptet, dass das Mittel die Infiltration von Krebszellen und die Metastasen von Krebszellen selektiv unterdrücken kann.
Die Französische Patentanmeldung FR-A-2712191 betrifft Ginsengextrakte, die durch alkoholische Extraktion hergestellt werden, mit pharmakologischen Wirkungen auf das Kreislaufsystem.
Die Französische Patentanmeldung FR-A-2671488 beschreibt, dass Ginsengextrakte auf kardiovaskulärer Ebene für die Behandlung von Schmerz, Herzklopfen oder Herzrhythmusstörungen verwendet werden können.
Kürzlich fanden wir, wie in der Internationalen Patentanmeldung WO-A-9640181 beschrieben, dass verarbeiteter Ginseng eine verbesserte pharmakologische Wirkung insbesondere bei der Herstellung durch Erwärmen von Ginseng für eine Dauer von 0,5 bis 20 Stunden bei 120 bis 180°C aufweist.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
So führten die Erfinder eine Studie über die Mittel durch, die die pharmakologische Wirkung von Ginseng durch Erhöhung der spezifischen Bestandteile in rotem Ginseng verbessern können. Als Ergebnis einer solchen Studie ermittelten wir, dass ein verarbeiteter Ginseng mit einer stark verbesserten pharmakologischen Wirkung gegenüber frischem Ginseng, weißem Ginseng oder rotem Ginseng durch Erwärmen von Ginseng für eine Dauer von 0,5 bis 20 Stunden bei ei ner hohen Temperatur von 110 bis 180°C hergestellt werden kann. Im Verlauf des Abtrennens der verschiedenen Bestandteile, die in einem solchen verarbeiteten Ginseng vorliegen, und des Bestimmens der pharmakologischen Wirkungen davon ermittelten die Erfinder auch, dass Rg₃- und Rg₅-Ginsenosid, die in weißem Ginseng oder in rotem Ginseng nicht oder nur in einer geringen Menge enthalten sind, und für welche die pharmakologische Wirkung im Wesentlichen nicht bekannt war, eine ausgezeichnete gefäßerweiternde Wirkung aufweisen. So vollendeten wir die vorliegende Erfindung.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Rg₃- und/oder Rg₅-Ginsenosid.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Für ein gründliches Verständnis der Natur und der Aufgaben der Erfindung sollte auf die folgende detaillierte Beschreibung Bezug genommen werden, indem die begleitenden Zeichnungen in Beziehung gesetzt werden, wobei:
1 eine Gefäßerweiterung von Rg₃-Ginsenosid darstellt, das allein in Gegenwart von Endothel (-o-) verabreicht wird, im Vergleich mit Gefäßerweiterungen, bei welchen Rg₃ nach Entfernung des Endothels (-o-) verabreicht wird, und mit 10^–6 M Methylenblau (MB)(-Δ-) und mit 10^–6 M Nitro-L-arginin (NLA)(
) in Gegenwart von Endothel verabreicht wird;
2 gefäßerweiternde Wirkungen darstellt, wenn die verarbeitete Saponinfraktion auf Panaxadiolbasis, die in Beispiel 7 hergestellt wird, in Gegenwart von Endothel (-•-) und nach Entfernen des Endothels (-o-) verabreicht wird;
3 das Überlebensverhältnis von HUVEC-Zellen darstellt, wenn die Zellen mit Dimethylsulfoxid (DMSO) (-o-) und mit Ginsenosid Rg₃-DMSO-Lösung (
) als Hinweis auf die Cytotoxizitäten für HUVEC-Zellen von Ginsenosid Rg₃ und als Lösungsmittel verwendetes DMSO gezüchtet werden;
4 eine Gefäßerweiterung von Rg₅-Ginsenosid darstellt, das allein in Gegenwart von Endothel (-o-) verabreicht wird, im Vergleich mit Gefäßerweiterungen, wenn Rg₅-Ginsenosid nach Entfernung von Endothel (
) verabreicht wird; und mit 10^–6 M Methylenblau (MB)(
) und mit 10^–6 M Nitro-L-arginin (NLA) (Δ-) in Gegenwart von Endothel verabreicht wird; und
5 das Überlebensverhältnis von HUVEC-Zellen darstellt, wenn die Zellen mit destilliertem Wasser (-•-) und mit einer Lösung von Rg₅-Ginsenosid in destilliertem Wasser (
) als Index der Cytotoxizitäten für HUVEC-Zellen von Rg₅-Ginsenosid und als Lösungsmittel verwendetem destillierten Wasser gezüchtet werden.
