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Hintergrund der Erfindung
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Ungefähr 500 Millionen
Menschen in der Welt sind allergisch gegenüber Staubmilben und man nimmt an,
dass Allergie gegenüber
Staubmilben ein Faktor bei 50% bis 80% der Patienten mit Asthma
sowie bei einer Vielzahl von Fällen
von Ekzemen, Heuschnupfen und anderen allergischen Symptomen ist.
Staubmilben sind in Häusern
ubiquitär
und gedeihen in Betten, Vorhängen
und Teppichen. Es ist äußerst schwierig,
sie aus der Lebensumgebung zu entfernen und ein allergisches Individuum
ist dem Allergen ständig
ausgesetzt und eine solche konstante Exposition kann eine Ursache
für eine
Verschlechterung des allergischen Zustands mit der Zeit sein. Daher
kann die Allergie gegenüber
Staubmilben chronisch und schwer zu behandeln sein.
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Allergien
gegenüber
Milben der Gattung Dermatophagoides wurden mit einer Anzahl an allergischen Zuständen wie
Asthma, Rhinitis und ektopische Dermatitis in Verbindung gebracht.
Zwei Spezies, D. pteronyssinus und D. farinae kommen vorherrschend
vor und als Folge wurden beträchtliche
Anstrengungen mit Versuchen unternommen, die von diesen beiden Spezies
produzierten Allergene zu identifizieren.
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Forscher
haben die Bedeutung des Ansprechens auf die Gruppe I-(z. B. Der
p I und Der f I) und Gruppe II-(z. B. Der p II und Der f II) Proteinallergene
dokumentiert. Zum Beispiel wurde dokumentiert, dass bei über 60%
der Patienten mindestens 50% ihrer Anti-Milben-Antikörper auf
diese Proteine gerichtet sind (z. B., Lind, P. et al., Allergy,
39:259-274 (1984); van der Zee, J. S. et al., Journal Allergy and
Clinical Immunology, 81:884-896 (1988)). Es ist möglich, dass
Kinder einen größeren Grad
an Reaktivität
gegenüber
den Gruppe I- und Gruppe II-Allergenen aufweisen (Thompson, P. J.,
et al., Immunology, 64:301-314 (1988)).
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Es
wurde eine konzertierte Anstrengung unternommen, die Hauptallergene
sowohl aus D. pteronyssinus wie auch aus D. farinae durch Genklonierung
zu charakterisieren. Demzufolge berichteten einige Veröffentlichungen
die vollständige
Nucleotidsequenz von einigen Allergenen, einschließlich Der
p I (Thomas, W. R., et al., International Archives of Allergy and
Applied Immunology, 85:127-129 (1988); und Chua, K. Y., et al., Journal
of Experimental Medicine, 167:175-182 (1988)), Der p II (Chua, K.
Y., et al., International Archives of Allergy and Applied Immunology,
91:118-123 (1990)), Der f I (Dilworth, R. J., et al. Clinical and
Experimental Allergy, 21: 2532 (1891)), Der f II (Yuuki, T., et
al., Japan Journal Allergol., 39:557-461 (1990); und Trudinger, M.,
et al., Clinical and Experimental Allergy, 21:33-37(1991)) und einem
Allergen mit geringem Molekulargewicht (Ovey, E. R., et al., Journal
of Experimental Medicine, 170:1457-1462 (1989)).
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Die
veröffentlichten
Nucleotidsequenzen der für
Der p I und Der f I kodierenden cDNAs zeigen, dass diese beiden
Proteine auf dem Aminosäureniveau
hoch homolog sind (81% Identität)
und dass die Produkte des reifen Proteins aus 222 bzw. 223 Resten
bestehen (Chua, K. Y., et al., Journal of Experimental Medicine, 167:175-182
(1988); und Dilworth, R. J., et al., supra)). Die Proteinallergene
Der p II und Der f II bestehen beide aus 129 Resten und sind ebenfalls
hoch homolog (88% Identität)
in der Aminosäuresequenz
(Trudinger, M., et al. supra; Yuuki, T., et al. supra); Chua, K.
Y., et al, International Archives of Allergy and Applied Immunology, 91:118-123
(1990)).
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Die
Isolierung von cDNA-Klonen, die für Der p I und Der p II kodieren,
hat Antikörperbindungsstudien an
den rekombinanten Antigenen ermöglicht
(Green, W. K., et al., International Archives of Allergy and Applied Immunology,
92:30-38(1990); Chua, K. Y., et al., International Archives of Allergy
and Applied Immunology, 91:124-129 (1990)). Komplementäre DNA-Fragmente
von Der p I wurden in E. coli exprimiert und bei IgE-Bindungsuntersuchungen
mit vereinigten humanen, gegenüber
Milben allergischen IgE-Seren wurden Bindungs- und Nichtbindungsregionen
im gesamten Molekül
nachgewiesen (Thomas, W. R., et al., In: Epitopes of Atopic Allergens,
Proceedings of Workshop from XIV Congress of the European Academy
of Allergy and Clinical Immunology, Berlin, Sept. 1989. pp 77-82). Über T-Zell-Epitope
von Der p I wurde berichtet (O'Hehir,
R. E., et al., Annual Review Immunology, 9:67-95 (1991); Stewart,
G. A., et al., In: Epitopes of Atopic Allergens, Proceedings of
Workshop from XIV Congress of the European Academy of Allergy and
Clinical Immunology, Berlin, Sept. 1989. pp 41-47; Yessel, H., et
al., In: T cell Activation in Health and Disease: Discrimination
Between Immunity and Tolerance, Conference 22-26 Sept., 1990, Trinity
College, Oxford, U. K. und Hessel, H., et al., Journal of Immunology,
148(3): 738-745 (1. Feb., 1992).
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Derzeit
wird eine Desensibilisierungstherapie für die Behandlung von Hausstaubmilben-Allergie angewandt.
Eine derartige Therapie umfasst die Verabreichung eines Extrakts,
dass aus Kulturen aus ganzen Hausstaubmilben gewonnen wird, an ein
allergisches Individuum. Die Desensibilisierungstherapie unter Verwendung
eines derartigen Extrakts hat den Nachteil, dass sie eine Anaphylaxie
hervorrufen kann, wenn hohe Dosen verwendet werden, wohingegen die
Behandlung, wenn zur Vermeidung einer Anaphylaxie geringe Dosen
verwendet werden, nicht besonders wirksam ist und über mehrere
Jahre fortgesetzt werden muss, um eine Toleranz gegenüber dem
Extrakt aufzubauen.
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WO 93/08279 und
WO 94/24281 offenbaren verbesserte
Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von Allergie gegenüber Hausstaubmilben,
die mögliche
unerwünschte
Wirkungen, die mit der herkömmlichen
Desensibilisierungstherapie unter Verwendung von Extrakt aus ganzen
Hausstaubmilben einhergehen, stark minimieren.
WO 93/08279 und
WO 94/24281 offenbaren isolierte antigene
Fragmente oder Peptid, die von Der p I, Der p II, Der f I und Der
f II abgeleitet sind und bei Verabreichung an ein gegenüber Staubmilben
sensibles Individuum in der Lage sind, die allergische Reaktion
des Individuums auf die Hausstaubmilbe herunterzuregulieren. Ein
solches Herunterregulieren der allergischen Reaktion des Individuums
führt zu einer
Verminderung oder Linderung der klassischen Symptome von Allergie,
einschließlich
asthmatischer Symptome, die durch Hausstaubmilben hervorgerufen
werden. Derartige antigene Fragmente sind in
WO 93/08279 und
WO 94/24281 so beschrieben, dass sie
eine T-Zell-Reaktion wie eine Stimulation (d. h. T-Zell-Proliferation
oder Lymphokin-Sekretion) hervorrufen können und/oder eine Nichtempfindlichkeit
der T-Zellen oder eine verminderte Empfindlichkeit der T-Zellen
induzieren können,
wenn diese mit einem Hausstaubmilben-Allergen konfrontiert werden. Außerdem beschreiben
WO 93/08279 und
WO 94/24281 , dass die am
meisten bevorzugten Peptide, die von Der p und Der f Gruppe I- und
Gruppe II-Proteinallergenen abgeleitet wurden und für therapeutische
Verwendung geeignet sind, nicht IgE binden, was für solche
Der p- und Der f-Proteine spezifisch ist, oder IgE in einem deutlich
geringeren Ausmaß binden
als das native Staubmilben-Proteinallergen, wodurch die Möglichkeit
einer Anaphylaxie in einem Behandlungsplan, der derartige Peptide
umfasst, vermindert oder beseitigt wird. Weiterhin offenbaren
WO 93/08279 und
WO 94/24281 , dass die im
Falle der Kreuzreaktivität
innerhalb der Interspezies-Gruppe I-Allergene (d. h. Der p I und Der f I)
und der Interspezies-Gruppe II-Allergene (d. h. Der p II und Der
f II), Peptide der Gruppe I, zum Beispiel, die aus einer Spezies abgeleitet
wurden (z. B., Der p I) eine T-Zell-Reaktion von T-Zellen hervorrufen
können,
die für
die andere Spezies (z. B., Der f I) spezifisch ist, um umgekehrt.
Schließlich
beschreiben
WO 93/08279 und
WO 94/24281 Peptide, die
die oben beschriebenen Eigenschaften besitzen.
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Als
Folge der ausgedehnten Anstrengungen einer Präformulierung, stellt die vorliegende
Erfindung neue Zusammensetzungen und Multipeptid-Zubereitungen von
aus Der p und Der f Gruppe I- und Gruppe II-Proteinallergenen abgeleiteten
Peptiden bereit, die optimal für
die Herstellung eines Wirkstoffprodukts sind, das für die Verwendung
bei der Behandlung von Hausstaubmilben-Allergie bei Menschen und
anderen Säugetieren
geeignet ist. Derartige neue Zusammensetzungen und Multipeptid-Zubereitungen
von Der p- und Der f-Proteinallergenpeptiden für die Verwendung als ein optimiertes
humanes Wirkstoffprodukt wurden bisher nicht offenbart oder in Erwägung gezogen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt neue therapeutische Zusammensetzungen
und Multipeptid-Zubereitungen von Peptiden und modifizierten Peptiden
bereit, die aus Der p und Der f Gruppe I- und Gruppe II-Proteinallergenen
abgeleitet wurden. Derartige neue therapeutische Zusammensetzungen
und Multipeptid-Zubereitungen sind das Ergebnis eines Präformulierungsschemas
zur Entwicklung eines optimierten Wirkstoffprodukts zur therapeutischen
Behandlung von Menschen, die an einer Allergie gegenüber Hausstaubmilben-Allergenen
leiden. Die erfindungsgemäßen Der
p- und Der f-Peptide und modifizierten Peptide besitzen bestimmte
einzigartige Eigenschaften, die sie besonders geeignet für die Wirkstoffprodukt-Zubereitung
machen. Erfindungsgemäße therapeutische
Zusammensetzungen und Multipeptid-Zubereitungen wurden optimiert,
um die einzigartigen Eigenschaften der Peptide und modifizierten
Peptide, die aus den Hausstaubmilben-Proteinallergenen abgeleitet
wurden, aufzunehmen und zu bewahren und gleichzeitig eine maximale
therapeutische Wirkung zu gewährleisten,
wenn sie in therapeutischen Behandlungsplänen für Hausstaubmilben-Allergien
bei Menschen verwendet werden. Die Erfindung stellt weiterhin neue
modifizierte Peptide bereit, die aus Der p I- und Der p II-Proteinallergenen abgeleitet
werden.
