DE69610826T2

DE69610826T2 - Morphogeninduzierte regenerierung der dentin

Info

Publication number: DE69610826T2
Application number: DE69610826T
Authority: DE
Inventors: F. Charette; Bruce Rutherford
Original assignee: Stryker Corp
Current assignee: Stryker Corp
Priority date: 1995-03-01
Filing date: 1996-02-14
Publication date: 2001-05-03
Anticipated expiration: 2016-02-15
Also published as: CA2214341A1; WO1996026737A1; ES2153564T3; ATE197250T1; JPH11501029A; EP0812207A1; EP0812207B1; DE69610826D1; AU713222B2; AU4868996A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Zahnheilkunde und Biomedizin. In bestimmten Ausführungsformen betrifft die Erfindung insbesondere Verfahren und Zusammensetzungen zum Stimulieren von Säugetier-Odontoblasten und zum Induzieren einer Morphogenese von Säugetier-Dentin.

Ausgangspunkt der Erfindung

Bei Säugetieren kann eine periodontale Erkrankung, wie beispielsweise Gingivitis, aus der Schwächung von periodontalem Gewebe durch infektiöse Mittel (beispielsweise buccale Mikroorganismen), Fehlernährung (beispielsweise Skorbut) oder Turmorleiden (beispielsweise Leukämie und Lymphom) entstehen. Periodontale Erkrankungen sind oftmals durch Entzündung, Blutung, Geweberückgang und/oder Ulzeration gekennzeichnet. Wenn sie nicht in geeigneter Weise behandelt werden, können periodontale Erkrankungen zum Zahriverlust beitragen. Beispielsweise können Zahnfleisch-Läsionen entstehen, wo Bakterien-Plaque an der Zahn-Zahnfleisch-Grenzfläche anhaftet und eine lokale Entzündung und/oder Zurückgang des Zahnfleisches provoziert. In frühen Stadien ist die Gingivitis mit einer Zahnempfindlichkeit gegenüber der Wahrnehmung von Druck und/oder Temperatur verbunden. Beispielsweise können die heimgesuchten Zähne bei Kontakt mit kalten oder heißen Reizen schmerzen. Dies schreitet zu einem ernsthaften ununterbrochenen pochenden Schmerz voran, der zuletzt mit einer Infektion des Zahnpulpa-Gewebes, der Wurzelhaut oder des Alveolarknochens des Zahnfaches verbunden ist, wenn sie unbehandelt bleibt. Ernsthaftere Komplikationen, wie beispielsweise Endocarditis, können entstehen, wo unbehandelte Läsionen buccale Mikroorganismen mit einem Eingangstor in den Blutstrom der heimgesuchten Person bereitstellen. Harrison's Principles of Internal Medicine, 12. Ausgabe, 1991 (Wilson et al., Herausgeber), S. 242-243. Gegenwärtige Behandlungen schließen professionelle Reinigung zur Entfernung von Plaque und Zahnstein, die Verwendung oraler Antiseptika, lokale und/oder systemische Antibiotika-Therapien und/oder chirurgische Verfahren zur Entfernung von Periodontal-Taschen ein, die aus periodontalen Gewebs-Läsionen und Nekrose gebildet werden. Die Gingivitis wird somit durch Wundreinigung der lädierten Gingiva und des beeinträchtigten Zahnes oder Zahnwurzel-Oberfläche, die an die Läsionsstelle angrenzt, behandelt. Behandelte Zahnfleisch-Läsionen heilen durch die Bildung von Narbengewebe an der Läsionsstelle. Wo ein Zahnverlust nahe bevorsteht oder als eine Folge einer Periodontalerkrankung bereits eingetreten ist, wird ein Prothesen-Zahn oder eine entfernbare Brücke anstelle des natürlichen Zahnes eingesetzt.
Dentalkaries trägt im allgemeinen ebenso zur Schwächung des Zahngewebes durch infektiöse Mittel oder nahrungsbedingte Ursachen bei. Ein Loch oder kariöse Läsion, schließt oftmals die Kolonisierung und den Abbau mineralisierten Zahngewebes (beispielsweise Zahnschmelz oder Dentin) durch buccale Mikroorganismen ein. Wenn sie unbehandelt ist, expandiert die Läsionsstelle und kann die mineralisierte Zahnwand schwächen, sie durchdringen und das Zahnpulpagewebe dem Risiko einer Infektion aussetzen. Somit kann eine unbehandelte kariöse Läsionsstelle ebenso buccale Mikroorganismen mit einem Eintrittstor in den Blutström bereitstellen. Herkömmliche Behandlungen für Dentalkaries schließen eine Abtragung des lädierten Dentins zur Exposition einer frischen Oberfläche von unbeeinträchtigtem Restdentin, gefolgt von einem Versiegeln und Restaurierung mit einem inerten Material, das für eine Zahnanwendung geeignet ist, beispielsweise Süber-Amalgam, zusammengesetzte Kunststoffe, Gold oder Porzellan, ein. Wenn sich die Infektion bis zum Pulpagewebe ausgebreitet hat, wird es notwendig, den Zahn zu extrahieren oder den Inhalt der Pulpakammer und die Wurzelkanäle vor dem Versiegeln und der Wiederherstellung bzw. Rekonstruktion mit Inertmaterialien zu entfernen. Beide Ansätze erfordern die Konstruktion von dauerhaften Dental-Prothesen, wie beispielsweise Brücken oder Kronen, die über die Zeit brüchig werden können.
Früher wurden Verfahren und Zusammensetzungen offenbart, die zum Induzieren einer Periodontalgewebs-Morphogenese und Dentinogenese bei einem Säugetier in der Lage waren, einschließlich einer therapeutisch wirksamen Konzentration eines Morphogens (US S. N. 08/155,343 (veröffentlicht als WO94/06399)). Immer noch verbleiben Bedürfnisse nach einer verbesserten Behandlung von Zahnkaries und Periodontalerkrankung, einschließlich Gingivitis. Besondere Bedürfnisse verbleiben für verbesserte Behandlungs-Verfahren und -Zusammensetzungen, die Zahnverlust und Verlust des damit verbundenen Gewebes, einschließlich Dentin-, Gingiva- und Pulpa-Gewebe, abschwächen. Noch speziellere Bedürfnisse bleiben nach verbesserten Verfahren und Zusammensetzungen, die die regenerative Heilung funktionaler Zahngewebe im Anschluß an die Resektion von kariösen oder periodontalen Läsionen ermöglichen, einschließlich Dentingewebe, Pulpa, Zahnzement, Wurzelhaut, Zahnfleisch und dergleichen.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist ein Ziel dieser Erfindung, Mittel zur Hemmung des Verlustes von Dentalgewebe bei Säugetieren, ebenso wie Mittel zur Induktion von dessen Regeneration bereitzustellen. Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Mittel zur Stimulierung der Proliferation und Differentiation von Odontoblasten bei Säugetieren, insbesondere Primaten, bereitzustellen. Es ist weiterhin ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Mittel zur Stimulierung der Expression des Odontoblasten-Phänotyps, einschließlich der Erzeugung mineralisierter Dentinmatrix durch Säugetier-Zahnpulpagewebe, bereitzustellen, einschließlich Primaten- Zahnpulpagewebe, wie beispielsweise menschliches Zahnpulpagewebe. Es ist ein weiteres Ziel, Mittel zum Hemmen der Periodontalgewebsschädigung und des Zahnverlustes, der mit periodontalen oder anderen Zahnfleischerkrankungen, einschließlich Gingivitis, verbunden ist, bereitzustellen. Zusätzliche Ziele schließen das Bereitstellen von Mitteln zum Desensibilisieren von Zähnen gegenüber der Wahrnehmung von Druck oder Temperatur, ebenso wie zum Versiegeln einer Zahnkavität ein, indem die Bildung von Dentin-Reparaturgewebe induziert wird. Diese und weitere Ziele, zusammen mit Vorteilen und Merkmalen der hierin offenbarten Erfindung, werden aus der Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen, die folgen, klar werden.
Die Erfindung ist durch die hierzu beigefügten Ansprüche definiert. Die Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzung zur Hemmung des Verlustes von Periodontal- und Zahngewebe (zusammen Dentalgewebe) bei einem Säugetier, insbesondere bei einem Menschen, bereit, die ein Regenerieren von geschädigtem Gewebe und/oder ein Hemmen einer zusätzlichen Beschädigung dessen, einschließen. Die Verfahren und Zusammensetzungen dieser Erfindung können zur Vorbeugung und/oder Hemmung des Zahnverlustes, der mit Gingivitis und anderen Periodontalerkrankungen verbunden ist, verwendet werden. Die vorliegenden Verfahren und Zusammensetzungen können weiterhin verwendet werden, um die Zähne gegenüber der Wahrnehmung von Druck und/oder Temperatur zu desensibilisieren und gegenüber Schmerz, der mit Dentalkaries und Gingivitis verbunden ist. Die Erfindung stellt weiterhin Verfahren und Zusammensetzungen zum Stimulieren der Morphogenese von Säugetier-Dentin, einschließlich des Stimulierens der Proliferation und Differentiation von Odontoblasten bereit. Die Erfindung stellt insbesondere Verfahren und Zusammensetzungen zum Stimulieren der Expression des Odontoblasten-Phänotyps, einschließlich der Erzeugung von Dentinmatrix durch Zahnpulpagewebe bei Säugetieren, einschließlich Primaten, bereit. Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um eine Kavität in einem Säugetierzahn zu versiegeln, indem die Bildung von Reparatur-Dentin induziert wird. Somit verringert die Erfindung den Bedarf nach einer Zahn-Extraktion oder Wurzelkanal-Therapie als Behandlungen für Dentalkaries oder eine andere Dentalschädigung, bei der das Pulpagewebe einem Risiko ausgesetzt ist.
Die Verfahren und Zusammensetzungen dieser Erfindung machen sich die Entdeckung zunutze, daß bestimmte Proteine von eukaryotischem Ursprung, die hierin als Morphogene definiert sind, die Morphogenese von funktioneilen Zellen, Geweben und Organen bei höheren Eukaryoten, insbesondere Säugetieren, einschließlich Menschen, induzieren. Das heißt, Morphogene induzieren oder reinduzieren die vollständig integrierte Entwicklungskaskade zellulärer und molekularer morphogenetischer Ereignisse, die in der Bildung von vollständig differenziertem funktionalem Gewebe eines Typs kulminieren, der im Zusammenhang oder der lokalen Umgebung, in der die Morphogenese induziert wird, einschließlich irgendeiner Gefäßbildung, Bindegewebsbildung, Nervenbildung und dergleichen, geeignet ist, was charakteristisch für das natürlich vorkommende Gewebe ist. Die Morphogenese unterscheidet sich deswegen signifikant von einfachen reparativen Heilungsverfahren, bei denen Narbengewebe (beispielsweise fibröses Bindegewebe) gebildet wird, und eine Läsion oder einen anderen Defekt in differenziertem, funktionalem Gewebe auffüllt. Weiterhin tritt eine Morphogenese in einer "permissiven Umgebung" ein, womit eine lokale Umgebung gemeint ist, die eine Morphogenese nicht erstickt oder unterdrückt (beispielsweise Regeneration oder regenerative Heilung). Permissive Umgebungen existieren beispielsweise in embryonalem Gewebe oder in verwundetem oder erkrankten Gewebe, einschließlich Gewebe, das einem chirurgischen Eingriff unterworfen wurde. Oftmals umfaßt eine permissive Umgebung eine geeignete Matrix oder Substrat, an der sich die Zellen, die eine Differentiation durchmachen, verankern können. Weitere Bestandteile einer permissiven Umgebung schliessen typischerweise Signale, beispielsweise Zelloberflächen-Marker oder extrazelluläre Matrix-Bestandteile ein, die die Gewebsspezifität der Differentiation leiten.
Morphogene sind im allgemeinen dimere Proteine, die eine Morphogenese einer oder mehrerer eukaryotischer (beispielsweise Säugetier-) Zellen, Geweben oder Organen induzieren. Von besonderem Interesse sind hierin Morphogene, die eine Morphogenese von zumindest Säugetier-Dentin, einschließlich der Bildung von Reparatur-Dentin, an oder passend für eine Dental- oder Periodontalläsionsstelle bei einem Säugetierzahn, induzieren. Morphogene umfassen zwei Polypeptide, die, wenn sie gefaltet sind, eine Konfiguration annehmen, die für das sich ergebende dimere Protein ausreichend sind, um bei Zellen und Geweben, die für das Morphogen spezifische Rezeptoren zeigen, morphogenetische Reaktionen hervorzurufen. Das heißt, Morphogene induzieren im allgemeinen alle der nachfolgenden biologischen Funktionen in einer morphogenetisch permissiven Umgebung: Stimulierung der Proliferation von Vorläuferzellen; Stimulierung der Differentierung von Vorläuferzellen; Stimulierung der Proliferation von differenzierten Zellen; und Unterstützen des Wachstums und der Aufrechterhaltung differenzierter Zellen. "Vorläufer"-Zellen sind nicht festgelegte Zeilen, die dafür kompetent sind, zu einem oder mehreren spezifischen Typen differenzierter Zellen zu differenzieren, abhängig von deren genomischem Repertoire und der Gewebsspezifität der permissiven Umgebung, in der die Morphogenese induziert wird. Morphogene können weiterhin das Einsetzen eines Alterungs- oder Ruhezustands-verbundenen Verlustes einer Phänotyp- und/oder Gewebsfunktion verzögern oder lindern. Morphogene können noch weiterhin die phänotypische Expression differenzierter Zellen, einschließlich der Expression metabolischer und/oder funktioneller, beispielsweise sekretorischer, Eigenschaften von diesen, simulieren. Zusätzlich können Morphogene die Redifferenzierung von determinierten Zellen unter geeigneten Umgebungsbedingungen induzieren. Wie vorstehend erwähnt, sind Morphogene, die eine Proliferation und Differenzierung zumindest von Säugetier- Odontoblasten induzieren, und/oder das Wachstum, die Aufrechterhai tung und funktioneilen Eigenschaften von Säugetier-Odontoblasten unterstützen, einschließlich der Bildung von Dentinmatrix, hierin von besonderem Interesse. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist ein "Odontoblast" irgendeine differenzierte Zelle, die in Säugetier-Zahnpulpagewebe auftritt oder entsteht, das heißt zur Erzeugung von Dentinmatrix kompetent ist.
Bei bevorzugten Ausführungsformen weisen die beiden Morphogen- Polypeptide Aminosäuresequenzen auf, die jeweils eine Sequenz umfassen, die jeweils ein definiertes Verhältnis mit einer Aminosäuresequenz eines Bezugs-Morphogens teilen. Hierin teilen bevorzugte Morphogen-Polypeptide ein definiertes Verhältnis mit einer Sequenz, die in morphogenetisch aktivem menschlichen OP-1, Sequenz ID Nr. 4, vorliegt. Jedoch könnte jede einzelne oder mehrere der natürlich vorkommenden oder biosynthetiachen Sequenzen, die hierin offenbart sind, in ähnlicher Weise als eine Bezugssequenz verwendet werden. Bevorzugte Morphogen- Polypeptide teilen ein definiertes Verhältnis mit zumindest der C-terminalen Sechs-Cystein-Domäne von menschlichem OP-1, Reste 43-139 von Sequenz ID Nr. 4. Vorzugsweise teilen die Morphogen-Polypeptide ein definiertes Verhältnis mit zumindest der C-terminalen Sieben-Cystein-Domäne von menschlichem OP-1, Reste 38-139 von Sequenz ID Nr. 4. Das heißt, bevorzugte Morphogen-Polypeptide in einem dimeren Protein mit einer morphogenetischen Aktivität, umfassen jeweils eine Sequenz, die einer Bezugssequenz entspricht oder funktioneil äquivalent zu dieser ist.
Funktioneil äquivalente Sequenzen schließen funktioneil äquivalente Anordnungen von Cystein-Resten ein, die innerhalb der Bezugssequenz angordnet sind, einschließlich Aminosäure-Insertionen oder -Deletionen, die die lineare Anordnung dieser Cysteine verändern, jedoch deren Beziehung in der gefalteten Struktur des dimeren morphogenen Proteins nicht materiell beeinträchtigen, einschließlich ihrer Fähigkeit, derartige Intra- oder Inter-Ketten-Disulfidbindungen zu bilden, wie es für die morphogenetische Aktivität notwendig sein kann. Funktioneil äquivalente Sequenzen schließen weiterhin diejenigen ein, bei denen ein oder mehrere Aminosäurereste sich von dem entsprechenden Rest einer Referenz- bzw. Bezugs-Morphogen-Sequenz unterscheiden, beispielsweise die C-terminale Sieben-Cystein- Domäne von menschlichem OP-1 (die hierin auch als das konvierte Sieben-Cystein-Skelett bezeichnet wird), vorausgesetzt, daß dieser Unterschied die morphogenetische Aktivität nicht zerstört. Demgemäß werden konservative Ersetzungen entsprechender Aminosäuren in der Bezugssequenz bevorzugt. Aminosäurereste, die "konservative Substitutionen" für entsprechende Reste in einer Bezugssequenz sind, sind diejenigen, die physikalisch oder funktioneil den entsprechenden Bezugsresten ähnlich sind, die beispielsweise eine ähnliche Größe, Form, elektrische Ladung, chemische Eigenschaften, einschließlich der Fähigkeit aufweisen, kovalente oder Wasserstoff-Bindungen oder dergleichen zu bilden. Besonders bevorzugte konservative Substitutionen sind diejenigen, die die Kriterien erfüllen, die für eine "akzeptierte Punktmutation" bei Dayhoff et al. (1978), 5 Atlas of Protein Sequence and Structure, Erg. Bd. 3, Kap. 22 (S. 354-352), Natl. Biomed. Res. Found, Washington, D. C. 20007 definiert sind.