BESTE AUSFÜHRUNGSWEISE DER ERFINDUNG
Die erfindungsgemäß hergestellten Rg₃- und Rg₅-Ginsenoside sind Saponinverbindungen mit den folgenden Formeln. In der vorliegenden Erfindung kann reines Rg₃- und/oder Rg₅-Ginsenosid, verarbeiteter Ginseng, der reich an Rg₃- und Rg₅-Ginsenosidbestandteilen ist, oder ein Extrakt davon als Rg₃- und Rg₅-Ginsenosidquelle verwendet werden.
Ginsengextrakt, das reich an Rg₃- und/oder Rg₅-Ginsenosid ist, kann durch das Verfahren erhalten werden, in welchem eine Pflanze der Panax-Gattung, enthaltend Ginsengsaponine, z. B. Panax ginseng, Panax notoginseng, Panax quinquefolium, Panax japonicus usw., Blätter oder Gewebekulturen davon oder ein Extrakt davon mit Wasser oder einem Niederalkohol für eine Dauer von 0,5 bis 20 Stunden bei einer Temperatur von 110 bis 180°C erwärmt werden; der so erhaltene verarbeitete Ginseng mit Wasser oder einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Methanol, Ethanol oder einem Lösungsmittelgemisch davon extrahiert wird, das Extrakt unter reduziertem Druck eingeengt wird, der Rückstand in Wasser suspendiert wird und die Suspension dann wieder mit einem nichtpolaren organischen Lösungsmittel wie Hexan, Ether, Dichlormethan, Chloroform, Ethylacetat oder einem Lösungsmittelgemisch davon extrahiert wird, die verbleibende wässrige Schicht wieder mit einem polaren organischen Lösungsmittel wie Butanol extrahiert wird und das Extrakt dann einer Chromatographie unterzogen wird, um eine Rg₃ oder Rg₅ enthaltende Fraktion oder eine gleichzeitig Rg₃ und Rg₅ enthaltende Fraktion zu erhalten. Durch wiederholtes Durchführen des chromatographischen Verfahrens kann der Gehalt an Rg₃- oder Rg₅-Ginsenosid stärker erhöht werden. Dann kann die Fraktion mit hohem Gehalt aus einem geeigneten Lösungsmittelsystem wie Wasser, Niederalkohol, Niederketon, Chloroform oder einem Lösungsmittelgemisch davon kristallisiert werden, um reines Rg₃- oder Rg₅-Ginsenosid zu erhalten. In diesem Verfahren wird während des Verfahrens des Wärmebehandelns von Ginseng eine Zuckereinheit, die an dem 20. Kohlenstoff des im Ginseng vorliegenden Panaxadiolsaponins wie die Ra-, Rb1-, Rb2-, Rc-, Rd-Ginsenoside usw. entfernt, um das gewünschte Rg₃-Ginsenosid herzustellen, und eine Doppelbindung kann anschließend an Position 20 von Rg₃ durch Dehydrierungsreaktion zur Herstellung des gewünschten Rg₅-Ginsenosids hergestellt werden. In einer anderen Ausführungsform können dieselben Ergebnisse in diesem Verfahren durch Umkehren der Reihenfolge des Wärmebehandlungsschritts und Extraktionsschritts mit organischem Lösungsmittel oder durch Erwärmen von Ginseng unter milden Bedingungen, z. B. bei 30 bis 100°C, vorzugsweise bei 70°C, gleichzeitig mit der Durchführung einer Säurebehandlung mit einer verdünnten anorganischen Säure wie Salzsäure, Salpetersäure, Perchlorsäure usw. oder einer niederen organischen Säure wie Essigsäure, Weinsäure, Oxalsäure usw. statt des Erwärmens bei hoher Temperatur, falls erforderlich, erhalten werden.
Zudem kann dasselbe Ergebnis durch direktes Erwärmen oder Säurehydrolysieren der bekannten Ginsenosidverbindungen Ra, Rb₁, Rb₂, Rc, Rd usw. oder einer Fraktion davon statt des Ginsengs selbst gemäß derselben Weise, wie vorstehend erwähnt, erhalten werden.