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Demzufolge
stellt die Erfindung eine therapeutische Zusammensetzung bereit,
die zumindest ein isoliertes Peptid, ausgewählt aus der Gruppe, die aus
DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27) und DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28) besteht, und
zumindest ein Peptid umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, die aus
DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ
ID NO: 31) DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO:
33) besteht, alle wie in 1 dargestellt. Die Zusammensetzung
ist vorzugsweise für
die Verwendung in der Therapie bestimmt.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine therapeutische Zusammensetzung
bereit, enthaltend:
- a) Peptide DFI-22.2 (SEQ
ID NO: 28); DPI-23.1 (SEQ ID NO: 29) und DPII-22.14 (SEQ ID NO:
32);
- b) Peptide DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30)
und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33);
- c) Peptide DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.22 (SEQ ID NO: 28),
DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-22.14
(SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33); oder
- d) Peptide DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.22 (SEQ ID NO: 28),
DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ
ID NO: 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33).
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Die
Zusammensetzung ist vorzugsweise für die Verwendung in der Therapie
bestimmt.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Multipeptid-Zubereitung
für pharmazeutische
Verabreichung bereit, enthaltend: a) zumindest ein isoliertes Peptid,
ausgewählt
aus der Gruppe, die aus DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27) und DFI-22.2 (SEQ
ID NO: 28) besteht und zumindest ein Peptid, ausgewählt aus
der Gruppe, die aus DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID
NO: 30), DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 31) und
DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33) besteht, wobei jedes Peptid bei einem
pH-Wert im Bereich von pH 6,0 bis pH 8,0 löslich und stabil ist und wobei
die Zubereitung einen ausreichenden Prozentsatz einer T-Zell-Aktivität von Gruppe
I und Gruppe II Der f- und Der p- Hausstaubmilben-Allergenen umfasst;
b) einen pharmazeutisch verträglichen
Träger;
und wahlweise c) ein oder mehreres von EDTA und einem pharmazeutisch
verträglichen
Gegenion. Vorzugsweise enthält
die Zubereitung zumindest 37% T-Zell-Aktivität von Gruppe I und Gruppe II
Der f- und Der p-Hausstaubmilben-Allergenen.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine optimierte Multipeptid-Zubereitung
bereit, die für eine
therapeutische Behandlung von Menschen geeignet ist, die unter einer
Allergie gegenüber
Hausstaubmilben leiden, die folgendes umfasst:
- a)
Peptide DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27); DFI-22.22 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31
(SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-22.14 (SEQ ID NO:
32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33); und wahlweise DPII-20.9; wobei
jedes Peptid in einer Konzentration von 0,75 mg pro Peptid vorliegt;
0,05M Natriumphosphat U.S.P.; 5 Gew.-% Mannitol U.S.P.; 0,1 mg/ml
Dinatrium-EDTA-Dihydrat U.S.P.; und steriles Wasser zur Injektion U.S.P.;
wobei die Zubereitung einen endgültigen
pH-Wert von 7,2–7,4
aufweist; oder
- b) Peptide DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.1 (SEQ ID NO: 29)
und DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32); wobei jedes Peptid in einer Konzentration
von 0,75 mg pro Peptid vorliegt; 0,05M Natriumphosphat U.S.P.; 5 Gew.-%
Mannitol U.S.P.; 0,1 mg/ml Dinatrium-EDTA-Dihydrat U.S.P.; und steriles
Wasser zur Injektion U.S.P.; wobei die Zubereitung einen endgültigen pH-Wert
von 7,0 aufweist; oder c) Peptide DP1-21.2 (SEQ ID NO: 27), DPI-26.6
(SEQ ID NO: 30) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33); wobei jedes Peptid
in einer Konzentration von 0,75 mg pro Peptid vorliegt; 0,05M Natriumphosphat
U.S.P.; 5 Gew.-% Mannitol U.S.P.; 0,1 mg/ml Dinatrium-EDTA-Dihydrat U.S.P.;
und steriles Wasser zur Injektion U.S.P.; wobei die Zubereitung
einen endgültigen
pH-Wert von 6,2 aufweist.
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Die
Zubereitung ist vorzugsweise für
die Verwendung in der Therapie bestimmt.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung erste und zweite optimierte
Multipeptid-Zubereitungen
für die
simultane oder sequentielle Verwendung in der Therapie bereit, wobei
diese erste Zubereitung Peptide DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28); DPI-23.1
(SEQ ID NO: 29) und DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) enthält; wobei
jedes Peptid in einer Konzentration von 0,75 mg pro Peptid vorliegt;
0.05M Natriumphosphat U.S.P.; 5 Gew.-% Mannitol U.S.P.; 0,1 mg/ml
Dinatrium-EDTA-Dihydrat U.S.P.; und steriles Wasser zur Injektion
U.S.P.; mit einem endgültigen
pH-Wert von 7,0; und wobei diese zweite optimierte Multipeptid-Zubereitung
Peptide DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27); DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30) und DPII-25.15
(SEQ ID NO: 33) enthält;
wobei jedes Peptid in einer Konzentration von 0,75 mg pro Peptid
vorliegt; 0.05M Natriumphosphat U.S.P.; 5 Gew.-% Mannitol U.S.P.;
0,1 mg/ml Dinatrium-EDTA-Dihydrat U.S.P.; und steriles Wasser zur
Injektion U.S.P.; mit einem endgültigen
pH-Wert von 6,2. Vorzugsweise ist die Zubereitung zur Verwendung
in der Behandlung einer Sensibilität gegenüber einem Hausstaubmilben-Allergen
bestimmt.
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Beschreibung der Abbildungen
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1 zeigt
die Aminosäuresequenzen
der erfindungsgemäßen „einzigartigen" Peptide, einschließlich der
erfindungsgemäßen neuen „einzigartigen" Peptide.
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2 zeigt überlappende
Peptide, die von Der p I- und Der p II-Proteinallergenen abgeleitet
werden, die in den hier beschriebenen T-Zell-Studien verwendet wurden.
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3 ist
eine graphische Darstellung, die T-Zell-Reaktionen auf die in 2 gezeigten überlappenden Der
p I-Peptide und die in 1 gezeigten „einzigartigen" Gruppe I-Peptide DPI-21.2
(SEQ ID NO 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO 29),
DPI-26.6 (SEQ ID NO 30) zeigt. Der über jeder Säule gezeigte (in Klammern)
mittlere S.I. sowie der Prozentsatz von Reaktionen, der Positivitätsindex
(mittlerer S.I. multipliziert mit dem Prozentsatz der Reaktionen),
ist die Y-Achse.
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4 ist
eine graphische Darstellung, die T-Zell-Reaktionen auf die in 2 gezeigten überlappenden Der
p II-Peptide, DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO:
32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33) und die in 2 gezeigten „einzigartigen" Der p II-Peptide
zeigt. Der über
jeder Säule
gezeigte (in Klammern) mittlere S.I. sowie der Prozentsatz von Reaktionen,
der Positivitätsindex
(mittlerer S.I. multipliziert mit dem Prozentsatz der Reaktionen),
ist die Y-Achse.
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5 ist
ein pH-Löslichkeitsprofil
von „einzigartigen" Kandidatenpeptiden
DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ
ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31),
DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33), in 50 mM Natriumphosphatpuffern
mit 5% Mannitol. Die Löslichkeit
wird in mg/ml (y-Achse) über
einen pH-Wertbereich von pH 5,5 bis pH 8,5 bei etwa 22°C ± 2 gemessen.
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6 ist
ein pH-Stabilitätsprofil
von Kandidatenpeptiden DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID
NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9
(SEQ ID NO: 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ
ID NO: 33), in einer gleichen Konzentrationskombination. Zersetzung von
Peptid wird berechnet als %-Zersetzung (bestimmt durch die Peakfläche unter
Verwendung von HPLC-Analyse) von Peptid, beobachtet nach 24 Stunden
bei etwa 22°C ± 2 und
etwa 5°C,
bei verschiedenen theoretischen Konzentrationen von 3,0, 2,0 und
1,0 mg/ml Peptid über
einen pH-Wertbereich von 6,0 bis 8,5.
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Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Die
Patent- und wissenschaftliche Literatur, auf die sich hier bezogen
wird, bildet das Wissen, das Fachleuten auf dem Gebiet zugänglich ist.
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Die
vorliegende Erfindung stellt neue modifizierte Der p I- und Der
p II-Peptide bereit, die zusammen mit anderen Der p I- und Der f
I-Peptiden Teil eines Präformulierungsschemas
zur Entwicklung eines optimierten Wirkstoffprodukts zur therapeutischen
Behandlung von Menschen sind, die an einer Allergie gegenüber Hausstaubmilben-Allergene leiden.
Derartige Peptide und modifizierte Peptide besitzen bestimmte einzigartige
Eigenschaften, die sie besonders geeignet für die Wirkstoffprodukt-Zubereitung machen
und können
hier als „einzigartige" Peptide bezeichnet
werden.
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In Übereinstimmung
mit pharmazeutischer Chemie ist eine Präformulierung das Verfahren,
einen Wirkstoff durch Bestimmung und/oder Definition von dessen
physikalischen und chemischen Eigenschaften zu optimieren, die bei
der Formulierung einer stabilen, wirksamen und sicheren Dosierungsform
für wichtig
erachtet werden. Die möglichen
Wechselwirkungen mit den verschiedenen Komponenten, die in dem fertigen
Wirkstoffprodukt angewendet werden sollen, werden ebenfalls in Betracht
gezogen. Die Präformulierung
ist ein intensiver Aufwand, der die Untersuchung solcher Parameter
wie Löslichkeit,
pH-Stabilitätsprofil
und Wirkstoff-Hilfsstoff-Wechselwirkungen umfasst, die eine tiefgreifende
Wirkung auf die physiologische Verfügbarkeit des Wirkstoffs und
dessen physikalische und chemische Stabilität haben kann. Die aus derartigen
Untersuchungen erhaltenen Daten werden zu denen gefügt, die
aus vorausgehenden pharmakologischen und biochemischen Untersuchungen
der aktiven Wirkstoffkomponente erhalten wurden, und stellen so
Informationen bereit, die eine Auswahl der besten Wirkstoffform
und der bevorzugtesten Hilfsstoffe für die Verwendung in dieser Entwicklung
ermöglichen.
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Die
Entwicklung einer optimalen Zubereitung aus aktiver Wirkstoffkomponente
und Hilfsstoffen ist komplex und viele Faktoren beeinflussen die
Eigenschaften der Zubereitung. Das hohe Ausmaß an Homogenität, die physiologische
Verfügbarkeit
und die therapeutische Qualität,
die von Pharmazeutika erwartet wird, kann nur durch beträchtlichen
Aufwand und Fachkenntnis erreicht werden.
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Flexibilität ist ebenfalls
ein wichtiger Faktor bei der Präformulierung.
Möglicherweise
müssen
eine Vielzahl an Hilfsstoffen, Stabilisierungsmitteln, Gegenionen
und dergleichen geprüft
werden, um diejenigen zu finden, die mit der aktiven Wirkstoffkomponente
der Zubereitung verträglich
sind. Es können
eine Vielzahl an Modifizierungen des aktiven Bestandteils notwendig
werden, um ein Wirkstoffprodukt erfolgreich zu formulieren. Derartige
Modifizierungen dürfen
sich nicht auf die allgemeine therapeutische Wirksamkeit des Wirkstoffs
auswirken, müssen
aber gleichzeitig den Wirkstoff für die Formulierung geeigneter
machen.