Bei bestimmten Ausführungsformen wird ein Polypeptid, das unter dem Verdacht steht, zu einem Bezugs-Morphogen-Polypeptid funktionell äquivalent zu sein, mit diesem unter Verwendung des Verfahrens von Needleman et al. (1970), 48 J. Mol. Biol., 443-453, mit maximaler Übereinstimmung ausgerichtet, was in bequemer Weise durch Computer-Programme, wie beispielsweise das Align Programm (DNAstar, Inc.) erfüllt wird. Wie vorstehend erwähnt, werden interne Lücken und Aminosäureinsertionen in der Kandidaten-Sequenz für die Zwecke der Berechnung des definierten Verhältnisses ignoriert, das herkömmlicherweise als die Höhe der Aminosäuresequenz-Homologie oder -Identität zwischen den Kandidaten- und Referenz-Sequenzen ausgedrückt wird. "Aminosäuresequenz-Homologie" soll hierin eine Aminosäuresequenz- Ähnlichkeit bedeuten. Homologe Sequenzen teilen identische oder ähnliche Aminosäurereste, wobei ähnliche Reste konservative Substitutionen für oder "erlaubte Punktmutationen" entsprechender Aminosäurereste in einer mit größter Übereinstimmung ausgerichteten Bezugssequenz sind. Somit ist eine Kandidaten- bzw. Test-Polypeptidsequenz, die 70% Aminosäure-Homologie mit einer Bezugssequenz teilt, eine, bei der 70% der mit größter Übereinstimmung ausgerichteten Reste entweder zu den entsprechenden Resten in einer Bezugssequenz identisch oder konservative Substitutionen von dieser sind.
Von besonderem Interesse hierin sind Morphogene, die, wenn sie den Zahn und/oder Kieferknochenoberflächen in einem Säugetier- Zahnfach verabreicht werden, eine periodontale Gewebsbildung induzieren, wo Periodontalgewebe verloren wurde oder beschädigt wurde. Hierin sind von noch speziellerem Interesse Morphogene, die, wenn sie auf eine Zahnoberfläche, wie beispielsweise einer Dentinaloberflache, aufgebracht wurden, eine Morphogenese von neuem oder Reparatur-Dentin induzieren. Derartige Morphogene können verwendet werden, um eine Zahnkavität zu versiegeln oder einen Zahn gegenüber der Wahrnehmung von Druck und/oder Temperatur zu desensibilisieren.
Die vorliegende Erfindung kann alternativ mit Verfahren und Zusammensetzungen ausgeübt werden, die ein Morphogen-stimulierendes Mittel anstelle eines Morphogens umfassen. Ein "Morphogen"-stimulierendes Mittel ist eine Verbindung, die in vivo die Erzeugung, beispielsweise Expression, einer therapeutisch wirksamen Konzentration eines endogenen Morphogens im Körper des Säugetiers ausreichend induziert, um beschädigtes Dentalgewebe zu regenerieren und/oder einen zusätzlichen Schaden für dieses zu hemmen. Unter derartigen Verbindungen werden Substanzen verstanden, die, wenn sie einem Säugetier verabreicht werden, auf Zellen von Gewebe(n) oder Organe(n) wirken, die normalerweise zur Erzeugung und/oder Sezernierung eines Morphogens geeignet sind, das im Genom des Säugetiers kodiert ist, und die verursachen, daß der endogene Spiegel des Morphogens im Säugetierkörper verändert wird. Endogene oder verabreichte Morphogene können als endokrine, parakrine und autokrine Faktoren dienen. Das heißt, endogene Morphogene können durch die Zellen synthetisiert werden, in denen morphogenetische Antworten induziert werden, durch benachbarte Zellen oder durch Zellen eines entfernten Gewebes, wobei unter diesen Umständen das sezernierte endogene Morphogen zur Stelle der Morphogenese transportiert wird, beispielsweise durch den Blutstrom des Individuums. Bei bevorzugten Ausführungsformen stimuliert das Mittel die Expression und/oder Sekretion eines endogenen Morphogens, um dessen Mengen in Dental-Geweben, wie beispielsweise Kieferknochen, Periodontium, Zahnzement, Dentin oder Pulpagewebszellen, anzuheben.
In bestimmten bevorzugten Aspekten der vorliegenden Erfindung können die hierin beschriebenen Morphogene eine Regeneration von geschädigtem oder verlorenen Dentin-Gewebe in einem Säugetierzahn induzieren. Das Morphogen kann topisch oder auf andere Weise dem Zahngewebe verabreicht werden. Beispielsweise kann das Morphogen in einem biokompatiblen, porösen Trägermaterial dispergiert werden, das dann dem beschädigten Dentin-Gewebe topisch verabreicht wird. Ein brauchbarer Träger kann aus geeigneten organspezifischen Gewebe, beispielsweise Knochen oder Dentin, formuliert werden, indem das Gewebe demineralisiert und Guanidin-extrahiert wird, um eine wie in den US S. Nummern 07/971,091 (veröffentlicht als WO94/10203), 08/155,343 (veröffentlicht als WO94/06399) und 08/174,605 (veröffentlicht als WO94/06420) beschriebene azelluläre Matrix zu erzeugen. Synthetische Materialien können ebenfalls verwendet werden. Bei einigen Ausführungsformen stellt das existierende Zahn-Gewebe eine geeignete Matrix dar. Wenn eine formulierte Matrix oder ein Träger verwendet wird, sollte dies eine biokompatible, in geeigneter Weise modifizierte azelluläre Matrix mit derartigen Dimensionen sein, daß die Differenzierung und Proliferation von wandernden Vorläuferzellen ermöglicht wird, und zu einer morphogenetisch permissiven Umgebung beiträgt. Die Matrix ermöglicht vorzugsweise eine zelluläre Anlagerung und ist biodegradierbar und bioresorbierbar. Wo dem Gewebsort, zu dem das Morphogen und die Matrix aufgebracht werden, ausreichende endogene Signale zur Leitung der Gewebsspezifität der Morphogenese fehlen, umfaßt die Matrix vorzugsweise weiterhin gewebsspezifische Bestandteile oder ist vom Gewebe der erwünschten Art abgeleitet. Matrices können aus dehydriertem organ-spezifischen Gewebe erzeugt werden, durch beispielsweise Behandeln des Gewebes mit Lösungsmitteln, um die zellulären, nicht strukturellen Bestandteile hiervon im wesentlichen zu entfernen. Alternativ kann die Matrix aus einem biokompatiblen, in vivo biodegradierbaren Strukturmolekül hergestellt werden, das wahlweise mit geeigneten gewebsspezifischen Zellanlagerungsfaktoren formuliert ist. Somit können Kollagen, Laminin, Hyaluronsäure und/oder dergleichen verwendet werden, wie auch synthetische Polymere oder oder Copolymere von Polymilchsäure, Polybuttersäure, Polyglykolsäure und dergleichen verwendet werden können. Gegenwärtig bevorzugte Strukturmoleküle schließen gewebsspezifische Kollagene ein. Gegenwärtig bevorzugte Zellanlagerungsfaktoren schließen Glykosaminglykane und Proteoglykane ein. Vorzugsweise werden Kollagene, Glykosaminglykane und/oder Proteoglykane verwendet, die vom selben Typ sind, wie diejenigen, die natürlicherweise in Dentalgeweben gefunden werden. Nach Bedarf kann die Matrix mit einem Mittel behandelt werden, das zur Erhöhung dessen Porosität wirksam ist, um ein für den Zellzufluß und die Anlagerung geeignetes Gerüst zu erzeugen.
Alternativ kann das Morphogen in Verbindung mit einem Träger aufgebracht werden, der das Morphogen im wesentlichen an der Aufbringungsstelle hält und/oder die kontrollierte Freisetzung des Morphogens im wesentlichen an der Stelle, an der die Morphogenese induziert werden soll, erhöht. Derartige Träger sind ebenfalls in US S. Nummern 07/971,091 (veröffentlicht als WO94/10203), 08/155,343 (veröffentlicht als WO94/06399) und 08/174,605 (veröffentlicht als WO94/06420) offenbart. Brauchbare Träger schließen Zusammensetzungen mit einer hohen Viskosität ein, wie beispielsweise diejenige, die durch Glyzerol und dergleichen bereitgestellt wird, ebenso wie Trägermaterialien, die aus extrazellulären Matrices formuliert wurden und/ oder die Laminin, Kollagen und/oder biokompatible synthetische Polymere, wie beispielsweise Polybuttersäure, Polymilchsäure, Polyglykolsäuren und Copolymere hiervon enthalten.
Demgemäß können die vorliegenden Morphogene zur Stimulierung der Morphogenese von neuem oder Reparatur-Dentin in einem Säugetierzahn verwendet werden, einschließlich der Bildung von Dentinmatrix durch reife, differenzierte oder neu geformte Odontoblasten, das heißt durch kompetente Zellen des Zahnpulpagewebes. Das heißt, die vorliegenden Morphogene können die Proliferation, Differenzierung und/oder phenotypische Expression von Säugetierzellen stimulieren, die dazu geeignet sind, eine Dentinmatrix zu entwickeln, einschließlich Odontoblasten und/oder Pulpabindegewebszellen. Die morphogenetische Aktivität ist für die Bildung von Reparatur-Dentin in Säugetierzahnen verantwortlich. Somit können die vorliegenden Morphogene zur Erhöhung der Dicke der Säugetier-Zahnwand verwendet werden; das heißt, um die Dicke von mineralisiertem Gewebe (Dentin, Zahnschmelz und/oder Zahnzement) zu erhöhen, das lebensfähiges Zahnpulpagewebe von der buccalen Umgebung trennt. Als Folge können die vorliegenden Morphogene zur Reduzierung des Risikos eines Zahnwandbruches verwendet werden, insbesondere an Stellen, an denen die Zahnwand dünn oder wegen der Verbindung mit einer Zahnfleischläsionsstelle oder einer Kavität geschwächt ist.
Somit kann die vorliegende Erfindung verwendet werden, um eine Zahnkavität zu versiegeln, bis zu und einschließlich einer Stufe-V-Kavität, in einem Säugetierzahn, insbesondere einem Primatenzahn, wie beispielsweise einem menschlichen Zahn. Kariöses Gewebe wird vorzugsweise aus der Kavitätsstelle entfernt, um eine frische Oberfläche von Restdentin darin freizulegen, vorzugsweise diagonal zu den Luminae der Zahnkanälchen innerhalb des Zahnes. Die Restdentin-Oberfläche befindet sich vorzugsweise bis zu ungefähr 1 mm, bevorzugter bis ungefähr 0,5 mm, noch mehr bevorzugt bis ungefähr 0,2 mm von der Pulpakammerwand (d. h. von einer reifen Odontoblastenschicht an der Dentin/Pulpa- Grenzfläche) entfernt. Eine Aufbringung eines Morphogens auf diese Oberfläche vor oder gleichzeitig mit einer Zahnwiederherstellung bzw. -rekonstruktion, einschließlich des Auffüllens der Stelle der kariösen Läsion mit einem geeigneten Material, induziert die Bildung von Reparatur-Dentinmatrix innerhalb des rekonstruierten Zahnes. Auf diese Weise kann das Risiko eines Bruchs im Restdentin und die anschließende Behandlung durch Wurzelkanaltherapie oder Zahnextraktion vermieden werden.
In ähnlicher Weise kann die vorliegende Erfindung verwendet werden, um Säugetierzähne gegenüber der Wahrnehmung von Druck und/ oder Temperatur bei einem Individuum zu desensibilisieren, das von einer Periodontalerkrankung, wie beispielsweise Gingivitis, heimgesucht ist. Im Anschluß an die Zertrümmerung von Oberflächen innerhalb einer Zahnfleischläsion, einschließlich der Entfernung von bakterieller Plaque oder Zahnstein, wird ein Morphogen auf eine exponierte Dentinal-Oberfläche darin aufgebracht, vorzugsweise in einer Menge, die zur Stimulierung der Bildung von Reparatur-Dentin wirksam ist, das für diese Oberfläche geeignet ist. Reparatur-Dentin, das so gebildet wird, kann innerhalb oder außerhalb der Pulpakammer des behandelten Zahnes gebildet werden und dient als eine verstärkte Schutzbarriere zwischen dem Pulpagewebe und der lokalen Umgebung. Weiterhin unterstützt ein auf eine gesunde Zahnfleisch-Oberfläche, die an der Läsionsstelle angrenzt, aufgebrachtes Morphogen, die Zahnfleischregeneration und/oder verlangsamt das Zurückweichen des Zahnfleisches.
In den vorher erwähnten Ausführungsformen werden morphogene und Morphogen-stimulierende Mittel aufgebracht, beispielsweise topisch oder durch lokale Injektion, auf eine Zahnoberfläche, beispielsweise eine Dentinaloberflache. Vorzugsweise ist die Oberfläche diagonal zu den Luminae der Dentalkanälchen, innerhalb natürlich gebildeten Zahn-Dentins, derartig, daß ein flüssiger Mikrokontakt zwischen aufgebrachtem Morphogen und Odontoblasten oder Pulpagewebe, das innerhalb des Zahnes vorliegt, eingerichtet werden kann. Das Morphogen kann in einem physiologisch kompatiblen flüssigen Vehikel bzw. Träger solubilisiert oder in anderer Weise dispergiert (beispielsweise als eine Kolloidsuspension oder Emulsion) aufgebracht werden, die beispielsweise physiologische Salzlösung umfaßt, oder in einem Vehikel aufgebracht werden, das beispielsweise Ethanol umfaßt, der unter physiologischen Bedingungen verdampft, um einen morphogenen Rest zurückzulassen, der an der Zahnoberfläche adsorbiert ist. Alternativ kann das Morphogen auf einer Matrix, wie beispielsweise einer biokompatiblen, azellulären Matrix, sorbiert werden, die zum Versiegeln oder Auffüllen von Defekten in den Säugetierzahnen geeignet ist, wie beispielsweise vorstehend beschrieben. Morphogen versiegelte Defekte können, wenn es erwünscht ist, zur Wiederherstellung originaler Zahnabmessungen, unter Verwendung herkömmlicher Zahnrekonstruktions-Materialien, aufgefüllt oder rekonstruiert werden.
Bei allen derartigen Ausführungsformen sollte die Morphogenbehandelte Dentinaloberflache im wesentlichen frei von buccalen Mikroorganismen gehalten werden und aseptische Bedingungen sollten im behandelten Ort während der Zeitspanne, in der die morphogenetische Aktivität induziert wird, aufrechterhalten werden.
Morphogene und Morphogen-stimulierende Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung können an Periodontium- und/oder Zahngeweben, zusammen mit anderen Molekülen ("Kofaktoren"), verabreicht werden, von denen bekannt ist, daß sie eine vorteilhafte Wirkung bei der Behandlung beschädigten Zahngewebes aufweisen, insbesondere Kofaktoren, die zum Lindern oder Vermindern von Symptomen geeignet sind, die typischerweise mit einer Dentalgewebsschädigung und/oder -verlust verbunden sind. Beispiele derartiger Kofaktoren schließen Antiseptika, wie beispielsweise Chlorhexidin und Tibezoniumjodid, Antibiotika, einschließlich Tetracyclin, Aminoglykoside, Macrolide, Penizilline und Cephalosporine, Anaesthetika und Analgetica und andere nicht-steroidale entzündungshemmende Mittel ein.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Das vorstehende und weitere Ziele, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung, ebenso wie die Erfindung selbst, sind durch die nachfolgende Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen besser verständlich, wenn sie zusammen mit den begleitenden Zeichnungen gelesen werden, bei denen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung eines gesunden Säugetierzahnes in einem Zahnfach ist.
Fig. 2 Blätter 2-1 bis 2-12 die Anordnung von Sequenzen verschiedener natürlich vorkommender Morphogene, mit einer bevorzugten Bezugssequenz von menschlichem OP-1, Reste 38-139 von Sequenz ID Nr. 4, mit maximaler Übereinstimmung darstellen. Die in Fig. 4 dargestellten Morphogene sind ebenfalls in Tabelle I, vorstehend und in der Sequenzliste identifiziert.
Fig. 3 ist ein digitalisiertes Videobild eines typischen Gewebsschnittes durch einen Primaten-Zahn, der mit einem Morphogen behandelt ist, und Morphogen-induziertes Reparatur-Gewebe darin darstellt. Der Balken ist 0,5 mm, Original-Vergrößerung 2,5 x.
Fig. 4 eine Balkendiagramm-Darstellung von Ergebnissen ist, die feststellen, daß die Morphogenstimulierung einer neuen oder Reparatur-Dentinbildung dosisabhängig ist. Bei dieser Figur ist die aufgebrachte Menge an rekombinantem menschlichen OP-1 in ug auf der X-Achse dargestellt, und die Oberfläche in mm an induziertem Dentin ist auf der Y-Achse dargestellt.
Fig. 5 ist eine graphische Liniendarstellung von Ergebnissen, die feststellen, daß Morphogen eine neue oder Reparatur- Dentinbildung unter dünnen Brücken von natürlichem Restdentin stimuliert. Bei dieser Figur wurden äquivalente Mengen (beispielsweise 10 ug) von rekombinantem menschlichen OP-1 auf Restdentin-Brücken der entlang der X-Achse dargestellten Dicken aufgebracht.
Fig. 6 ist eine graphische Liniendarstellung von Ergebnissen, die die Wirkungen von rekombinantem menschlichen OP-1 mit einem herkömmlichen Mittel, Ca(OH)&sub2;, auf die Stimulierung von neuem oder Reparatur-Dentin unter dünnen Brücken von Rest- Dentin vergleichen. Hier wurden ebenfalls äquivalente Mengen (beispielsweise 10 ug) von rekombinantem menschlichen OP-1 oder Ca(OH)&sub2; wie angezeigt auf Restdentin-Brücken der auf der X-Achse dargestellten Dicken aufgebracht.

