DE69535460T2 - Pharmazeutische peptide formulierungen zur behandlung von staubmilben allergie - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Ungefähr 500 Millionen Menschen in der Welt sind allergisch gegenüber Staubmilben und man nimmt an, dass Allergie gegenüber Staubmilben ein Faktor bei 50% bis 80% der Patienten mit Asthma sowie bei einer Vielzahl von Fällen von Ekzemen, Heuschnupfen und anderen allergischen Symptomen ist. Staubmilben sind in Häusern ubiquitär und gedeihen in Betten, Vorhängen und Teppichen. Es ist äußerst schwierig, sie aus der Lebensumgebung zu entfernen und ein allergisches Individuum ist dem Allergen ständig ausgesetzt und eine solche konstante Exposition kann eine Ursache für eine Verschlechterung des allergischen Zustands mit der Zeit sein. Daher kann die Allergie gegenüber Staubmilben chronisch und schwer zu behandeln sein.
  • Allergien gegenüber Milben der Gattung Dermatophagoides wurden mit einer Anzahl an allergischen Zuständen wie Asthma, Rhinitis und ektopische Dermatitis in Verbindung gebracht. Zwei Spezies, D. pteronyssinus und D. farinae kommen vorherrschend vor und als Folge wurden beträchtliche Anstrengungen mit Versuchen unternommen, die von diesen beiden Spezies produzierten Allergene zu identifizieren.
  • Forscher haben die Bedeutung des Ansprechens auf die Gruppe I-(z. B. Der p I und Der f I) und Gruppe II-(z. B. Der p II und Der f II) Proteinallergene dokumentiert. Zum Beispiel wurde dokumentiert, dass bei über 60% der Patienten mindestens 50% ihrer Anti-Milben-Antikörper auf diese Proteine gerichtet sind (z. B., Lind, P. et al., Allergy, 39:259-274 (1984); van der Zee, J. S. et al., Journal Allergy and Clinical Immunology, 81:884-896 (1988)). Es ist möglich, dass Kinder einen größeren Grad an Reaktivität gegenüber den Gruppe I- und Gruppe II-Allergenen aufweisen (Thompson, P. J., et al., Immunology, 64:301-314 (1988)).
  • Es wurde eine konzertierte Anstrengung unternommen, die Hauptallergene sowohl aus D. pteronyssinus wie auch aus D. farinae durch Genklonierung zu charakterisieren. Demzufolge berichteten einige Veröffentlichungen die vollständige Nucleotidsequenz von einigen Allergenen, einschließlich Der p I (Thomas, W. R., et al., International Archives of Allergy and Applied Immunology, 85:127-129 (1988); und Chua, K. Y., et al., Journal of Experimental Medicine, 167:175-182 (1988)), Der p II (Chua, K. Y., et al., International Archives of Allergy and Applied Immunology, 91:118-123 (1990)), Der f I (Dilworth, R. J., et al. Clinical and Experimental Allergy, 21: 2532 (1891)), Der f II (Yuuki, T., et al., Japan Journal Allergol., 39:557-461 (1990); und Trudinger, M., et al., Clinical and Experimental Allergy, 21:33-37(1991)) und einem Allergen mit geringem Molekulargewicht (Ovey, E. R., et al., Journal of Experimental Medicine, 170:1457-1462 (1989)).
  • Die veröffentlichten Nucleotidsequenzen der für Der p I und Der f I kodierenden cDNAs zeigen, dass diese beiden Proteine auf dem Aminosäureniveau hoch homolog sind (81% Identität) und dass die Produkte des reifen Proteins aus 222 bzw. 223 Resten bestehen (Chua, K. Y., et al., Journal of Experimental Medicine, 167:175-182 (1988); und Dilworth, R. J., et al., supra)). Die Proteinallergene Der p II und Der f II bestehen beide aus 129 Resten und sind ebenfalls hoch homolog (88% Identität) in der Aminosäuresequenz (Trudinger, M., et al. supra; Yuuki, T., et al. supra); Chua, K. Y., et al, International Archives of Allergy and Applied Immunology, 91:118-123 (1990)).
  • Die Isolierung von cDNA-Klonen, die für Der p I und Der p II kodieren, hat Antikörperbindungsstudien an den rekombinanten Antigenen ermöglicht (Green, W. K., et al., International Archives of Allergy and Applied Immunology, 92:30-38(1990); Chua, K. Y., et al., International Archives of Allergy and Applied Immunology, 91:124-129 (1990)). Komplementäre DNA-Fragmente von Der p I wurden in E. coli exprimiert und bei IgE-Bindungsuntersuchungen mit vereinigten humanen, gegenüber Milben allergischen IgE-Seren wurden Bindungs- und Nichtbindungsregionen im gesamten Molekül nachgewiesen (Thomas, W. R., et al., In: Epitopes of Atopic Allergens, Proceedings of Workshop from XIV Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology, Berlin, Sept. 1989. pp 77-82). Über T-Zell-Epitope von Der p I wurde berichtet (O'Hehir, R. E., et al., Annual Review Immunology, 9:67-95 (1991); Stewart, G. A., et al., In: Epitopes of Atopic Allergens, Proceedings of Workshop from XIV Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology, Berlin, Sept. 1989. pp 41-47; Yessel, H., et al., In: T cell Activation in Health and Disease: Discrimination Between Immunity and Tolerance, Conference 22-26 Sept., 1990, Trinity College, Oxford, U. K. und Hessel, H., et al., Journal of Immunology, 148(3): 738-745 (1. Feb., 1992).
  • Derzeit wird eine Desensibilisierungstherapie für die Behandlung von Hausstaubmilben-Allergie angewandt. Eine derartige Therapie umfasst die Verabreichung eines Extrakts, dass aus Kulturen aus ganzen Hausstaubmilben gewonnen wird, an ein allergisches Individuum. Die Desensibilisierungstherapie unter Verwendung eines derartigen Extrakts hat den Nachteil, dass sie eine Anaphylaxie hervorrufen kann, wenn hohe Dosen verwendet werden, wohingegen die Behandlung, wenn zur Vermeidung einer Anaphylaxie geringe Dosen verwendet werden, nicht besonders wirksam ist und über mehrere Jahre fortgesetzt werden muss, um eine Toleranz gegenüber dem Extrakt aufzubauen.
  • WO 93/08279 und WO 94/24281 offenbaren verbesserte Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von Allergie gegenüber Hausstaubmilben, die mögliche unerwünschte Wirkungen, die mit der herkömmlichen Desensibilisierungstherapie unter Verwendung von Extrakt aus ganzen Hausstaubmilben einhergehen, stark minimieren. WO 93/08279 und WO 94/24281 offenbaren isolierte antigene Fragmente oder Peptid, die von Der p I, Der p II, Der f I und Der f II abgeleitet sind und bei Verabreichung an ein gegenüber Staubmilben sensibles Individuum in der Lage sind, die allergische Reaktion des Individuums auf die Hausstaubmilbe herunterzuregulieren. Ein solches Herunterregulieren der allergischen Reaktion des Individuums führt zu einer Verminderung oder Linderung der klassischen Symptome von Allergie, einschließlich asthmatischer Symptome, die durch Hausstaubmilben hervorgerufen werden. Derartige antigene Fragmente sind in WO 93/08279 und WO 94/24281 so beschrieben, dass sie eine T-Zell-Reaktion wie eine Stimulation (d. h. T-Zell-Proliferation oder Lymphokin-Sekretion) hervorrufen können und/oder eine Nichtempfindlichkeit der T-Zellen oder eine verminderte Empfindlichkeit der T-Zellen induzieren können, wenn diese mit einem Hausstaubmilben-Allergen konfrontiert werden. Außerdem beschreiben WO 93/08279 und WO 94/24281 , dass die am meisten bevorzugten Peptide, die von Der p und Der f Gruppe I- und Gruppe II-Proteinallergenen abgeleitet wurden und für therapeutische Verwendung geeignet sind, nicht IgE binden, was für solche Der p- und Der f-Proteine spezifisch ist, oder IgE in einem deutlich geringeren Ausmaß binden als das native Staubmilben-Proteinallergen, wodurch die Möglichkeit einer Anaphylaxie in einem Behandlungsplan, der derartige Peptide umfasst, vermindert oder beseitigt wird. Weiterhin offenbaren WO 93/08279 und WO 94/24281 , dass die im Falle der Kreuzreaktivität innerhalb der Interspezies-Gruppe I-Allergene (d. h. Der p I und Der f I) und der Interspezies-Gruppe II-Allergene (d. h. Der p II und Der f II), Peptide der Gruppe I, zum Beispiel, die aus einer Spezies abgeleitet wurden (z. B., Der p I) eine T-Zell-Reaktion von T-Zellen hervorrufen können, die für die andere Spezies (z. B., Der f I) spezifisch ist, um umgekehrt. Schließlich beschreiben WO 93/08279 und WO 94/24281 Peptide, die die oben beschriebenen Eigenschaften besitzen.
  • Als Folge der ausgedehnten Anstrengungen einer Präformulierung, stellt die vorliegende Erfindung neue Zusammensetzungen und Multipeptid-Zubereitungen von aus Der p und Der f Gruppe I- und Gruppe II-Proteinallergenen abgeleiteten Peptiden bereit, die optimal für die Herstellung eines Wirkstoffprodukts sind, das für die Verwendung bei der Behandlung von Hausstaubmilben-Allergie bei Menschen und anderen Säugetieren geeignet ist. Derartige neue Zusammensetzungen und Multipeptid-Zubereitungen von Der p- und Der f-Proteinallergenpeptiden für die Verwendung als ein optimiertes humanes Wirkstoffprodukt wurden bisher nicht offenbart oder in Erwägung gezogen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt neue therapeutische Zusammensetzungen und Multipeptid-Zubereitungen von Peptiden und modifizierten Peptiden bereit, die aus Der p und Der f Gruppe I- und Gruppe II-Proteinallergenen abgeleitet wurden. Derartige neue therapeutische Zusammensetzungen und Multipeptid-Zubereitungen sind das Ergebnis eines Präformulierungsschemas zur Entwicklung eines optimierten Wirkstoffprodukts zur therapeutischen Behandlung von Menschen, die an einer Allergie gegenüber Hausstaubmilben-Allergenen leiden. Die erfindungsgemäßen Der p- und Der f-Peptide und modifizierten Peptide besitzen bestimmte einzigartige Eigenschaften, die sie besonders geeignet für die Wirkstoffprodukt-Zubereitung machen. Erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzungen und Multipeptid-Zubereitungen wurden optimiert, um die einzigartigen Eigenschaften der Peptide und modifizierten Peptide, die aus den Hausstaubmilben-Proteinallergenen abgeleitet wurden, aufzunehmen und zu bewahren und gleichzeitig eine maximale therapeutische Wirkung zu gewährleisten, wenn sie in therapeutischen Behandlungsplänen für Hausstaubmilben-Allergien bei Menschen verwendet werden. Die Erfindung stellt weiterhin neue modifizierte Peptide bereit, die aus Der p I- und Der p II-Proteinallergenen abgeleitet werden.
  • Demzufolge stellt die Erfindung eine therapeutische Zusammensetzung bereit, die zumindest ein isoliertes Peptid, ausgewählt aus der Gruppe, die aus DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27) und DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28) besteht, und zumindest ein Peptid umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, die aus DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31) DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33) besteht, alle wie in 1 dargestellt. Die Zusammensetzung ist vorzugsweise für die Verwendung in der Therapie bestimmt.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine therapeutische Zusammensetzung bereit, enthaltend:
    • a) Peptide DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28); DPI-23.1 (SEQ ID NO: 29) und DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32);
    • b) Peptide DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33);
    • c) Peptide DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.22 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33); oder
    • d) Peptide DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.22 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33).