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Als
ein Teil eines Präformulierungsschemas
zur Bereitstellung eines optimierten Wirkstoffprodukts, das für eine Verwendung
in Menschen und anderen Säugetieren
für die
Behandlung von Sensibilität
gegenüber
Hausstaubmilben geeignet ist, wurde bestimmt, dass die aktive Komponente
(hier als ein „Peptid" oder „Kandidatenpeptid" oder „einzigartiges
Peptid" bezeichnet)
in einer solchen Zubereitung die folgenden Eigenschaften besitzen
sollte, die solche Peptide unter allen anderen möglichen, von den Der p I-,
Der p II- und Der fI-Proteinallergensequenzen abgeleiteten Peptiden „einzigartig" machen würde. Erstens
sollte ein einzigartiges Peptid allein oder in Kombination mit anderen
einzigartigen Peptiden einen ausreichenden Prozentsatz der T-Zell-Reaktivität der Der
p- und Der f-Proteinallergen
enthalten, um die Nichtempfindlichkeit der T-Zellen oder eine verminderte
Empfindlichkeit der T-Zellen in einem wesentlichen Anteil der gegenüber dem
Hausstaubmilben-Allergen sensiblen Individuen zu induzieren. Zweitens
sollte das Kandidatenpeptid die Eigenschaft der „ausgezeichneten Löslichkeit" besitzen, was hier als
Löslichkeit
von mehr als 3 mg/ml bei einem pH-Wert in einem pH-Bereich von pH
6 bis pH 8 in einem wässrigen
Puffer definiert wird. Drittens ist das Peptid in einem wässrigen
Puffer bei einem pH-Wert in einem pH-Bereich von pH 6 bis pH 8 stabil.
Kandidatenpeptide, die von den Der p- und Der f-Proteinallergenen
abgeleitet werden und als erfindungsgemäße „einzigartige" Peptide bestimmt
wurden, sind DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28),
DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ
ID NO: 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO:
33), alle wie in 1 gezeigt.
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In Übereinstimmung
mit der ersten Eigenschaft versteht es sich, dass diejenigen Peptide,
die eine T-Zell-Reaktion wie eine T-Zell-Proliferation oder Lymphokin-Sekretion
hervorrufen (d. h. mindestens ein T-Zell-Epitop enthalten), oder
die Nichtempfindlichkeit der T-Zellen oder eine verminderte Empfindlichkeit
der T-Zellen induzieren, eine T-Zell-Reaktivität aufweisen.
Man nimmt an, dass T-Zell-Epitope an der Initiierung und Aufrechterhaltung
der Immunantwort auf ein Proteinallergen beteiligt sind, das für die klinischen
Symptome einer Allergie verantwortlich ist. Diese T-Zell-Epitope
lösen vermutlich
frühe Ereignisse
auf dem Niveau der T-Helferzellen aus, indem sie an ein geeignetes
HLA-Molekül
auf der Oberfläche
einer antigenpräsentierenden Zellen
binden und die betreffende T-Zell-Subpopulation stimulieren. Diese
Ereignisse führen
zu T-Zell-Proliferation,
Lymphokin-Sekretion, lokalen Entzündungsreaktionen, Rekrutierung
von zusätzlichen
Immunzellen an der Stelle und Aktivierung der B-Zell-Kaskade, was
zur Produktion von Antikörpern
führt.
Ein Isotyp dieser Antikörper,
IgE, ist von grundlegender Bedeutung für die Entwicklung von allergischen
Symptomen und seine Produktion wird früh in der Ereigniskaskade, auf
dem Niveau der T-Helferzellen, durch die Art der sezernierten Lymphokine
beeinflusst. Ein T-Zell-Epitop ist das Grundelement oder die kleinste
Erkennungseinheit für
einen T-Zell-Rezeptor, wobei das Epitop die Aminosäuren enthält, die
für die
Rezeptorerkennung notwendig sind. Man nimmt an, dass die Exposition
von Patienten mit Hausstaubmilben-Allergie auf isolierte Peptide
der Gruppe I- und Gruppe II-Proteinallergene der Hausstaubmilben,
die mindestens ein T-Zell-Epitop
enthalten, eine Nichtempfindlichkeit der T-Zellen von geeigneten
T-Zell-Subpopulationen
verursachen kann, so dass sie unempfindlich werden oder eine verminderte
Empfindlichkeit gegenüber
dem Proteinallergen aufweisen, und nicht an der Stimulierung einer
Immunantwort bei einer derartigen Exposition teilnehmen, zum Beispiel, über Anergie,
Toleranz oder Apoptose, über
die Fähigkeit,
das Lymphokin-Sekretionsprofil
verglichen mit Exposition gegenüber
dem natürlich
vorkommenden Autoantigen zu modifizieren; und/oder die Fähigkeit,
eine Induktion von T-Suppressorzellen zu verursachen.
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Um
Peptide zu bestimmen, die T-Zell-Reaktivität haben und mindestens ein
T-Zell-Epitop enthalten, werden
isolierte Peptide durch, zum Beispiel, Techniken der T-Zell-biologie untersucht,
um zu bestimmen, ob die Peptide eine T-Zell-Reaktion hervorrufen
oder eine Unempfindlichkeit der T-Zellen induzieren. Wie in den Beispielen
diskutiert, kann die Stimulierungsaktivität humaner T-Zellen untersucht
werden, indem T-Zellen, die von einem gegenüber dem Hausstaubmilben-Allergen
sensiblen Individuum erhalten wurden (d. h. einem Individuum, das
eine IgE vermittelte Immunantwort auf ein Hausstaubmilben-Allergen
hat), mit einem Peptid oder modifizierten Peptid, das von einem
Der p- oder Der f Gruppe I- oder Gruppe II-Proteinallergen abgeleitet wurde,
kultiviert werden, und man bestimmt, ob eine T-Zell-Proliferation
als Reaktion auf das Peptid wie gemessen auftritt, z. B. durch die
zelluläre
Aufnahme von tritiummarkiertem Thymidin. Stimulationsindizes für Reaktionen
von T-Zellen auf Peptide können
als die maximalen Zählimpulse
pro Minute (CPM) als Reaktion auf ein Peptid geteilt durch die Kontroll-CPM berechnet werden.
Ein Stimulationsindex (SI) gleich oder größer als zweimal der Hintergrundwert
wird als „positiv" betrachtet. Positive
Ergebnisse werden verwendet, um den mittleren Stimulationsindex
für jedes
Peptid für
die untersuchte Patientengruppe zu berechnen. Peptide, die sich als
Kandidaten für
eine Zubereitung in ein endgültiges
Wirkstoffprodukt eignen, haben einen mittleren T-Zell-Stimulationsindex
von größer oder
gleich 2,0 und vorzugsweise höher
(z. B. mindestens 2,5, mehr bevorzugt mindestens 3,5, mehr bevorzugt
mindestens 4,0, mehr bevorzugt mindestens 5, noch mehr bevorzugt mindestens
7 und am meisten bevorzugt mindestens etwa 9).
-
Für therapeutische
Zwecke werden Kandidatenpeptide von mindestens 10%, mehr bevorzugt
mindestens 20%, mehr bevorzugt mindestens 30% und noch mehr bevorzugt
mindestens 40% oder mehr der Individuen in einer Population aus
Individuen erkannt, die auf das Hausstaubmilben-Allergen sensibel
reagieren. Außerdem
weisen bevorzugte Kandidatenpeptide einen Positivitätsindex
(PI) von mindestens etwa 100, mehr bevorzugt mindestens etwa 250
und am meisten bevorzugt mindestens etwa 350 auf. Der Positivitätsindex
für ein
Peptid wird bestimmt, indem der mittlere T-Zell-Stimulationsindex
mit dem Prozentsatz an Individuen in einer Population aus Individuen,
die auf das Hausstaubmilben-Allergen sensibel reagieren, multipliziert
wird (z. B. vorzugsweise mindestens 15 Individuen, mehr bevorzugt
mindestens 30 Individuen oder mehr), die einen T-Zell-Stimulationsindex
gegenüber
einem derartigen Peptid von mindestens 2,0 haben. So stellt der
Positivitätsindex
sowohl die Stärke
einer T-Zell-Reaktion auf ein Peptid (SI) wie auch die Frequenz
einer T-Zellreaktion auf ein Peptid in einer Population aus Individuen
dar, die auf das Hausstaubmilben-Allergen sensibel reagieren.
-
Um
zu bestimmen, ob ein Peptid (Kandidatenpeptid) oder eine Kombination
aus Kandidatenpeptiden wahrscheinlich einen ausreichenden Prozentsatz
an T-Zell-Reaktivität auf die
Hausstaubmilben-Proteinallergene enthalten, um eine Nichtempfindlichkeit
der T-Zellen in einem wesentlichen Anteil einer Population aus Individuen
zu induzieren, die auf das Hausstaubmilben-Allergen sensibel reagieren,
kann ein Algorithmus verwendet werden. In Übereinstimmung mit einem solchen
Algorithmus wird ein Satz an überlappenden
Peptiden hergestellt, indem das/die Proteinallergen(e) von Interesse
systematisch in mindestens zwei überlappende Peptidregionen
von gewünschter
Länge unterteilt
wird (z. B. einer Länge
von etwa 12–30
Aminosäureresten, vorzugsweise
in eine Länge
von nicht länger
als etwa 25 Aminosäureresten
mit einer Überlappung
von etwa 5–15
Aminosäureresten).
Diese Unterteilung in Peptidregionen kann willkürlich sein, kann gemäß einem
Algorithmus erfolgen oder kann vollständig oder teilweise auf Regionen
von Gruppe I- und/oder Gruppe II-Proteinallergenen von Hausstaubmilben
erfolgen, von denen bekannt ist, dass sie mindestens ein T-Zell-Epitop
enthalten. Vorzugsweise werden mindestens 50% der gesamten Proteinallergensequenz
der Hausstaubmilbe und mehr bevorzugt die gesamte Proteinallergensequenz
der Hausstaubmilbe in zwei oder mehr Peptide unterteilt. Für jedes
dieser Peptide wird ein humaner T-Zell-Stimulationsindex in einem
in vitro T-Zell-Proliferationsassay bestimmt, wie hierin beschrieben,
für jedes
untersuchte Individuum in einer Population aus Individuen, die auf
das Proteinallergen sensibel reagieren. Zum Beispiel offenbaren
sowohl
WO 93/08279 wie
auch
WO 94/24281 T-Zell-Untersuchungen
mit überlappenden
Peptiden, die von Der p I, Der p II, Der f I und Der f II abgeleitet
werden. Ein Kandidatenpeptid oder eine Kombination aus Kandidatenpeptiden
wird auf der Grundlage, zumindest teilweise, des mittleren humanen
T-Zell-Stimulationsindex des Kandidatenpeptids in dem Satz der untersuchten
Peptide und dem Positivitätsindex
des Kandidatenpeptids in dem Satz untersuchter Peptide ausgewählt (siehe,
3 und
4).
Der humane T-Zell-Stimulationsindex
für das/die
Kandidatenpeptid(e) wird aufsummiert. Für jedes Individuum wird der
humane T-Zell-Stimulationsindex für das/die Kandidatenpeptid(e)
durch die Summe der humanen T-Zell-Stimulationsindizes der verbleibenden
Peptide in dem Satz an untersuchten Peptiden geteilt, um eine Prozentzahl
für die
T-Zell-Reaktivität
zu bestimmen, wie unten gezeigt:
-
Alternativ
kann die Gegenwart von T-Zell-Epitopen in dem Kandidatenpeptid,
die von Aminosäureresten
in einem überlappenden
Peptid abhängen,
die entweder am N-Terminus
oder dem C-Terminus des Kandidatenpeptids in der Aminosäuresequenz
des Proteinantigens lokalisiert sind, aber deren Epitope nicht in
dem Kandidatenpeptid anwesend sind, durch die Berechnung der Prozentzahl
an T-Zell-Reaktivität
in dem Kandidatenpeptid unter Verwendung der folgenden Formel betrachtet
werden:
-
In
dieser Formel bezieht sich „NT-flankierendes Peptid" auf ein Peptid, das Aminosäurereste
enthält, die
mit Aminosäureresten überlappen,
die sich am N-Terminus des Kandidatenpeptids in der Aminosäuresequenz
des Proteinantigens, von dem das Peptid abgeleitet wurde, befinden; „CT-flankierendes Peptid" bezieht sich auf ein Peptid, das Aminosäurereste
enthält,
die mit Aminosäureresten überlappen,
die sich am C-Terminus des Kandidatenpeptids in der Aminosäuresequenz
des Proteinantigens, von dem das Peptid abgeleitet wurde, befinden.
