DE60129748T2

DE60129748T2 - Biologisch wirksame chloroform fraktion eines extraktes erhalten aus der mangrovenpflanze salvadora persica l

Info

Publication number: DE60129748T2
Application number: DE60129748T
Authority: DE
Inventors: Usha National Ins GOSWAMI; N. National Ins FERNANDES
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2001-03-29
Filing date: 2001-03-29
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2021-03-30
Also published as: JP2004525943A; EP1372681A1; EP1372681B1; WO2002078725A1; AU2001256656B2; BR0116956A; DE60129748D1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die Erfindung betrifft eine biologisch wirksame Chloroformfraktion von Extrakten, die erhalten sind aus der Pflanze Salvadors persica Linneaus 1753. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Erhalt eines Rohextrakts und zum Erhalt der Chloroformfraktion. Weiterhin betrifft die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die biologische Wirkung zeigen.
STAND DER TECHNIK
Die zugehörige Mangrovenpflanze Salvadors persica Linneaus 1753 gehört zur Art Salvadoracea und ist ein Strauch oder kleiner Baum mit weißen Blüten, der in degenerierten Mangrovensümpfen und salzigen Ufern über die gesamte Westküste Indiens hinweg häufig vorkommt. Große Anzahlen von Meerspflanzen sind untersucht worden auf bioaktive Substanzen. Nazarine, F; Anita F; Rataboli, P. V.; Diniz D'Souza, R. S und Dhume; V. G.; 1998 in Indian Journal of marine Scienes, 27:499-501 haben vielversprechende pharmakologische Wirkungen in Meeresorganismen aus indischen Gewässern berichtet.
Es gibt mehrere Patente, die weltweit verfügbar sind, welche Verfahren und Verbindungen aus der Natur für verschiedene Zwecke betreffen. Kwak; Wie-jong, Han; Chang-kyun; kum; Hwan-su; An; Jae-suk, Kum; Taek-soo patentierten ein Verfahren zum Extrahieren und Reinigen von biologisch wirksamen Inhaltsstoffen aus kombinierten medizinischen Pflanzen und deren Extraktzusammensetzung ( US-Patent Nr. 5,910,307 , veröffentlicht am 8. Juni 1999). D'Amelio; Frank S; Mirhom; Youssef W. offenbarten eine therapeutische Zusammensetzung und Verfahren zur Behandlung der Haut unter Verwendung eines Extraktes der Pflanze Centipeda cunninghami in US-Patent Nr. 5,804,2006 , veröffentlicht am 8. September 1998. Zimmerman; Richard C.; Alber; Randall S.; Todd; James S.; Crews; Philip isolierten eine Verbindung aus dem methanolischen Extrakt des Aalgrases Zostrea marina mit signifikanten Fäulnis verhindernden Eigenschaften in Wasser ( US-Patent Nr. 5,607,741 , veröffentlicht am 4. März 1997).
Betulinsäure, welche hergestellt wird aus der Verbindung Betulin, hat viele pharmazeutische Potentiale. Pezzuto John M; Kim; Darrich S. H. L. offenbarten Verfahren zum Herstellen von Betulinsäure aus Betulin ( US-Patent Nr. 5,804,575 , veröffentlicht am 8. September 1998). Die Betulinsäure ist intensiv erforscht als ein potentielles therapeutisches Mittel für eine Vielzahl von Krankheiten. Pezzuto John M; Das Gupta, Tapas K; Schmidt; Mary Lou; Kuzmanoff; Konrad Marc, Ling Indeck; Lydia und Kim; Darrick; S. H. L. ( US-Patent Nr. 5,962,527 mit Datum vom 5. Oktober 1999). Pisha E, Chai H, Lee IS, Chagwedera TE, Framsworth NR, Cordell GA, Beecher CW, Fong H H, Kinghorn AD, Brown DM, in Nature medicine, 1, Seiten 1046-1051 (1995) offenbaren, daß Betulinsäure eine unerwartet selektive Antitumorwirkung gegen menschliche Melanome, zum Beispiel MEL-1, MEL-2 und MEL-4 hat. Zusätzlich offenbaren Fujioka T, Kashiwada Y, Kilkuskie RE, Cosentino LM, Ballas LM, Jiang JB, Janzen WP, Chen IS, Lee KH, J.Nat.Prod., 57 (2), S. 243–247 (1994), daß Betulinsäure Anti-HIV-Wirkung in H9-Lymphocytenzellen hat. Diese Erfinder erwähnten, daß die Forschungen, die gerichtet waren auf Betulinsäure als therapeutisches Mittel, behindert waren, da Betulinsäure in sehr begrenzten Mengen und zu sehr hohen Kosten verfügbar ist. Ramadoss, Sunder, Jaggi, Manu; Siddiqui; Mohammad Jamshed Ahmed beschreiben in US-Patent Nr. 6,048,847 , veröffentlicht am 11. April 2000, die Verwendungen von Betulinsäure und seinen Derivaten zum Inhibieren von Krebswachstum und ein Verfahren zur Überwachung von diesem. Kang; Raphael K. L.; Zyzak; Li Li; Nakatsu; Tetsuo veröffentlichten geschmacksangereicherte Produktzusätze in US-Patent Nr. 5,948,460 , mit Datum vom 7. September 1999, bei welchen Ursolsäure eine Verbindung unter einer Gruppe von drei Verbindungen war, welche dem geschmacksangereicherten Produkt zugegeben wurden, um den Nachgeschmack im Produkt zu vermindern und seine Süße wie in einem Diätgetränk zu verstärken. Sie wurde auch verwendet als ein Bestandteil bei einer Präparation zum Inhibieren von Hauttumorgenese.
Herman, S. ( US-Patent Nr. 5,190,979 , veröffentlicht am 2. März 1993) offenbarte Lupeol als eine Verbindung, die pharmazeutisch wirksame Terpen-Ozonide machen kann, welche medizinischen Wert haben.
AUFGABEN DER ERFINDUNG
Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Erhalt der Chloroformfraktion aus einem Rohextrakt aus Stielen, Blättern und Blüten von Salvadors persica bereitzustellen, einem gewöhnlich in Mangrovensümpfen erhältlichen Busch, sowie Screenen, um seine Bioaktivität zu untersuchen.
Eine andere durch die Erfindung offenbarte Aufgabe ist es, natürlich vorkommende Verbindungen aus der Pflanze Salvadors persica zu isolieren und deren Molekulargewicht, Molekularformel, Schmelzpunkt und deren Strukturformel zu bestimmen, was hilfreich bei chemischen Synthesen dieser Verbindungen sein wird.