  • Die Zusammensetzung ist vorzugsweise für die Verwendung in der Therapie bestimmt.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Multipeptid-Zubereitung für pharmazeutische Verabreichung bereit, enthaltend: a) zumindest ein isoliertes Peptid, ausgewählt aus der Gruppe, die aus DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27) und DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28) besteht und zumindest ein Peptid, ausgewählt aus der Gruppe, die aus DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 31) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33) besteht, wobei jedes Peptid bei einem pH-Wert im Bereich von pH 6,0 bis pH 8,0 löslich und stabil ist und wobei die Zubereitung einen ausreichenden Prozentsatz einer T-Zell-Aktivität von Gruppe I und Gruppe II Der f- und Der p- Hausstaubmilben-Allergenen umfasst; b) einen pharmazeutisch verträglichen Träger; und wahlweise c) ein oder mehreres von EDTA und einem pharmazeutisch verträglichen Gegenion. Vorzugsweise enthält die Zubereitung zumindest 37% T-Zell-Aktivität von Gruppe I und Gruppe II Der f- und Der p-Hausstaubmilben-Allergenen.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine optimierte Multipeptid-Zubereitung bereit, die für eine therapeutische Behandlung von Menschen geeignet ist, die unter einer Allergie gegenüber Hausstaubmilben leiden, die folgendes umfasst:
    • a) Peptide DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27); DFI-22.22 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33); und wahlweise DPII-20.9; wobei jedes Peptid in einer Konzentration von 0,75 mg pro Peptid vorliegt; 0,05M Natriumphosphat U.S.P.; 5 Gew.-% Mannitol U.S.P.; 0,1 mg/ml Dinatrium-EDTA-Dihydrat U.S.P.; und steriles Wasser zur Injektion U.S.P.; wobei die Zubereitung einen endgültigen pH-Wert von 7,2–7,4 aufweist; oder
    • b) Peptide DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.1 (SEQ ID NO: 29) und DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32); wobei jedes Peptid in einer Konzentration von 0,75 mg pro Peptid vorliegt; 0,05M Natriumphosphat U.S.P.; 5 Gew.-% Mannitol U.S.P.; 0,1 mg/ml Dinatrium-EDTA-Dihydrat U.S.P.; und steriles Wasser zur Injektion U.S.P.; wobei die Zubereitung einen endgültigen pH-Wert von 7,0 aufweist; oder c) Peptide DP1-21.2 (SEQ ID NO: 27), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33); wobei jedes Peptid in einer Konzentration von 0,75 mg pro Peptid vorliegt; 0,05M Natriumphosphat U.S.P.; 5 Gew.-% Mannitol U.S.P.; 0,1 mg/ml Dinatrium-EDTA-Dihydrat U.S.P.; und steriles Wasser zur Injektion U.S.P.; wobei die Zubereitung einen endgültigen pH-Wert von 6,2 aufweist.
  • Die Zubereitung ist vorzugsweise für die Verwendung in der Therapie bestimmt.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung erste und zweite optimierte Multipeptid-Zubereitungen für die simultane oder sequentielle Verwendung in der Therapie bereit, wobei diese erste Zubereitung Peptide DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28); DPI-23.1 (SEQ ID NO: 29) und DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) enthält; wobei jedes Peptid in einer Konzentration von 0,75 mg pro Peptid vorliegt; 0.05M Natriumphosphat U.S.P.; 5 Gew.-% Mannitol U.S.P.; 0,1 mg/ml Dinatrium-EDTA-Dihydrat U.S.P.; und steriles Wasser zur Injektion U.S.P.; mit einem endgültigen pH-Wert von 7,0; und wobei diese zweite optimierte Multipeptid-Zubereitung Peptide DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27); DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33) enthält; wobei jedes Peptid in einer Konzentration von 0,75 mg pro Peptid vorliegt; 0.05M Natriumphosphat U.S.P.; 5 Gew.-% Mannitol U.S.P.; 0,1 mg/ml Dinatrium-EDTA-Dihydrat U.S.P.; und steriles Wasser zur Injektion U.S.P.; mit einem endgültigen pH-Wert von 6,2. Vorzugsweise ist die Zubereitung zur Verwendung in der Behandlung einer Sensibilität gegenüber einem Hausstaubmilben-Allergen bestimmt.
  • Beschreibung der Abbildungen
  • 1 zeigt die Aminosäuresequenzen der erfindungsgemäßen „einzigartigen" Peptide, einschließlich der erfindungsgemäßen neuen „einzigartigen" Peptide.
  • 2 zeigt überlappende Peptide, die von Der p I- und Der p II-Proteinallergenen abgeleitet werden, die in den hier beschriebenen T-Zell-Studien verwendet wurden.
  • 3 ist eine graphische Darstellung, die T-Zell-Reaktionen auf die in 2 gezeigten überlappenden Der p I-Peptide und die in 1 gezeigten „einzigartigen" Gruppe I-Peptide DPI-21.2 (SEQ ID NO 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO 30) zeigt. Der über jeder Säule gezeigte (in Klammern) mittlere S.I. sowie der Prozentsatz von Reaktionen, der Positivitätsindex (mittlerer S.I. multipliziert mit dem Prozentsatz der Reaktionen), ist die Y-Achse.
  • 4 ist eine graphische Darstellung, die T-Zell-Reaktionen auf die in 2 gezeigten überlappenden Der p II-Peptide, DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33) und die in 2 gezeigten „einzigartigen" Der p II-Peptide zeigt. Der über jeder Säule gezeigte (in Klammern) mittlere S.I. sowie der Prozentsatz von Reaktionen, der Positivitätsindex (mittlerer S.I. multipliziert mit dem Prozentsatz der Reaktionen), ist die Y-Achse.
  • 5 ist ein pH-Löslichkeitsprofil von „einzigartigen" Kandidatenpeptiden DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33), in 50 mM Natriumphosphatpuffern mit 5% Mannitol. Die Löslichkeit wird in mg/ml (y-Achse) über einen pH-Wertbereich von pH 5,5 bis pH 8,5 bei etwa 22°C ± 2 gemessen.
  • 6 ist ein pH-Stabilitätsprofil von Kandidatenpeptiden DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33), in einer gleichen Konzentrationskombination. Zersetzung von Peptid wird berechnet als %-Zersetzung (bestimmt durch die Peakfläche unter Verwendung von HPLC-Analyse) von Peptid, beobachtet nach 24 Stunden bei etwa 22°C ± 2 und etwa 5°C, bei verschiedenen theoretischen Konzentrationen von 3,0, 2,0 und 1,0 mg/ml Peptid über einen pH-Wertbereich von 6,0 bis 8,5.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die Patent- und wissenschaftliche Literatur, auf die sich hier bezogen wird, bildet das Wissen, das Fachleuten auf dem Gebiet zugänglich ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt neue modifizierte Der p I- und Der p II-Peptide bereit, die zusammen mit anderen Der p I- und Der f I-Peptiden Teil eines Präformulierungsschemas zur Entwicklung eines optimierten Wirkstoffprodukts zur therapeutischen Behandlung von Menschen sind, die an einer Allergie gegenüber Hausstaubmilben-Allergene leiden. Derartige Peptide und modifizierte Peptide besitzen bestimmte einzigartige Eigenschaften, die sie besonders geeignet für die Wirkstoffprodukt-Zubereitung machen und können hier als „einzigartige" Peptide bezeichnet werden.
  • In Übereinstimmung mit pharmazeutischer Chemie ist eine Präformulierung das Verfahren, einen Wirkstoff durch Bestimmung und/oder Definition von dessen physikalischen und chemischen Eigenschaften zu optimieren, die bei der Formulierung einer stabilen, wirksamen und sicheren Dosierungsform für wichtig erachtet werden. Die möglichen Wechselwirkungen mit den verschiedenen Komponenten, die in dem fertigen Wirkstoffprodukt angewendet werden sollen, werden ebenfalls in Betracht gezogen. Die Präformulierung ist ein intensiver Aufwand, der die Untersuchung solcher Parameter wie Löslichkeit, pH-Stabilitätsprofil und Wirkstoff-Hilfsstoff-Wechselwirkungen umfasst, die eine tiefgreifende Wirkung auf die physiologische Verfügbarkeit des Wirkstoffs und dessen physikalische und chemische Stabilität haben kann. Die aus derartigen Untersuchungen erhaltenen Daten werden zu denen gefügt, die aus vorausgehenden pharmakologischen und biochemischen Untersuchungen der aktiven Wirkstoffkomponente erhalten wurden, und stellen so Informationen bereit, die eine Auswahl der besten Wirkstoffform und der bevorzugtesten Hilfsstoffe für die Verwendung in dieser Entwicklung ermöglichen.
  • Die Entwicklung einer optimalen Zubereitung aus aktiver Wirkstoffkomponente und Hilfsstoffen ist komplex und viele Faktoren beeinflussen die Eigenschaften der Zubereitung. Das hohe Ausmaß an Homogenität, die physiologische Verfügbarkeit und die therapeutische Qualität, die von Pharmazeutika erwartet wird, kann nur durch beträchtlichen Aufwand und Fachkenntnis erreicht werden.
  • Flexibilität ist ebenfalls ein wichtiger Faktor bei der Präformulierung. Möglicherweise müssen eine Vielzahl an Hilfsstoffen, Stabilisierungsmitteln, Gegenionen und dergleichen geprüft werden, um diejenigen zu finden, die mit der aktiven Wirkstoffkomponente der Zubereitung verträglich sind. Es können eine Vielzahl an Modifizierungen des aktiven Bestandteils notwendig werden, um ein Wirkstoffprodukt erfolgreich zu formulieren. Derartige Modifizierungen dürfen sich nicht auf die allgemeine therapeutische Wirksamkeit des Wirkstoffs auswirken, müssen aber gleichzeitig den Wirkstoff für die Formulierung geeigneter machen.
  • Als ein Teil eines Präformulierungsschemas zur Bereitstellung eines optimierten Wirkstoffprodukts, das für eine Verwendung in Menschen und anderen Säugetieren für die Behandlung von Sensibilität gegenüber Hausstaubmilben geeignet ist, wurde bestimmt, dass die aktive Komponente (hier als ein „Peptid" oder „Kandidatenpeptid" oder „einzigartiges Peptid" bezeichnet) in einer solchen Zubereitung die folgenden Eigenschaften besitzen sollte, die solche Peptide unter allen anderen möglichen, von den Der p I-, Der p II- und Der fI-Proteinallergensequenzen abgeleiteten Peptiden „einzigartig" machen würde. Erstens sollte ein einzigartiges Peptid allein oder in Kombination mit anderen einzigartigen Peptiden einen ausreichenden Prozentsatz der T-Zell-Reaktivität der Der p- und Der f-Proteinallergen enthalten, um die Nichtempfindlichkeit der T-Zellen oder eine verminderte Empfindlichkeit der T-Zellen in einem wesentlichen Anteil der gegenüber dem Hausstaubmilben-Allergen sensiblen Individuen zu induzieren. Zweitens sollte das Kandidatenpeptid die Eigenschaft der „ausgezeichneten Löslichkeit" besitzen, was hier als Löslichkeit von mehr als 3 mg/ml bei einem pH-Wert in einem pH-Bereich von pH 6 bis pH 8 in einem wässrigen Puffer definiert wird. Drittens ist das Peptid in einem wässrigen Puffer bei einem pH-Wert in einem pH-Bereich von pH 6 bis pH 8 stabil. Kandidatenpeptide, die von den Der p- und Der f-Proteinallergenen abgeleitet werden und als erfindungsgemäße „einzigartige" Peptide bestimmt wurden, sind DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33), alle wie in 1 gezeigt.
