DE69532469T2

DE69532469T2 - Adhäsion inhibierender Vaccinium Extrakt

Info

Publication number: DE69532469T2
Application number: DE69532469T
Authority: DE
Inventors: Edward B. Walker; Richard A. Mickelsen; Jennifer N. Mickelsen
Original assignee: JLB Inc Oqden; JLB Inc
Current assignee: JLB Inc Oqden; JLB Inc
Priority date: 1994-03-25
Filing date: 1995-03-24
Publication date: 2004-11-04
Anticipated expiration: 2015-03-25
Also published as: US5474774A; EP0752871A1; AU2272695A; KR970701556A; EP0752871A4; EP0752871B1; BR9507188A; JPH09510972A; AU708657B2; KR100343486B1; CN1144485A; ATE258059T1; WO1995026197A1; CA2186377A1; NZ284192A; MX9604307A; CN1152693C; DE69532469D1

Description

Fachgebiet: Die Erfindung betrifft Pflanzenextrakte der Vaccinium-Arten mit therapeutischen und anderen Verwendungen.
Hintergrund: Viele Menschen betrachten Moosbeersaft und dessen Derivate als nutzbringend für die Gesundheit, und Produkte, die aus Moosbeeren hergestellte Pulver oder Moosbeersaft einschließen, sind im Handel erhältlich. Ärzte empfehlen Moosbeerprodukte oft Patienten, die an Harnwegsinfektionen leiden. Die meisten erhältlichen Präparate, sowohl rohe Moosbeeren als auch typische Moosbeersaftprodukte, haben jedoch einen relativ hohen Säuregehalt. Dieser Säuregehalt kann Magenverstimmung hervorrufen und einen sauren Geschmack bewirken, welcher für viele Menschen unangenehm ist. Folglich besteht ein Bedarf an Moosbeerextrakt, der die aktive Fraktion von Moosbeeren einschließt, die für ihre wahrgenommenen vorteilhaften Wirkungen verantwortlich ist. Frühere Versuche auf diesem Gebiet sind durch DE 34 27 014 A (Dr. med. Hans Peter Moser) und A. E. Sobota "Inhibition of Bacterial Adherence by Cranberry Juice: Potential use for the Treatment of Urinary Tract Infections", The Journal of Urology, Mai 1984, Vol. 131, No. 5, S. 1013–1016, offenbart.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfindung schließt Extrakte von Vaccinium wie beansprucht ein. Diese Extrakte können verwendet werden, um in die mikrobielle Anhaftung an eine Oberfläche wie ein Körpergewebe einzugreifen. Derartige Körpergewebe schließen mit dem Mund in Verbindung stehende Gewebe, wie Zahnfleisch, Zahn- und Mundhöhlen-Schleimhautgewebe, Rachengewebe; genitale Gewebe und zervikale Oberflächengewebe ein. Die Erfindung schließt daher die Verwendung dieser Vaccinium-Extrakte zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung verschiedener Leiden wie z. B. Harnwegsinfektionen ein.
Die Erfindung schließt außerdem unterschiedliche Verfahren, wie beansprucht, zum Herstellen dieser Extrakte ein.
Wenn der Extrakt durch Umkehrphasen-HPLC auf einer lipophilen C18-Säule analysiert wird, werden charakteristische Sets von Elutionspeaks der Verbindung, absorbierend bei 230 Nanometer ("nm"), 280 nm und 360 nm, beobachtet. Wenn einer weiteren Reinigung ausgesetzt, wird festgestellt, dass einer der bei 280 nm absorbierenden Peaks das exemplarische Procyanidin enthält. Die Flavonolglucoside werden aus den bei 360 nm absorbierenden Elutionspeaks rein dargestellt.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird der Extrakt um mindestens das etwa 500- bis 1500fache der bakteriellen Anti-Anhaftungswirkung, im Vergleich zu Säften, die zu 100% aus dem Pflanzenmaterial abgeleitet sind, angereichert. Der Extrakt ist auf einen ähnlichen Grad bei der Konzentration an Flavonoid und anderen Polyphenolverbindungen, nachgewiesen durch spektroskopische Verfahren, angereichert.
Der Extrakt hat sehr wenig Säure und Einfachzucker, mit einem Benzoesäuregehalt von typischerweise weniger als etwa 0,01 Milligramm pro Gramm Trockenpulver und im Wesentlichen nicht nachweisbaren Mengen an freien monomeren und dimeren Zuckern. Der Extrakt wird aus Moosbeeren (V. macrocarpon und Varianten), V. myrtillus (Heidelbeere), V. oxycoccus (Europäische Moosbeere) oder V. corymbosum (Heidelbeere) hergestellt.
Der Extrakt hat einen stark verringerten Gehalt sowohl an Säuren als auch an Zucker und ist ein Nahrungsergänzungsmittel, um Moosbeeren und Moosbeersaft zu ersetzen. Der geringe Zucker- und Säuregehalt machen den Extrakt äußerst geeignet für orale Hygieneprodukte und weiter nützlich für jene, die die Vorteile eines Moosbeerextraktprodukts für die Gesundheit suchen.
Die Erfindung schließt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines Extrakts mit den vorstehend erwähnten Eigenschaften ein. Dieser Extrakt kann zur Hemmung des Anhaftens von Bakterien an Oberflächen verwendet werden.
Ein Verfahren zur Herstellung des Extrakts schließt Herstellen eines Ausgangsextrakts aus Pflanzen oder Pflanzenteilen von Arten, ausgewählt aus der Gattung Vaccinium, wobei dieser Ausgangsextrakt geladene und polare Verbindungen und die aktive Fraktion beinhaltet; Einengen des Extrakts auf ein kleineres Volumen und Anreichern des Extrakts an der aktiven Fraktion und an Polyphenol- und Flavonoidverbindungen im Allgemeinen ein. Das Verfahren schließt Entfernen der meisten freien monomeren und dimeren Zucker aus dem Extrakt; Entfernen des größten Teils der Benzoesäure aus dem Extrakt und Entfernen monomerer Anthocyanine ein. Verfahren werden für das Ausführen jedes der angedeuteten Schritte mit Chromatographie oder mit Ausfällen und der Schritte der Phasenextraktion beschrieben. In einer Ausführungsform schließt das Verfahren zusätzlich einen Schritt der Mannose-Affinitätschromatographie ein, welche Verbindungen selektiert, die um die Bindung an ein mannoseaffines Substrat konkurrieren können.
Die Erfindung umfasst Zusammensetzungen, die hergestellt werden durch erstes Extrahieren aktiver Verbindungen aus Pflanzenmaterialien mit Wasser oder Lösungsmitteln wie, aber nicht darauf beschränkt, Alkoholen, Aceton, Acetonitril oder Ethylacetat oder mischbaren Gemischen dieser Lösungsmittel, wobei Wasser oder MeOH/Wasser- oder Aceton/Wasser-Gemische bevorzugt werden, wobei eine Pulpe oder ein Rückstand zurückbleibt, die/der von der Anti-Anhaftungsfraktion wesentlich entleert ist. Alternativ können die Pflanzenmaterialien mit relativ unpolaren organischen Lösungsmitteln wie, aber nicht darauf beschränkt, Hexan, Heptan, Cyclohexan, Methylenchlorid, Chloroform oder Alkoholen von großem Molekulargewicht, die mehr als 8 Kohlenstoffatome enthalten, und dergleichen extrahiert werden. Eine derartige Behandlung extrahiert inaktive Materialien, wobei eine Pulpe oder ein Rückstand mit erhöhten Konzentrationen an aktiven Stoffen zurückbleibt. Diese Pulpe oder dieser Rückstand kann weiter behandelt werden durch Extraktion mit polareren Lösungsmitteln wie, aber nicht darauf beschränkt, Wasser, Alkoholen mit weniger als 8 Kohlenstoffatomen, Aceton, Acetonitril, Ethylacetat oder mischbaren Gemischen dieser Lösungsmittel, um die aktive Fraktion weiter anzureichern.
Das Anti-Anhaftungsvermögen des Extrakts ist auf einigen Gebieten nützlich. Beispielsweise kann die Reinigung von Ausrüstung der industriellen Fermentati on, medizinischer und dentaler Instrumente, von Laborkulturgefäßen und dergleichen mit dem Extrakt vollzogen werden. Der Extrakt kann außerdem beim Hemmen des Anhaltens von Bakterien an chirurgische Implantate, Zahnoberflächen und orale Zellarten, vorgefunden im Mund, und an Zellen im Harntrakt von Menschen und/oder Tieren nützlich sein.
Ein Verfahren zum Hemmen des Anhaltens von Bakterien schließt die Schritte des Bereitstellens eines Extrakts wie beschrieben und des Aufbringens des Extrakts in einem geeigneten Medium auf eine Oberfläche ein, von der man annimmt, dass darauf Bakterien wie E. coli anhaften, um die Bakterien von der/den Oberfläche(n) abzulösen. Das Verfahren ist nützlich, um das Anhaften von Bakterien an derartige Oberflächen wie Zähne, andere an Zähne anhaftende Bakterien, humane orale Epithelzellen und humane Epithelzellen des Harntraktes zu hemmen; und Zahnimplantate, Wannen der bakteriellen Fermentation und dergleichen zu reinigen.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 ist ein Flussdiagramm zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Extrakts.
2 ist ein Infrarot("IR")absorptionsspektrum (KBr fest) des Extrakts.
3 ist ein Absorptionsspektrum Ultraviolett("UV")/sichtbares Licht des in Methanol gelösten Extrakts.
4 ist ein Absorptionsspektrum UV/sichtbares Licht des in Wasser gelösten Extrakts.
5A–5B stellen eine Vergleichsanalyse eines Hochdruckflüssigchromatogramms des Extrakts durch Absorption bei Wellenlängen von 230 nm, 280 nm, 360 nm und 512 nm dar.
6A–6B sind Diagramme, die eine Doppelspektralanalyse und Analyse der bei 360 nm absorbierenden Elutionspeaks eines Hochdruckflüssigchromatogramms des Extrakts darstellen.
7A–7F sind Diagramme, die die kompletten Spektren UV/sichtbares Licht der ausgewählten Fraktionen der Hochdruckflüssigchromatographie ("HPLC") darstellen, die von der Probe erhalten wurden, deren Chromatogramm in 5A–5B gezeigt ist.
8 stellt ein Chromatogramm eines Extrakts des ersten Schrittes von zerdrückten Moosbeeren, analysiert bei mehreren Wellenlängen, dar.
9 stellt ein Chromatogramm des Extrakts, das mit einem anderen Elutionsgradienten als dem der Chromatogramme von 5A–5B und 6A–6B erhalten wurde, dar.
10 ist ein Flussdiagramm, das die Schritte eines alternativen Verfahrens zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Extrakts darstellt.
11A–11F sind HPLC-Chromatogramme des Produkts von ausgewählten Schritten in dem erfindungsgemäßen Verfahren.
12 ist ein Chromatogramm eines Produkts von 10, das das Auffangen sequenzieller Fraktionen zur Untersuchung der Wirkung anzeigt.
13 ist ein Flussdiagramm eines alternativen Verfahrens der Extraktherstellung.
Bestes Verfahren der Erfindung