Ausführliche Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

Es wurde festgestellt, daß die hierin beschriebenen Morphogene die Gewebsbildung, einschließlich der Morphogenese oder Regeneration von verlorenem oder geschädigten Säugetier-Zahngewebe, einschließlich Dentin, stimulieren können. Die Erfindung kann verwendet werden, um Zähne zu desensibilisieren, den Zahnfleisch-Rückgang zu verlangsamen, Kavitäten zu versiegeln, die Dicke der Zahnwand zu erhöhen und das Risiko eines Zahnwandbruchs zu verringern. Die Erfindung wird ausgeübt, indem ein Morphogen oder Morphogen-stimulierendes Mittel, wie hierin definiert, gemäß der hierin beschriebenen Verfahren verwendet wird.
Nachstehend ist eine Beschreibung der Zahnanatomie und brauchbarer Morphogene vorgesehen, die Verfahren zu deren Herstellung und Formulierung ebenso wie beispielhafte, nicht einschränkende, Beispiele einschließen, die (1) die Geeignetheit der hierin beschriebenen Morphogene bei den Verfahren der Erfindung demonstrieren und (2) Tests bereitstellen, mit denen Kandidaten- Morphogene auf ihre Wirksamkeit getestet werden.

1. Zahn-Anatomie

Ein vertikaler Schnitt eines Säugetier-Zahns im Zahnfach ist schematisch in Fig. 1 dargestellt. Die Krone 6 des Zahnes ist aus Zahnschmelz 8 und Dentin 22 zusammengesetzt. Die Pulpakammer 12 ist im Inneren der Krone 6 und im Zentrum der Wurzel 10 zu sehen; sie erstreckt sich nach unten in die knochigen Flächen 14, 16, 18 und öffnet sich durch eine feine Öffnung, der Wurzelspitzenöffnung 20, am Ausläufer der Wurzel 10. Die Pulpakammer 12 enthält Dentalpulpa, ein loses Bindegewebe, das reichlich mit Blutgefäßen und Nerven versorgt ist, die in die Kammer durch die Wurzelspitzenöffnung 20 eintreten. Einige Zellen des Pulpagewebes, das heißt Odontoblasten, Vorläufer von Dentin 22, sind im allgemeinen als eine Schicht auf der Wand der Pulpakammer 12 angeordnet. Während der Zahnentwicklung sind die Odontoblasten säulenförmig, jedoch werden sie später flach, nachdem das Dentin 22 vollständig gebildet ist und ähneln Osteoblasten.
Der feste Teil oder die mineralisierte Wand des reifen Zahns schließt Dentin 22, Zahnschmelz 8 und eine dünne Schicht an Zahnzement 24 ein, die auf der Oberfläche der Wurzel 25 abgelagert ist. Der Zahnschmelz 8 wird während der Entwicklung des Zahnes aus Amyloblasten gebildet und der Zahnzement 24 wird aus Zementoblasten gebildet. In einem vollständig entwickelten Zahn umfaßt die Hauptmasse des Zahnes Dentin 22, das aus Hydroxyapatit-Kristallen eingebettet in einem starken Netzwerk von Kotlagenfasern hergestellt ist. Das Dentin schließt eine Anzahl von kleinen wellenförmigen und verzweigten Rohren, den sogenannten Dentalkanälchen, ein, die in eine dichte homogene Substanz, der Matrix, eingebettet sind. Die Dentalkanälchen sind zueinander parallel und öffnen sich an ihren inneren Enden in die Pulpakammer 12. Die Dentinmatrix ist lichtdurchlässig und umfaßt den Großteil der anorganischen Masse des Dentins. Sie schließt eine Anzahl von feinen Fäserchen ein, die mit den Fäserchen der Dentalpulpa kontinuierlich verlaufen. Nachdem das anorganische Material durch Eintauchen eines Zahns in eine schwache Säure entfernt wurde, kann das verbleibende organische Material in Schichten gezogen werden, die mit der Pulpakammer 12 überkreuz, mit der Richtung der Röhren parallel laufen.
Der Zahnzement 24 wird als eine dünne mineralisierte Schicht abgelagert, die die Zahnwurzel bedeckt. Er erstreckt sich von der Stelle, an der das Zahnschmelz endet, zur Spitze jeder Wurzel, wo er üblicherweise sehr dick ist. Zahnzement ähnelt in Struktur und chemischer Zusammensetzung Knochen, insofern es Hohlräume und Kanälchen spärlich enthält, die wahren Knochen charakterisieren. In den dickeren Anteilen des Zahnzementes, werden die Lamellen und Havers-Kanäle, die knocheneigen sind, ebenfalls gefunden. Als Folge des Alterns nimmt der Zahnzement in der Dicke zu und die Pulpakammer wird teilweise mit einer harten Substanz gefüllt, die in der Struktur ein Mittelding zwischen Dentin und Knochen ist (hierin als "Osteodentin" bezeichnet). Es scheint durch eine langsame Umwandlung der Dentalpulpa gebildet zu werden, die einschrumpft oder sogar verschwindet.
Die Wurzelhaut oder Periodontalmembran 26 ist die Schicht des periodontalen Gewebes, die ein Polster zwischen dem Zahnzement 24 und dem Knochen 14, 16, 18 bildet; sie hält den Zahn in der Position, indem sie ihn im Zahnfach (Alveolus) des Kiefernknochens aufhängt. Die Wurzelhaut ist ein hochorganisiertes Gewebe, das aus periodontalen Fibroblasten gebildet wird. Es. organisiert die Kollagenfasern, die direkt vom Knochen des Kiefers in den Zement führen.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "Zahn" eine natürliche oder synthetische Zusammensetzung, die im wesentlichen die Form eines natürlichen Säugetier-Zahns definiert, der einen festen Zahnkörper aufweist, einschließlich einer Krone und einer Zahnwurzel. "Periodontium" definiert die Gewebe, die den Zahn im Zahnfach umgeben, und sowohl Wurzelhaut als auch Zahnzement einschließt. "Zahnfleisch" definierte das dichte fibröse Gewebe, das durch die Mundschleimheit bedeckt ist, das die Alveolarknochen (Zahnfach)-Vorgänge der oberen und unteren Kiefer, ebenso wie die mineralisierte Zahnwand umhüllt, wie sie sich aus dem Periodontium erhebt. "Lebensfähiges" Gewebe bedeutet lebendes, im wesentlichen gesundes Gewebe, das im wesentlichen frei von Mikroorganismen und damit verbundener Infektion ist. Lebensfähiges Gewebe bedeutet insbesondere lebensfähiges Dentalgewebe, wie beispielsweise Zahnschmelz-, Dentin-, Zahnpulpa-, Gingiva, Zahnzement und Wurzelhaut. "Verbessern der Lebensfähigkeit" von dentalem Gewebe bedeutet das Verbessern der strukturellen und funktioneilen Unversehrtheit von lebendem Gewebe, was das Verbessern des klinischen Status von beschädigtem oder erkranktem Gewebe einschließt. "Lebensfähiger Zahn" betrifft einen implantierten natürlichen Zahn mit einer lebenden Zahnwurzel. "Verlust verhindern" von dentalem Gewebe, wie hierin verwendet, bedeutet das Verhindern einer Beschädigung für und/oder den Verlust von Dentalgewebe und schließt das Regenerieren von verlorenem, geschädigtem oder erkrankten Gewebe und/ oder das Hemmen einer zusätzlichen Beschädigung für dieses ein.
"Restdentin" bedeutet natürlich gebildetes, gesundes Dentingewebe, das beispielsweise an eine kariöse oder Zahnfleisch- Läsion angrenzt, insbesondere eine Läsion, von der infiziertes Dentin abgetragen wurde und/oder bakterielle Plaque oder Zahnstein zertrümmert wurde. Natürlich gebildetes Dentingewebe umfaßt Rohrchen, die Dentalkanälchen, die sich im wesentlichen radial durch das Dentin von der Schicht von Odontoblasten erstreckt, die die Pulpakammerwand auskleiden (beschrieben vorstehend in Verbindung mit Fig. 1). Somit ist eine Dentinal- Oberflache, die "zu den Lumen der Dentalkanälchen diagonal ist" eine Dentin-Oberfläche, die auf irgendeiner Ebene angeordnet ist, die die Lumina eines oder mehrerer Dentalkanälchen eher schneidet als zu diesen parallel angeordnet ist. Eine "Dentinal"-Oberfläche kann eine natürliche Grenze eines natürlich gebildeten Dentins definieren, oder eine frische Oberfläche von Dentin, die durch Bohren oder andere Dentaltechniken freigelegt wurde, oder durch Bruch oder Absplittern der Zahnwand. Eine Behandlung oder Stimulierung, die "geeignet" für eine Dentinal-Oberfläche ist, bedeutet eine Behandlung oder Stimulierung in Nebeneinanderstellung oder enger Nähe zur Dentinal- Oberfläche (beispielsweise getrennt von der Oberfläche durch bis zu ungefähr 1 mm Dicke an dazwischenliegendem Gewebe, wie beispielsweise Restdentin). "Reparatur-Dentin" umfaßt eine nicht rohrförmige Dentinmatrix, die durch reife oder proliferierende Odontoblasten oder andere kompetente Zellen des Pulpa- Bindegewebes entwickelt wurden, und kann innerhalb der Pulpakammer eines Säugetierzahns gebildet werden.
"Symptom-lindernder Kofaktor" bezeichnet ein oder mehrere herkömmliche pharmazeutische Substanzen, die, wenn es erwünscht ist, in Zusammensetzungen dieser Erfindung eingeschlossen sein können, und die ein oder mehrere der Symptome, die typischerweise mit dem Verlust oder der Beschädigung von Dentalgewebe verbunden sind, lindern oder mildern. Beispielhafte Kofaktoren schließen Antibiotika, Antiseptika, nicht-steroidale entzündungshemmende Mittel, Anaesthetika und Analgetika ein.

II. Brauchbare Morphogene

Bei dieser Erfindung brauchbare Morphogene schließen eukaryotische Proteine ein, die ursprünglich als osteogenetische Proteine definiert wurden (siehe US-Patent 5,011,691), wie beispielsweise die OP-1-, OP-2-, OP-3- und CBMP2-Proteine (Sequenz ID Nr. 4-9, 15-22, 25 und 26), ebenso wie Aminosäuresequenzverwandte Proteine, wie beispielsweise DPP (Sequenz ID Nr. 10 von Drosophila), Vgl (Sequenz ID Nr. 11 von Xenopus), Vgr-1 (Sequenz ID Nr. 12 von der Maus), GDF-1 (Sequenz ID Nr. 13, 30 und 31, von Menschen, siehe Lee (1991), 88 PNAS 4250-4254), 60A (Sequenz ID Nr. 23 und 24 von Drosophila, siehe Wharton et al. (1991), 88 PNAS 9214-9218), Dorsalin-1 (vom Hühnchen, siehe Basler et al. (1993), 73 Cell 687-702 und GenBank Zugangs-Nummer L 12032) und GDF-5 (von der Maus, siehe Storm et al. (1994), 368 Nature 639-643). Zusätzliche brauchbare Morphogene schließen biosynthetische Morphogen-Konstrukte ein, die im US-Patent Nr. 5,011,691, beispielsweise COP-1, 3-5, 7 und 16 offenbart sind. Siehe weiterhin US-Patent Nr. 4,968,590.
Natürlich auftretende Proteine, die hierin als Morphogene identifiziert und/oder beurteilt wurden, bilden eine getrennte Subgruppe, innerhalb der losen evolutionären Gruppierung der sequenzverwandten Proteine, die als die TGFβ-Superfamilie oder Supergen-Familie bekannt ist. Die natürlich vorkommenden Morphogene teilen wesentliche bzw. beträchtliche Aminosäuresequenz -Homologie in ihren C-tertninalen Bereichen (Domänen). Die vorstehend erwähnten natürlich vorkommenden Morphogene werden typischerweise als ein Vorläufer translatiert, der eine N-terminale Signalpeptidsequenz aufweist, die typischerweise weniger als ungefähr 30 Reste aufweist, gefolgt von einer "Pro"-Domäne, die zur Erzielung der reifen C-terminalen Domäne abgespalten wird. Das Signalpeptid wird schnell nach Translation gespalten, an einer Spaltstelle, die in einer vorgegebenen Sequenz unter Verwendung des Verfahrens von Von Heijne (1986) 14 Nucleic Acids Research 4683-4691 vorausgesagt werden kann. Die Pro-Domäne ist typischerweise dreimal länger als die voll hergestellte reife C-terminale Domäne. Die "Pro"-Form eines Morphogens bezeichnet hierin ein Morphogen, das ein gefaltetes Paar von Polypeptiden umfaßt, wobei jedes die Pro- und reifen Domänen eines Morphogen-Polypeptids umfaßt. Typischerweise ist die Pro-Form eines Morphogens unter physiologischen Bedingungen löslicher als die reife Form. Die Pro-Form scheint die primäre Form zu sein, die von gezüchteten Säugetierzellen sezerniert wird.
Tabelle I, nachstehend, faßt verschiedene natürlich vorkommende Morphogene zusammen, die bis jetzt identifiziert wurden, einschließlich ihrer wie hierin verwendeten Nomenklatur, ihrer Sequenz-ID-Referenzen, und Veröffentlichungsquellen für die Aminosäuresequenzen für die Proteine in voller Länge, die nicht in der Sequenz-Liste eingeschlossen sind. Jeder der in der Tabelle 1 dargestellten generischen Begriffe soll als die morphogenetisch aktiven Proteine, die aus Nukleinsäuren exprimiert werden, die die identifizierte, nachstehend erwähnte Sequenz kodieren, und in der Sequenzliste dargelegt sind, oder ein morphogenetisch aktives Bruchstück oder Vorläufer hiervon, einschließlich funktioneller Äquivalente hiervon, wie beispielsweise natürlich vorkommenden und biosynthetischen Varianten hiervon, umfassend aufgefaßt werden. Natürlich vorkommende Varianten hiervon schließen Allel-Varianten-Formen ein, die aus anderen Individuen einer einzigen biologischen Arten isoliert wurden und phylogenetischen Gegenstück (Spezies) Variant-Formen, die aus phylogenetisch getrennten biologischen Spezies isoliert wurden, ein.