  • In Übereinstimmung mit der ersten Eigenschaft versteht es sich, dass diejenigen Peptide, die eine T-Zell-Reaktion wie eine T-Zell-Proliferation oder Lymphokin-Sekretion hervorrufen (d. h. mindestens ein T-Zell-Epitop enthalten), oder die Nichtempfindlichkeit der T-Zellen oder eine verminderte Empfindlichkeit der T-Zellen induzieren, eine T-Zell-Reaktivität aufweisen. Man nimmt an, dass T-Zell-Epitope an der Initiierung und Aufrechterhaltung der Immunantwort auf ein Proteinallergen beteiligt sind, das für die klinischen Symptome einer Allergie verantwortlich ist. Diese T-Zell-Epitope lösen vermutlich frühe Ereignisse auf dem Niveau der T-Helferzellen aus, indem sie an ein geeignetes HLA-Molekül auf der Oberfläche einer antigenpräsentierenden Zellen binden und die betreffende T-Zell-Subpopulation stimulieren. Diese Ereignisse führen zu T-Zell-Proliferation, Lymphokin-Sekretion, lokalen Entzündungsreaktionen, Rekrutierung von zusätzlichen Immunzellen an der Stelle und Aktivierung der B-Zell-Kaskade, was zur Produktion von Antikörpern führt. Ein Isotyp dieser Antikörper, IgE, ist von grundlegender Bedeutung für die Entwicklung von allergischen Symptomen und seine Produktion wird früh in der Ereigniskaskade, auf dem Niveau der T-Helferzellen, durch die Art der sezernierten Lymphokine beeinflusst. Ein T-Zell-Epitop ist das Grundelement oder die kleinste Erkennungseinheit für einen T-Zell-Rezeptor, wobei das Epitop die Aminosäuren enthält, die für die Rezeptorerkennung notwendig sind. Man nimmt an, dass die Exposition von Patienten mit Hausstaubmilben-Allergie auf isolierte Peptide der Gruppe I- und Gruppe II-Proteinallergene der Hausstaubmilben, die mindestens ein T-Zell-Epitop enthalten, eine Nichtempfindlichkeit der T-Zellen von geeigneten T-Zell-Subpopulationen verursachen kann, so dass sie unempfindlich werden oder eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber dem Proteinallergen aufweisen, und nicht an der Stimulierung einer Immunantwort bei einer derartigen Exposition teilnehmen, zum Beispiel, über Anergie, Toleranz oder Apoptose, über die Fähigkeit, das Lymphokin-Sekretionsprofil verglichen mit Exposition gegenüber dem natürlich vorkommenden Autoantigen zu modifizieren; und/oder die Fähigkeit, eine Induktion von T-Suppressorzellen zu verursachen.
  • Um Peptide zu bestimmen, die T-Zell-Reaktivität haben und mindestens ein T-Zell-Epitop enthalten, werden isolierte Peptide durch, zum Beispiel, Techniken der T-Zell-biologie untersucht, um zu bestimmen, ob die Peptide eine T-Zell-Reaktion hervorrufen oder eine Unempfindlichkeit der T-Zellen induzieren. Wie in den Beispielen diskutiert, kann die Stimulierungsaktivität humaner T-Zellen untersucht werden, indem T-Zellen, die von einem gegenüber dem Hausstaubmilben-Allergen sensiblen Individuum erhalten wurden (d. h. einem Individuum, das eine IgE vermittelte Immunantwort auf ein Hausstaubmilben-Allergen hat), mit einem Peptid oder modifizierten Peptid, das von einem Der p- oder Der f Gruppe I- oder Gruppe II-Proteinallergen abgeleitet wurde, kultiviert werden, und man bestimmt, ob eine T-Zell-Proliferation als Reaktion auf das Peptid wie gemessen auftritt, z. B. durch die zelluläre Aufnahme von tritiummarkiertem Thymidin. Stimulationsindizes für Reaktionen von T-Zellen auf Peptide können als die maximalen Zählimpulse pro Minute (CPM) als Reaktion auf ein Peptid geteilt durch die Kontroll-CPM berechnet werden. Ein Stimulationsindex (SI) gleich oder größer als zweimal der Hintergrundwert wird als „positiv" betrachtet. Positive Ergebnisse werden verwendet, um den mittleren Stimulationsindex für jedes Peptid für die untersuchte Patientengruppe zu berechnen. Peptide, die sich als Kandidaten für eine Zubereitung in ein endgültiges Wirkstoffprodukt eignen, haben einen mittleren T-Zell-Stimulationsindex von größer oder gleich 2,0 und vorzugsweise höher (z. B. mindestens 2,5, mehr bevorzugt mindestens 3,5, mehr bevorzugt mindestens 4,0, mehr bevorzugt mindestens 5, noch mehr bevorzugt mindestens 7 und am meisten bevorzugt mindestens etwa 9).
  • Für therapeutische Zwecke werden Kandidatenpeptide von mindestens 10%, mehr bevorzugt mindestens 20%, mehr bevorzugt mindestens 30% und noch mehr bevorzugt mindestens 40% oder mehr der Individuen in einer Population aus Individuen erkannt, die auf das Hausstaubmilben-Allergen sensibel reagieren. Außerdem weisen bevorzugte Kandidatenpeptide einen Positivitätsindex (PI) von mindestens etwa 100, mehr bevorzugt mindestens etwa 250 und am meisten bevorzugt mindestens etwa 350 auf. Der Positivitätsindex für ein Peptid wird bestimmt, indem der mittlere T-Zell-Stimulationsindex mit dem Prozentsatz an Individuen in einer Population aus Individuen, die auf das Hausstaubmilben-Allergen sensibel reagieren, multipliziert wird (z. B. vorzugsweise mindestens 15 Individuen, mehr bevorzugt mindestens 30 Individuen oder mehr), die einen T-Zell-Stimulationsindex gegenüber einem derartigen Peptid von mindestens 2,0 haben. So stellt der Positivitätsindex sowohl die Stärke einer T-Zell-Reaktion auf ein Peptid (SI) wie auch die Frequenz einer T-Zellreaktion auf ein Peptid in einer Population aus Individuen dar, die auf das Hausstaubmilben-Allergen sensibel reagieren.
  • Um zu bestimmen, ob ein Peptid (Kandidatenpeptid) oder eine Kombination aus Kandidatenpeptiden wahrscheinlich einen ausreichenden Prozentsatz an T-Zell-Reaktivität auf die Hausstaubmilben-Proteinallergene enthalten, um eine Nichtempfindlichkeit der T-Zellen in einem wesentlichen Anteil einer Population aus Individuen zu induzieren, die auf das Hausstaubmilben-Allergen sensibel reagieren, kann ein Algorithmus verwendet werden. In Übereinstimmung mit einem solchen Algorithmus wird ein Satz an überlappenden Peptiden hergestellt, indem das/die Proteinallergen(e) von Interesse systematisch in mindestens zwei überlappende Peptidregionen von gewünschter Länge unterteilt wird (z. B. einer Länge von etwa 12–30 Aminosäureresten, vorzugsweise in eine Länge von nicht länger als etwa 25 Aminosäureresten mit einer Überlappung von etwa 5–15 Aminosäureresten). Diese Unterteilung in Peptidregionen kann willkürlich sein, kann gemäß einem Algorithmus erfolgen oder kann vollständig oder teilweise auf Regionen von Gruppe I- und/oder Gruppe II-Proteinallergenen von Hausstaubmilben erfolgen, von denen bekannt ist, dass sie mindestens ein T-Zell-Epitop enthalten. Vorzugsweise werden mindestens 50% der gesamten Proteinallergensequenz der Hausstaubmilbe und mehr bevorzugt die gesamte Proteinallergensequenz der Hausstaubmilbe in zwei oder mehr Peptide unterteilt. Für jedes dieser Peptide wird ein humaner T-Zell-Stimulationsindex in einem in vitro T-Zell-Proliferationsassay bestimmt, wie hierin beschrieben, für jedes untersuchte Individuum in einer Population aus Individuen, die auf das Proteinallergen sensibel reagieren. Zum Beispiel offenbaren sowohl WO 93/08279 wie auch WO 94/24281 T-Zell-Untersuchungen mit überlappenden Peptiden, die von Der p I, Der p II, Der f I und Der f II abgeleitet werden. Ein Kandidatenpeptid oder eine Kombination aus Kandidatenpeptiden wird auf der Grundlage, zumindest teilweise, des mittleren humanen T-Zell-Stimulationsindex des Kandidatenpeptids in dem Satz der untersuchten Peptide und dem Positivitätsindex des Kandidatenpeptids in dem Satz untersuchter Peptide ausgewählt (siehe, 3 und 4). Der humane T-Zell-Stimulationsindex für das/die Kandidatenpeptid(e) wird aufsummiert. Für jedes Individuum wird der humane T-Zell-Stimulationsindex für das/die Kandidatenpeptid(e) durch die Summe der humanen T-Zell-Stimulationsindizes der verbleibenden Peptide in dem Satz an untersuchten Peptiden geteilt, um eine Prozentzahl für die T-Zell-Reaktivität zu bestimmen, wie unten gezeigt:
    Figure 00110001
  • Alternativ kann die Gegenwart von T-Zell-Epitopen in dem Kandidatenpeptid, die von Aminosäureresten in einem überlappenden Peptid abhängen, die entweder am N-Terminus oder dem C-Terminus des Kandidatenpeptids in der Aminosäuresequenz des Proteinantigens lokalisiert sind, aber deren Epitope nicht in dem Kandidatenpeptid anwesend sind, durch die Berechnung der Prozentzahl an T-Zell-Reaktivität in dem Kandidatenpeptid unter Verwendung der folgenden Formel betrachtet werden:
    Figure 00120001
  • In dieser Formel bezieht sich „NT-flankierendes Peptid" auf ein Peptid, das Aminosäurereste enthält, die mit Aminosäureresten überlappen, die sich am N-Terminus des Kandidatenpeptids in der Aminosäuresequenz des Proteinantigens, von dem das Peptid abgeleitet wurde, befinden; „CT-flankierendes Peptid" bezieht sich auf ein Peptid, das Aminosäurereste enthält, die mit Aminosäureresten überlappen, die sich am C-Terminus des Kandidatenpeptids in der Aminosäuresequenz des Proteinantigens, von dem das Peptid abgeleitet wurde, befinden. In dieser Berechnung werden Stimulationsindizes für das Kandidatenpeptid, das N-Terminus flankierende Peptid und das C-Terminus flankierende Peptid addiert und durch die Gesamtsumme der Stimulationsindizes für den gesamten Satz an überlappenden Peptiden dividiert erhalten einen Prozentsatz für T-Zell-Reaktivität für das Kandidatenpeptid. Wird eine Kombination aus zwei oder mehr Kandidatenpeptiden ausgewählt, von denen jedes überlappende Aminosäurereste enthält, kann diese Berechnung nicht verwendet werden, um einen Prozentsatz an T-Zell-Reaktivität getrennt für jedes Kandidatenpeptid zu bestimmen. Es kann jedoch ein Gesamtprozentsatz an T-Zell-Reaktivität für die Kombination aus Kandidatenpeptiden erhalten werden. In dieser Situation werden die Stimulationsindizes für alle überlappenden Kandidatenpeptide in die Berechnung aufgenommen.
  • Die Werte, die für den Prozentsatz an T-Zell-Reaktivität für das Kandidatenpeptid oder die Kombination aus Peptiden in jedem untersuchten Individuum erhalten werden, können als ein Bereich von niedrigeren und höheren Werten der Ergebnisse der oben beschriebenen Berechnungen ausgedrückt werden. Durch jede der obigen Berechnungen wird der Prozentsatz für mindestens etwa zwanzig (20) und vorzugsweise mindestens etwa dreißig (30) Individuen erhalten, die auf das Proteinantigen sensibel reagieren, und es wird ein mittlerer Prozentsatz bestimmt. Für die Verwendung in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen weisen das Kandidatenpeptid oder die Kombination aus Kandidatenpeptiden die folgenden Kriterien auf: (1) das Kandidatenpeptid oder die Kombination aus Kandidatenpeptiden hat einen mittleren Prozentsatz von mindestens etwa 10%, vorzugsweise mindestens etwa 20%, mehr bevorzugt mindestens etwa 30%, mehr bevorzugt mindestens etwa 40% und mehr bevorzugt mindestens etwa 50–60% oder mehr; und (2) in der Population von untersuchten Individuen zeigen mindestens etwa 60%, vorzugsweise mindestens etwa 75%, und mehr bevorzugt mindestens etwa 90–100% positive T-Zell-Antworten (SI gleich oder größer als 2,0) als Antwort auf das Kandidatenpeptid oder die Kombination aus Kandidatenpeptiden. Ein Kandidatenpeptid oder eine Kombination aus Kandidatenpeptiden, die die oben genannten Kriterien erfüllen, enthält wahrscheinlich einen ausreichenden Prozentsatz der T-Zell-Reaktivität auf das Hausstaubmilben-Proteinallergen, um eine Nichtempfindlichkeit der T-Zellen oder verminderte T-Zell-Empfindlichkeit in einem wesentlichen Anteil einer Population aus Individuen zu induzieren, die auf das Hausstaubmilben-Allergen sensibel reagieren.