Ein Extrakt aus einer Art der Gattung Vaccinium, welcher an einer aktiven Fraktion hoch angereichert ist, mit der Wirkung, das Anhaften bestimmter Bakterienar ten an verschiedene Substrate zu hemmen, ist außerdem in dem Gehalt an Flavonoiden und Polyphenolen hoch angereichert. Der Extrakt kann in pulverisierter Form oder gelöst in einem geeigneten Lösungsmittel vorliegen. Die hierin beschriebene pulverisierte Form ist ein rötlichbraunes Pulver mit einer Dichte von etwa 0,43 ! 0,03 g/cm³ und anderen wie hierin beschriebenen Eigenschaften. Zur Einfachheit und Klarheit wird der Extrakt nachstehend als der "angereicherte Extrakt" und, wenn Bezug auf einen Extrakt, der aus einer speziellen Art wie Moosbeeren hergestellt ist, genommen wird, als der "Moosbeerextrakt" bezeichnet.
A. Verfahren
Ein Extrakt mit den hierin beschriebenen charakteristischen Merkmalen des angereicherten Extrakts kann durch die in 1 veranschaulichten Schritte hergestellt werden. Bis auf die Endextraktion mit unpolarem Lösungsmittel, welche Anthocyanine selektiv entfernt, ist dieses Verfahren ähnlich einem zum Extrahieren von Anthocyaninen aus Pflanzenmaterialien verwendeten Standardverfahren (siehe z. B. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, §§ 22.092 bis 22.095 f., S. 424–425 (1984); außerdem Fuleki und Francis, "Purification of Cranberry Anthocyanins", J. Food Science 1968, 33: 266–274). Anthocyanine sind Flavonoidverbindungen, die eng verwandt und oft coisoliert mit Polyphenolen sind. Von Moosbeeren abgeleitete Anthocyanine, isoliert durch die vorstehend beschriebenen Verfahren, hemmten jedoch nicht wesentlich das bakterielle Anhaften an Oberflächen. Zudem weist der Moosbeerextrakt, welcher um etwa das 1000fache der Anhaftungshemmungswirkung angereichert ist, geringe oder keine Mengen an Anthocyaninen auf. Anthocyanine zeigen in charakteristischer Weise starke Absorption bei 512 nm Licht. Aus den Chromatogrammen von 5A und 5B ist ersichtlich, dass die Mengen an Anthocyaninen in dem Extrakt viel geringer als die Mengen der bei etwa 360 nm absorbierenden Polyphenolkomponenten waren.
Das in 1 dargestellte Verfahren entfernt im Wesentlichen auch alle freien Einfachzucker und den größten Teil der Benzoesäure aus dem angereicherten Extrakt. Es sind jedoch weitere Verfahren zum Anreichern und Reindarstellen von Polyphenolen und verwandten Verbindungen wie Flavonoiden, Anthocyaninen und Catecholen aus Moosbeeren und anderen Pflanzenmaterialien bekannt (siehe z. B. Puski und Francis, "Flavonol Glycosides in Cranberries", J. Food Science 1967, 32: 527–530; Fuleki und Francis, "Quantitative Methods for Anthocyanins: Purification of Cranberry Anthocyanins", J. Food Science 1968, 33: 266–274; P. L. Wang et al., "Isolation and Characterization of Polyphenolic Compounds in Cranberries", J. Food Science 1978, 43: 1402–1404). Diese anderen Verfahren können ebenfalls einen an der Anti-Anhaftungswirkung angereicherten Extrakt herstellen, der aber größere oder geringere Mengen peripherer Stoffe wie der vorstehend erwähnten Zucker, Benzoesäure und Anthocyanine aufweist. Ein Verfahren zum Herstellen eines angereicherten Extrakts ist wie folgt. Zuerst werden polare und geladene Verbindungen, die Anthocyanine und andere Flavonoid- und Polyphenolverbindungen einschließen, aus ausgewähltem Pflanzenmaterial von Pflanzen der Gattung Vaccinium extrahiert (Schritt 100). Das ausgewählte Pflanzenmaterial sind bevorzugt Beeren oder Früchte (z. B. Moosbeeren).
Es wurde außerdem festgestellt, dass anstelle von frischen oder gefrorenen Beeren ein weiteres nützliches Ausgangsmaterial eine wässrige Lösung eines pulverisierten Moosbeerprodukts ist (im Handel erhältlich unter der Marke OCEAN SPRAY). Diese Lösung kann statt des angesäuerten Alkohol-Wasser-Extrakts aus ganzen Beeren verwendet werden (Schritte 100–102 von 1). Man ist der Überzeugung, dass das Moosbeerpulver durch Sprühtrocknung eines wässrigen Extrakts aus dem rohen Moosbeermaterial erhalten werden kann. Eine Lösung von 10 bis 20 Gew.-% pulverisierten Moosbeeren ist ein Ausgangsmaterial, das gute Ergebnisse liefert. Höhere Konzentrationen dieses Pulvers sind weniger erwünscht. In einem Verfahren, das mit solch einer Moosbeerlösung beginnt, werden die Schritte 100 und 102 der Extraktion von 1 eliminiert.
Schritt 100 beinhaltet Zerdrücken des Pflanzenmaterials, Mischen des Materials mit einem großen Volumen angesäuerten Alkohols und gründliches Rühren des Gemisches. Der angesäuerte Alkohol umfasst einen ziemlich polaren Alkohol und Wasser in etwa gleichen Anteilen, mit einer geeigneten Säure in einer Menge von etwa 1 bis etwa 10 Vol.-%. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Anteile 10 : 1 : 10 Ethanol : Essigsäure : Wasser. Geeignete Alkohole schließen auch Methanol ("MeOH"), Ethanol ("EtOH") und Propanol ein, und geeignete Säuren schließen Essigsäure ("HOAc"), Salzsäure ("HCl") und Phosphorsäure ("H₃PO₄") ein. Der feste Rückstand wird vom flüssigen Anteil abgetrennt, und der Rückstand wird verworfen.
Schritt 100 stellt so einen flüssigen Extrakt her, der hauptsächlich polare und/oder geladene Verbindungen enthält, die die aktive Fraktion einschließen, mit einem festen Rückstand aus Pflanzenmaterialresten, die weitgehend unpolare Verbindungen enthalten.
Der flüssige Extrakt wird dann auf etwa 4–6% des Ausgangsvolumens des Extrakts durch Entfernen eines erheblichen Teils des Alkohols eingeengt (Schritt 102). Bevorzugt wird der Extrakt auf etwa 1–5% des Ausgangsvolumens des flüssigen Extrakts eingedampft, und anschließend wird Wasser zugesetzt, um ihn bis auf 4–6% des Ausgangsvolumens zu bringen. Ein konzentrierter flüssiger Extrakt ergibt sich.
In Schritt 104 werden monomere und dimere Zucker im Wesentlichen aus dem konzentrierten Extrakt entfernt. Beispielsweise wird ein Metallacetat oder -sulfat zu dem konzentrierten flüssigen Extrakt hinzugegeben, welches einen Feststoff ausfällt, wobei die Einfachzucker in Lösung verbleiben. Das Präzipitat schließt Komplexe der aktiven Fraktion mit dem Metall ein. Schritt 104 kann durch Zusetzen einer genügenden Menge der Metallverbindung zu dem Extrakt (eine Konzentration von etwa 1- bis 1,1-molar), gefolgt durch Zugabe von etwa 0,4 Volumina einer flüchtigen anorganischen Base zu dem konzentrierten Extrakt, unter innigem Vermischen, ausgeführt werden. Die anorganische Base ist vorzugsweise eine ziemlich starke (z. B. NH₄OH). Das feste Präzipitat bildet sich ziemlich schnell nach Zusetzen der Base.
Wenn die Verwendung einer Bleiverbindung (z. B. Bleiacetat) als Metallsalz des Schrittes 104 unerwünscht ist, können andere Metallsalze verwendet werden, z. B. Acetate von Zink, Magnesium, Nickel, Barium und Calcium, Cobalt oder Natrium, oder Zinksulfat, Zinkacetat, Magnesiumacetat und Zinksulfat werden bevorzugt. Nickel-, Barium- und Calciumacetat bewirkten eine Anreicherung von 60–80 im Verhältnis zu der mit Zinkacetat (als 100% genommen) erzielten, während Natriumacetat und Cobaltacetat relative Ausbeuten von nur 20–40% ergaben.
Die ausgefällten Feststoffe können mit einer großen Menge eines polaren Alkohols, wie 80% EtOH in Wasser, gewaschen werden, um überschüssiges Salz und geringe Mengen monomerer und dimerer Zucker zu entfernen (Schritt 106). EtOH kann durch MeOH oder Propanol ersetzt werden.
Die Feststoffe werden dann mit n-Butanol und konzentrierter HCl, in einem Verhältnis von etwa 6 : 1, vermischt (Schritt 108). Das säurehaltige n-Butanol entfernt das Metallion und macht die aktive Fraktion löslich, während die HCl vermutlich die relative Polarität der aktiven Komponenten verändert, um diese dadurch in n-Butanol löslich zu machen. Obwohl n-Butanol zur Zeit bevorzugt wird, können andere mittelpolare Lösungsmittel (z. B. i-Butanol, t-Butanol, Pentanol oder Hexanol) verwendet werden. Eine flüssige Alkoholphase und ein Pellet, das hauptsächlich Metallchlorid umfasst, ergeben sich. Das Pellet wird verworfen (Schritt 109).
Das Butanol wird anschließend aus der flüssigen Phase des Schrittes 108 durch Extraktion mit einem unpolaren organischen Lösungsmittel wie Petrolether entfernt (Schritt 110). Etwa drei bis zehn Volumina des organischen Lösungsmittels werden der flüssigen Alkoholphase zugesetzt und kräftig vermischt, dann stehengelassen, um die Trennung in eine erste hydrophobe organische Phase, die Petrolether und Butanol umfasst, und eine erste wässrige Phase, welche die aktive Fraktion enthält, zuzulassen. Die erste wässrige Phase, welche im Allgemeinen orangerot bis rotbraun in der Färbung ist (vermutlich aufgrund des Vorhandenseins von Anthocyaninen), wird von der organischen Schicht abgetrennt und mit etwa 4 Volumina Wasser verdünnt (Schritt 112).
Die erste organische Phase kann anschließend mit Wasser (1/20-Volumen) rückextrahiert werden, bis die rote Färbung aus der ersten organischen Phase verschwunden ist. Die wässrigen Schichten aus den Rückextraktionen können dann mit der wässrigen Phase des Schrittes 110, vor dem Verdünnungsschritt 112, vereinigt werden.
Nach Verdünnen wird die erste wässrige Phase dann weiter mit einem mittelpolaren organischen Lösungsmittel wie Ethylacetat ("EtAc") extrahiert (Schritt 114), um eine zweite organische Phase, die die aktive Fraktion enthält, und eine zweite wässrige Phase, in welcher ein wesentlicher Anteil der Anthocyanine verbleibt, herzustellen. Die erste wässrige Phase wird bevorzugt dreimal sequenziell mit etwa einem gleichen Volumen an EtAc extrahiert, und die drei EtAc-Phasen werden vereinigt. Der Extraktionsschritt 114 kann alternativ als zwei sequenzielle Extraktionen durchgeführt werden, die erste mit einem gleichen Volumen an Diethylether ("Et₂O") und die zweite mit einem gleichen Volumen an Ethylacetat.