TABELLE I

"OP-1" betrifft im allgemeinen morphogenetisch aktive Proteine, die aus Nukleinsäuren exprimiert werden, die das menschliche OP-1 Protein, offenbart in Sequenz ID Nr. 4 ("hOP-1") kodieren, und schließt zumindest Maus OP-1, Sequenz ID Nr. 5 ("mOP-1") ein. In jedem der menschlichen und Maus OP-1, Sequenz ID Nr. 4 und 5, ist das konservierte Sieben-Cystein-Skelett durch die Reste 38 bis 139 definiert. cDNA-Sequenzen und Aminosäuresequenzen, die hierin kodiert sind, und den Proteinen in voller Länge entsprechen, sind in Sequenz ID Nr. 15 und 16 (hOP1)) und Sequenz ID Nr. 17 und 18 (mOP1) bereitgestellt. Die reifen Proteine sind durch die Reste 293-431 (hOP1) und 292-430 (mOP1) definiert. Die "Pro"-Regionen der Proteine, zur Erzielung der reifen, morphogenetisch aktiven Proteine abgespalten, sind im wesentlichen durch die Reste 30-292 (hOP1) und durch die Reste 30-291 (mOP1) definiert.
"OP-2" betrifft im allgemeinen morphogenetisch aktive Proteine, die aus einer Nukleinsäure exprimiert werden, die das menschliche OP-2-Protein, offenbart in Sequenz ID Nr. 6 ("hOP-2") kodiert, und schließt zumindest Maus OP-2 ("mOP-2", Sequenz ID Nr. 7) ein. Bei jedem des menschlichen oder Maus-OP-2 ist das konservierte Sieben-Cystein-Skelett durch die Reste 38 bis 139 von Sequenz ID Nr. 6 und 7 definiert. cDNA-Sequenzen und Aminosäuresequenzen, die darin kodiert sind, und den Proteinen in voller Länge entsprechen, sind in den Sequenz ID Nr. 19 und 20 (hOP2) und Sequenz ID Nr. 21 und 22 (mOP2) kodiert. Die reifen Proteine sind im wesentlichen durch die Reste 264-402 (hOP2) und 261- 399 (mOP2) definiert. Die "Pro"-Regionen der Proteine, zur Erzielung der reifen morphogenetisch aktiven Proteine gespalten, sind im wesentlichen durch die Reste 18-263 (hOP2) und durch die Reste 18-260 (mOP1) definiert.
"OP-3" betrifft im allgemeinen morphogenetisch aktive Proteine, die aus einer Nukleinsäure exprimiert werden, die das in der Sequenz ID Nr. 26 ("mOP-3") offenbarte Maus OP-3 Protein kodiert. Die konservierte Sieben- Cystein-Domäne ist durch die Reste 298 bis 399 von Sequenz ID Nr. 26 definiert, die mehr als 79% Aminosäure-Identität mit den entsprechenden mOP-2 und hOP-2-Sequenzen teilt, und mehr als 66% Identität mit den entsprechenden OP-1-Sequenzen teilt. Eine cDNA-Sequenz, die die vorhererwähnte Aminosäuresequenz kodiert, ist in Sequenz ID Nr. 25 bereitgestellt. OP-3 ist unter den bis jetzt identifizierten Morphogenen einzigartig, insofern als der Rest an Position 9 in der konservierten Sieben-Cystein-Domäne (beispielsweise Rest 315 von Sequenz ID Nr. 26) ein Serin ist, wohingegen andere Morphogene typischerweise an diesem Ort ein Tryptophan aufweisen.
"CBMP2" betrifft im allgemeinen morphogenetisch aktive Proteine, die aus einer Nukleinsäure exprimiert wurden, die die CBMP2-Proteine kodiert, einschließlich zumindest menschlichem CBMP2A ("CBMP2A(fx)", Sequenz ID Nr. 8) und menschlichem CBMP2B ("CBMP2B(fx)", Sequenz ID Nr. 9). Die Aminosäuresequenz der Proteine in voller Länge, die in der Literatur als BMP2A und BMP2B oder BMP2 und BMP4 bezeichnet werden, erscheinen bei Wozney et al. (1988), 242 Science 1528-1534. Die Pro-Domäne für BMP2 (BMP2A) schließt wahrscheinlich Reste 25-248 ein; das reife Protein, die Reste 249-396. Die Pro-Domäne für BMP4 (BMP2B) schließt wahrscheinlich die Reste 25-256 ein; das reife Protein, die Reste 257-408.
"DPP(fx)" betrifft Proteine, die durch das Drosophila DPP-Gen kodiert sind, und die das konservierte Sieben-Cystein- Skelett (Sequenz ID Nr. 10) definieren. Die Aminosäuresequenz für das Protein in voller Länge erscheint bei Padgett, et al. (1987), 325 Nature 81-84. Die Pro-Domäne erstreckt sich wahrscheinlich von der Signal-Peptid-Spaltungsstelle bis Rest 456; das reife Protein wird wahrscheinlich durch die Reste 457-588 definiert.
"Vgl(fx)" betrifft Proteine, die durch das Xenopus Vgl-Gen kodiert werden, und die das konservierte Sieben-Cystein- Skelett (Sequenz ID Nr. 11) definieren. Die Aminosäuresequenz für das Protein in voller Länge erscheint bei Weeks (1987), 51 Cell 861-867. Die Pro-Domäne erstreckt sich wahrscheinlich von der Signal-Peptid- Spaltungsstelle bis zu Rest 246; das reife Protein wird wahrscheinlich durch die Reste 247-360 definiert.
"Vgr-1(fx)" betrifft Proteine, die durch das Maus Vgr-1-Gen kodiert sind, und die das konservierte Sieben-Cystein- Skelett (Sequenz ID Nr. 12) definieren. Die Aminosäuresequenz für das Protein in voller Länge erscheint bei Lyons, et al. (1989), 86 PNAS 4554-4558. Die Pro-Domäne erstreckt sich wahrscheinlich von der Signal-Peptid-Spaltungsstelle bis Rest 299; das reife Protein ist wahrscheinlich durch die Reste 300-438 definiert.
"GDF-1(fx)" betrifft Proteine, die durch das menschliche GDF-1-Gen kodiert sind, und die das konservierte Sieben-Cystein-Skelett (Sequenz ID Nr. 13) definieren. Die cDNA und kodierte Aminosäuresequenz für das Protein in voller Länge sind in Sequenz ID Nr. 30 und 31 bereitgestellt. Die Pro-Domäne erstreckt sich wahrscheinlich von der Signal- Peptid-Spaltungsstelle bis Rest 214; das reife Protein ist wahrscheinlich durch die Reste 215-372 definiert.
"60A" betrifft im allgemeinen morphogenetisch aktive Proteine, die aus Nukleinsäure (beispielsweise dem Drosophila 60A-Gen) exprimiert werden, die das 60A Protein oder morphogenetisch aktive Bruchstücke hiervon kodieren (siehe Sequenz ID Nr. 23 und 24, bei denen die cDNA und die kodierte Aminosäuresequenz für das Protein in voller Länge bereitgestellt werden). "60A(fx)M betrifft die Protein-Sequenzen, die das konservierte Sieben- Cystein-Skelett definieren (Reste 354 bis 455 von Sequenz ID Nr. 24). Die Pro-Domäne erstreckt sich wahrscheinlich von der Signal-Peptid-Spaltstelle bis zu Rest 324; das reife Protein wird wahrscheinlich durch die Reste 325-455 definiert. Das 60A- Protein wird hierin als eine phylogenetische Gegenstück-Variante der menschlichen und Maus OP-1-Gene betrachtet; Sampath et al. (1993), 90 PNAS 6004-6008.
"BMP3(fx)" betrifft Proteine, die durch das menschliche BMP3-Gen kodiert sind, und die das konservierte Sieben-Cystein- Skelett (Sequenz ID Nr. 26) definieren. Die Aminosäuresequenz für das Protein in voller Länge erscheint bei Wozney, et al. (1988), 242 Science 1528-1534. Die Pro-Domäne erstreckt sich wahrscheinlich von der Signal-Peptid-Spaltungsstelle bis Rest 290; das reife Protein ist wahrscheinlich durch die Reste 291-472 definiert.
MBMP5(fx)" betrifft Proteine, die durch das menschliche BMP5-Gen kodiert sind, und die das konservierte Sieben-Cystein- Skelett (Sequenz ID Nr. 27) definieren. Die Aminosäuresequenz für das Protein in voller Länge erscheint bei Celeste, et al. (1991), 87 PNAS 9843-9847. Die Pro-Domäne erstreckt sich wahrscheinlich von der Signal-Peptid-Spaltungsstelle bis Rest 316; das reife Protein ist wahrscheinlich durch die Reste 317-454 definiert.
"BMP6(fx)" betrifft Proteine, die durch das menschliche BMP6-Gen kodiert sind, und die das konservierte Sieben-Cystein- Skelett (Sequenz ID Nr. 28) definieren. Die Aminosäuresequenz für das Protein in voller Länge erscheint bei Celeste, et al. (1990), 87 PNAS 9843-9847. Die Pro-Domäne erstreckt sich wahrscheinlich von der Signal-Peptid-Spaltungsstelle bis Rest 374; die reife Sequenz schließt wahrscheinlich die Reste 375-513 ein.
Wie in Fig. 2 dargestellt, weisen die OP-2- und OP-3-Proteine einen zusätzlichen Cystein-Rest im konservierten C-terminalen Bereich auf (beispielsweise siehe Rest 41 von Sequenz ID Nr. 6 und 7), zusätzlich zum konservierten Cystein-Skelett oder -Domäne, die sie mit anderen bekannten Proteinen in dieser Familie gemeinsam haben. Das GDF-1-Protein weist eine Vier- Aminosäure-Einfügung innerhalb des konservierten Skeletts auf (Reste 44-47 von Sequenz ID Nr. 13), jedoch stört diese Einfügung wahrscheinlich das Verhältnis der Cysteine in der gefalteten Struktur nicht. Weiterhin fehlt den CBMP2-Proteinen ein Aminosäurerest innerhalb des Cystein-Skeletts. Somit veranschaulichen diese Morphogen-Polypeptide Prinzipien des Alignments bzw. der Anordnung mit maximaler Übereinstimmung, die hierin bezüglich der bevorzugten Morphogen-Bezugssequenz von menschlichem OP-1, Reste 38-139 von Sequenz ID Nr. 4 verwendet werden.
Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen schließen die hierin brauchbaren Morphogene diejenigen ein, bei denen die Aminosäuresequenzen von Morphogen-Polypeptiden eine Sequenz umfassen, die zumindest 70% Aminosäuresequenz-Homologie oder "Ähnlichkeit", und vorzugsweise 80% Homologie oder Ähnlichkeit mit einem Bezugs-Morphogen teilen, das aus den vorhergehenden natürlich vorkommenden Morphogenen ausgewählt ist. Das Bezugs-Morphogen ist vorzugsweise menschliches OP-1 und die Bezugssequenz von diesem ist die C-terminale Sieben-Cystein- Domäne, die in morphogenetisch aktiven Formen von menschlichem OP-1, Resten 38-139 von Sequenz ID Nr. 4, vorliegt. Hierin brauchbare Morphogene schließen demgemäß Allel-, phylogenetische Gegenstücke und andere Varianten der bevorzugten Bezugssequenz ein, gleichgültig, ob sie natürlich vorkommende oder biosynthetisch erzeugte (beispielsweise einschließlich "Muteinen" oder "mutierten Proteinen") oder neue Mitglieder der morphogenetischen Familie von Proteinen sind, die die Morphogene einschließen, die vorstehend, beispielsweise in Tabelle I, dargestellt und identifiziert wurden. Bestimmte besonders bevorzugte Morphogen-Polypeptide teilen zumindest 60% Aminosäure-Identität mit der bevorzugten Bezugssequenz von menschlichem OP-1, noch mehr bevorzugt zumindest 65% Aminosäure-Identität damit.
Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist die in der vorliegenden Erfindung brauchbare Familie von Morphogen-Polypeptiden und deren Mitgliedern durch eine generische Aminosäuresequenz definiert. Beispielsweise bringen die Generische Sequenz 7 (Sequenz ID Nr. 1) und die Generische Sequenz 8 (Sequenz ID Nr. 2), die nachstehend offenbart sind, die Homologien, die innerhalb der bevorzugten Morphogen-Protein-Familien-Mitglieder geteilt werden, die bis jetzt identifiziert wurden, den Einklang, die zumindest OP-1, OP-2, OP-3, CBMP2A, CBMP2B, BMP3, 60A, DPP, Vgl, BMP5, BMP6, Vgr-1 und GDF-1 (Sequenz Nr. 4-15, 24 und 26-29) einschließen. Die Aminosäure- Sequenzen für diese Proteine sind hierin beschrieben (siehe Sequenz-Liste) und/oder wie vorstehend zusammengefaßt, in der Technik. Die generischen Sequenzen schließen sowohl die Aminosäure-Identität ein, die von diesen Sequenzen in der C-terminalen Domäne geteilt werden, definiert durch die Sechs- und Sieben-Cystein-Skelette (Generische Sequenzen 7 bzw. 8), ebenso wie alternative Reste für die variablen Stellungen innerhalb der Sequenz. Die generischen Sequenzen stellen ein geeignetes Cystein-Skelett bereit, bei dem sich inter- oder intramolekulare Disulfidbrücken bilden können und enthält bestimmte entscheidende Aminosäuren, die wahrscheinlich die Tertiärstruktur der gefalteten Proteine beeinflussen. Zusätzlich ermöglichen die generischen Sequenzen ein zusätzliches Cystein in Position 41 (Generische Sequenz 7) oder in Position 46 (Generische Sequenz 8), wodurch die morphogenetisch aktiven Sequenzen von OP-2 und OP-3 eingeschlossen werden. Generische Sequenz 7
wobei jedes Xaa unabhängig aus einer Gruppe einer oder mehrerer bestimmter Aminosäuren ausgewählt ist, die wie folgt definiert sind: "res." bedeutet "Rest" und Xaa bei res.2 = (Tyr oder Lys); Xaa bei res.3 = (Val oder Ile); Xaa bei res.4 = (Ser, Asp oder Glu); Xaa bei res.6 = (Arg, Gin, Ser, Lys oder Ala); Xaa bei res.7 = (Asp oder Glu); Xaa bei res.8 = (Leu, Val oder Ile); Xaa bei res.11 = (Gin, Leu, Asp, His, Asn oder Ser); Xaa bei res.12 = (Asp, Arg, Asn oder Glu); Xaa bei res.13 = (Trp oder Ser); Xaa bei res.14 = (11e oder Val); Xaa bei res.15 = (11e oder Val); Xaa bei res.16 = (Ala oder Ser); Xaa bei res.18 = (Glu, Gin, Leu, Lys, Pro oder Arg); Xaa bei res.19 = (Gly oder Ser); Xaa bei res.20 = (Tyr oder Phe); Xaa bei res.21 = (Ala, Ser, Asp, Met, His, Gin, Leu oder Gly); Xaa bei res.23 = (Tyr, Asn oder Phe); Xaa bei res.26 = (Glu, His, Tyr, Asp, Gin, Ala oder Ser); Xaa bei res.28 = (Glu, Lys, Asp, Gin oder Ala); Xaa bei res.30 = (Ala, Ser, Pro, Gin, Ile oder Asn); Xaa bei res.31 = (Phe, Leu oder Tyr); Xaa bei res.33 = (Leu, Val oder Met); Xaa bei res.34 = (Asn, Asp, Ala, Thr oder Pro); Xaa bei res.35 = (Ser, Asp, Glu, Leu, Ala oder Lys); Xaa bei res.36 = (Tyr, Cys, His, Ser oder Ile); Xaa bei res.37 = (Met, Phe, Gly oder Leu); Xaa bei res.38 = (Asn, Ser oder Lys); Xaa bei res.39 = (Ala, Ser, Gly oder Pro); Xaa bei res.40 = (Thr, Leu oder Ser); Xaa bei res.44 = (11e, Val oder Thr) Xaa bei res.45 = (Val, Leu, Met oder Ile); Xaa bei res.46 = (Gin oder Arg); Xaa bei res.47 = (Thr, Ala oder Ser); Xaa bei res.48 = (Leu oder Ile); Xaa bei res.49 = (Val oder Met); Xaa bei res.50 = (His, Asn oder Arg); Xaa bei res.51 = (Phe, Leu, Asn, Ser, Ala oder Val); Xaa bei res.52 = (11e, Met, Asn, Ala, Val, Gly oder Leu); Xaa bei res.53 = (Asn, Lys, Ala, Glu, Gly oder Phe); Xaa bei res.54 = (Pro, Ser oder Val); Xaa bei res.55 = (Glu, Asp, Asn, Gly, Val, Pro oder Lys); Xaa bei res.56 = (Thr, Ala, Val, Lys, Asp, Tyr, Ser, Gly, Ile oder His); Xaa bei res.57 = (Val, Ala oder Ile); Xaa bei res.58 = (Pro oder Asp); Xaa bei res.59 = (Lys, Leu oder Glu); Xaa bei res.60 = (Pro, Val oder Ala) Xaa bei res.63 = (Ala oder Val); Xaa bei res.65 = (Thr, Ala oder Glu); Xaa bei res.66 = (Gin, Lys, Arg oder Glu); Xaa bei res.67 = (Leu, Met oder Val); Xaa bei res.68 = (Asn, Ser, Asp oder Gly); Xaa bei res.69 = (Ala, Pro oder Ser); Xaa bei res.70 = (11e, Thr, Val oder Leu); Xaa bei res.71 = (Ser, Ala oder Pro); Xaa bei res.72 = (Val, Leu, Met oder Ile); Xaa bei res.74 = (Tyr oder Phe); Xaa bei res.75 = (Phe, Tyr, Leu oder His); Xaa bei res.76 = (Asp, Asn oder Leu); Xaa bei res.77 = (Asp, Glu, Asn, Arg oder Ser); Xaa bei res.78 = (Ser, Gin, Asn, Tyr oder Asp); Xaa bei res.79 = (Ser, Asn, Asp, Glu oder Lys); Xaa bei res.80 = (Asn, Thr oder Lys); Xaa bei res.82 = (11e, Val oder Asn) Xaa bei res.84 = (Lys oder Arg); Xaa bei res.85 = (Lys, Asn, Gin, His, Arg oder Val); Xaa bei res.86 = (Tyr, Glu oder His); Xaa bei res.87 = (Arg, Gin, Glu oder Pro); Xaa bei res.88 = (Asn, Glu, Trp oder Asp); Xaa bei res.90 = (Val, Thr, Ala oder Ile); Xaa bei res.92 = (Arg, Lys, Val, Asp, Gin oder Glu); Xaa bei res.93 = (Ala, Gly, Glu oder Ser); Xaa bei res.95 = (Gly oder Ala) und Xaa bei res.97 = (His oder Arg).
Die Generische Sequenz 8 (Sequenz ID Nr. 2) schließt die gesamte Generische Sequenz 7 ein und schließt zusätzlich die folgende Sequenz (Sequenz ID Nr. 14) an ihrem N-Terminus ein:
Demgemäß ist, beginnend mit Rest 7, jedes "Xaa" in der Generischen Sequenz 8 eine bestimmte Aminosäure, wie sie für die Generische Sequenz 7 definiert ist, mit dem Unterschied, daß jede Restzahl, die für die Generische Sequenz 7 beschrieben ist, in der Generischen Sequenz 8 um fünf verschoben ist. Somit bezieht sich "Xaa bei res.2 = (Tyr oder Lys)" in der Generischen Sequenz 7 auf Xaa bei res.7 in der Generischen Sequenz 8. In der Generischen Sequenz 8, Xaa bei res.2 = (Lys, Arg, Ala oder Gin); Xaa bei res.3 = Lys, Arg oder Met); Xaa bei res.4 = (His, Arg oder Gin); und Xaa bei res.5 = (Glu, Ser, His, Gly, Arg, Pro, Thr oder Tyr).
Wie vorstehend erwähnt, weisen bestimmte gegenwärtig bevorzugte Morphogen-Polypeptid-Sequenzen, die bei dieser Erfindung brauchbar sind, mehr als 60% Identität, vorzugsweise mehr als 65% Identität, mit der Aminosäure-Sequenz auf, die die bevorzugte Bezugs-Sequenz von hOP-1 definiert. Diese besonders bevorzugten Sequenzen schließen Allel- und phylogenetische Gegenstück-Varianten der OP-1- und OP-2-Proteine ein, einschließlich des Drosophila-60A-Proteins. Demgemäß schließen bei bestimmten, besonders bevorzugten Ausführungsformen brauchbare Morphogene aktive Proteine ein, die zwei Polypeptid-Ketten innerhalb der generischen Aminosäure-Sequenz umfassen, die hierin als "OPX" (Sequenz ID Nr. 3) bezeichnet wird, die das Sieben-Cystein- Skelett definiert und die Homologien zwischen mehreren identifizierten Varianten von OP-1 und OP-2 in Einklang bringt. Wie dort beschrieben, ist jedes Xaa an einer gegebenen Position unabhängig aus den Resten ausgewählt, die an der entsprechenden Position in der C-terminalen Sequenz von Maus oder menschlichem OP-1 oder OP-2 auftreten (siehe Sequenz ID Nr. 4-7 und/ oder Sequenz ID Nr. 15-22).
Bei noch weiteren bevorzugten Ausführungsformen weisen brauchbare Morphogen-Polypeptide Aminosäuresequenzen auf, die eine Sequenz umfassen, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen an DNA oder RNA hybridisiert, die die Referenz-Morphogen-Sequenzen, beispielsweise C-terminale Sequenzen kodieren, die die konservierten Sieben-Cystein-Domänen von OP1 und OP2, beispielsweise die Nukleotide 1036-1341 und die Nukleotide 1390-1695 von Sequenz ID Nr. 15 bzw. 19 definieren. Wie hierin verwendet, sind stringente Hybridisierungs-Bedingungen als Hybridisierung gemäß bekannter Techniken in 40% Formamid, 5 X SSPE, 5 X Denhardt's Lösung, und 0,1% SDS bei 37ºC über Nacht und Waschen bei 0,1 X SSPE, 0,1% SDS bei 50ºC definiert.
Wie vorstehend erwähnt, sind bei der vorliegenden Erfindung brauchbare Morphogene im allgemeinen dimere Proteine, die ein gefaltetes Paar der vorstehenden Polypeptide umfassen. Morphogene sind inaktiv, wenn sie reduziert sind, sie sind jedoch als oxidierte Homodimere, und wenn sie in Kombinationen mit anderen Morphogenen dieser Erfindung zur Erzeugung von Heterodimeren oxidiert sind, aktiv. Somit können Teile eines gefalteten Paars von Morphogen-Polypeptiden in einem morphogenetisch aktiven Protein unabhängig von irgendeinem der vorstehend erwähnten spezifischen Morphogen-Polypeptiden ausgewählt werden.
Die bei den Verfahren, Zusammensetzungen und Vorrichtungen dieser Erfindung brauchbaren Morphogene schließen Proteine ein, die irgendeine der vorstehend beschriebenen Polypeptidketten umfassen, egal ob sie aus natürlich vorkommenden Quellen isoliert wurden oder durch DNA-Rekombinations- oder andere synthetische Techniken hergestellt wurden, und schließen Allel- und phylogenetische Gegenstück-Varianten von diesen Proteinen, ebenso wie biosynthetische Varianten (Muteine) hiervon, und verschiedene trunkierte und Fusionskonstrukte ein. Deletion- oder Additions-Mutanten werden ebenso als aktiv angesehen, einschließlich derjenigen, die die konservierte C-terminale Sechs-oder-Sieben-Cystein-Domäne verändern, vorausgesetzt, daß die Veränderung das Verhältnis dieser Cysteine in der gefalteten Struktur nicht funktionell stört. Demgemäß werden derartige aktive Formen als das Äquivalent der speziell hierin offenbarten beschriebenen Konstrukte angesehen. Die Proteine können Formen mit variierenden Glykosylierungs-Mustern, variierenden N-Termini, eine Familie verwandter Proteine mit Regionen einer Aminosequenz-Homologie und aktive trunkierte oder mutierte Formen nativer oder biosynthetischer Proteine aufweisen, die durch Expression rekombinanter DNA in Wirtszellen erzeugt wurden.
Die morphogenetischen Proteine können aus intakter oder trunkierter cDNA oder aus synthetischen DNAs in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen exprimiert und gereinigt, gespalten, erneut gefaltet und zur Bildung morphogenetisch aktiver Zusammensetzungen dimerisiert werden. Gegenwärtig bevorzugte Wirtszellen schließen E. coli oder Säugetierzellen, wie beispielsweise CHO, COS oder BSC-Zellen ein. Eine ausführliche Beschreibung der bei den Verfahren, Zusammensetzungen und Vorrichtungen dieser Erfindung brauchbaren Morphogene ist in der gleichzeitig anhängigen US Serie-Nr. 07/752,764 (veröffentlicht als WO92/15323), eingereicht am 30. August 1991, und 07/667,724 (zugunsten von 07/752,764 aufgegeben), eingereicht am 11. März 1991, offenbart.
Somit können im Hinblick auf diese Offenbarung erfahrene Gen- Techniker Gene aus cDNA- oder Genom-Bibliotheken verschiedener unterschiedlicher biologischer Spezies isolieren, die geeignete Aminosäuresequenzen oder Konstrukt-DNAs aus Oligonukleotiden kodieren und können darauf diese in verschiedenen Arten von Wirtszellen, einschließlich sowohl prokaryotischen als auch eukaryotischen Wirtszellen, zur Erzeugung großer Mengen aktiver Proteine exprimieren, die zur Stimulierung der Morphogenese von und/oder Hemmung eines Schadens für Säugetier-Dentalgewebe in der Lage sind.
Wie vorstehend erwähnt, ist ein Protein im allgemeinen hierin morphogenetisch, wenn es die Entwicklungskaskade zellulärer und molekularer Ereignisse induziert, die in der Bildung neuen, organspezifischen Gewebes kulminieren. Vorzugsweise umfaßt ein Morphogen zwei Polypeptide, die eine Sequenz aufweisen, die dem konservierten C-terminalen Sechs-oder Sieben-Cystein-Skelett von menschlichem OP-1, eingeschlossen in Sequenz ID Nr. 4, entsprechen oder dieser funktionell äquivalent sind. Die Morphogene sind im allgemeinen dazu fähig, alle der nachfolgenden biologischen Funktionen in einer morphogenetisch permissiven Umgebung zu induzieren: Stimulierung der Proliferation von Vorläufer-Zellen; Stimulierung der Differenzierung von Vorläufer- Zellen; Stimulierung der Proliferation von differenzierten Zellen; und Unterstützung des Wachstums und der Aufrechterhaltung differenzierter Zellen. Einzelheiten, wie die bei dieser Erfindung brauchbaren Morphogene zuerst identifiziert wurden, ebenso wie eine Beschreibung wie sie herzustellen, zu verwenden und wie sie auf eine morphogenetische Aktivität zu testen sind, sind in den US-Patentschriften Nr. 07/752,764 (veröffentlicht als WO92/15323) und 07/667,274 (zugunsten von 07/752,764 nicht weiterverfolgt) offenbart. Wie hierin offenbart können die Morphogene aus natürlich gewonnenem Material gereinigt werden oder rekombinant aus prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszeilen unter Verwendung der hierin offenbarten Gensequenzen erzeugt werden. Alternativ können neuartige morphogenetische Sequenzen durch Befolgen der hierin offenbarten Verfahren identifiziert werden.
Beispielhafte brauchbare Morphogene schließen natürlich abgeleitete Proteine mit einem Paar Polypeptiden ein, deren Aminosäuresequenzen ein oder mehrere der in der Sequenzliste und in Fig. 2 offenbarten Sequenzen umfaßt. Weitere brauchbare Sequenzen schließen diejenigen von natürlich abgeleiteten Morphogenen Dorsalin-1 und GDF-5 ein, die hierin in Verbindung mit Tabelle I erörtert werden, ebenso wie biosynthetische Konstrukte, die im US-Patent Nr. 5,011,691 offenbart sind (beispielsweise COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7 und COP-16).
Demgemäß können bestimmte bevorzugte Morphogene, die bei den Verfahren und Zusammensetzungen dieser Erfindung brauchbar sind, als morphogenetisch aktive Proteine mit Aminosäuresequenzen beschrieben werden, die 70% oder vorzugsweise 80% Homologie (Ähnlichkeit) mit einer Referenz-Morphogen-Sequenz teilen, die vorstehend beschrieben wurde, beispielsweise mit den Resten 38-139 von Sequenz ID Nr. 4, wobei "Homologie" wie hierin vorstehend definiert ist. Alternativ fallen bei anderen bevorzugten Ausführungsformen Morphogene, die bei den Verfahren und Zusammensetzungen, die hierin offenbart wurden, brauchbar sind, in die Familie von Polypeptiden, die durch die Generische Sequenz 7, Sequenz ID Nr. 1, bevorzugter durch die Generische Sequenz 8, Sequenz ID Nr. 2, beschrieben sind.
Figure 2 beschreibt hierin eine Anordnung der Aminosäuresequenzen der aktiven Regionen natürlich vorkommender Proteine mit maximaler Übereinstimmung, die als Morphogene hierin identifiziert oder eingeschätzt wurden, einschließlich menschlichem OP-1 (hOP-1, Sequenz ID Nr. 4 und 15-16), Maus OP-1 (mOP-1, Sequenz ID Nr. 5 und 17-18), menschlichem und Maus OP-2 (Sequenz ID Nr. 6, 7 und 19-22), Maus OP-3 (Sequenz ID Nr. 25-26), CBMP2A (Sequenz ID Nr. 8), CBMP2B (Sequenz ID Nr. 9), BMP3 (Sequenz ID Nr. 27), DPP (von Drosophila, Sequenz ID Nr. 10), Vgl (von Xenopus, Sequenz ID Nr. 11), Vgr-1 (von der Maus, Sequenz ID Nr. 12), GDF-1 (von der Maus und/oder vom Menschen, Sequenz ID Nr. 13, 30 und 31), 60A Protein (von Drosophila, Sequenz ID Nr. 23 und 24), BMP5 (Sequenz ID Nr. 28) und BMP6 (Sequenz ID Nr. 29). Die Sequenzen werden folgend dem Verfahren von Needleman et al (1970), 48 J. Mol. Biol., 443-453, mit maximaler Übereinstimmung angeordnet, berechnet unter Verwendung des Align Program (DNAstar, Inc.). In Fig. 2 zeigen drei Punkte an, daß die Aminosäure in dieser Position dieselbe wie die entsprechende Aminosäure in hOP-1 ist. Drei Striche zeigen an, daß keine Aminosäure in dieser Position vorliegt und sind zum Zweck der Veranschaulichung von Homologien eingeschlossen. Beispielsweise "fehlt" Aminosäurerest 60 von CBMP-2A und CBMP-2B. Natürlich umfassen beide dieser Aminosäuresequenzen in diesem Bereich Asn-Ser (Reste 58, 59), wobei CBMP-2A dann Lys und Ile umfaßt, wohingegen CBMP-2B Ser und Ile umfaßt. Fig. 2 veranschaulicht weiterhin die Handhabung von Insertionen in der Morphogen-Aminosäuresequenz: zwischen den Resten 56 und 57 von BMP3 ist ein Val-Rest eingefügt; zwischen den Resten 43 und 44 von GDF-1 ist die Aminosäuresequenz, Gly-Gly-Pro-Pro eingefügt. Derartige Abweichungen von der Referenz-Morphogen-Sequenz werden wegen der Berechnung der definierten Beziehung zwischen, beispielsweise, GDF-1 und hOP-1, ignoriert. Wie aus den Aminosäuresequenz-Vergleichen klar wird, die in Fig. 4 dargelegt sind, können signifikante Aminosäure-Austauschungen aus der Referenz-Sequenz vorgenommen werden, während die morphogenetische Aktivität erhalten bleibt. Während beispielsweise die GDF-1-Proteinsequenz, die in Fig. 4 dargestellt ist, nur ungefähr 50% Aminosäure-Identität mit der dort beschriebenen hOP1-Sequenz teilt, teilt die GDF-1- Sequenz mehr als 70% Aminosäuresequenz-Homologie (oder "Ähnlichkeit") mit der hOP1-Sequenz, wobei "Homologie" oder "Ähnlichkeit" erlaubte, konservative Aminosäure-Substitutionen innerhalb der mit maximaler Übereinstimmung ausgerichteten Sequenz einschließen, beispielsweise wie durch Dayhoff et al., (1979) 5 Atlas of Protein Sequence and Structure, Erg. 3, S. 345-362, (M. O. Dayhoff, Herausgeber, Nat'l BioMed. Res. Fd'n, Washington D. C.) definiert wurde.
Die gegenwärtig am meisten bevorzugten Proteinsequenzen, die bei dieser Erfindung als Morphogene brauchbar sind, schließen diejenigen ein, die mehr als 60% Identität, vorzugsweise mehr als 65% Identität, mit der Aminosäuresequenz aufweisen, die das konservierte Sechs-oder-Sieben-Cystein-Skelett von hOP1 (beispielsweise die Reste 43-139 oder 38-139 von Sequenz ID Nr. 5) definiert. Diese am meisten bevorzugten Proteine schließen sowohl Allel- und phylogenetische Gegenstück-Varianten der OP-1- und OP-2-Proteine, einschließlich des Drosophila 60A-Proteins, ein. Demgemäß schließt, bei einem noch weiteren bevorzugten Grundgedanken, die Erfindung Morphogene ein, die Spezies von Polypeptid-Ketten, mit der hierin als "OPX" bezeichneten generischen Aminosäuresequenz ein, die die Sieben- Cystein-Domäne definiert, und die Identitäten und Homologien zwischen den verschiedenen identifizierten OP1- und OP2-Proteinen in Einklang bringt. OPX liegt in Sequenz ID Nr. 3 vor. Wie dort beschrieben, ist jedes Xaa an einer gegebenen Position unabhängig aus den Resten ausgewählt, die an der entsprechenden Position in der C-terminalen Sequenz von Maus oder Menschen OP1 oder OP2 auftreten (siehe Fig. 2 und Sequenz ID Nr. 4-7 und/oder Sequenz ID Nr. 15-22).
Alternativ kann eine wirksame Menge eines Mittels, das zur Stimulierung der endogenen Morphogenspiegel bei einem Säugetier geeignet ist, auf irgendeinem der hierin beschriebenen Wege verabreicht werden. Beispielsweise kann ein Mittel, das zur Stimulierung der Morphogen-Produktion und/oder -Sekretion aus Periodontal-Gewebe, Zahnfleisch, Kieferknochen-Gewebe im Zahnfach oder Pulpagewebe, einem Säugetier, beispielsweise durch direkte Verabreichung des Morphogen-stimulierenden Mittels an ein Zahngewebe, verabreicht werden. Alternativ kann das Morphogen-stimulierende Mittel eine Morphogen-Ex- pression und/oder -Sekretion an einer beabstandeten Stelle (beispielsweise an einem Gewebs-Locus, der von Dentalgewebe verschieden ist), induzieren, wobei das exprimierte Morphogen im Kreislauf zu Dentalgewebe transportiert wird, das zur Aufnahme des Morphogens zu einer Reaktion hierauf in der Lage ist. Ein Verfahren zum Identifizieren und Testen von Mitteln, die zur Modulierung der Spiegel von endogenem Morphogen in einem vorgegebenen Gewebe in der Lage sind, ist ausführlich in der früher Bezug genommenen US S. Nr. 07/938,021 (veröffentlicht als WO93/05172) und 07/752,859 (veröffentlicht als WO93/05751) beschrieben. Kurz, Kandidaten- bzw. Test- Verbindungen können durch Inkubation in vitro mit einem Testgewebe oder Zellen hiervon identifiziert und getestet werden, oder einer hiervon abgeleiteten gezüchteten Zell-Linie, für eine ausreichende Zeit, um der Verbindung zu ermöglichen, die Erzeugung, das heißt die Expression und/ oder Sekretion, eines durch die Zellen dieses Gewebes produzierten Morphogens zu ermöglichen. Hier kann geeignetes Gewebe, oder gezüchtete Zellen eines geeigneten Gewebes, vorzugsweise aus renalem Epithel, Dental-Fibroblasten, Zementoblasten, Odontoblasten und Osteoblasten ausgewählt werden.