  • Als eine erläuternde Ausführungsform des oben beschriebenen Algorithmus wurde ein Satz aus überlappenden Peptiden und Kandidatenpeptiden, die von Der p I bzw. Der p II abgeleitet wurden, hergestellt und untersucht. Es wurden sekundäre T-Zell-Kulturen, bei denen eine Reaktion mit Der p I-Proteinallergen nachgewiesen wurde, aus 39 auf Hausstaubmilben allergischen Subjekten gewonnen und auf ihre Reaktivität gegenüber einem überlappenden Satz an Peptiden sowie gegenüber Kandidatenpeptiden, die von dem Der p I- und Der f I-Proteinallergen, DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29) und DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30) abgeleitet wurden, in einem in vitro T-Zell-Proliferationsassay, wie hierin beschrieben, analysiert. Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt. Der höchste Stimulationsindex größer als oder gleich 2,0 als Antwort auf jedes Peptid wurde für jedes untersuchte Subjekt aufgezeichnet. Die Daten wurden anschließend mittels der oben aufgeführten Gleichungen analysiert. Die Ergebnisse und Berechnungen des Prozentsatzes an T-Zell-Reaktivität für ein einzelnes auf Staubmilben allergisches Subjekt werden unter gezeigt, unter Verwendung der Formeln (1) und (2). T-ZEEL-REAKTIVITÄT FÜR PATIENT 1733 PEPTID-STIMULATIONSINDEX
    DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27) 3,6
    DPI-3 (SEQ ID NO: 3) 3,9
    DPI-22.2 (SEQ ID NO: 28) 3,1
    DPI-12.1 (SEQ ID NO: 6) 2,2
    DPI-5.1 (SEQ ID NO: 7) 3,5
    DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29) 5,7
    DPI-14 (SEQ ID NO: 9) 2,3
    DPI-15 (SEQ ID NO: 10) 2,8
    DPI-6.1 (SEQ ID NO: 11) 2,1
    DPI-7.1 (SEQ ID NO: 12) 2,2
    DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30) 5,0
    DPI-9 (SEQ ID NO: 14) 2,4
    DPI-16 (SEQ ID NO: 15) 2,0
    DPI-10 (SEQ ID NO: 16) 0
    DPI-17 (SEQ ID NO: 17) 0
    SUMME DER STIMULATIONSINDIZES 40,8 (NENNER)
  • %-Reaktivität von Peptid DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30) für Patient 1733 beträgt
    Figure 00140001
    Figure 00140002
  • Daher beträgt für diesen Patienten der geschätzte Bereich der T-Zell-Reaktivität für Peptid DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30) 12,3%–24% der gesamten Reaktivität des Der p I-Proteins.
  • Die oben aufgeführte Berechnung wird für jedes mögliche Kandidatenpeptid für jeden untersuchten Patient wiederholt. In der Population von 39 untersuchten, Cry j I-allergischen Subjekten wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
    Kandidatenpeptide Bereich des mittleren Prozentsatzes an T-Zell-Reaktivität Antwortfrequenz auf mindestens ein Peptid
    DPI-21.2 (SEQ. ID. NO. 27),
    DFI-22.2 (SEQ. ID. NO. 28)
    DPI-23.31 (SEQ. ID. NO. 29),
    DPI-26.6 (SEQ. ID. NO. 30) 38–67% 82%
  • Also befindet sich die Kombination aus den vier Kandidatenpeptiden gut innerhalb des gewünschten Bereichs, in dem, in Kombination, eine ausreichende T-Zell-Reaktivität auf Gruppe I-Proteinallergen von Der f und Der p gezeigt wird, und sie erfüllt die erste Eigenschaft eines erfindungsgemäßen „einzigartigen" Peptids.
  • Die gleiche Berechnung wurde für das Gruppe II Der p-Proteinallergen untersucht. Es wurden sekundäre T-Zell-Kulturen, bei denen eine Reaktion mit Der p I-Proteinallergen nachgewiesen wurde, aus 30 auf Hausstaubmilben allergischen Subjekten gewonnen und auf ihre Reaktivität gegenüber einem überlappenden Satz an Peptiden sowie gegenüber Kandidatenpeptiden, die von Der p II-, DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33) abgeleitet wurden, in einem in vitro T-Zell-Proliferationsassay, wie hierin beschrieben, analysiert. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt. Der höchste Stimulationsindex größer als oder gleich 2,0 als Antwort auf jedes Peptid wurde für jedes untersuchte Subjekt aufgezeichnet. Die Daten wurden anschließend mittels der oben aufgeführten Gleichungen analysiert. In der Population von 30 untersuchten, gegenüber Hausstaubmilben allergischen Subjekten wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
    Kandidatenpeptide Bereich des mittleren Prozentsatzes an T-Zell-Reaktivität Antwortfrequenz auf mindestens ein Peptid
    DPII-20.9 (SEQ. ID. NO. 31),
    DPII-22.14 (SEQ. ID. NO. 32)
    DPII-25.15 (SEQ. ID. NO. 33) 37–51% 63%
  • Also befindet sich die Kombination aus den drei erfindungsgemäßen Der p II-Kandidatenpeptiden gut innerhalb des gewünschten Bereichs, in dem, in Kombination, eine ausreichende T-Zell-Reaktivität auf Gruppe II-Hausstaubmilben-Proteinallergen von Der p gezeigt wird, und sie erfüllt die erste Eigenschaft eines erfindungsgemäßen „einzigartigen" Peptids.
  • Für die Behandlung von Allergie gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass ein Peptid, das im Zusammenhang damit verwendet wird, nicht Immunglobulin E (IgE) bindet oder IgE in einem beträchtlich geringerem Ausmaß bindet (d. h. mindestens 100fach geringere Bindung und mehr bevorzugt mindestens 1.000fach geringere Bindung) als das entsprechende Hausstaubmilben-Proteinallergen, von dem das Peptid abgeleitet wurde, IgE bindet. Die Hauptkomplikationen einer standardmäßigen Immuntherapie sind IgE-vermittelte Antworten wie Anaphylaxie. Immunglobulin E ist ein Vermittler für anaphylaktische Reaktionen, die eine Folge der Bindung und Vernetzung von Antigen mit IgE auf Mastzellen oder Basophilen und der Freisetzung von Vermittlern (z. B. Histamin, Serotonin, eosinophile chemotaktische Faktoren) in allergischen („atopischen") Patienten sind. Daher könnte Anaphylaxie in einem beträchtlichen Anteil einer Population aus behandelten Individuen, die auf das Allergen sensibel reagieren, vermieden werden, indem bei der Immuntherapie ein Peptid oder Peptide verwendet werden, die IgE zu einem beträchtlichen Anteil (z. B. zu mindestens 75% nicht) einer Population von auf das Hausstaubmilben-Allergen sensibel reagierenden Individuen nicht binden, oder wenn das Peptid IgE bindet, diese Bindung nicht zur Freisetzung von Vermittlern aus Mastzellen oder Basophilen führt. Das Risiko von Anaphylaxie könnte vermindert werden, indem bei der Immuntherapie ein Peptid oder Peptide verwendet werden, die eine verminderte IgE-Bindung aufweisen. IgE-Bindung kann, zum Beispiel durch direkte ELISA oder Capture-ELISA untersucht werden. Darüber hinaus sind Peptide, die eine minimale IgE stimulierenden Aktivität haben, für therapeutische Wirksamkeit erwünscht. Minimale IgE stimulierende Aktivität bezieht sich auf eine IgE-Produktion, die geringer ist als die Menge an IgE-Produktion und/oder IL-4-Produktion, die durch das native, betreffende Hausstaubmilben-Proteinallergen stimuliert wird. Bindet ein Peptid IgE, ist es bevorzugt, dass eine derartige Bindung nicht zu der Freisetzung von Vermittlern (z. B. Histaminen) aus Mastzellen oder Basophilen führt. Um zu bestimmen, ob ein Peptid, das IgE bindet, die Freisetzung von Vermittlern verursacht, kann ein Histamin-Freisetzungs-Assay unter Verwendung von Standardreagenzien und -protokollen ausgeführt werden, die erhalten wurden, zum Beispiel von Amac, Inc. (Westbrook, ME). Kurz gesagt wird eine gepufferte Lösung eines zu untersuchenden Peptids mit einem gleichen Volumen von vollständigem, heparinisiertem Blut von einem allergischen Subjekt zusammen gegeben. Nach Mischen und Inkubieren werden die Zellen pelletiert und die Überstände werden verarbeitet und analysiert unter Verwendung eines Radioimmunassays, um die Menge an freigesetztem Histamin zu bestimmen. Aktuelle Experimente deuten darauf hin, dass Kandidatenpeptide DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ ID 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33) negative IgE-Reaktivität oder Histaminfreisetzung aufweisen (Daten nicht gezeigt).
  • Die zweite Eigenschaft für ein einzigartiges Peptid ist die der „ausgezeichneten Löslichkeit", die weiter oben als eine Löslichkeit von mehr als 3 mg/ml bei einem pH-Wert in einem Bereich von pH 6 bis pH 8 definiert wurde. Löslichkeit in einem physiologisch zulässigen pH-Bereich (z. B. pH 6 bis pH 8) ist insbesondere von Bedeutung, wenn ein Multipeptid-Therapeutikum für Injektion formuliert werden soll.
  • Verabreichung eines löslichen Wirkstoffprodukts in einem physiologisch zulässigen pH-Bereich durch intravenöse oder subkutane Injektion gewährleistet etwa 100%ige Bioverfügbarkeit der Wirkstoffkomponente in dem physiologischen System, in das der Wirkstoff eingeführt wurde. Daher ist es notwendig, dass ein für Injektion bestimmtes Wirkstoffprodukt in einem solchen Ausmaß flüssig ist, das eine leichte Spritzbarkeit besteht, und die aktive Komponente sollte auch löslich sein, wenn eine maximale therapeutische Wirkung erreicht werden soll. Die Löslichkeit ist auch von Nutzen bei der Zubereitung von Zusammensetzungen, die über andere Verabreichungswege wie bei spielsweise durch orale Verabreichung (Tablette, Aerosol, sublingual) oder in Präparaten und Formulierungen mit verlängerter Freisetzung verabreicht werden sollen.
  • Bei Proteinen und Peptiden kann eine Formulierung in löslichen Zusammensetzungen schwierig sein, da ein Peptid vielleicht nicht in jedem gewünschten pH-Bereich löslich ist, oder vielleicht nur in einem engen pH-Bereich löslich ist. Es ist insbesondere schwierig, wenn viele Peptide zusammen in eine einzelne Multipeptid-Zubereitung formuliert werden, da jedes Peptid in einem pH-Bereich löslich sein kann, der nicht mit denen der anderen Peptide in der Zubereitung überlappt. Als Folge ist es die Anforderung von „ausgezeichneter Löslichkeit", die die meiste Flexibilität bei der Zubereitung erfordert, insofern vielleicht beträchtliche Modifizierungen der angestrebten Kandidatenpeptide notwendig sind, um ein Multipeptid-Wirkstoffprodukt erfolgreich zu formulieren.
