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Unter dem Einfluss von durch „Neurotransmitter-Peptide" innerlich bewirkten
oder durch „ionisierende und
ultraviolette Strahlung" äußerlich
bewirkten physiologischen Prozessen sezernieren die Zellen der Epidermis,
insbesondere die germinativen Keratinozyten, Wachstums- und Zellkooperationsfaktoren,
deren Rolle darin besteht, die zellulären Synthesen von Zytoskelettmolekülen zu stimulieren
und die zellulären
Wechselwirkungen zu aktivieren.
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Diese physiologischen Eigenschaften
kommen zum Ausdruck durch eine Aktivierung der zellulären Stoffwechselvorgänge, die
für die
Regeneration der Bindegewebe der Dermis und der Epidermis und Vernarbungsprozesse
unabdingbar sind.
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Die Erfindung hat die Realisierung
von peptidischen Molekülen,
homologen Derivaten der aktiven peptidischen Sequenzen von Wachstums-
und Zellkooperationsfaktoren, die natürlicherweise durch die Keratinozyten
sezerniert werden, zum Gegenstand.
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Unter den peptidischen Derivaten,
die den Gegenstand der Erfindung bilden, können insbesondere peptidische
und Metallpeptidische Derivate aufgeführt werden, deren pharmakologische
Aktivitäten
ausgerichtet sind:
- – einerseits
auf die zellulären
Synthesen der das Zytoskelett bildenden Moleküle, wie die Kollagene vom Typ I
und III, die Glycosaminoglycane, die Fibronectine,
- – andererseits
auf die Synthese von Molekülen,
deren Rolle darin besteht, die Phänomene von zellulärer Kooperation
und Wechselwirkung zu stimulieren und zu aktivieren, von „Endothelinen,
Integrinen".
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Diese Aktivitäten sind komplementär und unverzichtbar
bei der Expression auf der Ebene der Dermis und der Epidermis für die Prozesse
von Restrukturierung der Gewebe, Narbenbildung, Angiogenese, Melanogenese
u.s.w...
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Einer der Gegenstände der Erfindung besteht in
der Verwendung der vorangegangenen peptidischen und Metall-peptidischen
Derivate durch Applikation auf topischem Wege zur Behandlung der
Vernarbung von chronischen Wunden, wie den ulzerösen Läsionen beim Diabetiker, den
varikösen
Geschwüren,
für die ästhetische
Vernarbung von operationsbedingten Wunden, die präventive
und heilende Behandlung von Striemen und deren Komplikationen.
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Bei den vorangegangenen Indikationen
können
die peptidischen Derivate bei der humanen und veterinärmedizinischen
Therapie in Form von „Pommaden,
Gelen, Lösungen
oder eines Sprays eingesetzt werden.
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Eine der privilegierten Anwendungen
der Erfindung besteht in der Verwendung der peptidischen Derivate
auf den verschiedenen Gebieten der Kosmetik, für die präventive und heilende Behandlung
von Falten, des Gesichts, des Halses und der Hände in Form von Lotionen, Gelen,
Milchpräparaten,
Cremes oder eines Sprays bei einer örtlichen Anwendung.
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Eine andere Anwendung der peptidischen
Derivate der Erfindung besteht in ihrer Verwendung als Mittel zur
Aktivierung und Verstärkung
der physiologischen Zellkooperationsmechanismen.
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Die peptidischen Derivate können allein
oder vorzugsweise in Verbindung mit Biomolekülen oder natürlichen
Verbindungen oder deren synthetischen Derivaten eingesetzt werden,
deren spezielle biologische Aktivität gänzlich lediglich durch die
Kooperation zwischen zwei komplementären zellulären Systemen, von denen sie
lediglich ein einziges Element stimulieren oder induzieren, erklärt werden
kann.
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Dies ist insbesondere der Fall bei
den melanotropen Hormonen, die die Melanogenese in den Melanozytenzellen
induzieren und deren Expression auf der Ebene der Oberfläche der
menschlichen Epidermis (weiße
Rasse) gänzlich
lediglich durch die innige Kooperation zwischen den Melanozytenzellen
und den Keratinozyten, welche so eine wirkliche funktionale Einheit,
die als „Epidermal
Melanin Unit" bezeichnet
wird, bilden, erklärt
werden kann.
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Die durch αMSH und dessen Derivate aktivierten
Melanozyten sezernieren Melanin, das in die Keratinozyten transferiert
und in diesen dispergiert wird unter dem Einfluss der peptidischen
Zellkooperationsfaktoren und von deren homologen Derivaten.
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Eine der Anwendungen der Erfindung
besteht in der Verwendung der zuvor beschriebenen peptidischen Derivate
auf den verschiedenen Gebieten der Dermatologie und der Kosmetik.
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Die peptidischen Derivate können allein
oder in Kombination mit anderen aktiven Molekülen, wie den synthetischen
homologen Derivaten von aMSH, oder anderen Substanzen in Form von
Cremes, Milchpräparaten,
Lotionen, Lösungen
oder Sprays im Rahmen von topischen (örtlichen) Anwendungen zur Beschleunigung
der Prozesse der Melanogenese der Epidermis, Beschleunigung der
Melanisation der Haut durch Erzielung einer natürlichen Bräunung und eines vollständigen Schutzes
gegen die Sonnenstrahlen (UV) verwendet werden.
