DE69604298T2

DE69604298T2 - Varianten des grünen fluoreszenzproteins, gfp

Info

Publication number: DE69604298T2
Application number: DE69604298T
Authority: DE
Inventors: Sara Bjorn; Lars Poulsen; Ole Thastrup; Soren Tullin
Original assignee: BioImage AS
Current assignee: Fisher BioImage ApS
Priority date: 1995-09-22
Filing date: 1996-01-31
Publication date: 2000-05-18
Anticipated expiration: 2016-02-01
Also published as: US7314915B2; US20020107362A1; DK0851874T3; ATE184613T1; US6172188B1; JP3535177B2; WO1997011094A1; CA2232727C; CA2232727A1; AU4482996A; EP0851874A1; JP2004024258A; DE69604298D1; US6818443B2; EP0851874B1; US20050054050A1; JPH11512441A; ES2139329T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Varianten des Fluoreszenzproteins GFP mit verbesserten Fluoreszenzeigenschaften.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Entdeckung, daß das Grüne Fluoreszenzprotein (GFP) aus der Qualle A. victoria bei Expression in heterologen Zellen seine Fluoreszenzeigenschaften behält, stellte der biologischen Forschung ein neues, einzigartiges und wirkungsvolles Werkzeug zur Verfügung (Chalfie et al. (1994), Science 263: 802; Prasher (1995), Trends in Genetics 11: 320; WO 95/07463).
Ferner hat die Entdeckung einer blau fluoreszierenden Variante von GFP (Heim et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 12501) die potentiellen Anwendungsmöglichkeiten des Einsatzes fluoreszierender rekombinanter Sonden zur Verfolgung von zellulären Ereignissen oder Funktionen stark erhöht, da die Verfügbarkeit von Sonden mit unterschiedlichen Anregungs- und Emissionsspektren die gleichzeitige Verfolgung von mehr als einem Prozeß ermöglicht.
Jedoch weist die von Heim et al. beschriebene blau fluoreszierende Variante, Y66H-GFP, bestimmte Beschränkungen auf Die blaue Fluoreszenz ist schwach (Emissionsmaximum bei 448 nm), was somit den Nachweis schwierig macht und eine längere Anregung von Zellen, die Y66H-GFP exprimieren, erfordert. Darüber hinaus ist die längere Anregungszeitspanne zellschädigend, insbesondere da die Anregungswellenlänge im UV-Bereich, 360 nm - 390 nm, liegt.
Ein sehr wichtiger Aspekt der Verwendung rekombinanter Fluoreszenzproteine bei der Untersuchung zellulärer Funktionen ist die nicht-invasive Natur des Assays. Dies ermöglicht den Nachweis zellulärer Ereignisse in intakten, lebenden Zellen. Eine Beschränkung bei gegenwärtigen Fluoreszenzproteinen besteht jedoch darin, daß relativ hochintensive Lichtquellen für die Sichtbarmachung erforderlich sind. Insbesondere bei der blauen Variante, Y66H-GFP, ist es erforderlich, mit Intensitäten anzuregen, welche die meisten Zellen schädigen. Es ist erwähnenswert, daß einige zelluläre Ereignisse wie Oszillationen in intrazellulären Signalsystemen, z. B. zytosolischem freiem Calcium, sehr lichtempfindlich sind. Eine weitere Folge der geringen Lichtemission ist, daß nur hohe Expressionsniveaus nachgewiesen werden können. Der Erhalt eines derartig hohen Expressionsniveaus kann die transkriptionale und/oder translationale Maschinerie der Zellen belasten.
Das Anregungsspektrum des Grünen Fluoreszenzproteins aus Aequorea victoria zeigt zwei Peaks: Ein Hauptpeak bei 396 nm, welcher im potentiell zelischädigenden UV-Bereich liegt, und ein geringerer Peak bei 475 nm, welcher in einem Anregungsbereich liegt, der für Zellen wesentlich weniger schädlich ist. Heim et al. (1995), Nature, Bd. 373, S. 663-4, offenbaren eine Ser65Thr-Mutation von GFP (S65T) mit längeren Wellenlängen von Anregung und Emission, 490 nm bzw. 510 nm, als das Wildtyp-GFP und bei der die Fluorophor-Bildung etwa viermal schneller als bei dem Wildtyp-GFP vonstatten ging.
Die Expression von GFP oder dessen fluoreszierenden Varianten in lebenden Zellen bietet ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung zellulärer Ereignisse und es ist wohlbekannt, daß viele Zellen, einschließlich Säugerzellen, bei etwa 37ºC inkubiert werden, um ein optimales und/oder physiologisch relevantes Wachstum sicherzustellen. Zellinien, die von verschiedenen Organismen oder Geweben stammen, können unterschiedliche relevante Temperaturen im Bereich von etwa 35ºC für Fibroblasten bis etwa 38ºC - 39ºC für Maus-β-Zellen aufweisen. Die Erfahrung hat jedoch gezeigt, daß das Fluoreszenzsignal von Zellen, die GFP exprimieren, schwach oder abwesend ist, wenn die Zellen bei Temperaturen oberhalb von Raumtemperatur inkubiert werden, vgl. Webb, C. D. et al., Journal of Bacteriology, Okt. 1995, S. 5906-5911; Ogawa H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 92, S. 11899-11903, Dezember 1995, und Lim et al., J. Biochem. 118, 13-17 (1995). Die von Heim et al. (1995) oben beschriebene verbesserte Fluoreszenzvariante S65T zeigt ebenfalls sehr geringe Fluoreszenz bei Inkubation unter normalen Kulturbedingungen (37ºC), vgl. Kaether und Gerdes, FEBS Letters 369 (1995), S. 267- 271. Viele Experimente, die sich mit der Untersuchung des Zellmetabolismus befassen, sind abhängig von der Möglichkeit, die Zellen bei physiologisch relevanten Temperaturen, d. h., Temperaturen bei etwa 37ºC, zu inkubieren.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung neuer Fluoreszenzproteine, wie z. B. F64L-GFP, F64L-Y66H-GFP und F64L-S65T-GFP, die zu einer zellulären Fluoreszenz führen, welche die zelluläre Fluoreszenz aus Zellen, welche die Stammproteine exprimieren, d. h., GFP, die blaue Variante Y66H-GFP bzw. die S65T-GFP-Variante, weit übersteigt. Dies erhöht die Nützlichkeit von Fluoreszenzproteinen bei der Untersuchung zellulärer Funktionen in lebenden Zellen sehr.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung neuer Fluoreszenzproteine, welche eine hohe Fluoreszenz in diese exprimierenden Zellen aufweisen, wenn die Zellen bei einer Temperatur von 30ºC oder darüber, vorzugsweise bei einer Temperatur von 32ºC bis 39ºC, noch bevorzugter bei einer Temperatur von 35ºC bis 38ºC, und am meisten bevorzugt bei einer Temperatur von etwa 37ºC inkubiert werden.
Es ist bekannt, daß die Fluoreszenz bei Wildtyp-GFP auf der Anwesenheit eines Chromophors beruht, welcher durch Cyclisierung und Oxidation des SYG an Position 65-67 in der vorausgesagten primären Aminosäuresequenz gebildet wird und mutmaßlich aus denselben Gründen durch Cyclisierung und Oxidation der SHG- Sequenz und anderer GFP-Analoga an den Positionen 65-67, vgl. Heim et al. (1994). Wir haben überraschenderweise festgestellt, daß eine Mutation, vorzugsweise eine Substitution, des F-Aminosäurerests an Position 1, die dem S des SYG- oder SHG-Chromophors oder dem T des THG-Chromophors vorangeht, bei Position 64 in der vorausgesagten primären Aminosäuresequenz, zu einer substantiellen Erhöhung der Fluoreszenzintensität anscheinend ohne Verschiebung der Anregungs- und Emissionswellenlängen führt. Diese Erhöhung ist bemerkenswert für die blaue Variante Y66H-GFP, welche aufgrund ihrer schwachen Fluoreszenz bisher nicht für biologische Systeme geeignet war.
Die F64L-, F64I-, F64V-, F64A- und F64G-Substitionen sind bevorzugt, wobei die F64L-Substitution am meisten bevorzugt ist, jedoch werden andere Mutationen, z. B. Deletionen, Insertionen oder posttranslationale Modifikationen, die dem Chromophor unmittelbar vorangehen, ebenfalls von der Erfindung umfaßt, vorausgesetzt, daß sie zu verbesserten Fluoreszenzeigenschaften der verschiedenen Fluoreszenzproteine führen. Es sollte beachtet werden, daß umfangreiche Deletionen zu einem Verlust der Fluoreszenzeigenschaften von GFP führen können. Es wurde gezeigt, daß nur ein Rest vom Aminoterminus und weniger als 10 oder 15 vom Carboxyterminus geopfert werden kann/können, bevor die Fluoreszenz verloren geht, vgl. Cubitt et al., TIBS, Bd. 20 (11), S. 448-456, November 1995.
