DE69605419T2

DE69605419T2 - Mehrfach-tyrosinierte somatostatin-analoga

Info

Publication number: DE69605419T2
Application number: DE69605419T
Authority: DE
Inventors: David Coy; William Murphy; M. O'dorisio; Thomas O'dorisio; Eugene Woltering
Original assignee: Childrens Hospital Inc; Louisiana State University Medical Center Foundation; Ohio State University Research Foundation; Tulane University
Current assignee: Childrens Hospital Inc; Louisiana State University Medical Center Foundation; Ohio State University Research Foundation; Tulane University
Priority date: 1995-06-05
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 2000-06-08
Anticipated expiration: 2016-06-04
Also published as: JPH11507622A; ES2140858T3; NZ310006A; GR3032437T3; EP0833646B1; AU6031796A; DK0833646T3; EP0833646A4; WO1996039161A1; CA2222962A1; EP0833646A1; PT833646E; US5597894A; AU709506B2; CZ386297A3; ATE187075T1; DE69605419D1

Description

Die Erfindung betrifft die Diagnose und Behandlung von Tumoren mit Peptid-spezifischen Oberflächen-Rezeptoren.
Trotz der Fortschritte in der Diagnose und Behandlung von Krebs bleibt der operative Eingriff die zuverlässigste und wirksamste Langzeitbehandlung mancher Krebstypen. Der Erfolg des operativen Eingriffs wird von einer zuverlässigen und vollständigen Lokalisierung der Tumore vor oder während der operativen Behandlung bestimmt. In 20% bis 40% der Krebsfälle wird eine ungenaue und unvollständige Diagnose der Krankheit erstellt. Zwar sind verschiedene präoperative Darstellungstechniken verfügbar, jedoch ist die Sensitivität dieser Techniken proportional zur Tumorgröße. Zum Beispiel beträgt die untere Auflösungsgrenze des CT- Scannings 0,8 cm bis 1,0 cm. Superselektive Angiographie ist geeigneter zur Tumorlokalisierung, erfordert jedoch eine große technische Erfahrung. Tumorlokalisierungstechniken, die nicht auf einer bildlichen Darstellung beruhen, wie perkutane transhäpatische Pfortadersammlung (PTPVS) wurden erfolgreich zur regionalen Lokalisierung kleiner funktioneller Tumore eingesetzt, die von anderen Verfahren unerkannt blieben. Jedoch sind diese Tumorlokalisierungsverfahren immer noch begrenzt. Zum Beispiel erlaubt PTPVS nicht routinemäßig die einzelne Beurteilung von nodaler Positivität oder Negativität und kann keine multizentrischen Tumore nachweisen.
Falls eine präoperative Tumorlokalisierung versagt, muß der behandelnde Arzt im weiteren auf eine untersuchende operative Behandlung in Kombination mit intraoperativer Tumorlokalisierung und Entfernung zurückgreifen. Eine forsche intraoperative Lokalisierung wird durch eine Kombination von Ultraschall, Abtastung und endoskopischen oder laparoskopischen Techniken erreicht. Obwohl diese Techniken den Nachweis von kleinen Tumoren, die von verfügbaren präoperativen Lokalisierungstechniken unerkannt bleiben, ermöglichen, können kleine Tumore außerhalb der untersuchten Organe unentdeckt bleiben. Außerdem steigt die aus einer untersuchenden operativen Behandlung resultierende Morbidität mit der Menge des untersuchten Gewebes.
Eine Vielzahl von Krebsarten, einschließlich sowohl endokriner als auch nicht-endokriner Tumore, exprimieren Somatostatin-Rezeptoren. Fünf menschliche Somatostatin-Rezeptoren wurden identifiziert und kloniert. Die Expression dieser fünf Rezeptor-Subtypen variiert in den Gewebetypen. Somatostatin-Rezeptor-Subtyp 2 wird auf einer Vielzahl von Tumortypen exprimiert. Tabellen 1A und 1B zeigen eine Zusammenfassung der Somatostatin-Rezeptorexpression in sowohl normalen als auch Tumorgeweben. TABELLE 1A Somatostatin-Rezeptor-Subtypexpression in normalem menschlichen Gewebe TABELLE 1B Somatostatin-Rezeptor-Subtypexpression in menschlichem Tumorgewebe
Endogen produziertes Somatostatin hemmt die Freisetzung mehrerer Hypophysen- und Intestinalfaktoren, die Zellteilung, Zellbeweglichkeit und/oder Sekretion regulieren, einschließlich Wachstumshormon, Kortikotropin, Prolaktin, Thyroidea-stimulierendes Hormon, Insulin, Glukagon, Motilin, gastrisches inhibierendes Peptid (GIP), vasoaktives intestinales Peptid (VIP), Sekretin, Cholecystokinin, Bombesin, Gastrin-freisetzendes Peptid (GRP), Gastrin, adrenokortikotropes Hormon (ACTH), Thyroidea-freisetzendes Hormon (TRH), Choleocystokinin (CCK), Aldosteron, pankreatisches Polypeptid (PP), Cytokine (wie Interleukine, Interferone), Wachstumsfaktoren (wie epidermaler Wachstumsfaktor, Nervenwachstumsfaktor) und vasoaktive Amine (wie Serotonin). Mehrere dieser Faktoren stehen in Zusammenhang mit der Regulation der Zellteilung normaler Zellen sowie der Teilung und/oder Metastatisierung von Tumorzellen. Zum Beispiel stimuliert GRP die Teilung normaler und maligner intestinaler Epithelzellen, stimuliert die Vermehrung von normalen bronchialen Epithelzeflen und ist ein autokriner Wachstumsfaktor für das kleinzellige Lungenkarzinom.
Somatostatin-14 (S-14) und Somatostatin-28 (S-28) sind die zwei grundsätzlichen Formen nativen Somatostatins. S-14 ist ein 14 Aminosäuren langes Peptid mit der Sequenz Ala-Gly- Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys (SEQ ID NO: 1). Die Aminosäuresequenz von S-14 ist unter Vertebraten stark konserviert. S-14 besitzt eine cyclische molekulare Struktur, die durch eine Disulfidbrücke zwischen Cys&sub3; und Cys&sub1;&sub4; (die Cysteine an Positionen 3 und 14, ausgehend vom N-Terminus) und durch Wasserstoff- und hydrophobe Bindungen stabilisiert wird. Vier Aminosäurereste innerhalb der Ringstruktur von Somatostatin, Phe&sub7;-Trp&sub8;-Lys&sub9;-Thr&sub1;&sub0; (SEQ ID NO: 2) sind primär verantwortlich für Rezeptorbindung und biologische Aktivität, während die Reste Trp&sub8;-Lys&sub9; hauptsächlich verantwortlich für Rezeptorbindung sind. S-28 ist ein 28 Aminosäuren langes Peptid und enthält die Aminosäuresequenz von S-14 mit zusätzlich 14 sich vom N-Terminus erstreckenden Aminosäuren. Die strukturellen Unterschiede zwischen S-14 und S-28 beeinflussen die relative Stärke der inhibitorischen Aktivität auf die durch Somatostatin regulierten biologischen Funktionen.
Eine Vielzahl von Somatostatin-Peptid-Analoga wurde durch Beseitigung von für die Aktivität nicht absolut notwendigen Aminosäuren und/oder durch den Austausch der nativen L-Aminosäuren durch die entsprechenden D-Aminosäure-Isomere produziert. Somit sind manche dieser Analoga länger wirkende, stärkere Rezeptor-Agonisten als natives Somatostatin teilweise aufgrund der Resistenz von D-Aminosäuren gegenüber Enzymabbau. Zum Beispiel hemmt das synthetische Somatostatin-Analog Octreotid-Acetat, das die Aminosäuresequenz D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr(ol) (SEQ ID NO: 3) besitzt, die Freisetzung von Wachstumsfaktor 45 bis 70 mal stärker als natives Somatostatin. LANREOTIDE®, ein synthetisches Somatostatin-Octapeptid-Analogon mit der Aminosäuresequenz Dβ-Nal-Cys-Tyr- D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr (NH&sub2;) (SEQ ID NO: 4), ist 20 bis 50 mal stärker als natives Somatostatin.
Die Verwendung von Somatostatin-Analoga bei der Diagnose und Therapie wird durch die relativ kurze Halbwertszeit dieser Analoga in vivo begrenzt. Zudem werden Tumorlokalisierungstechniken, die nachweisbar markierte Somatostatin-Analoga verwenden, durch die Menge des detektierbaren Markers, die mit jedem Analogon assoziiert werden kann, die Stärke des pro Analogon-Molekül erzeugten Signals und die Sensitivität von verfügbaren Marker-Nachweistechniken begrenzt. Diagnostische und therapeutische Verfahren, die eine sehr spezifische und sensitive Identifizierung von Tumorzellen sowie eine weniger invasive Krebstherapie ermöglichen, sind absolut erforderlich.
Man fand heraus, dass Scmatostatin-Peptid-Analoga durch das Anfügen von N-terminalen Aminosäuren modifiziert werden können, ohne die Fähigkeit der Verbindung zu beeinträchtigen, an Somatostatin-Rezeptoren zu binden. Die N-terminalen Erweiterungen können linear oder verzweigt sein und können mehrere L-, D- oder Desamino-Tyrosinreste enthalten.
Entsprechend betrifft die Erfindung Verfahren und Zusammensetzungen zur Diagnose und Behandlung von Krankheiten, die in Zusammenhang stehen mit (1) einer abweichenden Expression eines Somatostatin-Rezeptors (wie Krebs) oder (2) einer erhöhten Produktion von (einem) durch Somatostatin regulierbaren Faktor(en) (wie Acromegalie).
In einem Aspekt betrifft die Erfindung eine Verbindung der Formel:
a) (Y)n+1 P.
b) (Y)n-Ala-Y-P, oder
(c)
worin P ein Somatostatin-Peptid-Analogon ist, das an einen Somatostatin-Rezeptor bindet, Y ein D-Tyrosin-, L-Tyrosin- oder Desamino-Tyrosinrest ist, n eine ganze Zahl von einschließlich 1 bis 32 ist, jedes q unabhängig eine ganze Zahl von einschließlich 1 bis 32 ist, jedes s unabhängig eine ganze Zahl von einschließlich 1 bis 32 ist und q und s gleich oder verschieden sein können und X die Formel
D-NH&sub2;CH(CH&sub2;)mNH&sub2;-CO&sub2;H oder
L-NH&sub2;CH(CH&sub2;)mNH&sub2;CO&sub2;H,
hat, worin m eine ganze Zahl von einschließlich 1 bis 10 ist. Vorzugsweise besitzt P die Formel
a) Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH&sub2;,
b) Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH&sub2; oder
c) Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr(ol).
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist X ein Lysinrest. Vorzugsweise enthält die Verbindung wenigstens ein Halogenatom, das an einen Tyrosinrest (Y in der vorstehenden Formel) der Verbindung gebunden ist. Vorzugsweise ist das Halogenatom radioaktiv markiert.
Bevorzugte Verbindungen haben eine der folgenden Formeln:
oder
f)
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können einem pharmazeutisch verträglichen Träger beigemischt werden, um eine pharmazeutische Zusammensetzung herzustellen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zur in vivo-Detektion eines Tumors verwendet werden, der einen Somatostatin-Rezeptor exprimiert, durch: 1) Verabreichung einer Menge einer radioaktiv markierten erfindungsgemäßen Verbindung an einen Patienten, die an Somatostatin-Rezeptoren auf Krebszellen in dem Patienten bindet, und 2) Nachweis der von der an den Krebszellen gebundenen radioaktiv markierten Verbindung abgestrahlten radioaktiven Strahlung.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können ebenfalls zur Diagnose einer mit einer abweichenden Expression eines Somatostatin-Rezeptors und der Produktion eines biochemischen Markers in Verbindung stehenden Krankheit (z. B. Krebs, wie Gastrinom) verwendet werden, durch: a) Verabreichung einer Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung an einen Patienten, die die Produktion eines biochemischen Markers, der mit der Krankheit in Verbindung steht, hemmt; und 2) Bestimmung der Menge des biochemischen Markers, die nach Verabreichung der Verbindung produziert wird im Vergleich mit der Menge des biochemischen Markers, die vor der Verabreichung der Verbindung produziert wird; eine Verringerung der Menge des biochemischen Markers (im Vergleich zu der Menge des biochemischen Markers vor Verabreichung der Verbindung) weist auf eine Krankheit hin, die mit einer abweichenden Expression eines Somatostatin-Rezeptors in Verbindung steht und/oder durch Verabreichung von Somatostatin oder einem Somatostatin-Analogon kontrollierbar ist.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können ebenfalls für die Behandlung eines Patienten verwendet werden, der an einer Krankheit leidet, die mit einer abweichenden Expression eines Somatostatin-Rezeptors in Verbindung steht (wie Krebs), durch Verabreichung einer Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung an den Patienten, die an Somatostatin- Rezeptoren von Zellen bindet, die die Rezeptoren abweichend exprimieren.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können ebenfalls für die Behandlung eines Patienten verwendet werden, der an einer Krankheit leidet, die mit einer abweichend erhöhten Produktion von (einem) Faktor(en) in Verbindung steht, die/der durch Somatostatin regulierbar ist/sind, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung an den Patienten (wie Acromegalie).
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind ebenfalls für die in vitro-Diagnose eines Tumors hilfreich, der mit einer abweichenden Expression eines Somatostatin-Rezeptors in Verbindung steht, durch: a) Gewinnung einer Gewebeprobe aus einem Patienten, wobei das Gewebe im Verdacht steht, einen Somatostatin-Rezeptor abweichend zu exprimieren, b) Kontaktieren der Probe mit einer nachweisbar markierten erfindungsgemäßen Verbindung, um eine Bindung der Verbindung an Somatostatin-Rezeptoren der Probe zu erlauben, und c) Messung der Bindung des Markers an die Probe. Eine signifikant stärkere Bindung des Markers an die Probe im Vergleich mit einer negativen Kontrollprobe (z. B. mehr als zweifach) weist auf einen Tumor hin, der mit einer abweichenden Expression eines Somatostatin-Rezeptors in dem Patienten in Verbindung steht.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum in situ-Nachweis eines einen Somatostatin-Rezeptor exprimierenden Tumors, umfassend: 1) Verabreichung einer Menge einer radioaktiv markierten erfindungsgemäßen Verbindung an einen Patienten, die an Somatostatin-Rezeptoren auf Krebszellen des Patienten bindet, und 2) Nachweis der von der radioaktiv markierten, an die Krebszellen gebundenen Verbindung abgestrahlten Strahlung.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer Krankheit, die mit einer abweichenden Expression eines Somatostatin-Rezeptors und der Produktion eines biochemischen Markers in Verbindung steht (z. B. Krebs wie neuroendokrine Tumore und Gastrinome und Krankheiten wie Acromegalie). Dieses diagnostische Verfahren umfaßt: a) Verabreichung einer Menge der erfindungsgemäßen Verbindung an einen Patienten, die die Produktion eines mit der Krankheit in Verbindung stehenden biochemischen Markers hemmt, und 2) Bestimmung der nach der Verabreichung der Verbindung produzierten Menge des biochemischen Markers im Vergleich zu der Menge des biochemischen Markers, die vor der Verabreichung der Verbindung produziert wurde. Eine Verringerung der Menge des biochemischen Markers (im Vergleich zur Menge des biochemischen Markers vor der Verabreichung der Verbindung) weist auf eine Krankheit hin, die mit einer abweichenden Expression eines Somatostatin-Rezeptors in Verbindung steht.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur in vitro-Diagnose eines mit der abweichenden Expression eines Somatostatin-Rezeptors in Verbindung stehenden Tumors, umfassend: a) Erhalten einer Gewebeprobe eines Patienten, wobei das Gewebe im Verdacht steht, einen Somatostatin-Rezeptor abweichend zu exprimieren, b) Kontaktieren der Probe mit einer erfindungsgemäßen nachweisbar markierten Verbindung, um eine Bindung der Verbindung an die Somatostatin-Rezeptoren der Probe zu erlauben, und c) Nachweis des Bindungsgrades des Markers an die Probe. Ein Bindungsgrad des Markers an die Probe, der signifikant höher als ein Bindungsgrad mit einer negativen Kontrollprobe ist, weist auf einen Tumor hin, der mit der abweichenden Expression eines Somatostatin-Rezeptors in dem Patienten in Verbindung steht.
"Somatostatin-Analogon" oder "Somatostatin-Peptid-Analogon" bedeutet hier ein strukturelles Derivat von nativem Somatostatin, das an einen Somatostatin-Rezeptor mit wenigstens etwa 5% der Avididät und/oder Affinität von nativem Somatostatin bindet. Analoga beinhal ten sowohl Somatostatin-Antagonisten als auch -Agonisten. Somatostatin-Peptid-Analoga, im allgemeinen, (1) enthalten die Aminosäuresequenzen Cys-X&sub1;-D-Trp-Lys-X&sub2;-Cys-Thr oder ein Derivat davon mit einer substituierten D-Aminosäure (d. h. jede der Aminosäuren kann ein D-Isomer sein), worin X&sub1; vorzugsweise Phe oder Tyr und X&sub2; vorzugsweise Thr oder Val ist, und 2) besitzen ein Molekulargewicht von etwa 1000 Da bis 15.000 Da.
"Halogen" oder "Halogenatom" bedeutet hier Fluor, Chlor, Brom, 10d oder Astatin.
"Abweichende Expression eines Somatostatin-Rezeptors" bedeutet hier die signifikarit höhere Expression eines Somatostatin-Rezeptors auf der Oberfläche eines spezifischen normalen Zelltyps als normalerweise auf diesem spezifischen normalen Zelltyp. Zum Beispiel exprimieren als Neuroblastome bezeichnete Tumore abweichend Somatostatin- Rezeptoren dadurch, dass die Zellen eines Neuroblastoms eine höhere Expression des Somatostatin-Rezeptors auf der Oberfläche aufweisen als das Nervengewebe, von dem das Neuroblastom abstammt. Abweichende Zelloberflächen-Expression kann durch eine Reihe von Mechanismen erfolgen, wie Steigerung von Transkription und Translation von Somatostatin-Rezeptoren kodierenden Nukleinsäure, Steigerung einer Oberflächen-Präsentation und/oder Absenkung des Rezeptorabbaus und/oder erhöhte Internalisierung.
"Biochemischer Marker" bedeutet hier ein Hormon, Peptid, Protein oder eine andere biologische Substanz, die mit einem spezifischen biologischen Phänomen (wie Zellteilung, Zellbeweglichkeit, Tumor-Metastatisierung) oder Zelltyp (wie einer neuroendokrinen Zelle, endokrinen Zelle, Tumorzelle) in Verbindung steht.
"Eine Krankheit, die mit einer abweichend erhöhten Produktion eines durch Somatostatin regulierbaren Faktors in Verbindung steht" bedeutet eine Krankheit, die durch die Produktion von (einem) Somatostatin regulierbaren Faktor(en) charakterisiert ist, wobei die Produktion signifikant erhöht ist im Vergleich zur Produktion des gleichen Faktors, falls keine Krankheit vorliegt. Acromegalie, die mit einer Überproduktion des Somatostatin regulierbaren Faktors, Wachstumshormon und Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor-1 in Verbindung steht, ist ein Beispiel einer derartigen Krankheit:
"Durch Somatostatin regulierbarer Faktor" bedeutet jedes Hormon, Peptid, Protein oder andere biologische Substanz, dessen Expression und/oder Sekretion in Anwesenheit von Somatostatin erniedrigt oder gehemmt ist. Beispiele von Somatostatin regulierbaren Fakto ren beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf Wachstumshormon, Adrenokortikotropin (ACTH), Prolaktin, Thyroida-stimulierendes Hormon, Insulin, Glukagon, Motilin, gastrisches inhibitorisches Peptid (GIP), vasoaktives intestinales Peptid (VIP), Sektretin, Cholecystokinin (CCK), Bombesin, Thyroida-freisetzendes Hormon (THR), Aldosteron, Cytokine (wie Interleukine, Interferone), Wachstumsfaktoren (wie epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Nervenwachstumsfaktor (NGF)), Gastrin und Gastrin-freisetzendes Peptid (GRP).
"Pharmazeutische Zusammensetzung" bedeutet hier eine Zusammensetzung, die für eine Verabreichung an einen Patienten für ein Diagnose- oder Behandlungsverfahren geeignet ist.
"Therapeutisch wirksame Menge" bedeutet hier eine Menge einer Zusammensetzung, die wirksam bei der Behandlung einer Krankheit ist, die mit einer abweichend erhöhten Produktion eines durch Somatostatin regulierbaren Faktors oder einer abweichenden Expression eines Somatostatin-Rezeptorsin Verbindung steht, insbesondere ein Tumor mit Rezeptoren, die von dem verabreichten mehrfach-tyrosinierten Peptid gebunden werden können.
Ein Vorteil der Erfindung ist, dass viele Radioisotop-Atome an ein einziges mehrfach-tyrosiniertes Somatostatin-Analogon (d. h. eine erfindungsgemäße Verbindung) gebunden werden können. Bei der Bindung eines Somatostatin-Rezeptors liefern diese mehrfach-markierten Analoga eine Vielzahl von Radioisotope (gleicher oder verschiedener Elemente und/oder mit gleicher oder verschiedener Energie) an einen einzigen Rezeptor und stellen so eine stärkere Strahlendosis an der zu therapierenden Stelle und ein stärkeres radioaktives Signal für diagnostische Radiolokalisierungstechniken mit einer erhöhten Sensitivität bereit.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Vorteil ist, dass mehrfach-tyrosinierte Somatostatin-Analoga erhöhte Halbwertszeiten in vivo im Vergleich zu konventionellen Somatostatin-Analoga haben, resistent gegenüber enzymatischem Abbau sind und einen erhöhten Übertritt über die Blut-Hirn-Schranke aufweisen.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Vorteil ist, dass mit Hallogenatomen versehene mehrfachtyrosinierte Somatostatin-Analoga irreversibel Somatostatin-Rezeptoren binden und somit einen Nachweis des gebundenen Analogons über eine längere Zeit erlauben im Vergleich zu reversibel-bindenden Analoga.
Weitere erfindungsgemäße Merkmale und Vorteile werden durch nachfolgende Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und aus den Ansprüchen deutlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1A-D sind Diagramme, die Somatostatin-Rezeptor-Bindekurven für natives Somatostatin (Fig. 1A), WOC-2A (Fig. 1 B) und WOC3B (Fig. 1 C) zeigen sowie eine zusammengesetzte Kurve (Fig. 1 D). Die zusammengesetzte Kurve zeigt die relativen Bindeaffinitäten von nativem Somatostatin (offene Quadrate), WOC-2A (geschlossene Kreise), WOC-3B (offene Rauten) und Lanreotid (offene Dreiecke).
Erfindungsgemäße mehrfach-tyrosinierte Somatostatin-Analoga binden an Somatostatin- Rezeptoren mit im wesentlichen der gleichen Affinität wie natives Somatostatin. Die mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga können durch Halogenierung der Tyrosinreste der Verbindung modifiziert sein. Derartige halogenierte erfindungsgemäße Analoga binden an Somafostatin-Rezeptoren mit einer derart hohen Affinität, dass die Bindung nahezu irreversibel unter physiologischen Bedingungen erfolgt. Die erfindungsgemäßen mehrfach-tyrosinierten Analoga können weiter durch einen detektierbaren Marker modifiziert sein, wie durch die Bindung eines Radioisotops (wie ¹²&sup5;I, ¹²&sup7;I, ¹²³I, ¹²&sup9;I, ¹³¹I) an die Tyrosinreste und/oder Bindung von anderen Verbindungen (z. B. eines Fluorochroms wie Fluorescein) an einen Lysinrest des Analogons, insbesondere an ein Analogon mit einer verzweigten, Lysine-enthaltenden N-terminalen Verlängerung.
Die mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga und deren halogenierte Derivate können in einer Vielzahl von diagnostischen und therapeutischen Verfahren verwendet werden. Beispielhafte Verwendungen der erfindungsgemäßen Analoga sind nachstehend kurz zusammengefaßt.