Bei dem in 1 dargestellten Verfahren wurde festgestellt, dass in dem Schritt der EtAc-Extraktion (Schritt 114) eine wesentlich höhere Ausbeute, sowohl bezüglich der Masse als auch bezüglich der Wirkungsmenge pro Masseneinheit, erhalten wird, wenn die Extraktion unter sauren Bedingungen (z. B. pH < etwa 2) durchgeführt wird. Das Ansäuern kann durch Zusatz von HCl oder einer anderen geeigneten Säure vollzogen werden.
Dem Extraktionsschritt 114 folgend, wird auf jeden Fall die zweite organische Phase von der zweiten wässrigen Phase abgetrennt und eingeengt, wodurch eine Paste oder ein Pulver zurückbleibt (in einem Beispiel ein Pulver, das eine im Allgemeinen orange Färbung und eine Dichte von etwa 0,43 g/cm³ aufweist, mit einer Löslichkeit in Wasser von etwa 8,5 g/ml). Dieses Produkt wird, der Einfachheit halber, als "mit Flavonoid angereicherter Extrakt" bezeichnet werden, was mit den Spektraldaten übereinstimmt, die die Anreicherung von Flavonoid enthaltenden Verbindungen anzeigen. Der Begriff soll jedoch die aktive Fraktion des Extrakts nicht auf Flavonoide oder dergleichen begrenzen. Die Anthocyanine werden im Wesentlichen in der zweiten wässrigen Phase der Extraktion 114 selektiv zurückgehalten, obwohl einige in der zweiten organischen Phase verbleiben. Die zweite wässrige Phase weist jedoch eine erheblich geringere Anti-Anhaftungswirkung als die zweite organische Phase auf.
Der durch dieses Verfahren hergestellte Extrakt ist etwa 1000fach an einer aktiven Fraktion angereichert, was das Anhaften von Bakterien, einschließlich E. coli und P. aeruginosa, an Säugetierzellen und an bestimmte Oberflächen hemmt. Es gibt kein nachweisbares Protein und wenige oder keine freien monomeren und dimeren Zucker in dem angereicherten Extrakt. Der Kalorienwert des Extrakts beträgt im Allgemeinen weniger als 4 Kalorien pro Gramm. Außerdem ist der Säuregehalt des angereicherten Extrakts, insbesondere der Benzoesäuregehalt, erheblich geringer als der von Vaccinium-Beeren und vielen anderen Moosbeerextrakt- oder -pulverprodukten.
Eine Auswahl von Verfahren kann verwendet werden, um einen wässrigen Vaccinium-Ausgangsextrakt zu erhalten, aus welchem die Anti-Anhaftungswirkung erzielt werden kann. Tabelle VIII beeinhaltet einen Vergleich der Wirkung, die unter Verwendung einer Auswahl von Extraktionsverfahren erhalten wird.
Ein weiteres Verfahren ist in 10 dargestellt. Dieses Verfahren beinhaltet die Behandlung des wässrigen Ausgangsextrakts weitgehend durch chromatographische Trennungsschritte anstelle von Ausfällungen, Phasentrennungen usw. Diese Ausführungsform ist günstig und reduziert die Verwendung von organischen Lösungsmitteln. Die chromatographische Ausführungsform ist jedoch trotzdem auf die grundlegenden Schritte des Anreicherns von geladenen und polaren Verbindungen, des Entfernens von monomeren und dimeren Zuckern, des Entfernens von Benzoesäure und anderen organischen Säuren und des Entfernens von Anthocyaninen gerichtet, und diese Schritte könnten durch Ersetzen der geeigneten, vorstehend unter Bezugnahme auf 1 beschriebenen Schritte vollzogen werden. Das heißt, eine "gemischte" Ausführungsform, die bestimmte Schritte aus der Ausführungsform von 1 und einige aus der Ausführungsform von 10 in sich vereinigt, kann ebenfalls den gewünschten Extrakt herstellen.
In der Ausführungsform von 10 wird beispielsweise die Entfernung von Einfachzuckern und Benzoesäure (Schritt 1000) aus dem Extrakt (z. B. Schritte 100, 108, 112 von 1) durch Umkehrphasen-Affinitätschromatographie auf einer lipophilen Säule, wie der C18-Säule, welche auch für die HPLC-Analyse des Extrakts (Schritt 1000) verwendet wird, vollzogen.
Die chromatographische Ausführungsform kann wünschenswerterweise einen weiteren Schritt der selektiven Abtrennung von Verbindungen, die mit Mannose um die Bindung an ein mannoseaffines Substrat konkurrieren, einschließen. Dieser Schritt wird realisiert, indem der Extrakt der Affinitätschromatographie auf einem Mannose bindenden Substrat, das an einen Träger gebunden ist, unterworfen wird. In den vorliegenden Arbeitsbeispielen wird eine Säule mit Concanavalin A (abgekürzt: ConA) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) verwendet.
Es ist bekannt, dass ConA Mannose bindet, und Mannose bindet an Typ-1-Pili und greift dadurch in die pilivermittelte Anhaftung von Typ-1-Pili ein. Beim Schritt der ConA-Affinitätschromatographie wird der Extrakt über die Säule geleitet, um zu bewirken, dass selektierte Komponenten an das ConA binden, und nicht an ConA bindende Verbindungen aus der Säule gewaschen werden. Eine Lösung, die einen ausreichenden Überschuss an Mannose oder Mannosederivaten enthält, wird dann verwendet, um die selektierten Verbindungen durch Konkurrenzreaktion aus der Säule zu eluieren.
Andere Mannose bindende Mittel könnten ebenso für eine Trennung mit Mannose-Affinitätschromatographie verwendet werden. Eine alternative Ausführungsform beinhaltet das Isolieren der Pili und/oder des Mannose bindenden Bereichs der Pili und Verwenden dieser anstelle von ConA für die Affinitätschromatographie. ConA-konjugierte Träger sind aber im Handel erhältlich und daher günstig.
Die Mannose-Affinitätschromatographie kann durchgeführt werden, nachdem der Extrakt zum Teil durch andere Schritte gereinigt wurde. Beispielsweise sollte der Extrakt bereits frei von Einfachzuckern sein, die an ConA binden und dadurch in die Bindung der gewünschten Polyphenol- und Flavonoidverbindungen eingreifen könnten.
Der erste Schritt 1000 (10) des Verfahrens ist das Entfernen der monomeren und dimeren Zucker und der Benzoesäure aus einem wässrigen Vaccinium-Erstextrakt, indem der Erstextrakt der Umkehrphasen-Flüssigchromatographie auf einer lipophilen Säule ausgesetzt wird. Der Erstextrakt kann durch Herstellen einer wässrigen Lösung eines pulverisierten Ausgangsmaterials wie vorstehend beschrieben, durch Herstellen eines Extrakts mit angesäuertem Alkohol wie durch die Schritte 100–102 des Verfahrens von 1 oder durch gleichwertige andere Möglichkeiten, erhalten werden.
In einer Ausführungsform wird die Umkehrphasen-Chromatographie des Schrittes 1000 auf einer C18-Kartuschensäule (Waters, C18 "BondaPak", 10-μm-Kügelchen, erhältlich von Millipore Corp., Milford, Massachusetts, Kat.-Nr. WAT038505) durchgeführt. Eine C18-Kartuschensäule von 50 ml wird im We sentlichen gemäß der Gebrauchsanweisung des Herstellers vorbereitet, durch Spülen zuerst mit 100 ml MeOH und dann mit 200 ml destilliertem Wasser bei einer Flussrate von 4–6 ml/min. Zwischen 350 ml und etwa 500 ml des wässrigen Erstextrakts werden anschließend auf eine C18-Säule bei einer Flussrate von 0,5 bis etwa 2,0 ml/min aufgegeben. Wenn die die Säule verlassende Flüssigkeit sich während des Beladens pink oder rot färbt, ist die Säule gesättigt. Die Säule wird dann mit einem Überschuss an Wasser (800–1000 ml oder eine ausreichende Menge, bis das Elutionsmittel farblos oder mattpink erscheint) bei einer Flussrate von etwa 4–6 ml/min gewaschen, um die Zucker zu entfernen. Als Nächstes wird ein ausreichendes Volumen an MeOH, typischerweise etwa 150 bis etwa 300 ml, durch die Säule laufen gelassen, um die gewünschten Verbindungen zu eluieren. Das MeOH-Eluat sollte ein tiefrotes sein; wenn das Eluat blasspink wird, hat ausreichend MeOH die Säule durchlaufen. Das MeOH-Eluat enthält gewöhnlich Präzipitat, welches durch Zentrifugieren bei 1500 bis 5000 Umdrehungen pro Minute mit beispielsweise einer Top-Tischzentrifuge oder einer etwas größeren Zentrifuge leicht entfernt werden kann (Schritt 1004).
Das MeOH des MeOH-Überstands des Schrittes 1002 wird dann unter Vakuum verdampft, und der Rückstand wird in 25 ml warmen Wassers, bevorzugt mit Beschallung, wieder aufgelöst (Schritt 1004). Die Probe kann zentrifugiert oder mit einem Filter Whatman Nr. 1 filtriert werden, um das Präzipitat abzutrennen, welches verworfen wird.
Die wässrige Probe wird anschließend der chromatographischen Trennung auf einer Kationensäule unterzogen (Schritt 1008). Eine Kationensäule von 4 bis 8 ml wird vorbereitet, wie allgemein bekannt, aus einer Aufschlämmung von Kationenmaterial in Wasser. Ein derzeit bevorzugtes Kationenmaterial ist Waters Accell + CM Cation, was ein Kieselgelbett mit einer hydrophilen gebundenen Schicht mit der Carboxymethylgruppe als der verfügbaren Kationengruppe ist (Millipore Corp., Milford, Massachusetts). In einem typischen Verfahren wird die wässrige Probe, die ein Volumen von etwa 5 ml hat, vorsichtig direkt auf die Kationensäule aufgegeben. Zu diesem Zeitpunkt wird eine grüne Färbung in der Säule und ein sehr dunkelgrünes Material an dem Kopf der Säule beobachtet werden. Die Säule wird dann mit etwa 25 ml destilliertem Wasser gewaschen (Schritt 1008A). Das dunkelgrüne Material genau an der Spitze wird nur sehr langsam mit reinem Wasser ausgewaschen und wird erwünscht zurückgelassen. Die Ausgangsaufgabelösung und die Wasserwäsche (das Leervolumen; Schritt 1008A) der Kationensäule enthalten einen wesentlichen Anteil der gewünschten Anti-Anhaftungswirkung. Ein erhebliche Menge an Anthocyaninen ist durch die Kationensäule aus dem Extrakt entfernt, wie durch analytische C18-Chromatographie der Produkte 1006 und 1008A (welche auch der optionalen CHCl₃/EtAc-Extraktion unterzogen werden können) offenbart. Es ist erwünscht, dass die Säule jetzt mit 1–2 Säulenvolumina von 1% HCl (aq) gewaschen wird (Schritt 1008B), was im Wesentlichen das gesamte grüne Material eluiert. Es wird festgestellt, dass das HCl-Eluat hauptsächlich aus Anthocyaninen besteht. Der HCl-Elution folgend, wird dann ein Schritt der MeOH-Elution (Schritt 1008C) ausgeführt. Das MeOH-Eluat 1008C, nach Eindampfen und Resuspendieren in Wasser, zeigt überraschenderweise einen wesentlichen Anteil der Anti-Anhaftungswirkung. Die Verbindungen des MeOH-Eluats weisen wesentliche HPLC-Elutionspeaks auf, die durch Absorption bei 230, 280 und 360 nm beobachtbar sind.