Bei der Herstellung von Rg₃ und/oder Rg₅ enthaltendem Ginsengextrakt kann eine Fraktion, enthaltend Panaxadiolsaponinbestandteil in hoher Konzentration, die durch Extrahieren von Ginseng mit einem organischen Lösungsmittel, z. B. Alkoholen wie Methanol, Ethanol, Butanol usw., Ethern oder einem Lösungsmittelgemisch davon vor der Wärmebehandlung zur Entfernung der unerwünschten Pana xatriolsaponinbestandteile hergestellt wird, einer Wärmebehandlung gemäß derselben Weise wie vorstehend erwähnt unterzogen werden, um eine verarbeitete Panaxadiolsaponinfraktion zu erhalten, die Rg₃ und/oder Rg₅ in großen Mengen enthält und den unerwünschten Panaxatriolsaponinbestandteil nicht enthält. Die so erhaltene Fraktion kann als verarbeitetes Ginsengextrakt, enthaltend Rg₃ und/oder Rg₅ gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Da Zusammensetzungen, die erfindungsgemäß hergestelltes Rg₃- und/oder Rg₅-Ginsenosid enthalten, wirkungsvolle Gefäßerweiternde Wirkungen aufweisen, können sie wirksam als Mittel zur Verhinderung oder Behandlung von Störungen, die durch Kreislaufstörungen wie Bluthochdruck, Arteriosklerose, Blutkreislaufstörungen, Diabetes mellitus, Sexualstörungen, Gedächtnisstörungen usw. verursacht werden, verwendet werden. Wird eine Zusammensetzung für solche Zwecke im klinischen Bereich verwendet, kann sie mit pharmazeutisch verträglichen Trägern zur Herstellung von verschiedenen Formulierungen, die herkömmlich auf dem pharmazeutischen Gebiet verwendet werden, z. B. oralen Präparaten wie Tabletten, Kapseln, Trochus, Lösungen, Suspensionen usw.; injizerbaren Präparaten in Form von injizierbaren Lösungen oder Suspensionen oder getrockneten injizierbaren Fertigpulvern, die mit injizierbarem destillierten Wasser direkt vor der Injektion wieder gebildet werden usw., oder örtlich anwendbaren Präparaten wie Salben, Cremes, Lösungen usw., kombiniert werden.
Die Träger, die in solchen Zusammensetzungen verwendet werden können, sind herkömmliche Träger des pharmazeutischen Gebiets, z. B. Bindemittel, Schmiermittel, Sprengmittel, Exzipienten, Löslichmacher, Dispersionsmittel, Stabilisatoren, Suspensionsmittel, Färbemittel, Geschmacksstoffe und dergleichen im Falle von oralen Präparaten; Konservierungsmittel, Mittel zur Schmerzlosigkeit, Löslichmacher, Stabilisatoren und dergleichen im Falle von injizierbaren Präparaten; Basen, Exzipienten, Schmiermittel, Konservierungsmittel und dergleichen im Falle von örtlich anwendbaren Präparaten. Die so hergestellten Arzneimittel können oral oder parenteral, wie z. B. intravenös, peritoneal, subkutan oder topisch verab reicht werden. Zudem können die oralen Präparate zusammen mit einem Säure neutralisierenden Mittel oder in Form eines enterisch beschichteten Präparats, das durch Beschichten des oral verabreichbaren festen Präparats wie eine Tablette mit den enterischen Beschichtungen zur Verhütung der Zersetzung des Präparats durch Magensäure bei oraler Verabreichung formuliert wird, verabreicht werden.
Obwohl die Verabreichungsdosierung des Rg₃- und/oder Rg₅-Ginsenosids für einen Menschen abhängig von der Absorption, Inaktivierungsgeschwindigkeit und Ausscheidungsgeschwindigkeit des Wirkstoffs im Körper, des Alters, des Geschlechts und des Zustands des Patienten, der Schwere der zu behandelnden Störungen und dergleichen ausgewählt werden kann, wird es im Allgemeinen an einen Erwachsenen in einer Menge von 5 bis 500 mg, vorzugsweise 10 bis 200 mg täglich verabreicht. Deshalb kann bei Formulierung der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in die Einheitsdosierungsform jede der Einheitsdosisformen Rg₃- und/oder Rg₅-Ginsenosid in einer Menge von 5 bis 500 mg, vorzugsweise 10 bis 200 mg unter Berücksichtigung des wie vorstehend erwähnten wirksamen Mengenbereichs enthalten. Falls nötig, kann die so formulierte Einheitsdosierungsform unter Verwendung eines spezialisierten Verfahrens gemäß der Einschätzung des Spezialisten, der die Verabreichung und den Bedarf der Patienten anordnet oder beobachtet, verabreicht werden. Die tägliche Gesamtdosis kann auch in mehrere Portionen aufgeteilt und über mehrere Male, vorzugsweise 1 bis 6 Mal verabreicht werden.