Zusammenfassung der erfindungsgemäßen diagnostischen und therapeutischen Verfahren

I. Diagnose und Behandlung von Krankheiten, die mit einer abweichenden Somatostatin-Rezeptorexpression und Produktion eines biochemischen Markers in Verbindung stehen

Die mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga können für eine Diagnose von Krankheiten verwendet werden, die mit einer abweichenden Expression eines Somatostatin-Rezeptors und einhergehender Produktion eines biochemischen Markers in Verbindung stehen. Falls eine Verabreichung des mehrfach-tyrosinierten Analogons zu einer Absenkung der Menge des biochemischen Markers im Vergleich zu der Menge des biochemischen Markers vor der Verabreichung des Analogons führt, leidet der Patient an einer Krankheit, die mit einer abweichenden Expression eines Somatostatin-Rezeptors in Verbindung steht. Das mehrfachtyrosinierte Analogon kann unmodifiziert oder durch Halogenierung modifiziert sein. Vorzugsweise ist das Analogon halogeniert und nicht radioaktiv.
Mehrfach-tyrosinierte Somatostatin-Analoga und ihre halogenierte Derivate können ebenfalls für die Behandlung von Patienten verwendet werden, die an einer Krankheit leiden, die mit einer abweichenden Expression eines Somatostatin-Rezeptors und/oder abweichend erhöhten Produktion von (einem) Faktor(en) in Verbindung stehen, der/die durch Somatostatin regulierbar ist/sind. Das in diesem therapeutischen Verfahren verabreichte Analogon kann modifiziert oder nicht modifiziert sein. Vorzugsweise ist das Analogon halogeniert und nicht radioaktiv.

II. Diagnose und Behandlung von Somatostatin-Rezeptor-exprimierenden Tumoren

Radioaktiv markierte Derivate der erfindungsgemäßen mehrfach-tyrosinierten Somatostatin- Analoga können für den Nachweis und die Diagnose von Tumoren verwendet werden, die Somatostatin-Rezeptoren exprimieren. Diese diagnostischen Verfahren können durchgeführt werden: 1) in vivo, 2) in situ oder 3) in vitro.
Die in vivo-diagnostischen Verfahren umfassen Verabreichung eines radioaktiv markierten mehrfach-tyrosinierten Analogons, vorzugsweise ein mit ¹²³I oder ¹³¹I radioaktiv markiertes Analogon und Nachweis des den Somatosfatin-Rezeptor exprimierenden Gewebes durch bekannte in vivo-Darstellungstechniken (wie scintigraphische Verfahren der Nuklearmedizin).
Die in situ-diagnostischen Verfahren umfassen Verabreichung eines radioaktiv markierten mehrfach-tyrosinierten Analogons, vorzugsweise ein mit ¹²&sup5;I radioaktiv markiertes Analogon unmittelbar vor oder während der operativen Beseitigung des Tumors. Das Somatostatin- Rezeptoren-exprimierende Gewebe wird direkt in dem Patienten während der operativen Behandlung nachgewiesen und Gewebe mit einer signifikanten Menge an gebundenem radioaktiven Marker wird herausgeschnitten.
Das in vitro-diagnostische Verfahren wird z. B. an einer Gewebebiopsieprobe durchgeführt durch Kontaktieren der Probe mit einem nachweisbar markierten mehrfach-tyrosinierten Analogon.
Im allgemeinen weist eine im Vergleich zu einer negativen Kontrolle (wie normales Gewebe (in vivo) oder eine gesättigte normale Gewebeprobe (in vitro)) stärkere Bindung des Analogons an ein Gewebe auf einen Tumor hin, der mit einer abweichenden Expression eines Somatostatin-Rezeptors in Verbindung steht. Patienten mit Somatostatin-Rezeptor-exprimierenden Tumoren, nachgewiesen durch vorstehend beschriebene Verfahren oder durch konventionelle diagnostische Verfahren, können mit einem erfindungsgemäßen radioaktiv markierten mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analogon, vorzugsweise einem mit ¹³¹I radioaktiv markierten Analogon, behandelt werden. Jede dieser Verwendungen für mehrfach-tyrosinierte Somatostatin-Analoga wird detailliert nachstehend beschrieben. Die Synthese und Modifikation der erfindungsgemäßen Analoga wird allgemein zuerst beschrieben.

Synthese von mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga

Die Formel der erfindungsgemäßen mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga kann auf der Aminosäuresequenz oder auf einem Derivat der Aminosäuresequenz eines jeden der Vielzahl von käuflichen Somatostatin-Peptid-Analoga oder anderen bekannten Somatostatin- Peptid-Analoga beruhen (vgl. z. B. die Somatostatin-Analoga, beschrieben in der PCT- Anmeldung WO 91/09056 (1991), PCT-Anmeldung WO 91/0114 (1991), EP-A1-0 505 680 (1992), EP-A2-0 363 589 (1990), EP-A2-0 2203 031 (1986), EP-A1-0 588 754, US-PSen 4,904,642 (1990), 4,871,717 (1989), 4,853,371 (1989), 4,725,577 (1988), 4,684,620 (1987), 4,650,787 (1987), 4,603,120 (1986), 4,585,755 (1986), 4,522,813 (1985), 4,486,415 (1984), 4,485,101 (1984), 4,435,385 (1984), 4,395,403 (1983), 4,369,179 (1983), 4,360,516 (1982), 4,358,439 (1982), 4,328,214 (1982), 4,316,890 (1982), 4,310,518 (1982), 4,291,022 (1981), 4,328,481 (1980), 4,235,886 (1980), 4,224,190 (1980), 4,211,693 (1980), 4,190,648 (1980), 4,146,612 (1979), 4,133,782 (1979), Van Binst et al., Peptide Res. 5 : 8 (1992), Prevost et al., Cancer Res. 52 : 893 (1992) und Bachem California 1993-1994, Katalog 94-95 (1993).
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden durch N-terminale Verlängerung von Somatostatin-Peptid-Analoga wie den vorstehend exemplarisch beschriebenen hergestellt. Die N-terminale Verlängerung kann entweder ein lineares, symmetrisch verzweigtes oder asymmetrisch verzweigtes Peptid sein. Obwohl die Gesamtzahl an Tyrosinresten in der Nterminalen Verlängerung variieren kann, enthält sie wenigstens zwei Tyrosinreste, vorzugsweise wenigstens drei Tyrosinreste, insbesondere wenigstens vier Tyrosinreste und insbesondere wenigstens acht Tyrosinreste und kann bis zu 32 Tyrosinreste oder mehr enthalten.
Erfindungsgemäße am N-Terminus erweiterte, mehrfach-tyrosinierte Somatostatin-Analoga besitzen die allgemeine Formel:
a) (Y)n+1P,
b) (Y)n-Ala-Y-P, oder
c) (Y)
worin a) P ein Somatostatin-Peptid-Analogon ist, das an einen Somatostatin-Rezeptor bindet, b) Y ein D-Tyrosin-, L-Tyrosin- oder Desamino-Tyrosinrest ist, c) n eine ganze Zahl von einschließlich 1 bis 32 ist, vorzugsweise einschließlich 1 bis 16, insbesondere einschließlich 1 bis 3, d) jedes q unabhängig eine ganze Zahl von einschließlich 1 bis 32 ist, vorzugsweise einschließlich 1 bis 16, insbesondere einschließlich 1 bis 4 und e) jedes s unabhängig eine ganze Zahl von einschließlich 1 bis 32 ist, vorzugsweise einschließlich 1 bis 16, insbesondere einschließlich 1 bis 4, wobei q und s gleich oder verschieden sein können und f) X der folgenden Formel entspricht
DNH&sub2;CH(CH&sub2;)mNH&sub2;C&sub2;OH Oder
L-NH&sub2;OH(CH&sub2;)mNH&sub2;-COZH,
in der m eine ganze Zahl von einschließlich 1 bis 10 ist.
Vorzugsweise besitzt das Somatostatin-Analogon "P" in der vorstehend beschriebenen Formel die Formel
a) Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH&sub2;, (ein Derivat von LANREOTIDE®),
b) Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH&sub2; (ein Derivat von Octreotidacetat) oder
c) Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr(ol) (ein Derivat von Octreotidacetat).
Die Fähigkeit der mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga, an Somatostatin-Rezeptoren zu binden und als Somatostatin-Rezeptor-Agonisten oder -Antagonisten zu wirken, kann in vitro durch bekannte Verfahren beurteilt werden (vgl. z. B. O'Dorisio, M. S., et al., Cell Growth and Differentiation 5: 1-8, 1994). Die Aktivitäten der Analoga in derartigen in vifro- Tests sind ein Indiz für die Aktivitäten der Analoga in vivo.