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Die Erfindung betrifft Konjugate,
welche eine peptidische Sequenz umfassen, welche wenigstens drei Aminosäuren ausgewählt unter
Gly-His-Lys und Glu-His-Lys umfasst, in welcher „Lys" für
Lysin oder ein halogeniertes Derivat von Lysin oder ein methyliertes
Derivat von Lysin, insbesondere Methyllysin und Dihydrobrommethyllysin
steht, wobei die Aminosäuren
in der D-, L- oder DL-Form vorliegen können.
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Wobei diese Aminosäuren in
ihrer natürlichen
oder nicht-natürlichen
Form vorliegen, wird diese Sequenz eingesetzt in peptidischer Form
oder chemisch oder physikalisch konjugiert mit wenigstens einer
Verbindung, die ausgewählt
ist unter 1) den Monocarbonsäuren
der allgemeinen Formel
HOOC-R (I)
in
welcher R für
einen gerad- oder verzweigtkettigen, substituierten oder nicht-substituierten
aliphatischen C1- bis C20-Rest, insbesondere
einen Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylrest, welcher eine oder mehrere
Ungesättigtheiten
umfassen kann und substituiert sein kann durch einen oder mehrere
Reste, ausgewählt
aus der Gruppe, umfassend: NH2, OH, Oxo
oder einen cyclischen nicht-aromatischen Rest, der in dem Cyclus
5 bis 6 Atome umfasst, von denen 1 oder 2 von Kohlenstoff verschieden,
insbesondere S, O oder N sein können,
steht, wobei die Cyclen durch C1- bis C3-Alkylreste, insbesondere Methyl, substituiert
sein können,
wie
auch den Alkohol- oder Aldehyd- oder Amidderivaten der Säuren der
Formel I;
mit der Maßgabe,
dass, wenn die peptidische Sequenz einzig Gly-His-Lys umfasst, sie
nicht mit einem einzelnen Palmitinsäurerest konjugiert ist.
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Unter den Cyclen, die substituiert
werden können,
kann man die Cyclen
aufführen, welche Derivaten von
Retinsäure
und Liponsäure
entsprechen.
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In bestimmten Fällen kann die aliphatische
Kette aus einer Polyalkenylkette bestehen.
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Unter den Verbindungen der Formel
1 kann man vorzugsweise die Verbindungen der Formel:
R2-CH=CH-OOOH
von cis-
oder trans-Konfiguration, in welcher R2 ein
C6- bis C16-Alkylrest, welcher gegebenenfalls
einen oder mehrere -NH2, OH- oder Oxosubstituenten
umfasst, ist, aufführen.
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2) den Dicarbonsäuren der allgemeinen Formel
HOOC-RI-COOH (II),
in
welcher R1 für einen gerad- oder verzweigtkettigen,
substituierten oder nicht-substituierten, zweiwertigen, aliphatischen
insbesondere C3- bis C10-Alkylrest,
insbesondere einen Alkyl-, Alkylen-, Alkenylen- oder Alkinylenrest,
welcher eine oder mehrere Ungesättigtheiten
umfassen kann und durch einen oder mehrere Reste NH2,
OH, Oxo oder einen Cl- bis C3-Alkylrest
substituiert sein kann, steht.
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In Zusammenhang mit der allgemeinen
Formel I kann man insbesondere die Verbindungen aufführen, in
denen R steht für:
- – einen
einfach ungesättigten
Rest von cis- oder trans-Konfiguration
mit der allgemeinen Formel
R2-CH=CH- ,
in
welcher R2 für einen aliphatischen Rest,
insbesondere Alkylrest, linear oder verzweigt, welcher wenigstens 6
Kohlenstoffatome, vorzugsweise 6 bis 16 Kohlenstoffatome umfasst,
welcher durch eine Amino-, Hydroxy- oder Oxogruppe substituiert
ist, steht;
- – einen
linearen oder verzweigten C1-C20-Alkylrest,
welcher gegebenenfalls substituiert ist durch einen oder mehrere
Sub stituenten, ausgewählt
unter: Amino, Hydroxy, Oxo, Thiol, Imino, C4-C7-Cycloalkyl, welches gegebenenfalls substituiert
ist und wenn wenigstens 2 Substituenten vorhanden sind, können sie
zusammen eine Bindung, insbesondere eine Disulfidbrücke bilden.
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Die konjugierten Peptide gemäß der Erfindung
sind in Form von Salzen, Estern oder Amiden an Säuren gebunden, die essentielle
Stoffwechselfunktionen bei der Aktivierung des Krebs-Tricarbonsäurecyclus
aufweisen.
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Die Säuren der allgemeinen Formel
(I) oder (II) werden insbesondere ausgewählt unter den Carbonsäuren, bei
denen R1 für ein substituiertes oder nicht-substituiertes
C4-C8-Alkylen steht,
insbesondere Essigsäure,
Adipinsäure, α-Aminoadipinsäure und
Derivaten davon, DL-Liponsäure
und Derivaten davon, Dihydroliponsäure und dessen Derivat N-Lipoyllysin,
Pimelinsäure
und Derivaten davon, Sebacinsäure
und Derivaten davon.