In dieser Berechnung werden Stimulationsindizes für das Kandidatenpeptid,
das N-Terminus flankierende Peptid und das C-Terminus flankierende
Peptid addiert und durch die Gesamtsumme der Stimulationsindizes
für den
gesamten Satz an überlappenden
Peptiden dividiert erhalten einen Prozentsatz für T-Zell-Reaktivität für das Kandidatenpeptid.
Wird eine Kombination aus zwei oder mehr Kandidatenpeptiden ausgewählt, von
denen jedes überlappende
Aminosäurereste
enthält,
kann diese Berechnung nicht verwendet werden, um einen Prozentsatz
an T-Zell-Reaktivität
getrennt für
jedes Kandidatenpeptid zu bestimmen. Es kann jedoch ein Gesamtprozentsatz
an T-Zell-Reaktivität
für die
Kombination aus Kandidatenpeptiden erhalten werden. In dieser Situation
werden die Stimulationsindizes für
alle überlappenden
Kandidatenpeptide in die Berechnung aufgenommen.
-
Die
Werte, die für
den Prozentsatz an T-Zell-Reaktivität für das Kandidatenpeptid oder
die Kombination aus Peptiden in jedem untersuchten Individuum erhalten
werden, können
als ein Bereich von niedrigeren und höheren Werten der Ergebnisse
der oben beschriebenen Berechnungen ausgedrückt werden. Durch jede der
obigen Berechnungen wird der Prozentsatz für mindestens etwa zwanzig (20)
und vorzugsweise mindestens etwa dreißig (30) Individuen erhalten,
die auf das Proteinantigen sensibel reagieren, und es wird ein mittlerer
Prozentsatz bestimmt. Für
die Verwendung in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen weisen
das Kandidatenpeptid oder die Kombination aus Kandidatenpeptiden
die folgenden Kriterien auf: (1) das Kandidatenpeptid oder die Kombination
aus Kandidatenpeptiden hat einen mittleren Prozentsatz von mindestens
etwa 10%, vorzugsweise mindestens etwa 20%, mehr bevorzugt mindestens
etwa 30%, mehr bevorzugt mindestens etwa 40% und mehr bevorzugt
mindestens etwa 50–60% oder
mehr; und (2) in der Population von untersuchten Individuen zeigen
mindestens etwa 60%, vorzugsweise mindestens etwa 75%, und mehr
bevorzugt mindestens etwa 90–100%
positive T-Zell-Antworten (SI gleich oder größer als 2,0) als Antwort auf
das Kandidatenpeptid oder die Kombination aus Kandidatenpeptiden.
Ein Kandidatenpeptid oder eine Kombination aus Kandidatenpeptiden,
die die oben genannten Kriterien erfüllen, enthält wahrscheinlich einen ausreichenden
Prozentsatz der T-Zell-Reaktivität
auf das Hausstaubmilben-Proteinallergen, um eine Nichtempfindlichkeit der
T-Zellen oder verminderte T-Zell-Empfindlichkeit in einem wesentlichen
Anteil einer Population aus Individuen zu induzieren, die auf das
Hausstaubmilben-Allergen sensibel reagieren.
-
Als
eine erläuternde
Ausführungsform
des oben beschriebenen Algorithmus wurde ein Satz aus überlappenden
Peptiden und Kandidatenpeptiden, die von Der p I bzw. Der p II abgeleitet
wurden, hergestellt und untersucht. Es wurden sekundäre T-Zell-Kulturen,
bei denen eine Reaktion mit Der p I-Proteinallergen nachgewiesen
wurde, aus 39 auf Hausstaubmilben allergischen Subjekten gewonnen
und auf ihre Reaktivität
gegenüber
einem überlappenden
Satz an Peptiden sowie gegenüber
Kandidatenpeptiden, die von dem Der p I- und Der f I-Proteinallergen,
DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ
ID NO: 29) und DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30) abgeleitet wurden, in einem
in vitro T-Zell-Proliferationsassay, wie hierin beschrieben, analysiert.
Die Ergebnisse sind in
3 dargestellt. Der höchste Stimulationsindex
größer als
oder gleich 2,0 als Antwort auf jedes Peptid wurde für jedes
untersuchte Subjekt aufgezeichnet. Die Daten wurden anschließend mittels
der oben aufgeführten
Gleichungen analysiert. Die Ergebnisse und Berechnungen des Prozentsatzes
an T-Zell-Reaktivität
für ein
einzelnes auf Staubmilben allergisches Subjekt werden unter gezeigt,
unter Verwendung der Formeln (1) und (2). T-ZEEL-REAKTIVITÄT FÜR PATIENT
1733 PEPTID-STIMULATIONSINDEX
DPI-21.2
(SEQ ID NO: 27) | 3,6 |
DPI-3
(SEQ ID NO: 3) | 3,9 |
DPI-22.2
(SEQ ID NO: 28) | 3,1 |
DPI-12.1
(SEQ ID NO: 6) | 2,2 |
DPI-5.1
(SEQ ID NO: 7) | 3,5 |
DPI-23.31
(SEQ ID NO: 29) | 5,7 |
DPI-14
(SEQ ID NO: 9) | 2,3 |
DPI-15
(SEQ ID NO: 10) | 2,8 |
DPI-6.1
(SEQ ID NO: 11) | 2,1 |
DPI-7.1
(SEQ ID NO: 12) | 2,2 |
DPI-26.6
(SEQ ID NO: 30) | 5,0 |
DPI-9
(SEQ ID NO: 14) | 2,4 |
DPI-16
(SEQ ID NO: 15) | 2,0 |
DPI-10
(SEQ ID NO: 16) | 0 |
DPI-17
(SEQ ID NO: 17) | 0 |
SUMME
DER STIMULATIONSINDIZES | 40,8
(NENNER) |
-
%-Reaktivität von Peptid
DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30) für
Patient 1733 beträgt
-
Daher
beträgt
für diesen
Patienten der geschätzte
Bereich der T-Zell-Reaktivität
für Peptid
DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30) 12,3%–24%
der gesamten Reaktivität
des Der p I-Proteins.
-
Die
oben aufgeführte
Berechnung wird für
jedes mögliche
Kandidatenpeptid für
jeden untersuchten Patient wiederholt. In der Population von 39
untersuchten, Cry j I-allergischen
Subjekten wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
Kandidatenpeptide | Bereich
des mittleren Prozentsatzes an T-Zell-Reaktivität | Antwortfrequenz
auf mindestens ein Peptid |
DPI-21.2
(SEQ. ID. NO. 27), | | |
DFI-22.2
(SEQ. ID. NO. 28) | | |
DPI-23.31
(SEQ. ID. NO. 29), | | |
DPI-26.6
(SEQ. ID. NO. 30) | 38–67% | 82% |
-
Also
befindet sich die Kombination aus den vier Kandidatenpeptiden gut
innerhalb des gewünschten Bereichs,
in dem, in Kombination, eine ausreichende T-Zell-Reaktivität auf Gruppe
I-Proteinallergen von Der f und Der p gezeigt wird, und sie erfüllt die
erste Eigenschaft eines erfindungsgemäßen „einzigartigen" Peptids.
-
Die
gleiche Berechnung wurde für
das Gruppe II Der p-Proteinallergen untersucht. Es wurden sekundäre T-Zell-Kulturen,
bei denen eine Reaktion mit Der p I-Proteinallergen nachgewiesen
wurde, aus 30 auf Hausstaubmilben allergischen Subjekten gewonnen
und auf ihre Reaktivität
gegenüber
einem überlappenden Satz
an Peptiden sowie gegenüber
Kandidatenpeptiden, die von Der p II-, DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22.14
(SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33) abgeleitet wurden,
in einem in vitro T-Zell-Proliferationsassay,
wie hierin beschrieben, analysiert. Die Ergebnisse sind in
4 dargestellt.
Der höchste
Stimulationsindex größer als
oder gleich 2,0 als Antwort auf jedes Peptid wurde für jedes
untersuchte Subjekt aufgezeichnet. Die Daten wurden anschließend mittels
der oben aufgeführten
Gleichungen analysiert. In der Population von 30 untersuchten, gegenüber Hausstaubmilben
allergischen Subjekten wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
Kandidatenpeptide | Bereich
des mittleren Prozentsatzes an T-Zell-Reaktivität | Antwortfrequenz
auf mindestens ein Peptid |
DPII-20.9
(SEQ. ID. NO. 31), | | |
DPII-22.14
(SEQ. ID. NO. 32) | | |
DPII-25.15
(SEQ. ID. NO. 33) | 37–51% | 63% |
-
Also
befindet sich die Kombination aus den drei erfindungsgemäßen Der
p II-Kandidatenpeptiden
gut innerhalb des gewünschten
Bereichs, in dem, in Kombination, eine ausreichende T-Zell-Reaktivität auf Gruppe II-Hausstaubmilben-Proteinallergen
von Der p gezeigt wird, und sie erfüllt die erste Eigenschaft eines
erfindungsgemäßen „einzigartigen" Peptids.
-
Für die Behandlung
von Allergie gemäß den Verfahren
der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass ein Peptid, das
im Zusammenhang damit verwendet wird, nicht Immunglobulin E (IgE)
bindet oder IgE in einem beträchtlich
geringerem Ausmaß bindet
(d. h. mindestens 100fach geringere Bindung und mehr bevorzugt mindestens
1.000fach geringere Bindung) als das entsprechende Hausstaubmilben-Proteinallergen,
von dem das Peptid abgeleitet wurde, IgE bindet. Die Hauptkomplikationen
einer standardmäßigen Immuntherapie sind
IgE-vermittelte Antworten wie Anaphylaxie. Immunglobulin E ist ein
Vermittler für
anaphylaktische Reaktionen, die eine Folge der Bindung und Vernetzung
von Antigen mit IgE auf Mastzellen oder Basophilen und der Freisetzung
von Vermittlern (z. B. Histamin, Serotonin, eosinophile chemotaktische
Faktoren) in allergischen („atopischen") Patienten sind.
Daher könnte
Anaphylaxie in einem beträchtlichen
Anteil einer Population aus behandelten Individuen, die auf das
Allergen sensibel reagieren, vermieden werden, indem bei der Immuntherapie
ein Peptid oder Peptide verwendet werden, die IgE zu einem beträchtlichen
Anteil (z. B. zu mindestens 75% nicht) einer Population von auf
das Hausstaubmilben-Allergen sensibel reagierenden Individuen nicht
binden, oder wenn das Peptid IgE bindet, diese Bindung nicht zur Freisetzung
von Vermittlern aus Mastzellen oder Basophilen führt. Das Risiko von Anaphylaxie
könnte
vermindert werden, indem bei der Immuntherapie ein Peptid oder Peptide
verwendet werden, die eine verminderte IgE-Bindung aufweisen. IgE-Bindung kann,
zum Beispiel durch direkte ELISA oder Capture-ELISA untersucht werden.
Darüber
hinaus sind Peptide, die eine minimale IgE stimulierenden Aktivität haben,
für therapeutische
Wirksamkeit erwünscht.
Minimale IgE stimulierende Aktivität bezieht sich auf eine IgE-Produktion,
die geringer ist als die Menge an IgE-Produktion und/oder IL-4-Produktion,
die durch das native, betreffende Hausstaubmilben-Proteinallergen
stimuliert wird. Bindet ein Peptid IgE, ist es bevorzugt, dass eine
derartige Bindung nicht zu der Freisetzung von Vermittlern (z. B.