Modifikation von mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga

Die mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga können durch kovalente Bindung eines nicht-radioaktiven Halogenatoms (wie Fluor, Chlor, Brom, 10d oder Astatin), eines Fluorochroms oder eines Radioisotops (vorzugsweise ein Radioisotop eines Halogens) an einen Tyrosinrest der N-terminalen Verlängerung des Analogons modifiziert werden.
Falls das mehrfach-tyrosinierte Somatostatin-Analogon durch Bindung eines nichtradioaktiven Halogenatoms an einen Tyrosinrest der N-terminalen Verlängerung modifiziert ist, ist das Halogen vorzugsweise 10d. Erfindungsgemäße halogenierte Analoga enthalten ein kovalent an wenigstens einen Tyrosinrest und vorzugsweise an mehrere Tyrosinreste in jedem Molekül gebundenes Halogen. Vorzugsweise sind etwa die Hälfte, besser etwa drei Viertel, am besten alle Tyrosinreste der N-terminalen Verlängerung des Analogons an ein radioaktives oder nicht-radioaktives Halogenatom gebunden. Erfindungsgemäße mehrfachhalogenierte Analoga können eine verlängerte Halbwertszeit im Vergleich zu nicht modifizierten Somatostatin-Analoga aufweisen. Mehrfach-halogenierte Analoga können auch einen verstärkten Übertritt über die Blut-Hirn-Schranke im Vergleich zu nicht modifizierten Somatostatin-Analaga zeigen. Eine Halogenierung erhöht die Lipophilizität des Moleküls, was wiederum eine Überschreitung der Bluf-Hirn-Schranke verstärkt (Banks et al., Brain Res. Bull. 15: 287-292, 1985). Verfahren zur Halogenierung von Peptiden sind bekannt (vgl. z. B. Parker, Radioimmunoassay of Biologically Active Compounds, Prentice Hall, 1976, Kapitel 5).
Die erfindungsgemäßen mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga können nachweisbar durch Bindung eines Fluorochroms an einen Aminrest des Analogons markiert sein. Zum Beispiel kann das Fluorochrom (wie Fluoresceinisothiocyanat) spezifisch an Lysinreste des Analogons gebunden sein. Mehrfach mit Fluorescein markierte Somatostatin-Analoga, insbesondere mehrfach-tyrosinierte Analoga mit vielen Lysinresten (wie in einer verzweigten Nterminalen Verlängerung) können zum Nachweis der Oberflächenexpression von Somatostatin-Rezeptoren in einer Vielzahl von diagnostischen und wissenschaftlichen Anwendungen hilfreich sein, z. B., falls das mehrfach mit Fluorescein versehene Analogon mit einer gemischten Population von Zellen inkubiert wird und eine Zell-Subpopulation von Somatostatin-Rezeptor-exprimierenden Zellen mittels FACS (Fluoreszenz-vermittelte Zelisortierung) durch bekannte Verfahren isoliert wird.
Radioisotope zur radioaktiven Markierung der erfindungsgemäßen mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga beinhalten jegliches Radioisotop, das kovalent an einen Tyrosinrest des Analogons gebunden werden kann. Die Radioisotope können entweder β- oder γ-Strahlung emittieren, vorzugsweise γ-Strahlung. Zusätzlich oder als Alternative können die mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga durch Chelatgruppen modifiziert sein, die z. B. kovalent an (einen) Lysinrest(e) des Analogons gebunden werden können. Die Chelatgruppen können sodann mit einem jeglichen der verschiedenen Radioisotope modifiziert werden, wie Gallium, Indium, Technetium, Ytterbium, Rhenium oder Tallium (wie I, &sup6;&sup7;Ga, ¹¹¹In, &sup9;&sup9;mTc, ¹&sup6;&sup9;Yb, ¹&sup6;&sup6;Re).
Falls das mehrfach-tyrosinierte Somatostatin-Analogon durch Anbindung eines Radioisotops modifiziert wird, sind die bevorzugten Radioisotope die mit einer radioaktiven Halbwertszeit entsprechend oder länger als der biologischen Halbwertszeit des verwendeten Analogons. Insbesondere ist das Radioisotop ein Radioisotop eines Halogenatoms (wie ein Radioisotop von Fluor, Chlor, Brom, 10d und Astatin), insbesondere ein Radioisotop von 10d und insbesondere ¹²³I, ¹²&sup4;I, ¹²&sup5;I, ¹²&sup9;I oder ¹³¹I. Vorzugsweise besitzt das Radioisotop eine Halbwertszeit von etwa 1 Stunde bis 60 Tage, insbesondere 5 Stunden bis 10 Tage und insbesondere 12 Stunden bis 8 Tage.
Das spezifische Analogon und der radioaktive Marker werden gemäß des verwendeten diagnostischen oder therapeutischen Verfahrens ausgewählt, entsprechend, ob das diagnostische Verfahren in vivo, in situ oder in vitro durchgeführt wird und entsprechend der vermuteten Lokalisierung des Tumors (wie Leber, Lunge, Pankreas, Gehirn), des Metabolismus des gewählten Analogons und des verwendeten Verfahrens zum Nachweis des gebundenen radiomarkierten Analogons. Zum Beispiel sind Isotope mit niedriger Energie bevorzugt, falls das diagnostische Verfahren in situ durchgeführt wird (d. h., der radioaktive Marker wird direkt in den Geweben des Patienten während des operativen Eingriffs nachgewiesen), insbesondere Isotope, die β- oder γ-Photonen mit einer Energie von weniger als etwa 300 kev emittieren, vorzugsweise weniger als etwa 150 kev, insbesondere weniger als 50 kev. Der bevorzugte Radiomarker für eine in situ-Diagnose ist ¹²&sup5;I. Falls der Radiomarker durch Nuklearmedizin-Scintigraphie (d. h. Nuklearmedizin-Scanning) nachgewiesen wird, ist '231 ein bevorzugter Radiomarker. Falls das Analogon als therapeutische Substanz verwendet werden soll (wie in der Radiotherapie) sind ¹²&sup9;I und ¹³¹I bevorzugte Radiomarker.
Erfindungsgemäße radioaktiv markierte Analoga besitzen wenigstens einen Tyrosinrest mit einem kovalent gebundenen Radioisotop. Falls das mehrfach-tyrosinierte Somatostatin- Analogon viele Tyrosinreste enthält, kann das Analogon radioaktiv markiert werden, so dass etwa ein Drittel der Tyrosinreste, vorzugsweise etwa die Hälfte, noch besser etwa drei Viertel und am besten alle Tyrosinreste in der N-terminalen Verlängerung des Analogons an das Radioisotop gebunden sind. Radioaktiv markierte mehrfach-tyrosinierte Somatostatin-Analoga können viele an ein einziges Analogon gebundene Radioisotope enthalten, z. B. durch Bindung von Radioisotopen an viele Tyrosinreste und/oder Bindung von bis zu zwei Halogen-Radioisotopen pro Tyrosinrest, was viele Radioisotop-Atome an einen einzigen Somatostatin-Rezeptor bringt. Da ein einfach halogenierter Tyrosinrest im allgemeinen stabiler ist als ein zweifach halogenierter Tyrosinrest, sind mehrfach-tyrosinierte Somatostatin-Analoga mit einfach halogenierten Tyrosinresten bevorzugt. Analoga mit 1) mehreren Tyrosinresten und 2) bis zu zwei an jeden Tyrosinrest gebundenen Halogen-Radioisotop-Atomen sorgen für ein im Vergleich zum Hintergrundrauschen starkes Signal in Nachweisverfahren und sind gute radiotherapeutische Wirkstoffe in der Krebstherapie. Verfahren zur Radiomarkierung von Peptiden sind bekannt.

Pharmazeutische Zusammensetzungen mit mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga

Pharmazeutische Zusammensetzungen mit einem mehrfach-tyrosinierten Analogon, die für eine Verwendung in den erfindungsgemäßen diagnostischen und therapeutischen Verfahren geeignet sind, werden in an sich bekannter Weise hergestellt. Im allgemeinen sind die pharmazeutischen Zusammensetzungen injizierbare Formulierungen mit wenigstens einem mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analogon und einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Der pharmazeutisch verträgliche Träger kann jeder bekannte Träger sein und wird gemäß Faktoren wie dem Verabreichungsweg, dem verwendeten diagnostischen oder therapeutischen Verfahren und dem zu verabreichenden Analogon ausgewählt.
Im allgemeinen ist die Konzentration des mehrfach-tyrosinierten Analogons in der pharmazeutischen Zusammensetzung ausreichend, um mit einer einzigen Dosis eine Menge des Analogons zu liefern, die an Somatostatin-Rezeptoren auf dem Zielgewebe bindet. Spezifische Dosierungen werden abhängig von verschiedenen Faktoren unterschiedlich sein, einschließlich des verwendeten diagnostischen oder therapeutischen Verfahrens, des verwendeten mehrfach-tyrosinierten Analogons (wie die spezifische Aktivität, die Bindeaffinität oder Avidität an den Somatostatin-Rezeptor, das Molekulargewicht, die Anzahl von an das Analogon gebundenen Radioisotop-Atomen), des Verabreichungsweges, der zu behandelnden Krankheit und Patienten-abhängiger Faktoren wie Alter, Gewicht und Stärke der Krankheit. Zum Beispiel beeinträchtigt die Ausscheidung von radioaktiv markierten Analoga die Effizienz einer Lokalisierung kleiner Tumore, insbesondere im oberen Abdomen. Im allgemeinen werden mit ¹²³I, ¹²&sup5;I oder ¹³¹I radioaktiv markierte Analoga primär durch die Galle und sodann den Darm ausgeschieden.
Eine Orientierung für Dosen, die für die spezifischen erfindungsgemäßen diagnostischen und therapeutischen Verfahren geeignet sind, wird nachstehend in der Beschreibung für jedes Verfahren bereitgestellt. Spezifische Dosen für mehrfach-tyrosinierte Analoga können auf den Dosen, die für herkömmliche Somatostatin-Analoga wie LANREOTIDE® und Octreotidacetat verwendet werden, basieren (vgl. z. B. EP 0 588 754, veröffentlicht am 23. März 1994). Falls das Analogon verabreicht wird, um Wildtyp-Somatostatinmengen vorzutäuschen, wird das Analogon so verabreicht, dass Blutkreislaufmengen im Picogramm- bis Nanogrammbereich erreicht werden. Dosismengen für mehrfach-tyrosinierte Somatostatin- Analoga sind im allgemeinen niedriger als die für herkömmliche Somatostatin-Analoga erforderlichen aufgrund der Fähigkeit, viele Halogenatome und Radioisotope an die N-terminale Verlängerung der mehrfach-tyrosinierten Analoga zu binden, der relativen Affinität und/oder Avidität der mehrfach-tyrosinierten Analoga für Somatostatin-Rezeptoren und/oder der erhöhten Halbwertszeit von mehrfach-tyrosinierten Analoga.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können zusätzlich zu den mehrfach-tyrosinierten Analoga Verbindungen enthalten. Zum Beispiel können die pharmazeutischen Zusammensetzungen Verbindungen enthalten, die eine Erleichterung der mit der zu behandelnden Krankheit verbundenen Symptome ermöglichen (wie schmerzlindernde Verbindungen, entzündungshemmende Stoffe, usw.). Falls das mehrfach-tyrosinierte Analogon radioaktiv markiert ist, kann die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich Verbindungen enthalten, die die Stabilität des Analogons erhöhen, wie durch eine Verhinderung von Autoradiolyse. Derartige Verbindungen beinhalten Fänger freier Radikale wie Ascorbinsäure, Benzoesäure, 2,5-Dihydroxybenzoesäure. Autoradiolyse kann ebenfalls durch Verdünnung verhindert werden, d. h. Aufbewahrung der radioaktiv markierten Analoga bei niedrigeren Konzentrationen.

Für eine Diagnose mit mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga zugängliche Krankheiten