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Die Fettsäuren, bei denen R für einen
linearen oder verzweigten Alkylenrest steht, sind insbesondere die
Hydroxydecen- und Decenoylsäuren,
die Retinsäuren
und deren Derivate, Retinal und Retinol, Myristinsäure und
deren Derivate und Palmitinsäure
in Form von Salzen, Estern oder Amiden.
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Speziell für die Gewinnung von erfindungsgemäßen Konjugaten
angepasste Verbindungen werden unter Essigsäure und deren Derivaten, α-DL-Liponsäure und
deren Derivaten, Dihydroliponsäure,
N-Lipoyllysin, Adipinsäure, α-Aminoadipinsäure, Pimelinsäure, Sebacinsäure und
deren Derivaten, trans-l0-Hydroxy-Δ2-decensäure und trans-Oxo-9-decen-2-säure, Retinsäure und
deren Derivaten, Retinol und Retinal, Myristinsäure und Palmitinsäure ausgewählt.
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Spezieller betrifft die Erfindung
Peptide, die die endozellulären
Synthesen der Kollagene vom Typ I und III und der Glycosaminoglycane
induzieren, mit hoher Vernarbungs- und Stoffwechselaktivität wie auch
Moleküle,
die die zellulären
Kooperationsprozesse induzieren und stimulieren.
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Die erfindungsgemäßen Peptidkonjugate umfassen
wenigstens eine der folgenden Peptidsequenzen:
Gly-His-Lys
Glu-His-Lys
in
welcher Lys für
Lysin oder ein halogeniertes Derivat von Lysin oder ein methyliertes
Derivat von Lysin, insbesondere Methyllysin und Dihydrobrommethyllysin
steht, wobei die Aminosäuren
in D-, L- oder DL-Form vorliegen können.
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Die Peptidkonjugate entsprechen einer
der folgenden allgemeinen Formeln:
in welcher – A eine
Verbindung der allgemeinen Formel I oder II oder das dieser Verbindung
entsprechende Radikal ist,
– X eine Kette von 1 bis 3
Lys-Resten, welche gegebenenfalls methyliert ist, insbesondere am
N-terminalen Ende,
OH, NH
2 oder eine Bindung steht,
–Y für OH oder
NH
2 steht,
wobei die Aminosäuren in
D-, L- oder DL-Form vorliegen; A ist vorzugsweise Essigsäure, Adipinsäure, α-Aminoadipinsäure, DL-Liponsäure, Dihydroliponsäure, N-Lipoyllysin,
Pimelinsäure,
Sebacinsäure, trans-Oxo-9-decen-2-säure und
trans-Hydroxy-l0-decen-2-säure.
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Die Erfindung betrifft insbesondere
die folgenden Peptidkonjugate:
- 1 – A-McLys-Lys-Lys-Gly-His-Lys-NH2
- 2 – A-McLys-Lys-Gly-His-Lys-NH2
- 3 – A-McLys-Gly-His-Lys-NH2
- 4 – A-McLys-Lys-Lys-Gly-His-Lys-OH
- 5 – A-McLys-Lys-Gly-His-Lys-OH
- 6 – A-McLys-Gly-His-Lys-OH
- 7 – A-Lys-Lys-Gly-His-Lys-NH2
- 8 – A-Lys-Gly-His-Lys-NH2
- 9 – A-Lys-Lys-Gly-His-Lys-OH
- 10 – A-Lys-Gly-His-Lys-OH
- 11 – A-Lys-Lys-Glu-His-Lys-NH2
- 12 – A-Lys-Glu-His-Lys-NH2
- 13 – A-Glu-His-Lys-NH2
- 14 – A-Lys-Lys-Glu-His-Lys-OH
- 15 – A-Lys-Glu-His-Lys-OH
- 16 – A-Glu-His-Lys-OH
wobei
A wie zuvor definiert ist, wie auch die Derivate dieser Moleküle in Form
von Salzen, Estern oder Amiden.
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Die vorstehend erwähnten Aminosäuresequenzen
können
Sequenzen von natürlichen
oder nicht-natürlichen
Aminosäuren
sein.
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Die erfindungsgemäßen Konjugationen können ausgeführt werden,
indem man die Amin- oder Säurefunktion
der Aminosäure
mit einer Amin- oder Säurefunktion
der Säure
A reagieren lässt,
oder es ebenfalls möglich,
das Vorhandensein einer Hydroxyfunktion an der Säure auszunutzen.
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Die Erfindung betrifft die Gesamtheit
dieser Konjugationen wie auch die nicht-funktionalen Konjugate.
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Die zuvor im Rahmen der Erfindung
beschriebenen Peptidkonjugate können
in ihrer peptidischen Form oder gebunden an ein Metall in Form von äquimolekularen
Komplexen eingesetzt werden.
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Das für die Herstellung der Metall-Peptid-Komplexe
der Erfindung eingesetzte Metall ist vorzugsweise ein zweiwertiges
Metall, insbesondere Zink (Zn), das in Form eines Salzes mit der
Carboxylgruppe der terminalen Aminosäure, des Lysins (Lys) gekoppelt
werden kann.
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In bestimmten Fällen ist es ebenfalls möglich, dass
bestimmte Aminosäuren
beispielsweise Glycosylierungsfunktionen umfassen.
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Es muss sich verstehen, dass die
Erfindung gleichfalls die Gesamtheit dieser Formen betrifft.