Eine weitere durch die Erfindung offenbarte Aufgabe betrifft das pharmakologische Screening der Chloroformfraktion des Rohextrakts, ihrer Fraktionen und gereinigten Verbindungen, um zu überprüfen, daß die durch das Rohextrakt und die Chloroformfraktion gezeigten Aktivitäten durchweg erhalten bleiben.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, pharmazeutische Zusammensetzungen zu liefern, die die Chloroformfraktion enthalten von dem Extrakt von der Pflanze Salvadors persica und welche biologische Wirkung zeigen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer wirksamen Menge einer Chloroformfraktion des aus der Pflanze Salvadors persica erhaltenen Extrakts bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Arrhythmien und/oder spasmoiden Zuständen und/oder Bronchialasthma in einem menschlichen oder tierischen Subjekt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung versucht, die dem Stand der Technik inhärenten Unzulänglichkeiten durch Bereitstellen von hocheffizienten und selektiven Mitteln zur Verarbeitung des Rohextrakts, seiner Fraktionierung, Isolierung und Reinigung der aktiven Verbindungen zu überwinden. Die Erfindung ergibt weiterhin pharmazeutische Zusammensetzungen, die den aus der Pflanze Salvadors persica erhaltenen Extrakt enthalten.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung offenbart zum ersten Mal Verfahren zur Isolierung, Reinigung und zum pharmakologischen Screening von all diesen zuoberst genannten kommerziell wichtigen Verbindungen aus einer allgemein verfügbaren Pflanze aus Mangrovensümpfen der Westküste Indiens. Diese Pflanze, identifiziert als Salvadors persica, ist eine zugehörige Mangrovenpflanze. Sie ist ein Strauch, und die Zweige mit Blättern von Blüten können von Hand gepflückt werden. Selbst das Rohextrakt und Fraktionen zeigen therapeutischen Wert. Der wichtige Punkt ist, daß die biologische Wirkung, die von dem Extrakt gezeigt wird, in den gereinigten Verbindungen wie Methylpalmitat und Betulin aufrecht erhalten wird.
Diese Offenbarung weist in Richtung zukünftiger potentieller klinischer Anwendungen des Extrakts und von Fraktionen zur Behandlung von Krankheiten, wie Entspannung der glatten Muskulatur, Bronchialasthma, Nierenkoliken und Verhinderung von Frühgeburten. Sie betrifft ferner die Verwendung von Methylpalmitat und Betulin bei Bewegungskrankheiten und abdominalen Krämpfen.
Die Erfindung ergibt Verfahren, wodurch biologisch wirksames Rohextrakt einer zugehörigen Pflanze, identifiziert als Salvadors persica Linneaus 1753 hergestellt wird. Salvadors persica Linneaus (Salvadoraceae) sind Sträucher oder kleine Bäume mit weißen Blüten, die in degenerierten Mangrovensümpfen und salzigen Ufern über die Westküste Indiens, Westasiens hinweg häufig sind. Das bei der Erfindung offenbarte Verfahren betrifft weiter die Extraktion, Fraktionierung und Reinigung von aktiven Metabolitenbestandteilen der Pflanze. Die Erfindung betrifft auch die spektrale Identifikation der Verbindungen β-Amyrin (nichtsteroidales polyzyklisches Triterpen), Betulin, Ursolsäure (Triterpensäure), Methylpalmitat (aliphatischer Ester) und Lupeol (nichtsteroidales polyzyklisches Triterpen). Die Erfindung betrifft auch Molekularformeln, Molekulargewichte, Schmelzpunkte und Strukturformeln der Verbindungen. Die Erfindung ergibt hocheffiziente und selektive Mittel zur Verarbeitung des aktiven Rohextrakts, erhalten aus Salvadors persica, dessen Fraktionierung, Isolierung und Reinigung. Wie hierin verwendet bedeuten die Begriffe Fraktionierung Trennen des Rohextrakts. Der Begriff Isolierung und Fraktionierung bedeutet Trennung der Fraktion in reine Verbindungen.
Die Erfindung offenbart weiter Verfahren zum Screenen pharmakologischer Wirkungen der Verbindungen in Säugetiergeweben. Die Anmelderin hat gefunden, daß der aus der Pflanze Salvadors persica erhaltene Rohextrakt getrennt werden kann in zwei Fraktionen, nämlich Chloroformfraktionen und wäßrige Fraktionen. Die Chloroformfraktion zeigt antispasmoide, anticholinerge und antiarrhytmische Wirkungen, welche detailliert in der vorliegenden Erfindung beschrieben werden.
Die Erfindung hat einen unterschiedlichen Ansatz zum pharmakologischen Screenen von antiarrhythmischer Aktivität bei Atriumgeweben. Das linke Atrium wurde eher für elektrische Stimulationen als das rechte Atrium verwendet, welches den Schrittmacher hat. Das Verfahren wurde für das längere Überleben des Atriums bei den Experimenten als vorteilhaft befunden.
Die Erfindung offenbart demgemäß ein Verfahren zur Extraktion, Fraktionierung und Reinigung von biologisch wirksamen Molekülen aus einer zugehörigen Mangrovenpflanze, umfassend die Schritte des:

i) Sammelns und Bearbeitens der Pflanzenteile von Salvadors persica,
ii) Herstellens des Rohextrakts aus Pflanzenteilen von Salvadors persica,
iii) Testens des Rohextrakts unter Verwendung pharmakologischer Verfahren,
iv) Fraktionierens des Rohextrakts,
v) Testens der Fraktionen unter Verwendung pharmakologischer Verfahren,
vi) Isolierens der reinen Verbindungen mittels Säulenchromatographie,
vii) Testens der reinen Verbindungen unter Verwendung pharmakologischer Verfahren und
viii) Identifizierens der Verbindungen durch Spektroskopie.