Dementsprechend betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Fluoreszenzprotein, das ein Derivat des Grünen Fluoreszenzproteins (GFP) von Aequorea ist oder ein beliebiges funktionelles GFP-Analogon, wobei die Aminosäure in Position 1 stromaufwärts des Chromophors mutiert worden ist unter Bereitstellung einer Erhöhung der Fluoreszenzintensität, wenn das Fluoreszenzprotein der Erfindung in Zellen exprimiert wird. Überraschenderweise führt diese Mutation auch zu einer signifikanten Erhöhung der Intensität des Fluoreszenzsignals von Zellen, die das mutierte GFP exprimieren und bei 30ºC oder oberhalb von 30ºC, vorzugsweise bei etwa 37ºC, inkubiert werden, im Vergleich zu GFP-Varianten des Standes der Technik.
Es gibt mehrere Vorteile der Proteine der Erfindung, einschließlich:
Anregung mit niederenergetischen Lichtquellen. Aufgrund des hohen Leuchtstärkegrades von F64L-Y66H-GFP und F64L-GFP kann deren emittiertes Licht sogar nach Anregung mit niederenergetischen Lichtquellen nachgewiesen werden. Dadurch ist es möglich, zelluläre Phänomene, wie z. B. Oszillationen in interzellulären Signalsystemen, die für eine lichtinduzierte Schädigung anfällig sind, zu untersuchen. Nachdem die Intensität des emittierten Lichts von den neuen blau und grün emittierenden Fluoreszenzproteinen dieselbe Stärke hat, ist es möglich, diese gleichzeitig unter Verwendung derselben Lichtquelle sichtbar zu machen.
Ein Echtzeit-Reportermolekül für Genexpression in lebenden Zellen ist nunmehr möglich, da die Fluoreszenz von F64L-Y66H-GFP und F64L-GFP viel schneller als die von Wildtyp-GFP und bisher bekannten Derivaten davon ein nachweisbares Niveau erreicht. Somit ist es für Echtzeitstudien von Genexpression in lebenden Zellen besser geeignet. Eine nachweisbare Fluoreszenz kann aufgrund einer kürzeren Reifungszeit des Chromophors, einer höheren Emissionsintensität oder eines stabileren Proteins oder einer Kombination davon schneller erhalten werden.
Eine gleichzeitige Expression der neuen Fluoreszenzproteine unter der Kontrolle von zwei oder mehreren separaten Promotoren.
Die Expression von mehr als einem Gen kann gleichzeitig ohne irgendeine Schädigung von lebenden Zellen verfolgt werden.
Eine gleichzeitige Expression der neuen Proteine unter Verwendung eines Reportermoleküls als interner Referenz und des anderen als variabler Marker, da die regulierte Expression eines Gens quantitativ durch Fusion eines Promotors mit z. B. F64L-GFP (oder F64L-Y66H-GFP), Messung der Fluoreszenz und Normalisierung auf die Fluoreszenz von konstitutiv exprimiertem F64L-Y66H-GFP (oder F64L-GFP) nachgewiesen werden kann. Das konstitutiv exprimierte F64L-Y66H- GFP (oder F64L-GFP) dient als interne Referenz.
Verwendung als Protein-Markierung in lebenden und fixierten Zellen. Aufgrund der starken Fluoreszenz sind die neuen Proteine geeignete Markierungen für Proteine, die in niedrigen Konzentrationen vorliegen. Da kein Substrat erforderlich ist und die Sichtbarmachung der Zellen die Zellen nicht schädigt, kann eine dynamische Analyse durchgeführt werden.
Verwendung als Organellen-Markierung. Mehr als eine Organelle kann gleichzeitig markiert und in lebenden Zellen sichtbar gemacht werden, z. B. das Endoplasmatische Retikulum und das Zytoskelett.
Verwendung als Marker in Zell- oder Organell-Fusionen. Durch Markierung von zwei oder mehr Zellen oder Organellen mit den neuen Proteinen, z. B. F64L-Y66H- GFP bzw. F64L-GFP, können Fusionen, wie z. B. Heterokaryon-Bildung, verfolgt werden.
Eine Translokation von Proteinen, die mit den neuen Proteinen der Erfindung fusioniert sind, kann sichtbar gemacht werden. Die Translokation von intrazellulären Proteinen zu einer speziellen Organelle kann sichtbar gemacht werden durch Fusionierung des Proteins von Interesse mit einem Fluoreszenzprotein, z. B. F64L- Y66H-GFP, und Markierung der Organelle mit einem anderen Fluoreszenzprotein, z. B. F64L-GFP, welches Licht einer unterschiedlichen Wellenlänge emittiert. Die Translokation kann dann als Spektralverschiebung der Fluoreszenzproteine in der speziellen Organelle nachgewiesen werden.
Verwendung als Sekretionsmarker. Durch Fusion der neuen Proteine mit einem Signalpeptid oder einem zu sekretierenden Peptid kann die Sekretion online in lebenden Zellen verfolgt werden. Eine Voraussetzung dafür ist, daß die Reifung einer nachweisbaren Anzahl neuer Fluoreszenzprotein-Moleküle schneller als die Sekretion geschieht. Dies scheint für die Fluoreszenzproteine GFP oder Y66H- GFP des Standes der Technik nicht der Fall zu sein.
Verwendung als genetisches Reportermolekül oder Proteinmarkierung in transgenen Tieren. Aufgrund der starken Fluoreszenz der neuen Proteine eignen sie sich als Markierung für Proteine und Genexpression, da das Signal-Rauschverhältnis gegenüber Proteinen des Standes der Technik, wie z. B. Wildtyp-GFP, signifikant verbessert ist.
Verwendung als Indikatoren von Zell- oder Organellintegrität. Durch Coexpression von zwei der neuen Proteine, wobei eines eine Organelle als Ziel hat und das andere im Zytosol exprimiert wird, ist es möglich, den relativen Austritt des zytosolischen Proteins zu berechnen und dies als Maß für die Zellintegrität zu verwenden.
Verwendung als Indikatoren für Veränderungen in der Zellmorphologie. Die Expression der neuen Proteine in Zellen erlaubt einen leichten Nachweis von Veränderungen der Zellmorphologie, z. B. Bläschenbildung, die durch zytotoxische Agentien oder Apoptose verursacht werden. Solche morphologischen Veränderungen sind in intakten Zellen ohne den Einsatz fluoreszierender Sonden schwer sichtbar zu machen.
Verwendung als Transfektionsmarker und als Marker, der in Kombination mit FACS-Sortierung eingesetzt werden soll. Aufgrund der erhöhten Leuchtstärke der neuen Proteine kann die Qualität des Zellnachweises und der Zellsortierung signifikant verbessert werden.
Verwendung der neuen Proteine als Echtzeit-Kinase-Verhältnis-Sonde durch gleichzeitige Expression von z. B. F64L-GFP (oder F64L-Y66H-GFP), welches nach Phosphorylierung mehr Licht emittiert, und eines Derivats von F64L-Y66H- GFP, welches nach Phosphorylierung weniger Licht emittiert. Dadurch würde das Verhältnis der beiden Intensitäten die Kinase-Aktivität genauer offenbaren als nur eine Sonde.
Verwendung als Echtzeit-Sonde, die bei nahezu physiologischen Konzentrationen arbeitet. Nachdem die neuen Proteine bei etwa 37ºC signifikant leuchtstärker als Wildtyp-GFP und Derivate des Standes der Technik sind, kann die für die Sichtbarmachung erforderliche Konzentration verringert werden. Target-Stellen für Enzyme, die in die neuen Proteine, z. B. F64L-Y66H-GFP oder F64L-GFP, eingeführt wurden, können deshalb in der Zelle in niedrigen Konzentrationen in lebenden Zellen vorhanden sein. Dies ist aus zwei Gründen wichtig 1) Die Sonde darf den zu untersuchenden intrazellulären Prozeß so wenig wie möglich stören; 2) der translationale und transkriptionale Apparat sollte nur minimal belastet werden.
Die neuen Proteine können als Echtzeit-Sonden, basierend auf Energietransfer, eingesetzt werden. Ein Sonden-System, das auf Energietransfer von z. B. F64L- Y66H-GFP zu F64L-GFP basiert.
Die neuen Proteine können als Reportermoleküle zur Verfolgung lebender/toter Biomasse von Organismen, wie z. B. Pilzen, eingesetzt werden. Durch konstitutive Expression von F64L-Y66H-GFP oder F64L-GFP in Pilzen wird die lebensfähige Biomasse aufleuchten.
Transposon-Vektor-Mutagenese kann unter Verwendung der neuen Proteine als Marker in transkriptionalen und translationalen Fusionen durchgeführt werden.