  • Einige der erfindungsgemäßen einzigartigen Peptide sind das Produkt von multiplen Aminosäure-Modifizierungen der ursprünglich geplanten Kandidatenpeptidsequenz („Ausgangspeptid"), von der die modifizierten, erfindungsgemäßen einzigartigen Peptide ursprünglich abgeleitet wurden. Derartige modifizierte erfindungsgemäße "einzigartige" Peptide umfassen DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ ID NO: NO: 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID 33), alle wie in 1 gezeigt. Zum Beispiel wurde die Aminosäuresequenz von DpII-22.14 (SEQ ID NO: 32) von der Proteinsequenz von Der p II abgeleitet, indem zunächst solche Regionen des nativen Proteins mit hoher T-Zell-Reaktivität identifiziert wurden, wobei ein Satz an überlappenden Peptiden verwendet wurde, der die gesamte Proteinsequenz abdeckte. Es wurden einige Peptide gefunden, die eine hohe T-Zell-Reaktivität aufweisen, entsprechend den drei unterschiedlichen Positionen/Regionen in dem Protein. Eine dieser Regionen wurde durch drei benachbarte Peptide abgedeckt, das jedes etwa 25–29 Aminosäuren lang war und mit einer Überlappung von 10–15 Aminosäuren, DpII-3.1 (SEQ ID NO: 20), DpII-4 (SEQ ID NO: 21) und DpII-5 (SEQ ID NO: 22) (2), die alle eine hohe T-Zell-Reaktivität aufwiesen. Auf der Grundlage dieser T-Zell-Karte wurde ein neues Peptid synthetisiert mit der Aminosäuresequenz QLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDGLEV (SEQ ID NO: 34), 28 Aminosäuren lang, das die meiste Reaktivität zeigt, die in den einzelnen Peptiden gefunden wurde (Daten nicht gezeigt) und enthält das gesamte DpII-4 (SEQ ID NO: 21) und Teile von DpII-3.1 (SEQ ID NO: 20) und DpII-5 (SEQ ID NO: 22). Dieses Peptid erfüllte jedoch nicht die Anforderung der „ausgezeichneten Löslichkeit" von 3 mg/ml für ein erfindungsgemäßes einzigartiges Peptid, und es erfüllt auch nicht die Stabilitätsanforderung. Daher wurden zwei Analoga hergestellt mit einer Addition von einem oder zwei geladenen Resten an jedem Ende, DpII-22.2 KQLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDGLEVK (SEQ ID NO: 35) und DpII-22.6 DKQLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDGLEVD (SEQ ID NO: 36) und die Stabilität verbesserte sich deutlich, aber die Löslichkeit erreicht nicht den Standard einer „ausgezeichneten Löslichkeit". In dem zweiten Versuch eine Reihe von trunkierten Analoga mit bis zu fünf geladenen Aminosäureresten, die an die Enden addiert wurden (Tabelle 1).
    DpII-22 (SEQ. ID. NO. 34) QLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDGLEV
    DpII-22.2 (SEQ. ID. NO. 35) KQLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDGLEVK
    DpII-22.6 (SEQ. ID. NO. 36) DKQLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDGLEVD
    DpII-22.4 (SEQ. ID. NO. 37) QLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDE
    DpII-22.5 (SEQ. ID. NO. 38) DKQLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDE
    DpII-22.8 (SEQ. ID. NO. 39) DKEQLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDE
    DpII-22.9 (SEQ. ID. NO. 40) DKEQLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDEE
    DpII-22.12 (SEQ. ID. NO. 41) DKQLEAVFEANQATKTAKIEIKASIDE
    DpII-22.16 (SEQ. ID. NO. 42) DKELEAVFEANQNTKTAKIEIKASD
    DpII-22.19 (SEQ. ID. NO. 43) DKELEAVFEANQNTKTAKIEIKAD
    DpII-22.20 (SEQ. ID. NO. 44) DKELEAVFEANQNTKTAKIEIKAK
    DpII-22.21 (SEQ. ID. NO. 45) DKELEAVFEANQNTKTAKIEIKD
    DpII-22.22 (SEQ. ID. NO. 46) DKELEAVFEANQNTKTAKIEIKK
    DgII-22.26 (SEQ. ID. NO. 47) DKELEAVFEANQNTKTAKIEIK
    DpII-22.23 (SEQ. ID. NO. 48) DKELEAVFEANQNTKTAKIED
    DpII-22.24 (SEQ. ID. NO. 49) DKELEAVFEANQNTKTAKIEK
    DpII-22.25 (SEQ. ID. NO. 50) DKELEAVFEANQNTKTAKIE
    DpII-22.14 (SEQ. ID. NO. 32) DKELEAVFEANQNTKTAKAE
    DpII-22.10 (SEQ. ID. NO. 51) LEAVFEANQNTKTAK
    DpII-22.11 (SEQ. ID. NO. 52) LEAVFEANQATKTAK
    DpII-22.18 (SEQ. ID. NO. 53) DKTAKIEIKASIDGLE
    DpII-22.15 (SEQ. ID. NO. 54) KTAKIEIKASIDGLE
    Tabelle 1
  • Von diesen war das DpII-22.5, DKQLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDE (SEQ ID NO: 38) vielversprechend, da es die T-Zell-Reaktivität des „Ausgangs"-peptids, DPII-22, (SEQ ID NO: 34) bewahrte und sehr löslich war, aber es war sehr schwierig zu synthetisieren. Es stellte sich heraus, dass diese Schwierigkeiten bei der Synthese dieser Sequenz mit dem Austausch des hydrophoben Isoleucins durch das weniger hydrophobe Alanin verschwanden und sich gleichzeitig die Löslichkeit um eine Größenordnung erhöhte. Es fand sich, dass Peptid DpII-22.14, DKELEAVFEANQNTKTAKAE (SEQ ID NO: 32) annähernd die gleich T-Zell-Reaktivität wie das „Ausgangs"-peptid DpII-22 (SEQ ID NO: 34) besaß und auch mit mehr als 3 mg/ml bei einem pH-Wert in dem pH-Bereich von 6,0 bis 8,0 löslich war, und dass es einfach zu synthetisieren und zu reinigen war. Daher wurde DPII-22 (SEQ ID NO: 34) als ein „einzigartiges" Peptid ausgewählt, als festgestellt wurde, dass es bei einem pH-Wert in dem Bereich von 6,0 bis 8,0 stabil ist. Die Entwicklung der anderen modifizierten „einzigartigen" Peptide, DpI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DpI-26.6 (SEQ ID NO: 30) und DpII-25.15 (SEQ ID NO: 33) folgte einem Verfahren ähnlich dem oben für DpII-22.14 (SEQ ID NO: 32) beschriebenen. Peptide DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32), DpI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DpI-26.6 (SEQ ID NO: 30) und DpII-25.15 (SEQ ID NO: 33), alle wie in 1 gezeigt, sind neue, erfindungsgemäße, modifizierte Peptide.
  • Das dritter Kriterium, das die erfindungsgemäßen einzigartigen Peptide erfüllen müssen, ist Stabilität, insbesondere Lösungsstabilität, in einem physiologisch zulässigen pH-Bereich von pH 6 bis pH 8. Es muss unter den Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil sein, und gegebenenfalls unter Bedingungen einer Rekonstituierung. Eine Stabilitätsprüfung legt den Zeitraum fest, für den die Unversehrtheit, Qualität und Reinheit des Wirkstoffprodukts in seiner endgültigen Dosierungsform konserviert ist. Die Stabilitätsprüfung kann gleichzeitig mit Löslichkeitsstudien ausgeführt werden, wie in Beispiel 3 diskutiert. Eine Zusammensetzung mit gleicher Konzentration, die jedes der erfindungsgemäßen Kandidatenpeptide enthält, blieb stabil (z. B. keine deutliche Zersetzung) in einer Lösung in einem üblichen „Fenster" innerhalb des pH-Bereichs von pH 6–pH 8 bei etwa Raumtemperatur und bei etwa 5°C für mindestens 24 Stunden (siehe, 6).
  • Daher besitzen Kandidatenpeptide DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33) jede der drei geforderten „einzigartigen" Eigenschaften, die oben dargelegt wurden, was darauf hindeutet, dass diese Kombination aus Peptiden für die Zubereitung als ein optimiertes therapeutisches Wirkstoffprodukt für die Verabreichung an Menschen zur Behandlung einer Allergie auf das Hausstaubmilben-Allergen geeignet ist.
  • Hoch reine, erfindungsgemäße Peptide können synthetisch mittels chemischer Synthese unter Verwendung von Standardtechniken hergestellt werden. Verschiedene Verfahren zur chemischen Synthese von Peptiden sind auf dem Fachgebiet bekannt, wie beispielsweise Festphasensynthese, die auf kommerziell erhältlichen Peptid-Synthesizern vollständig oder halbautomatisiert wurde. Synthetisch hergestellte Peptide können anschließend bis zur Homogenität gereinigt werden (d. h. mindestens 90%, mehr bevorzugt mindestens 95% und noch mehr bevorzugt mindestens 97% Reinheit), frei von allen anderen Polypeptiden und Verunreinigungen unter Verwendung einer beliebigen Anzahl an in der Literatur für Proteinreinigung bekannten Techniken.
  • Gemäß eines Verfahrens zur Herstellung von erfindungsgemäßen, hoch reinen, homogenen Peptiden kann ein Peptid, das durch synthetische chemische Mittel hergestellt wurde (entweder an einen Polymerträger in einer „Festphasensynthese" oder durch konventionelle homogene chemische Reaktionen in einer „Lösungssynthese"), durch präparative Umkehrphasenchromatographie gereinigt werden. In diesem Verfahren wird das synthetisch hergestellte Peptid in „roher" Form in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst (typischerweise einem wässrigen Puffer) und auf eine Trennsäule aufgegeben (typischerweise ein auf Siliciumdioxid basierendes Umkehrphasenmedium, zusätzlich können auf Polymeren oder Kohlenstoff basierende Medien verwendet werden). Das Peptid wird aus der Säule durch Erhöhung der Konzentration einer organischen Komponente eluiert (typischerweise Acetonitril oder Methanol) in einen wässrigen Puffer (typischerweise TFA, Triethylaminphosphat, Acetat oder gleichartige Puffer). Fraktionen des Eluats werden gesammelt und mittels geeigneter analytischer Verfahren analysiert (typischerweise Umkehrphasen-HPLC oder KZE-Chromatographie). Solche Fraktionen mit der geforderten Homogenität werden vereinigt. Das vorliegende Gegenion kann durch zusätzliche Umkehrphasen-Chromatographie in einem Salz nach Wahl oder durch Ionenaustauscherharze ausgetauscht werden. Das Peptid kann anschließend als sein Acetat oder ein anderes geeignetes Salz isoliert werden. Das Peptid wird anschließend filtriert und das Wasser entfernt (typischerweise durch Lyophilisierung), um eine homogene Peptidzusammensetzung zu ergeben, die mindestens 90%, mehr bevorzugt mindestens 95% und noch mehr bevorzugt mindestens 97% der geforderten Peptidkomponente enthält. Gegebenenfalls, oder zusammen mit der Umkehrphasen-HPLC wie oben beschrieben, kann eine Reinigung durch Affinitätschromatographie, Ionenaustausch-, Größenausschluss, Gegenstrom- oder Normalphasen-Trennungssysteme oder jegliche Kombination dieser Verfahren erreicht werden. Peptid können außerdem unter Verwendung von Ultrafiltration, Rotationsverdampfung, Ausfällung, Dialyse oder anderer gleichartiger Techniken eingeengt werden.