Gemäß einer anderen Ausführung der Erfindung zeigte die Chloroformfraktion der Mangrovenpflanze Salvadors persica arrhythmische, antispasmoide, anticholinerge Wirkung wie das Mutterrohextrakt.
Die Erfindung ergibt auch die Identifizierung von Molekülen aus den Spektraldaten. Die Molekülformel der fünf Verbindungen wird aus den Spektraldaten bereitgestellt. Die Erfindung ergibt Molekulargewichte von Molekülen aus EIMS. Die Strukturformel der Verbindungen wird auch aus den Spektraldaten bereitgestellt.
Ein Rohextrakt wurde aus der Pflanze Salvadora persica erhalten. Das Rohextrakt wurde getestet auf seine Bioaktivität und wenn es als vielversprechend hinsichtlich seiner pharmakologischen Wirkungen befunden wurde, wurde es fraktioniert unter Verwendung von Lösungsmitteln mit ansteigender Polarität, um Fraktionen wie Petrolether, Chloroform, Butanol und wäßrig zu erhalten. Jede von diesen wurde getestet auf deren pharmakologische Aktivität.
Die fünf aus dem Extrakt der Pflanze gereinigten Verbindungen waren β-Amyrin (nichtsteroidales polyzyklisches Triterpen), Betulin, Ursolsäure (Triterpensäure), Methylpalmitat (aliphatischer Ester) und Lupeol (nichtsteroidales polyzyklisches Triterpen).
Es wurde gefunden, daß β-Amyrin ein nichtstereodiales polyzyklisches Terpen ist, mit folgenden Details:

Molekularformel: C₃₀H₅₀O

Molekulargewicht: 426

Schmelzpunkt: 160°C
Ein anderes gefundenes Molekül war Betulin mit:

Molekularformel: C₃₀H₅₀O₂

Molekulargewicht: 442

Schmelzpunkt: 255°C
Ursolsäuremolekül (Triterpensäure) wurde in dem Extrakt gefunden. Es hatte:

Molekularformel: C₃₀H₄₈O₃

Molekulargewicht: 456

Schmelzpunkt: 292°C
Methylpalmitat (aliphatischer Ester), das in dem Extrakt gefunden wurde, hatte:

Molekularformel: C₁₆H₃₂O₂

Molekulargewicht: 256

Schmelzpunkt: 30°C
Lupeol (nichtsteroidales polyzyklisches Triterpen), das in dem Extrakt gefunden wurde, hatte:

Molekularformel: C₃₀H₅₀O

Molekulargewicht: 426

Schmelzpunkt: 215°C
Eine der Betulinverbindungen, welche bei der Herstellung von Betulinsäure verwendet werden kann ( US-Patent Nr. 5,804,575 veröffentlicht am 8. September 1998). Betulinsäure ist intensiv als potentielles therapeutisches Mittel für verschiedene Krankheiten untersucht worden.
Ursolsäure wird einem geschmacksangereicherten Produkt zugesetzt, um den Nachgeschmack im Produkt zu vermindern und seine Süße zum Beispiel in einem Diätgetränk zu verstärken. Sie wurde auch als ein Bestandteil in einer Präparation zur Inhibierung von Hauttumorgenese verwendet.
Extrakte von einigen Pflanzen zeigen Gefäßverengungs- und Schmerzlinderungseigenschaften und enthalten auch das Triterpenoid β-Amyrin. Diese Verbindungen zur Inhibierung der Bildung von ungewünschter Hautpigmentierung kombinieren hohes Tyrosinaseblockiervermögen mit Stabilität in kosmetischen Präparationen, Abwesenheit von signifikanten cytotoxischen Wirkungen und Synergiewirkung ( US-Patente 5,773,014 ; 5,679,393 ). Beta-Amyrin und Lupeol werden als Bestandteile von Dimethylsterolen in medizinischen Formulierungen verwendet ( US-Patent 4,808,574 ).
Methylpalmitat ist eine Verbindung, verwendet beim Herstellen von Alkoholen wie erwähnt in US-Patent Nr. 6,049,013 , veröffentlicht im April 2000. Lupeol kann als Verbindung für mehrere Linderungsmedikamente, Insektenabwehrmittel, Antitumordestillate und chemische Industrien verwendet werden ( US-Patent Nr. 4,808,574 ; 5,962,527 ; 5,908,628 ).
Der Extrakt von Salvadors persica enthielt daher verschiedene Verbindungen, die oben aufgelistet sind. Die Chloroformfraktion des Extrakts Salvadors persica wurde dann getestet auf seine biologische Aktivität bei Meerschweinchen. Die Anmelderin fand zu ihrer Überraschung, daß der Extrakt hervorragende anticholinerge, antiarrhytmische und antispasmoide Wirkung zeigte. Die Erfindung ergibt demgemäß Zusammensetzungen, die die Chloroformfraktion des Extrakts, erhalten aus Salvadors persica, optional mit konventionellen Zusätzen zur Inhibition von einer Behandlung von anticholinergen Zuständen wie Asthma enthalten. Die Zusammensetzung kann etwa 10 μgm des Extrakts enthalten. Die Chloroformfraktion des aus der Pflanze Salvador persica erhaltenen Extraktes ist daher ein potentielles anticholinerges Mittel. Die Zusammensetzungen können, wie es erforderlich sein kann, in verschiedenen physikalischen Formen formuliert werden. Der Extrakt kann als solcher oder mit konventionellen Zusätzen, physiologisch verträglichen Trägern, Konservierungsmitteln, Puffern usw., je nach Erfordernis verwendet werden.
Zusätzlich offenbart die Erfindung die Verwendung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von anticholinergen Zuständen wie Bronchialasthma von therapeutisch wirksamen Mengen eines Extrakts, erhalten aus Salvadors persica. Das Extrakt kann verabreicht werden bei einem Dosiergehalt im Bereich von 50 μg/ml bis 250 μg/ml im Fall von normalen Erwachsenen. Die genaue Dosierung wird abhängig von dem zu behandelnden Patienten variieren und wird von Faktoren wie den Erfordernissen des Patienten, der Ernstheit des Zustandes, welcher behandelt wird, und der Wirksamkeit des Extraktes abhängen. Die Bestimmung von Optimaldosierungen für einen speziellen Patienten ist Fachleuten wohlbekannt.
Die Anmelderin fand weiterhin, daß die Chloroformfraktion des Extraktes, erhalten aus der Pflanze Salvadors persica antispasmoide Wirkung zeigt. Die Erfindung ergibt demgemäß Zusammensetzungen, die die Chloroformfraktion des Extraktes, erhalten aus Salvadors persica, enthalten, optional mit konventionellen Zusätzen zur Inhibition von einer Behandlung von spasmoiden Zuständen wie Muskelspasmen. Die Zusammensetzung kann etwa 10 μgm des Extrakts enthalten. Die Chloroformfraktion des aus der Pflanze Salvadors persica erhaltenen Extraktes ist daher ein potentielles antispasmoides Mittel. Die Zusammensetzungen können formuliert werden in verschiedenen physikalischen Formen wie erforderlich. Der Extrakt kann verwendet werden als solcher oder mit konventionellen Zusätzen, physiologisch verträglichen Trägern, Konservierungsstoffen, Puffern, usw., wie erforderlich.
Zusätzlich offenbart die Erfindung die Verwendung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von spasmoiden Zuständen wie Bronchialasthma von einer therapeutisch wirksamen Menge eines Extrakts, das aus Salvadors persica erhalten ist. Das Extrakt kann bei einem Dosisgehalt im Bereich von 50 μg/ml bis 250 μg/ml im Fall von normalen Erwachsenen verabreicht werden. Die exakte Dosierung wird abhängig vom zu behandelnden Patienten variieren und wird weiter abhängen von Faktoren wie Erfordernissen des Patienten, Ernstheit des Zustandes, der zu behandeln ist, und Wirkung des Extraktes. Die Bestimmung von Optimaldosierungen für einen speziellen Patient ist Fachleuten wohlbekannt.
Weiterhin hat die Anmelderin gefunden, daß die Chloroformfraktion des Extraktes, erhalten aus der Pflanze Salvadors persica, antiarrhythmische Wirkung zeigt. Die Erfindung ergibt demnach Zusammensetzungen, die die Chloroformfraktion des Extraktes, erhalten aus Salvadors persica, enthalten, optional mit konventionellen Zusätzen zur Inhibition von einer Behandlung von Arrhythmien des Herzens. Die Zusammensetzung kann etwa 10 μgm des Extraktes enthalten. Die Chloroformfraktion des Extraktes, erhalten aus Salvadors persica, ist daher ein potentielles antiarrhythmisches Mittel. Die Zusammensetzungen können formuliert werden in verschiedenen physikalischen Formeln, wie erforderlich. Der Extrakt kann verwendet werden als solcher oder mit konventionellen Zusätzen, physiologisch verträglichen Trägern, Konservierungsmitteln, Puffern, usw. wie erforderlich.
Die Erfindung offenbart zusätzlich die Verwendung zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Herzarrhythmien von einer therapeutisch wirksamen Menge eines Extraktes, erhalten aus Salvadors persica. Das Extrakt kann verabreicht werden bei einem Dosisgehalt im Bereich von 3 μg/ml bis 10 μm/ml im Fall von normalen Erwachsenen. Der Extrakt wird dem Subjekt für einen Zeitraum von 10 Minuten verabreicht. Die exakte Dosierung wird variieren abhängig von dem zu behandelnden Patienten und wird von Faktoren wie Bedürfnissen des Patienten, der Ernstheit des behandelten Zustandes und Wirkung des Extraktes abhängen. Die Bestimmung von Optimaldosierungen für einen speziellen Patienten ist Fachleuten wohlbekannt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ANLIEGENDEN ZEICHNUNGEN
1(a) zeigt die Mangrovenpflanze und
1(b) zeigt den Zweig der zugehörigen verwendeten Mangrovenpflanze.
2 zeigt verschiedene Fraktionen, erhalten aus dem Extrakt des Pflanze Salvadors persica.
3 zeigt die Strukturformel von β-Amyrin (nichtsteroidales polyzyklisches Triterpen).
4 zeigt die Strukturformel von Betulin.
5. zeigt die Strukturformel von Ursolsäure (Triterpensäure).
6 zeigt die Strukturformel von Methylpalmitat (aliphatischer Ester).
7 zeigt die Strukturformel von Lupeol (nichtsteroidales polyzyklisches Triterpen).
8 zeigt das Fraktionierungsdiagramm des Extraktes von Salvadors persica.

Die Erfindung wird detailliert beschrieben und veranschaulicht durch die folgenden Beispiele, welche nicht als Einschränkungen des erfinderischen hier ausgeführten Konzeptes zu verstehen sind. Beispiel 1: Dieses Beispiel gibt Informationen über die Chemikalien, Reagenzien, Vorrichtungen, die verwendet wurden, und deren Quellen.