Histaminen) aus Mastzellen oder Basophilen führt. Um zu bestimmen, ob ein
Peptid, das IgE bindet, die Freisetzung von Vermittlern verursacht,
kann ein Histamin-Freisetzungs-Assay unter Verwendung von Standardreagenzien
und -protokollen ausgeführt
werden, die erhalten wurden, zum Beispiel von Amac, Inc. (Westbrook,
ME). Kurz gesagt wird eine gepufferte Lösung eines zu untersuchenden
Peptids mit einem gleichen Volumen von vollständigem, heparinisiertem Blut
von einem allergischen Subjekt zusammen gegeben. Nach Mischen und
Inkubieren werden die Zellen pelletiert und die Überstände werden verarbeitet und
analysiert unter Verwendung eines Radioimmunassays, um die Menge
an freigesetztem Histamin zu bestimmen. Aktuelle Experimente deuten
darauf hin, dass Kandidatenpeptide DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2
(SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO:
30), DPII-20.9 (SEQ ID 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO:
33) negative IgE-Reaktivität
oder Histaminfreisetzung aufweisen (Daten nicht gezeigt).
-
Die
zweite Eigenschaft für
ein einzigartiges Peptid ist die der „ausgezeichneten Löslichkeit", die weiter oben
als eine Löslichkeit
von mehr als 3 mg/ml bei einem pH-Wert in einem Bereich von pH 6
bis pH 8 definiert wurde. Löslichkeit
in einem physiologisch zulässigen
pH-Bereich (z. B. pH 6 bis pH 8) ist insbesondere von Bedeutung,
wenn ein Multipeptid-Therapeutikum für Injektion formuliert werden
soll.
-
Verabreichung
eines löslichen
Wirkstoffprodukts in einem physiologisch zulässigen pH-Bereich durch intravenöse oder
subkutane Injektion gewährleistet
etwa 100%ige Bioverfügbarkeit
der Wirkstoffkomponente in dem physiologischen System, in das der
Wirkstoff eingeführt
wurde. Daher ist es notwendig, dass ein für Injektion bestimmtes Wirkstoffprodukt
in einem solchen Ausmaß flüssig ist,
das eine leichte Spritzbarkeit besteht, und die aktive Komponente
sollte auch löslich
sein, wenn eine maximale therapeutische Wirkung erreicht werden
soll. Die Löslichkeit
ist auch von Nutzen bei der Zubereitung von Zusammensetzungen, die über andere
Verabreichungswege wie bei spielsweise durch orale Verabreichung
(Tablette, Aerosol, sublingual) oder in Präparaten und Formulierungen
mit verlängerter
Freisetzung verabreicht werden sollen.
-
Bei
Proteinen und Peptiden kann eine Formulierung in löslichen
Zusammensetzungen schwierig sein, da ein Peptid vielleicht nicht
in jedem gewünschten
pH-Bereich löslich
ist, oder vielleicht nur in einem engen pH-Bereich löslich ist.
Es ist insbesondere schwierig, wenn viele Peptide zusammen in eine
einzelne Multipeptid-Zubereitung formuliert werden, da jedes Peptid
in einem pH-Bereich löslich
sein kann, der nicht mit denen der anderen Peptide in der Zubereitung überlappt.
Als Folge ist es die Anforderung von „ausgezeichneter Löslichkeit", die die meiste
Flexibilität
bei der Zubereitung erfordert, insofern vielleicht beträchtliche
Modifizierungen der angestrebten Kandidatenpeptide notwendig sind,
um ein Multipeptid-Wirkstoffprodukt erfolgreich zu formulieren.
-
Einige
der erfindungsgemäßen einzigartigen
Peptide sind das Produkt von multiplen Aminosäure-Modifizierungen der ursprünglich geplanten
Kandidatenpeptidsequenz („Ausgangspeptid"), von der die modifizierten,
erfindungsgemäßen einzigartigen
Peptide ursprünglich
abgeleitet wurden. Derartige modifizierte erfindungsgemäße "einzigartige" Peptide umfassen
DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ
ID NO: NO: 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID
33), alle wie in
1 gezeigt. Zum Beispiel wurde
die Aminosäuresequenz
von DpII-22.14 (SEQ ID NO: 32) von der Proteinsequenz von Der p
II abgeleitet, indem zunächst
solche Regionen des nativen Proteins mit hoher T-Zell-Reaktivität identifiziert
wurden, wobei ein Satz an überlappenden
Peptiden verwendet wurde, der die gesamte Proteinsequenz abdeckte.
Es wurden einige Peptide gefunden, die eine hohe T-Zell-Reaktivität aufweisen,
entsprechend den drei unterschiedlichen Positionen/Regionen in dem
Protein. Eine dieser Regionen wurde durch drei benachbarte Peptide
abgedeckt, das jedes etwa 25–29
Aminosäuren
lang war und mit einer Überlappung
von 10–15 Aminosäuren, DpII-3.1 (SEQ ID NO: 20),
DpII-4 (SEQ ID NO: 21) und DpII-5 (SEQ ID NO: 22) (
2),
die alle eine hohe T-Zell-Reaktivität aufwiesen. Auf der Grundlage
dieser T-Zell-Karte wurde ein neues Peptid synthetisiert mit der
Aminosäuresequenz
QLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDGLEV (SEQ ID NO: 34), 28 Aminosäuren lang,
das die meiste Reaktivität
zeigt, die in den einzelnen Peptiden gefunden wurde (Daten nicht
gezeigt) und enthält
das gesamte DpII-4 (SEQ ID NO: 21) und Teile von DpII-3.1 (SEQ ID
NO: 20) und DpII-5 (SEQ ID NO: 22). Dieses Peptid erfüllte jedoch
nicht die Anforderung der „ausgezeichneten
Löslichkeit" von 3 mg/ml für ein erfindungsgemäßes einzigartiges
Peptid, und es erfüllt
auch nicht die Stabilitätsanforderung.
Daher wurden zwei Analoga hergestellt mit einer Addition von einem
oder zwei geladenen Resten an jedem Ende, DpII-22.2 KQLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDGLEVK
(SEQ ID NO: 35) und DpII-22.6 DKQLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDGLEVD (SEQ
ID NO: 36) und die Stabilität
verbesserte sich deutlich, aber die Löslichkeit erreicht nicht den Standard
einer „ausgezeichneten
Löslichkeit". In dem zweiten
Versuch eine Reihe von trunkierten Analoga mit bis zu fünf geladenen
Aminosäureresten,
die an die Enden addiert wurden (Tabelle 1).
DpII-22
(SEQ. ID. NO. 34) | QLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDGLEV |
DpII-22.2
(SEQ. ID. NO. 35) | KQLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDGLEVK |
DpII-22.6
(SEQ. ID. NO. 36) | DKQLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDGLEVD |
DpII-22.4
(SEQ. ID. NO. 37) | QLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDE |
DpII-22.5
(SEQ. ID. NO. 38) | DKQLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDE |
DpII-22.8
(SEQ. ID. NO. 39) | DKEQLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDE |
DpII-22.9
(SEQ. ID. NO. 40) | DKEQLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDEE |
DpII-22.12
(SEQ. ID. NO. 41) | DKQLEAVFEANQATKTAKIEIKASIDE |
DpII-22.16
(SEQ. ID. NO. 42) | DKELEAVFEANQNTKTAKIEIKASD |
DpII-22.19
(SEQ. ID. NO. 43) | DKELEAVFEANQNTKTAKIEIKAD |
DpII-22.20
(SEQ. ID. NO. 44) | DKELEAVFEANQNTKTAKIEIKAK |
DpII-22.21
(SEQ. ID. NO. 45) | DKELEAVFEANQNTKTAKIEIKD |
DpII-22.22
(SEQ. ID. NO. 46) | DKELEAVFEANQNTKTAKIEIKK |
DgII-22.26
(SEQ. ID. NO. 47) | DKELEAVFEANQNTKTAKIEIK |
DpII-22.23
(SEQ. ID. NO. 48) | DKELEAVFEANQNTKTAKIED |
DpII-22.24
(SEQ. ID. NO. 49) | DKELEAVFEANQNTKTAKIEK |
DpII-22.25
(SEQ. ID. NO. 50) | DKELEAVFEANQNTKTAKIE |
DpII-22.14
(SEQ. ID. NO. 32) | DKELEAVFEANQNTKTAKAE |
DpII-22.10
(SEQ. ID. NO. 51) | LEAVFEANQNTKTAK |
DpII-22.11
(SEQ. ID. NO. 52) | LEAVFEANQATKTAK |
DpII-22.18
(SEQ. ID. NO. 53) | DKTAKIEIKASIDGLE |
DpII-22.15
(SEQ. ID. NO. 54) | KTAKIEIKASIDGLE |
Tabelle
1
-
Von
diesen war das DpII-22.5, DKQLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDE (SEQ ID NO:
38) vielversprechend, da es die T-Zell-Reaktivität des „Ausgangs"-peptids, DPII-22, (SEQ ID NO: 34) bewahrte
und sehr löslich
war, aber es war sehr schwierig zu synthetisieren. Es stellte sich
heraus, dass diese Schwierigkeiten bei der Synthese dieser Sequenz
mit dem Austausch des hydrophoben Isoleucins durch das weniger hydrophobe Alanin
verschwanden und sich gleichzeitig die Löslichkeit um eine Größenordnung
erhöhte.
Es fand sich, dass Peptid DpII-22.14, DKELEAVFEANQNTKTAKAE (SEQ
ID NO: 32) annähernd
die gleich T-Zell-Reaktivität
wie das „Ausgangs"-peptid DpII-22 (SEQ
ID NO: 34) besaß und
auch mit mehr als 3 mg/ml bei einem pH-Wert in dem pH-Bereich von
6,0 bis 8,0 löslich
war, und dass es einfach zu synthetisieren und zu reinigen war.
Daher wurde DPII-22 (SEQ ID NO: 34) als ein „einzigartiges" Peptid ausgewählt, als
festgestellt wurde, dass es bei einem pH-Wert in dem Bereich von
6,0 bis 8,0 stabil ist. Die Entwicklung der anderen modifizierten „einzigartigen" Peptide, DpI-23.31
(SEQ ID NO: 29), DpI-26.6 (SEQ ID NO: 30) und DpII-25.15 (SEQ ID
NO: 33) folgte einem Verfahren ähnlich
dem oben für
DpII-22.14 (SEQ ID NO: 32) beschriebenen. Peptide DPII-22.14 (SEQ ID
NO: 32), DpI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DpI-26.6 (SEQ ID NO: 30) und
DpII-25.15 (SEQ ID NO: 33), alle wie in 1 gezeigt,
sind neue, erfindungsgemäße, modifizierte
Peptide.
-
Das
dritter Kriterium, das die erfindungsgemäßen einzigartigen Peptide erfüllen müssen, ist
Stabilität, insbesondere
Lösungsstabilität, in einem
physiologisch zulässigen
pH-Bereich von pH
6 bis pH 8. Es muss unter den Herstellungs- und Lagerungsbedingungen
stabil sein, und gegebenenfalls unter Bedingungen einer Rekonstituierung.
Eine Stabilitätsprüfung legt
den Zeitraum fest, für
den die Unversehrtheit, Qualität
und Reinheit des Wirkstoffprodukts in seiner endgültigen Dosierungsform
konserviert ist. Die Stabilitätsprüfung kann gleichzeitig
mit Löslichkeitsstudien
ausgeführt
werden, wie in Beispiel 3 diskutiert. Eine Zusammensetzung mit gleicher
Konzentration, die jedes der erfindungsgemäßen Kandidatenpeptide enthält, blieb
stabil (z. B. keine deutliche Zersetzung) in einer Lösung in
einem üblichen „Fenster" innerhalb des pH-Bereichs
von pH 6–pH
8 bei etwa Raumtemperatur und bei etwa 5°C für mindestens 24 Stunden (siehe, 6).