Die erfindungsgemäßen mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga können für die Diagnose von Krankheiten verwendet werden, die mit einer abweichenden Expression eines Somatostatin-Rezeptors und/oder abweichenden Produktion eines Somatostatin-regulierbaren Faktors in Verbindung stehen. Diese zwei allgemeinen Klassen von Krankheiten schließen sich nicht gegenseitig aus. Zum Beispiel stehen verschiedene endogene Krebsarten in Verbindung mit einer abweichenden Produktion von Somatostatin regulierbaren Faktoren und mit einer abweichenden Somatostatin-Rezeptorexpression. Im Gegensatz dazu begleitet eine abweichende Produktion eines Somatostatin regulierbaren Faktors nicht notwendigerweise alle Krankheiten, die mit einer abweichenden Somatostatin-Rezeptorexpression in Verbindung stehen.
Krankheiten, die mit einer abweichend erhöhten Produktion eines durch Somatostatin regulierbaren Faktors in Verbindung stehen, beinhalten alle Krankheiten, die durch eine signifikant höhere Produktion eines Somatostatin regulierbaren Faktors charakterisiert sind im Vergleich zur Produktion des gleichen Faktors, falls die Krankheit nicht vorliegt. Beispiele derartiger Krankheiten beinhalten Krebs, Acromegalie und Sarkoidose. Somatostatin-regu lierbare Faktoren beinhalten jegliches Hormon, Peptid, Protein oder ein anderes biologisches Produkt, dessen Expression und/oder Sekretion in Anwesenheit von Somatostatin verringert oder gehemmt wird. Beispiele Somatostatin regulierbarer Faktoren beinhalten Wachstumshormone, Adrenokortikotropin (ACTH), Prolaktin, Thyroida-stimulierendes Hormon, Insulin, Glukagon, Motilin, gastrisches inhibitorisches Peptid (GIP), vasoaktives intestinales Peptid (VIP), Sektretin, Cholecystokinin (CCK), Bombesin, Thyroida-freisetzendes Hormon (TRH), Aldosteron, Cytokine (wie Interleukine, Interferone), Wachstumfaktoren (wie Epidermis- Wachstumsfaktor, neuronaler Wachstumsfaktor), Gastrin, pankreatisches Polypeptid (PP) und Gastrin-freisetzendes Peptid (GRP).
In Verbindung mit einer abweichenden Expression eines Somatostatin-Rezeptors in Verbindung stehende Krankheiten sind ebenfalls mittels der erfindungsgemäßen mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga einer Diagnose und Therapie zugänglich. In Verbindung mit einer abweichenden Expression eines Somatostatin-Rezeptors in Verbindung stehende Krankheiten beinhalten alle Krankheiten, wo ein spezifischer Zelltyp einen Somatostatin- Rezeptor signifikant stärker exprimiert als normalerweise bei dem spezifischen Zelltyp. Beispielhafte Krankheiten, die abweichend Somatostatin-Rezeptoren exprimieren, beinhalten verschiedene Typen fester oder nicht-fester Tumore und endokrine Tumore. Beispiele von Tumoren, die erfindungsgemäß diagnostiziert und behandelt werden können, beinhalten Hypophysentumore, Tumore des zentralen Nervensystems, Gehirntumore, Brusttumore, Ovartumore, Prostatatumore, Nierentumore, Tumore des Gastrointestinaltrakts (Dickdarm, Pankreas, Magen), Lungentumore (wie Bronchoalveolärkarzinom, kleinzelliges Karzinom), Myelome, Lymphome (wie Nicht-Hodgkins Lymphom und Hodgkins Lymphom), neuroendokrine Tumore (wie Karzinoid, ViPom, Insulinom, Glucagonom, Mark-Thyroidea-Karzinom, Gastrinom, Pheochromozytom, Hypophysentumore), Tumore des Nervensystems (wie Neuroblastom, Gliom, Medulloblastom, Paragangliom·, primitive neuroektodermale Tumore, Meningiom, Astrozytom), Knochentumore (wie osteogenes Sarkom, Ewings Sarkom) und Metastasen davon. Zusätzliche Somatostatin-Rezeptor-exprimierende Tumore sind in Krenning et al., Europ. Nuc. Med. 20: 716-731, 1993, beschrieben. Die erfindungsgemäßen diagnostischen Verfahren können somit zur Identifikation eines jeden primären, multizentrischen oder metastatischen Tumors, der einen Somatostatin-Rezeptor exprimiert, verwendet werden.
Im allgemeinen wird das mehrfach-tyrosinierte Somatostatin-Analogon aufgrund einer Vielzahl von Faktoren ausgewählt, wie dem verwendeten Diagnoseverfahren, der Fähigkeit des Analogons, sich in einer anvisierten, definierten Zellpopulation anzuhäufen, wie (einem) spezifisch beeinträchtigten Zelltyp(en), Gewebe(n) oder Organ(en), der Halbwertszeit des Analogons und der Bindeaffinität und/oder Avidität des Analogons an einen Somatostatin- Rezeptor.
Die erfindungsgemäßen diagnostischen Verfahren können zur Identifikation eines primären, Somatostatin-Rezeptor-exprimierenden Tumors verwendet werden, zur Identifikation von Metastasen derartiger Tumore, als Untersuchungsverfahren für einen Rückfall (d. h. erneutes Tumorwachstum) in einem Patienten oder als Routineuntersuchungsverfahren für Somatostatin-Rezeptor-exprimierende Tumore in einem Patienten, der im Verdacht steht, einen Tumor zu entwickeln.

Diagnose von Krankheiten, die mit einer abweichenden Produktion eines Somatostatin regulierbaren Faktors und/oder abweichenden Expression eines Somatostatin-Rezeptors in Verbindung stehen

Die erfindungsgemäßen mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga können an einen Patienten verabreicht werden zur Bestimmung, ob der Patient an einer Krankheit leidet, die mit einer abweichenden Produktion eines Somatostatin regulierbaren Faktors und/oder einer abweichenden Expression eines Somatostatin-Rezeptors in Verbindung steht. Im allgemeinen werden diese Verbindungen durch Untersuchung der Wirkung einer Verabreichung eines nicht markierten (d. h. nicht radioaktiven) mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analogons in der Menge eines biologischen Markers diagnostiziert.
Das für die Diagnose verabreichte Analogon ist vorzugsweise ein nicht radioaktiv markiertes, mehrfach-tyrosiniertes Somatostatin-Analogon, insbesondere ein nicht radioaktiv markiertes halogeniertes mehrfach-tyrosiniertes Somatostatin-Analogon. Die Menge des verabreichten Analogons kann in Abhängigkeit einer Reihe von Faktoren variieren, einschließlich der biologischen Aktivität und Halbwerts des ausgewählten Analogons, des Typus und der vermuteten Lokalisierung des Tumors und vom Patienten abhängige Faktoren, einschließlich Größe, Gewicht und Tumormasse. Die spezifisch verabreichte Menge beläuft sich im allgemeinen auf etwa 0,1 pg bis 1000 ug, vorzugsweise etwa 1 ng bis 500 ug, insbesondere etwa 1 ug bis 200 ug, normalerweise etwa 100 ug. Die verabreichte Menge wird mit steigendem Molekulargewicht des verabreichten mehrfach-tyrosinierten Analogons zunehmen.
Der biochemische Marker kann jedes Hormon, Peptid, Protein oder ein anderes biologisches Produkt sein, das mit einem spezifischen Zelltyp (wie endokrinen Zellen, Tumorzellen) oder biologischen Phänomen (wie Zellteilung, Zellmobilität, Tumormetastatisierung) in Verbindung steht. Der biochemische Marker kann in jeder Körperflüssigkeit des Patienten vorkommen, vorzugsweise Urin oder Blut. Die Sensitivität des diagnostischen Verfahrens kann durch Bestimmung der Mengen von zwei oder mehr biochemischen Markern (wie Gastrin und VIP) erhöht werden. Nachweis eines biochemischen Markers, der nicht durch Somatostatin reguliert wird, kann als Negativkontrolle dienen. Eine signifikante Verminderung der Menge des biochemischen Markers nach Verabreichung des mehrfach-tyrosinierten Analogons weist darauf hin, dass die Krankheit mit der Produktion eines Somatostatin regulierbaren Faktors und/oder Expression eines Somatostatin-Rezeptors in Verbindung steht. Vorzugsweise beträgt die Verminderung des biochemischen Markers wenigstens etwa 20%, insbesondere etwa 30% und noch besser etwa 50%. Eine Verminderung der Mengen des biochemischen Markers als Reaktion auf die Verabreichung des mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analogons weist darauf hin, dass z. B. die Analoga an die Oberflächen der Tumorzellen für einen Nachweis vor oder während der Operation binden werden und/oder dass die Analoga wirksam bei der Behandlung der Krankheit sind (z. B. ist die Produktion des biochemischen Markers durch Verabreichung von Somatostatin oder eines Somatostatin-Analogons kontrollierbar).
Zum Beispiel wird eine Blutprobe (Kontrollprobe) aus einem Patienten mit einem Gastrinom erhalten und die Menge an Gastrin wird mittels bekannter Verfahren bestimmt. Eine injizierbare Formulierung mit etwa 100 ug bis 200 ug eines mehrfach-tyrosinierten Somatostatin- Analogons wird dem Patienten verabreicht. Das Analogon kann durch parenterale Injektion verabreicht werden, insbesondere durch intravenöse Injektion. Eine zweite Blutprobe wird 30 Sekunden nach Verabreichung des Analogons aus dem Patienten erhalten, gewöhnlich etwa 10 Minuten nach Verabreichung bis etwa 30 Minuten bis 1 Stunde nach Verabreichung, normalerweise nicht mehr als 2 Stunden nach Verabreichung. Der biochemische Marker kann nachgewiesen werden, bis die Blutmengen des Analogons 0 sind und die beeinträchtigte Zelle wieder hergestellt ist (normalerweise etwa 30 bis 60 Minuten). Die Menge an Gastrin in der Blutprobe wird bestimmt und mit der Menge an Gastrin in der Kontrollprobe verglichen. Falls die Menge an Gastrin in der Probe, die nach Verabreichung des Analogons erhalten wurde, signifikant geringer ist als die Menge an Gastrin in der Kontrollprobe, exprimiert das Gastrinom Somatostatin-Rezeptoren und ist den erfindungsgemäßen präoperati ven und intraoperativen Verfahren zur Tumorlokalisierung sowie den therapeutischen Verfahren zugänglich.
In einem weiteren Beispiel wird eine Kontroll-Blutprobe aus einem Patienten erhalten, der im Verdacht steht, an Acromegalie erkrankt zu sein. Die Menge an Wachstumshormon (GH) und/oder Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor-1 (IGF-1) in der Kontrollprobe wird gemäß bekannter Verfahren bestimmt. Etwa 100 ug eines mehrfach-tyrosinierten Somatostatin- Analogons wird mittels intravenöser Injektion dem Patienten verabreicht und eine zweite Blutprobe wird etwa 30 Minuten nach Verabreichung erhalten. Die Menge an GH und/oder IGF-1 in der zweiten Blutprobe wird bestimmt und mit der Menge an GH und/oder IGF-1 in der Kontrollprobe verglichen. Falls die Menge an GH und/oder lGF-1 in der zweiten Probe signifikant niedriger ist im Vergleich zu der Menge an GH und/oder IGF-1 in der Kontrollprobe, ist die Krankheit des Patienten einer Behandlung mit mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga zugänglich.

Präoperative Diagnose von Somatostatin-Rezeptoren abweichend exprimierenden Tumoren

Radiomarkierte mehrfach-tyrosinierte Peptid-Analoga können in einem Verfahren zum präoperativen Nachweis und zur Lokalisierung eines Tumors, der einen Somatostatin- Rezeptor exprimiert, verwendet werden. Tumore, die einem Nachweis mittels der erfindungsgemäßen radiomarkierten Analoga zugänglich sind, können durch Bestimmung, ob der Tumor einen Somatostatin regulierbaren Faktor, wie vorstehend beschrieben, produziert, identifiziert werden. Eine Voruntersuchung von Patienten mit Hilfe des vorstehend beschriebenen diagnostischen Verfahrens kann kostengünstiger sein, da z. B. das vorstehend beschriebene diagnostische Verfahren nicht erfordert, dass das Analogon radioaktiv markiert ist und im allgemeinen niedrigere Dosen des Analogons erfordert als Tumorlokalisierungsverfahren. Jedoch sind derartige Voruntersuchungstests in keinem der erfindungsgemäßen präoperativen, intraoperativen oder postoperativen diagnostischen Verfahren erforderlich. Weiterhin produzieren nicht alle Somatostatin-Rezeptor-exprimierenden Tumore einen Somatostatin regulierbaren Faktor oder die Identität des Somatostatin regulierbaren Faktors kann unbekannt sein. Daher kann erwünscht sein, dass das erfindungsgemäße präoperative Verfahren der Tumorlokalisierung durchgeführt wird, selbst wenn die diagnostischen Verfahren zum Nachweis der Produktion von Somatostatin regulierbaren Faktoren negative Ergebnisse liefern. Bindung eines mehrfach-tyrosinierten Analogons ist ausreichend für eine Identifikation von Tumoren, die Somatostatin-Rezeptoren exprimieren.
Im allgemeinen wird eine präoperative Diagnose durch Verabreichung eines radioaktiv markierten mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analogons erreicht, vorzugsweise eines radioaktiv markierten, halogenierten mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analogons an den Patienten durch parenterale Injektion, vorzugsweise durch intravenöse Injektion. Eine Auswahl des spezifischen mehrfach-tyrosinierten Analogons und des spezifischen Radiomarkers wird von einer Vielzahl von Faktoren abhängen, einschließlich des Typus und der Lokalisierung des nachzuweisenden Tumors und der verwendeten Radiomarker-Nachweistechnik. Vorzugsweise ist der Radiomarker ein γ-emittierendes Radioisotop, insbesondere ein Radioisotop von Iod und insbesondere ¹²³I.
Die geeignete Dosierung des markierten mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analogons wird von einer Vielzahl von Faktoren abhängen, einschließlich des verwendeten Markers und des verwendeten mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analogons, des Typus und der Lokalisation des darzustellenden Tumors und verschiedener vom Patienten abhängender Faktoren wie Alter und Gewicht des Patienten und Ausmaß der Krankheit (wie Größe und Anzahl von Tumoren). Eine geeignete Dosis für eine Injektion ist eine Menge, die eine Darstellung durch bekannte Scintigraphieverfahren der Nuklearmedizin ermöglicht (wie Computertomographie (CT), Positronenemissionstomographie (PEP) oder Single-Photon-Emissionscomputertomographie (SPECT)). Falls das Analogon mit einem γ-emittierenden Radioisotop radioaktiv markiert ist, wird Bindung des Analogons normalerweise mittels SPECT nachgewiesen. Zum Beispiel kann die verabreichte Radioaktivitätsmenge in einer einzelnen Dosis eine Aktivität von etwa 10uCi bis 50 mCi besitzen, vorzugsweise etwa 100 uCi bis 25 mCi, insbesondere etwa 500 uCi bis 20 mCi, normalerweise etwa 1 mCi bis 10 mCi, gewöhnlich etwa 10 mCi.
Nach Verabreichung des radioaktiv markierten mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analogons können die Somatostatin-Rezeptor-exprimierenden Tumore 1 Minute nach Verabreichung nachgewiesen werden, vorzugsweise etwa 60 Minuten nach Verabreichung, insbesondere etwa 1 Stunde nach Verabreichung, bis zu 12 Stunden bis 96 Stunden und zwei bis drei Wochen nach Verabreichung.
Im allgemeinen wird ein Nachweis von Somatostatin-Rezeptor-exprimierenden Tumoren nach einer für die Beseitigung von ungebundenem oder nicht spezifisch gebundenem radioaktiv markiertem, mehrfach-tyrosiniertem Analogon ausreichenden Zeit durchgeführt.
Beseitigung von ungebundenem und/oder nicht spezifisch gebundenem Analogon verringert das mit normalem Gewebe verbundene radioaktive Signal und ermöglicht somit ein höheres Verhältnis von Signal zu Hintergrundrauschen (d. h. an Tumorgewebe gebundener Radiomarker gegenüber normalem (Hintergrund) Gewebe). Daher erfolgt ein Nachweis des gebundenen radioaktiv markierten mehrfach-tyrosinierten Analogons vorzugsweise mehrere Stunden (wie 8 Stunden bis 24 Stunden) bis mehrere Tage (wie 2 Tage bis 7 Tage) nach Verabreichung. Im allgemeinen erfolgt ein Nachweis 24 Stunden bis 48 Stunden nach Verabreichung. Außerdem kann aufgrund der irreversiblen oder nahezu irreversiblen Bindung von halogenierten mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga Nuklearmedizin-Scanning zum Nachweis von Somatostatin-Rezeptor-exprimierendem Gewebe nachfolgend auf einen operativen Eingriff oder auf eine Therapie mehrere Wochen nach der ersten Verabreichung eines zusätzlichen Analogons ohne Verabreichung von zusätzlichem Analogon erfolgen.
Tumore werden als Gewebe sichtbar gemacht, das das radioaktiv markierte mehrfach-tyrosinierte Analogon stärker bindet als normales Gewebe. Die Verteilung des radioaktiv markierten Analogons in Tumor-/normalem Gewebe beträgt im allgemeinen etwa 2 : 1, vorzugsweise etwa 3 : 1, insbesondere etwa 4 : 1 und kann bis zu 6 : 1 bis 12 : 1 oder mehr betragen.
Der Tumor kann ebenfalls durch Identifikation von Gewebe, in dem sich das radioaktiv markierte Analogon mit der Zeit anhäuft, nachgewiesen werden. Wie vorstehend erläutert, erfolgt ein Nachweis der Bindung des radioaktiv markierten Analogons vorzugsweise nach Beseitigung von ungebundenen oder nicht spezifisch gebundenen Analoga aus normalem Gewebe. Gewebe mit höheren Mengen an radioaktiver Markierung zu einem späteren Zeitpunkt im Vergleich zu einem früheren Zeitpunkt (wie 36 Stunden im Vergleich zu 12 Stunden) wird als Somatostatin-Rezeptor-exprimierendes krebsartiges Gewebe identifiziert. Nachdem der Somatostatin-Rezeptor-exprimierende Tumor identifiziert wurde, kann der Tumor operativ beseitigt werden. Alternativ dazu oder zusätzlich kann der Patient durch Verabreichung von nicht markierten oder radioaktiv markierten mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga oder mit Hilfe herkömmlicher therapeutischer Verfahren behandelt werden.