Wie durch die nachstehend beschriebenen Testergebnisse begründet, zeigen sie, da Rg₃- und/oder Rg₅-Ginsenoside als Wirkstoffe der Zusammensetzungen eine Gefäßerweiterung ohne jegliche Schädigung des Gefäß Endothels zeigen, keine Nebenwirkung wie Hämolyse oder Toxizität bei Fischen und keine akute Toxizität bei Testtieren, weshalb sie sicher verwendet werden können.
Die vorliegende Erfindung wird spezifischer durch die folgenden Beispiele, Testbeispiele und Zusammensetzungsbeispiele erklärt. Jedoch sollte es klar sein, dass die vorliegende Erfindung auf diese Beispiele in keinster Weise beschränkt ist.
BEISPIEL 1: Herstellung von Ginsengextrakt, enthaltend Rg₃-Ginsenosid
100 g frischer Ginseng wurde in einen versiegelten Behälter eingebracht und dann für eine Dauer von 2 Stunden bei 130°C erwärmt. Der erhaltene verarbeitete Ginseng wurde mit 200 ml Methanol extrahiert, um das Methanolextrakt zu erhalten, und das Methanol dann aus dem Extrakt durch Verdampfen entfernt. Der Rückstand wurde in 100 ml Wasser suspendiert, 3 Mal mit 100 ml Ether extrahiert und die übrige wässrige Schicht 3 Mal mit 100 ml Butanol, gesättigt mit Wasser, extrahiert, um das Saponine enthaltende Butanolextrakt zu erhalten. Dieses Butanolextrakt wurde getrocknet und dann einer Silicagelsäulenchromatographie (Eluent; Ethylacetat/Methanol/Wasser = 20 : 1 : 1) unterzogen, um 1,5 g der Fraktion, enthaltend 60% des gewünschten Rg₃-Ginsenosids zu erhalten.
BEISPIEL 2: Herstellung von Ginsengextrakt, enthaltend Rg₅-Ginsenosid
1,0 g einer Fraktion, enthaltend 50% des gewünschten Rg₅-Ginsenosids, wurde gemäß demselben Verfahren wie in Beispiel 1 erhalten.
BEISPIEL 3: Herstellung von Ginsengextrakt, enthaltend Rg₃-Ginsenosid
1 kg getrockneter Wurzelhaarginseng wurde mit 2 l Methanol extrahiert und dann filtriert. Der so erhaltene Ginsengextrakt wurde unter reduziertem Druck getrocknet. Das erhaltene Ginsengextrakt in Form eines Sirups wurde in einen Autoklaven eingebracht und dann für eine Dauer von 4 Stunden bei 120°C erwärmt. Das wärmebehandelte Ginsengextrakt wurde einer Silicagelsäulenchromatographie gemäß demselben Verfahren wie in Beispiel 1 unterzogen, um 20 g der Fraktion, enthaltend 65% des gewünschten Rg₃-Ginsenosids, zu erhalten.
BEISPIEL 4: Herstellung von Ginsengextrakt, enthaltend Rg₅-Ginsenosid
10 g einer Fraktion, enthaltend 60% des gewünschten Rg₅-Ginsenosids, wurden gemäß demselben Verfahren wie in Beispiel 3 erhalten.
BEISPIEL 5: Herstellung von Ginsengextrakt, enthaltend Rg₃-Ginsenosid
1 kg weißer Ginseng wurde mit 2 l Methanol für eine Dauer von 4 Stunden unter Rückfluss extrahiert und dann filtriert. Der so erhaltene Ginsengextrakt wurde unter reduziertem Druck getrocknet. Das erhaltene Ginsengextrakt in Form eines Sirups wurde mit einer Säure gemäß dem bekannten Verfahren (siehe: Yakhak Hoeji, Band 35(5), Seite 432–437, 1991) behandelt. Speziell wurde das Ginsengextrakt in 1 l eines Lösungsmittelgemischs aus Wasser und Essigsäure (1 : 1) gelöst und bei 70°C für eine Dauer von 2 Stunden unter Rühren erwärmt. Dann wurde das Lösungsmittel entfernt, um das säurebehandelte Ginsengextrakt zu erhalten, das einer Silicagelsäulenchromatographie in derselben Weise wie in Beispiel 1 unterzogen wurde, um 20 g der Fraktion, enthaltend 72% des gewünschten Rg₃-Ginsenosids zu erhalten.
BEISPIEL 6: Herstellung von Ginsengextrakt, enthaltend Rg₅-Ginsenosid
10 g einer Fraktion, enthaltend 60% des gewünschten Rg₅-Ginsenosids wurden gemäß demselben Verfahren wie in Beispiel 5 erhalten.
BEISPIEL 7: Herstellung von verarbeiteter Panaxadiolsaponinfraktion