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Gemäß einem anderen Aspekt betrifft
die Erfindung galenische Zusammensetzungen, die wenigstens ein Peptidkonjugat,
wie zuvor definiert, mit kosmetisch und/oder pharmazeutisch annehmbaren
Trägersubstanzen
enthalten.
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Die Erfindung betrifft insbesondere
die Verwendung von einem oder mehreren der zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen Peptidkonjugate
und -derivate als Arzneimittel.
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Die Erfindung betrifft gleichfalls
kosmetische Zubereitungen, die ein oder mehrere erfindungsgemäße Peptidkonjugate
und -derivate, die zuvor beschrieben worden sind, enthalten.
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Die Erfindung betrifft gleichfalls
galenische, pharmazeutische und kosmetische Zusammensetzungen, die
wenigstens eine der Verbindungen, wie zuvor definiert, umfassen.
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Einer der Gegenstände der Erfindung ist die Verwendung
der Peptidkonjugate und von deren Derivaten, der Zusammensetzungen oder
Kombinationen mit bekannten Wirkstoffen auf topischem oder injizierbarem
Wege.
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Diese Peptidkonjugate, deren Derivate,
die Zusammensetzungen oder Kombinationen können in Form von injizierbaren
lyophilisierten Ampullen und in Form von Creme, Gelen, Milchpräparaten,
Lotionen oder Sprays vorliegen und bekannte Trägersubstanzen umfassen.
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Die Peptidkonjugate der Erfindung,
deren Derivate, Zusammensetzungen oder Kombinationen mit bekannten
Wirkstoffen sind für
die Behandlung und die Vernarbung von Wunden und chronischen Läsionen beim Diabetiker,
den varikösen
Geschwüren,
der Vernarbung von operationsbedingten Wunden, der präventiven und
heilenden Behandlung von Striemen nützlich.
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Das Konjugat könnte insbesondere mit wenigstens
einer Substanz, welche unter den Antiseptika, den Antibiotika mit
breitem antimikrobiellem Spektrum oder den Antimykotika mit breitem
Aktivitätsspektrum
ausgewählt
wird, kombiniert werden für
die Herstellung einer Zusammensetzung, welche für die Behandlung auf topischem
Wege und für
die Vernarbung von infizierten Wunden bestimmt ist.
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Gemäß einem anderen Aspekt kann
das Peptidkonjugat in Form von Kombinationen oder Zusammensetzungen
mit für
ihre gerinnungshemmenden und phlebotonen Aktivitäten auf topischem Wege bekannten Molekülen präsentiert
werden, welche für
die präventive
und heilende Behandlung von Striemen, Veneninsuffizienz (schweren
Beinen), Kupferausschlag bei lokaler Anwendung in Form von Cremes,
Gelen, Milchpräparaten
oder Sprays bestimmt sind.
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Eine der bevorzugten Anwendungen
der Erfindung besteht in der Verwendung der Peptidkonjugate als Adjuvantien/Hilfsstoffe, Aktivatoren
oder Cofaktoren in Kombination mit Molekülen, ausgewählt unter aMSH oder dessen
homologen Derivaten, ACTH oder Propionmelanocortin und deren Analoga
in Zusammensetzungen, die für
die präventive
und heilende Behandlung von Störungen
der Melanogenese, für
die Stimulierung der Melanogenese in der Epidermis, in Hinblick
auf die Erzielung einer schnellen natürlichen Bräunung und eines vollständigen Schutzes
gegen die ultravioletten Sonnenstrahlen (DEM) bestimmt sind.
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Eine andere der bevorzugten Anwendungen
der Erfindung besteht in der Verwendung der Peptidkonjugate in verschiedenen
kosmetischen Formulierung für
die präventive
und heilende Behandlung von Falten, des Gesichts, des Halses und
der Hände
in Form von Emulsionen, Cremes, Milchpräparaten, Lotionen, Gelen oder
Sprays bei örtlicher
Anwendung.
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Die folgenden Beispiele sind dazu
bestimmt, die Erfindung zu veranschaulichen, ohne ihren Umfang in
irgendeiner Weise zu beschränken.
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In diesen Beispielen erfolgt eine
Bezugnahme auf die folgenden Figuren:
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1:
Fluoreszenzintensität
von mit Rhodamin markierten Fibroblasten: Nachweis von Kollagen
vom Typ 1.
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2 und 3: Nachweis der Kollagensynthese durch
mit dem Konjugat Nr. 7 behandelte oder nicht behandelte Zellen durch
Messung der Färbungsintensität.
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Beispiel Nr. 1 – Synthese
des Konjugats 7
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A-Lys-Lys-Gly-His-Lys-NH2
A
= Adipinsäure
= COOH-(CH2)4-OOOH
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Die Synthese wurde durch die an die
Struktur des Konjugats angepasste Merrifield-Methode gemäß den folgenden
Schritten ausgeführt:
Z-Gly-His-Lys-NH2:
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Zu einer Lösung in Dimethylformamid (10
ml), welche Z-Gly-OH (2,08 g, 10 mmol), BOP (4,42 g, 10 mmol) und
Diisopropylethylamin (DIEA, 22 mmol) enthält, wird unter Bewegung und
bei 0°C
das Chlorhydrat von H-His-Lys-NH2 (2,1 g,
11 mmol) zugesetzt.