Intraoperative (in situ) Diagnose von Somatostatin-Rezeptoren abweichend exprimierenden Tumoren

Mehrfach-tyrosinierte Somatostatin-Analoga können ebenfalls für die Identifikation von Somatostatin-Rezeptor-exprimierenden Tumoren während eines operativen Eingriffs verwendet werden. Eine intraoperative Lokalisierung von Tumoren kann besonders hilfreich z. B. bei der Identifikation von Tumormetastasen sein, die durch herkömmliche radiographische Tumorlokalisierungstechniken unerkannt bleiben. Tumore, die dem erfindungsgemäßen intraoperativen Nachweisverfahren zugänglich sind, können durch Bestimmung, ob der Tumor einen Somatostatin regulierbaren Faktor produziert, identifiziert werden, durch Bestimmung, ob der Tumor ein mehrfach-tyrosiniertes Analogon bindet mit Hilfe des vorstehend beschriebenen diagnostischen Tests und der präoperativen Darstellungstechniken oder mit Hilfe herkömmlicher Diagnoseverfahren.
Im allgemeinen wird ein intraoperativer Tumornachweis durch Verabreichung eines radioaktiv markierten mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analogons an einen Patienten durch parenterale Injektion, vorzugsweise durch intravenöse Injektion und Nachweis des gebundenen Radiomarkers in situ erreicht. Falls die allgemeine Lokalisierung des Tumors bekannt ist (z. B. deutete eine präoperative Diagnose an, dass (der) Tumor(e) sich in einem spezifischen Organ befand(en)), kann das radioaktiv markierte Analogon direkt in die betroffene Stelle injiziert werden. Gewebe, das mit einer abweichenden Expression von Somatostatin- Rezeptoren in Verbindung steht, wird als Gewebe identifiziert, das eine erhöhte Bindung des radioaktiv markierten Analogons aufweist im Vergleich zu normalem Gewebe. Bindung des radioaktiv markierten Analogons an den Tumor kann 1 Minute nach Injektion nachgewiesen werden und kann bis zur Beendigung des operativen Eingriffs überwacht werden (normalerweise 1 Stunde bis 8 Stunden nach Injektion).
Die Auswahl des spezifischen mehrfach-tyrosinierten Analogons und des spezifischen Radiomarkers wird von einer Vielzahl von Faktoren abhängen, einschließlich des Typus und der Lokalisierung des nachzuweisenden Tumors und der verwendeten Radiomarker-Nachweistechnik. Vorzugsweise ist der Radiomarker ein β-emittierendes oder γ-emittierendes Radioisotop, insbesondere ein γ-emittierendes Radioisotop, noch besser ein Radioisotop von Iod und am besten ¹²&sup5;I. Radioisotope mit niedriger Energie sind bevorzugt, insbesondere Radioisotope mit einer Photonen-Emissionsenergie von weniger als etwa 300 kev, vorzugsweise weniger als etwa 150 kev.
Die geeignete Dosis des radioaktiv markierten, mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analogons wird von einer Reihe von Faktoren abhängen, einschließlich des verwendeten Radiomarkers und mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analogons, des Typus und der Lokalisierung des nachzuweisenden Tumors und verschiedenen vom Patienten abhängenden Faktoren wie dem Ausmaß der Erkrankung (wie Größe und Anzahl von Tumoren) oder anderer begleitender medizinischer Bedingungen. Eine geeignete Injektionsdosis ist eine Menge, die an Krebsgewebe bindet und einen Nachweis des Radiomarkers mit einer Handsonde ermöglicht. Die spezifische Menge des für einen intraoperativen Tumornachweis verabreichten radioaktiv markierten mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analogons beträgt etwa 10 uCi bis 100 mCi, vorzugsweise etwa 100 uCi bis 50 mCi, besser etwa 500 uCi bis 40 mCi, gewöhnlich etwa 1 mCi bis 10 mCi, normalerweise weniger als 2 mCi. Im allgemeinen produzieren etwa 0,01 mg bis 100 mg, normalerweise etwa 0,1 mg bis 1,0 mg (1 · 10&sup5; bis 1 x 106 Zellen) radiomarkierten Tumorgewebes pro Gramm Gesamtgewebe eine Strahlung, die für ein Auslösen des Hand-Detektors ausreichend ist. Das radioaktiv markierte mehrfachtyrosinierte Analogon kann während des operativen Eingriffs verabreicht werden oder 30 Minuten, normalerweise etwa 1 Stunde bis 2 Stunden vor dem operativen Eingriff.
Wie in dem vorstehend beschriebenen präoperativen Diagnoseverfahren erläutert, wird ein Nachweis des gebundenen Analogons vorzugsweise nach Beseitigung von ungebundenem oder nicht spezifisch gebundenem Analogon durchgeführt. Somit wird ein intraoperativer Nachweis vorzugsweise mehrere Stunden (wie 6 Stunden bis 24 Stunden) bis mehrere Tage (wie 2 Tage bis 8 Tage) oder Wochen nach Verabreichung durchgeführt. Weiterhin kann, falls der Somatostatin-Rezeptor-exprimierende Tumor mit Hilfe des vorstehend beschriebenen präoperativen Diagnoseverfahrens identifiziert worden war, eine intraoperative Diagnose ohne Verabreichung von zusätzlichem radioaktiv markiertem, mehrfach-tyrosiniertem Analogon erfolgen.
Verfahren und Vorrichtungen für den Nachweis von β- und y-Strahlung sind bekannt. US-PS 5,008,546, durch eine Referenz einbezogen, beschreibt eine für den Nachweis von β-emittierenden Radioisotopen geeignete Sonde. Geeignete Hand-Sonden zum Nachweis von γ- emittierenden Radioisotopen sind in US-PS 4,801,803, 4,889,991 und 5,070,878 beschrieben. Zusätzliche Vorrichtungen zum Nachweis der Strahlung können gegebenenfalls verwendet werden. Strahlungssonden können als Teil eines Endoskops, Laparoskops, Bronchoskops oder anderen spezifischen Instrumenten verwendet werden. Während des in situ- Nachweises wird normales Gewebe, das nicht das radiomarkierte, mehrfach-tyrosinierte Analogon bindet, als "Referenz" (negative Kontrolle)-Gewebe verwendet. Der Nachweis von mehr γ-Counts als eine vorgewählte Anzahl von Counts (wie die Quadratwurzel aus wenigstens zwei Standardabweichungen, vorzugsweise wenigstens drei Standardabweichungen) gegenüber dem Hintergrund (wie über dem Mittelwert der Counts des Referenzgewebes) weist auf ein Gewebe hin, das aufgrund einer erhöhten Anzahl von Somatostatin-Rezeptoren das radiomarkierte Analogon gebunden hat. Das radiomarkierte Gewebe wird dann herausgeschnitten und das Nachweisverfahren fortgesetzt, bis das gesamte nachweisbare radiomarkierte Gewebe entfernt ist.
Zum Beispiel werden, falls der Patient an einem Gastrinom erkrankt ist, 10 uCi bis 1 mCi des ¹²&sup5;I-mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analogons intravenös injiziert und die y-Counts in situ mit einem Hand-γ-Nachweisgerät gezählt. Die γ-Counts werden im Pankreas, Magen, Duodenum, proximalen, mittleren und distalen Dünndarm, Mesenterium des Dünndarms, Dickdarm, Blase, Leber, Nieren, Schilddrüse, Herz und Aorta nachgewiesen. Sodann wird das Nachweisgerät auf ein Einleseverfahren umgestellt, das einen "Ausschluß" der Hintergrund-Counts aus dem benachbarten Referenzgewebe erlaubt. Die γ-Counts eines Referenzgewebes werden während eines Zeitraums von 1 Sekunde bis 60 Sekunden, normalerweise etwa in einem Zeitraum von 5 Sekunden bestimmt und die Kontrolleinheit errechnet sowohl den Durchschnitt als auch die Standardabweichung dieses Signals. Sobald der γ- Detektor über ein Gewebe mit einer γ-Strahlung von mehr als der Quadratwurzel von drei Standardabweichungen über den mittleren Counts des Referenzgewebes geführt wird, wird ein "Alarmsignal" aktiviert. Der Hand-y-Detektor kann im Scan-Modus zur Identifikation von einzelnen Herden einer erhöhten Strahlung zur Entfernung verwendet werden.

Postoperative (in vitro) Diagnose von Tumoren, die abweichend Somatostatin-Rezeptoren exprimieren

Die Diagnose von Tumoren, die abweichend Somatostatin-Rezeptoren exprimieren, kann mittels Bindung eines nachweisbar markierten mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analogons an eine Gewebeprobe in vitro durchgeführt werden. Zuerst wird eine Gewebeprobe aus einem Patienten erhalten, der im Verdacht steht, an einem Tumor erkrankt zu sein, der abweichend einen Somatostatin-Rezeptor exprimiert. Die Gewebeprobe kann für eine Inkubation mit dem nachweisbar markierten Analogon gemäß einer Vielzahl von bekannten Verfahren aufbereitet werden. Zum Beispiel kann das Gewebe für eine Einzelzellsuspension zertrennt werden und die einzelnen Zellen an einen festen Träger gebunden werden (wie einem Well einer Mikrotiterplatte). Alternativ werden die Zellen in der Gewebeprobe lysiert und eine vorwiegend aus Proteinen der Zelloberflächenmembran bestehende Proteinfraktion wird gemäß bekannter Verfahren hergestellt (O'Dorisio et al., Cell Growth and Differentiation 5: 1-8, 1994).
Die Gewebeprobe wird dann mit einem nachweisbar markierten mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analogon inkubiert, vorzugsweise einem halogenierten mehrfach-tyrosinierten Analogon. Eine Gewebeprobe ohne Somatostatin-Rezeptoren kann als Negativkontrolle dienen. Der nachweisbare Marker kann jeder bekannte nachweisbare Marker sein, vorzugsweise ein Fluorochrom oder ein Radiomarker. Fluorescein ist als nachweisbarer Marker für ein Fluorochrom bevorzugt. Ein Radioisotop von Iod, insbesondere ¹²&sup5;I ist ein bevorzugter nachweisbarer Marker, falls der nachweisbare Marker ein Radiomarker ist. Ein kompetitierender, unmarkierter Somatostatin-Rezeptor-Ligand wird hinzugefügt, um eine spezifische Bindung an die Rezeptoren zu bestimmen. Die Menge des mit den Proben inkubierten unmarkierten Analogons steigt bis zu einer Menge, die einen Überschuß dessen darstellt, was zur Bindung der Somatostatin-Rezeptoren in der Kontrollprobe erforderlich ist, vorzugsweise ein etwa 10facher Überschuß, insbesondere ein etwa 100facher Überschuß. Die Inkubation wird für eine Zeit durchgeführt, die ausreichend ist, um eine kompetitive Bindung der markierten und unmarkierten Analoga an den Somatostatin-Rezeptor in den Proben zu ermöglichen.
Nach der Inkubation wird ungebundenes Material durch Waschen aus der Probe entfernt und der gebundene Marker nachgewiesen. Falls der nachweisbare Marker ein Radiomarker ist, kann ein Nachweis mit einem Scintillationszähler erfolgen. Falls die Menge des an die Testprobe gebundenen nachweisbaren Markers signifikant höher ist als die Menge des an die Negativprobe gebundenen nachweisbaren Markers und die Bindung von markiertem Peptid kompetitiv durch unmarkiertes Peptid gehemmt wird, exprimiert die Gewebeprobe einen Somatostatin-Rezeptor. Die Testergebnisse zeigen an, ob 1) der Patient zugänglich für ein diagnostisches Scanning ist, 2) der Tumor des Patienten einer Behandlung mit dem erfindungsgemäßen mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analogon zugänglich ist und 3) der Zustand des Patienten mit den vorstehend beschriebenen präoperativen Verfahren überwacht werden kann.

Therapeutische Verabreichung von mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga

Patienten mit einer Krankheit, die in Verbindung mit einer abweichend erhöhten Produktion eines Somatostatin regulierbaren Faktors steht und/oder einer Krankheit, die mit einer abweichenden Expression eines Somatostatin-Rezeptors in Verbindung steht, kann durch Verabreichung eines mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analogons behandelt werden. Patienten mit einer Krankheit, die einer Behandlung mit den erfindungsgemäßen Analoga zugänglich ist, können mit Hilfe der vorstehend beschriebenen diagnostischen Verfahren erkannt werden, obwohl dies keine notwendige Voraussetzung für die hier beschriebenen Behandlungsverfahren ist. Das erfindungsgemäße Behandlungsverfahren kann als Primärtherapie oder als Nachfolgetherapie nach einer operativen Behandlung (wie nach Entfernen des Tumors) eingesetzt werden.
Mehrfach-tyrosinierte Somatostatin-Analoga zur therapeutischen Verabreichung können unmarkiert, halogeniert, fluoreszenz-markiert oder radiomarkiert sein. Die Auswahl des spezifischen Analogons ist von der zu behandelnden Krankheit abhängig. Falls die Krankheit z. B. nur mit einer abweichend erhöhten Produktion eines Somatostatin regulierbaren Faktors (wie Acromegalie, Sarkoidosis) in Verbindung steht, ist das Analogon vorzugsweise ein unmarkiertes mehrfach-tyrosiniertes Somatostatin-Analogon, insbesondere ein halogeniertes mehrfach-tyrosiniertes Somatostatin-Analogon. Falls der Patient an einer Krankheit leidet, die mit einer abweichenden Expression eines Somatostatin-Rezeptors in Verbindung steht (wie ein Tumor), ist das Analogon vorzugsweise ein radiomarkiertes mehrfach-tyrosiniertes Somatostatin-Analogon, insbesondere ein radiomarkiertes halogeniertes Analogon und insbesondere ein ¹²&sup9;I- oder ¹³¹I-radiomarkiertes mehrfach-tyrosiniertes Somatostatin-Analogon. Falls ein radiomarkiertes mehrfach-tyrosiniertes Analogon verwendet wird, kann das Peptid unmittelbar vor der Verabreichtung markiert werden, wie 24 Stunden oder weniger vor Verabreichung.
Die mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga können auf jedem herkömmlichen Weg verabreicht werden, insbesondere durch parenterale Injektion in Form einer injizierbaren Lösung oder Suspension. Die mehrfach-tyrosinierten Analoga können ebenfalls mittels Infusion verabreicht werden, wie einer intravenösen Infusion über 30 Minuten bis 60 Minuten. Die mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga können an oder in der Nähe der Tumorstelle verabreicht werden, z. B. durch Verwendung eines angiographischen intraarteriellen oder intravenösen regionalen Katheters, der in einer Vene oder Arterie plaziert wird, die den Tumor ernährt. Die Art der Verabreichung wird entsprechend der Tumorstelle, der Affinität und Spezifität des Analogons, der Halbwertszeit des mehrfach-tyrosinierten Analogons, der Halbwertszeit eines an das Analogon gebundenen Radiomarkers und weiteren vom Fachmann erkennbaren Faktoren ausgewählt.
Die in dem erfindungsgemäßen therapeutischen Verfahren verwendeten Dosen hängen von einer Vielzahl von Faktoren ab, wie der spezifischen zu behandelnden Krankheit, dem verwendeten Radiomarker und mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analogon und vom Patienten abhängigen Faktoren wie Größe, Gewicht und Schwere der Erkrankung (wie Tumorgröße und Tumorausmaß). Die Menge des zu verabreichenden mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analogons kann durch Berechnen der Menge des radiomarkierten Analogons, die zum Ziel geliefert wird, mit Hilfe des vorstehend beschriebenen in vivo-diagnostischen Verfahrens bestimmt werden. Verfahren zur Berechnung von Dosen mittels dosimetrischer Techniken sind Routineverfahren und sind bekannt (vgl. z. B. Fischer et al., Cancer 73: 905- 911, 1994). Im allgemeinen beträgt die spezifische angelieferte Dosis etwa 0,1 pg/kg bis 500 ug/kg, insbesondere etwa 1 ng/kg bis 250 ug/kg, normalerweise etwa 200 ng/kg des mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analogons. Falls das Analogon radiomarkiert ist, kann es als Dosis mit einer Radioaktivität von etwa 0,1 uCi/kg bis 50 mCi/kg Körpergewicht, insbesondere etwa 1 uCi/kg bis 25 mCi/kg Körpergewicht, besser etwa 10 uCi/kg bis 15 mCi/kg Körpergewicht verabreicht werden. Im allgemeinen beträgt die Gesamtmenge des mehrfachtyrosinierten Somatostatin-Analogons, die in einer einzigen Dosis geliefert wird, etwa 100 mCi bis 2000 mCi, normalerweise etwa 150 mCi bis 1500 mCi.
Die Wirksamkeit der Therapie kann durch Überwachung der Mengen eines biochemischen Markers, der mit der Krankheit in Verbindung steht (wie ein Somatostatin regulierbarer Faktor) bewertet werden mittels in vivo-bildlicher Darstellung durch Verwendung eines vorstehend beschriebenen radiomarkierten mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analogons oder durch Verwendung herkömmlicher radiographischer Techniken. Die Dosis des mehrfachtyrosinierten Somatostatin-Analogons kann dann entsprechend angepaßt werden, z. B. für eine Therapie mit nicht-radioaktiven mehrfach-tyrosinierten Analoga (nicht modifiziert oder z. B. durch Halogenierung modifiziert) oder für eine Therapie mit ansteigenden Dosen des erfindungsgemäßen radiomarkierten Analogons.