1 kg Ginseng wurde mit 200 ml Methanol extrahiert, um das Methanolextrakt zu erhalten, und das Methanol wurde dann von dem Extrakt durch Abdampfen entfernt. Der Rückstand wurde in 100 ml Wasser suspendiert und 3 Mal mit 100 ml Ether extrahiert. Die übrige wässrige Schicht wurde 3 Mal mit einem Lösungsmit telgemisch aus Ethylacetat und Butanol (10 : 1) extrahiert und die übrige wässrige Schicht wieder 3 Mal mit 100 ml Butanol extrahiert, um die Panaxadiolsaponinfraktion zu erhalten. Diese Panaxadiolsaponinfraktion wurde für eine Dauer von 3 Stunden bei 130°C in derselben Weise wie Beispiel 1 wärmebehandelt, um etwa 40 g der verarbeiteten Panaxadiolsaponinfraktion zu erhalten.
BEISPIEL 8: Herstellung von Rg3-Ginsenosid
1 g der Fraktion, enthaltend Rg₃-Ginsenosid, hergestellt in vorstehendem Beispiel 3, wurde wiederholt einer Silicagelsäulenchromatografie in derselben Weise wie in Beispiel 1 unter Verwendung des Lösungsmittelgemischs aus Ethylacetat/Methanol/Wasser (20 : 1 : 1) als Eluent unterzogen, um 500 mg der Fraktion, enthaltend 92% des gewünschten Rg₃-Ginsenosids zu erhalten. Die so erhaltene Rg₃-Ginsenosid enthaltende Fraktion wurde aus dem Lösungsmittelgemisch aus Methanol und Ethylacetat umkristallisiert, um etwa 400 mg des gewünschten Rg₃-Ginsenosids zu erhalten.
Das so erhaltene Rg₃-Ginsenosid stellt ein ¹³C-NMR-Massenspektrum bereit, das mit den aus der Literatur (siehe Yakugaku Zasshi, 103(6), Seite 612–622, 1983) bekannten Daten übereinstimmt. Das heißt, Rg₃ zeigt einen spezifischen Peak im CNMR-Spektrum, wenn etwa 10 mg so erhaltenes Rg₃-Ginsenosid in 600 μl Pyridin-d₅ (99,5%) gelöst und dann einer CNMR-Spektroskopie unterzogen wurde. Zusätzlich ist ein Molekülionenpeak von 785 ([M + H]⁺) oder 807 ([M + Na]⁺) im Massenspektrum (FAB+) von Rg₃-Ginsenosid dargestellt.
BEISPIEL 9: Herstellung von Rg5-Ginsenosid
200 mg einer Fraktion, enthaltend etwa 90% Rg₅-Ginsenosid, wurden gemäß demselben Verfahren wie in Beispiel 8 aus 1 g der vorstehend in Beispiel 4 hergestellten Rg₅-haltigen Fraktion hergestellt. Dann wurde die so erhaltene Fraktion aus einem Lösungsmittelgemisch aus Ethanol und Ethylacetat umkristallisiert, um etwa 150 mg des gewünschten Rg₅-Ginsenosids zu erhalten.
Das so erhaltene Rg₅-Ginsenosid stellt die folgenden Eigenschaften dar.
MS(FAB+, m/z) : 789 ([M + Na]⁺), 805([M + K]⁺)
¹³C-NMR (ppm, Pyridin-d5): δ 13,0, 16,0, 16,5, 16,6, 17,0, 17,8, 18,5, 25,8, 26,7, 27,0, 27,4, 28,1, 32,3, 32,6, 35,3, 37,0, 39,2, 39,7, 40,2, 50,5, 50,9, 51,2, 56,4, 62,6, 62,8, 71,4, 72,4, 72,6, 77,2, 77,9, 78,1, 78,3, 78,3, 83,5, 88,9, 105,2, 106,1, 123,5, 124,6, 131,2, 140,2
Testbeispiel 1: Gefäßerweiternde Aktivität von Rg3- und Rg5-Ginsenosid
Gefäßendothel spielt eine sehr wichtige Rolle bei der Beibehaltung der Homöostase im Blut durch Regulierung des Blutstroms und der Blutgefäßspannung und durch Hemmen der Plättchenkoagulation. Insbesondere ist es bekannt, dass das GefäßEndothel Stickoxid (NO) als Endothel-abgeleiteter Relaxationsfaktor (EDRF) freisetzt, das auf die glatte Muskulatur des Blutgefäßes wirkt, um lösliche Guanylatcyclase zu aktivieren und das Blutgefäß durch Erhöhen des cyclischen GMP im Gewebe zu entspannen. Wird die Funktion des Endothels durch Kreislaufstörungen wie Bluthochdruck, Hypercholesterämie usw. gestört, vermindert sich die freigesetzte Menge an Stickoxid, wodurch der Verlust der normalen Funktion der Regulierung des Blutgefässes verursacht wird. Da jedoch die meisten Saponine die Endothelzellen unter Verursachung von schweren Nebenwirkungen wie Hämolyse oder Toxizität bei Fischen usw. zerstören, sind sie unerwünscht. Deshalb war ein Bestandteil erforderlich, der eine Gefäßerweiterung des Blutgefäßes ohne jegliche Schädigung des Endothels zeigt.