Das Leervolumeneluat 1008A wird dann auf eine Konzentration von weniger als etwa 60 mg/ml eingeengt (z. B. durch Eindampfen), in Vorbereitung auf die Affinitätschromatographie auf einer ConA-Säule. Eine Säule von 3 bis 10 ml eines ConA-gebundenden Säulenmaterials (Sigma Chem. Co., St. Louis, Missouri, Kat.-Nr. C-9017) wird vorbereitet und gespült mit 100 ml Phosphatpuffer (0,05 M Natriumphosphat, eingestellt auf pH-Wert 7 mit H₃PO₄) bei einer Flussrate von etwa 1 ml/min. 2 ml des wässrigen Eluats, das nicht mehr als 60 mg/ml Probe enthält, wird auf dieselbe Konzentration an ConA-Phosphatpuffer eingestellt und auf die Säule aufgebracht. Nach dem Aufgeben wird die Säule mit etwa 50 ml Phosphatpuffer oder, bis das Eluat klar ist, wieder bei etwa 1 ml/min gewaschen. Zum Schluss wird die Säule mit mindestens 50–100 ml Phosphatpuffer, der 10% α-Methylmannopyranosid enthält, eluiert. Die Mannopyranosidverbindung wird für diesen Zweck gegenüber Mannose bevorzugt, weil sie fester an das ConA bindet, und daher zu erwarten ist, dass sie an die mannoseaffine Stelle von ConA gebundene Verbindungen wirksamer eluiert. Es wird festgestellt, dass eine Konzentration von 10% des α-Methylmannopyranosids beim Eluieren der aktiven Fraktion effizienter als eine geringere Konzentration von 2% ist.
Das so erhaltene ConA-Eluat wird dann einer weiteren Trennung auf einer C18-Säule unterworfen, ähnlich dem Schritt 1000, um das α-Methylmannopyranosid zu entfernen. Eine kleinere C18-Säule (Waters, Sep-Pak C18, 1 ml Volumen, Millipore Corp., Milford, Massachusetts, Kat.-Nr. WAT051910) ist bei der weiter gereinigten Probe bei diesem Schritt ausreichend. Dieser Schritt dient außerdem dazu, die aktive Fraktion anzureichern. Die Säule wird durch Durchlauf von 5–10 ml MeOH, gefolgt durch 5–10 ml Wasser, über diese vor dem Beladen mit 50 ml des ConA-Eluats vorbereitet. Die Säule wird dann mit 10–20 ml Wasser gewaschen, und die aktive Fraktion wird in einem Volumen von etwa 2 ml MeOH eluiert. Die Probe kann bis zur Trockenheit eingeengt und in einem Volumen von etwa 150 μl destilliertem Wasser resuspendiert werden. Der so erhaltene Extrakt ist blassgelb bis braun (hinweisend auf wenige oder keine Anthocyanine). Ein großer Teil der Anthocyanine ist durch die Trennung mit der Kationensäule abgegangen.
Gegebenenfalls kann ein Schritt des Extrahierens der wässrigen Probe mit einem gleichen Volumen eines mittelpolaren organischen Lösungsmittels, z. B. 50 : 50 CHCl₃/EtAc, in das Verfahren von 10 einbezogen werden. Dieser Schritt wird ausgeführt, um einige unpolare oder weniger polare Verbindungen aus dem Extrakt zu entfernen. Die CHCl₃/EtAc-Extraktion kann entweder nach Schritt 1004 oder vor den Schritten 1000, 1002 z. B. an dem wässrigen Ausgangsextrakt durchgeführt werden.
Die CHCl₃/EtAc-Extraktion scheint eine Komponente des Extrakts zu entfernen, welche die Wirkung der Anti-Anhaftungsfraktion in dem RBC-Versuch maskiert oder anders beeinträchtigt, da ihre Entfernung im Allgemeinen die wie in diesem Versuch gemessene Wirkung erhöht, ohne dass sich die Massenausbeute wesentlich verändert. Die Entfernung der offensichtlich "maskierenden" Komponente(n) kann jedoch die Langzeitstabilität der aktiven Verbindung verringern. Daher kann der Schritt der CHCl₃/EtAc-Extraktion verwendet werden, wenn versucht wird, die Anti-Anhaftungswirkung in dem RBC-Versuch zu quantifizieren, aber es kann unerwünscht sein, diesen Schritt in die routinemäßige Herstellung des Extrakts einzuschließen.
Bei der Durchführung der CHCl₃/EtAc-Extraktion wird die wässrige Probe vorzugsweise zweimal extrahiert (jedes Mal mit einem gleichen Volumen an CHCl₃/EtAc). Die organische(n) Phase(n) wird/werden verworfen, und die wässrige Phase wird durch Eindampfen auf etwa 1/5 ihres Ausgangsvolumens (z. B. etwa 5 ml) eingeengt. Das Eindampfen entfernt außerdem Spurenmengen der organischen Lösungsmittel. Alternativ kann die Probe bis zur Trockenheit eingedampft und in Wasser resuspendiert werden. So oder so, die so erhaltene wässrige Probe wird dann weiter mit Schritt 1008 oder Schritt 1004 gereinigt.
Tabelle VIII zeigt die relative anhaftungshemmende Wirkung, gemessen für Extrakte bei ausgewählten Schritten in dem Verfahren von 1 und 10, wie gemessen in dem Versuch der Agglutination roter Blutzellen (abgekürzt: RBC-Versuch; siehe Beispiel 2 und Tabelle VI). Die Wirkungswerte sind auf die Wirkung einer 1%igen Mannoselösung in dem Versuch und auf die Materialmenge in g/ml normalisiert. Die Mannoselösung ist 1%ig oder 1 g/100 ml, so zeigt ein Wert von 100 eine der Mannose äquivalente Wirkung an. Werte größer als 100 zeigen an, dass die Probe wirksamer als Mannose in der Anti-Anhaftungswirkung ist. Die Konzentrationen der Versuchsextrakte wurden durch Wägen von bis zur Trockenheit eingedampften Teilen ermittelt.
Die in Tabelle VIII gezeigten Ergebnisse demonstrieren, dass (im Allgemeinen) verschiedene Verfahren der Herstellung des Ausgangsextrakts mit dem Verfahren MeOH : HOAC : Wasser ("MAW") vergleichbar waren. Extrakte mit Wasser (Raumtemperatur) und siedendem Wasser waren etwas besser bezüglich der Gewinnung der Wirkung. Eine 10%ige Lösung von OCEAN SPRAY-Moosbeerpulver ("OSCP") war mit diesen genauso vergleichbar. Um die Größe der in der Pulpe verbleibenden Wirkung zu bestimmen, wurde die Pulpe mit MeOH extrahiert und das MeOH-lösliche Material wurde in wässriger Form aufbereitet.
Der MAW-Extrakt wird bevorzugt, weil er zu einer größeren Gewinnung der Wirkung bei der Ausgangsextraktion aus Beeren zu führen und einen kleineren Anteil der Wirkung in der Pulpe zu hinterlassen scheint.
Ein alternatives Verfahren zur Herstellung eines Moosbeerextrakts mit Anti-Anhaftungswirkung und weitere enthaltene Schritte der wesentlichen Reinigung einer aktiven Verbindung aus dem Extrakt beginnen mit einer Einstellung einer wässrigen Lösung von zuvor extrahiertem Pflanzenmaterial, in welcher die "aktiven" Verbindungen löslich sind, auf alkalischen pH-Wert. Wenn auf eine wässrige Lösung von OCEAN SPRAY-Moosbeerpulver angewandt, verlief das Verfahren wie folgt. Eine ausreichende Menge einer starken Base (z. B. NaOH) wird der OSCP-Lösung zugesetzt, um sie auf einen pH-Wert zu bringen, der genügt, um die Phenolgruppen von Polyphenolen zu Phenoxidgruppen zu ionisieren (μ pH 10) (13; Schritt 1300). Wenn das Verfahren auf die OSCP-Lösung angewendet wurde, schlug die Lösung nach Erreichen des notwendigen pH-Wertes auf Grün um. Für 1 l einer gesättigten (20%) OSCP-Lösung aus Moosbeerpulver wurden etwa 70–80 ml 10 N NaOH verwendet. Die so hergestellte grüne, alkalische OSCP-Lösung wurde dann mit einer ausreichenden Menge eines einfachen Alkohols gerührt, um die Bildung eines grünen Präzipitats hervorzurufen (Schritt 1302). Etwa 4 Volumina (4 l) MeOH wurden verwendet. Anstelle von MeOH könnten andere Alkohole mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen verwendet werden. Das Präzipitat wurde setzen gelassen, auf Filterpapier gesammelt und anschließend mit einem kleinen Volumen (etwa 1/5 bis 1/3 l in dem Beispiel) des "alkalischen" MeOH gewaschen (Schritt 1304). "Alkalisches" MeOH ist MeOH, das mit etwa 1–2 ml 10 N NaOH pro l alkalisch gemacht ist. Die gewaschenen Feststoffe wurden an der Luft getrocknet, und das so erhaltene hellgrüne Pulver, welches erhöhte Mengen der aktiven Fraktion enthielt, wie durch Prüfen in dem nachstehend beschriebenen Versuch der RBC-Agglutination offenbart, war über viele Monate bei Raumtemperatur stabil. Die meisten Zucker wurden in diesem Schritt entfernt. Im Allgemeinen wurden zwischen etwa 70 und 80 Gramm des grünen Pulvers pro Liter 20% OSCP gewonnen.
Als Nächstes wurde eine ausreichende Menge des grünen Pulvers in 200 ml Wasser gelöst, um eine stark oder fast gesättigte Lösung herzustellen (Schritt 1306; im Allgemeinen 30–40 Gramm aus dem Verfahren mit 20% OSCP). Die wässrige Lösung wurde dann angesäuert, um die Phenoxid-Ionen in die Phenoxidgruppen umzuwandeln, in dem vorliegenden Fall durch Zusetzen einer ausreichend konzentrierten Säure (z. B. etwa 13–16 ml 12 M HCl), um sie auf einen pH-Wert zwischen etwa 3 und 4 zu bringen (Schritt 1308). Bei der Extraktion aus OSCP wechselte die Lösung nach Erreichen des geeigneten pH-Werts zu einer weinroten Färbung. Ungelöste Feststoffe wurden abgetrennt (z. B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren), und der Überstand wurde auf eine lipophile C18-Säule aufgegeben (Waters-Kartusche), welche mit MeOH vorbehandelt und anschließend mit entionisiertem Wasser gewaschen wurde (Schritt 1310). Nachdem die von Moosbeeren abgeleitete Lösung aufgegeben worden war, wurde die C18-Säule mit 2–3 Säulenvolumina Wasser gewaschen und in Methanol eluiert. Für eine C18-Säule von 35 ml, die mit etwa 200 ml der angesäuerten, von Moosbeeren abgeleiteten Lösung beladen war, wurde der Elutionsschritt 1312 mit 100 ml (2–3 Säulenvolumina) Methanol durchgeführt. Andere wassermischbare Alkohole könnten MeOH ersetzen. Andere unpolare organische Lösungsmittel im Vergleich zu Wasser (z. B. Acetonitril) könnten den Alkohol ersetzen. Außerdem können andere ähnliche Umkehrphasen-Kieselgel-Säulen, wie C2- oder C8- oder Phenyl-Säule oder dergleichen, die C18- oder lipophile Säule Sephadox LH-20 oder LH-60 oder dergleichen ersetzen.
B. Die Extrakte
Tabelle I zeigt die Löslichkeit einer Ausführungsform (Moosbeerpulver) der Erfindung in verschiedenen Lösungsmitteln von sich unterscheidendem Polaritätsgrad.
Der Brechungsindex einer wässrigen Lösung des Pulvers beträgt etwa 1,3320 bei einer Konzentration von 1,0 mg/ml und etwa 1,3370 bei einer Konzentration von 8,5 mg/ml (die maximale Löslichkeit in Wasser). Tabelle I