-
Daher
besitzen Kandidatenpeptide DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ
ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30),
DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15
(SEQ ID NO: 33) jede der drei geforderten „einzigartigen" Eigenschaften, die
oben dargelegt wurden, was darauf hindeutet, dass diese Kombination
aus Peptiden für
die Zubereitung als ein optimiertes therapeutisches Wirkstoffprodukt
für die
Verabreichung an Menschen zur Behandlung einer Allergie auf das
Hausstaubmilben-Allergen geeignet ist.
-
Hoch
reine, erfindungsgemäße Peptide
können
synthetisch mittels chemischer Synthese unter Verwendung von Standardtechniken
hergestellt werden. Verschiedene Verfahren zur chemischen Synthese
von Peptiden sind auf dem Fachgebiet bekannt, wie beispielsweise
Festphasensynthese, die auf kommerziell erhältlichen Peptid-Synthesizern
vollständig
oder halbautomatisiert wurde. Synthetisch hergestellte Peptide können anschließend bis
zur Homogenität
gereinigt werden (d. h. mindestens 90%, mehr bevorzugt mindestens 95%
und noch mehr bevorzugt mindestens 97% Reinheit), frei von allen
anderen Polypeptiden und Verunreinigungen unter Verwendung einer
beliebigen Anzahl an in der Literatur für Proteinreinigung bekannten
Techniken.
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Gemäß eines
Verfahrens zur Herstellung von erfindungsgemäßen, hoch reinen, homogenen
Peptiden kann ein Peptid, das durch synthetische chemische Mittel
hergestellt wurde (entweder an einen Polymerträger in einer „Festphasensynthese" oder durch konventionelle
homogene chemische Reaktionen in einer „Lösungssynthese"), durch präparative
Umkehrphasenchromatographie gereinigt werden. In diesem Verfahren
wird das synthetisch hergestellte Peptid in „roher" Form in einem geeigneten Lösungsmittel
gelöst
(typischerweise einem wässrigen
Puffer) und auf eine Trennsäule
aufgegeben (typischerweise ein auf Siliciumdioxid basierendes Umkehrphasenmedium,
zusätzlich
können
auf Polymeren oder Kohlenstoff basierende Medien verwendet werden).
Das Peptid wird aus der Säule
durch Erhöhung
der Konzentration einer organischen Komponente eluiert (typischerweise
Acetonitril oder Methanol) in einen wässrigen Puffer (typischerweise
TFA, Triethylaminphosphat, Acetat oder gleichartige Puffer). Fraktionen
des Eluats werden gesammelt und mittels geeigneter analytischer
Verfahren analysiert (typischerweise Umkehrphasen-HPLC oder KZE-Chromatographie).
Solche Fraktionen mit der geforderten Homogenität werden vereinigt. Das vorliegende
Gegenion kann durch zusätzliche
Umkehrphasen-Chromatographie in einem Salz nach Wahl oder durch
Ionenaustauscherharze ausgetauscht werden. Das Peptid kann anschließend als
sein Acetat oder ein anderes geeignetes Salz isoliert werden. Das
Peptid wird anschließend
filtriert und das Wasser entfernt (typischerweise durch Lyophilisierung),
um eine homogene Peptidzusammensetzung zu ergeben, die mindestens
90%, mehr bevorzugt mindestens 95% und noch mehr bevorzugt mindestens
97% der geforderten Peptidkomponente enthält. Gegebenenfalls, oder zusammen
mit der Umkehrphasen-HPLC wie oben beschrieben, kann eine Reinigung
durch Affinitätschromatographie,
Ionenaustausch-, Größenausschluss,
Gegenstrom- oder Normalphasen-Trennungssysteme oder jegliche Kombination
dieser Verfahren erreicht werden. Peptid können außerdem unter Verwendung von
Ultrafiltration, Rotationsverdampfung, Ausfällung, Dialyse oder anderer
gleichartiger Techniken eingeengt werden.
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Die
hoch reine, homogene Peptidzusammensetzung wird anschließend durch
jegliche der folgenden Techniken oder Kombinationen daraus charakterisiert:
a) Massenspektroskopie zur Bestimmung des Molekulargewichts, um
die Peptididentität
zu prüfen;
b) Aminosäure-Analyse,
um die Identität
des Peptids über
die Aminosäurezusammensetzung
zu prüfen;
c) Aminosäuresequenzierung
(unter Verwendung eines automatisierten Proteinsequenzers oder manuell),
um die definierte Sequenz der Aminosäurereste zu bestätigen; d) HPLC
(multiple Systeme, wenn gewünscht),
verwendet, um Peptididentität
und -Reinheit zu prüfen,
(d.h. Identifizierung von Peptidverunreinigungen); e) Wassergehalt
zur Bestimmung der Wasserkonzentration der Peptidzusammensetzungen;
f) Ionengehalt zur Bestimmung der Gegenwart von Salzen in den Peptidzusammensetzungen;
und g) restliche organische Verbindungen, um auf die Gegenwart von
restlichen organischen Reagenzien, Ausgangsmaterialien und/oder
organischen Verunreinigungen zu prüfen.
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Ein
erfindungsgemäßes Peptid
kann auch durch DNA-Rekombinationstechniken in einer Wirtszelle hergestellt
werden, die mit einer Nucleinsäuresequenz
transformiert wurde, die für
ein derartiges Peptid kodiert. Wenn durch solche Rekombinationstechniken
hergestellt, werden Wirtszellen, die mit einer für das gewünschte Peptid kodierenden Nucleinsäure transformiert
wurden, in einem für
die Zellen geeigneten Medium kultiviert und isolierte Peptide können aus
dem Zellkulturmedium, den Wirtszellen oder beiden unter Verwendung
von Techniken gereinigt werden, die auf dem Gebiet für die Reinigung
von Peptiden oder Proteinen bekannt sind, einschließlich Ionenaustauschchromatographie,
Ultrafiltration, Elektrophorese oder Immunreinigung mit Antikörpern, die
für das
gewünschte
Peptid spezifisch sind. Rekombinant hergestellte Peptide können isoliert
und bis zur Homogenität
gereinigt werden, frei von zellulärem Material, anderen Polypeptiden
oder Kulturmedium, das gemäß der oben
beschriebenen Verfahren zur synthetischen Herstellung von Peptiden
verwendet wird.
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Unter
bestimmten, eingeschränkten
Umständen
können
erfindungsgemäße Peptide
auch durch chemische oder enzymatische Spaltung eines hoch reinen
Volllängen-
oder nativen Proteins hergestellt werden, dessen Stellen für chemischen
Verdau oder enzymatische Spaltung im Voraus bestimmt wurden und
bei dem das resultierende Aufschlussprodukt reproduzierbar ist.
Peptide mit definierten Aminosäuresequenzen
können hoch
rein und frei von jeglichen anderen Polypeptide oder Verunreinigungen,
die beim enzymatischen oder chemischen Verdau vorkommen, durch ein
beliebiges der oben beschriebenen Verfahren für hoch reine und isolierte,
synthetisch oder rekombinant hergestellte Peptide isoliert werden.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch therapeutische Zusammensetzungen
und therapeutische Multipeptid-Zubereitungen, die die erfindungsgemäßen einzigartigen
Peptide enthalten. Erfindungsgemäße therapeutische
Zusammensetzungen können
eines oder mehrere der erfindungsgemäßen einzigartigen Peptide enthalten,
die gleichzeitig oder aufeinander folgend als eine einzelne Behandlungsepisode
für die
Behandlung von Allergie auf das Hausstaubmilben-Allergen in einem
Menschen oder einem anderen Säugetier
verabreicht werden können.
Ein derartiger Behandlungsplan muss nicht notwendigerweise eine
physikalische Mischung von mehr als einem erfindungsgemäßen Peptid
sein, sondern enthält
eine Kombination aus derartigen Peptiden, die gleichzeitig oder
aufeinander folgend als eine einzelne Behandlungsepisode verabreicht
werden, um die maximale therapeutische Wirkung der Zusammensetzung
der einzigartigen Peptide zu erreichen, DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27),
DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ
ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32)
und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33) gewährleisten (z. B. Löslichkeit
und Stabilität
in einem zulässigen
physiologischen pH-Bereich sowie einen Bereich an T-Zell-Reaktivität von 38–67% der
gesamten T-Zell-Reaktivität
des Gruppe I-Hausstaubmilben-Proteinallergens und eine Ansprechfrequenz
von 91% für
mindestens ein Der p I-Peptid, das in einer Population von auf Hausstaubmilben
allergischen Individuen geprüft
wurde, und gleichfalls eine T-Zell-Reaktivität von 37–51% der gesamten T-Zell-Reaktivität des Gruppe
II-Hausstaubmilben-Proteinallergens und eine Ansprechfrequenz von
63% für mindestens
ein Der p II-Peptid, das in einer Population aus auf Hausstaubmilben
allergischen Individuen geprüft
wurde).
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Erfindungsgemäße therapeutische
Zusammensetzungen enthalten ein oder mehrere Peptide DPI-21.2 (SEQ
ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29),
DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22.14
(SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33), enthalten auch ein
oder mehrere pharmazeutisch unbedenkliche Träger, wie beispielsweise Hilfsstoffe,
die mit dem/den in einer einzelnen Zusammensetzung vorkommenden
Peptid oder Peptiden verträglich
sind. Wenn die Zusammensetzung eine Multipeptid-Zubereitung ist,
muss der pharmazeutisch unbedenkliche Träger mit allen Peptiden in der
Multipeptid-Zubereitung verträglich
sein. Bevorzugte Hilfsstoffe umfassen, sind aber nicht beschränkt auf
steriles Wasser, Natriumphosphat, Mannitol oder sowohl Natriumphosphat
wie auch Mannitol und jegliche Kombination daraus. Andere geeignete
Hilfsstoffe umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Sorbit, Saccharose,
Dextrose, Lactose Dextran und PVP. Außerdem können aufgrund der Möglichkeit
einer Dimerisierung der Peptide in einer Multipeptid-Zubereitung auch
ein Mittel wie EDTA eingeschlossen sein, um Dimerisierung zu verhindern.
Alternativ kann jegliches andere Material oder Verfahren, die auf
dem Fachgebiet zur Verhinderung von Dimerisierung bekannt sind,
verwendet werden. Außerdem
können
pharmazeutisch unbedenkliche Gegenionen während der Herstellung der Multipeptid-Zubereitung
zugegeben werden. Beispiele für
pharmazeutisch unbedenkliche Gegenionen umfassen Acetat, HCl und
Citrat.
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Eine
erfindungsgemäße therapeutische
Zusammensetzung sollte steril und unter den Herstellungs-, Lagerungs-,
Vertriebs- und Verwendungsbedingungen stabil sein und sollte gegen
die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen wie beispielsweise
Bakterien und Pilzen konserviert sein. Ein bevorzugtes Mittel zur
Herstellung von erfindungsgemäßen therapeutischen
Zusammensetzungen, um die Integrität der Zusammensetzung aufrechtzuerhalten
(d. h. Vermeidung von Kontamination, verlängerte Lagerung usw.), ist
die Herstellung der Zubereitung von Peptid und pharmazeutisch unbedenklichen
Träger(n),
so dass die Zusammensetzung in der Form eines lyophilisierten Pulvers
vorliegt, das in einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger rekonstituiert
wird, wie beispielsweise sterilem Wasser, direkt vor der Verwendung.
In dem Fall von sterilen Pulvern für die Herstellung von sterilen
injizierbaren Lösungen,
sind die bevorzugten Verfahren zur Herstellung Vakuumtrocknung,
Gefriertrocknung oder Trockenschleudern, was ein Pulver mit dem
Wirkstoff plus jeglichem, zusätzlichen,
gewünschten
Bestandteil aus einer im Voraus steril-gefilterten Lösung davon
ergibt.