Die Erfinder stellten fest, dass Rg₃- und Rg₅-Ginsenosid eine wirksame Endothel-abhängige Gefäßerweiterung zeigt, die sich von den herkömmlichen Saponinkomponenten unterscheidet, was durch den folgenden Versuch ermittelt wurde.
1. Versuchsverfahren
Sprague-Dawley(SD)-Ratten, die 300–400 g wogen, wurden getötet, und ihre Thorax-Schlagadern wurden schnell entfernt und dann in eine Krebs-Ringer-Natriumbicarbonatlösung (Kontrolllösung, NaCl 118,3; KCl 4,7; MgSO₄ 1,2; KH₂PO₄ 1,2; CaCl₂ 2,5; NaHCO₃ 25,0; CaEDTA 0,016 und Glukose 11,1 mM) gegeben. Blut in den Hauptschlagadern, und das Blutgefäß umgebendes Fett- und Bindegewebe wurden entfernt und die sauberen Hauptschlagadern dann zur Herstellung der Aortaringe mit einer Länge von 2–3 mm abgeschnitten. Die Aortaringe wurden vertikal in einer Organkammer, befüllt mit 25 ml Kontrolllösung (pH 7,4), suspendiert. In einigen Aortaringen wurde das Endothel mechanisch durch Rollen der Ringe 7 bis 8 Mal über ein Gewebehandtuch mit einer Pinzette entfernt. Der Boden des Aortarings wurde an der Organkammer befestigt und der obere Teil davon mit einem Umwandlungskuppler durch Bügel zum Aufzeichnen der isometrischen Spannung verbunden.
Den Aortaringen, die eine stabile Kontraktion, induziert durch Zugabe von 10^–6 M Phenylephrin zu der Organkammer, zeigten, wurde eine Lösung von Rg₃- oder Rg₅-Ginsenosid in Dimethylsulfoxid allein oder zusammen mit 10^–6 M Methylenblau (MB) oder 10^–6 M Nitro-L-arginin (NLA) zugesetzt, um die Gefäßerweiterung davon zu beobachten. Der Kontraktionsgrad durch 10^–6 M Phenylephrin wurde auf 100% eingestellt und der Relaxationsgrad, verursacht durch Rg₃- oder Rg₅-Ginsenosid wurde als Prozent (%) in Bezug darauf dargestellt.
2. Versuchsergebnis
Wie in den 1 und 4 dargestellt, zeigen Rg₃- und Rg₅-Ginsenosid eine konzentrationsabhängige Relaxation auf das Blutgefäß mit Endothel. Jedoch zeigen sie keine Wirkung auf das Blutgefäß ohne Endothel. Ebenso wird die Gefäßerweiterung von Nitro-L-arginin (NLA), ein Hemmstoff für Stickoxidsynthase, oder durch Methylenblau (MB), ein Hemmstoff für lösliche Guanylatcyclase, gehemmt.
Aus solchen Ergebnisse ist ersichtlich, dass Rg₃- und Rg₅-Ginsenosid eine Gefäßerweiterung nur für das Blutgefäß mit Endothel zeigen. Deshalb legen die Ergebnisse nahe, dass Rg₃- und Rg₅-Ginsenosid sichere medizinische Bestandteile sind, da sie keine Nebenwirkungen wie Hämolyse, Toxizität bei Fischen usw. zeigen, was zu anderen Saponinbestandteilen, die die Endothelzellen zerstören, in Gegensatz steht.
Testbeispiel 2: Gefäßerweiterungsaktivität der verarbeiteten Saponinfraktion
1. Versuchsverfahren
Die Gefäßerweiterung der in Beispiel 7 wie vorstehend erwähnt erhaltenen verarbeiteten Panaxadiolsaponinfraktion wurde gemäß demselben Versuchsverfahren wie Testbeispiel 1 bestimmt.
2. Versuchsergebnis
Wie in 2 dargelegt, zeigt die verarbeitete Panaxadiolsaponinfraktion eine konzentrationsabhängige Relaxation auf das Blutgefäß mit Endothel. Jedoch zeigt sich keine Wirkung auf das Blutgefäß ohne Endothel. Ebenso wird die Gefäßerweiterung davon deutlich durch Nitro-L-arginin (NLA), ein Hemmstoff für Sti ckoxidsynthase, oder durch Methylenblau (MB), ein Hemmstoff für lösliche Guanylatcyclase, gehemmt.
Die Ergebnisse zeigen, dass die verarbeitete Panaxadiolsaponinfraktion eine Gefäßerweiterung nur für das Blutgefäß mit Endothel zeigt. Deshalb legt dies nahe, dass die verarbeitete Panaxadiolfraktion ein sicherer medizinischer Bestandteil ist, da sie keine Nebenwirkungen wie Hämolyse, Toxizität bei Fischen usw. zeigt, was im Gegensatz zu anderen Saponinbestandteilen steht, die die Endothelzellen zerstören.