Transposons, die in Mikroorganismen eingesetzt werden sollen, kodierend für die neuen Proteine. Die Transposons können für translationale und transkriptionale Fusionen konstruiert werden. Sie können für die Suche nach Promotoren eingesetzt werden.
Transposon-Vektoren, welche für die neuen Proteine kodieren, wie z. B. F64L- Y66H-GFP und F64L-GFP, können zur Markierung von Plasmiden und Chromosomen eingesetzt werden.
Die Verwendung der neuen Proteine ermöglicht die Untersuchung des Transfers konjugativer Plasmide, da mehr als ein Parameter in lebenden Zellen verfolgt werden kann. Das Plasmid kann durch F64L-Y66H-GFP oder F64L-GFP markiert werden und das Chromosom des Donors/Empfängers durch F64L-Y66H-GFP oder F64L-GFP.
Verwendung als Reportermolekül für Bakterien-Nachweis durch Einführung der neuen Proteine in das Genom von Bakteriophagen.
Durch Einführung der neuen Proteine, z. B. F64L-Y66H-GFP oder F64L-GFP, in das Genom eines Phagen kann ein diagnostisches Werkzeug konstruiert werden. F64L-Y66H-GFP oder F64L-GFP wird nur nach Transfektion des Genoms in einen lebenden Wirt exprimiert werden. Die Wirtsspezifität ist durch den Bakteriophagen definiert.
Jede(s) hier beschriebene neue Merkmal oder Kombination von Merkmalen wird als für diese Erfindung essentiell betrachtet.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das neue Fluoreszenzprotein die F64L-Mutante von GFP oder die blaue Variante Y66H- GFP, wobei die Mutante erhöhte Fluoreszenzintensität zeigt. Eine bevorzugte Sequenz des für GFP kodierenden Gens, erhalten aus Aequorea victoria, ist hier in Fig. 2 offenbart. Fig. 2 zeigt die Nukleotidsequenz eines Wildtyp-GFP (Hind3- EcoR1-Fragment) und die Aminosäuresequenz, wobei das Startcodon ATG der Position 8 entspricht und das Stopcodon TAA der Position 722 in der Nukleotidsequenz entspricht. Ein Mikroorganismus, E. coli NN049087, der die in Fig. 2 dargestellte DNA-Sequenz trägt, wurde für das Patenterteilungsverfahren gemäß dem Budapester Vertrag bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Bundesrepu blik Deutschland, unter der Hinterlegungsnummer DSM 10260 hinterlegt. Eine weitere Sequenz eines Isotyps dieses Gens wird von Prasher et al., Gene 111, 1992, S. 229-233 (GenBank-Zugriffsnummer M62653) offenbart. Im übrigen können die neuen Fluoreszenzproteine auch von anderen fluoreszierenden Proteinen, z. B. dem Fluoreszenzprotein des Seestiefmütterchens Renilla reniformis, erhalten werden.
Die hier für die Aminosäuren verwendeten Abkürzungen sind die in J. Biol. Chem. 243 (1968), 3558, angegebenen.
Das DNA-Konstrukt der Erfindung, kodierend für die neuen Fluoreszenzproteine, kann synthetisch nach etablierten Standardverfahren, z. B. dem von Beaucage und Caruthers beschriebenen Phosphoamidit-Verfahren, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869, oder dem von Matthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801- 805, beschriebenen Verfahren, hergestellt werden. Nach dem Phosphoamidit- Verfahren werden Oligonukleotide synthetisiert, z. B. in einem automatischen DNA-Synthesizer, gereinigt, verschmolzen, ligiert und in geeignete Vektoren kloniert.
Das DNA-Konstrukt kann auch durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung spezifischer Primer hergestellt werden, wie z. B. beschrieben in US 4,683,202 oder Saiki et al., Science 239 (1988), 487-491. Ein aktuellerer Überblick über PCR-Methoden ist in PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, Kalifornien, USA, zu finden.
Das DNA-Konstrukt der Erfindung kann in einen rekombinanten Vektor inseriert werden, welcher jeder beliebige Vektor sein kann, der günstig rekombinanten DNA-Prozeduren unterworfen werden kann. Die Wahl des Vektors wird oft von der Wirtszelle abhängen, in die er eingeführt werden soll. So kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, d. h., ein Vektor, der als extrachromosomales Gebilde existiert, dessen Replikation unabhängig von chromosomaler Replikation ist, z. B. ein Plasmid. Alternativ kann der Vektor einer sein, der bei Einführung in eine Wirtszelle in das Genom der Wirtszelle integriert und zusammen mit dem oder den Chromosom(en), in das bzw. die es integriert wurde, repliziert wird.
Der Vektor ist vorzugsweise ein Expressionsvektor, in dem die DNA-Sequenz, die für das Fluoreszenzprotein der Erfindung kodiert, funktionsfähig mit zusätzlichen Segmenten verknüpft ist, die zur Transkription der DNA erforderlich sind. Im allgemeinen ist der Expressionsvektor von Plasmid- oder viraler DNA abgeleitet oder kann Elemente von beiden enthalten. Der Begriff "funktionsfähig verknüpft" zeigt an, daß die Segmente so angeordnet sind, daß sie für die beabsichtigten Zwecke zusammenwirken, z. B. die Transkription an einen Promotor beginnt und durch die DNA-Sequenz, die für das Fluoreszenzprotein der Erfindung kodiert, fortschreitet.
Der Promotor kann jede beliebige DNA-Sequenz sein, welche transkriptionale Aktivität in der Wirtszelle der Wahl zeigt, und kann von Genen stammen, die für Proteine kodieren, welche entweder homolog oder heterolog zu der Wirtszelle sind, einschließlich nativen Aequorea-GFP-Genen.
Beispiele geeigneter Promotoren zur Steuerung der Transkription der DNA- Sequenz, welche für das Fluoreszenzprotein der Erfindung kodiert, in Säugerzellen sind der SV40-Promotor (Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854-864), der MT-1 (Metallothionein-Gen)-Promotor (Palmiter et al., Science 222 (1983), 809- 814) oder der "major late"-Promotor des Adenovirus 2.
Ein Beispiel eines geeigneten Promotors zur Verwendung in Insektenzellen ist der Polyhedrin-Promotor (US 4,745,051; Vasuvedan et al., FEBS Lett. 311, (1992) 7- 11), der P10-Promotor (J.M. Vlak et al., J. Gen. Virology 69, 1988, S. 765-776), der Promotor des basischen Proteins des Virus Autographa californica polyhedrosis (EP 397 485), der "immediate early gene 1"-Baculovirus-Promotor (US 5,155,037; US 5,162,222) oder der "39K delayed-early gene"-Baculovirus- Promotor (US 5,155,037; US 5,162,222).
Beispiele geeigneter Promotoren zur Verwendung in Hefe-Wirtszellen umfassen Promotoren von Glycolyse-Genen der Hefe (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073-12080; Alber und Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419-434) oder Alkoholdehydrogenase-Genen (Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al., Hrsg.), Plenum Press, New York, 1982) oder die TPI1- (US 4,599,311) oder ADH2-4c-Promotoren (Russel et al., Nature 304 (1983), 652-654).
Beispiele geeigneter Promotoren zur Verwendung in Wirtszellen filamentöser Pilze sind beispielsweise der ADH3-Promotor (McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093-2099) oder der tpiA-Promotor. Beispiele anderer geeigneter Promotoren sind diejenigen, welche von dem Gen stammen, das für TAKA-Amylase aus A. oryzae, Asparaginsäure-Proteinase aus Rhizomucor miehei, neutrale α-Amylase aus A. niger, säurestabile α-Amylase aus A. niger, Glucoamylase (gluA) aus A. niger oder A. awamori, Lipase aus Rhizomucor miehei, alkalische Protease aus A. oryzae, Triosephosphatisomerase aus A. oryzae oder Acetamidase aus A. nidulans kodiert. Bevorzugt sind die TAKA-Amylase- und gluA-Promotoren.
Beispiele geeigneter Promotoren zur Verwendung in Bakterienwirtszellen umfassen den Promotor des maltogenen Amylase-Gens aus Bacillus stearothermophilus, des α-Amylase-Gens aus Bacillus licheniformis, des BAN-Amylase-Gens aus Bacillus amyloliquefaciens, des Gens der alkalischen Protease aus Bacillus subtilis oder des Xylosidase-Gens aus Bacillus pumilus, oder die Lambda-Phagen-PR- oder PL-Promotoren oder die lac-, trp- oder tac-Promotoren von E. coli.