Lösungsmittel Löslichkeit

Aceton 133 mg/ml

Methanol 530 mg/ml

Ethanol 450 mg/ml

Butanol 275 mg/ml

Wasser 8,5 mg/ml
Der aus Moosbeeren (Beeren von V. macrocarpon) hergestellte Extrakt hat bestimmte charakteristische Merkmale in den Absorptionsspektren in den Bereichen des infraroten, sichtbaren und ultravioletten Lichts. 2 zeigt ein IR-Transmissionsspektrum des Extrakts, mit wesentlichen Absorptionswellentälern bei ungefähr den folgenden jeweiligen Wellenzahlen in cm^–1: 3410, 2960, 1735, 1610, 1524, 1443, 1360, 1285, 1210, 1111, 1066, 822, 785, 500, welche jeweils durch die Referenzzahlen 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228 angegeben sind. Peak 228 bei etwa 500 cm^–1 ist sehr breit.
3 zeigt ein Absorptionsspektrum des in MeOH gelösten Moosbeerextrakts, für Wellenlängen von etwa 250 nm bis etwa 600 nm (die Bereiche des UV- und sichtbaren Lichts). Die Konzentration des Extrakts in MeOH beträgt etwa 0,05 mg/ml. Vier Absorptionsmaxima werden zwischen etwa 200–500 nm mit Peaks gewöhnlich bei 200–210 nm und 275–290 nm und 355–375 nm und 440–460 nm beobachtet. Diese Maxima sind durch die Pfeile 310, 320, 330, 340 angegeben. Diese vier Peaks scheinen charakteristisch für den Extrakt zu sein. Die relativen Intensitäten der Peaks können etwas variabel sein, liegen aber im Allgemeinen jeweils in dem Bereich von etwa 1,8 : 0,64 : 0,12 für die Peaks 320, 330, 340. Es ist bekannt, dass Polyphenole, einschließlich Flavonoid enthaltenden Verbindungen, Absorptionsspektren UV/sichtbares Licht mit ähnlichen Merkmalen haben. Der Moosbeerextrakt zeigt außerdem starke Fluoreszenz bei 315 nm bei Anregung bei 280 nm Licht. Sowohl Fluoreszenz- als auch Absorptionsspektralmaxima werden durch Zusatz von AlCl₃ zum roten Bereich verschoben, was für phenolische Verbindungen charakteristisch ist.
4 stellt Absorptionsspektren des in Wasser gelösten Moosbeerextrakts, bei zwei verschiedenen Konzentrationswerten, dar (Kurven 400, 402). Kurve 402 wird von einer Probe erhalten, welche 200-mal mehr angereichert als die von Kurve 400 ist. Das Spektrum hat die folgenden charakteristischen Absorptionspeaks: 202, 278, 368 und 454 nm, welche jeweils durch die Referenzzahlen 410, 420, 430 und 440 angegeben sind. Die ungefähren relativen Intensitäten der Peaks betragen, in (mg/ml)^–1(cm)^–1, 0,28, 0,025, 0,0031 bzw. 0,00085. Die Peaks Nr. 420, 430 (278 nm bzw. 368 nm) sind ebenfalls charakteristisch für die Spektren in Wasser von Flavonoid und Polyphenol enthaltenden Verbindungen. Im Allgemeinen ist eine Absorption bei sowohl 280 nm als auch 360–370 nm anzei gend für das Vorhandensein von Flavonoiden, während Polyphenole die größte Absorption in dem Bereich von 200 nm bis 280 nm haben und geringe oder keine Absorption bei 360–370 nm zeigen.
Die in dem Extrakt vorliegenden Flavonoid-/Polyphenolverbindungen schließen Verbindungen mit einer Glycosideinheit ein. Verschiedene Flavonoid-Aglycone, die Myricetin, Rutin und Quercetin einschließen, wurden untersucht, und es wurde bei ihnen keine Anti-Anhaftungswirkung festgestellt.
Der Moosbeerextrakt ist außerdem durch die Elution zu spezifischen Zeiten während der HPLC des in MeOH gelösten Extrakts, der bei 360 nm lichtabsorbierenden Komponenten, gekennzeichnet. 5A und 6A stellen typische Chromatogramme der Absorption gegen die Zeit des Moosbeerextrakts von Komponenten, die bei 360 nm absorbieren, dar. 1500 μl einer Lösung, die 100 mg Trockenpulver pro 4 ml MeOH enthielt (d. h. etwa 37,5 mg), wurden auf eine präparative Umkehrphasen-C18-Säule (Waters, C18, vorgepackte Säule, BONDAPAK, Kat.-Nr. WAT038505, Millipore Corp., Milford, Massachusetts, USA) aufgegeben. C18 ist ein Mittel mit lipophiler Affinität mit 18 Kohlenstoffatomen langen, an das Bett gebundenen Kohlenstoffketten. Für eine präparative Säule von etwa 50 ml Volumen; 25 mm Durchmesser und 100 mm Länge wird ein linearer Gradient aus zwei Lösungsmitteln von 80% A/20% B (A = 0,4% Phosphorsäure, B = MeOH) bis 31% A/69% B wird bei einer Flussrate von 5 ml/min über eine Zeit von 0 bis 76 min laufen gelassen. Nach 76 min wird eine isocratische Strömung bei 31 A/69% B über weitere 44 min aufrechterhalten. Mit Photodetektion bei 360 nm werden etwa vier große bei 360 nm absorbierende Peaks bei jeweils etwa 46, 52, 56 und 64 min beobachtet (gekennzeichnet durch die Referenzzahlen 602, 604, 606 bzw. 608 in 6A und 6B).
Für eine analytische Säule von etwa 5 ml Volumen (8) werden etwa 1,25 mg Pulver in einem Volumen von etwa 1 ml Wasser oder Alkohol aufgebracht. Ein linearer Gradient aus zwei Lösungsmitteln von 80% A/20% B (A = 0,4% H₃PO₄, B = MeOH) bis 31% A/69% B wird bei einer Flussrate von 1 ml/min über eine Zeit von 0 bis 38,3 min laufen gelassen. Nach 38,3 min wurde eine isocratische Strömung bei 31% A/69% B über weitere 21,7 min aufrechterhalten. Mit Photodetektion bei 360 nm werden etwa vier größere Elutionspeaks bei Elutionszeiten zwischen etwa 22 und etwa 40 min beobachtet, und drei kleinere Elutionspeaks treten früher auf, zwischen etwa 9 min und etwa 15 min. Alternativ kann ein überarbeitetes Verfahren verwendet werden, um das Grundlinienrauschen zu verfeinern und die Peaksymmetrie zu verbessern. Ein linearer Gradient aus zwei Lösungsmitteln von 79% A/21% B (A = 0,4,% H₃PO₄, B = 95% MeOH und 5% 0,4% Phosphorsäure) bis 35% A/65% B wird bei einer Flussrate von 1 ml/min über eine Zeit von 0 bis 38,3 min laufengelassen. Nach 38,3 min wurde eine isocratische Strömung bei 35% A/65% B über weitere 21,7 min aufrechterhalten. Die Säule wird dann mit 100% MeOH über weitere 10 min bei einer Flussrate von 1,0 ml/min gewaschen.
In einigen Fällen (z. B. 9) wurde eine präparative Säule von 50 ml zuerst für 5 min bei 80% A durchlaufen, gefolgt durch den linearen Gradienten von 80% A bis 31% A über die nächsten 38,3 min, und schließlich durch eine isocratische Phase bei 31% A für die nachfolgenden 21,7 min (Gesamtzeit 70 min). Mit diesem Gradientenprotokoll ist das Bild der bei 360 nm absorbierenden Elutionspeaks, die mit der aktiven Fraktion des Extrakts in Verbindung stehen, etwas anders, aber näher an dem für die analytische Säule beobachteten.
Der Moosbeerextrakt ist außerdem durch bestimmte UV-fluoreszierende Komponenten gekennzeichnet, die in einem spezifischen Muster bei der Papier- und Dünnschichtchromatographie ("TLC") wandern. Wenn eine Lösung des Moosbeerextrakts der TLC auf Kieselgel in einem Lösungsmittel von 98 : 2 Aceton : Wasser unterzogen wird, können vier charakteristische fluoreszierende Banden unter langwelligem ultravioletten Licht beobachtet werden. Diese charakteristischen Banden haben die in Tabelle II beschriebenen Eigenschaften:
Tabelle II
Relativer Wanderabstand (R_f) und Färbung nach Bestrahlung mit UV-Licht für charakteristische, mit TLC in Aceton : Wasser (98 : 2) beobachtete Banden.
Wenn der Papierchromatographie auf einem Papier Whatman Nr. 3 mit einem Lösungsmittelsystem von 6 : 1 : 2 Butanol : HOAc : H₂O unterzogen, werden drei wesentliche Peaks unter Einwirkung von langwelligem UV-Licht (366 nm) beobachtet. Diese drei Peaks sind in Tabelle III beschrieben:
Tabelle III
Relativer Wanderabstand (R_f) und Färbung der Fluoreszenzbanden nach Bestrahlung mit langwelligem UV-Licht, für Papierchromatographie in 6 : 1 : 2 Butanol : Essigsäure : Wasser.