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Nach 6 h Bewegung bei Umgebungstemperatur
wird das Reaktionslösemittel
unter Vakuum bei einer Temperatur unter 40°C verdampft.
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Der Rückstand wird in Ethylacetat
(200 ml) gelöst.
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Die organische Phase wird mehrere
Male mit einer gesättigten
Natriumbicarbonatlösung
(2 × 50
ml), Wasser (2 × 50
ml), mit einer gesättigten
KHSO4-Lösung
(2 × 50
ml), mit Wasser (2 × 50
ml) gewaschen.
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Die organische Phase wird über Natriumsulfat
getrocknet und unter Vakuum aufkonzentriert, was zu einem weißen Schaum
(3,1 g, 91%) führt,
der bei einer Chromatographie an Kieselgel sich als homogen erweist.
Z-Lys(Boc)-Gly-His-Lys-NH2
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Die Verbindung Z-Gly-His-Lys-NH2 (3,45 g, 10 mmol) wird in Ethanol 95 (100
ml), welches 20 ml Salzsäure
enthält,
gelöst.
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Die Reaktionsmischung wird 5 h hydriert.
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Der Katalysator wird abfiltriert
und das Lösemittel
unter Vakuum bei einer Temperatur unter 40°C auf konzentriert.
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Der verbleibende Rückstand
wird mehrere Male mit Ether verrieben, dekantiert. Er wird unter
Vakuum in Gegenwart von KOH getrocknet. Dieser Rückstand wird in Dimethylformamid
(10 ml) in Gegenwart von Z-Lys(Boc)-OH (3,81 g, 10 mmol), BOP (4,42
g, 10 mmol), Diisopropylethylamin (DIEA, 22 mmol) gelöst.
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Die Reaktionsmischung wird 30 min
bei 0°C,
dann 4 h bei Umgebungstemperatur bewegt.
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Das Reaktionslösemittel wird unter Vakuum
bei einer Temperatur unter 40°C
verdampft.
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Der Rückstand wird in Ethylacetat
(200 ml) gelöst.
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Die organische Phase wird mehrere
Male mit einer gesättigten
Natriumbicarbonatlösung
(2 × 50
ml), Wasser (2 × 50
ml), mit einer gesättigten
KHSO4-Lösung
(2 × 50
ml), Wasser (2 × 50
ml) gewaschen. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet
und unter Vakuum auf konzentriert, was zu einem weißen Schaum
(4,7 g, 82%) führt,
welcher sich bei einer Chromatographie an Kieselgel als homogen
erweist.
Z-Lys-(Boc)-Lys-(Boc)-Gly-His-Lys-NH2
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Die Verbindung ZLys(Boc)-Gly-His-Lys-NH22
(5,7 g, 10 mmol) wird in Ethanol 95 (150 ml), welches 10 mmol
Salzsäure
enthält,
gelöst.
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Die Reaktionsmischung wird 5 h hydriert.
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Der Katalysator wird abfiltriert
und das Lösemittel
unter Vakuum bei einer Temperatur unter 40°C auf konzentriert.
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Der zurückbleibende Rückstand
wird mehrere Male mit Ether verrieben, abdekantiert. Er wird unter
Vakuum in Gegenwart von KOH getrocknet. Dieser Rückstand wird in Dimethylformamid
(10 ml) in Gegenwart von Z-Lys(Boc)-OH (3,81 g, 10 mmol), BOP (4,
42 g, 10 mmol) , Diisopropylethylamin (DIEA, 22 mmol) gelöst.
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Die Reaktionsmischung wird 30 min
bei 0°C,
dann 6 h bei Umgebungstemperatur bewegt.
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Das Reaktionslösemittel wird unter Vakuum
bei einer Temperatur unter 40°C
verdampft.
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Der Rückstand wird in Ethylacetat
(300 ml) gelöst.
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Die organische Phase wird mehrere
Male mit einer gesättigten
Natriumbicarbonatlösung
(2 × 50
ml), Wasser (2 × 50
ml), mit einer gesättigten
KHSO4-Lösung
(2 × 50
ml), Wasser (2 × 50
ml) gewaschen. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet
und unter Vakuum auf konzentriert, was zu einem weißen Schaum
(6,5 g, 81%) führt,
welcher sich bei einer Chromatographie an Kieselgel als homogen
erweist.
A-Lys-Lys-Gly-His-Lys-NH2
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Die Verbindung ZLys(Boc)-Lys(Boc)-Gly-His-Lys-NH2 (8 g, 10 mmol) wird in Ethanol 95 (200
ml), welches 20 mmol Salzsäure
enthält,
gelöst.
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Die Reaktionsmischung wird 5 h hydriert.
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Der Katalysator wird abfiltriert
und das Lösemittel
unter Vakuum bei einer Temperatur unter 40°C auf konzentriert.
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Der zurückbleibende Rückstand
wird mehrere Male mit Ether verrieben, abdekantiert. Er wird unter
Vakuum in Gegenwart von KOH getrocknet. Dieser Rückstand wird in Dimethylformamid
(10 ml) in Gegenwart von Adipinsäure
(2,1 g, 10 mmol), BOP (4,42 g, 10 mmol), Diisopropylethylamin (DIEA,
22 mmol) gelöst.