Die DNA-Sequenz, welche für die neuen Fluoreszenzproteine der Erfindung kodiert, kann auch erforderlichenfalls funktionsfähig mit einem geeigneten Terminator verknüpft sein, wie z. B. dem Humanwachstumshormon-Terminator (Palmiter et al., op. cit.) oder (für Pilzwirte) den TPI1- (Alber und Kawasaki, op. cit.) oder ADH3-Terminatoren (McKnight et al., op. cit.). Der Vektor kann ferner Elemente wie z. B. Polyadenylierungssignale (z. B. aus SV40 oder der Adenovirus 5-Elb- Region), transkriptionale Enhancer-Sequenzen (z. B. den SV40-Enhancer) und translationale Enhancer-Sequenzen (z. B. diejenigen, welche für Adenovirus VA- RNAs kodieren) enthalten.
Der rekombinante Vektor kann ferner eine DNA-Sequenz umfassen, welche dem Vektor die Replikation in der fraglichen Wirtszelle ermöglicht. Ein Beispiel einer solchen Sequenz (wenn die Wirtszelle eine Säugerzelle ist) ist der SV40- Replikationsursprung.
Ist die Wirtszelle eine Hefezelle, so sind geeignete Sequenzen, die dem Vektor die Replikation ermöglichen, die Replikationsgene REP 1-3 und der Replikationsursprung des Hefeplasmids 2u.
Der Vektor kann auch einen selektierbaren Marker umfassen, z. B. ein Gen, dessen Produkt einen Defekt in der Wirtszelle ergänzt, wie z. B. das Gen, welches für Dihydrofolatreduktase (DHFR) kodiert, oder das TPI-Gen von Schizosaccharomyces pombe (beschrieben von P. R. Russell, Gene 40, 1985, S. 125-130) oder eines, welches Resistenz gegenüber einem Arzneimittelwirkstoff verleiht, z. B. Ampicillin, Kanamycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Neomycin oder Hygromycin. Für filamentöse Phagen umfassen selektive Marker amdS, prG, argB, niaD, sC.
Die Verfahren, welche eingesetzt werden, um die für das Fluoreszenzprotein der Erfindung kodierenden DNA-Sequenzen, die Promotorsequenz und gegebenenfalls die Terminatorsequenz und/oder sekretorische Signalsequenz zu ligieren und diese in geeignete Vektoren einzuführen, welche die für die Replikation erforderliche Information enthalten, sind Fachleuten wohlbekannt (vgl. beispielsweise Sambrook et al., op. cit.).
Die Wirtszelle, in welche das DNA-Konstrukt oder der rekombinante Vektor der Erfindung eingeführt wird, kann jede beliebige Zelle sein, welche zur Expression des vorliegenden DNA-Konstrukts imstande ist, und umfaßt Bakterien, Hefen, Pilze und höhere eukaryotische Zellen.
Beispiele von bakteriellen Wirtszellen, welche bei Kultivierung imstande sind, das DNA-Konstrukt der Erfindung zu exprimieren, sind grampositive Bakterien, wie z. B. Bacillus-Stämme wie B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megatherium oder B. thuringiensis, oder Streptomyces-Stämme wie S. lividans oder S. murinus, oder gramnegative Bakterien wie Escherichia coli. Die Transformation der Bakterien kann durch Protoplasten-Transformation erfolgen oder durch Einsatz kompetenter Zellen in an sich bekannter Weise (vgl. Sambrook et al., supra).
Beispiele geeigneter Säuger-Zellinien sind die HEK293- und die HeLa-Zellinien, Primärzellen und die COS- (z. B. ATCC CRL 1650), BHK- (z. B. ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10), CHL- (z. B. ATCC CCL 39) oder CHO-Zellinien (z. B. ATCC CCL 61). Verfahren zur Transfektion von Säugerzellen und zur Expression von DNA-Sequenzen, die in die Zellen eingeführt wurden, werden beispielsweise in Kaufman und Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 602-621; Southern und Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327-341; Loyter et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 79 (1982), 422-426; Wigler et al., Cell 14 (1978), 725; Corsaro und Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603; Graham und von der Eb, Virology 52 (1973), 456; und Neumann et al., EMBO J. 1 (1982), 841-845, beschrieben.
Beispiele geeigneter Hefezellen umfassen Zellen von Saccharomyces spp. oder Schizosaccharomyces spp., insbesondere Stämme von Saccharomyces cerevisiae oder Saccharomyces kluyveri. Verfahren zur Transformation von Hefezellen mit heterologer DNA und zur Produktion von heterologen Polypeptiden daraus werden beispielsweise in US 4,599,311, US 4,931,373, US 4,870,008, 5,037,743 und US 4,845,075 beschrieben, von denen hier alle durch die Bezugnahme mit eingeschlossen sind. Transformierte Zellen werden durch einen Phänotyp selektiert, welcher von einem selektierbaren Marker bestimmt wird, gewöhnlich Arzneimittelresistenz oder die Fähigkeit, in Abwesenheit eines bestimmten Nährstoffes, z. B. Leucin, zu wachsen. Ein bevorzugter Vektor zur Verwendung in Hefe ist der in US 4,931,373 offenbarte POT1-Vektor. Der DNA-Sequenz, welche für das Fluoreszenzprotein der Erfindung kodiert, kann eine Signalsequenz und gegebenenfalls eine Leadersequenz, z. B. wie oben beschrieben, vorangehen. Weitere Beispiele geeigneter Hefezellen sind Stämme von Kluyveromyces, z. B. K. lactis, Hansenula, z. B. H. polymorpha, oder Pichia, z. B. P. pastoris (vgl. Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132, 1986, S. 3459-3465; US 4,882,279).
Beispiele anderer Pilzzellen sind die Zellen filamentöser Pilze, z. B. Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarium spp. oder Trichoderma spp., insbesondere Stämme von A. oryzae, A. nidulans oder A. niger. Die Verwendung von Aspergillus spp. zur Expression von Proteinen wird beispielsweise in EP-272 277, EP-230 023, EP-184 438 beschrieben.
Wird ein filamentöser Pilz als Wirtszelle eingesetzt, kann er mit dem DNA- Konstrukt der Erfindung transformiert werden, günstigerweise durch Integration des DNA-Konstrukts in das Wirtschromosom, um eine rekombinante Wirtszelle zu erhalten. Diese Integration wird im allgemeinen als Vorteil betrachtet, da die DNA- Sequenz mit größerer Wahrscheinlichkeit stabil in der Zelle aufrechterhalten wird. Die Integration der DNA-Konstrukte in das Wirtschromosom kann nach üblichen Verfahren, z. B. durch homologe oder heterologe Rekombination, erfolgen.
Die Transformation von Insektenzellen und Produktion heterologer Polypeptide darin kann erfolgen wie in US 4,745,051; US 4,879,236; US 5,155,037; 5,162,222; EP 397 485) beschrieben, von denen alle durch die Bezugnahme hier mit eingeschlossen sind. Die als Wirt eingesetzte Insektenzellinie kann geeigneterweise eine Lepidoptera-Zellinie sein, z. B. Zellen von Spodoptera frugiperda oder Zellen von Trichoplusia ni (vgl. US 5,077,214). Die Kulturbedingungen können geeigneterweise wie z. B. in WO 89/01029 oder WO 89/01028 oder irgendeiner der vorgenannten Referenzen beschrieben sein.
Die oben beschriebene transformierte oder transfizierte Wirtszelle wird dann in einem geeigneten Nährmedium unter Bedingungen kultiviert, welche die Expression des vorliegenden DNA-Konstrukts erlauben, wonach die Zellen in dem Screening-Verfahren der Erfindung eingesetzt werden können. Alternativ können die Zellen aufgebrochen werden, wonach Zellextrakte und/oder Überstände hinsichtlich Fluoreszenz analysiert werden können.
Das zur Kultivierung der Zellen eingesetzte Medium kann jedes übliche Medium sein, welches zur Züchtung der Wirtszellen geeignet ist, wie z. B. Minimalmedien oder komplexe Medien, die geeignete Ergänzungen enthalten. Geeignete Medien sind von kommerziellen Lieferanten erhältlich oder können nach veröffentlichten Rezepten (z. B. in Katalogen der American Type Culture Collection) hergestellt werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Fluoreszenz von Zellen, die mit dem DNA-Konstrukt der Erfindung transformiert oder transfiziert wurden, geeigneterweise in einem Spektrometer oder einem Fluoreszenzmikroskop gemessen werden, wobei die Spektraleigenschaften der Zellen in Flüssigkultur als Abtastungen ("scans") der Lichtanregung und -emission bestimmt werden können.
Die Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen erläutert.