  • Die hoch reine, homogene Peptidzusammensetzung wird anschließend durch jegliche der folgenden Techniken oder Kombinationen daraus charakterisiert: a) Massenspektroskopie zur Bestimmung des Molekulargewichts, um die Peptididentität zu prüfen; b) Aminosäure-Analyse, um die Identität des Peptids über die Aminosäurezusammensetzung zu prüfen; c) Aminosäuresequenzierung (unter Verwendung eines automatisierten Proteinsequenzers oder manuell), um die definierte Sequenz der Aminosäurereste zu bestätigen; d) HPLC (multiple Systeme, wenn gewünscht), verwendet, um Peptididentität und -Reinheit zu prüfen, (d.h. Identifizierung von Peptidverunreinigungen); e) Wassergehalt zur Bestimmung der Wasserkonzentration der Peptidzusammensetzungen; f) Ionengehalt zur Bestimmung der Gegenwart von Salzen in den Peptidzusammensetzungen; und g) restliche organische Verbindungen, um auf die Gegenwart von restlichen organischen Reagenzien, Ausgangsmaterialien und/oder organischen Verunreinigungen zu prüfen.
  • Ein erfindungsgemäßes Peptid kann auch durch DNA-Rekombinationstechniken in einer Wirtszelle hergestellt werden, die mit einer Nucleinsäuresequenz transformiert wurde, die für ein derartiges Peptid kodiert. Wenn durch solche Rekombinationstechniken hergestellt, werden Wirtszellen, die mit einer für das gewünschte Peptid kodierenden Nucleinsäure transformiert wurden, in einem für die Zellen geeigneten Medium kultiviert und isolierte Peptide können aus dem Zellkulturmedium, den Wirtszellen oder beiden unter Verwendung von Techniken gereinigt werden, die auf dem Gebiet für die Reinigung von Peptiden oder Proteinen bekannt sind, einschließlich Ionenaustauschchromatographie, Ultrafiltration, Elektrophorese oder Immunreinigung mit Antikörpern, die für das gewünschte Peptid spezifisch sind. Rekombinant hergestellte Peptide können isoliert und bis zur Homogenität gereinigt werden, frei von zellulärem Material, anderen Polypeptiden oder Kulturmedium, das gemäß der oben beschriebenen Verfahren zur synthetischen Herstellung von Peptiden verwendet wird.
  • Unter bestimmten, eingeschränkten Umständen können erfindungsgemäße Peptide auch durch chemische oder enzymatische Spaltung eines hoch reinen Volllängen- oder nativen Proteins hergestellt werden, dessen Stellen für chemischen Verdau oder enzymatische Spaltung im Voraus bestimmt wurden und bei dem das resultierende Aufschlussprodukt reproduzierbar ist. Peptide mit definierten Aminosäuresequenzen können hoch rein und frei von jeglichen anderen Polypeptide oder Verunreinigungen, die beim enzymatischen oder chemischen Verdau vorkommen, durch ein beliebiges der oben beschriebenen Verfahren für hoch reine und isolierte, synthetisch oder rekombinant hergestellte Peptide isoliert werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch therapeutische Zusammensetzungen und therapeutische Multipeptid-Zubereitungen, die die erfindungsgemäßen einzigartigen Peptide enthalten. Erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzungen können eines oder mehrere der erfindungsgemäßen einzigartigen Peptide enthalten, die gleichzeitig oder aufeinander folgend als eine einzelne Behandlungsepisode für die Behandlung von Allergie auf das Hausstaubmilben-Allergen in einem Menschen oder einem anderen Säugetier verabreicht werden können. Ein derartiger Behandlungsplan muss nicht notwendigerweise eine physikalische Mischung von mehr als einem erfindungsgemäßen Peptid sein, sondern enthält eine Kombination aus derartigen Peptiden, die gleichzeitig oder aufeinander folgend als eine einzelne Behandlungsepisode verabreicht werden, um die maximale therapeutische Wirkung der Zusammensetzung der einzigartigen Peptide zu erreichen, DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33) gewährleisten (z. B. Löslichkeit und Stabilität in einem zulässigen physiologischen pH-Bereich sowie einen Bereich an T-Zell-Reaktivität von 38–67% der gesamten T-Zell-Reaktivität des Gruppe I-Hausstaubmilben-Proteinallergens und eine Ansprechfrequenz von 91% für mindestens ein Der p I-Peptid, das in einer Population von auf Hausstaubmilben allergischen Individuen geprüft wurde, und gleichfalls eine T-Zell-Reaktivität von 37–51% der gesamten T-Zell-Reaktivität des Gruppe II-Hausstaubmilben-Proteinallergens und eine Ansprechfrequenz von 63% für mindestens ein Der p II-Peptid, das in einer Population aus auf Hausstaubmilben allergischen Individuen geprüft wurde).
  • Erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzungen enthalten ein oder mehrere Peptide DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33), enthalten auch ein oder mehrere pharmazeutisch unbedenkliche Träger, wie beispielsweise Hilfsstoffe, die mit dem/den in einer einzelnen Zusammensetzung vorkommenden Peptid oder Peptiden verträglich sind. Wenn die Zusammensetzung eine Multipeptid-Zubereitung ist, muss der pharmazeutisch unbedenkliche Träger mit allen Peptiden in der Multipeptid-Zubereitung verträglich sein. Bevorzugte Hilfsstoffe umfassen, sind aber nicht beschränkt auf steriles Wasser, Natriumphosphat, Mannitol oder sowohl Natriumphosphat wie auch Mannitol und jegliche Kombination daraus. Andere geeignete Hilfsstoffe umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Sorbit, Saccharose, Dextrose, Lactose Dextran und PVP. Außerdem können aufgrund der Möglichkeit einer Dimerisierung der Peptide in einer Multipeptid-Zubereitung auch ein Mittel wie EDTA eingeschlossen sein, um Dimerisierung zu verhindern. Alternativ kann jegliches andere Material oder Verfahren, die auf dem Fachgebiet zur Verhinderung von Dimerisierung bekannt sind, verwendet werden. Außerdem können pharmazeutisch unbedenkliche Gegenionen während der Herstellung der Multipeptid-Zubereitung zugegeben werden. Beispiele für pharmazeutisch unbedenkliche Gegenionen umfassen Acetat, HCl und Citrat.
  • Eine erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung sollte steril und unter den Herstellungs-, Lagerungs-, Vertriebs- und Verwendungsbedingungen stabil sein und sollte gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen wie beispielsweise Bakterien und Pilzen konserviert sein. Ein bevorzugtes Mittel zur Herstellung von erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen, um die Integrität der Zusammensetzung aufrechtzuerhalten (d. h. Vermeidung von Kontamination, verlängerte Lagerung usw.), ist die Herstellung der Zubereitung von Peptid und pharmazeutisch unbedenklichen Träger(n), so dass die Zusammensetzung in der Form eines lyophilisierten Pulvers vorliegt, das in einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger rekonstituiert wird, wie beispielsweise sterilem Wasser, direkt vor der Verwendung. In dem Fall von sterilen Pulvern für die Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen, sind die bevorzugten Verfahren zur Herstellung Vakuumtrocknung, Gefriertrocknung oder Trockenschleudern, was ein Pulver mit dem Wirkstoff plus jeglichem, zusätzlichen, gewünschten Bestandteil aus einer im Voraus steril-gefilterten Lösung davon ergibt.
  • Eine bevorzugte Multipeptid-Zubereitung enthält die folgenden einzigartigen Peptide DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33) sowie Natriumphosphat und Mannitol und kann gegebenenfalls weiterhin DPII-20.9 (SEQ ID NO: NO: 31) enthalten. Für diese Ausführungsform wird EDTA zu der Zubereitung gegeben. Ein geeignetes Gegenion wie beispielsweise Acetat kann ebenfalls während der Herstellung der Zubereitung zugegeben werden. Die Zubereitung wird vorzugsweise in der Form eines lyophilisierten Pulvers herstellt, das in einem physiologisch unbedenklichen Träger wie beispielsweise sterilem Wasser vor der Verwendung rekonstituiert wird. Einige nichteinschränkende Beispiele von einer erfindungsgemäßen bevorzugten Multipeptid-Zubereitungen werden unten beschrieben. Die einzigartigen Peptide des Hausstaubmilben-Proteinallergens werden vorzugsweise während der Herstellung mit dem geeigneten Gegenion kombiniert, um ein Gläschen herzustellen, das ein Pyrogen-freies und vorzugsweise lyophilisiertes Pulver der gewünschten Formulierung enthält:
    Wirkstoff: Der p I-, Der f I- und Der p II-Peptide DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33) In einer Konzentration von 0,75 mg pro Peptid.
    Inaktive Bestandteile: 0.05 M Natriumphosphat U.S.P. 5 Gew.-% Mannitol, U.S.P. 0.1 mg/ml Dinatrium-EDTA-Dihydrat U.S.P. endgültiger pH-Wert 7,2–7,4
    Verdünnungsmittel: Steriles Wasser für Injektion, U.S.P.
    Optional: Es kann 0,75 mg DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31) zu den Wirkstoffen gegeben werden.
  • Eine bevorzugte Kombination aus Multipeptid-Zubereitung, die für eine gleichzeitige oder aufeinander folgende Verabreichung als eine Einzelbehandlungsepisode geeignet ist und in zwei getrennten, sterilen, Pyrogen-freien Gläschen in der Form von lyophilisiertem Pulver enthalten ist, umfasst die folgenden Zubereitungen:
    Gläschen #1
    Wirkstoff: Der p I-, Der f I- and Der p II-Peptide DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29) und DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) In einer Konzentration von 0,75 mg pro Peptid.
    Inaktive Bestandteile: 0.05 M Natriumphosphat U.S.P. 5 Gew.-% Mannitol, U.S.P. 0.1 mg/ml Dinatrium-EDTA-Dihydrat U.S.P. endgültiger pH-Wert 7,0
    Verdünnungsmittel: Steriles Wasser für Injektion, U.S.P.
    Gläschen #2
    Wirkstoff: Der p I- und Der p II-Peptide DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII 20.9 (SEQ ID NO: 31), DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33) In einer Konzentration von 0,75 mg pro Peptid.
    Inaktive Bestandteile: 0.05 M Natriumphosphat U.S.P. 5 Gew.-% Mannitol, U.S.P. 0.1 mg/ml Dinatrium-EDTA-Ddihydrat U.S.P. endgültiger pH-Wert 6,2
    Verdünnungsmittel: Steriles Wasser für Injektion, U.S.P.
  • Die erfindungsgemäßen Multipeptid-Zubereitungen können auch in der Form eines Kits bereitgestellt werden, das Anweisungen für die Verwendung enthält.
  • Herunterregulierung der allergischen Immunantwort auf das Hausstaubmilben-Allergen in Menschen kann klinisch bestimmt werden, wann immer möglich (siehe z. B., Varney et al, British Medical Journal, 302:265-269 (1990), oder kann subjektiv bestimmt werden (d. h. der Patient fühlt sich, als ob einige oder alle der durch die Hausstaubmilben-Allergene hervorgerufenen Symptome gelindert wurden).
  • Eine der einzigartigen Eigenschaften von jedem einzigartigen Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung ist, dass jedes Peptid eine „ausgezeichnete Löslichkeit" besitzt. Daher sind erfindungsgemäße Zusammensetzungen und Multipeptid-Zubereitungen insbesondere geeignet für Verabreichung durch Injektion (z. B. subkutan oder intravenös). Jedoch können optimierte erfindungsgemäße Zusammensetzungen und Multipeptid-Zubereitungen auf jegliche herkömmliche Weise verabreicht werden, wobei die Löslichkeit der Wirkstoffkomponente entweder erwünscht oder akzeptabel ist, wie beispielsweise durch Injektion (subkutan, intravenös, usw.) orale Verabreichung, sublingual, Inhalation, transdermale Aufbringung, rektale Verabreichung oder jeglicher anderer Verabreichungsweg, der auf dem Fachgebiet für die Verabreichung von löslichen therapeutischen Mitteln bekannt ist. Es kann wünschenswert sein, eine therapeutisch wirksame Menge von einer oder mehreren der erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen gleichzeitig oder aufeinander folgend an ein Individuum als eine einzelne Behandlungsepisode zu verabreichen. Eine jede solcher Zusammensetzungen für die gleichzeitige oder aufeinander folgende Verabreichung als eine einzelne Behandlungsepisode kann nur ein einzigartiges erfindungsgemäßes Peptid enthalten oder kann eine erfindungsgemäße optimierte Multipeptid-Zubereitung erhalten.