III. Formulierungen und Verfahren zu Verabreichungen

Die Morphogene können an eine Dentalgewebsoberflache, beispielsweise eine dentinale oder gingivale Oberfläche, durch irgendwelche geeigneten Mittel verabreicht werden. Vorzugsweise wird das Morphogen oder ein Morphogen-stimulierendes Mittel direkt an die Gewebsoberflache durch topische Verabreichung verabreicht. Alternativ kann das Morphogen dem Gewebe beispielsweise durch eine lokale Injektion verabreicht werden. Obwohl sie gegenwärtig nicht bevorzugt sind, können systemische Injektionen ein gangbarer Verabreichungsweg unter bestimmten Umständen sein, wie beispielsweise zur Behandlung fortgeschrittener oder chronischer Erkrankungs-Stadien, oder als eine Präventivmaßnahme bei Individuen, die einem extremen Risiko einer Krankheit ausgesetzt sind. Eine ausführliche Beschreibung von Überlegungen bezüglich einer systemischen Verabreichung, einschließlich einer oralen und parenteralen Verabreichung, ist beispielsweise in US S. Nr. 08/165,511 (veröffentlicht als WO93/04692) offenbart.
Wo das Morphogen direkt an eine Dentinal-Oberflache verabreicht wird, kann es als Teil einer biokompatiblen Formulierung verabreicht werden, die eine Flüssigkeit, ein Gel oder ein Feststoff sein kann. Beispielsweise kann es in einem wäßrigen Medium dispergiert werden, das das physiologische Flüssigkeits- oder Salzgleichgewicht des Säugetiers nicht nachteilig beeinflußt. Das wäßrige Medium für das Morphogen kann somit normale physiologische Salzlösung (0,85% oder 0,15 M NaCl), pH 7,0-7,4 umfassen. Die wäßrige Morphogenformulierung kann beispielsweise hergestellt werden, indem das Morphogen in 50% Ethanol, der Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure (trifluoroacetic acid = TPA) oder 0,1% HCl enthält, oder äquivalenten Lösungsmitteln gelöst werden. Ein Volumen der sich ergebenden Lösung wird dann beispielsweise zu zehn Volumina phosphatgepufferter Salzlösung (phosphate buffered saline = PBS) zugesetzt, die weiterhin 0,1-0,2% menschliches Serum-Albumin (human serum albumin = HSA) oder ein anderes akzeptables Trägerprotein einschließen. Die sich ergebende Lösung wird vorzugsweise umfassend gewirbelt. Das Morphogen kann weiterhin in einem Träger dispergiert und mit diesem verbunden werden, der zur Erhaltung des Morphogens an dem verabreichten Ort in der Lage ist. Brauchbare Formulierungen für einige Ausführungsformen schließen hierin viskose Zusammensetzungen und verdunstende Zusammensetzungen ein. Biokompatible Zusammensetzungen, die die Viskosität der Formulierung erhöhen, schließen Glyzerol, Polyalkylenglykole, wie beispielsweise Polyethylenglykol, Öle pflanzlicher Herkunft, hydrogenierte Naphthalene und dergleichen ein. Brauchbare verdunstende Zusammensetzungen schließen physiologisch akzeptable, beispielsweise biologisch inerte, Flüssigkeiten ein, die unter physiologischen Bedingungen abdampfen, um einen Morphogenrest auf der Gewebsoberflache zurückzulassen. Verdampfende Flüssigkeiten schließen organische oder anorganische Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht ein, wie beispielsweise Wasser, Ethanol, Isopropanol, Essigsäure und dergleichen, die die Gewebsfunktions- oder Gewebsstruktur-Unversehrtheit vor dem Abdampfen nicht beeinträchtigen.
Die Formulierung kann weiterhin ein in vivo bioresorbierbares Trägermaterial einschließen, das als ein Vehikel zur kontrollierten Freisetzungs-Abgabe dient. Brauchbare Träger können biokompatible, vorzugsweise biologisch abbaubare bzw. biodegradierbare strukturelle Bestandteile von beispielsweise einer extrazellulären Matrix, wie beispielsweise Kollagen, Laminin, Hyaluronsäure und dergleichen, oder Polymermaterialien, wie beispielsweise Polymilch-, Polybutter- und Polyglykolsäuren sein. Der Träger kann weiterhin eine azelluläre Gewebsmatrix umfassen, der im wesentlichen nicht-strukturelle Bestandteile fehlen, wie beispielsweise demineralisierter, guanidinextrahierter Knochen, Dentin, Wurzelhaut- oder Zementmatrix. Einzelheiten bezüglich der Herstellung derartiger Matrices sind in US S. N. 07/752,764 (veröffentlicht als WO92/15323) offenbart. Weitere brauchbare Träger mit kontrollierter Freisetzung, in denen das Morphogen dispergiert werden kann, sind in den US- Patenten Nr. 4,975,526 und 4,919,939 beschrieben. Derartige Träger werden als besonders brauchbar angesehen, wo das Morphogen zur Versiegelung einer Kavität verwendet wird.
Morphogen-Zusammensetzungen, die viskos, verdampfend sind oder einen bioresorbierbaren Träger umfassen, sind zur topischen Verabreichung auf eine Dentinal- oder Gingival-Oberfläche geeignet und können den Rückgang von Zahnfleischgewebe hemmen oder die regenerative Heilung erhöhen, ebenso wie die Morphogenese von Dentingewebe stimulieren.
Wenn es erwünscht ist, kann ein vorgegebenes Morphogen in der wäßrigen Zusammensetzung löslicher gemacht werden, indem es mit einem geeigneten Molekül verbunden wird. Beispielsweise ist die Proform eines morphogenetischen Proteins typischerweise löslicher oder in physiologischen Lösungen dispergierbarer als die entsprechende reife Form. Es wird tatsächlich angenommen, daß endogene Morphogene im Säugetierkörper in dieser Form transportiert (beispielsweise sezerniert und kreislaufbefördert) werden. Die lösliche Form des Proteins kann aus einem Kulturmedium von morphogen-sezernierenden Säugetierzellen gewonnen werden, beispielsweise aus Zellen, die mit einer Nukleinsäure transfiziert wurden, die das Morphogen kodiert und zu dessen Exprimierung in der Lage ist. Alternativ kann eine lösliche Spezies formuliert werden indem das reife Dimer (oder ein aktives Bruchstück hiervon) mit einer Morphogen Prodomäne oder einem löslichkeitsverbessernden Bruchstück hiervon (vollständiger nachstehend beschrieben) komplexiert wird. Weitere Bestandteile, einschließlich verschiedener Serum-Proteine können zur Steigerung der Morphogen-Löslichkeit ebenfalls brauchbar sein.
Letztendlich können die Morphogene oder Morphogen-stimulierenden Mittel, die hierin bereitgestellt sind, allein oder in Kombination mit anderen Molekülen, insbesondere Symptom-lindernden Kofaktoren, verabreicht werden. Brauchbare pharmazeutische Kofaktoren zur Linderung von Symptomen, die mit einer Schädigung von Dentalgewebe verbunden sind, schließen Antiseptika, Antibiotika, Anaesthetika und Analgetika ein. Bevorzugte Antiseptika zur Verwendung im vorliegenden System schließen Chlorhexidin und Tibezonium-Jodid ein. Bevorzugte Antibiotika schließen Tetracyclin, Aminoglykoside, wie beispielsweise Neomycin, Gentamycin, Kanamycin, Tobramycin, Netilmycin, Sisomycin, Amicamycin, deren Sulfate oder andere Derivate, Macrolide, wie beispielsweise Erythromycin, dessen Salze und weitere Derivate, Spiramycin, Josamycin oder Miocamycin, Penizilline, wie beispielsweise Ampicillin, Amoxicillin und dergleichen, und Cephalosporine, beispielsweise Cefaclor, Cefadroxil, Cefazolin, Cefoperazon, Cefotaxim, Cephalothin, Cefalexin, Ceforanid, Cefonicid oder Ceftriaxon ein. Bevorzugte Anaesthetika/Analgetika schließen Lokalanaesthetika vom Amid-Typ, wie beispielsweise Lidocain, Mepivacain, Pyrrocain, Bupivacain, Prilocain, Etidocain und weitere weit verbreitete Anaesthetika, wie beispielsweise Procain ein.
Weitere Kofaktoren schließen nicht-steroidale entzündungshemmende Mittel ein. Jedoch können die hierin beschriebenen Morphogene selbst die Enzündungs-/Immunreaktion des Körpers auf eine initiale Gewebsverletzung modulieren. Speziell und wie ausführlich in US S. N. 08/165,511 (veröffentlicht als WO93/04692) beschrieben, werden in Gegenwart eines Morphogens proinflammatorische Effektorzellen, die zur Wanderung an den Ort einer Gewebsverletzung induziert sind, nicht signifikant aktiviert. Ohne an irgendeine vorgegebene Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, daß in der Gegenwart des Morphogens geschädigtes Gewebe induziert wird, eine Wiederholung der Gewebsmorphogenese durchzumachen, wo Vorläuferzellen zur Proliferation und Differenzierung in einer gewebsspezifischen Art induziert werden, und neues, funktionelles, organisiertes Gewebe zur Ersetzung des geschädigten oder verlorenen Gewebes, eher als unorganisiertes, fibröses Narbengewebe, gebildet wird.
Die formulierten Zusammensetzungen enthalten therapeutisch wirksame Mengen des Morphogens, beispielsweise Mengen, die ausreichende Konzentrationen des Morphogens für die dentinale Oberfläche für eine Zeitspanne bereitstellen, die ausreicht, um die Morphogenese von Dentin und/oder die Produktion von Dentinmatrix dafür angemessen zu stimulieren. Wie der Fachmann zu würdigen weiß, wird die Konzentration der in einer therapeutischen Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verbindungen abhängig von einer Anzahl von Faktoren, einschließlich der biologischen Wirksamkeit des ausgewählten Morphogens, den chemischen Eigenschaften (beispielsweise Hydrophobie) der verwendeten Verbindungen, der Formulierung der Verbindungs-Träger, des Verabreichungsweges und von der in Aussicht genommenen Behandlung abhängen, einschließlich, ob reparatives Dentin in einer Entfernung, beispielsweise bis zu ungefähr 0,5 mm von der Auftragungsstelle, induziert werden soll. Die bevorzugte Dosis, die verabreicht werden soll, ist wahrscheinlich von derartigen Variablen, wie beispielsweise dem Zustand des Dentalgewebes, besonders der dentinalen Oberfläche, auf die das Morphogen verabreicht werden soll, der Größe des Zahnes oder der dentinalen Oberfläche, die behandelt werden soll, dem Ausmaß des Dentalgewebsverlustes oder -rückganges und dem Gesamt-Gesundheitszustand des speziellen Patienten abhängig. Im allgemeinen sind 0,00001-1000 mg Morphogen ausreichend, wobei 0,0001-100 mg bevorzugt werden und 0,001-10 mg für Primatenzähne, einschließlich menschlicher Zähne noch mehr bevorzugt werden. Es entstehen keine offensichtlichen Morphogeninduzierten pathologische Läsionen, wenn reifes Morphogen (beispielsweise OP-1, 20 mg) täglich normal wachsenden Ratten für 21 aufeinanderfolgende Tage verabreicht wird. Überdies erzeugen systemische Injektionen des Morphogens (beispielsweise OP-1) von 10 mg, die täglich über 10 Tage hinweg normalen neu geborenen Mäusen injiziert wurden, keine groben Abnormalitäten.
Die Ausübung der Erfindung, einschließlich zusätzlicher bevorzugter Grundgedanken und Ausführungsformen von dieser, werden noch vollständiger durch die nachfolgenden Beispiele begriffen werden, die hierin nur zur Veranschaulichung dargelegt sind und nicht als die Erfindung in irgendeiner Art und Weise einschränkend aufgefaßt werden sollen.

IV. Beispiele

Beispiel 1: Morphogen-induzierte Dentinocrenese in Säugetier- Zähnen

Die folgenden Studien zeigen die Wirksamkeit von Morphogenen bei der Induktion von Dentingewebs-Morphogenese in Modell-Säugetieren. Es wurde beobachtet, daß die menschliche Dental-Pulpa in unvorhersehbarer Weise auf eine Verletzung reagiert. Dies stellt gegenwärtig ein grundlegendes klinisches Problem in der Zahnheilkunde dar. Demgemäß werden Primaten hierin als Modell- Säugetiere zur Darstellung der Dentin-Regeneration verwendet. Der Fachmann wird die Korrelation zwischen menschlicher und nicht-menschlicher Primaten-Dental-Biologie verstehen und schätzen.
Rekombinantes menschliches osteogenetisches Protein-1 (hOP-1, Sequenz ID Nr. 4) stimulierte mehr Reparatur-Dentinbildung als Calciumhydroxid-Paste (eine herkömmliche Behandlung), wenn es auf frisch geschnittenes Primaten-Rest-Dentin aufgebracht wurde. Die Reaktion auf OP-1 war von der auf den Zahn als eine Kavitätsauskleidung aufgebrachten Konzentration ebenso wie von der Dicke des Rest-Dentins abhängig. Die Reaktion auf Calciumhydroxid war in ähnlicher Weise abhängig von der Dicke des Rest-Dentins.
Es wurde bereits dargestellt, daß Dentin-Matrices morphogenetiche Knochen-Protein-(bone morphogenetic protein = BMP) -Aktivität (Bang und Urist (1967), 94 Arch. Surg. 781-789; Youmans und Urist (1967), 12 Arch. Oral. Biol. 999-1008; Butler et al. (1977), 56 J. Dent. Res. 288-232; Bessho et al. (1990), 70 J. Dent. Res. 171-175), Wachstumsfaktoren (Finklemen et al. (1990), 5 J. Bone Min. Res. 717-723) und dentinogenetische Aktivität (Anneroth und Bang (1972), 23 Odont. Rev. 315-328; Nakashima, M. (1989), 5 Endodont. Dent. Traumat. 279-286; Nakashima, M. (1990), 35 Arch. Oral. Biol. 493-497; Nakashima, M. (1990), 35 Arch. Oral. Biol. 227-281; Tziafas und Kolokuris (1990), 69 J. Dent. Res. 75-81; Tziafas et al. (1992), 37 Arch. Oral. Biol. 119-128; Smith et al. (1994), 39 Arch. Oral. Biol. 13-22) aufwiesen. Unreine Dentin-Extrakte mit BMP-Aktivität (Nakashima, M. (1990), 35 Arch. Oral. Biol. 493-497; Nakashima, M. (1990), 35 Arch. Oral. Biol. 277-281), rekombinantes BMP-2 und BMP-4 (Nakashima, M. (1994), 73 J. Dent. Res. 1515-1522) und rekombinantes menschliches osteogenetisches Protein-1 (OP-1, BMP-7), (Rutherford et al. (1993), 38 Arch. Oral. Biol. 571-576; Rutherford et al. (1994), 39 Arch. Oral. Biol. 833-838) induzieren eine Reparatur-Dentineogenese, wenn sie auf teilweise amputierten Pulpas in reifen adulten Zähnen angeordnet werden, siehe ebenfalls US S. N. 07/752,764 (veröffentlicht als WO92/15323) und 08/155,343 (veröffentlicht als WO94/06399). Zusätzlich exprimieren dentale Pulpas (Vaino et al. (1993), 75 Cell, 45-58; Heikinheimo, H. (1994), 73 J. Dent. Res. 590-597) oder von Dental-Pulpas abgeleitete Zellen (Takeda et al. (1994), 15 Bone 467-470) einige Morphogen-Gene unterschiedlich. Demgemäß untersuchte die vorliegende Studie, ob solubilisiertes OP-1 die Dentinbildung induzierte, wenn es auf frisch geschnittenen Dentin- Oberflächen in permanenten Affen-Zähnen angeordnet wurde.
Neunzig (90) Schneide-, vordere Backen- und Backendauerzähne wurden mit Carbocain (Cook-Waite) ohne Vasoconstrictor anaesthesiert, durch Gummi-Damm isoliert, mit Kühlmittel gereinigt. Die Variation der Fläche der Pulpa-Böden betrug weniger als 10% und die durchschnittliche Dicke des restlichen Boden-Dentins variierte von ungefähr 0,1 bis 0,9 mm zwischen unterschiedlichen Zähnen (wie histomorphometrisch gemessen). Die Pulpa-Böden wurden mit einem festgelegten Volumen einer verdampfenden Lösung bedeckt, die 0,01, 0,1 oder 10 ug OP-1 in Säure-Alkohol (28,5% Ethanol, 0,025% HCL), Säure-Alkohol allein, eine dünne Schicht einer Calciumhydroxidpaste (Dycal, L. D. Caulk, Wilmington DE) enthielt, oder ohne ein Auskleidungsmittel (keine Behandlung) gefüllt. Die Kavitäten wurden mit Ketac-Silber (ESPE- Premier, Norristown, PA) gemäß Rekonstruktions-Standardtechniken gefüllt. Es wird erkannt werden, daß jedes Standard-Zahn- Rekonstruktionsmaterial verwendet werden kann. Die Tiere wurden zwei Monate im Anschluß an den chirurgischen Eingriff getötet, Proben gewonnen, und wie in der Literatur beschrieben untersucht (Rutherford et al. (1993), 38 Arch. Oral. Biol. 571-576.
Alle Verfahren, die vorstehend beschrieben wurden, und die Tiere einschlössen, wurden durch eine akkreditierte Tierschutzeinrichtung mit umfassender Erfahrung beim Umgang mit nicht-menschlichen Primaten gebilligt und durchgeführt. Diese Studien wurden unter Verwendung von fünf ausgewachsenen (gemischte Zahnreihe) männlichen Macaca fasicularis von jeweils ungefähr 4-6 kg durchgeführt. Die Dental-Prozeduren wurden bei stark sedierten Tieren durchgeführt, die mit beispielsweise Ketamin (15 mg/kg Körpergewicht) und Acepromazin (0,55 mg/kg Körpergewicht), ergänzt mit lokalen intraoralen Infiltrations-Anaesthetika (ohne Vasoconstrictor) sediert wurden.
Die variablen Mengen an Reparatur-Dentin, die in dieser Studie beobachtet wurden, waren in ihrer Fläche typischerweise auf die Dentinal-Oberfläche beschränkt, die diagonal zu den Luminae der geschnittenen Dentinal-Kanälchen verliefen. Fig. 3 ist ein digitalisiertes Videobild eines typischen Gewebsschnitts, der durch histologische Standardtechniken aus einem mit OP-1 behandelten Tier präpariert wurde. Fig. 3 zeigt, daß sich Reparaturdentin tief bis zu denjenigen Dentinal-Kanälchen bildete, die während der Präparation des Zahnes geschnitten wurden. In den meisten Fällen lag das Reparaturdentin in allen Abschnitten vor, in denen sowohl der Pulpa-Boden der Kavität-Präparation als auch die darunterliegende Pulpa-Kammer ersichtlich waren. Das räumliche Verhältnis der Masse von Reparaturdentin zum Pulpa-Boden schien durch die Ausrichtung der Dentinal-Kanälchen hin zur Längsachse des Zahnes und zur Oberfläche von geschnittenem Dentin, daß die Kanälchen schnitt, gelenkt zu werden. Die räumliche Ausrichtung legt nahe, daß OP-1 durch die Dentinal-Kanälchen diffundierte.
In der Tat hing die Fläche einer neuen Dentin-Bildung zwei Monate nach der Morphogenbehandlung weiterhin von der aufgebrachten OP-1 Dosis ab. Fig. 4 zeigt histomorphometrische Ergebnisse, die dieses Verhältnis veranschaulichen. Die mittlere bzw. durchschnittliche Dicke des Rest-Dentins wurde durch Mitteln dreier getrennter und repräsentativer histomorphometrischer Messungen in jeder der fünf Abschnitte, die über 75% der Oberfläche der Kavität-Zubereitung verteilt waren, bestimmt. In Fig. 4 wurde die mittlere Fläche des Reparatur-Dentin durch Mitteln dreier wiederholter histomorphometrischer Messungen in jedem der fünf (5) Gewebsabschnitte bestimmt, die über 75% der Oberfläche der Kavitäts-Zubereitung verteilt waren. Im Gegensatz hierzu existierten keine signifikanten Unterschiede zwischen der Menge an Reparatur-Dentin tief in den geschnittenen Dentinal-Kanälchchen in Zähnen, auf die keine Auskleidungen aufgebracht wurden (keine Behandlung) und denjenigen, die allein mit verdampfendem Träger behandelt wurden.
Wie in den Fig. 5 und 6 dargestellt ist, stimulierten äquivalente Mengen an OP-1 (beispielsweise 10 ug in fixen äquivalenten Volumina pro Zahn) signifikant mehr Reparatur-Dentin zwei Monate nach der Behandlung, als es alle anderen Behandlungen erreichten, einschließlich Calciumhydroxid. Der Stimulationsgrad hatte Bezug zur Dicke des Rest-Dentins, das die Morphogen-Aufbringungsstelle von der Pulpakammerwand trennte und wurde besonders klar ersichtlich, wenn die Dicke des Rest- Dentins 0,2 mm erreichte. Jeder dargestellte Rest-Dentin-Wert (0,2, 0,45, 0,75 und 0,9 mm) repräsentiert eine Gruppe berechneter Werte, die bis zu ± 0,15 mm schwankten. Somit ist die Fläche an Reparatur-Dentin, die zwei (2) Monate nach dem Auskleiden der Kavitäten mit 10 ug OP-1, einer dünnen Schicht an Calciumhydroxid oder verdampfendem Träger allein, vorlag, als eine Funktion der Dicke des Rest-Dentins, das im Pulpa- Boden verblieb, ausdrückbar. Mehr Reparatur-Dentin lag bei OP-1-behandelten als bei Calciumhydroxid-behandelten Zähnen vor (ANOVA, Scheffe's F, P< 0,05), mehr in Calciumhydroxid-behandelten Zähnen als in Träger-behandelten Zähnen (P< 0,05), und mehr bei OP-1-behandelten Zähnen als bei Träger-behandelten Zähnen (P< 0,01). OP-1 bei 1 ug und Calciumhydroxid waren über den Dicken-Bereich von Rest-Dentin (nicht dargestellt) aquipotent. Kleinere Mengen an OP-1 waren in Kavitäten der in dieser Studie bestimmten Größe schlecht wirksam.
Eine Resektion bzw. operative Entfernung der Dentinal-Kanalchen kann den Odontoblasten-Tod zur Folge haben, insbesondere in den tieferen Präparationen (Lee et al. (1992), AM. J, Den. 64-68). Es ist jedoch möglich, daß die Zahn-Präparations-Prozedur, die verwendet wurde, die Odontoblasten sogar in den tiefsten Präparationen bewahrte (Smith et al. (1994), 39, Aren. Oral. Biol. 13-22). Deshalb mag das bei diesen Studien gebildete Dentin reaktionäres Dentin sein, das durch Stimulation der phenotypisehen Funktion der originalen Odontoblasten gebildet wurde, oder mag Reparatur-Dentin sein, das durch neu differenzierte Zellen tief in den verlorenen Odontoblasten gebildet wurde (Lesot et al. (1993), 3 Cells and Materials 201- 217; Smith et al. (1994), 39 Arch. Oral. Biol. 13-22). Das bei diesen Studien verwendete Design erlaubte keine zeitlichen Beobachtungen der Odontoblasten-Schicht tief in den geschnittenen Dentinal-Kanälchen. Frühere Studien zeigten das Vermögen von OP-1, das mit einem unlöslichen Träger auf Kollagen-Grundlage komplexiert war, Reparatur-Dentin zu stimulieren, wenn es direkt auf teilweise amputierten Pulpen angeordnet war (US S. N. 08/155,343 (published as WO94/06399) und Rutherford et al. (1993), 38 Arch. Oral. Biol. 571-576; Rutherford et al. (1994), 39 Arch. Oral. Biol. 833-838). Eine teilweise Pulpa-Amputation entfernt offensichtlich die Odontoblastenschicht, wodurch das tiefere fibröse Bindegewebe der Pulpa freigelegt wird. Menschliche Pulpa-Zellen sind in vitro auf OP-1 reaktiv, was weiterhin nahelegt, daß die Pulpa selbst reagierende (kompetente) Zellen enthält. Die spezifischen Phänotypen dieser auf OP-1 ansprechenden Pulpa-Zellen wurden bis jetzt nicht letztendlich identifiziert.