Der angereicherte Extrakt ist weitgehend frei von Einfachzuckern (monomeren und dimeren Zuckern wie Fructose, Galactose, Glucose, Sucrose usw.) In einer Ausführungsform beträgt der Gesamtsäuregehalt des angereicherten Extrakts (einschließlich Benzoesäure) weniger als etwa 2%. Benzoesäure ist gewöhnlich mit weniger als etwa 0,005 mg pro Gramm vorhanden. Dieser Benzoesäuregehalt ist weniger als oder gleich etwa 1% des Gehalts in bestimmten existierenden Produkten, wie zusammengefasst in Tabelle IV. Saftprodukte wurden vor dem Prüfen auf ein Pulver verringert, und der Säuregehalt ist in Bezug auf die Masse der erhaltenen Feststoffe angegeben. Der herabgesetzte Gehalt an Benzoesäure und Gesamtsäure führt zu einem Produkt mit einem weniger sauren Geschmack und von dem man annimmt, dass es weniger wahrscheinlich ist, dass es Magenverstimmung hervorruft oder Karies fördert. Tabelle IV

Produkt	Gew.-% Benzoesäure
Moosbeersaft KNUDSEN	0,50
Moosbeersaft HAINS	0,11
Moosbeersaft JANET LEE	0,06
Moosbeercocktail OCEAN SPRAY	0,10
Moosbeerpulver OCEAN SPRAY	0,12
Moosbeerextrakt der Anmeldung	0,0002

Es wurde festgestellt, dass der Moosbeerextrakt mit den vorstehenden Eigenschaften, einschließlich eines sehr niedrigen Gehalts an Einfachzuckern und Benzoesäure, in die Anhaftung von Bakterienzellen sowohl an bestimmte Zellarten als auch an Oberflächen wie Polystyrol eingreift.
C. Verwendung
Ein Verfahren zum Hemmen des Anhaftens von Bakterien an Oberflächen umfasst die Schritte des Bereitstellens eines Vaccinium-Extrakts, angereichert an der Anti-Anhaftungswirkung und an bei 280 und/oder 360 nm absorbierenden Polyphenolverbindungen, und Aufbringen einer wirksamen Menge einer den Extrakt in einem verträglichen Träger umfassenden Zusammensetzung auf eine Oberfläche, von der man annimmt, dass darauf Bakterien wie E. coli anhaften, um die Bakterien von der Oberfläche abzulösen. Es ist erwünscht, dass die Oberfläche abgespült wird, um die abgelösten Bakterien zu entfernen. Das Verfahren ist nützlich, um das Anhaften von Bakterien an solche Oberflächen wie Zähne, andere an Zähne anhaftende Bakterien, humane orale Epithelzellen und humane Epithelzellen des Harntraktes zu hemmen; und um Zahnimplantate, Wannen der bakteriellen Fermentation und dergleichen zu reinigen
D. Zusammensetzungen
Die Erfindung schließt orale Hygieneprodukte ein, die einen von Vaccinium abgeleiteten Extrakt, wie hierin vorstehend offenbart, mit mikrobiellen Anti-Anhaftungswirkungen enthalten. Derartige orale Hygieneprodukte schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Zahnreinigungsmittel, orale Spülungen und Kaugummis.
Ein erfindungsgemäßes Zahnreinigungsmittel würde durch Ansetzen einer wirksamen Menge des von Vaccinium abgeleiteten "Extrakts" in einem herkömmlichen Pulver- oder Pastenträger hergestellt werden, wobei der Träger aus Bestandteilen in üblichen Anteilen besteht, die eine hydrophile Base, Emulgatoren, Aromastoffe, Duftstoffe, Konservierungsstoffe usw., einschließen. Solch ein Zahnreinigungsmittel kann wirksame Mengen an Schleifmittelkomponenten zur mechanischen Störung/Entfernung von Zahnstein und/der Fluorid einschließen. Ein spezielles Beispiel einer Zahnpasta beinhaltet von Vaccinium abgeleiteten Extrakt in einer Menge zwischen etwa 0,2% und etwa 5% des Trockengewichts in Kombination mit Zahnpastabestandteilen.
Ein Kaugummi würde eine herkömmliche Gummikomponente, einen Konservierungsstoff und eine wirksame Menge des Extrakts enthalten. In dem Gummi wird die Menge des Extrakts im Allgemeinen zwischen etwa 0,5% und etwa 5% des Trockengewichts liegen.
Eine orale Spülung kann einen wässrigen oder wässrig-alkoholischen flüssigen Träger, einen Konservierungsstoff und eine wirksame Menge des Extrakts enthalten, wobei der letztere im Allgemeinen von etwa 0,5% bis etwa 10 Vol.-%, oder 0,005 bis 2% des Trockengewichts, vorhanden ist.
Ein weiteres Produkt, in welchem der Extrakt Verwendung findet, ist ein Rachenspray oder eine Pastille, um einen entzündeten Rachen beispielsweise durch Verringern oder Verhindern des Anhaftens von gesundheitsschädlichen Bakterien an Rachengewebe zu behandeln.
Herkömmlich sind Wasserstoffperoxid oder andere starke Oxidationsmittel manchmal in oralen Hygieneprodukten enthalten. Zur Zeit ist man jedoch der Überzeugung, dass es besser ist, dass keine starken Oxidationsmittel wie Wasserstoffperoxid enthalten sind.
Es wird außerdem in Betracht gezogen, dass der von Vaccinium abgeleitete Extrakt in Kapsel- oder Tablettenform zur regelmäßigen Verabreichung hergestellt werden kann, um die Erhaltung der Gesundheit des Harntraktes zu unterstützen, und insbesondere als vorbeugendes Mittel gegen Harnwegsinfektionen. Oder mit dem Extrakt angereicherte Getränke könnten für einen ähnlichen Zweck hergestellt werden, wobei die bekannten Vorteile von Moosbeersaft Personen zur Verfügung gestellt werden, die den Geschmack von Moosbeeren nicht mögen. Der Extrakt sollte in einer Menge von 5 bis 500 mg in einer Tablettenform vorhanden sein, oder in einer Menge, um eine ähnliche Dosierung in einem Getränk von 100 ml bis 250 ml bereitzustellen.
Der von Vaccinium abgeleitete Extrakt könnte außerdem in Zusammensetzungen zur Behandlung von Harnwegsinfektionen angesetzt werden. In Tablettenform würde solch eine Zusammensetzung zwischen etwa 10 und etwa 500 mg des von Vaccinium abgeleiteten Bestandteils pro Dosiseinheit in einem geeigneten inerten Träger einschließen, wobei die Dosis 1- bis 4-mal täglich zu nehmen ist. Gegebenenfalls können eins oder mehrere der folgenden enthalten sein: Phenazopyridin-HCl zur Linderung akuter Symptome (zwischen etwa 50 mg und etwa 200 mg pro Dosiseinheit); Methenamin als infektionsverhinderndes Mittel (zwischen etwa 50 mg und etwa 500 mg Methenamin pro Dosiseinheit) und ein harnansäuerndes Mittel wie Natriumdiphosphat, Hippursäure, Ascorbinsäure oder Mandelsäure (zwischen etwa 100 mg und etwa 500 mg pro Dosiseinheit).
Ein erfindungsgemäßes Fußpulver würde typischerweise eine wirksame Konzentration des mit Miconazol oder Clotrimazol, Talk, Stärke und möglicherweise Duftstoff versetzten Extrakts einschließen. Beim Einbringen in ein Aerosol würde auch ein Treibgas verwendet werden.
Eine Fußsalbe oder -creme würde typischerweise eine wirksame Menge des Extrakts, Miconazol oder Clotrimazol, Erdöl, Lanolin, Natriumlaurylsulfat, Emulgatoren und Konservierungsstoffe einschließen.
Eine Fußlösung würde typischerweise den erfinderischen Extrakt, ein Antimykotikum wie Miconazol oder Clotrimazol und ein Lösungsmittelsystem (z. B. Wasser und Alkohol) einschließen.
Eine vaginale Creme zum Behandeln von Hefeinfektionen würde den Extrakt, eine wirksame Menge eines Antimykotikums wie Clotrimazol, Miconazol oder Terconazol, Benzylalkohol, Cetylalkohol und Wachs oder eine andere Cremegrundlage einschließen.
Beispiele
Die Beispiele 1–3 demonstrieren die Anti-Anhaftungswirkungen des Extrakts. Mindestens drei Arten des Anhaftens von Bakterienzellen an andere Zellen und Oberflächen sind bekannt. Eine Art wird durch Typ-1-Pili auf der Oberfläche der Bakterien vermittelt, und ist durch Sensibilität gegen freie Mannose gekennzeichnet. Eine zweite Art wird durch P-Typ-Pili ("P-Typ-Fimbrien") vermittelt. Die Mechanismen der dritten Art und andere Anhaftungsarten sind nicht gut charakterisiert. Man vermutet, dass Meerschweinchenerythrozyten von Rezeptoren für die Typ-1-Pili (mannoseempfindlich) von E. coli sind, da die Bakterien zum Agglutinieren von Meerschweinchenerythrozyten bei Fehlen von Mannose, aber nicht in deren Gegenwart imstande sind (siehe z. B. Aronsen, J. Infect. Dis. 1979, 139: 329–332; Riegman, J. Bacter. 1990, 172: 1114–1120; Jann, Infect. Immun. 1981, 22: 247–254).
Beispiel 1
Anti-Anhaftungswirkung, gemessen als Störung des bakteriellen Anhaftens an Blasenzellen
Humane Blasenepithelzellen wurden durch Zentrifugieren aus dem Urin einer gesunden weiblichen Freiwilligen gesammelt. Die Zellen wurden in Standard-Saline-Citrat (SSC) gewaschen und auf das gewünschte Volumen resuspendiert. Die optische Dichte der Zelllösung und die Zellzählungen wurden ermittelt. Bakterienstämme von E. coli, isoliert von Harnwegsinfektionen, wurden in tryptischer Sojanährlösung bei 37°C über 72 Stunden kultiviert, um die Piliation zu fördern. Die Bakterien wurden außerdem durch Zentrifugieren geerntet, in dem gewünschten Volumen an SSC resuspendiert, und die ungefähre Zellzahl wurde bestimmt.
Ein Reagenzglas wurde vorbereitet, das 0,667 ml einer ausgewählten Lösung der auf die Anti-Anhaftungswirkung zu testenden Substanz und 0,334 ml der bakteriellen Suspension enthielt. Die Bakterien wurden mit der Testsubstanz (einem angereicherten Extrakt, hergestellt aus Moosbeeren durch das Verfahren von 1, Schritt 116) über 15 min bei 37°C inkubiert. Als Nächstes wurden 1,0 ml der Blasenzellsuspension zu jedem Glas hinzugegeben und die Gläser über weitere 15 min inkubiert. Der Moosbeerextrakt wurde in einer Lösung von 8,5 mg/ml verwendet. Unfraktionierter Moosbeersaft wurde ebenfalls getestet.
Nach der Inkubation wurde der Inhalt jedes Glases durch einen 8-μm-Polycarbonatfilter filtriert, und der Filter wurde mit zwei Volumina (2 ml = ein Volumen) SSC abgespült, um jegliche Bakterien, die nicht an die Blasenzellen angehaftet waren, wegzuwaschen. Der Filter wurde mit der Seite nach unten auf ein Mikroskop gelegt, und die Zellen wurden an den Objektträger durch Wärme fixiert. Der Filter wurde entfernt, die Objektträger wurden angefärbt, um die Zellen sichtbar zu machen, und die pro Zelle anhaftende Bakterienzahl wurde bei jeweils 20 Zellen pro Objektträger ausgezählt.
Zwei Kontrollversuche wurden außerdem durchgeführt. Zuerst wurden die Blasenzellen nur in SSC ohne bakterielle Suspension oder Testsubstanz inkubiert, um festzustellen, wie viele Bakterien, die der Urinprobe entstammten, an die Epithelzellen angehaftet waren. Als Zweites wurde SSC durch die Testsubstanz ersetzt, um die maximale Anzahl an Bakterien, die ohne Inhibitor an die Zellen anhafteten, zu ermitteln.
Beispiel 2
Der folgende Versuch wurde entwickelt und verwendet, um das Vermögen des Extrakts, die Agglutination von roten Blutkörperchen ("RBC") vom Meerschweinchen durch E. coli zu hemmen, zu prüfen:
RBC, von Meerschweinchen (Microbio Products, Tempe, Arizona) als Suspension in Alsevers-Lösung, wurden in SSC gewaschen und in SSC resuspendiert. Humane RBC, erhalten durch Standardverfahren aus dem Blut von Freiwilligen, wurden durch Waschen und Resuspendieren in SSC vorbereitet. Man vermutet, dass humane RBC einen Rezeptor für mannoseresistente Pili von E. Coli von haben.
E. coli, kultiviert und vorbereitet wie im Beispiel 1 beschrieben, wurden wie folgt untersucht. Eine Reihe von Punkten, die abgestufte Mengen der in SSC gelösten Testsubstanz enthielten, und ein Punkt, der nur SSC enthielt, wurden auf einer Polystyrolplatte aufgebracht. Die Punkte hatten ein Volumen von etwa 10 μl. Ein gleiches Volumen der bakteriellen Suspension wurde in jeden Punkt gemischt, gefolgt durch 1/2 Volumen an RBC. Das Gesamtvolumen in jedem Punkt, bei einem Ausgangsvolumen von 10 μl pro Punkt, war so 25 μl. Die Inhalte jedes Punktes wurden innig vermischt, und der Agglutinationsgrad wurde auf einer Skala von 0–4, wobei 0 keine Agglutination darstellt, bepunktet. Die Summe der Punktzahlen der Punkte für alle Verdünnungen wurde addiert und von 32 subtrahiert, um einen Wirkungsindex der die Agglutination beeinflussenden Wirkung zu liefern.
5A, 5B und 6A, 6B stellen die Absorptionschromatogramme von der Hochdruckflüssigchromatographie dar (präparative Säule, 25 ml bis 100 ml). In 5A wird die Absorption bei vier verschiedenen Wellenlängen gezeigt: 230, 280, 360 und 512 nm. Es ist bekannt, dass Flavonoide und Polyphenole wesentliche Absorption bei etwa 280 nm aufweisen, wobei Flavonoide außerdem ein Absorptionspeak bei etwa 360 nm haben. Es ist bekannt, dass Anthocyanine wesentliche Absorption bei 512 nm aufweisen. 5B ist eine vergrößerte Kopie des Chromatogramms von 5A bei 512 nm. Aus einem Vergleich von 5A und 5B kann ersehen werden, dass die Peakhöhen der der Anthocyaninabsorption entsprechenden Peaks etwa 1/10 oder weniger der Peakhöhen der der Polyphenolabsorption (280 nm) entsprechenden Peaks betragen.
Zwölf Fraktionen 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524 wurden getrennt aufgefangen und weiter analysiert. Die Fraktionen 510, 514, 518, 522 umfassten wesentliche Peaks, absorbierend bei etwa 350 bis etwa 370 nm, Wellenlängen, die charakteristisch für Flavonoid- und Polyphenoleinheiten sind. Die Fraktionen 504 und 506 umfassten die Retentionszeit von Anthocyaninpeaks, absorbierend bei 512 nm.
Tabelle V vergleicht die Anti-Anhaftungswirkung der Fraktionen 502 bis 524 mit der eines ganzen (unfraktionierten) Extrakts. Ein Chromatogramm der letzteren Probe ist in 9 dargestellt (erhalten durch das alternative Gradientenverfahren mit einer Säule von 50 ml Größe). Diagramme des Absorptionsspektrums der Fraktionen 510, 514, 518, 522, 504 und 506 sind jeweils in 7A–7F dargestellt.