  • Für subkutane Injektion von einer oder mehreren erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen und Multipeptid-Zubereitungen können vorzugsweise etwa 1 μg–3 mg und mehr bevorzugt von etwa 20 μg–1,5 mg und noch mehr bevorzugt etwa 50 μg–750 μg von jeder aktiven Komponente (Peptid) pro Dosierungseinheit verabreicht werden. Es ist besonders vorteilhaft, parenterale Zusammensetzungen in vordosierter Darreichungsform zur Erleichterung der Verabreichung und Gleichmäßigkeit der Dosierung zu formulieren. Vordosierte Darreichungsform wie hierin verwendet, bezieht sich auf physikalisch einzelne Einheiten, die als einzelne Dosierungen für zu behandelnde menschliche Subjekte geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an aktiver Verbindung enthält, die so berechnet wurde, dass sie die gewünschte therapeu tische Wirkung zusammen mit dem gewünschten pharmazeutischen Träger erzeugt. Die Spezifikation für die erfindungsgemäßen, neuen vordosierten Darreichungsformen werden diktiert durch und hängen direkt ab (a) von den einzigartigen Eigenschaften der aktiven Verbindung und der bestimmten zu erreichenden therapeutischen Wirkung, und (b) von den Einschränkungen, die dem Gebiet des Vermischen einer derartigen aktiven Verbindung für die Behandlung von menschlichen Subjekten inhärent sind.
  • Um eine erfindungsgemäße Zusammensetzung durch andere als parenterale Verabreichung zu verabreichen (d. h. durch orale Verabreichung), kann es notwendig sein, die Zusammensetzung zu beschichten mit oder die Zusammensetzung gemeinsam zu verabreichen mit einem Material, das ihre Inaktivierung verhindert oder ihre Absorption und Bioverfügbarkeit erhöht. Zum Beispiel kann eine Peptid-Zubereitung gemeinsam mit Enzyminhibitoren oder in Liposomen verabreicht werden. Enzyminhibitoren umfassen den Pankreas-Trypsininhibitor, Diisopropylfluorphosphat (DEP) und Trasylol. Liposomen umfassen Wasser-in-Öl-in-Wasser-CGF-Emulsionen sowie herkömmliche Liposomen (Strejan et al., (1984) J. Neuroimmunol., 7:27). Wenn ein Peptid auf geeignete Weise geschützt ist, kann das Peptid oral verabreicht werden, zum Beispiel mit einem inerten Verdünnungsmittel oder einem assimilierbaren, essbaren Träger. Das Peptid und andere Bestandteile können auch in eine Gelatinekapsel mit harter oder weicher Hülle eingeschlossen werden, zu Tabletten komprimiert werden oder direkt in die Diät des Individuums eingebaut werden. Für orale therapeutische Verabreichung kann die aktive Verbindung mit Hilfsstoffen eingebaut werden und in der Form von einnehmbaren Tabletten, buccalen Tabletten, Pastillen, Kapseln, Elixieren, Lösungen, Gelen, Suspensionen, Sirups, Oblaten und dergleichen verwendet werden. Derartige Zusammensetzungen und Präparate sollten mindestens 1 Gew.-% der aktiven Verbindung enthalten. Der Anteil der Zusammensetzung und Präparate kann, selbstverständlich, verändert werden und kann in geeigneter Weise zwischen etwa 5 bis 80 Gew.-% der Einheit betragen. Die Menge an aktiver Verbindung in derartigen therapeutisch nützlichen Zusammensetzungen ist dergestalt, dass eine geeignete Dosierung erhalten wird. Außerdem kann die aktive Verbindung in Präparate und Zubereitungen mit verlängerter Freisetzung oder kontrollierter Freisetzung (ständige oder gepulste Freisetzung) eingebaut werden.
  • Wirksame Mengen der optimierten erfindungsgemäßen Wirkstoffzusammensetzungen werden variieren gemäß Faktoren wie beispielsweise dem Grad an Sensibilität des Individuums gegenüber dem Antigen, dem Alter, Geschlecht und Gewicht des Individuums sowie der Fähigkeit des Peptids, eine Herunterregulierung der antigenspezifischen Immunantwort in dem Individuum zu verursachen. Dosierungspläne können angepasst werden, um die optimale therapeutische Antwort zu gewährleisten. Zum Beispiel können mehrere geteilte Dosen über den Verlauf von Tagen, Wochen, Monaten oder Jahren verabreicht werden, oder die Dosis kann proportional mit jeder nachfolgenden Injektion erhöht oder vermindert werden, wie durch die Anforderungen der therapeutischen Situation indiziert. In einem bevorzugten Therapieplan werden subkutane Injektionen der therapeutischen Zusammensetzungen einmal pro Woche über 3–6 Wochen gegeben. Die Dosierung kann für jede Injektion konstant bleiben oder kann mit jeder nachfolgenden Injektion erhöht oder vermindert werden. Eine Auffrisch-Injektion kann in Intervallen von etwa drei Monaten bis etwa einem Jahr nach der ersten Behandlung verabreicht werden und kann nur eine einzelne Injektion beinhalten oder kann eine weitere Reihe von Injektionen ähnlich der bei der ersten Behandlung beinhalten.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden, nichteinschränkenden Beispiele erläutert.
  • Beispiel 1
  • Bestimmung des Anteils der gesamten Hausstaubmilben-Gruppe I-T-Zell-Reaktivität und Patientenabdeckung der Kombination aus einzigartigen Der p I- und Der f I-Peptiden.
  • Synthese von Überlappenden Peptiden
  • Der p I wurde in einen Satz aus 17 überlappenden Peptiden aufgeteilt. Überlappende Peptide und einzigartige Der p I- und Der f I-Peptide (d. h. DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30)) wurden unter Verwendung von standardmäßiger Fmoc/tBoc-Synthesechemie hergestellt und mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigt. 1 zeigt die einzigartigen Der p I- und Der f I-Peptide und 2 zeigt die überlappenden Der p I-Peptide, die in diesen Studien verwendet wurden. Die Peptidbezeichnungen sind durchweg konsistent.
  • T-Zell-Antworten auf überlappende Gruppe I-Peptide und einzigartige Peptide
  • Periphere mononukleare Blutzellen (PBMC) wurden durch Ficoll-Hypaque-Zentrifugation von 60 ml heparinisiertem, peripherem Blut von Individuen mit Hausstaubmilben-Allergie, die klinische Symptome der Milben-Allergie zeigten und deren Hauttest auf Hausstaubmilbe positiv war, gereinigt.
  • Es wurden 107 PBMC von jedem Patienten in 5 ml RPMI-1640, enthaltend 5% vereinigtes humanes AB-Serum and ergänzt mit Glutamin, Penicillin, Streptomycin und HEPES-Puffer, in der Gegenwart von 20 μg/ml gereinigtem nativen Der p I/ml bei 37°C für 6 Tage kultiviert. Lebensfähige Zellen wurden anschließend durch Ficoll-Hypaque-Zentrifugation gereinigt und für weitere 2–3 Wochen in RPMI-1640/5% AB-Serum, enthaltend 5 Einheiten rekombinantes humanes IL-2/ml und 5 Einheiten rekombinates humanes IL-4/ml, kultiviert. Die ruhenden T-Zellen wurden anschließend in einem sekundären Proliferationsassay untersucht, um die T-Zell-Antworten auf gereinigtes natives Der p I, überlappende Peptide und einzigartige Peptide zu bewerten. Für das Assay wurden 2 × 104 ruhende T-Zellen in 200 μl RPMI-1640/5% AB-Serum für 3 Tage bei 37°C in der Gegenwart von 2 × 104 mit autologem Estein-Barr-Virus transformierten B-Zellen (20.000 Rads) oder in der Gegenwart von 5 × 104 PBMC (3500 Rads) als antigenpräsentierende Zellen mit verschiedenen Konzentrationen an gereinigtem Der p I oder synthetischem einzigartigem Der p I-Peptid oder überlappenden Peptiden kultiviert. Jeder Well erhielt anschließen 1 μCi tritiummarkiertes Thymidin für 16 Stunden. Die eingebauten Zähler wurden auf Glasfaserfiltern gesammelt und für eine flüssige Sczintillationszählung verarbeitet. Medium allein, das als negative Kontrolle diente, enthielt kein Allergen oder Peptid. Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt. Der höchste Stimulationsindex größer als oder gleich 2,0 als Antwort auf jedes Peptid wurde für jedes untersuchte Subjekt aufgezeichnet. Die Daten wurden anschließend mittels der früher in der Patentschrift beschriebenen Gleichungen analysiert.
  • Die Kombination aus Gruppe I-Kandidatenpeptiden DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29) DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), wies einen Bereich an T-Zell-Reaktivität von etwa 38–67% auf, basierend auf einer Analyse von 39 Patienten, die Antwortfrequenz von 82% stellt Reaktivität auf mindestens eines der Kandidatenpeptide dar, was darauf hindeutet, dass diese Kombination aus Peptiden dem ersten Kriterium für erfindungsgemäße „einzigartige" Peptide genügt, insofern dass die Kombination aus Peptiden DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30) einen ausreichenden Anteil an der gesamten T-Zell-Reaktivität der Gruppe-I-Proteinallergenen aus Der p und Der f in einem wesentlichen Anteil der untersuchten Population enthält.
  • Beispiel 2
  • Bestimmung des Anteils der gesamten Hausstaubmilben-Gruppe II-T-Zell-Reaktivität und Patientenabdeckung der Kombination aus einzigartigen Der p I-Kandidatenpeptiden.
  • Synthese von Überlappenden Peptiden
  • Der p II wurde in einen Satz aus 9 überlappenden Peptiden aufgeteilt Überlappende Der p II-Peptide und einzigartige Der p II-Peptide (d.h. DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31), DPII- 22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33)) wurden unter Verwendung von standardmäßiger Fmoc/tBoc-Synthesechemie hergestellt und mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigt. 1 zeigt die einzigartigen Der p II-Peptide und 2 zeigt die überlappenden Der p II-Peptide, die in diesen Studien verwendet wurden. Die Peptidbezeichnungen sind durchweg konsistent.
  • T-Zell-Antworten auf überlappenden Gruppe II-Peptide und einzigartigen Kandidatenpeptide
  • Es wurden sekundäre, gegenüber Der p II reaktive T-Zell-Kulturen, die aus 30 auf Milben allergischen Patienten gewonnen wurden, auf ihre Reaktivität gegenüber einem überlappenden Satz an Der p II-Peptiden sowie gegenüber Der p II-Kandidatenpeptiden in einem in vitro T-Zell-Proliferationsassay, wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt. Der höchste Stimulationsindex größer als oder gleich 2,0 als Antwort auf jedes Peptid wurde für jedes untersuchte Subjekt aufgezeichnet. Die Daten wurden anschließend mittels der früher in der Patentschrift beschriebenen Gleichungen analysiert.
  • Die Kombination aus Kandidatenpeptiden DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33) wies einen Bereich an T-Zell-Reaktivität von etwa 36%–51% auf, basierend auf einer Analyse von 30 Patienten (4). Die Antwortfrequenz auf mindestens eines der Kandidatenpeptide betrug etwa 63%, was darauf hindeutet, dass diese Kombination aus Peptiden dem ersten Kriterium für erfindungsgemäße „einzigartige" Peptide genügt, insofern dass die Kombination aus Der p II-Peptiden DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33) einen ausreichenden Anteil an der gesamten T-Zell-Reaktivität auf Der p II in einem wesentlichen Anteil der untersuchten Population enthält.