Name des Reagenzes/Chemikalien	Firma
Wäßriges Methanol	Sisco Research Laborstories Pvt Ltd.
Petrolether	Ranbaxy Fine Chemicals Ltd.
Chloroform	Sisco Research Laborstories Pvt Ltd.
Butanol	Sisco Research Laborstories Pvt Ltd.
Ethylacetat	Sisco Research Laborstories Pvt Ltd.
Histaminsäurephosphat	Blenkinsop & Co. Ltd.
Acetylcholinchlorid	Hopkin & Williams Ltd.
5-Hydroxytryptamin-Kreatininsulfat	Sigma Chemicals
Bariumchlorid	Apex Chemicals
Nicotinsulfat	BDH Chemicals
Oxytocin	Parke Davis India Ltd.
Prostodin-PGF-2 Alpha	Astra IDL Ltd.

Vorrichtung:

1. Physiograph, Firma: Biodevices, Ambala, Indien
2. Kraftsignalgeber Modell Nr. T-305 Firma: GRASS, USA
3. Stimulator Modell SS44 Firma Biodevices, Ambala
4. Polygraph Modell 7 Firma: GRASS, USA
5. Kraftsignalgeber Modell Nr. FT-03 Firma: GRASS, USA
6. Organbad Ambala Indien

Beispiel 2
Das Sammeln der Mangrovenpflanze Salvadors persica L von der Küste von Goa, einem Staat in Indien erfolgte entlang von Ribandar, nahe der Mündung der Mandovi-Flußmündung, stromaufwärts. Diese Spezies ist ubiquitär in den Küstenregionen und wurde manuell an den Flutungsufern gesammelt.
Beispiel 3
Zur Bearbeitung wurden die gesammelten Mangroven gewaschen, zuerst mit Seewasser, gefolgt von Leitungswasser. Die ungewünschten Materialen wurden ausgesiebt beim Waschen mit Leitungswasser, um die Salze zu entfernen. Die Blätter, die Stiele und Blüten, die zu der Mangrovenpflanze gehörten, wurden luftgetrocknet. Nach Trocknen wurde das Pflanzenmaterial in kleine Stücke geschnitten, getränkt in dem Lösungsmittel 90% wäßriges Methanol für eine Woche zur Extraktion. Es wurde darauf geachtet, sicherzustellen, daß diese in dem Lösungsmittel gründlich getränkt/eingetaucht waren und auf Fäulnis überprüft.
Beispiel 4
Die Extraktion und Herstellung von Rohextrakt wurde ausgeführt durch einen Kaltfiltrationsverfahren bei Raumtemperatur und mit Lösungsmittelverdampfung in einem Wasserbad (Temperatur 50°C) unter vermindertem Druck. Dies hilft beim Schutz von jeglichem hitzelabilen Metaboliten, der in ihm vorliegt. Die Reaktion wurde zweimal gemacht, bis der Extrakt unter Vakuum konzentriert wurde, um den Rohextrakt zu erhalten.
Beispiel 5
Fraktionierung des Rohextraktes
Der Rohextrakt wurde unterteilt in Petrolether-, Chloroform-, n-Butanol- und wäßrige Fraktionen unter Verwendung eines Scheidetrichters. Petrolether wurde zu dem Extrakt in den Scheidetrichter gegeben und abgetrennt. Als nächstes wurde Chloroform zu dem Rückstand zugegeben, gut gemischt und die untere Schicht abgetrennt. Zu dem Rückstand wurde Butanol zugegeben und die obere Schicht stellte die Butanolfraktion dar und die untere Schicht war die wäßrige Fraktion. Die Extraktion von jeder Fraktion wurde dreimal gemacht und immer, wenn es eine Emulsion gab, wurde Natriumchlorid zum Aufbrechen der Emulsion zugegeben. Natriumsulfat wurde zu Chloroform- und Butanolfraktionen zugegeben, um Spuren von Wasser vor dem Konzentrieren zu entfernen. Alle Fraktionen wurden in der gleichen Weise wie das Rohextrakt konzentriert. Diese Fraktionen wurden auf dieselbe pharmakologische Wirkung wie das Mutterrohextrakt getestet. Säulenchromatographie zur Isolierung von reiner Verbindung wurde durch wiederholte Säulenchromatographie und Dünnschichtchromatographie (TLC) der Elutionsmittel gemacht. Die TLC zeigte Verbindungen wie Beta-Amyrin, Betulin, Ursolsäure und Lupeol.
Beispiel 6
Um die Verbindungen Beta-Amyrin und Betulin zu erhalten, wird die Trennung durch Dünnschichtchromatographie auf 0,25 mm dicken Silicagelplatten (Qualigen) ausgeführt. Das Elutionsmittel ist ein 90:10 (v/v) Petrolether/Ethylacetat-Gemisch und die Flecken werden entwickelt durch Besprühen mit 5% H₂SO₄-Lösung und Fixieren durch Erhitzen bei 110°C.
Für Ursolsäure- und Methylpalmitatverbindungen wurde die Trennung durch Dünnschichtchromatographie ausgeführt auf 0,25 mm dicken Silicalgelplatten (Qualigen). Das Elutionsmittel ist ein 85:15 (v/v) Petrolether/Ethylacetat-Gemisch und die Flecken werden entwickelt durch Besprühen mit 5% H₂SO₄-Lösung und Fixieren durch Erhitzen bei 110°C.
Für die Verbindung Lupeol wird die Trennung durch Dünnschichtchromatographie ausgeführt auf 0,25 mm dicken Silicalgelplatten (Qualigen). Das Elutionsmittel ist ein 75:25 (v/v) Petrolether/Ethylacetat-Gemisch und die Flecken werden entwickelt durch Besprühen mit 5% H₂SO₄-Lösung und Fixieren durch Erhitzen bei 110°C.
Bei der vorliegenden Erfindung wurde die aktive Chloroformfraktion der Mangrovenpflanze S. persica säulenchromatographiert über Silicagel zur Isolierung des wirksamen Bestandteils. Eluate aus der Säule mit demselben TLC-Profil wurden gemischt und pharmakologischen Tests unterzogen. Die aktiven Unterfraktionen wurden weiter chromatographiert, bis aktive reine Verbindungen erhalten wurden (Flußdiagramm I). Flecken auf Dünnschichtchromatographie (TLC) wurden visualisiert unter Verwendung von Joddämpfen und Besprühen mit methanolischer Schwefelsäure.
TLC wurde auf Glasplatten (20 × 20 cm) gemacht, die mit einer 0,25 mm Schicht von TLC-Grad-Silicagel (Qualigens) beschichtet waren, aktiviert bei 110°C für eine Stunde vor dem Gebrauch. Die aktive wäßrige Fraktion wurde durch eine XAD-Säule geführt und die Eluate wurden behandelt wie oben erwähnt zur Isolierung und Reinigung von wirksamen Metabolitenbestandteilen.
Die fünf Verbindungen wurden identifiziert auf Basis von Spektraldaten, erhalten am Regional Sophisticated Instrumentation Center (RSIC), Indien durch die folgenden Spektren:
¹HNMR zur Bestimmung der Protonenumgebung des Moleküls, ausgeführt auf Bruker DPX-200 MHz.