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Die Reaktionsmischung wird 15 min
bei 0°C,
dann 5 h bei Umgebungstemperatur bewegt.
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Das Reaktionslösemittel wird unter Vakuum
bei einer Temperatur unter 40°C
verdampft.
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Der Rückstand wird in Ethylacetat
(200 ml) gelöst.
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Die organische Phase wird mehrere
Male mit einer gesättigten
Natriumbicarbonatlösung
(2 × 50
ml), Wasser (2 × 50
ml), mit einer gesättigten
KHSO4-Lösung
(2 × 50
ml), Wasser (2 × 50
ml) gewaschen. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet
und unter Vakuum aufkonzentriert, was zu einem weißen Pulver
(7,5 g, 76%) führt,
welches sich bei einer Chromatographie an Kieselgel als homogen
erweist.
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Diese Verbindung wird in Trifluoressigsäure (50
ml) gelöst.
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Nach 30 min wird das Lösemittel
unter Vakuum bei einer Temperatur unter 40°C aufkonzentriert und der Rückstand
mehrere Male mit wasserfreiem Ether verrieben.
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Das erhaltene weiße Pulver (6,9 g, 88%) wird
unter Vakuum getrocknet.
Adipoyl-Lys-Lys-Gly-His-Lys-NH2
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Beispiel Nr. 2 – Synthese
des Konjugats 8
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A-Lys-Gly-His-Lys-NH2
A
= traps-l0-Hydroxy-dec-2-ensäure
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Die Synthese wurde durch die angepasste
Merrifield-Methode gemäß den folgenden
Schritten und der in Beispiel Nr. 1 beschriebenen Methodik ausgeführt.
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- 1 – Z-Gly-OH
+ H-His-Lys-NH2
- 2 – Z-Gly-His-Lys-NH2
- 3 – Z-Lys-(BOC)-Gly-His-Lys-NH2
- 4 – -BOP,
DIEA, DMF
- 5 – Decenoyl-Lys-Gly-His-Lys-NH2
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Herstellung des Metall-Peptid-Komplexes
mit Zink Man verwendet das Zinksalz in Form von ZnCl2.
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Das zuvor erhaltene Peptidkonjugat
wird bei pH 5,6 in destilliertem Wasser in den folgenden Anteilen in
Lösung
gebracht: 1 Molekül
des Konjugats Nr. 8 in einer 10%-igen Lösung von ZnCl2.
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Nach Erwärmen bei 20°C während 10 min wird der Komplex
an einer Biogel P-2-Säule
gereinigt, um den nicht an dem Peptid fixierten Überschuss von Zinkchlorid zu
entfernen und mit destilliertem Wasser eluiert.
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Nach der Flution erhält man eine
Lösung,
welche 0,5% von diesem ZnCl2 auf ein peptidisches
Molekül enthält.
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Die Lösung wird dann bei tiefer Temperatur „–60°C" eingefroren
und lyophilisiert.
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Man erhält den Metall-Peptid-Komplex
in Form eines weißen
Pulvers, dessen Formel die folgende ist:
HO(CH
2)
7-CH=CH-CO-Lys-Gly-His-Lys-Zn
oder (trans-10-Hydroxy-dec-2-ensäure-Lys-Gly-His-Lys-Zn),
dessen
analytische Eigenschaften die folgenden sind:
| Organoleptische
Eigenschaften: | weißes, in
Wasser lösliches
Lyophilisat |
| HPLC-Reinheit: | 95% |
| Massenspektrometrie
(„Zink
ausgenommen"): | PM
636,4–6363,6 |
| Aminosäurezusammensetzung:
(%, Zink ausgenommen) | |
| Lysin | 42,95 |
| Histidin | 21,55 |
| Glycin | 8,97 |
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Beispiel 3 – Untersuchung
des Vernarbungsvermögens
des Peptidkonjugats Nr. 7 an dem Tier „Ratte"
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Ziel der Untersuchung
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Bestimmen des Vernarbungsvermögens des
Peptids Nr. 7, verabreicht an OFA-Ratten durch topische Applikationen
in Dosen von 0,75 μg,
7,5 μg und
75 μg pro
Tier während
fünf Tagen.
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Material und
Methode
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I – Tiere: Ratten des Stamms
OFA, OF1, IFFA-CREDO, mit einem Gewicht von 250 bis 300 g.
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II – Zu untersuchende
Produkte
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Peptidkonjugat Nr. 7, welches der
folgenden Formel entspricht:
Adipoyl-Lys-Lys-Gly-His-Lys-NH2.
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In Lösung gebracht in Propylenglycol
in Dosen von 1,5 μg/ml,
15 μg/ml,
150 μg/ml.
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III – Methode
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Nach Ether-Vollnarkose wurde ein
Einschnitt von 5 cm Länge
an der rechten Flanke der Tiere vorgenommen.
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Es wurde eine Naht mittels eines
Trinyl 2/0-Fadens mit einem Stich alle 0,5 cm ausgeführt.
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Die als Vergleichstiere behandelten
Tiere unterzogen sich dem gleichen Eingriff unter den gleichen Bedingungen.
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Die Behandlung begann an dem dem
Eingriff folgenden Tag an den Gruppen von behandelten Tieren mit
Dosen von 0,5 ml peptidischer Lösung
auf jedem Einschnitt.