An diesen Spektren ist ersichtlich, dass die Fraktionen 510, 514, 518 und 522 alle relativ große Mengen an bei etwa 350–360 nm absorbierendem Material enthielten. Zusätzlich, wie in Tabelle V zu ersehen, wurde eine wesentliche Anti-Anhaftungswirkung in den Fraktionen 504, 506, die keine nachweisbaren Mengen an bei 360 nm absorbierendem Material enthielten, festgestellt. Die Fraktionen 504, 506 enthalten kleine Mengen an bei 512 nm absorbierenden Verbindungen (die für Anthocyanine gehalten werden) und wesentliche Mengen an bei 230 bis 280 nm absorbierendem Material. Es wurde jedoch eine Moosbeerzubereitung mit Anthocyanin analysiert und festgestellt, dass sie keine nachweisbare Anti-Anhaftungswirkung enthält (siehe Tabelle VI). So hat es den Anschein, dass mindestens etwas von der Anti-Anhaftungswirkung von Moosbeeren in einigen bei 230 bis 280 nm absorbierenden Verbindungen gefunden wird. Tabelle V Vergleich von HPLC-Fraktionen in Meerschweinchen-RBC Agglutinationsversuch

Fraktion Nr.	Wirkungsindex
510	6
512	4
514	5
516	2
518	1
520	0
522	0
524	0
526	4
504	18
506	18
508	6
500	0
502	5
Extrakt des Schrittes 116	9
Umkristallisierter Extrakt 116	33