Synthese von sechs beispielhaften mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga

Sechs beispielhafte mehrfach-tyrosinierte Somatostatin-Analoga wurden synthetisiert. Die Formeln dieser Analoga sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2: Beispielhafte mehrfach-tyrosinierte Somatostatin-Analoga
Alle vorstehend beschriebenen mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga wurden durch Reaktion eines neutralisierten Benzhydrylamin-Polystyrolharzes mit aktivierten Aminosäuren hergestellt. Insbesondere wurde Benzhydrylamin-Polystyrolharz (Advanced ChemTech, Inc.) (1,2 g, 0,5 mmol) als Chloridion in das Reaktionsgefäß eines Advanced ChemTech Peptidsynthesegeräts gegeben, das mit den folgenden Schritten eines Reaktionszyklus programmiert war: (1) Methylenchlorid, (2) 33% Trifluoressigsäure in Methylenchlorid (zweimal für 1 Stunde und jeweils 25 Minuten), (3) Methylenchlorid, (4) Ethanol, (5) Methylenchlorid, (6) 10% Triethylamin in Chloroform. Die gleichen Reaktionsschritte wurden zur Herstellung aller vorstehend beschriebenen Analoga verwendet.
Zur Herstellung des WOC-2A-Analogons wurde zuerst das neutralisierte Harz mit Boc-Obenzylthreonin und Diisopropylcarbodiimid (jeweils 1,5 mmol) in Methylenchlorid 1 Stunde gerührt. Das resultierende Aminosäureharz wurde gemäß den Schritten (1) bis (6) des vorstehenden Waschprogramms einem Zyklus unterworfen. Die nachfolgenden Aminosäuren (1,5 mmol) wurden sodann jeweils sukzessiv durch das gleiche Verfahren gekoppelt: Boc-Smethylbenzyl-Cys, Boc-Val, Boc-N-benzyloxycarbonyl-lysin, Boc-D-Trp, Boc-O-dichlorobenzyl-Tyr und Boc-S-methylbenzyl-Cys und Boc-O-dichlorobenzyl-D-Tyr. Nach Waschen und Trocknen besaß das vollständige Harz mit gebundenem Boc-O-dichlorobenzyl-D-tyrosin-Smethylbenzyl-cystein-O-dichlorobenzyl-tyrosin-D-tryptophan-N-benzyloxycarbonyl-lysinvalin-S-methylbenzyl-cystein-threonin ein Gewicht von 1,78 g.
Das WOC-2A-Analogon wurde von dem Harz (1,78 g, 0,5 mmol) durch Mischen des Aminosäureharzes mit Anisol (5 ml), Dithiothreit (100 mg) und wasserfreiem Fluorwasserstoff (35 ml) bei 0ºC freigesetzt und 45 Minuten gerührt. Überschüssiges Fluorwasserstoff wurde rasch unter einem Strahl von trockenem Stickstoff verdampft, freies cyclisches D-Tyrosin- Cystein-Tyrosin-D-Tryptophan-Lysin-Valin-Cystein-Threonin-NH&sub2; (WOC-2A)-Peptid präzipitiert und mit Ether gewaschen.
Das Rohpeptid wurde sodann in 500 ml 90%iger Essigsäure, zu der eine konzentrierte 12/MeOH-Lösung bis zum Aufkommen einer permanenten braunen Farbe hinzugefügt worden war, gelöst. Überschüssiges 12 wurde durch Zugabe von Ascorbinsäure entfernt und die Lösung auf ein kleines Volumen eingedampft, das auf eine Sephadex G-25-Säule (2,5 · 90 cm) gegeben und mit 50% AcOH eluiert wurde. Fraktionen mit einem Hauptbestandteil gemäß UV-Absorption und Dünnschichtchromatographie wurden sodann gepoolt, auf ein kleines Volumen eingedampft und auf eine Säule (1,5 · 70 cm) mit Vydac Octadecylsilan- Kieselerde (10-15 um) gegeben. Das Analogon wurde mit einem linearen Gradienten aus Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser eluiert. Fraktionen wurden durch Dünnschichtchromatographie und analytische hochauflösende Flüssigkeitschromatographie getestet und für eine maximale Reinheit gepoolt. Mehrfache Lyophilisierung der Lösung vom Wasser ergab das gewünschte Produkt als weißes, flockiges Pulver. Gemäß Hochdruck- Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und TLC war das Produkt homogen. Aminosäureanalyse eines Säurehydrolysats und MALD MS bestätigten die Zusammensetzung des Octapeptids.
Zur Herstellung des WOC-2B-Analogons wurde zuerst das neutralisierte Harz mit Boc-Obenzylthreonin und Diisopropylcarbodümid (jeweils 1,5 mmol) in Methylenchlorid 1 Stunde gerührt. Das resultierende Aminosäureharz wurde gemäß den Schritten (1) bis (6) des vorstehenden Waschprogramms einem Zyklus unterworfen. Die nachstehenden Aminosäuren (1,5 mmol) wurden sodann alle sukzessiv durch das gleiche Verfahren gekoppelt: Boc-S- methylbenzyl-Cys, Boc-O-benzyl-Thr, Boc-N-benzyloxycarbonyl-lysin, Boc-D-Trp, Boc-Phe, Boc-S-methylbenzyl-Cys, Boc-O-dichlorobenzyl-D-Tyr und Boc-O-dichlorbenzyl-Tyr. Nach Waschen und Trocknen wog das vervollständigte Harz mit gebundenem Boc-O-dichlorobenzyl-tyrosin-O-dichlorobenzyl-D-tyrosin-S-methylbenzyl-cystein-phenylalanin-D-tryptophan-N- benzyloxycarbonyl-lysin-O-benzyl-threonin-S-methylbenzyl-cystein-O-benzyl-threonin 1,78 g.
Das WOC-2B-Analogon wurde von dem Harz (1,78 g, 0,5 mmol) durch Mischen des Aminosäureharzes mit Anisol (5 ml), Dithiothreit (100 mg) und wasserfreiem Fluorwasserstoff (35 ml) bei 0ºC freigesetzt und 45 Minuten gerührt. Überschüssiges Fluorwasserstoff wurde rasch unter einem Strahl von trockenem Stickstoff verdampft und freies cyclisches Tyrosin- D-Tyrosin-Cystein-Phenylalanin-D-Tryptophan-Lysin-Threonin-Cystein-Threonin-NH&sub2; (WOC- 2B)-Peptid präzipitiert und mit Ether gewaschen.
Das Rohpeptid wurde sodann in 500 ml 90%iger Essigsäure, zu der eine konzentrierte I&sub2;/MeOH-Lösung gegeben worden war, bis eine permanente Braunfärbung eintrat, gelöst. Überschüssiges 1Z wurde durch Zugabe von Ascorbinsäure entfernt und die Lösung auf ein kleines Volumen eingedampft, das auf eine Sephadex G-25-Säule (2,5 · 90 cm) gegeben und mit 50% AcOH eluiert wurde. Die gemäß der UV-Absorption und Dünnschichtchromatographie eine Hauptkomponente enthaltenden Fraktionen wurden sodann gepoolt, auf ein kleines Volumen eingedampft und auf eine Säule (1,5 · 70 cm) mit Vydac Octadecylsilan- Kieselerde (10-15 um) gegeben. Das Analogon wurde mit einem linearen Gradienten von Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser eluiert. Fraktionen wurden mittels Dünnschichtchromatographie und analytischer hochauflösender Flüssigkeitschromatographie untersucht und für eine maximale Reinheit gepoolt. Mehrfache Lyophilisierung der Lösung von Wasser ergab das gewünschte Produkt als weißes, flockiges Pulver. Gemäß der Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und TLC war das Produkt homogen. Die Aminosäureanalyse eines Säurehydrolysats und MALD MS bestätigten die Zusammensetzung des Nonapeptids.
Das cyclische Tyrosin-Alanin-D-Tyrosin-Cystein-Tyrosin-D-Tryptophan-Lysin-Valin-Cystein- Threonin (WOC-3A)-Analogon wurde durch Rühren des vorstehend beschriebenen neutralisierten Benzhydrylamin-Polystyrolharzes mit Boc-O-benzyl-threonin und Diisopropylcarbodiimid (jeweils 1,5 mmol) in Methylenchlorid für 1 Stunde hergestellt. Das resultierende Aminosäureharz wurde dann gemäß den Schritten (1) bis (6) des vorstehend beschriebenen Waschprogramms einem Zyklus unterworfen. Die nachstehenden Aminosäuren (jeweils 1,5 mmol) wurden sodann sukzessiv durch das gleiche Verfahren gekoppelt: Boc-S-methylbenzyl-Cys, Boc-Val, Boc-N-benzyloxycarbonyl-lysin, Boc-D-Trp, Boc-O-dichlorbenzyl-Tyr, Boc- S-methylbenzyl-Cys, Boc-O-dichlorbenzyl-D-Tyr, Boc-Ala und Boc-O-dichlorbenzyl-Tyr. Nach Waschen und Trocknen wog das resultierenden Boc-O-dichlorbenzyl-tyrosin-alanin-Odichlorbenzyl-D-tyrosin-S-methylbenzyl-cystein-dichlorbenzyl-tyrosin-D-tryptophan-N-benzyloxycarbonyl-lysinvalin-S-methylbenzyl-cystein-O-benzyl-threonin-benzhydrylamin-Peptidharz 2,1 g.
Das Aminosäureharz wurde sodann einer HF-Spaltung und I&sub2;-Zyklisierung wie vorstehend beschrieben unterzogen. Die beschriebene Säulenaufreinigung ergab die cyclische Tyrosin- Alanin-D-Tyrosin-Cystein-Tyrosin-D-Tryptophan-Lysin-Valin-Cystein-Threonin (WOC-3A)- Verbindung. Gemäß HPLC und TLC war WOC-3 homogen. Aminosäureanalyse eines Säurehydrolysats und MALD MS bestätigten die Zusammensetzung des WOC-3A-Peptids.
Das cyclische Tyrosin-D-Tyrosin-Cystein-Tyrosin-D-Tryptophan-Lysin-Valin-Cystein-Threonin (WOC-3B)-Analogon wurde durch Rühren des vorstehend beschriebenen neutralisierten Benzhydrylamin-Polystyrolharzes mit Boc-O-benzyl-threonin und Diisopropylcarbodümid (jeweils 1,5 mmol) in Methylenchlorid für 1 Stunde hergestellt. Das resultierende Aminosäureharz wurde dann gemäß den Schritten (1) bis (6) des vorstehend beschriebenen Waschprogramms einem Zyklus unterworfen. Die nachstehenden Aminosäuren (jeweils 1,5 mmol) wurden sodann sukzessiv durch das gleiche Verfahren gekoppelt: Boc-S-methylbenzyl-Cys, Boc-Val, Boc-N-benzyloxycarbonyl-lysin, Boc-D-Trp, Boc-O-dichlorbenzyl-Tyr, Boc-S-methylbenzyl-Cys, Boc-O-dichlorbenzyl-D-Tyr und Boc-O-dichlorbenzyl-Tyr. Nach Waschen und Trocknen wurde das Aminsäureharz einer HF-Spaltung und I&sub2;-Zyklisierung wie vorstehend beschrieben unterworfen. Die beschriebene Säulenaufreinigung ergab die cyclische Tyrosin-D-Tyrosin-Cystein-Tyrosin-D-Tryptophan-Lysin-Valin-Cystein-Threonin (WOC-3B)- Verbindung. Gemäß HPLC und TLC war WOC-3B homogen. Aminosäureanalyse eines Säurehydrolysats und MALD MS bestätigten die Zusammensetzung des WOC-3B-Peptids.
Das cyclische D-Tyrosin-Tyrosin-Tyrosin-D-Tyrosin-Cystein-Phenylalanin-D-Tryptophan- Lysin-Threonin-Cystein-Threonin (WOC-4)-Analogon wurde durch Rühren des vorstehend beschriebenen neutralisierten Benzhydrylamin-Polystyrolharzes mit Boc-O-benzyl-threonin und Diisopropylcarbodümid (jeweils 1,5 mmol) in Methylenchlorid für 1 Stunde hergestellt. Das resultierende Aminosäureharz wurde dann gemäß den Schritten (1) bis (6) des vorstehend beschriebenen Waschprogramms einem Zyklus unterworfen. Die nachstehenden Aminosäuren (jeweils 1,5 mmol) wurden sodann sukzessiv durch das gleiche Verfahren gekoppelt: Boc-S-methylbenzyl-Cys, Boc-O-benzyl-Thr, Boc-N-benzyloxycarbonyl-lysin, Boc-D- Trp, Boc-Phe, Boc-S-methylbenzyl-Cys, Boc-O-dichlorbenzyl-D-Tyr, Boc-O-dichlorbenzyl- Tyr, Boc-O-dichlorbenzyl-Tyr und Boc-O-dichlorbenzyl-D-Tyr. Nach Waschen und Trocknen wurde das Aminosäureharz einer HF-Spaltung und I&sub2;-Zyklisierung wie vorstehend beschrieben unterworfen. Die beschriebene Säulenaufreinigung ergab das cyclische D-Tyrosin-Tyrosin-Tyrosin-D-Tyrosin-Cystein-Phenylalanin-D-Tryptophan-Lysin-Threonin-Cystein-Threonin (WOC-4)-Peptid, das von dem Harz mittels HF-Spaltung und I&sub2;Zyklisierung wie vorstehend beschrieben freigesetzt worden war. Die beschriebene Säulenaufreinigung ergab die gemäß HPLC und TLC homogene WOC-4-Verbindung. Aminosäureanalyse eines Säurehydrolysats und MALD MS bestätigten die Zusammensetzung des WOC-4-Peptids.
Das cyclische (D-Tyrosin)&sub8;-(Lysin)&sub4;-(Lysin)&sub2;-Lysin-Cystein-Phenylalanin-D-Tryptophan-Lysin- Threonin-Cystein-Threonin (WOC-8)-Peptid wurde durch Rühren des vorstehend beschriebenen neutralisierten Harzes mit Boc-O-benzyl-threonin und Diisopropylcarbodümid (jeweils 0,75 mmol) in Methylenchlorid für 1 Stunde hergestellt und das resultierende Aminosäureharz sodann gemäß den Schritten (1) bis (6) des vorstehenden Waschprogramms einem Zyklus unterworfen. Die nachstehenden Aminosäuren (0,75 mmol) wurden sodann sukzessiv durch das gleiche Verfahren gekoppelt: Boc-S-methylbenzyl-Cys, Boc-O-benzyl-Thr, Boc-N-benzyloxycarbonyl-lysin, Boc-D-Trp, Boc-Phe, Boc-S-methylbenzyl-Cys, Boc-D-Phe und Bis-Boc-Lys. Das Harz wurde sodann deprotegiert, neutralisiert und mit BOC-Tyr (6 mmol) und DIC (6 mmol) in Anwesenheit von 1-Hydroxybenztriazol (6 mmol) gekoppelt. Nach Waschen und Trocknen wog das vollständige (Boc-D-tyrosin)8-(lysin)4-(lysin)2-lysin-Dphenylalanin-S-methylbenzyl-cystein-phenylalanin-D-tryptophan-N-benzyloxycarbonyl-lysin- Boc-O-benzyl-Thr-S-methylbenzyl-cystein-O-benzyl-threonin-benzhydrilamin-Harz 1,53 g.
Das WOC-8-Peptid wurde von dem Harz durch HF-Spaltung und I&sub2;-Zyklisierung wie beschrieben freigesetzt. Säulenaufreinigung ergab gemäß HPLC und TLC homogenes WOC-8. Aminosäureanalyse eines Säurehydrolysats und MALD MS bestätigten die Zusammensetzung des WOC-8-Peptids.
Wie aus vorstehender Beschreibung deutlich wird, können mehrere Tyrosinreste am N-Terminus des Somatostatin-Analogons eingebaut werden. Die Tyrosinreste können an das Analogon angefügt werden zur Bildung einer symmetrisch verzweigten Struktur, wie exemplarisch durch die Verbindung WOC-8 gezeigt. Alternativ können die Somatostatin-Analoga asymmetrisch N-terminal erweitert werden (d. h. die Variablen q und s in der vorstehenden Formel sind nicht gleichbedeutend). Asymmetrische verzweigte N-terminale Erweiterungen können durch Verwendung von Kombinationen des Lysin-Derivats Nα-BOC, NE-FMOC-Lys hergestellt werden. Dieses Lysin-Derivat kann entweder an der Nα-Position mittels TFA- Behandlung oder an der NE-Position mittels Behandlung mit Piperidin/DMF-Lösungen deprotegiert werden. Somit können offenbar alle Kombinationen von Tyrosinresten an den N-Terminus angefügt werden zur Herstellung von symmetrischen oder asymmetrischen Verzweigungsketten.