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0,75 μg, 7,5 μg oder 75 μg Peptid pro Tier und pro Anwendung
während
der Behandlungsdauer, d.h. 5 Tagen.
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Die Tiere wurden 9 Tage beobachtet,
dann wurden sie durch eine letale Dosis Penthiobarbital getötet.
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Die in Vernarbung befindlichen Zonen
der Haut wurden entnommen und Streck„tests" mit dem Dynamometer unterzogen, um
die Widerstandsfähigkeit
der Narbe gegenüber
dem Strecken zu messen.
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Statistische
Analyse der Ergebnisse
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An den mit dem Dynamometer erhaltenen
Widerstandsfähigkeitswerten
wurde eine statistische Analyse vorgenommen.
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Es wurden an den einzelnen Werten
eine Varianzanalyse und ein Student-T-Test ausgeführt, um
das Signifikanzniveau der Ergebnisse zu definieren.
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Ergebnisse
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Das den Versuchstieren in Dosen von
0,75 μg,
7,5 μg und
75 μg pro
Tag und während
5 aufeinanderfolgenden Tagen verabreichte Peptid Nr. 7 verstärkt auf
signifikante Weise die Vernarbung der Wunden bei den behandelten
Tieren bezogen auf die Vergleichstiere; bei Dosen von:
0,75 μg beträgt die Verstärkung 14,5%,
7,5 μg beträgt die Verstärkung 30,9%,
75 μg beträgt die Verstärkung 59,6%.
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Man beobachtet insbesondere eine
vollständige
Vernarbung bei den behandelten Tieren ab dem dritten Tag, wohingegen
die Vergleichstiere kein sichtbares Anzeichen einer Vernarbung aufweisen.
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Das Erscheinungsbild der Vernarbungen
am neunten Tag zeigt bei den behandelten Tieren eine perfekt flache
Vernarbung bei Fehlen von Narbenwülsten.
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Tabelle
Nr. 1
Mit 0,75 μg/Tag/5
Tage durch das Peptid mit der Formel Nr. 7 behandelte Tiere „Dynanometermessung" Widerstandsfähigkeit
der Narben gegenüber
dem Strecken
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Tabelle
Nr. 2
Mit 7,5 μg/Tag/5
Tage durch das Peptid mit der Formel Nr. 7 behandelte Tiere
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Tabelle
Nr. 3
Mit 7,5 μg/Tag/5
Tage durch das Peptid mit der Formel Nr. 7 behandelte Tiere
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Schlussfolgerungen
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Die im Verlauf dieser Untersuchung
erhaltenen Ergebnisse erlauben den Rückschluss, dass das Peptid
Nr. 7 eine hochgradig signifikante Vernarbungswirkung aufweist.
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Für
die Dosen von 75 μg
pro Tag während
5 Tagen beträgt
der Unterschied zwischen der behandelten Gruppe und der Vergleichsgruppe
59,6%.
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Beispiel 4 – Nachweis
der Aktivität
des Konjugats Nr. 7 auf die Synthese von Kollagen vom Typ I durch
Fibroblasten in Kultur
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Der Nachweis des Einflusses des Konjugats
Nr. 7 auf die Synthese von Kollagen vom Typ I durch in Kultur befindliche
Zellen wurde an zwei Zelltypen geführt:
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- – menschlichen
Mammaplastik-Fibroblasten bei der 3. Passage, erhalten in unserem
Zellkulturlabor am IEB,
- – MRC5,
nicht transformierten menschlichen embryonalen Lungenfibroblasten
bei Passage p38, erhalten bei ICN Flow bei/auf p25–30.
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Die Zellen werden mit dem Konjugat
Nr. 7 stimuliert oder nicht, dann werden sie mit dem Fluoreszenzlichtmikroskop
nach Sichtbarmachung des Kollagens vom Typ I durch eine sekundäre Immunfluoreszenzreaktion
beobachtet.
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Material und
Methode
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Zellkultur:
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Die Zellen werden in einer Menge
von 70000 Zellen pro ml für
die Primärkultur-Fibroblasten
und 20000 für
die MRC5 angeimpft.
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Die Kultur wird in DMEM mit 10% fötalem Kälberserum
in Leigton-Röhrchen,
die eine Lamelle am Boden des Röhrchens
enthalten, Endvolumen: 1,6 ml, ausgeführt.
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8 Röhrchen werden für jeden
Zelttyp vorgesehen: 3 Vergleichsproben und 5 Konzentrationen.
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Vorbereitung des Produkte:
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Herstellung
einer 2,34 10
–3 M
Stammlösung
des Konjugats Nr. 7: M1
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Diese unterschiedlichen Stammlösungen werden
dem Kulturmedium im Moment des Kontakts mit dem Produkt zugesetzt.
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Die Verdünnungen werden in PBS (Eurobio) – BSA 0,1%
(Flucka) vorgenommen, dann durch 0,22 μm-Filter (Sartorius) filtriert.
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Methodik
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Am Tag 0 wird das Medium entfernt
und durch frisches Medium ersetzt, zu welchem das Konjugat Nr. 7
in verschiedenen Konzentrationen gemäß der folgenden Tabelle zugesetzt
wird:
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Die Vergleichsproben TO und T erhielten
lediglich Medium. T1 wird wie Cl behandelt.