Beispiel 2: Herstellung von löslichen Morphogen-Komplexen, die bei der Stimulierung der Dentineogenese brauchbar sind

Eine gegenwärtig bevorzugte Form des hierin brauchbaren Morphogens, mit verbesserter Löslichkeit in wäßrigen Lösungen, ist ein dimeres morphogenetisches Protein, das zumindest die C-terminale Sleben-Cystein-Domäne umfaßt, die für die Morphogen- Familie characteristisch ist, komplexiert mit einem Peptid, das eine Proregion eines Mitglieds der Morphogen-Familie umfaßt, oder ein Löslichkeit verbesserndes Bruchstück hiervon, oder eine Allel-, Spezies- oder andere Sequenzvariante hiervon. Vorzugsweise ist das dimere morphogenetische Protein mit zwei Proregion-Peptiden komplexiert. Weiterhin ist das dimere morphogenetische Protein vorzugsweise nicht kovalent mit den Proregion-Peptiden komplexiert. Die Proregion-Peptide umfassen vorzugsweise zumindest die achtzehn N-terminalen Aminosäuren, die die Pro-Domäne eines gegebenen natürlich vorkommenden Morphogens oder einer Allel- oder phylogenetischen Gegenstück- Variante hiervon definieren. Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen werden Peptide, die im wesentlichen wie Pro-Domäne in voller Länge definieren, verwendet.
Weitere lösliche Formen von Morphogenen schließen Dimere der nicht gespalteten Proformen dieser Proteine, ebenso wie "Hemi-Dimere" ein, bei denen eine Untereinheit des Dimers eine ungespaltete Proform des Proteins ist und die andere Untereinheit die reife Form des Proteins umfaßt, einschließlich trunkierter Formen hiervon, vorzugsweise nicht-kovalent mit einem gespalteten Pro-Domän-Peptid verbunden.
Wie vorstehend und in US S. N. 08/040,510 (veröffentlicht als WO94/03600) beschrieben, schließen brauchbare Pro-Domänen die Proregionen voller Länge, ebenso wie verschiedene trunkierte Formen hiervon, insbesondere trunkierte Formen ein, die an proteolytischen Arg-Xaa-Xaa-Arg (Sequenz ID Nr. 32) Spaltungsstellen innerhalb des Pro-Domän-Polypeptids gespalten werden. Beispielsweise schließen bei OP-1 mögliche Pro-Sequenzen Sequenzen ein, die durch die Reste 30-292 (volle Länge Form); 48-292 und 158-292 definiert sind. Die Stabilität des löslichen OP-1-Komplexes wird am besten erhöht, wenn die Pro-Region die volle Länge Form umfaßt, eher als die trunkierte Form, wie beispielsweise die trunkierte Form der Reste 48-292, insofern als die Reste 30-47 eine Sequenz-Homologie zu den N-terminalen Teilen weiterer Morphogene zeigen, und von denen gegenwärtig angenommen wird, daß sie besondere Brauchbarkeit bei der Erhöhung der Komplex-Stabilität für alle Morphogene aufweisen. Demgemäß schließen gegenwärtig bevorzugte Pro-Domänen Peptide mit zumindest dem N-terminalen Bruchstück, beispielsweise Aminosäureresten 30-47 einer natürlich vorkommenden Morphogen- Pro-Domäne oder einer biosynthetischen Variante hiervon ein, die die Löslichkeit- und/oder Stabilität-erhöhenden Eigenschaften des natürlich vorkommenden Peptids beibehält.
Wie der Fachmann zu schätzen weiß, können brauchbare Sequenzen, die die Proregion kodieren, aus genetischen Sequenzen gewonnen werden, die bekannte Morphogene kodieren. Alternativ können chimäre Proregionen aus den Sequenzen einer oder mehrerer bekannter Morphogene konstruiert werden. Eine noch weitere Option ist es, eine synthetische Sequenzvariante einer oder mehrerer bekannter Proregion-Sequenzen zu erzeugen.
Bei einem weiteren bevorzugten Grundgedanken schließen brauchbare Proregion-Peptide Polypeptid-Ketten ein, die eine Aminosäuresequenz umfassen, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit einer DNA- oder RNA- Sequenz hybridisiert, die zumindest die 18 N-terminalen Aminosäuren der Proregion-Sequenz für OP1 oder OP2 kodiert, beispielsweise die Nukleotide 136-192 und 152-211, von Sequenz ID Nr. 15 bzw. 19.

2.1 Isolierung eines löslichen Morphogen-Komplexes aus konditionierten Medien oder Körperflüssigkeit

Morphogene werden aus Säugetierzellen als lösliche Komplexe exprimiert. Typischerweise wird der Komplex jedoch während der Reinigung disassoziiert, im allgemeinen durch Exposition gegenüber denaturierenden Mitteln, die oftmals den Reinigungslösungen zugesetzt sind, wie beispielsweise Detergenzien, Alkohole, organische Lösungsmittel, chaotrope Mittel und Verbindungen, die zur Reduktion des pH-Werts der Lösung zugegeben sind. Nachstehend ist eine gegenwärtig bevorzugte Vorschrift zum Reinigen der löslichen Proteine aus konditionierten Medien bereitgestellt (oder wahlweise einer Körperflüssigkeit, wie beispielsweise Serum, cerebrospinaler oder peritonealer Flüssigkeit), unter nicht-denaturierenden Bedingungen. Das Verfahren ist schnell, reproduzierbar und erzielt isolierte lösliche Morphogenkomplexe in im wesentlichen reiner Form.
Lösliche Morphogenkomplexe können aus konditionierten Medien unter Verwendung einer einfachen Drei-Schritt-Chromatographischen-Vorschrift isoliert werden, die in Abwesenheit von den Denaturanten durchgeführt wird. Die Vorschrift schließt das Laufen der Medien (oder Körperflüssigkeit) über eine Affinitätssäule, gefolgt von Ionenaustausch- und Gelfiltrations- Chromatographien ein. Die nachstehend beschriebene Affinitätssäule ist eine Zn-IMAC-Säule. Die vorliegende Vorschrift weist für die Reinigung einer Vielzahl von Morphogenen allgemeine Anwendbarkeit auf, von denen alle voraussichtlich unter Verwendung nur geringer Modifikationen der nachstehend beschriebenen Vorschrift isolierbar sind. Eine ebenfalls anvisierte alternative Vorschrift, die Brauchbarkeit aufweist, schließt eine Immunoaffinitätssäule ein, die unter Verwendung von Standardverfahren und beispielsweise unter Verwendung von für eine gegebene Morphogen-Pro-Domäne spezifischen Antikörpern erzeugt wurde (komplexiert beispielsweise an eine Protein-A-konjugierte Sepharose-Säule). Vorschriften zur Entwicklung von Immunaffinitätssäulen sind in der Technik gut beschrieben (siehe beispielsweise Guide to Protein Purification, M. Deutscher, Ed., Academic Press, San Diego, 1990, insbesondere Abschnitte VII und XI hiervon).
Bei dieser Studie wurde OP-1 in Säugetier-(CHO, chinesischer Hamster Ovar)-Zellen wie in der Technik beschrieben, exprimiert (siehe beispielsweise Internationale Patentanmeldung US90/05903 (WO91/05802). Die CHO-Zell-konditionierten Medien, die 0,5% FB3 enthielten, wurden anfangs unter Verwendung einer Immobilisierten Metall-Ionen-Affinitäts-Chromatographie (IMAC) gereinigt. Der lösliche OP-1 Komplex aus konditionierten Medien bindet sehr selektiv an das Zn-IMAC-Harz und eine hohe Konzentration an Imidazol (50 mM Imidazol, pH 8,0) ist für die wirksame Elution des gebundenen Komplexes erforderlich. Der Zn- IMAC-Schritt trennt das lösliche OP-1 aus der Masse der kontaminierenden Serum-Proteine, die im Durchfluß und 35 mM Imidazol-Waschfraktionen eluieren. Das Zn-IMAC gereinigte lösliche OP-1 wird als nächstes auf eine S-Sepharose Kationenaustauschsäule aufgebracht, die in 20 mM NaPO&sub4; (pH 7,0) mit 50 mM NaCl equilibriert wurde. Der S-Sepharose-Schritt dient dazu, den löslichen OP-1-Komplex in Vorbereitung für den nachfolgenden Gel-Filtrations-Schritt weiterhin zu reinigen und zu konzentrieren. Das Protein wurde auf eine Sephacryl S-200 HR Säule aufgebracht, die in TBS equilibriert war. Unter Verwendung der im wesentlichen gleichen Vorschrift, können ebenfalls lösliche Morphogene aus einem oder mehreren Körperflüssigkeiten, einschließlich Serum, cerebrospinaler Flüssigkeit oder peritonealer Flüssigkeit isoliert werden.
Eine IMAC wurde unter Verwendung von chelierender Sepharose (Pharmacia) durchgeführt, die mit drei Säulen-Volumina 0,2 M ZnSO beschickt wurde. Das konditionierte Medium wurde bis zu pH 7,0 titriert und direkt auf das Zn-IMAC-Harz aufgebracht, das in 20 mM HEPES (pH 7,0) mit 500 mM NaCl equilibriert wurde. Das Zn-IMAC-Harz wurde mit 80 mL Start-konditionierten Medien pro mL Harz beschickt. Nach der Beschickung wurde die Säule mit Equilibrations-Puffer gewaschen und die meisten der verunreinigenden Proteine wurde mit 35 mM Imidazol (pH 7,0) in Equilibrations-Puffer eluiert. Der lösliche OP-1-Komplex eluierte dann mit 50 mM Imidazol (pH 8,0) in 20 mM HEPES und 500 mM NaCl.
Das 50 mM Imidazol-Eluat, das den löslichen OP-1-Komplex enthielt, wurde mit neun Volumina 20 mM NaPO&sub4; (pH 7,0) verdünnt und auf eine S-Sepharose-(Pharmacia-)Säule aufgebracht, die in 20 mM NaPO&sub4; (pH 7,0) mit 50 mM NaCl equilibriert wurde. Das S-Sepharose-Harz wurde mit einem Äquivalent von 800 mL konditioniertem Start-Medium pro mL Harz beschickt. Nach der Beschickung wurde S-Sepharose-Säule mit Equilibrations-Puffer gewaschen und mit 100 mM NaCl, gefolgt von 300 mM und 500 mM NaCl in 20 mM NaPO&sub4; (pH 7,0) eluiert. Der 300 mM NaCl Pool wurde weiterhin unter Verwendung einer Gel-Filtrations-Chromatographie gereinigt. Fünfzig mL des 300 mm NaCl-Eluats wurden auf eine 5,0 · 90 cm Sephacyl S-200 HR (Pharmacia) aufgebracht, die in Tris gepufferte Salzlösung (Tris buffered saline = TBS), 50 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 7,4) equilibriert wurden. Die Säule wurde bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 5 mL/Minute unter Sammeln von 10 mL Fraktionen eluiert. Das apparente bzw. offensichtliche Molekulargewicht des löslichen OP-1 wurde durch Vergleich mit Protein-Molekulargewichts-standards (Alkohol- Dehydrogenase (ADH, 150 kDa), Rinderserumalbumin (BSA, 68 kDa) Carbo-Anhydrase (CA, 30 kDa) und Cytochrom C (cyt C, 12,5 kDa) bestimmt. Die Reinheit der S-200-Säulen-Fraktionen wurde durch Trennung auf 15%-ige Standard-Polyacrylamid SDS-Gels bestimmt, die mit Coomassie Blau angefärbt waren. Die Identität des reifen OP-1 und der Pro-Domäne wurde durch N-terminale Sequenzanalyse nach Trennung des reifen OP-1 von der Pro-Domäne unter Verwendung von Umkehrphasen C18 HPLC bestimmt.
Der lösliche OP-1-Komplex eluiert mit einem apparenten Molekulargewicht von 110 kDa. Dies stimmt gut mit der vorhergesagten Zusammensetzung des löslichen OP-1-Komplexes mit einem reifen OP-1-Dimer (35-36 kDa) überein, das mit zwei Pro-Domänen verbunden ist (jeweils 39 kDa). Die Reinheit des Endkomplexes kann durch Laufen der geeigneten Fraktion in einem reduzierten 15-%-igen Polyacrylamidgel verifiziert werden.
Die Komplex-Bestandteile können verifiziert werden, indem die komplexenthaltende Fraktion von der S-200 oder S-200-HR-Säule über eine Umkehrphasen C-18-HPLC-Säule läuft und in einem Acetonitril-Gradienten (in 0,1% TPA), unter Verwendung von Standardverfahren eluiert. Der Komplex wird durch diesen Schritt dissoziiert und die Pro-Domän- und reife Spezies eluieren als getrennte Spezies. Diese getrennten Spezies können dann einer N-terminalen Sequenzierung unter Verwendung von Standard-Verfahren unterworfen werden (siehe beispielsweise Guide to Protein Purification, M. Deutscher ed., Academic Press, San Diego, 1990, insbesondere S. 602-613), und die Identität der isolierten 36 kD, 39 kDa-Proteine konnte als reifes Morphogen bestätigt und isoliert, bzw. die Pro-Domäne abgespalten werden. Ein N-terminales Sequenzieren der isolierten Pro-Domäne aus Säugetierzell-erzeugten OP-1 enthüllte zwei Formen der Pro-Region, die intakte Form (beginnend bei Rest 30 von Sequenz ID Nr. 16) und eine trunkierte bzw. verkürzte Form (beginnend bei Rest 48 von Sequenz ID Nr. 16). Ein N-terminales Sequenzieren der Polypeptid-Untereinheit der isolierten reifen Spezies enthüllt einen Bereich von N-Termini für die reife Sequenz, beginnend bei den Resten 293, 300, 313, 315, 316 und 318 von Sequenz ID Nr. 16, von denen alle, wie durch den Standard-Knochen- Morphogenese-Test, der in US S. N. 07/752,764 (veröffentlicht als WO92/15323) beschrieben, als wirksam demonstriert wurden.