Apparat: Bruker Spektrometer

Modell: DPX

Firma: Bruker
¹³CNMR für Kohlenstoffatome Bruker DPA 300 MHz.
Die Verbindungen wurden identifiziert aus einem Vergleich von deren Spektraldaten mit jenen von ähnlichen in der Literatur berichteten Verbindungen.
Massenspektren, Elektronenstoßmassenspektroskopie (EIMS), zur Bestimmung von deren Molekulargewichten zusammen mit ihrem Fragmentierungsmuster wurden ausgeführt auf einem Massenspektrometer (EI/CIMS) Modell D-300 JEOL,

Apparat: Massenspektrometer (EIMS)

Modell: D-300

Firma: JEOL, Japan
Beispiel 7
Pharmakologisches Testen von reinen Verbindungen Verwendete Standardmedikamente waren die folgenden:
Histaminsäurephosphat (Blenkinsop & Co. Ltd.) auf dem Ileum.
Acetylcholinchlorid (Hopkin & Williams Ltd.) auf dem Ileum.
5-Hydroxytrypatamin-Kreatininsulfat (Sigma Chemicals Co.) auf dem Gastrointestinaltrakt.
Bariumchlorid (Apex Chemicals) bei Kontraktion der glatten Muskulatur. Nikotinsulfat (BDH Chemicals) am Darm als Ganglionstimuliermittel.
Alle anderen Reagenzien wurden mit analytischem Reinheitsgrad verwendet.
Tyrode wurde verwendet beim Meerschweinchenileum und physiologische Ringer-Lock-Lösung wurde verwendet beim Meerschweinchenatrium.
Alle anderen Reagenzien wurden mit analytischem Reinheitsgrad verwendet.
Verwendete physiologische Lösungen und verschiedene Parameter:
Alle physiologischen Lösungen wurden frisch zum Zeitpunkt des Experimentes hergestellt.
pH-Wert: der pH-Wert der verschiedenen Salzlösungen variierte zwischen 7,3 und 7,4. Bei niedrigem pH-Wert neigt der Tonus der Präparation dazu, abzufallen und ist daher geneigt, die Medikamentenwirkung zu verändern.
Temperatur: Um konsistente Wirkungen zu bekommen, war es wichtig, die Temperatur der Badlösung bei einem spezifizierten Niveau zu halten, da, wenn die Temperatur unter 37°C abfiel, der Tonus des Darms vergrößert ist, Kontraktionen geringer werden und die Kontraktions- und Entspannungszeiten vergrößert werden.
Luft: Luft oder Sauerstoff wird benötigt zur guten Funktion der Gewebe. Neben der Versorgung von Sauerstoff zu den Geweben durchwirbelt auch ein Strom von Gasblasen die Badlösung, was so die Diffusion von Medikamenten erleichtert, die dem Bad zugesetzt sind.
Die Lösung in dem Bad wurde häufig gewechselt, da anhaltende Belüftung dazu neigt, den pH-Wert zu verändern.
In vitro Experimente
Weibliche, jungfräuliche Meerschweinchen, die etwa 300 bis 350 g wiegen, gehalten unter gewöhnlichen Tierhaltungsbedingungen (Temperatur 25 ± 1°C), wurden verwendet. Die Tiere wurden 24 Stunden vor dem Experiment gehungert und nur Wasser wurde ad libitum bereitgestellt.
Das isolierte Meerschweinchenileum wurde verwendet, um die antispasmoide, anticholinerge und antiarrhytmische Wirkung zu untersuchen.
A. ANTICHOLINERGE WIRKUNG
Die wirksamen Fraktionen wurden für anticholinerge Wirkung isoliert, die fünf isolierten Verbindungen wurden nur auf isoliertem Meerschweinchenileum getestet. Der Ileumlängsmuskel aus frisch getötetem Meerschweinchen wurde aufgehängt in einem Organbad von 10 ml Kapazität, gefüllt mit Tyrodelösung und belüftet mit Luft. Tyrodelösung