Beispiel 1

Klonierung von cDNA, die für GFP kodiert

In Kürze, Gesamt-RNA, aus A. victoria nach einem Standardverfahren (Sambrook et al., Molecular Cloning. 2. Aufl. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York), 7.19-7.22) isoliert, wurde unter Verwendung der reversen Transkriptase aus AMV (Promega, Madison, XVI, USA) wie vom Hersteller empfohlen in cDNA überführt. Die cDNA wurde dann PCR-amplifiziert, wobei PCR-Primer, die auf der Grundlage einer bereits veröffentlichten GFP- Sequenz (Prasher et al., Gene 111 (1992), 229-233; GenBank- Hinterlegungsnummer M62653) konstruiert worden waren, zusammen mit der UlTmaTM-Polymerase (Perkin Elmer, Foster City, CA, USA) eingesetzt wurden. Die Sequenzen der Primer waren: GFP-2: TGGAATAAGCTTTATGAG- TAAAGGAGAAGAACTTTT und GFP-1: AAGAATTCGGATCCCTTT- AGTGTCAATTGGAAGTCT. Restriktionsendonuklease-Stellen, die in die 5'- Primer (eine HindIII-Stelle) und 3'-Primer (EcoRI- und BamHI-Stellen) inseriert worden waren, erleichterten die Klonierung der PCR-amplifizierten GFP-cDNA in einen leicht modifizierten pUC19-Vektor. Die Details der Konstruktion waren wie folgt: LacZ-Shine-Dalgarno-AGGA, unmittelbar gefolgt von der 5'-HindIII-Stelle plus einem zusätzlichen T und dem GFP-ATG-Codon, ergab die folgende DNA- Sequenz am lacZ-Promotor-GFP-Fusionspunkt: PLacZ-AGGAAAGCTTTATG- GFP. Am 3'-Ende der GFP-cDNA wurde das Basenpaar, welches Nukleotid 770 in der veröffentlichten GFP-Sequenz (GenBank-Hinterlegungsnummer M62653) entsprach, mit der EcoRI-Stelle der pUC19-Mehrfachklonierungsstelle (MCS) über eine PCR-erzeugte BamHI-, EcoRI-Linker-Region fusioniert.
Die DNA-Sequenz und vorausgesagte primäre Aminosäuresequenz von GFP ist unten in Fig. 2a dargestellt. Ein weitere DNA-Sequenz, welche für dieselbe Aminosäuresequenz wie in Fig. 2a dargestellt kodiert, ist in Fig. 2b dargestellt. Zur Erzeugung der blau fluoreszierenden Variante, die von Heim et al. (1994) beschrieben wurde, wurde ein PCR-Primer, inkorporierend die Y66H-Substitution, welche für die Änderung der grünen Fluoreszenz in blaue Fluoreszenz verantwortlich ist, als 5'-PCR-Primer in Kombination mit einem GFP-spezifischen 3'-Primer eingesetzt. Die Matrize war der oben beschriebene GFP-Klon. Die Sequenz des 5'- Primers ist 5'-CTACCTGTTCCATGGCCAACGCTTGT- CACTACTTTCCTCATGGTGTTCAATGCTTTTCTAGATACCC-3'. Dessen 5'- Ende entspricht Position 164 in der GFP-Sequenz. Zusätzlich zu der Y66H- Substitution führt der 5'-Primer eine A-zu-T-Änderung an Position 223 ein; diese Mutation erzeugt eine Xba1-Stelle ohne Änderung einer Aminosäure. Der 5'- Primer enthält auch die natürlich vorkommende Nco1-Erkennungssequenz (Position 173 in der GFP-Sequenz). Die Sequenz des 3'-Primers ist 5'- AAGAATTCGGATCCCTTTAGTGTCAATTGGAAGTCT-3'. Position 3 vom 5'- Ende ist die erste Base der EcoR1-Erkennungsstelle, welche dem 3'-Ende der GFP-Sequenz entspricht. Das resultierende PCR-Produkt wurde mit Nco1 und EcoR1 verdaut und in ein Nco1-EcoR1-Vektorfragment kloniert, um das gesamte Y66H-GFP-Gen zu rekonstituieren.
E. coli-Zellen, die einen Expressionsvektor, enthaltend Y66H-GFP, trugen, wurden über Nacht in Gegenwart von 10 ug pro ml N-Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin gezüchtet. Plasmid-DNA wurde isoliert, das Hind3-EcoR1-Insert von 764 bp, enthaltend Y66H-GFP, wurde isoliert und in ein Hind3-EcoR1 verdautes Vektorfragment kloniert, was die Expression des Inserts in E. coli erlaubte. E. coli- Transformanten wurden auf blaue Fluoreszenz bei Anregung mit einem UV-Licht von 365 nm überprüft und Kolonien, welche stärker als Wildtyp-GFP zu fluoreszieren schienen, wurden identifiziert.
10 ng DNA aus einer bestimmten Kolonie wurden als Matrize in einer PCR- Reaktion eingesetzt, die 1,5 Einheiten Taq-Polymerase (Perkin Elmer), 0,1 mM MnCl&sub2;, jeweils 0,2 mM an dGTP, dCTP und dTTP, 0,05 mM dATP, 1,7 mM MgCl&sub2; und den vom Hersteller empfohlenen Puffer enthielt. Die eingesetzten Primer flankieren das Y66H-GFP-Insert. Die Sequenz des 5-Primers war 5'- AATTGGTACCAAGGAGGTAAGCTTTATGAG-3'; sie enthält eine Hind3- Erkennungssequenz. Die Sequenz des 3'-Primers war 5'- CTTTCGTTTTGAATTCGGATCCCTTTAGTG-3'; sie enthält eine EcoR1- Erkennungssequenz.
Das PCR-Produkt wurde mit Hind3 und EcoR1 verdaut und in ein Hind3-EcoR1- verdautes Vektorfragment kloniert, was die Expression des Inserts in E. coli erlaubte. E. coli-Transformanten wurden auf blaue Fluoreszenz bei Anregung mit einem UV-Licht von 365 nm überprüft und Kolonien, welche stärker als Y66H- GFP zu fluoreszieren schienen, wurden identifiziert. Plasmid-DNA aus einer stark fluoreszierenden Kolonie (als BX12-1A bezeichnet) wurde isoliert und das Y66H- GFP-Insert einer Sequenzbestimmung unterworfen. Die Mutation F64L wurde identifiziert. Diese Mutation ersetzt den Phenylalaninrest, welcher der SHG- Tripeptid-Chromophor-Sequenz von Y66H-GFP vorangeht, durch Leucin. Es lagen keine anderen Aminosäureaustausche in der Y66H-GFP-Sequenz von BX12- 1A vor. Die DNA-Sequenz und die vorausgesagte primäre Aminosäuresequenz von F64L-Y66H-GFP ist in Fig. 3 unten dargestellt.