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Eine
bevorzugte Multipeptid-Zubereitung enthält die folgenden einzigartigen
Peptide DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31
(SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-22.14 (SEQ ID NO:
32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33) sowie Natriumphosphat und Mannitol
und kann gegebenenfalls weiterhin DPII-20.9 (SEQ ID NO: NO: 31)
enthalten. Für
diese Ausführungsform
wird EDTA zu der Zubereitung gegeben. Ein geeignetes Gegenion wie
beispielsweise Acetat kann ebenfalls während der Herstellung der Zubereitung
zugegeben werden. Die Zubereitung wird vorzugsweise in der Form
eines lyophilisierten Pulvers herstellt, das in einem physiologisch
unbedenklichen Träger
wie beispielsweise sterilem Wasser vor der Verwendung rekonstituiert
wird. Einige nichteinschränkende
Beispiele von einer erfindungsgemäßen bevorzugten Multipeptid-Zubereitungen
werden unten beschrieben. Die einzigartigen Peptide des Hausstaubmilben-Proteinallergens
werden vorzugsweise während
der Herstellung mit dem geeigneten Gegenion kombiniert, um ein Gläschen herzustellen,
das ein Pyrogen-freies und vorzugsweise lyophilisiertes Pulver der
gewünschten
Formulierung enthält:
Wirkstoff: | Der
p I-, Der f I- und Der p II-Peptide DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2
(SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO:
30), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33)
In
einer Konzentration von 0,75 mg pro Peptid. |
Inaktive
Bestandteile: | 0.05
M Natriumphosphat U.S.P.
5 Gew.-% Mannitol, U.S.P.
0.1
mg/ml Dinatrium-EDTA-Dihydrat U.S.P.
endgültiger pH-Wert 7,2–7,4 |
Verdünnungsmittel: | Steriles
Wasser für
Injektion, U.S.P. |
Optional: | Es
kann 0,75 mg DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31) zu den Wirkstoffen gegeben
werden. |
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Eine
bevorzugte Kombination aus Multipeptid-Zubereitung, die für eine gleichzeitige
oder aufeinander folgende Verabreichung als eine Einzelbehandlungsepisode
geeignet ist und in zwei getrennten, sterilen, Pyrogen-freien Gläschen in
der Form von lyophilisiertem Pulver enthalten ist, umfasst die folgenden
Zubereitungen:
Gläschen #1 | |
Wirkstoff: | Der
p I-, Der f I- and Der p II-Peptide DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31
(SEQ ID NO: 29) und DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32)
In einer Konzentration
von 0,75 mg pro Peptid. |
Inaktive Bestandteile: | 0.05
M Natriumphosphat U.S.P.
5 Gew.-% Mannitol, U.S.P.
0.1
mg/ml Dinatrium-EDTA-Dihydrat U.S.P.
endgültiger pH-Wert 7,0 |
Verdünnungsmittel: | Steriles
Wasser für
Injektion, U.S.P. |
Gläschen #2 | |
Wirkstoff: | Der
p I- und Der p II-Peptide DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DPI-26.6 (SEQ ID NO:
30), DPII 20.9 (SEQ ID NO: 31), DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33)
In
einer Konzentration von 0,75 mg pro Peptid. |
Inaktive
Bestandteile: | 0.05
M Natriumphosphat U.S.P.
5 Gew.-% Mannitol, U.S.P.
0.1
mg/ml Dinatrium-EDTA-Ddihydrat U.S.P.
endgültiger pH-Wert 6,2 |
Verdünnungsmittel: | Steriles
Wasser für
Injektion, U.S.P. |
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Die
erfindungsgemäßen Multipeptid-Zubereitungen
können
auch in der Form eines Kits bereitgestellt werden, das Anweisungen
für die
Verwendung enthält.
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Herunterregulierung
der allergischen Immunantwort auf das Hausstaubmilben-Allergen in
Menschen kann klinisch bestimmt werden, wann immer möglich (siehe
z. B., Varney et al, British Medical Journal, 302:265-269 (1990),
oder kann subjektiv bestimmt werden (d. h. der Patient fühlt sich,
als ob einige oder alle der durch die Hausstaubmilben-Allergene
hervorgerufenen Symptome gelindert wurden).
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Eine
der einzigartigen Eigenschaften von jedem einzigartigen Peptid gemäß der vorliegenden
Erfindung ist, dass jedes Peptid eine „ausgezeichnete Löslichkeit" besitzt. Daher sind
erfindungsgemäße Zusammensetzungen
und Multipeptid-Zubereitungen insbesondere geeignet für Verabreichung
durch Injektion (z. B. subkutan oder intravenös). Jedoch können optimierte
erfindungsgemäße Zusammensetzungen
und Multipeptid-Zubereitungen auf jegliche herkömmliche Weise verabreicht werden,
wobei die Löslichkeit
der Wirkstoffkomponente entweder erwünscht oder akzeptabel ist,
wie beispielsweise durch Injektion (subkutan, intravenös, usw.)
orale Verabreichung, sublingual, Inhalation, transdermale Aufbringung,
rektale Verabreichung oder jeglicher anderer Verabreichungsweg,
der auf dem Fachgebiet für
die Verabreichung von löslichen
therapeutischen Mitteln bekannt ist. Es kann wünschenswert sein, eine therapeutisch
wirksame Menge von einer oder mehreren der erfindungsgemäßen therapeutischen
Zusammensetzungen gleichzeitig oder aufeinander folgend an ein Individuum
als eine einzelne Behandlungsepisode zu verabreichen. Eine jede
solcher Zusammensetzungen für
die gleichzeitige oder aufeinander folgende Verabreichung als eine
einzelne Behandlungsepisode kann nur ein einzigartiges erfindungsgemäßes Peptid
enthalten oder kann eine erfindungsgemäße optimierte Multipeptid-Zubereitung
erhalten.
-
Für subkutane
Injektion von einer oder mehreren erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen
und Multipeptid-Zubereitungen können
vorzugsweise etwa 1 μg–3 mg und
mehr bevorzugt von etwa 20 μg–1,5 mg
und noch mehr bevorzugt etwa 50 μg–750 μg von jeder
aktiven Komponente (Peptid) pro Dosierungseinheit verabreicht werden.
Es ist besonders vorteilhaft, parenterale Zusammensetzungen in vordosierter Darreichungsform
zur Erleichterung der Verabreichung und Gleichmäßigkeit der Dosierung zu formulieren. Vordosierte
Darreichungsform wie hierin verwendet, bezieht sich auf physikalisch
einzelne Einheiten, die als einzelne Dosierungen für zu behandelnde
menschliche Subjekte geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte
Menge an aktiver Verbindung enthält,
die so berechnet wurde, dass sie die gewünschte therapeu tische Wirkung
zusammen mit dem gewünschten
pharmazeutischen Träger
erzeugt. Die Spezifikation für
die erfindungsgemäßen, neuen
vordosierten Darreichungsformen werden diktiert durch und hängen direkt
ab (a) von den einzigartigen Eigenschaften der aktiven Verbindung
und der bestimmten zu erreichenden therapeutischen Wirkung, und
(b) von den Einschränkungen,
die dem Gebiet des Vermischen einer derartigen aktiven Verbindung
für die
Behandlung von menschlichen Subjekten inhärent sind.
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Um
eine erfindungsgemäße Zusammensetzung
durch andere als parenterale Verabreichung zu verabreichen (d. h.
durch orale Verabreichung), kann es notwendig sein, die Zusammensetzung
zu beschichten mit oder die Zusammensetzung gemeinsam zu verabreichen
mit einem Material, das ihre Inaktivierung verhindert oder ihre
Absorption und Bioverfügbarkeit
erhöht.
Zum Beispiel kann eine Peptid-Zubereitung gemeinsam mit Enzyminhibitoren
oder in Liposomen verabreicht werden. Enzyminhibitoren umfassen
den Pankreas-Trypsininhibitor, Diisopropylfluorphosphat (DEP) und
Trasylol. Liposomen umfassen Wasser-in-Öl-in-Wasser-CGF-Emulsionen
sowie herkömmliche
Liposomen (Strejan et al., (1984) J. Neuroimmunol., 7:27). Wenn ein
Peptid auf geeignete Weise geschützt
ist, kann das Peptid oral verabreicht werden, zum Beispiel mit einem inerten
Verdünnungsmittel
oder einem assimilierbaren, essbaren Träger. Das Peptid und andere
Bestandteile können
auch in eine Gelatinekapsel mit harter oder weicher Hülle eingeschlossen
werden, zu Tabletten komprimiert werden oder direkt in die Diät des Individuums
eingebaut werden. Für
orale therapeutische Verabreichung kann die aktive Verbindung mit
Hilfsstoffen eingebaut werden und in der Form von einnehmbaren Tabletten,
buccalen Tabletten, Pastillen, Kapseln, Elixieren, Lösungen,
Gelen, Suspensionen, Sirups, Oblaten und dergleichen verwendet werden.
Derartige Zusammensetzungen und Präparate sollten mindestens 1
Gew.-% der aktiven Verbindung enthalten. Der Anteil der Zusammensetzung
und Präparate
kann, selbstverständlich, verändert werden
und kann in geeigneter Weise zwischen etwa 5 bis 80 Gew.-% der Einheit
betragen. Die Menge an aktiver Verbindung in derartigen therapeutisch
nützlichen
Zusammensetzungen ist dergestalt, dass eine geeignete Dosierung
erhalten wird. Außerdem
kann die aktive Verbindung in Präparate
und Zubereitungen mit verlängerter
Freisetzung oder kontrollierter Freisetzung (ständige oder gepulste Freisetzung)
eingebaut werden.
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Wirksame
Mengen der optimierten erfindungsgemäßen Wirkstoffzusammensetzungen
werden variieren gemäß Faktoren
wie beispielsweise dem Grad an Sensibilität des Individuums gegenüber dem
Antigen, dem Alter, Geschlecht und Gewicht des Individuums sowie
der Fähigkeit
des Peptids, eine Herunterregulierung der antigenspezifischen Immunantwort
in dem Individuum zu verursachen. Dosierungspläne können angepasst werden, um die
optimale therapeutische Antwort zu gewährleisten. Zum Beispiel können mehrere
geteilte Dosen über
den Verlauf von Tagen, Wochen, Monaten oder Jahren verabreicht werden,
oder die Dosis kann proportional mit jeder nachfolgenden Injektion
erhöht
oder vermindert werden, wie durch die Anforderungen der therapeutischen
Situation indiziert. In einem bevorzugten Therapieplan werden subkutane
Injektionen der therapeutischen Zusammensetzungen einmal pro Woche über 3–6 Wochen
gegeben. Die Dosierung kann für
jede Injektion konstant bleiben oder kann mit jeder nachfolgenden
Injektion erhöht
oder vermindert werden. Eine Auffrisch-Injektion kann in Intervallen
von etwa drei Monaten bis etwa einem Jahr nach der ersten Behandlung
verabreicht werden und kann nur eine einzelne Injektion beinhalten
oder kann eine weitere Reihe von Injektionen ähnlich der bei der ersten Behandlung
beinhalten.
-
Die
vorliegende Erfindung wird durch die folgenden, nichteinschränkenden
Beispiele erläutert.
-
Beispiel 1
-
Bestimmung des Anteils der gesamten Hausstaubmilben-Gruppe
I-T-Zell-Reaktivität und Patientenabdeckung der
Kombination aus einzigartigen Der p I- und Der f I-Peptiden.
-
Synthese von Überlappenden Peptiden
-
Der
p I wurde in einen Satz aus 17 überlappenden
Peptiden aufgeteilt. Überlappende
Peptide und einzigartige Der p I- und Der f I-Peptide (d. h. DPI-21.2
(SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO:
29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30)) wurden unter Verwendung von standardmäßiger Fmoc/tBoc-Synthesechemie
hergestellt und mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigt. 1 zeigt
die einzigartigen Der p I- und Der f I-Peptide und 2 zeigt
die überlappenden
Der p I-Peptide, die in diesen Studien verwendet wurden. Die Peptidbezeichnungen
sind durchweg konsistent.