Glucose 1,0 g

Natriumchlorid 8,0 g

Natriumbicarbonat 1,0 g

Kaliumchlorid 0,2 g

Kalziumchlorid 0,2 g

Magnesiumchlorid 0,1 g

Natriumhydrogenphosphat 0,05 g
Alle wurden gelöst in 1000 ml destilliertem Wasser.
Zwei bis vier Dosen von dem Standardmedikament Acetylcholin wurden zu dem Bad zugegeben, um eine gleichförmige Amplitude mit einer Kontaktzeit von 30 Sekunden zu erhalten, deren Kontraktionen auf einem Polygraph aufgezeichnet wurden. Die fünf isolierten Verbindungen wurden getestet in Dosen von 196 bis 392 mal 10^–6 mol/ml Radkonzentration. Die Wirkung der Verbindungen gegen Acetylcholin-induzierte Kontraktion wurde beobachtet und die prozentuale Verminderung der Kontraktion gemessen.
B. ANTISPASMOIDE WIRKUNG
Die wirksamen Fraktionen wurden isoliert für antispasmoide Wirkung, die fünf isolierten Verbindungen wurden nur beim isolierten Meerschweinchenileum getestet. Der Ileumlängsmuskel aus einem frisch getöteten Meerschweinchen wurde aufgehängt in einem Organbad von 10 ml Kapazität, gefüllt mit Tyrodelösung und belüftet mit Luft.
Zum pharmakologischen Testen auf Meerschweinchenileum wurde das Meerschweinchen geopfert durch Betäuben mit einem abrupten Schlag auf seinen Kopf. Der Bauch wurde schnell aufgeschnitten. In Richtung des unteren Endes des Bauches war das grünlich beutelartige Caecum. Der Dünndarm wurde markiert durch eine lokale Verdickung der Wand – ein Peyer-Plaque von Lymphgewebe. Die untersten 10 cm Ileum, am nächsten zu der Ileocaecalis-Verbindung wurden verworfen. Von dort wurden etwa 10 cm des Ileumgewebes weggeschnitten und von Gekröse befreit und in einer Petrischale plaziert, die warme Tyrodelösung enthält. Das Lumen des Ileum wurde leicht ausgewaschen unter Verwendung einer hypodermischen Spritze, gefüllt mit Tyrodelösung, um die Ansammlung von Schleim im Lumen zu verhindern. Das Ileum wurde zerschnitten in kleine Abschnitte von etwa 3–4 cm Länge im vollrelaxierten Zustand. Das untere Ende wurde an einen Gewebehalter genäht durch Bilden von zunächst einer Schleife, um direkten Kontakt mit dem Schlauch zu verhindern. Das Gewebe wurde positioniert in einem Organbad mit 10 ml Fassungsvermögen, das Tyrodelösung enthält, die mit Luft belüftet ist, bei 37°C. Der Strang des oberen Endes des Ileums wurde befestigt am Hebel eines Kraftsignalgebers (FT03), welcher isometrisch Muskelkontraktionen mißt und mit einem Grass-Polygraphen (Modell 7) verbunden ist. Das Ileumgewebe wurde aufbewahrt, um in Tyrodelösung für 30 Minuten zu stabilisieren und das Fluid in dem Organbad wurde alle 10 Minuten erneuert (wenn der pH-Wert sich ändert).

Zwei bis vier Dosen der Standardmedikamentspasmogene (Acetylcholin, Histamin, 5-Hydroxytryptamin, Bariumchlorid und Nikotin) wurden zu dem Bad zugegeben, um eine gleichförmige Amplitude mit einer Kontaktzeit von 60 Sekunden zu erhalten, deren Kontraktionen auf einem Polygraphen aufgezeichnet wurden. Der Chloroformextrakt wurde eine Minute vor Zugabe der Spasmogene zugegeben. Die Wirkung der Verbindungen gegen Acetylcholin-induzierte Kontraktion wurden beobachtet und die prozentuale Kontraktionsverminderung wurde gemessen. Tabelle, die die relative antispasmoide Wirkung in vitro von Salvadors persica L. Rohextrakt auf Meerschweinchenileum zeigt (Mittel von 0 Auslesungen)

Extrakt	Gewebe	Verwendete Spasmogene	Induzierte standardkontraktion (mm)	Dosis 50 mg/ml (mm)	Inhibition % abnahme	Dosis 250 mg/ml	Inhibition % abnahme
Rohextrakt	Meerschweinchenileum	Acetylcholin	20	15	25	8	60
		Histamin	22	18	18.17	15	32
		Nicotin	16	16	0	10	37.5
		Barium chlorid	18	16	11	12	33

C. ANTIARRHYTHMISCHE WIRKUNG
In Vitro Experimente wurden an isoliertem Meerschweinchenatrium durchgeführt.
Der Thorax von dem betäubten Meerschweinchen wurde schnell geöffnet durch Schneiden der Sternocostalverbindungen. Das Herz wurde hinter dem Brustbein in seiner pericardialen Bedeckung schlagend beobachtet. Es wurde herausgekerbt und einer Petrischale plaziert, die Ringer-Locke-Lösung, belüftet mit reinem Sauerstoff, enthält. Es wurde leicht gedrückt, um Blut aus Hohlräumen des Atriums zu entfernen und den Ventrikeln und um das Gerinnen von Blut in den koronären Arterien zu verhindern. Alle anderen Gewebe wurden weggeschnitten, bis nichts verblieb außer den Aurikeln, welche als ein Paar von schnell schlagenden pink blassen blattartigen Strukturen erschienen. Fäden wurden an ein Ende von jedem Aurikel gebunden. Das rechte Atrium mit dem Schrittmacher wurde gebunden an ein Sauerstoffglasrohr und angebracht in einem Organbad mit 40 ml Fassungsvermögen, das Ringer-Locke-Lösung bei 34°C enthält, und oxygeniert. Der Faden des anderen Endes vom linken Aurikel wurde an den Signalgeber befestigt (Kraftsignalgeber T-305), welcher mit einem Biodevices Physiograph verbunden war. Die Zusammensetzung von Ringer-Locke-Lösung war:

Glucose 0,5g

Natriumchlorid 9,0g

Natriumbicarbonat 0,5g

Kaliumchlorid 0,42g

Kalziumchlorid 0,24g
Die Sensitivität bei dem Physiograph wurde eingestellt gemäß dem Herzschlag. Die Aurikel wurden befestigt in einem Paar von stimulierenden Elektroden und vertikal in das Bad eingetaucht gehalten. Die Aurikel ließ man sich für einen Zeitraum von 30 Minuten equilibrieren. Die Elektrode wurde verbunden an einen Stimulator (Medicare Research Stimulator SS44) bei einer Dauer von 5 × 1 ms und 5 × 0,1 ms Verzögerung, die hier konstant gehalten wurde. Anfangs waren die Spannung und Frequenz minimal. Dann wurde die Spannung graduell vergrößert bis es eine Änderung bei der Amplitude gab. Dann wurde die Frequenz vergrößert/eingestellt, um Arrhythmien zu bekommen. Dosen von Extrakt/Fraktion wurden bei Konzentrationen des Salzes pro ml Badlösung gegeben und man ließ sie verbleiben in Kontakt mit den Aurikeln für 10 Minuten. Nach jeder wechselnden Minute wurde der Physiograph betätigt, um zu sehen, ob es eine Änderung der Herzgeschwindigkeit gab. Nach 10 Minuten wurden die Aurikel zweimal für Arrhythmien stimuliert. Die antiarrhythmische Wirkung für jede Dosis, d.h. 3 und 10 μg wurde berechnet. Die verwendete Formel zum Bewerten der arrhythmischen Wirkung von Rohextrakt von Salvadors persica beim Meerschweinchen Atrium ist: % Inhibition = (X) – (Y) × 100(X) wobei

X: = Maximalfrequenz vor dem Extrakt
Y: = Maximalfrequenz nach dem Extrakt

Die relative in vitro Wirkung von Salvadors Persica beim Meerschweinchenatrium ist in der folgenden Tabelle hierunter gezeigt:

Extrakt Gewebe Frequenz vor Medikament Frequenz nach Medikament prozentuale Veränderung

Rohextrakt Atrium 96 Schläge/ sek. 96 Schläge/ sek. 0

Claims

Verfahren zur Extraktion, Fraktionierung, Reinigung und Identifizierung von biologisch wirksamen Metaboliten aus biologisch wirksamem Extrakt der Pflanze Salvadora persica, umfassend die Schritte des: a) Sammelns der Pflanzenteile von Salvadors persica, b) Lufttrocknens der Pflanzenteile; c) Eintauchens der Pflanzenteile in etwa 90% wäßriges Methanol für etwa eine Woche bei Raumtemperatur von etwa 28 ± 2°C, d) Filterns des methanolischen Extraktes, e) Eindampfens des methanolischen Extraktes unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von etwa 50°C auf eine minimale Menge, um ein Rohextrakt zu erhalten, f) Fraktionierens des Rohextraktes unter Verwendung von Lösungsmitteln steigender Polarität, g) Identifizierens der biologisch wirksamen Fraktion, und h) Isolierens biologisch aktiver Verbindungen aus der Fraktion von Schritt (g) durch Säulenchromatographie.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Pflanzenteile von Salvadors persica ausgewählt sind aus Blättern, Stielen und Blüten.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Lösungsmittel ansteigender Polarität Petrolether, Chloroform, Butanol und eine wäßrige Fraktion sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Chloroformfraktion anticholinerge Wirkung, antispasmodische Wirkung und antiarrhythmische Wirkung zeigt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Chloroformfraktion durch eine Silicagelsäule geführt wird und dann eluiert wird unter Verwendung eines Petrolether-Ethylacetat-Chloroform-Methanol-Gradientensystems.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Dünnschichtchromatographie (TLC) auf Silicagel ausgeführt wurde.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die TLC entweder durch Exponieren der Platten gegenüber Joddämpfen oder durch Besprühen mit methanolischer Schwefelsäure visualisiert wurde.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Fraktionen, welche anticholinerge Wirkung zeigten, zusammengestellt wurden und durch eine Silicagelsäule geführt wurden und eluiert wurden mit demselben Satz von Lösungsmitteln.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine anticholinerge Wirkung, antispasmodische Wirkung und antiarrhythmische Wirkung zeigt, wobei die Zusammensetzung, die Chloroformfraktion von dem aus der Pflanze Salvadors persica erhältlichen Extrakt umfaßt, optional mit konventionellen Zusätzen.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die Zusätze gewählt sind aus therapeutisch verträglichen Zusätzen.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei der Extrakt Verbindungen enthält, die gewählt sind aus β–Amyrin, Betulin, Ursolsäure, Methylpalmitat und Lupeol.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die Extraktmenge in der Zusammensetzung 10 μg ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die Dosierung des Extraktes 3 μg/ml bis 10 μg/ml ist.
Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Chloroformfraktion, erhältlich aus der Pflanze Salvadors persica, optional mit konventionellen Zusätzen, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Arrhythmien bei einem Subjekt.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Medikament formuliert wird zur Verabreichung von 3 bis 10 μg/ml der Chloroformfraktion für einen Zeitraum von 10 Minuten an ein Subjekt.
Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, wobei das Subjekt ein menschliches oder tierisches Subjekt ist.
Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Chloroformfraktion des Rohextrakts der Pflanze Salvadors persica, optional mit konventionellen Zusätzen, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von spasmoiden Zuständen wie Muskelspasmen bei einem Subjekt.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei das Medikament formuliert wird für die Verabreichung von 3 bis 10 μg/ml der Chloroformfraktion für einen Zeitraum von 10 Minuten an das Subjekt.
Verwendung nach Anspruch 17 oder 18, wobei das Subjekt ein menschliches oder tierisches Subjekt ist.
Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Chloroformfraktion von einem Rohextrakt, erhältlich aus der Pflanze Salvadors persica, optional mit konventionellen Zusätzen, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von cholinergen Zuständen wie Bronchialasthma bei einem Subjekt.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Medikament formuliert wird zur Verabreichung von 3 bis 10 μg/ml der Chloroformfraktion für einen Zeitraum von 10 Minuten an ein Subjekt.
Verwendung nach Anspruch 20 oder 21, wobei das Subjekt ein menschliches oder tierisches Subjekt ist.