2.2 In Vitro lösliche Morphogen-Komplexbildunq

Als eine Alternative zum Reinigen löslicher Komplexe aus Kulturmedien oder einer Körperflüssigkeit, können lösliche Komplexe aus gereinigten Pro-Domänen und reifen dimeren Spezies formuliert werden. Eine erfolgreiche Komplexbildung erfordert offensichtlich die Verbindung der Bestandteile unter denaturierenden Bedingungen, die zur Entspannung der gefalteten Struktur dieser Moleküle ausreichen, ohne die Disulfid-Brücken zu beeinträchtigen. Vorzugsweise ahmen die Denaturierungs- Bedingungen die Umgebung eines intrazellulären Vesicles in ausreichender Weise nach, derartig, daß die gespaltene Pro- Domäne eine Gelegenheit hat, sich an die reife dimere Spezies unter entspannten Faltungsbedingungen anzulagern. Die Konzentration an Denaturierungsmittel in der Lösung wird dann in einer kontrollierten, vorzugsweise schrittartigen Weise, vermindert, um die richtige Rückfaltung des Dimers und der Pro-Regionen zu ermöglichen, während die Anlagerung der Pro- Domäne an das Dimer aufrechterhalten bleibt. Brauchbare Denaturierungsmittel schließen 4-6 M Urea oder Guanidinhydrochlorid (GuHCl) in gepufferten Lösungen von pH 4-10, vorzugsweise pH 6-8, ein. Der lösliche Komplex wird dann durch kontrollierte Dialyse oder Verdünnung in einer Lösung gebildet, die eine Denaturierungsmittel-Endkonzentration von weniger als 0,1-2 M Urea oder GuHCl, vorzugsweise 1-2 M Urea or GuHCl, aufweist, die dann vorzugsweise in einem physiologischen Puffer verdünnt werden kann. Protein-Reinigungs-/Renaturierungsverfahren und Überlegungen sind in der Technik gut beschrieben und Einzelheiten zur Entwicklung einer geeigneten Renaturierungs- Vorschrift können leicht von einem Durchschnitts-Fachmann bestimmt werden. Ein für diesen Gegenstand brauchbarer Text ist Guide to Protein Purification, M. Deutscher, ed., Academic Press, San Diego, 1990, besonders Abschnitt V, die Komplexbildung mag weiterhin durch Zugabe eines oder mehrerer Chaperon- Proteine gestützt werden.

2.3 Stabilität der löslichen Morphogen-Komplexe

Die Stabilität der hochgereinigten löslichen Morphogen-Komplexe in einem physiologischen Puffer, beispielsweise tris-gepufferter Salzlösung (TBS) und phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) kann durch irgendeine Anzahl von Mitteln gesteigert werden. Gegenwärtig bevorzugt wird dies mittels einer Pro-Region erreicht, die zumindest die ersten 18 Aminosäuren der Pro-Sequenz (beispielsweise Reste 30-47 von Sequenz ID Nr. 16 für OP-1) umfaßt und vorzugsweise die Pro-Region in voller Länge ist. Die Reste 30-47 zeigen eine Sequenzhomologie zum N-terminalen Anteil anderer Morphogene und es wird angenommen, daß dies eine besondere Brauchbarkeit bei der Erhöhung der Komplex-Stabilität für alle Morphogene aufweist. Andere brauchbare Mittel zur Erhöhung der Stabilität löslicher Morphogen-Komplexe schließen drei Klassen an Zusatzstoffen ein. Diese Zusatzstoffe schließen basische Aminosäuren (beispielsweise L-Arginin, Lysin und Betain), nicht-ionische Detergenzien (beispielsweise Tween 80 oder Nonldet P-120) und Träger-Proteine (beispielsweise Serumalbumin und Casein) ein. Brauchbare Konzentrationen dieser Zusatzstoffe schließen 1-100 mM, vorzugsweise 10-70 mM, einschließlich 50 mM, basische Aminosäure ein; 0,01-1,0%, vorzugsweise 0,05-0,2%, einschließlich 0,1% (V/V) nicht-ionisches Detergenz; und 0,01-1,0%, vorzugsweise 0,05-0,2%, einschließlich 0,1% (G/V) Trägerprotein.

SEQUENZ-LISTE

(1) ALLGEMEINE INFORMATION
(i) ANMELDER:
(A) NAME: CREATIVE BIOMOLECULES, INC.
(B) STRASSE: 45 SOUTH STREET
(C) STADT: HOPKINTON
(D) STAAT: MA
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL (ZIP): 01748
(G) TELEFON 1-508-435-9001
(H) TELEFAX 1-508-435-0454
(I) TELEX:
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: MORPHOGEN-INDUZIERTE DENTIN- REGENERATION
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 32
(iv) KORRESPONDENZ-ADRESSE:
(A) ADRESSAT: CREATIVE BIOMOLECULES, INC.
(B) STRASSE: 45 SOUTH STREET
(C) STADT: HOPKINTON
(D) STAAT: MA
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 01748
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MEDIUM-TYP: Floppy disc
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30
(vi) AKTUELLE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDETAG:
(C) KLASSIFIKATION:
(viii) ANWALT/VERTRETER INFORMATION:
(A) NAME: FENTON, GILLIAN M
(B) REGISTRIER-NUMMER: 36,508
(C) REFERENZ/GERICHTS-NR. CRP-088PC
(ix) TELEKOMMUNIKATIONS-INFORMATION:
(A) TELEFON: 617/248-7000
(B) TELEFAX: 617/248-7100
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 97 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Protein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..97
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = GENERISCHE-SEQ-7 /Bemerkung = "WOBEI JEDES XAA UNABHÄNGIG AUS EINER GRUPPE EINER ODER MEHRERER, WIE IN DER BESCHREIBUNG DEFINIERTER, SPEZIFIZIERTER AMINOSÄUREN AUSGEWÄHLT IST"
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 102 Aminosäuren
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(C) STRÄNGIGKEIT:
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(ii) MOLEKÜL-ART: Protein
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(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..102
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = GENERISCHE-SEQ-8 /Bemerkung = "WOBEI JEDES XAA UNABHÄNGIG AUS EINER GRUPPE EINER ODER MEHRERER, WIE IN DER BESCHREIBUNG DEFINIERTER, SPEZIFIZIERTER AMINOSÄUREN AUSGEWÄHLT IST"
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 102 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Protein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..102
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = OPX /Bemerkung = "WOBEI JEDES XAA UNABHÄNGIG AUS EINER GRUPPE EINER ODER MEHRERER FESTGESETZTER AMINOSÄUREN AUSGEWÄHLT IST, WIE IN DER BESCHREIBUNG DEFINIERT."
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 139 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Protein
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(A) ORGANISMUS: HOMO SAPIENS
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(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLUSSEL: Protein
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(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung hOP1-REIF
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 139 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
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(ii) MOLEKÜL-ART: Protein
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(A) ORGANISMUS: MURIDAE
(F) GEWEBSART: EMBRYO
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..139
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = mOP1-REIF
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 139 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
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(ii) MOLEKÜL-ART: Protein
(vi) ORIGINAL-QUELLE:
(A) ORGANISMUS: HOMO SAPIENS
(F) GEWEBSART: HIPPOCAMPUS
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..139
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = HOP2-REIF
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 139 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Protein
(vi) ORIGINAL-QUELLE:
(A) ORGANISMUS: MURIDAE
(F) GEWEBEART: EMBRYO
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..139
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = MOP2-REIF
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 101 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Protein
(vi) ORIGINAL-QUELLE:
(A) ORGANISMUS: BOVINAE
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..101
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = CBMP-2A-FX
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 101 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Protein
(vi) ORIGINAL-QUELLE:
(A) ORGANISMUS: HOMO SAPIENS
(F) GEWEBSART: HIPPOCAMPUS
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLUSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..101
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = CBMP-2B-FX
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 102 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Protein
(vi) ORIGINAL-QUELLE:
(A) ORGANISMUS: DROSOPHILA MELANOGASTER
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..102
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = DPP-FX
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 102 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Protein
(vi) ORIGINAL-QUELLE:
(A) ORGANISMUS: XENOPUS
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..102
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = VGL-FX
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTFJtf:
(A) LÄNGE: 102 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Protein
(vi) ORIGINAL-QUELLE:
(A) ORGANISMUS: MURIDAE
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..102
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = VGR-1-FX
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 106 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Protein
(vi) ORIGINAL-QUELLE:
(A) ORGANISMUS: HOMO SAPIENS
(f) GEWEBSART: GEHIRN
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..106
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung GDF-1 (fx)
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Peptid
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1822 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(Ü) MOLEKÜL-ART: cDNA
(vi) ORIGINAL-QUELLE:
(A) ORGANISMUS: HOMO SAPIENS
(F) GEWEBEART: HIPPOCAMPUS
(ix) MERKMAL:
(A) NAME /SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 49..1341
(C) IDENTIFIZIERUNGS- VERFAHREN: experimentell
(D) WEITERE INFORMATION: /Funktion = "OSTEOGENES PROTEIN"
/Erzeugnis = "OP1"
/Beweis = EXPERIMENTELL
/Standard-Name = "OP1"
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 431 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Protein
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 17:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1873 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: cDNA
(vi) ORIGINAL-QUELLE:
(A) ORGANISMUS: MURIDAE
(F) GEWEBSART: EMBRYO
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 104..1393
(D) WEITERE INFORMATION: /Funktion = "OSTEOGENES PROTEIN"
/Erzeugnis = "MOP1"
/Bezeichnung = "MOP1 (CDNA)"
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 18:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 430 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Protein
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 19:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1723 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGIGKEIT: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: cDNA
(vi) ORIGINAL-QUELLE:
(A) ORGANISMUS: HOMO SAPIENS
(F) GEWEBSART: HIPPOCAMPUS
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 490..1695
(D) WEITERE INFORMATION: /FUNKTION "OSTEOGENES PROTEIN"
/Erzeugnis = "hOP2-PP"
/Bezeichnung = "hOP2 (cDNA)"
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 20:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 402 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Protein
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ. ID NR. 20
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 21:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1926 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(vi) ORIGINAL-QUELLE:
(A) ORGANISMUS: MURIDAE
(F) GEWEBSART: EMBRYO
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 93..1289
(D) WEITERE INFORMATION: /FUNKTION = "OSTEOGENES PROTEIN"
/Erzeugnis = "mOP2-PP"
/Bezeichnung = "mOP2 cDNA"
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 22:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 399 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Protein
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 23:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1368 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(Ü) MOLEKÜL-ART: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..1365
(D) WEITERE INFORMATION: /BEZEICHNUNG = 60A
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 24:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 455 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Protein
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 25:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1674 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 69..1265
(D) WEITERE INFORMATION: /Bemerkung = "mOP3-PP"
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 26:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 399 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Protein
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 27:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 104 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Protein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..104
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = "BMP3"
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 28:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 102 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(c) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Protein
(vi) ORIGINAL-QUELLE:
(A) ORGANISMUS: HOMO SAPIENS
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..102
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = "BMP5"
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 29:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 102 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Protein
(vi) ORIGINAL-QUELLE:
(A) ORGANISMUS: HOMO SAPIENS
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..102
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = "BMP6"
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 30:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1247 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: cDNA
(vi) ORIGINAL-QUELLE:
(A) ORGANISMUS: HOMO SAPIENS
(F) GEWEBSART: GEHIRN
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 84..1199
(D) WEITERE INFORMATION: /Bezeichnung = "GDF-1"
/Bemerkung = "GDF-1 cDNA"
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 31:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 372 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: PROTEIN
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 31;
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 32:
(i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 32

Claims

1. Verwendung eines Morphogens zur Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung bei:

(a) Stimulieren der Dentinmorphogenese in einem Säugetierzahn; oder

(b) Stimulieren der phänotypischen Expression von Säugetier- Odontoblasten; oder

(c) Stimulieren der Erzeugung von Dentinmatrix durch Säugetier- Odontoblasten; oder

(d) Erhöhen der Dicke eines Säugetierzahnes; oder

(e) Vermindern des Bruchrisikos bei einem Säugetierzahn; oder

(f) Desensibilisieren eines Säugetierzahns gegenüber dem Wahrnehmungsvermögen von Druck oder Temperatur; oder

(g) Versiegeln einer Höhle in einem Säugetierzahn; wobei das Medikament auf eine Dentinal-Oberfläche aufgebracht wird.

2. Verwendung nach Anspruch 1, bei der die Dentinal- Oberfläche entweder: (i) an eine Stelle verlorenen oder beschädigten Zahnschmelzes, Dentin- oder Zementgewebes, wie beispielsweise einer Höhle dieses Zahnes, angrenzt oder (ii) an eine Stelle eines verlorenen oder beschädigten Zahnfleisch- Gewebes angrenzt.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei der die Dentinal-Oberfläche entweder zum: (i) Abtragen von beschädigtem oder infiziertem Zahnschmelz, Dentin- oder Zementgewebe von der Stelle dieser Kavität oder zum (ii) Reinigen von geschädigtem Zahnfleisch-, Zahnschmelz-, Dentin- oder Zementgewebe von dieser Dentinal-Oberfläche behandelt wird.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-3, die die Anwendung des Morphogens in einer zur Stimulierung der Bildung von Reparaturdentin wirksamen Menge umfaßt, die der Dentinal- Oberfläche angemessen ist.

5. Verwendung nach Anspruch 4, bei der die Dentinal- Oberfläche quer zu Hohlräumen von Dentalkanälchen innerhalb des Zahns verläuft.

6. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Dentinal- Oberfläche von der Pulpakammerwand des Zahns von bis zu ungefähr 1 Millimeter Restdentin getrennt ist.

7. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der:

(A) Das Morphogen in einem physiologisch akzeptablen Träger oder einem Verdunstungsträger solubilisiert ist; oder

(B) das Morphogen an eine biokompatible, azelluläre Matrix adsorbiert ist, die zum Versiegeln oder Füllen von Defekten in Säugetierzahnen geeignet ist.

8. Verwendung nach Anspruch 7A, bei der das Morphogen durch den Vorbereitungsschritt, das Morphogen in einem physiologisch akzeptablen Träger oder in einem Verdunstungsträger zu solubilisieren, solubilisiert wird, wobei der Träger optional weiterhin einen Co-Faktor umfaßt, der mit Zahnbeschädigung verbundene Symptome lindert.

9. Verwendung nach Anspruch 7B, bei der das Morphogen durch den Vorbereitungsschritt des Adsorbierens des Morphogens an eine biokompatible, azelluläre Matrix adsorbiert wird, die zum Versiegeln und Füllen von Defekten in Säugetierzähnen geeignet ist, wobei die Matrix optional weiterhin einen Co-Faktor umfaßt, der mit einer Zahnbeschädigung verbundene Symptome lindert.

10. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das Morphogen ein dimeres Protein umfaßt, das die Morphogenese von Säugetier-Dentingewebe induziert, wobei das dimere Protein zwei gefaltete Polypeptide umfaßt, deren Aminosäuresequenz jeweils

(i) eine Sequenz, die zumindest 70% Homologie mit der Cterminalen 7-Cystein-Domäne von menschlichem OP1, Reste 38 bis 139 von Sequenz ID Nr. 4, teilt;

(ii) eine Sequenz, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleinsäure hybridisiert, die diese Domäne von menschlichem OP1 kodiert; oder

(iii) eine Sequenz umfaßt, die durch Gattungssequenz 8, Sequenz ID-Nr. 2 definiert ist.

11. Verwendung nach Anspruch 10, bei der: (i) die Sequenz dieser Morphogen- Polypeptide durch OPX, Sequenz ID-Nr. 3 definiert ist und/oder (ii) das Morphogen aus Kulturmedium Morphogen-sezernierender Säugetierzellen gewonnen wird.

12. Verwendung nach Anspruch 10 oder 11, bei der die Sequenz des Morphogen- Polypeptids unabhängig bei jedem dieser Polypeptide aus den Sequenzen der C-Terminalen 7-Cystein- Domänen von menschlichem OP1, Maus-OP1, menschlichem OP2, Maus-OP2, Maus-OP3, Drosophila 60A-Protein, Xenopus Vgl, Maus Vgr-1, Maus-GDF-1, Drosophila-DPP, CBMP2A, CBMP2B, BMP3, BMP5, BMP6 (dargestellt in den Sequenz ID-Nr. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 24, 26, 27, 28 und 29) und Allel-, phylogenetische und biosynthetische Varianten hiervon, ausgewählt ist.

13. Verwendung nach Anspruch 10 oder 11, bei der die Sequenz des Morphogen- Polypeptids bei jedem Polypeptid aus den Sequenzen der C-Terminalen 7-Zystein-Domänen von menschlichem OP1, menschlichem OP2, Maus-OP1, Maus-OP2, Maus-OP3 und Drosophila 60A-Protein (dargestellt in den Sequenz ID-Nr. 4, 5, 6, 7, 24 und 26) und Allel-, phylogenetischen und biosynthetischen Varianten hiervon, ausgewählt ist.

14. Verwendung nach Anspruch 10 oder 11, bei der das Morphogen durch Verbindung mit zumindest einem Morphogen-Prodomän- Polypeptid oder Löslichkeits-verbessernden Bruchstücks hiervon solubilisiert wird.