Radioiodierung der WOC-2A, WOC-2B, WOC-3A, WOC-3B, WOC-4 und WOC-8 mehrfachtyrosinierten Somatostatin-Analoga

Radiomarkierung der mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga kann durch eine Vielzahl von bekannten Radiomarkierungsverfahren durchgeführt werden.
Zur Radioiodierung von WOC-2A, WOC-3A, WOC-3B, WOC-4 und WOC-8 wurden zuerst 0,5 M Kalium/Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 (0,1 ml) zu einem 12 · 75 mm Polypropylenröhrchen mit 1 mCi ¹²&sup5;I Natriumiodid (10 ul) hinzugegeben und gemischt. Sodann wurden 5 ug eines mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analogons und 100 ul 0,05 M Kalium/Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, zu der Mischung hinzugefügt und die Lösung erneut gemischt. Unmittelbar im Anschluß wurden 5,7 ug Chloramin T (10 ul) zu der Lösung hinzu gefügt und die Reaktion 60 Sekunden später durch Zugabe von 57 ug Metabisulfit (100 ul) gestoppt. Bei jedem Schritt wurde unaufhörlich stark gemischt, um eine rasche und gute Durchmischung sicherzustellen. 30 Sekunden nach Zugabe des Natriummetabisulfits wurden 2,0 ml 0,005% injizierbares menschliches Serumalbumin (HSA) in 0,05 M Essigsäure zu dem Reaktionsgefäß hinzugefügt.
Eine SEP-PAK C-18-Säule (Millipore Corporation, Milford, MA) wurde mit 5 ml 70% Ethanol sterilisiert, mit 5 ml 2-Propanol aktiviert und mit 12,5 ml HPLCgereinigtem Wasser gespült. Die Reaktionsmischung wurde auf diese Säule aufgetragen und die Säule mit 5 ml HPLCgereinigtem Wasser gewaschen. Die Säule wurde sodann mit 5 ml 0,05 M Essigsäure gewaschen. Das markierte Analogon wurde mit 5 ml 96%igem Ethanol eluiert. Das letzte Eluat wurde in einem 13 · 100 mm Polypropylenröhrchen, das nicht mit HSA beschichtet war, 'gesammelt. Der Prozentsatz der gesamten, für jedes Eluat wiedergewonnenen Radioaktivität wurde mit einem Radioisotopen-Eichgerät unter einem gelinden Stickstoffstrom bei 40ºC gemessen. Das getrocknete radiomarkierte Analogon wurde in 115 ul 100 mM Kaliumphosphat, pH 6,9 : Methanol (40 : 60) gelöst und 15 Minuten bei 40ºC mit periodischem Vortexen inkubiert, um ein vollständiges Lösen sicherzustellen. Das gelöste, markierte Material wurde 2 Minuten zentrifugiert, um alle Teilchenrückstände zu beseitigen.
Die radiomarkierten Analoga wurden sodann weiter durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) gereinigt. Das HPLC-System wurde zuerst mit 100 mM Kaliumphosphat, pH 6,9 : Methanol : Wasser (20 : 30 : 50) 18 Minuten bei 1,0 ml/min equilibriert. Das gelöste radiomarkierte Analogon wurde auf die Säule geladen und bei einer Flußrate von 1,0 ml/min 20 Minuten gereinigt. Die anfänglichen Bedingungen für die mobile Phase wurden 1 Minute nach Probeninjektion aufrechterhalten, dann auf 100 mM Kaliumphosphat, pH 6,9 : Methanol (40 : 60) für einen Zeitraum von 2 Minuten geändert. 0,2 ml-Fraktionen wurden in 13 · 100 mm HSA-beschichteten Polypropylenröhrchen gesammelt. Die Radioaktivität einer jeden Fraktion wurde in einem Radioisotopen-Eichgerät gemessen. Die Chromatogramme für UV- und Radioisotopen-Detektion wurden bearbeitet und mit der MILLENIUM® 2010 Chromatography Manager Software aufgezeichnet. Das gereinigte einfach iodinierte ¹²&sup5;I-markierte Analogon wurde in einem 40ºC-Wasserbad mit Hilfe eines gelinden Stickstoffflusses trocken eingedampft. Der getrocknete, gereinigte und radiomarkierte Analogonrest wurde in 2,0 ml 0,9% Natriumchlorid und 0,05 M Essigsäure gelöst. Die Analogonlösung wurde dann durch einen Niedrig-Protein-bindenden 0,22 Mikron MILLEX-GV-Filter, der mit 2% HSA beschichtet und mit 0,9% Natriumchlorid gespült war, geschickt. Diese Technik ermöglicht eine rasche Trennung der spezifischen radiomarkierten Probe von nicht gewünschtem Abfall.
Ein Teil dieser Filter-sterilisierten Verbindung wurde mit Sojabohne-Kasein-Verdau bei 35ºC bis 14 Tage und Thioglykolat-Medien bei 22ºC bis 14 Tage zum Test auf Bakteriumwachstum inkubiert. Ein Endotoxintest wurde mit dem E-Toxat-Kit (Sigma, St. Louis, MO) durchgeführt. Lösungen ohne bakterielles Wachstum nach 48 Stunden und ohne erkennbares Endotoxin wurden als sicher für die Verwendung am Menschen betrachtet.
Die gesamte Probenaktivität (uCi) wurde in einem Dosis-Eichgerät wenigstens 30 Minuten vor der intravenösen Injektion gemessen. Radiomarkiertes Peptid wurde durch eine periphere Armvene in einer Freifluß-intravenösen Linie injiziert. Eine Woche nach der Markierung waren nur 30% der ¹³¹I-markierten mehrfach-tyrosinierten Peptide WOC-3A und WOC- 3B, die in Salzlösung aufbewahrt worden waren, abgebaut.