Testbeispiel 3: Cytotoxizität von Rg3-Ginsenosid
1. Versuchsverfahren
Menschliche Endothelzellen der Nabelschnurvene (HUVEC), gezüchtet in M199-Medium, wurden in physiologischer Kochsalzlösung mit einer Konzentration von 20.000 Zellen/180 μl suspendiert. Die Zellsuspension wurde in jede Mulde einer 96-Muldenplatte in einer Menge von 180 μl eingebracht und dann wurden 20 μl Dimethylsulfoxid als Lösungsmittel oder dasselbe Volumen Rg₃ gelöst in Dimethylsulfoxid zugesetzt. Die Platte wurde für eine Dauer von 48 Stunden in einem Zellinkubator bei 37°C inkubiert, während 5% CO₂ beibehalten wurden. Dann wurden 50 μl MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2'-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid), gelöst in phosphatgepufferter Lösung in einer Konzentration von 2 mg/ml, zugesetzt und dies wieder für eine Dauer von 4 Stunden unter denselben Bedingungen wie vorstehend erwähnt inkubiert. Anschließend wurde der Überstand entfernt, und 200 μl Dimethylsulfoxid wurden zugesetzt, um die Absorption bei 540 nm zu messen. Die gemessene Absorption wurde in eine Zellzahl umgewandelt, um den IC₅₀ von Dimethylsulfoxidlösungsmittel und Rg₃ zu bestimmen, wobei es sich hierbei um die Konzentration handelt, die das Zellwachstum um 50% hemmt und als Cytotoxizitätsindex verwendet werden kann.
2. Versuchsergebnis
Im Falle von Dimethylsulfoxid (Kontrollgruppe) begann es seine Cytotoxizität beginnend bei 0,6% zu zeigen und unterdrückte 100% des Zellwachstums bei 6%. Folglich hängt die Cytotoxizität des Lösungsmittels von seiner Menge ab, und der IC₅₀ davon beträgt 18,4 μg/ml. Rg₃ zeigte die Cytotoxizität bei einer Konzentration von 1 bis 100 μg/ml in derselben Weise der Ergebnisse mit Dimethylsulfoxid. Der IC₅₀ von Rg₃ beträgt jedoch 26,7 μg/ml, was etwas höher als derjenige des Lösungsmittels ist, und es ist deshalb zu erkennen, dass Rg₃ eine geringere Cytotoxizität als das Lösungsmittel aufweist. Das heißt, da das Überlebensverhältnis der Rg₃-erhaltenden Gruppe höher als dasjenige der Kontrollgruppe ist, ist zu erkennen, dass Rg₃ eine stimulierende Wirkung auf das Zellwachstum aufweist (siehe 3).
Testbeispiel 4 Cytotoxizität von Rg5-Ginsenosid
1. Versuchsverfahren
Menschliche Endothelzellen der Nabelvene (HUVEC), gezüchtet in einem M199-Medium, wurden in physiologischer Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 20.000 Zellen/180 μl suspendiert. Die Zellsuspension wurde in jede Mulde einer 96-Muldenplatte in einer Menge von 180 μl eingebracht, und dann wurden 20 μl destilliertes Wasser als Lösungsmittel oder dasselbe Volumen Rg₅, gelöst in destilliertem Wasser, zugesetzt. Die Platte wurde für eine Dauer von 48 Stunden in einem Zellinkubator bei 37°C unter Beibehaltung von 5% CO₂, inkubiert. Dann wurden 50 μl MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2'-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid), gelöst in phosphatgepuffferter Lösung in einer Konzentration von 2 mg/ml, zugesetzt und dies wieder für eine Dauer von 4 Stunden unter denselben Bedingungen wie vorstehend erwähnt inkubiert. Anschließend wurde der Überstand entfernt und 200 μl Dimethylsulfoxid wurde zum Messen der Absorption bei 540 nm zugesetzt.
2. Versuchsergebnis
Wie in 5 dargelegt, wachsen die Zellen mit Rg₅-Ginsenosid aktiver als nur mit destilliertem Wasser, obwohl keine statistische Bedeutung vorliegt. Deshalb ist ersichtlich, dass Rg₅-Ginsenosid keine Cytotoxizität ausweist.
ZUSAMMENSETZUNGSBEISPIELE
In den folgenden Zusammensetzungsbeispielen kann Rg₃ oder eine Rg₃-enthaltende Fraktion durch Rg₅, Rg₃ und Rg₅ bzw. einer gleiches enthaltenden Fraktion ersetzt werden. ZUSAMMENSETZUNGSBEISPIEL 1