Beispiel 2

F64L-GFP wurde wie folgt konstruiert: Ein E. coli-Expressionsvektor, enthaltend Y66H-GFP, wurde mit den Restriktionsenzymen Nco1 und Xba1 verdaut. Die Erkennungssequenz von Nco1 ist an Position 173 und die Erkennungssequenz von Xba1 ist an Position 221 in der im folgenden aufgeführten F64L-Y66H-GFP- Sequenz lokalisiert. Das große Nco1-Xba1-Vektorfragment wurde isoliert und mit einem synthetischen Nco1-Xba1-DNA-Linker der folgenden Sequenz ligiert:
Ein DNA-Strang besitzt die Sequenz:
5'-CATGGCCAACGCTTGTCACTACTCTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTT-3'.
Der andere DNA-Strang besitzt die Sequenz:
5'-CTAGAAAAGCATTGAACACCATAAGAGAGAGTAGTGACAAGCGTTGGC-3'.
Nach Anlagerung bilden die beiden Stränge ein Nco1-Xba1-Fragment, welches die Sequenz des GFP-Chromophors SYG mit der F64L-Substitution, die SYG vorangeht, inkorporiert. Die DNA-Sequenz und vorausgesagte primäre Aminosäuresequenz von F64L-GFP ist in Fig. 4 unten dargestellt.
Die S65T-GFP-Mutation wurde von Heim et al. beschrieben (Nature, Bd. 373, S. 663-664, 1995). F64L-S65T-GFP wurde wie folgt konstruiert: Ein E. coli- Expressionsvektor, enthaltend Y66H-GFP, wurde mit den Restriktionsenzymen Nco1 und Xba1 verdaut. Die Erkennungssequenz von Nco1 ist an Position 173 und die Erkennungssequenz von Xba1 ist an Position 221 in der im folgenden aufgeführten F64L-Y66H-GFP-Sequenz lokalisiert. Das große Nco1-Xba1- Vektorfragment wurde isoliert und mit einem synthetischen Nco1-Xba1-DNA- Linker der folgenden Sequenz ligiert:
Ein DNA-Strang besitzt die Sequenz:
5'-CATGGCCAACGCTTGTCACTACTCTCACTTATGGTGTTCAATGCTTTT-3'.
Der andere DNA-Strang besitzt die Sequenz:
5'-CTAGAAAAGCATTGAACACCATAAGTGAGAGTAGTGACAAGCGTTGGC-3'.
Nach Verschmelzung bilden die beiden Stränge ein Nco1-Xba1-Fragment, welches die F64L- und S65T-Mutationen in dem GFP-Chromophor inkorporiert. Die DNA-Sequenz und vorausgesagte primäre Aminosäuresequenz von F64L-S65T- GFP ist in Fig. 5 unten dargestellt.
Der E. coli-Expressionsvektor enthält einen durch IPTG (Isopropylthiogalactosid) induzierbaren Promotor. Der verwendete E. coli-Stamm ist ein del(lacZ)MI5- Derivat von K 803 (Sambrook et al., supra).
Das in dem pGFP-N1-Plasmid (erhältlich von Clontech Laboratories) vorhandene GFP-Allel wurde in den durch IPTG induzierbaren E. coli-Expressionsvektor auf folgende Weise eingeführt
1 ng pGFP-N1-Plasmid-DNA wurde als Matrize in einer Standard-PCR-Reaktion eingesetzt, wobei der 5'-PCR-Primer die Sequenz:
5'- TGGAATAAGCTTTATGAGTAAAGGAGAAGAACTT'-3' besaß
und der 3'-PCR-Primer die Sequenz:
5'-GAATCGTAGATC7ITTATTTGTATAGTTCATCCATG-3' besaß.
Die Primer flankieren das GFP-N1-Insert in dem Vektor pGFP-N1. Der 5'-Primer umfaßt das ATG-Startcodon, dem eine Hind3-Klonierungsstelle vorangeht. Der 3'- Primer umfaßt ein TAA-Stopcodon, gefolgt von einer Bgl2-Klonierungsstelle.
Das PCR-Produkt wurde mit Hind3 und Bgl2 verdaut und in ein Hind3-BamH1- verdautes Vektorfragment hinter einem durch IPTG induzierbaren Promotor kloniert, was die Expression des Inserts in E. coli in Anwesenheit von IPTG erlaubte.
Das in dem pZeoSV-LacZ-Plasmid (erhältlich von Invitrogen) vorhandene lacZ- Gen wurde in den durch IPTG induzierbaren E. coli-Expressionsvektor auf folgende Weise eingeführt:
1 ng pZeoSV-LacZ-Plasmid-DNA wurde als Matrize in einer Standard-PCR- Reaktion eingesetzt, wobei der 5'-PCR-Primer die Sequenz:
5'-TGGAATAAGCTTTATGGATCCCGTCGTTTTACAACGTCGT-3' besaß
und der 3'-PCR-Primer die Sequenz:
5'-GCGCGAATTCTTATTATTATTTTTGACACCAGAC-3' besaß.
Die Primer flankieren das lacZ-Insert in dem Vektor pZeoSV-LacZ. Der 5'-Primer umfaßt das ATG-Startcodon, dem eine Hind3-Klonierungsstelle vorangeht. Der 3'- Primer umfaßt ein TAA-Stopcodon, gefolgt von einer EcoR1-Klonierungsstelle.
Das PCR-Produkt wurde mit Hind3 und EcoR1 verdaut und in ein Hind3-EcoR1- verdautes Vektorfragment hinter einem durch IPTG induzierbaren Promotor kloniert, was die Expression des Inserts in E. coli in Anwesenheit von IPTG erlaubte.
Zur Messung und zum Vergleich der Fluoreszenz, die in E. coli-Zellen erzeugt wurde, welche GFP, GFP-N1, F64L-GFP, F64L-S65T-GFP, Y66H-GFP, F64L- Y66H-GFP oder Beta-Galactosidase (als Hintergrundkontrolle) unter verschiedenen Bedingungen exprimierten, wurden die folgenden Experimente durchgeführt:
E. coli-Zellen, enthaltend ein Expressionsplasmid, welches die Expression eines der verschiedenen Genprodukte nach Induktion mit IPTG gestattet, wurden in LB- Medium, enthaltend 100 ug pro ml Ampicillin und kein IPTG, gezüchtet. Zu 1 ml Zellsuspension wurden 0,5 ml 50%iges Glycerin zugegeben und die Zellen eingefroren und bei -80ºC eingefroren aufbewahrt.
Zellen aus den -80ºC-Glycerin-Stammkulturen wurden in 2 ml LB-Medium, enthaltend 100 ug/ml Ampicillin, inokuliert und unter Belüftung 6 h lang bei 37ºC gezüchtet. 2 ul dieses Impfguts wurden in jedes von zwei Röhrchen überführt, die 2 ml LB-Medium mit 100 ug/ml Ampicillin und 1 mM IPTG enthielten. Die beiden Sätze von Röhrchen wurden unter Belüftung bei zwei verschiedenen Temperaturen inkubiert: Raumtemperatur (22ºC) und 37ºC.
Nach 16 h wurden 0,2-ml-Proben von Zellen entnommen, die GFP, GFP-N1, F64L-GFP, F64L-S65T-GFP, Y66H-GFP, F64L-Y66H-GFP oder β-Galactosidase exprimierten. Die Zellen wurden pelletiert, der Überstand entfernt, die Zellen wurden in 2 ml Wasser resuspendiert und in eine Küvette überführt. Fluoreszenzemissionsspektren wurden in einem LS-50-Luminometer (Perkin-Elmer) gemessen, wobei die Anregungs- und Emissionsschlitze auf 10 nm eingestellt wurden. Die Anregungswellenlängen wurden auf 398 nm und 470 nm für GFP, GFP-N1, F64L- GFP und F64L-S65T-GFP eingestellt; 398 nm ist der optimalen Anregungswellenlänge für GFP, GFP-N1 und F64L-GFP nahe, und 470 nm ist der optimalen Anregungswellenlänge für F64L-S65T-GFP nahe. Für Y66H-GFP und F64L- Y66H-GFP wurde die Anregungswellenlänge auf 380 nm eingestellt, welche der optimalen Anregungswellenlänge für diese Derivate nahe ist. β-Galactosidase exprimierende Zellen waren als Hintergrundkontrollen eingeschlossen. Nach den Messungen in dem LS-50-Luminometer wurde die optische Dichte bei 450 nm für jede Probe in einem Spektralphotometer (Lambda UV/VIS, Perkin-Elmer) gemessen. Dies ist eine Messung der gesamten Zellen in dem Assay. Luminometer-Daten wurden auf die optische Dichte der Probe normalisiert.
Die Ergebnisse der Experimente sind in Fig. 6a - 6f unten dargestellt und können wie folgt zusammengefaßt werden:
Nach 16 h bei 22ºC unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 398 nm gab es starke Signale für GFP und F64L-GFP und nachweisbare Signale für GFP- N1 und F64L-S65T-GFP, vgl. Fig. 6a.
Nach 16 h bei 37ºC mit einer Anregungswellenlänge von 398 nm gab es starke Signale für F64L-GFP, ein nachweisbares Signal für F64L-S65T-GFP und keine nachweisbaren Signale für GFP und GFP-N1, vgl. Fig. 6b.
Nach 16 h bei 22ºC mit einer Anregungswellenlänge von 470 nm gab es starke Signale für F64L-S65T-GFP, nachweisbare Signale für GFP und F64L-GFP und keine nachweisbaren Signale für GFP-N1, vgl. Fig. 6c.
Nach 16 h bei 37ºC mit einer Anregungswellenlänge von 470 nm gab es starke Signale für F64L-S65T-GFP und F64L-GFP und keine nachweisbaren Signale für GFP und GFP-N1, vgl. Fig. 6d.
Nach 16 h bei 22ºC mit einer Anregungswellenlänge von 380 nm gab es nachweisbare Signale gegenüber dem Hintergrund für Y66H-GFP und F64L-Y66H- GFP, vgl. Fig. 6e.
Nach 16 h bei 37ºC mit einer Anregungswellenlänge von 380 nm gab es kein nachweisbares Signal gegenüber dem Hintergrund für Y66H-GFP und ein starkes Signal für F64L-Y66H-GFP, vgl. Fig. 6f.
Zur Feststellung, ob die Unterschiede in den Fluoreszenzsignalen auf Unterschiede in den Expressionsniveaus zurückzuführen waren, wurde Gesamtprotein aus den E. coli-Zellen (0,5 OD&sub4;&sub5;&sub0;-Einheiten), analysiert wie oben beschrieben, mittels SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese (12%ige Tris-Glycin-Gele von BIO-RAD Laboratories) fraktioniert, gefolgt von einer Western-Blot-Analyse (ECL Western blotting von Amersham International) mit polyklonalen GFP-Antikörpern (aus Kaninchen). Das Ergebnis zeigte, daß Expressionsniveaus von GFP, GFP-N1, F64L- GFP, F64L-S65T-GFP, Y66H-GFP und F64L-Y66H-GFP sowohl bei 22ºC als auch 37ºC identisch waren. Die Unterschiede in den Fluoreszenzsignalen sind deshalb nicht auf unterschiedliche Expressionsniveaus zurückzuführen.