  • Beispiel 3
  • Bestimmung der pH-Löslichkeits- und pH-Stabilitätsprofile der erfindungsgemäßen Kandidatenpeptide
  • 1. Pufferherstellung
  • 50 mM Natriumphosphat-Stammlösungen:
    Stammlösung A: 0,66 g (0,05 mol) Natriumdihydrogenphosphat U.S.P. und 50 mg Dinatrium-EDTA-Dihydrat, U.S.P. wurden in 100 ml WFI (Wasser für Injektionszwecke) gelöst. Die Lösung wurde durch einen 0,2 Mikron-Filter filtriert.
    Stammlösung B: 0,71 g (0,05 mol) Natriumhydrogenphosphat U.S.P. wurden in 100 ml WFI gelöst. Die Lösung wurde durch einen 0,2 Mikron-Filter filtriert.
  • 2. Ausgangspeptiddispersionen
  • Dispersion A: 3,0 mg von jedem Kandidatenpeptid, DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33), wurden getrennt ausgewogen und in getrennte 1,5 ml Eppendoff-Vials mit 600 μl Stammlösung A gegeben. Die Zusammensetzung wurde für 5 Sekunden geschüttelt, um gut zu durchmischen.
  • Dispersion B: 3,0 mg von jedem Kandidatenpeptid, DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33), wurden getrennt ausgewogen und in getrennte 1,5 ml Eppendoff-Vials mit 600 μl Stammlösung B gegeben. Die Mischung wurde für 5 Sekunden geschüttelt, um gut zu durchmischen.
  • Dispersionen A und B wurde für 2 Minuten für eine gute Homogenität mit Ultraschall behandelt. Ein kleines Volumen wurde aus jeder Dispersion in ein markiertes Eppendoff-Vial pipettiert, gemäß dem folgenden Volumenverhältnis:
    Gläschen-Nr. Suspension A (μ1) Suspension B (μl) Gesamtvolumen (μl) Geschätzter endgültiger pH-Wert
    1 100 0 100 5.2
    2 80 20 100 6.2
    3 60 40 100 6.6
    4 40 60 100 6.8
    5 20 80 100 7.1
    6 0 100 100 8.0
  • Die resultierenden Lösungen/Suspensionen wurden im Dunkeln bei etwa 22°C ± 2 für 24 Stunden ohne Rühren gelagert. Die Lösungen wurden filtriert und die Filtrate wurden auf pH-Wert und Peptidkonzentration analysiert.
  • Die Konzentration der filtrierten Peptidlösungen wurden mittels HPLC-Analyse bestimmt. In diesem Experiment wurde die Löslichkeit des Peptids bei jedem pH-Wert definiert als die Menge an Peptid, in nach Filtration durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,2 um in Lösung verblieb. Das Ausmaß der Zersetzung der Peptide wurde abgeschätzt, indem der Anteil an gesamter Zersetzungsprodukt-Peakfläche über die gesamten Peakfläche berechnet wurde.
  • Die pH-Werte bezogen auf die Löslichkeitswerte wurden aufgetragen und sind in 5 für das jeweilige Peptid gezeigt. Wie in der Löslichkeitskurve für jedes Peptid gezeigt, wie in 5 dargestellt, sind die Peptide DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33) jeweils zu mehr als 3 mg/ml bei einem pH-Wert in dem pH-Bereich von pH 6 bis pH 8 löslich.
  • Die pH-Stabilitätsprofile für jedes Peptid DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33) in gleicher Konzentrationskombination bei 3,2 und 1 mg/ml pro Peptid und doppelt hergestellt, wie oben beschrieben, mit einem Satz, der bei etwa 5°C für 24 Stunden gelagert wurde und einen Satz, der bei etwa 22°C ± 2 für 24 Stunden gelagert wurde, wurden berechnet und als eine Funktion des Anteils an der gesamten Zersetzungsprodukt-Peakfläche (6) tabelliert. Wie aus den Daten in 6 ersichtlich, war der Anteil an Peptidzersetzung bei jeder Konzentration für Peptide geringer, die bei etwa 5°C für 24 Stunden gelagert wurden, verglichen mit Peptiden, die bei 22°C ± 2 für 24 Stunden gelagert wurden, über den kritischen pH-Bereich von pH 6,0 bis pH 8,0. Es wurde jedoch eine akzeptable Lösungsstabilität für alle Peptide in einem gemeinsamen „Fenster" innerhalb des pH-Bereichs von pH 6 bis pH 8 bei beiden Temperaturen nachgewiesen.
  • Daher wurde für jedes der Peptide DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ ID 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33) nachgewiesen, dass sie die geeignete Löslichkeit und Stabilität besitzen, die für ein erfindungsgemäßes einzigartiges Peptid erforderlich sind. SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (13)

  1. Therapeutische Zusammensetzung, die zumindest ein isoliertes Peptid, ausgewählt aus der Gruppe, die aus DPI-21,2 (SEQ ID NO: 27) und DFI-22,2 (SEQ ID NO: 28) besteht und zumindest ein Peptid umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, die aus DPI-23,31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26,6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20,9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22,14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25,15 (SEQ ID NO: 33) besteht, die alle in 1 dargestellt sind.
  2. Therapeutische Zusammensetzung, die folgendes umfasst: a) die Peptide DFI-22,2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23,1 (SEQ ID NO: 29) und DPII-22,14 (SEQ ID NO: 32); b) die Peptide DPI-21,2 (SEQ ID NO: 27), DPI-26,6 (SEQ ID NO: 30), und DPII-25,15 (SEQ ID NO: 33); c) die Peptide DPI-21,2 (SEQ ID NO: 27), DPI-22,2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23,31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26,6 (SEQ ID NO: 30), DPII-22,14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25,15 (SEQ ID NO: 33); oder d) Peptide DPI-21,2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22,2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23,31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26,6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20,9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22,14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25,15 (SEQ ID NO: 33).
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2 zur Verwendung in der Therapie.
  4. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 zur Verwendung in: a) einem Verfahren zur Behandlung der Sensibilität gegenüber einem Hausstaubmilbenallergen bei einem Säugetier, umfassend eine gleichzeitige oder aufeinanderfolgende Verabreichung zumindest zwei unterschiedlicher Zusammensetzungen nach Anspruch 1; oder b) ein Verfahren zur Behandlung der Sensibilität gegenüber einem Hausstaubmilbenallergen in einem Säugetier, umfassend eine Verabreichung einer therapeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 2.
  5. Multipeptid-Zubereitung zur pharmazeutischen Verabreichung, die folgendes umfasst: a) zumindest ein isoliertes Peptid, ausgewählt aus der Gruppe, die aus DPI-21,2 (SEQ ID NO: 27) und DFI-22,2 (SEQ ID NO: 28) besteht und zumindest ein Peptid, ausgewählt aus der Gruppe, die aus DPI-23,31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26,6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20,9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22,14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25,15 (SEQ ID NO: 33) besteht, wobei jedes Peptid bei einem pH im Bereich von pH 6,0 bis pH 8,0 löslich und stabil ist und wobei die Zubereitung einen ausreichenden Prozentsatz einer T-Zell-Aktivität von Gruppe I und Gruppe II Der f- und Der p-Hausstaubmilben-Allergenen umfasst; b) einen pharmazeutisch verträglichen Träger und wahlweise c) ein oder mehreres von EDTA und einem pharmazeutisch vertraglichen Gegenion.
  6. Zubereitung nach Anspruch 5, die zumindest 37% T-Zell-Aktivität von Gruppe 1 und Gruppe II Der f und Der p-Hausstaubmilben-Allergenen umfasst.
  7. Multipeptid-Zubereitung nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, die folgendes umfasst: a) Peptide, die DPI-21,2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22,2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23,31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26,6 (SEQ ID NO: 30), DPII-22,14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25,15 (SEQ ID NO: 33); oder b) Peptide DPI-21,2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22,2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23,31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26,6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20,9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22,14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25,15 (SEQ ID NO: 33).
  8. Optimierte Multipeptid-Zubereitung, die für eine therapeutische Behandlung von Menschen geeignet ist, die unter einer Allergie gegenüber Hausstaubmilben leiden, die folgendes umfasst: a) Peptide DPI-21,2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22,2. (SEQ ID NO: 28), DPI-23,31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26,6 (SEQ ID NO: 30), DPII-29,14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25,15 (SEQ ID NO: 33); und wahlweise DPII-20,9 (SEQ ID No: 31); wobei jedes Peptid in einer Konzentration von 0,75 mg pro Peptid vorliegt; 0,05M Natriumphosphat U.S.P.; 5% g/v Mannitol U.S.P.; 0,1 mg/ml Dinatrium-EDTA-Dihydrat U.S.P.; und steriles Wasser zur Injektion U.S.P.; wobei die Formulierung einen End-pH von 7,2–7,4 aufweist; oder b) Peptide DFI-22,2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23,1 (SEQ ID NO: 29) und DPII-22,14 (SEQ ID NO: 32); wobei jedes Peptid in einer Konzentration von 0,75 mg pro Peptid vorliegt; 0,05M Natriumphosphat U.S.P.; 5% g/v Mannitol U.S.P.; 0,1 mg/ml Dinatrium-EDTA-Dihydrat U.S.P.; und steriles Wasser zur Injektion U.S.P.; wobei die Zubereitung einen endgültigen pH von 7,0 aufweist; oder c) Peptide DPI-21,2 (SEQ ID NO: 27), DPI-26,6 (SEQ ID NO: 30), und DPII-25,15 (SEQ ID NO: 33); wobei jedes Peptid in einer Konzentration von 0,75 mg pro Peptid vorliegt; 0,05M Natriumphosphat U.S.P.; 5% g/v Mannitol U.S.P.; 0,1 mg/ml Dinatrium-EDTA-Dihydrat U.S.P.; und steriles Wasser zur Injektion U.S.P.; wobei die Zubereitung einen endgültigen pH von 6,2 aufweist.
  9. Formulierung nach Anspruch 8 zur Verwendung in der Therapie.
  10. Erste und zweite optimierte Multipeptid-Zubereitungen zur simultanen oder sequentiellen Verwendung in der Therapie, wobei die erste Zubereitung folgendes umfasst: Peptide DFI-22,2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23,1 (SEQ ID NO: 29) und DPII-22,14 (SEQ ID NO: 32); wobei jedes Peptid in einer Konzentration von 0,75 mg pro Peptid vorliegt; 0,05M Natriumphosphat U.S.P.; 5% g/v Mannitol U.S.P.; 0,1 mg/ml Dinatrium-EDTA-Dihydrat U.S.P.; und steriles Wasser zur Injektion U.S.P.; mit einem endgültigen pH von 7,0; und wobei die zweite optimierte Multipeptid-Zubereitung folgendes umfasst: Peptide DPI-21,2 (SEQ ID NO: 27), DPI-26,6 (SEQ ID NO: 30) und DPII-25,15 (SEQ ID NO: 33); wobei jedes Peptid in einer Konzentration von 0,75 mg pro Peptid vorliegt; 0,05M Natriumphosphat U.S.P.; 5% g/v Mannitol U.S.P.; 0,1 mg/ml Dinatrium-EDTA Dihydrat U.S.P.; und steriles Wasser zur Injektion U.S.P.; mit einem endgültigen pH von 6,2.
  11. Zubereitung nach Anspruch 9 oder Anspruch 10 zur Verwendung in der Behandlung einer Sensibilität gegenüber einem Hausstaubmilben-Allergen.
  12. Verwendung einer Zubereitung nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 5 bis 8 in der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung der Sensibilität gegenüber einem Hausstaubmilben-Allergen.
  13. Isoliertes Peptid mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe, die aus DPI-23,31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26,6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20,9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22,14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25,15 (SEQ ID NO: 33) besteht.
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