Somatostatin-Rezeptorbindung und Messungen der biologischen Aktivität

Die menschliche Neuroblastom-Zellinie IMR32 (ATCC CCL 127), die Typ 2-Somatostatin- Rezeptoren (SSTR2) exprimiert, wurde in den Somatostatin-Rezeptor-Bindetests verwendet. Die IMR32-Zellen wurden in minimal essential Medien (MEM), die mit 15% Hitze-inaktiviertem fötalen Rinderserum, 100 U/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin und nicht essentiellen Aminosäuren supplementiert worden waren, gehalten. Kultivierte Zellen wurden in einen Puffer mit 20 mM HEPES, 2 mM MgCl&sub2;, 5 mM EDTA, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 150 mM NaCl und 50 ug/ml Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), pH 7,4, bei einer Konzentration von 1 · 10&sup6; Zellen/ml geerntet. Zellmembranen wurden gemäß dem Verfahren von O'Dorisio, M. S., et al., Cell Growth and Differentiation 5: 1-8, 1994, hergestellt. Membranfraktionen wurden mittels Differentialzentrifugation hergestellt, die Membranen in Puffer resuspendiert und bei -80ºC für die Rezeptor-Bindestudien aufbewahrt.
Bindetests wurden gemäß dem Verfahren von O'Dorisio et al., supra, durchgeführt. Somatostatin-Rezeptor-Bindetests wurden in Medien mit 50 mM HEPES, 10 mM CaCl&sub2;, 5mM MgCl&sub2;, 50 ng/ml Bacitracin, 200 KIU/ml Aprotinin, 0,02 ug/ml PMSF und 0,5% Rinderserumalbumin durchgeführt. Spezifische Bindung von sowohl ¹²&sup5;I-mehrfach-tyrosinierten Somatostatin- Analoga als auch ¹²&sup5;I-nativem Somatostatin (S-14) wurde bestimmt. IMR32-Membranfraktionen (100-150 ug) wurden mit 0,015 pM ¹²&sup5;I-mehrfach-tyrosiniertem Analogon oder 1251- Somatostatin mit oder ohne steigende Konzentrationen an unmarkiertem Ligand in einem Temperatur-kontrollierten Schüttelwasserbad (17ºC) 30 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zentrifugation bei 11.000 · g für 3 Minuten beendet. Der Überstand wurde abgesaugt und die Radioaktivität des gebundenen Liganden in dem Pellet in einem y-Counter quantifiziert.
Spezifische Bindung wurde mit Hilfe des Unterschieds zwischen gesamter und nichtspezifischer (in Gegenwart von 1 uM unmarkiertem Liganden) Bindung berechnet. Gleichgewichts- Dissoziationskonstanten (KD) und die maximale Anzahl an Bindestellen (Bmax) wurden mit Hilfe von sieben Konzentrationen des unmarkierten Peptids in einer kompetitiven Bindungskurve bestimmt und mit Hilfe einer computerisierten nicht linearen Anpassung der kleinsten Quadrate an die Massengesetz-Gleichung von Munson und Rodbard berechnet (Munson, P. J., et al., Anal. Biochem. 107: 220-239, 1980, modifiziert durch McPhearson, G. A., J. of Pharm. Meth. 14: 213-228, 1985). Die Ergebnisse dieser Tests mit WOC-2A, WOC-2B, WOC-3A, WOC-3B, WOC-4 und WOC-8 sind in Tabelle 3 gezeigt. Bindekurven für natives Somatostatin, WOC-2A und WOC-3B sind in Fig. 1A, 1B bzw. 1C gezeigt. Fig. 1D ist ein Diagramm einer zusammengesetzten Kurve, die die relativen Affinitäten von nativem Somatostatin, WOC-2A und WOC-3B und dem käuflichen Somatostatin-Analogon LANREOTIDE® zeigt. TABELLE 3
* Anzahl der auf GH-Freisetzung getesteten Proben.
Ein Aussetzen der IMR-32-Membranen für das radiomarkierte Somatostatin-Analogon WOC-3A resultierte in einer starken Gesamtbindung. Falls Membranen mit gebundenem radiomarkierten WOC-3A in Gegenwart eines 10.000-fachen Überschusses an unmarkiertem WOC-3A oder nativem Somatostatin inkubiert wurden, wurde keine Radioaktivität ersetzt. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass halogenierte, mehrfach-tyrosinierte Analoga Somatostatin-Rezeptoren irreversibel (oder nahezu irreversibel) binden und deuten an, dass diese Somatostatin-Analoga in der Zelle internalisiert werden können.
Die mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga wurden ebenfalls auf ihre Fähigkeit zur Hemmung der Freisetzung von Wachstumshormon (GH) aus akut zerstreuten Ratten-Hypophysenzellen, die SSTR2 exprimieren, getestet. Hypophysen aus erwachsenen männlichen Charles River-CD-Ratten (Wilmington, MA), die unter kontrollierten Bedingungen gehalten worden waren (mit Licht von 05.00-19.00 h) wurden zerteilt und mit Hilfe aseptischer Techniken gemäß eines zuvor beschriebenen, modifizierten Protokolls kultiviert (Höfer et al., Mol. Cell. Endocrinol. 35: 229, 1984, Ben-Jonathan et al., Methods Enzymol. 103: 249, 1983 und Heiman et al., Endocrinology 116: 410, 1985).
Hyophysen wurden aus enthaupteten Ratten entfernt, zerschnitten und dann in ein silikonisiertes Flüssigkeits-Scintillationsgefäß mit 2 ml 0,2% Trypsin (Worthington Biochemicals, Freehold, NJ) in steril gefiltertem Krebs-Ringer Bicarbonatpuffer, supplementiert mit 1% Rinderserumalbumin, 14 mM Glucose, modifizierter Eagle Medium (MEM)-Vitaminlösung und MEM-Aminosäuren (Gibco Laboratories, Grand Island, NY) (KRBGA) gelegt. Alle Glasgegenstände waren silikonisiert wie beschrieben von Sayers et al., Endocrinology 88: 1063, 1971. Die Hypophysenfragmente wurden 35 min bei 37ºC unter Schütteln in einem Wasserbad inkubiert. Der Inhalt der Gefäße wurde dann in ein Scintillationsgefäß mit 2 ml 0,1% DNAse (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in KRBGA gefüllt und 2 Minuten bei 37ºC unter Schütteln inkubiert. Nach Inkubation wurde das Gewebe in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen abgegossen und man ließ es absetzen. Das Medium wurde verworfen und die Hypophysenteile wurden dreimal mit 1 ml frischem KRBGA gewaschen. Die Zellen wurden in 2 ml 0,05% LBI (lima bean trypsin inhibitor, Worthington Biochemicals) durch vorsichtiges Aufziehen der Fragmente in und Herausdrücken aus einer silikonisierten, feuerpolierten Pasteur- Pipette verteilt. Verteilte Zellen wurden durch ein Nylonnetz (Tetko, Elmsford, NY) mit 630 um Durchmesser in ein neues 15 ml Zentrifugenröhrchen filtriert. Das erste Röhrchen wurde zusätzlich mit 2 ml 0,05% LBI-Lösung gespült und die Lösung wurde mittels Filtrierung in das zweite Röhrchen transferiert.
Die zerstreuten Zellen wurden mit etwa 15 ml steril filtriertem, Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (Gibco), supplementiert mit 2,5% fötalem Kälberserum (Gibco), 3% Pferdeserum (Gibco), 10% frischem Rattenserum (für nicht länger als 1 Stunde auf Eis aufbewahrt) aus den Hypophysenspendern, 1% MEM nicht-essentielle Aminosäuren (Gibco), Gentamycin (10 ng/ml, Sigma) und Nystatin (10.000 U/ml, Gibco) weiter verdünnt. Die Zellen wurden in ein 50 ml Glas-Extraktionsgefäß mit einem runden Boden und einer großen Öffnung gegeben, mit einem Hämocytometer gezählt (etwa 2.000.000 Zellen pro Hypophyse) und zufällig bei einer Dichte von 200.000 Zellen pro Well ausplattiert (Co-star Cluster 24, Rochester Scientific Co., Rochester, NY). Die ausplattierten Zellen wurden in Dulbeccos Medium und in einer befeuchteten Umgebung aus 95% Luft und 5% CO&sub2; 4 bis 5 Tage bei 37ºC gehalten.
Zur Vorbereitung der Hormongabe wurden die Zellen dreimal mit Medium 199 (Gibco) gewaschen, um altes Medium und flottierende Zellen zu beseitigen. Jede Somatostatin- Dosis oder Dosis eines Analogons (in silikonisierten Teströhrchen verdünnt) wurde in Gegenwart von 1 nM GRF (1-29) NH&sub2; in dreifachen Wells in einem Gesamtvolumen von 1 ml Medium 199 mit 1% BSA (Fraktion V; Sigma) getestet. Nach 3 h bei 37ºC in einer Luft/Kohlendioxid-Atmosphäre (95/5%) wurde das Medium entfernt und bis zum Test des Hormongehalts bei -20ºC aufbewahrt. IC&sub5;&sub0;-Werte (eine Konzentration, die für eine halbmaximale Hemmung der GH-Freisetzung sorgt) wurden mit Hilfe des Computerprogramms SigmaPlot (Jandel Scientific, San Rafael, CA) berechnet.
Die Ergebnisse der Tests einer gehemmten GH-Freisetzung sind in Tabelle 3 gezeigt. Alle getesteten mehrfach-tyrosinierten Somatostatin-Analoga hemmten die GH-Freisetzung. Der direkte Zusammenhang zwischen Bindung des Somatostatin-Rezeptors und Hemmung der Wachstumshormon-Freisetzung, zwischen Somatostatin-Rezeptorbindung und Hemmung der Wachstumshormon-Freisetzung wird in Rayner, Mol. Pharmacol. 43: 838-844, 1993, erörtert.
Die vorstehenden Daten zeigen, dass mehrfach-tyrosinierte Peptid-Analoga nicht nur an Somatostatin-Rezeptoren binden, sondern auch die biologische Aktivität von Somatostatin aufrecht erhalten.
Beispiel einer in vivo-Diapnose und Therapie an einem menschlichen Patienten HC ist ein 75 Jahre alter weißer Mann, bei dem vor etwa 5 Jahren ein bronchoalveoläres Karzinom der Lunge diagnostiziert worden war. HC unterzog sich einer oberen rechten Lobektomie und einer intensiven Chemotherapie mit vielen Wirkstoffen. Seine Erkrankung verschlimmerte sich während dieser Behandlungen. Ein Scan mit ¹¹¹In-markiertem Pentetreotid (OCTREOSCAN®) zeigte viele, über beide Lungenhälften verteilte Tumore. Aufgrund dieser Erkenntnisse wurde dem Patienten subkutan Octrotidacetat (2 mg/Tag) gegeben, das zuerst mittels dreier räumlich voneinander getrennter Injektionen und sodann durch eine kontinuierliche subkutane Infusion mittels einer batteriebetriebenen Pumpe verabreicht worden war. Der Patient vertrug diese Therapie gut und wies anfänglich eine 25%ige Abnahme des Tumorvolumens auf. Nach den darauffolgenden Monaten schritten die Tumore des Patienten trotz der Therapie fort.
Die Octreotidacetat-Therapie wurde abgesetzt und der Patient unterzog sich eine Woche später erneut einem ¹¹¹In-Pentetreotid (Octreoscan®)-Scanning. Dieser Scan zeigte, dass sich bei HC etwa 15 Gehirnmetastasen entwickelt hatten und dass er immer noch positiv bezüglich des Lungentumors war. Keine weiteren zusätzlichen Metastasen wurden entdeckt.
Nach sorgfältiger Beratung mit dem behandelnden Arzt und dem Onkologen kam man zu dem Ergebnis, dass dieser Patient alle herkömmlichen Therapiemöglichkeiten durchlaufen hatte. Da der Tumor des Patienten radiomarkierte Somatostatin-Analoga band, wie durch den ¹¹¹I-Pentetreotid-Scan festgestellt wurde, könnte eine Therapie mit radiomarkierten Somatostatin-Analoga wirksam sein, da diese Analoga die Radioaktivität direkt zu dem Tumor bringen. Die erforderliche Verwendung von radiomarkierten Somatostatin-Analoga wurde sofort eingeleitet.
Das mehrfach-tyrosinierte Somatostatin-Analogon WOC-3A wurde radiomarkiert und seine Bindung an Somatostatin-Rezeptor wie vorstehend beschrieben getestet. Eine Probe ¹³¹I WOC-3A (1,6 mCi) wurde hergestellt (Iso-Tex Corporation, Friendswood, TX) und seine Sterilität und Pyrogenizität bei Iso-Tex getestet. Radiomarkiertes WOC-3A wurde intravenös injiziert und die Pharmakokinetiken und Bioverteilung der radiomarkierten Verbindung berechnet. Das Verhältnis der Verteilung von radiomarkiertem WOC-3A in Tumor/normalem Gewebe betrug etwa 3 : 1 bis 6 : 1.
Nach Injektion von 1,6 mCi ¹³¹I WOC-3A unterzog sich der Patient einem dreitägigen Nuklearmedizin-Scanning mit einer SPECT-Kamera mit 3 Köpfen und einer ADAC-Kamera.
Zusätzlich wurde die Gesamtstrahlung im ganzen Körper gemessen, um einen Verlust des Radioisotops im gesamten Körper über den Zeitraum von 3 Tagen zu berechnen. Diese Studien deuteten an, dass eine Dosis von 1500 mCi eine tumorizide Dosis für eine Strahlentherapie bereitstellen kann, wobei sie sich innerhalb des Toleranzbereichs einer Strahlenexposition für normales Gewebe aller Gewebearten mit der Ausnahme von Knochenmark befindet. Knochenmark würde einen Überschuß von 450 rads (eine Dosis, die eine Knochenmarkstransplantation in 50% der Patienten erforderlich macht) erhalten. Somit unterzog sich der Patient in Vorbereitung der Knochenmarkstransplantation einer Knochenmarksentnahme, um Zellen für eine Reinfusion nach der WOC-3-Therapie und ausreichender Entfernung des radiomarkierten Analogons aus dem Blutkreislauf des Patienten sicherzustellen.
Der Patient erhielt 1610 mCi der Präparation des radiomarkierten Somatostatin-Analogons mittels intravenöser Infusion über einen Zeitraum von 1 Stunde. Die Präparation des Analogons enthielt 582 mCi, 758 mCi WOC-3A und 221 mCi WOC-3B. Um eine Anhäufung des exkretierten ¹³¹I-Analogons im Darm zu verhindern, wurde ein Dobhoff-Rohr im Dünndarm eingesetzt. Das Rohr wurde mit 500 cc/h Go-Lytely® gespült. Während des gesamten Zeitraums der Go-Lytely®-Verabreichung saß der Patient auf einer Toilette, die dazu ausgelegt war, kontinuierlich zu spülen und den radioaktiven Abfall so schnell wie möglich zu verdünnen. Diese Behandlung wurde am Medical Center von Louisiana in New Orleans (Charity Hospital) in einem Blei-verkleideten Raum in einem isolierten Teil des Krankenhauses durchgeführt. Sich in der Luft befindliches freies ¹³¹I wurde aus der Luft mit einem Aktivkohlefilter in einer Serie mit einem UHEPA-Filter herausgefiltert. Die gesamte Strahlenbelastung des Personals wurde kontinuierlich mit Personen-Dosimetern überwacht. Die "State of Louisiana Nuclear Regulatory Agency" stellte zwei Kontrolleure zur Verfügung, um für eine Personensicherheit zu sorgen.
Sechs Tage nach der Verabreichung des radiomarkierten Somatostatin-Analogons verringerte sich die Radioaktivität im gesamten Körper des Patienten auf eine Menge, die einen Nuklearmedizin-Scan seines Gehirns erlaubte. Die Radioaktivität in seinem Brustkorb war zu diesem Zeitpunkt immer noch zu hoch für ein Scanning.
Nachfolgend zeigte sich beim Patienten eine Herzrhythmusstörung (vorzeitige Vorhofkontraktionen mit einer raschen ventrikulären Reaktion), die eine Digitalisierung erforderlich machte. Der Patient wurde auf die Intensivstation verlegt und es zeigte sich durch Veränderungen der Enzyme und des EKG, dass er einen myokardialen Infarkt hatte. Er hatte bisher zwei myokardiale Infarkte, von denen der jüngere etwa 5 Monate vor der Therapie zurücklag. Am siebten Tag nach Verabreichung des 131I-Somatostatin-Analogons zeigte der Patient eine lethale Herzrhythmusstörung und verstarb. Eine Autopsie wurde 7 Tage nach Injektion durchgeführt und normales/Tumorgewebe zur Bestimmung der mCi-Werte an ¹³¹I in jedem Gramm Gewebe entnommen. Zusätzlich wurde eine Standard-Autopsie für eine Histologie durchgeführt. Biopsiematerialien aus Gehirn, Muskel und Schilddrüse wurden einer Autoradiographie unterzogen, um eine Exposition von Silberkörnchen durch ¹³¹I-WOC-3 zu ermöglichen. Eine Ablagerung von Silberkörnchen wurde im Gehirn beobachtet, was andeutet, dass das ¹³¹I-WOC-3 die Blut-Hirn-Schranke überschritten hatte. Eine Ablagerung von Silberkörnchen wurde auch in der Schilddrüse beobachtet, jedoch nicht im Muskel. Die letzte Beobachtung weist darauf hin, dass die ¹³¹I-WOC-3-Lokalisation Gewebe-spezifisch ist und mit einer Gewebe-spezifischen Expression von Somatostatin-Rezeptoren einhergeht.
Die groben Erkenntnisse der Autopsie zeigten eine schwere Erkrankung der Koronararterie mit "trockenen Röhren"-Koronararterien, einer Anzahl von alten Kardialnarben in Übereinstimmung mit früheren myokardialen Infarkten und als Hinweis auf einen neueren sub-endokardialen Infarkt. Es gab keinen Hinweis auf ein signifikantes Gehirnödem oder eine andere Dysfunktion eines Organs.
Das normale Gehirn und Gehirntumore waren deutlich voneinander unterscheidbar und das Verhältnis an mCi/g Gewebe in dem Gehirntumor/normalen Gehirn betrug 12 : 1. Keine signifikante Radioaktivität wurde im Herz entdeckt. Die diffuse Gestalt der miliaren Lungentumore des Patienten machten eine Unterscheidung zwischen normaler Lunge und Lunge mit Tumor sehr schwierig. Somit war eine Bestimmung der Verhältnisse zwischen Tumor/normalem Gewebe in der Lunge unmöglich.
Daraufhin wurden Proben von Tumor- und normalem Gewebe mittels Autoradiographie untersucht. Signifikante Mengen der Radioaktivität wurden im Gehirntumor entdeckt und eine begrenzte Menge war innerhalb des normalen Gehirngewebes verteilt. Obwohl diese Ergebnisse nicht einzig den mehrfach-tyrosinierten Analoga aufgrund der Gegenwart von LANREOTIDE® in der injizierten Zubereitung zugewiesen werden können, stimmen die Verhältnisse von Bindung an Tumor zu normalem Gewebe mit der präoperativen Scanning- Diagnose mit WOC-3A allein überein.
Weitere erfindungsgemäße Ausführungsformen werden von den nachstehenden Ansprüchen umfaßt.

Claims

1. Eine Verbindung mit einer Formel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) (Y)n+1P,

b) (Y)-Ala-Y-P, und

c)

in der P ein Somatostatin-Peptid-Analogon ist, das an einen Somatostatin-Rezeptor bindet, Y ein D-Tyrosin-, L-Tyrosin- oder Desamino-Tyrosinrest ist, n eine ganze Zahl von einschließlich 1 bis 32 ist, jedes q unabhängig eine ganze Zahl von einschließlich 1 bis 32 ist, jedes s unabhängig eine ganze Zahl von einschließlich 1 bis 32 ist, q und s gleich oder verschieden sein können und X der folgenden Formel entspricht

D-NH&sub2;CH(CH&sub2;)mNH&sub2;-CO&sub2;H oder

L-NH&sub2;CH(CH&sub2;)mNH&sub2;CO&sub2;H,

in der m eine ganze Zahl von einschließlich 1 bis 10 ist.

2. Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei P ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

a) Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH&sub2;,

b) Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH&sub2; und

c) Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr(ol).

3. Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei X ein Lysinrest ist.

4. Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei die Verbindung ein Halogenatom umfaßt, das an einen D-Tyrosin-, L-Tyrosin- oder Desamino-Tyrosinrest der Verbindung gebunden ist.

5. Verbindung gemäß Anspruch 4, wobei das Halogenatom radioaktiv markiert ist.

6. Verbindung gemäß Anspruch 5, wobei das radioaktiv markierte Halogenatom 123j 124j ¹²&sup5;I, ¹²&sup9;I oder ¹³¹I ist.

7. Verbindung mit einer Formel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

8. Verbindung gemäß Anspruch 7, weiter umfassend ein an einen Tyrosinrest gebundenes Halogenatom.

9. Verbindung gemäß Anspruch 8, wobei der Tyrosinrest ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus L-Tyrosin, D-Tyrosin und Desamino-Tyrosin.

10. Verbindung gemäß Anspruch 8, wobei das Halogenatom radioaktiv markiert ist.

11. Verbindung gemäß Anspruch 9, wobei das radioaktiv markierte Halogenatom ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: ¹²³I, ¹²&sup4;I, ¹²&sup5;I, ¹²&sup9;I und ¹³¹I.

12. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend:

eine Verbindung gemäß Anspruch 1, und

einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

13. Verfahren zur in vitro-Diagnose eines Tumors, der mit einer abweichenden Expression eines Somatostatin-Rezeptors in Verbindung steht, umfassend die Schritte:

Erhalten einer Gewebeprobe eines Patienten, wobei das Gewebe im Verdacht steht, einen Somatostatin-Rezeptor abweichend zu exprimieren,

Kontaktieren der Probe mit einer Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei die Verbindung mit einem nachweisbaren Marker versehen ist und das Kontaktieren eine Bindung der Verbindung an die Somatostatin-Rezeptoren der Probe erlaubt, und

Nachweis des Bindungsgrades des Markers mit der Probe, wobei ein Bindungsgrad des Markers mit der Probe, der signifikant höher als ein Bindungsgrad mit einer negativen Kontrollprobe ist, auf einen Tumor hinweist, der mit einer abweichenden Expression eines Somatostatin-Rezeptors in dem Patienten in Verbindung steht.