Beispiel 3

Einfluß der F64L-Substitution auf GFP und dessen Derivate bei Eipression in Säugerzellen

F64L-Y66H-GFP, F64L-GFP und F64L-S65T-GFP wurden in pcDNA3 (Invitrogen, Ca, USA) so kloniert, daß die Expression unter der Kontrolle des CMV- Promotors stand. Wildtyp-GFP wurde von dem pGFP-N1-Plasmid (Clontech, Ca, USA) exprimiert, bei dem der CMV-Promotor die Expression steuert. Plasmid- DNA, die zur Transfektion eingesetzt werden sollte, wurde mit Hilfe des Jetstar Plasmid-Kits (Genomed Inc. NC, USA) gereinigt und in destilliertem Wasser gelöst.
Das für die Transfektionen eingesetzte Präzipitat wurde hergestellt durch Mischen der folgenden Komponenten: 2 ug DNA in 44 ul Wasser wurden mit 50 ul 2xHBS-Puffer (280 mM NaCl, 1,5 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 12 mM Dextrose, 50 mM HE- PES) und 6,2 ul 2 M CaCl&sub2; gemischt. Die Transfektionsmischung wurde bei Raumtemperatur 25 Minutenlang inkubiert, bevor sie zu den Zellen gegeben wurde. HEK 293-Zellen (ATCC CRL 1573) wurden in 2 cm · 2 cm Deckglas- Kammern (Nung, Dänemark) mit etwa 1,5 ml Medium (Dulbecco's MEM mit Glutamax-1, 4500 mg/l Glucose und 10% FCS; Gibco BRL, MD; USA) gezüchtet. Die DNA wurde zu den Zellen bei 25-50% Konfluenz gegeben. Zellen wurden bei 37ºC in einem CO&sub2;-Inkubator gezüchtet. Vor der Sichtbarmachung wurde das Medium entfernt und 1,5 ml Ca²&spplus;-HEPES-Puffer (5 mM KCl, 140 mM NaCl, 5,5 mM Glucose, 1 mM MgSO&sub4;, 1 mM CaCl, 10 mM HEPES) wurden der Kammer zugegeben.
Transfektanten wurden mit Hilfe eines Axiovert 135 (Carl Zeiss, Deutschland) Fluoreszenzmikroskops sichtbar gemacht. Das Mikroskop war mit einer HBO 100 Quecksilber-Anregungsquelle und einem Objektiv von 40 x, Fluar, NA = 1,3 (Carl Zeiss, Deutschland) versehen. Zur Sichtbarmachung von GFP, F64L-GFP und F64L-S65T-GFP wurden die folgenden Filter eingesetzt: Anregung 480/40 nm, dichroitisch 505 nm und Emission 510LP nm (alle von Chroma Technologies Corp., Vt, USA). Zur Sichtbarmachung von F64L-Y66H-GFP wurden die folgenden Filter eingesetzt: Anregung 380/15 nm, dichroitisch 400 nm und Emission 450/65 nm (alle von Omega Optical, Vt, USA). Zellen in mehreren Kammern wurden parallel transfiziert, so daß eine neue Kammer für jeden Probenpunkt verwendet werden konnte. In Fällen, in denen die Inkubation über 8,5 h hinausging, wurde das Ca²&spplus;-Präzipitat durch Ersatz des Mediums entfernt.
Wie in Tabelle 1 gezeigt, erhöht die F64L-Mutation das Fluoreszenzsignal signifikant (Wildtyp-GFP gegenüber F64L-GFP und F64L-S65T-GFP). Fluoreszierende Zellen können bereits 1-2 h nach der Transfektion beobachtet werden, was eine effektive Reifung des Chromophors bei 37ºC anzeigt. Ferner verstärkt die F64L- Mutation andere GFP-Derivate wie die S65T-Mutante, welche ein verschobenes Anregungsspektrum aufweist, und das blaue Derivat, welches ohne die F64L- Substitution in Säugerzellen nicht nachweisbar ist.
(Anmerkung: Beim Vergleich der Ergebnisse von F64L-S65T-GFP und F64L-GFP ist zu berücksichtigen, daß sich die Anregungsspektren unterscheiden und daß der verwendete Filtersatz für F64L-S65T-GFP optimiert ist. F64L-GFP und WT-GFP haben dieselben Spektraleigenschaften.) Tabelle 1.
Erscheinungsbild fluoreszierender HEK 293-Zellen nach Transfektion mettesl Ca²&spplus;-Präzipitation
1) Zeigt die geschätzte mittlere Intensität der fluoreszierenden Zellen an.
2) Zeigt die Anzahl der fluoreszierenden Zellen an.
3) Die Zellen erreichten 100% Konfluenz.