-
T-Zell-Antworten auf überlappende Gruppe I-Peptide
und einzigartige Peptide
-
Periphere
mononukleare Blutzellen (PBMC) wurden durch Ficoll-Hypaque-Zentrifugation
von 60 ml heparinisiertem, peripherem Blut von Individuen mit Hausstaubmilben-Allergie, die klinische
Symptome der Milben-Allergie zeigten und deren Hauttest auf Hausstaubmilbe
positiv war, gereinigt.
-
Es
wurden 107 PBMC von jedem Patienten in 5
ml RPMI-1640, enthaltend 5% vereinigtes humanes AB-Serum and ergänzt mit
Glutamin, Penicillin, Streptomycin und HEPES-Puffer, in der Gegenwart
von 20 μg/ml
gereinigtem nativen Der p I/ml bei 37°C für 6 Tage kultiviert. Lebensfähige Zellen
wurden anschließend durch
Ficoll-Hypaque-Zentrifugation
gereinigt und für
weitere 2–3
Wochen in RPMI-1640/5% AB-Serum, enthaltend 5 Einheiten rekombinantes
humanes IL-2/ml und 5 Einheiten rekombinates humanes IL-4/ml, kultiviert. Die
ruhenden T-Zellen wurden anschließend in einem sekundären Proliferationsassay
untersucht, um die T-Zell-Antworten auf gereinigtes natives Der
p I, überlappende
Peptide und einzigartige Peptide zu bewerten. Für das Assay wurden 2 × 104 ruhende T-Zellen in 200 μl RPMI-1640/5%
AB-Serum für
3 Tage bei 37°C
in der Gegenwart von 2 × 104 mit autologem Estein-Barr-Virus transformierten
B-Zellen (20.000 Rads) oder in der Gegenwart von 5 × 104 PBMC (3500 Rads) als antigenpräsentierende
Zellen mit verschiedenen Konzentrationen an gereinigtem Der p I
oder synthetischem einzigartigem Der p I-Peptid oder überlappenden
Peptiden kultiviert. Jeder Well erhielt anschließen 1 μCi tritiummarkiertes Thymidin
für 16
Stunden. Die eingebauten Zähler
wurden auf Glasfaserfiltern gesammelt und für eine flüssige Sczintillationszählung verarbeitet.
Medium allein, das als negative Kontrolle diente, enthielt kein
Allergen oder Peptid. Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt.
Der höchste
Stimulationsindex größer als
oder gleich 2,0 als Antwort auf jedes Peptid wurde für jedes untersuchte
Subjekt aufgezeichnet. Die Daten wurden anschließend mittels der früher in der
Patentschrift beschriebenen Gleichungen analysiert.
-
Die
Kombination aus Gruppe I-Kandidatenpeptiden DPI-21.2 (SEQ ID NO:
27), DFI-22.2 (SEQ
ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29) DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30),
wies einen Bereich an T-Zell-Reaktivität von etwa 38–67% auf,
basierend auf einer Analyse von 39 Patienten, die Antwortfrequenz
von 82% stellt Reaktivität
auf mindestens eines der Kandidatenpeptide dar, was darauf hindeutet,
dass diese Kombination aus Peptiden dem ersten Kriterium für erfindungsgemäße „einzigartige" Peptide genügt, insofern
dass die Kombination aus Peptiden DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2
(SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO:
30) einen ausreichenden Anteil an der gesamten T-Zell-Reaktivität der Gruppe-I-Proteinallergenen
aus Der p und Der f in einem wesentlichen Anteil der untersuchten
Population enthält.
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Beispiel 2
-
Bestimmung des Anteils der gesamten Hausstaubmilben-Gruppe
II-T-Zell-Reaktivität und Patientenabdeckung
der Kombination aus einzigartigen Der p I-Kandidatenpeptiden.
-
Synthese von Überlappenden Peptiden
-
Der
p II wurde in einen Satz aus 9 überlappenden
Peptiden aufgeteilt Überlappende
Der p II-Peptide und einzigartige Der p II-Peptide (d.h. DPII-20.9
(SEQ ID NO: 31), DPII- 22.14
(SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33)) wurden unter Verwendung
von standardmäßiger Fmoc/tBoc-Synthesechemie
hergestellt und mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigt. 1 zeigt
die einzigartigen Der p II-Peptide und 2 zeigt
die überlappenden
Der p II-Peptide, die in diesen Studien verwendet wurden. Die Peptidbezeichnungen
sind durchweg konsistent.
-
T-Zell-Antworten auf überlappenden Gruppe II-Peptide
und einzigartigen Kandidatenpeptide
-
Es
wurden sekundäre,
gegenüber
Der p II reaktive T-Zell-Kulturen, die aus 30 auf Milben allergischen Patienten
gewonnen wurden, auf ihre Reaktivität gegenüber einem überlappenden Satz an Der p
II-Peptiden sowie gegenüber
Der p II-Kandidatenpeptiden in einem in vitro T-Zell-Proliferationsassay,
wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
Der höchste
Stimulationsindex größer als
oder gleich 2,0 als Antwort auf jedes Peptid wurde für jedes
untersuchte Subjekt aufgezeichnet. Die Daten wurden anschließend mittels
der früher
in der Patentschrift beschriebenen Gleichungen analysiert.
-
Die
Kombination aus Kandidatenpeptiden DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31), DPII-22.14
(SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33) wies einen Bereich
an T-Zell-Reaktivität von etwa
36%–51%
auf, basierend auf einer Analyse von 30 Patienten (4).
Die Antwortfrequenz auf mindestens eines der Kandidatenpeptide betrug
etwa 63%, was darauf hindeutet, dass diese Kombination aus Peptiden
dem ersten Kriterium für
erfindungsgemäße „einzigartige" Peptide genügt, insofern
dass die Kombination aus Der p II-Peptiden DPII-20.9 (SEQ ID NO:
31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33) einen ausreichenden
Anteil an der gesamten T-Zell-Reaktivität auf Der p II in einem wesentlichen
Anteil der untersuchten Population enthält.
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Beispiel 3
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Bestimmung der pH-Löslichkeits- und pH-Stabilitätsprofile
der erfindungsgemäßen Kandidatenpeptide
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1. Pufferherstellung
-
50
mM Natriumphosphat-Stammlösungen:
Stammlösung A:
0,66 g (0,05 mol) Natriumdihydrogenphosphat U.S.P. und 50 mg Dinatrium-EDTA-Dihydrat, U.S.P.
wurden in 100 ml WFI (Wasser für
Injektionszwecke) gelöst.
Die Lösung
wurde durch einen 0,2 Mikron-Filter filtriert.
Stammlösung B:
0,71 g (0,05 mol) Natriumhydrogenphosphat U.S.P. wurden in 100 ml
WFI gelöst.
Die Lösung wurde
durch einen 0,2 Mikron-Filter filtriert.
-
2. Ausgangspeptiddispersionen
-
Dispersion
A: 3,0 mg von jedem Kandidatenpeptid, DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27),
DFI-22.2 (SEQ ID
NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ ID NO:
31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33),
wurden getrennt ausgewogen und in getrennte 1,5 ml Eppendoff-Vials
mit 600 μl
Stammlösung
A gegeben. Die Zusammensetzung wurde für 5 Sekunden geschüttelt, um
gut zu durchmischen.
-
Dispersion
B: 3,0 mg von jedem Kandidatenpeptid, DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27),
DFI-22.2 (SEQ ID
NO: 28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ ID NO:
31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33),
wurden getrennt ausgewogen und in getrennte 1,5 ml Eppendoff-Vials
mit 600 μl
Stammlösung
B gegeben. Die Mischung wurde für
5 Sekunden geschüttelt,
um gut zu durchmischen.
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Dispersionen
A und B wurde für
2 Minuten für
eine gute Homogenität
mit Ultraschall behandelt. Ein kleines Volumen wurde aus jeder Dispersion
in ein markiertes Eppendoff-Vial
pipettiert, gemäß dem folgenden Volumenverhältnis:
Gläschen-Nr. | Suspension
A (μ1) | Suspension
B (μl) | Gesamtvolumen (μl) | Geschätzter endgültiger pH-Wert |
1 | 100 | 0 | 100 | 5.2 |
2 | 80 | 20 | 100 | 6.2 |
3 | 60 | 40 | 100 | 6.6 |
4 | 40 | 60 | 100 | 6.8 |
5 | 20 | 80 | 100 | 7.1 |
6 | 0 | 100 | 100 | 8.0 |
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Die
resultierenden Lösungen/Suspensionen
wurden im Dunkeln bei etwa 22°C ± 2 für 24 Stunden ohne
Rühren
gelagert. Die Lösungen
wurden filtriert und die Filtrate wurden auf pH-Wert und Peptidkonzentration
analysiert.
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Die
Konzentration der filtrierten Peptidlösungen wurden mittels HPLC-Analyse
bestimmt. In diesem Experiment wurde die Löslichkeit des Peptids bei jedem
pH-Wert definiert als die Menge an Peptid, in nach Filtration durch
einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,2 um in Lösung verblieb.
Das Ausmaß der
Zersetzung der Peptide wurde abgeschätzt, indem der Anteil an gesamter
Zersetzungsprodukt-Peakfläche über die
gesamten Peakfläche
berechnet wurde.
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Die
pH-Werte bezogen auf die Löslichkeitswerte
wurden aufgetragen und sind in 5 für das jeweilige
Peptid gezeigt. Wie in der Löslichkeitskurve
für jedes
Peptid gezeigt, wie in 5 dargestellt, sind die Peptide
DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31 (SEQ
ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ ID NO: 31),
DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33) jeweils
zu mehr als 3 mg/ml bei einem pH-Wert in dem pH-Bereich von pH 6
bis pH 8 löslich.
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Die
pH-Stabilitätsprofile
für jedes
Peptid DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO: 28), DPI-23.31
(SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9 (SEQ ID NO:
31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO: 33) in
gleicher Konzentrationskombination bei 3,2 und 1 mg/ml pro Peptid und
doppelt hergestellt, wie oben beschrieben, mit einem Satz, der bei
etwa 5°C
für 24
Stunden gelagert wurde und einen Satz, der bei etwa 22°C ± 2 für 24 Stunden
gelagert wurde, wurden berechnet und als eine Funktion des Anteils
an der gesamten Zersetzungsprodukt-Peakfläche (6) tabelliert.
Wie aus den Daten in 6 ersichtlich, war der Anteil
an Peptidzersetzung bei jeder Konzentration für Peptide geringer, die bei
etwa 5°C für 24 Stunden
gelagert wurden, verglichen mit Peptiden, die bei 22°C ± 2 für 24 Stunden
gelagert wurden, über
den kritischen pH-Bereich von pH 6,0 bis pH 8,0. Es wurde jedoch
eine akzeptable Lösungsstabilität für alle Peptide
in einem gemeinsamen „Fenster" innerhalb des pH-Bereichs von pH 6
bis pH 8 bei beiden Temperaturen nachgewiesen.
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Daher
wurde für
jedes der Peptide DPI-21.2 (SEQ ID NO: 27), DFI-22.2 (SEQ ID NO:
28), DPI-23.31 (SEQ ID NO: 29), DPI-26.6 (SEQ ID NO: 30), DPII-20.9
(SEQ ID 31), DPII-22.14 (SEQ ID NO: 32) und DPII-25.15 (SEQ ID NO:
33) nachgewiesen, dass sie die geeignete Löslichkeit und Stabilität besitzen,
die für ein
erfindungsgemäßes einzigartiges
Peptid erforderlich sind. SEQUENZPROTOKOLL