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Fixierung der
Zellen
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Das Medium wird entfernt; die Röhrchen werden
dreimal mit DMEM ohne Serum bei 37°C gewaschen.
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Die Zellen werden 20 min bei 4°C in Gegenwart
von 2,5% PFA (Prolabo) in Hanks (Eurobio) fixiert.
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Es werden drei Spülungen in DMEM ohne Serum ausgeführt, gefolgt
von zwei Waschvorgängen
von 10 min in PBS ohne Calcium und ohne Magnesium (Eurobio).
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Markierung der
Zellen
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– Primärreaktion:
Anheftung des ersten anti-humanes Kollagen vom Typ I-Antikörpers von
der Maus, 1/100 in PBS verdünnt.
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Die Lamellen werden aus den Röhrchen herausgenommen
und getrocknet. Die die Zellen tragende Fläche wird lokalisiert und markiert
(eine Ecke wird als Markierung abgerissen).
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100 ml primärer Antikörper werden mit den Zellen
unter den Bedingungen C1 bis C5 in Kontakt gebracht.
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Die Lamellen T und T1 bleiben in
den Röhrchen
mit PBS ohne Calcium und ohne Magnesium, denn sie sind Vergleichsproben
für den
zweiten Antikörper.
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Die Lamellen werden in eine feuchte
Kammer bei +4°C
unter sanfter Bewegung während
einer Nacht gelegt, um die Dehydratisierung zu vermeiden.
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– Sekundärreaktion:
dieser Schritt weist die Primärreaktion
durch einen mit TRITC markierten sekundären anti-Maus-IgG-Antikörper von
der Ziege: Sigma Ref. T-7782, Charge 044H4831, nach.
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Der primäre Antikörper wird entfernt und die
Lamellen werden zweimal 10 min mit PBS bei Umgebungstemperatur gewaschen.
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Dann wird eine Wäsche in PB5 mit 0,1% BSA für weitere
10 min ausgeführt.
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100 ml sekundärer Antikörper, 1/120 verdünnt, werden
mit den Zellen von allen Lamellen bei Umgebungstemperatur 1 h in
Kontakt gebracht.
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Der Antikörper wird dann entfernt und
die Lamellen werden mit PBS mit 0,1% BSA 10 min, dann viermal 5
min mit durch Osmose behandeltem Wasser gewaschen.
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Einmal getrocknet, werden die Lamellen
mit der Seite mit den Zellen mit einem Tropfen Eindeck- oder Fixierungsflüssigkeit
(Sigma) auf einem Mikroskopie-Objektträger fixiert. Die Ränder der
Lamellen werden mit Firnis zugeschmiert.
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Ergebnisse
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Die mikroskopischen Beobachtungen
erfolgen an einem geraden (Auflicht; „droit") Fluoreszenzmikroskop der Firma Zeiss
(Axioplan), auf dem eine 3 CCD-Kamera von Sony (MC-3215 P/M), welche
mit einem Trinitron-Videomonitor mit Farbbildschirm von Sony verbunden
ist, montiert ist. Das Ganze ist mit einem Sony-Farbdrucker (UP-7000p)
verbunden. Die Beobachtungen der Objektträger erfolgt mit dem Objektiv
Plan Apochromat × 63
mit Öl.
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Die Zellen werden zuerst im Interferenz-
und/oder Phasenkontrast beobachtet. Wenn ein Feld ausgewählt ist,
wird das Bild aufgezeichnet, dann wird, ohne die Stelle zu verändern, die
Beobachtung in Fluoreszenz ausgeführt und aufgezeichnet.
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So ordnen wir für jede Abtastung gleichzeitig
auf dem Schirm oder übereinandergelagert
die zwei gespeicherten Bilder an.
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Schlussfolgerungen
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Wie die Gesamtheit dieser Ergebnisse
zeigt, stimuliert das Konjugat Nr. 7 in einer Konzentration von 10–11 M die
Synthese von Kollagen vom Typ I durch Primärkultur-Fibroblasten sehr signifikant.
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Die rote Farbe zeigt die Fixierung
der mit Rhodamin markierten sekundären Antikörper an den anti-Kollagen vom
Typ I-Antikörpern
an. Diese Farbe weist folglich das Vorhandensein von durch die in
Kultur befindlichen Fibroblasten synthetisiertem Kollagen vom Typ
I nach.
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Die mittlere Leuchtstärke des
roten Bereichs auf dem gesamten Bild der mit dem Konjugat Nr. 7
in einer Konzentration von 10–11 M behandelten Zellen
beträgt
54,8, wohingegen sie für
die nicht behandelten Zellen lediglich 32,78 beträgt.
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Das Konjugat Nr. 7 stimuliert die
Synthese von Kollagen vom Typ I durch menschliche Primärkultur-Fibroblasten
auf signifikante Weise: +67%.
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Die hier nicht gezeigten Experimente,
die mit den MRC 5 erhalten wurden, ergeben die gleichen
Tendenzen.
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(Siehe 1 bis 3).
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LEGENDEN DER
FIGUREN
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1:
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Fluoreszenzintensität von mit
Rhodamin markierten Fibroblasten: Nachweis von Kollagen vom Typ
I
10–11 M
10–9 M
10–7 M
T
(T = Vergleichsprobe)
10–9 M
10–7 M
T