Claims

1. Fluoreszenzprotein, das ein Derivat des Grünen Fluoreszenzproteins (Green Fluorescent Protein, GFP) ist, oder ein beliebiges funktionelles GFP-Analog, wobei die Aminosäure in Position 1, die dem Chromophor vorangeht, mutiert worden ist unter Bereitstellung einer Erhöhung der Fluoreszenzintensität, mit der Maßgabe, daß die GFP-Varianten mit den Sequenzen GSYGLL, LLYGAQ, GCYGMN, MGYGVL, VAYGML und LCYGTV in Position 64 bis 69 nicht in der erfindungsgemäßen Gruppe von Fluoreszenzproteinen enthalten sind.

2. Fluoreszenzprotein nach dem vorangehenden Anspruch, wobei der Chromophor sich in Position 65-67 der vorhergesagten primären Aminosäuresequenz von GFP befindet.

3. Fluoreszenzprotein nach einem der vorangehenden Ansprüche, das zu einer erhöhten Fluoreszenz in Zellen führt, die dieses Fluoreszenzprotein exprimieren, wenn die Zellen bei einer Temperatur von 30ºC oder über 30ºC, vorzugsweise bei einer Temperatur von 32ºC bis 39ºC, stärker bevorzugt bei einer Temperatur von 35ºC bis 38ºC, und am stärksten bevorzugt bei einer Temperatur von ungefähr 37ºC, inkubiert werden.

4. Fluoreszenzprotein nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Protein von Aequorea victorea oder Renilla reniformis stammt.

5. Fluoreszenzprotein nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Aminosäure F in Position 64 von GFP oder Y66H-GFP durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus L, I, V, A und G, substituiert worden ist.

6. Fluoreszenzprotein nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Aminosäure F in Position 1, die dem Chromophor vorangeht, durch L substituiert worden ist und die Aminosäuren des Chromophors SYG, SHG, THG oder TYG umfassen.

7. Fluoreszenzprotein nach einem der vorangehenden Ansprüche, das die Aminosäuresequenz von den hierin offenbarten Fig. 3, Fig. 4 oder Fig. 5 besitzt.

8. Fusionsverbindung, bestehend aus einem Fluoreszenzprotein (GFP) gemäß einem der Ansprüche 1-7, wobei das GFP mit einem Polypeptid verknüpft ist.

9. Fusionsverbindung nach dem vorangehenden Anspruch, wobei das Polypeptid eine Kinase, vorzugsweise die katalytische Untereinheit der Proteinkinase A oder Proteinkinase C oder Erk1 oder ein Zytoskelett-Element ist.

10. Nukleotidsequenz, kodierend für das Fluoreszenzprotein von Ansprüchen 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 oder für eine Fusionsverbindung gemäß Anspruch 8 oder 9.

11. Nukleotidsequenz nach dem vorangehenden Anspruch, ausgewählt aus den in Fig. 3, Fig. 4 und Fig. 5 gezeigten Sequenzen.

12. DNA-Konstrukt, umfassend eine geeignete Kontrollregion oder -regionen und eine Nukleotidsequenz nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Sequenz unter der Kontrolle der Kontrollregion steht.

13. DNA-Konstrukt nach dem vorangehenden Anspruch, das unter der Kontrolle des nativen GFP-Promoters oder eines konstitutiven oder regulierten Säugetier-Promoters, eines viralen Promoters, eines Hefe-Promoters, eines Promoters von filamentösen Pilzen oder eines Bakterien-Promoters steht.

14. Wirt, der mit einem DNA-Konstrukt nach Anspruch 12 oder 13 transformiert ist.

15. Wirt nach dem vorangehenden Anspruch, ausgewählt aus der folgenden Gruppe: Organismen und Zellen, die zu Bakterien, Hefen, Pilzen, Protozoen und höheren Eukaryoten gehören.

16. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das das Züchten eines Wirts nach Anspruch 14, oder 15 und das Erhalten des Polypeptids, das durch die Nukleotidsequenz exprimiert wird, aus diesem umfaßt.

17. Verfahren nach dem vorangehenden Anspruch, wobei die Expression der Nukleotidsequenz durch den nativen GFP-Promoter bewirkt wird.

18. Verwendung des Fluoreszenzproteins nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 in einem in vitro-Assay zum Messen von Proteinkinase-Aktivität oder Dephosphorylierungs-Aktivität, wobei das Fluoreszenzprotein in gereinigter Form einer biologischen Probe, vorzugsweise einem Zellextrakt, zugesetzt wird und jede beliebige Fluoreszenzänderung aufgezeichnet wird.

19. Verwendung des Fluoreszenzproteins nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 als ein Reportermolekül für die Genexpression in lebenden Zellen.

20. Verwendung des Fluoreszenzproteins nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 für das gleichzeitige Verfolgen (Monitoring) von mehr als einem Gen in lebenden, intakten Zellen.

21. Verwendung von zwei oder mehreren der Fluoreszenzproteine nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 als Organellen- oder Zell-Markierung für die gleichzeitige Sichtbarmachung von Organell- oder Zell-Prozessen in lebenden Zellen.

22. Wirt nach Anspruch 14 oder 15 zur Verwendung in einem in vivo-Assay zum Messen einer Stoffwechselaktivität, vorzugsweise einer Kinase-Aktivität und Dephosphorylierungs-Aktivität.

23. Fluoreszenzprotein nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 zur Verwendung als ein Reportermolekül für die Genexpression in lebenden Zellen.

24. Fluoreszenzprotein nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 zur Verwendung bei dem gleichzeitigen Verfolgen (Monitoring) von mehr als einem Gen in lebenden, intakten Zellen.

25. Zwei oder mehrere der Fluoreszenzproteine nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 zur Verwendung als Organellen- oder Zell-Markierung für die gleichzeitige Sichtbarmachung von Organell- oder Zell-Prozessen in lebenden Zellen.