Bestandteil Gehalt

Maisstärke 44 g

Kristalline Zellulose 40 g

Calciumcarboxymethylcellulose 5 g

Magnesiumstearat 1 g

In Beispiel 1 erhaltene Fraktion 10 g

Gesamtwert 100 g

Gemäß der vorstehenden Zusammensetzung wurden alle Bestandteile gleichmäßig gemischt und dann komprimiert in einer Tablettiermaschine geformt, um Tabletten, wiegend 500 mg und enthaltend 50 mg der in Beispiel 1 erhaltenen Fraktion pro Tablette, herzustellen. Die tägliche Dosis für eine Erwachsenen, 3–10 Tabletten, kann in mehrere Portionen aufgeteilt und mehrere Male verabreicht werden. ZUSAMMENSETZUNGSBEISPIEL 2

Bestandteil	Gehalt
Kristalline Zellulose	34,5 g
10%ige Hydroxypropylcelluloseethanollösung	50 g
Calciumcarboxymethylcellulose	5 g
Magnesiumstearat	0,5 g
In Beispiel 5 erhaltene Fraktion	10 g
Gesamtwert	100 g

Gemäß der vorstehenden Zusammensetzung wurden die kristalline Zelluose, die 10%ige Hydroxapropylcelluloseethanollösung und die in Beispiel 5 erhaltene Fraktion gleichmäßig gemischt, unter Verwendung eines Granulators gemäß einer herkömmlichen Weise getrocknet und dann gemahlen. Calciumcarboxymethylcellulose und Magnesiumstearat wurden damit gemischt und das Gemisch dann komprimierend in einer Tablettiermaschine geformt, um Tabletten herzustellen, die 500 mg wogen und 50 mg der in Beispiel 5 erhaltenen Fraktion pro jede Tablette, enthielten. Die tägliche Dosis für einem Erwachsenen, 3 bis 10 Tabletten, kann in mehrere Portionen aufgeteilt und mehrere Male verabreicht werden. ZUSAMMENSETZUNGSBEISPIEL 3

Bestandteil Gehalt

Injizierbares destilliertes Wasser 86,5 g

Ethanol 5 g

Sojabohnenphospholipid 2,5 g

Glycerin 1 g

In Beispiel 8 erhaltenes Rg₃ 1 g

Gesamtwert 100 g

Gemäß der vorstehenden Zusammensetzung wurde in Beispiel 8 erhaltenes Rg₃ in Ethanol und Sojabohnenphospholipid gelöst. Dann wurde die erhaltene Lösung durch Zugabe von injizierbarem destillierten Wasser und Glycerinlösung zur Herstellung des injizierbaren Präparates emulgiert. ZUSAMMENSETZUNGSBEISPIEL 4

Bestandteil	Gehalt
1) Pyridoxinhydrochlorid	300 mg
2) Nikotinsäureamid	1 g
3) Calciumpantothenat	1 g
4) Riboflavin	200 mg
5) Zitronensäure	30 g
6) In Beispiel 1 erhaltene Fraktion	20 g
7) Epimedii Herba Extrakt	200 mg
8) zugesetztes Wasser	101

Der vorstehenden Zusammensetzung wurden die Bestandteile 1) bis 7) in Bestandteil 8) gelöst, um die Lösung herzustellen. 100 ml dieser Lösung enthalten 200 mg der in Beispiel 1 erhaltenen Fraktion. ZUSAMMENSETZUNGSBEISPIEL 5

Bestandteil Gehalt

Kristalline Cellulose 440 mg

Magnesiumstearat 10 g

In Beispiel 8 erhaltenes Rg₃ 50 g

Gesamtwert 500 g
All im Vorstehenden beschriebenen Bestandteile wurden gleichmäßig gemischt, in herkömmlicher Weise granuliert, und dann in Kapseln gefüllt. Jedes so erhalte ne Kapselpräparat wiegt 500 mg und enthält 50 mg Rg₃. Die tägliche Dosis für einen Erwachsenen, 3 bis 10 Kapseln, kann in mehrere Portionen aufgeteilt und mehrere Male verabreicht werden.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Rg₃- und/oder Rg₅-Ginsenosid, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze der Gattung Panax 0,5 bis 20 Stunden lang auf eine Temperatur von 110 bis 180°C erwärmt, der so erhaltene, aufgearbeitete Ginseng mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert und das Extrakt dann einer Chromatografie unterzogen wird, um Rg₃-Ginsenosid abzutrennen.
Verfahren zur Herstellung von Rg₃- und/oder Rg₅-Ginsenosid, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze der Gattung Panax mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert und das Extrakt dann 0,5 bis 20 Stunden lang auf eine Temperatur von 110 bis 180°C erwärmt und dann einer Chromatografie unterzogen wird, um Rg₃- und/oder Rg₅-Ginsenosid abzutrennen.
Verfahren zur Herstellung von Rg₃- und/oder Rg₅-Ginsenosid, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze der Gattung Panax mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert und das Extrakt dann mit einer Säure bei einer Temperatur von 50 bis 100°C behandelt und dann einer Chromatografie unterzogen wird, um Rg₃- und/oder Rg₅-Ginsenosid abzutrennen.