Der für die Tests auf Anhaften an humane Blasenzellen verwendete Bakterienstamm von E. coli, wurde von einer aktiven Blaseninfektion bei einer Versuchsperson isoliert. Dieser Bakterienstamm, bezeichnet als der Bakterienstamm 3B, scheint sowohl Typ-1-Pili als auch P-Typ-Pili zu besitzen.
Die Ergebnisse des Agglutinationstests für verschiedene Substanzen und für die beiden Bakterienstämme E. coli sind in TABELLE VI dargestellt. "Gp" verdeutlicht den Versuch mit Meerschweinchenzellen, während "Hu" den Versuch mit humanen Zellen anzeigt. In dem Meerschweinchenversuch betrug die höchste Konzentration an Endextrakt (Schritt 116 von 1) in einem Testpunkt von 25 μl 0,056 mg/25 μl; die höchste Menge an Anthocyaninen in einem Punkt war 0,063 mg/25 μl; die höchste Menge an Mannose betrug 0,10 mg/25 μl. Ergebnisse eines ähnlichen Versuchs, durchgeführt an einer Probe des Extrakts mit angesäuertem Alkohol (Schritt 102), wobei die maximale Menge 0,4 mg/25-μl-Punkt beträgt, sind ebenfalls angeführt. Die in dem Versuch, der in Tabelle VI aufgezeigt ist, verwendeten Anthocyanine wurden aus Moosbeeren mit dem Verfahren von 10 erhalten. Im Schritt 1008B wurde festgestellt, dass die Elution der Kationensäule mit 1% HCl, nach Auffangen des Leervolumens und der wässrigen Wäschen (Schritt 1008A), den meisten oder gesamten Anthocyaningehalt von Moosbeeren selektiv gewinnt. Die Anthocyaninaufbereitung erhielt keine wesentlichen Mengen anderer Substanzen.
Tabelle VI Vergleich der Hemmung der Anhaftung durch den Extrakt mit der durch bekannte Substanzen
Aus den Ergebnissen in den Tabellen V und VI ist offensichtlich, dass der Moosbeerextrakt sowohl die durch Typ-1-Pili vermittelte Anhaftung von E. coli an Meerschweinchen-RBC als auch die durch P-Typ-Pili vermittelte Anhaftung hemmt. Da der Extrakt so gut wie keine freien monomeren oder dimeren Zucker enthält, kann die Hemmung jedes der beiden Typen der Anhaftung nicht auf derartige Zucker zurückgeführt werden. Interessanterweise vermutet man, dass die P-Typ-Anhaftung bei hohen Mengen von E. coli bei Harnwegsinfektionen stattfindet.
Der Extrakt verringerte ebenfalls die Anhaftung von P. aeruginosa an Blasenepithelzellen, trotz eines geringeren Grads als mit E. coli beobachtet. Es gab keine offensichtliche Wirkung auf das Anhaften verschiedener Lacfobacillus-Stämme an humane Blasenzellen.
Außerdem hafteten E. coli in Gegenwart des Extrakts nicht an Polystyrolkunststoff. Es sollte jedoch beachtet werden, dass E. coli, im Allgemeinen, nicht sehr zum Anhaften an Polystyrol neigen.
Beispiel 3
Vergleich von Extraktausbeuten unter Verwendung verschiedener Metallverbindungen im Schritt 104 (1):
420 g Moosbeeren wurden mit 420 ml angesäuertem Alkohol zerdrückt, und das Gemisch wurde über Nacht stehengelassen. Das Gemisch wurde zentrifugiert, der Überstand 1 abgetrennt und verworfen, und das feste Pellet 1 wurde mit weiteren 1200 ml angesäuertem Alkohol zerdrückt. Das zerdrückte Pelletgemisch 1 wurde zentrifugiert, der Überstand 2 verworfen und das Pellet 2 wiederum mit 1000 ml angesäuertem Alkohol (HCl/MeOH) zerdrückt. Das zerdrückte Pelletgemisch 2 wurde noch einmal zentrifugiert, und der Überstand 3 wurde mit den Überständen 1 und 2 vereinigt.
Die vereinigten Überstände wurden auf ein Volumen von 450 ml bei einem pH-Wert von etwa 1,7 eingeengt. Das Gemisch wurde in sechs Teile von jeweils etwa 75 ml aufgeteilt. Zu jedem der 75-ml-Teile wurden 20 ml 15 M NH₄OH zugesetzt, um die Lösung auf einen pH-Wert von etwa 8,5 bis 8,8 zu bringen. Die Einzelproben wurden dann jeweils mit 100 ml einer 1,1 M Lösung der folgenden vermischt: Zinkacetat, Zinksulfat, Calciumacetat, Bariumacetat, Kupfer(II)-acetat und Cobaltacetat. Die Proben wurden zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und jedes Pellet dreimal mit 100 ml 80% EtOH in Wasser bei jedem Mal gewaschen. Die Waschüberstände (Zucker enthaltend) wurden verworfen (Schritte 103, 106).
Als Nächstes wurden, zu jedem Pellet, 20 ml n-Butanol und eine ausreichende Menge an konzentrierter HCl, um den pH-Wert auf weniger als pH 2,5 zu reduzieren, zugegeben (Schritt 110), im Allgemeinen etwa 0,75 ml 12 N HCl mit bestimmten Ausnahmen wie in Tabelle VII angemerkt. Die mit Zinksulfat behandelte Probe lieferte ein relativ großes Pellet, zu welchem weitere 0,8 ml HCl hinzugefügt werden mussten, um eine ausreichende Löslichmachung des Pellets zu erzielen. Für die Bariumacetatprobe wurden zusätzliche 0,25 ml HCl benötigt, um das Pellet umzusetzen. Der pH-Wert aller Proben bewegte sich zwischen etwa 0,8 und 2,5.
Die sechs Proben wurden wiederum zentrifugiert und die Pellets verworfen. Der Butanolüberstand jeder der sechs Proben wurde einer Petroletherextraktion unterzogen (Schritt 112), mit einer ausreichenden Anzahl an Rückextraktionen mit Wasser, um im Wesentlichen die gesamte Rotfärbung von der organischen Phase auf die wässrige Phase zu übertragen. Die Ergebnisse der Petroletherextraktion für die sechs Proben (Schritt 112) sind in Tabelle VII zusammengefasst.
Die wässrige Schicht jeder Probe wurde anschließend 3-mal mit 50 ml EtAc extrahiert (Schritt 114). Die mit Zinkacetat behandelte Probe ergab etwa 150 ml einer orangeroten Ethylacetatphase. Die Zinksulfatprobe lieferte etwa 150 ml einer dunkelroten Lösung. Die Calciumacetatprobe brachte etwa 150 ml einer gelborangen Lösung hervor. Die Bariumacetatprobe lieferte etwa 150 ml einer hellgelben Lösung, während die Kupfer(II)-acetatprobe etwa 150 ml einer intensiv gelben Lösung ergab und die mit Cobalt behandelte Probe zu etwa 150 ml einer gelben Lösung führte.
Die abgetrennte EtAc-Phase jeder der Proben wurde bis zur Trockenheit eingeengt (außer der Zinksulfatprobe, welche nicht restlos trocken wurde), unter Bildung eines roten pulverförmigen Rückstands. Die gewonnene Masse der Trockenextrakte war wie folgt: Zinkacetat, 63 mg; Zinksulfat, 2980 mg; Calciumacetat, 31 mg; Bariumacetat, 113 mg; Kupfer(II)-acetat, 14 mg und Cobaltacetat, 26 mg.
Beispiel 4
Ein zweiter Vergleich der Ausbeute unter Verwendung verschiedener Metallverbindungen im Schritt 104 wurde auf dieselbe Weise wie für Beispiel 3 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII enthalten. Die Trockenmasse betrug: Zinkacetat, 46 mg; Nickelaceat, 14 mg; Magnesiumacetat, 17 mg; Natriumacetat, 18 mg und Ammoniumacetat, 1 mg.
Tabelle VII
Beispiel 5
8 zeigt ein Chromatogramm des flüssigen Ausgangsextrakts, der aus Schritt 102 resultiert, hergestellt aus Moosbeeren. Der flüssige Extrakt (der wässrige Überstand nach Entfernen des Alkohols) hatte ungefähr dasselbe Volumen wie das Ausgangsvolumen der Moosbeeren (siehe Beispiel 3). Dieses Chromatogramm unterscheidet sich von dem von 5A, 5B, 6A und 6B darin, dass eine andere Säulengröße, mit einer Packung der Partikelgröße 4 μm, mit einem etwas anderen Verfahren, verwendet wurde. Um dieses Chromatogramm zu erhalten, wurde eine analytische C18-Säule der Abmessungen 8 mm Durchmesser, 100 mm Länge und eines Volumens von 5 ml verwendet. Die auf die Masse des Materials in dem Extrakt bezogene Konzentration betrug etwa 200 mg pro ml (ermittelt von einem Aliquot des zur Trockne eingeengten flüssigen Extrakts). 50 μl einer Lösung von 200 mg/ml Lösung (Gesamtmasse 10 mg) wurden in die Säule injiziert, und eine Flussrate von 1 ml/min wurde verwendet. Unter diesen Bedingungen weisen die herausragendsten Elutionspeaks 802, 804, 806, die bei 360 nm absorbieren, Retentionszeiten von etwa 33, 36 bzw. 38 min auf.
Beispiel 6
9 stellt ein Chromatogramm des vom Schritt 116 resultierenden Moosbeerextrakts dar, eluiert durch das alternative Protokoll. auf einer präparativen C18-Säule (50 ml). In diesem Fall wurden 50 μl einer Lösung des Moosbeerextrakts von 50 mg pro ml auf die Säule injiziert (2,5 mg Gesamtmasse). Drei herausragende bei 360 nm absorbierende Peaks 902, 904, 906 sind auch in dem Chromatogramm von 9 zu sehen, wobei sie Retentionszeiten von etwa 34, 39 und 43 min haben. Es ist zu ersehen, dass sich die Retentionszeiten der bei 360 nm absorbierenden Peaks ziemlich von denen der Chromatogramme von 5 und 6 unterscheiden, welche auf präparativen Säulen von 25 mm Durchmesser, 100 mm Länge, 50 ml Volumen, ebenfalls mit Partikeln des Typs C18, erhalten wurden. Diese Peaks sind leicht von denen von 8 verschoben, um einen Wert, der mit der 5-min-Differenz im Timing des Gradienten zwischen der analytischen Säule von 8 und dem alternativen (verkürzten) Protokoll der präparativen Säule übereinstimmt.
Die folgende Berechnung liefert eine grobe Schätzung der relativen Anreicherung der bei 360 nm absorbierenden Verbindungen (Flavonoide) in dem Moosbeerextrakt. Die Fläche unter den bei 360 nm absorbierenden Peaks in 9 beträgt etwa 2,6 AU (Absorptionseinheiten), während die für die bei 360 nm absorbierenden Peaks in 8 etwa 0,12 AU beträgt. Dividiert man 2,6 durch 0,12 und multipliziert das Ergebnis mit 4, dem Faktor der Differenz der auf die Säule aufgebrachten Masse (4-mal so viel Material geladen für 8 wie für 9), ist zu ersehen, dass die Anreicherung der bei 360 nm absorbierenden Verbindungen in dem Moosbeerextrakt vom Schritt 116 gegenüber den Mengen in dem flüssigen Ausgangsextrakt etwa das 87fache beträgt. Aus der groben Berechnung und ähnlichen groben Schätzungen, angestellt bei anderen Proben, wird sichtbar, dass der Grad der Anreicherung von bei 360 nm absorbierenden Verbindungen (von denen man zur Zeit annimmt, dass sie Polyphenole sind) ähnlich dem Grad der Anreicherung an Anti-Anhaftungswirkung in dem Moosbeerextrakt ist.
Beispiel 7
11A–F sind Chromatogramme auf einer C18-Säule von ausgewählten Zubereitungen, einschließlich einiger aus Tabelle VIII. 11A ist ein Chromatogramm von Probe 18 in Tabelle VIII, welche eine 10%ige Lösung von OCEAN SPRAY-Pulver ist. 11B und 11C sind Chromatogramme der Wasserwäschen der C18-Säule vom Schritt 1000, die den Proben 19, 20 in Tabelle VIII entsprechen. 11D ist ein Chromatogramm des MeOH-Eluats vom Schritt 1000 (10), das die aktive Fraktion enthält und der Probe 21 in Tabelle VIII entspricht. In 11D kann man eine Gruppe von bei 360 nm absorbierenden Peaks 1100, die zwischen 30 und 42 Minuten eluieren, erkennen. Diese Peakgruppe ist in 11B oder 11C nicht feststellbar, und die relative Menge an Material, die in diesen Peaks eluiert, ist im Ausgangsmaterial viel geringer (11A). Eine Gruppe von bei 512 nm absorbierenden Elutionspeaks 1102, charakteristisch für Anthocyanine, ist außerdem in 11D zu erkennen.

11E ist ein Chromatogramm einer Probe, welche außerdem der Kationenchromatographie, Schritt 1008, unterzogen wird, der Probe 23 von Tabelle VIII entsprechend. Die Peaks 1100 sind noch in einer Größe ähnlich der von 11 vorhanden, aber die Peaks 1102 (die Anthocyanine) sind in der Größe erheblich reduziert. Zusätzlich ist eine Gruppe kleiner Peaks 1104, die bei etwa 23 bis etwa 27 min eluieren, nachweisbar. 11F ist ein Chromatogramm eines HCl-Eluats der Kationensäule, das der Probe 24 entspricht. Die Peaks 1102 sind in erheblicher Größe vorhanden, während die Peaks 1100 fast nicht da sind. Tabelle VIII Anti-Anhaftungswirkung von ausgewählten Produkten während der Herstellung des Extrakts

Probe	Normalisierte Wirkung
1. MAW-Ausgangsextrakt	14,9
2. – Präzipitat vom Ausgangsextrakt	1,2

3. Vor der EtAc-Extraktion (Schritt 110, Fig. 1)	5,7
4. Schritt 114, wässrige Phase	8,4 (16,8; 0,0)
5. Schritt 116 (eingeengte organische Phase)	33,8 (117,7; 0,0)
6. Ausgangsextrakt EtAcEt² 10 : 1 : 5	4,3
7. – Präzipitat vom Ausgangsextrakt	3,9
8. Ausgangsextrakt EtAcEt 5 : 1 : 10	0,0
9. – Präzipitat vom Ausgangsextrakt	7,7
10. EtAc-Ausgangsextrakt	3,3
11. – Präzipitat vom Ausgangsextrakt	6,4
12. Siedendes Wasser	6,1
13. – Präzipitat vom Ausgangsextrakt	5,3
14. – Produkt Schritt 1002	23,9
15. Unter Rückfluss erhitztes Wasser	4,1
16. – Präzipitat vom Ausgangsextrakt	6,6
17. – Produkt Schritt 1002	39,4
18. 10% Ocean Spray-Pulver	4,6
19. Verworfene Wäsche Schritt 1001	4,1
20. 2. verworfene Wäsche Schritt 1001	0,0
21. Produkt Schritt 1002	34,5
22. CHCl₃/EtAc-Extrakt von Produkt 1002	22,7

23. Produkt Schritt 1008A	45,1
24. HCl-Eluat Schritt 1008B	0,0
25. Methanol-Eluat Schritt 1008C	92,1

Der Vergleich der Werte des RBC-Versuchs und der Chromatogramme für die Proben von 11A–11F offenbart, dass das Vorhandensein einer wesentlichen Wirkung in dem RBC-Versuch positiv mit der Anwesenheit der Peaks 1100 korreliert.
Beispiel 8
Eine Probe des Produkts des Schrittes 1006 in dem Verfahren von 10 wurde der HPLC auf einer C18-Säule von 50 ml unterzogen (12). Die aufgezeigten Fraktionen 1200, 1202, 1204, 1206, 1208, 1210, 1212, 1214 wurden aufgefangen und in dem RBC-Versuch (Tabelle IX) bei den unterschiedlichen Elutionszeiten, dargestellt auf der x-Achse in Minuten, analysiert. Da die Fraktionen 1200–1208 erhebliche Werte der Wirkung umfassten, hat es den Anschein, dass der Extrakt vielfältige Verbindungen enthält, die zur Anti-Anhaftungswirkung beitragen. Aus den Daten wird ebenfalls sichtbar, dass Polyphenole zur Anti-Anhaftungswirkung des Extrakts beitragen. Polyphenole absorbieren stark UV-Wellenlängen (bei 230 nm und 280 nm). Die Fraktionen 1200, 1202 und 1204, welche wenig bei 360 nm absorbierendes Material enthalten, weisen wesentliche Elutionspeaks von bei 230 und 280 nm absorbierendem Material, in dem für Polyphenole erwarteten Wellenlängenbereich, auf. Es ist bekannt, dass Polyphenole auf lipophilen Säulen ähnlich den C18-Säulen zurückgehalten werden können. Daher könnte man erwarten, dass ein durch das Verfahren hergestellter Extrakt Polyphenole einschließt. Tabelle IX Vergleich der Wirkung in ausgewählten HPLC-Fraktionen

Probe Normalisierte Aktivität

1200 10,5

1202 25,1

1204 37,8

1206 45,1

1208 41,6

1210 0,0

1212 0,0

1214 0,0
Die Erfindung wird mit Verweis. auf spezielle Ausführungsformen, Pflanzenarten und -teile, Puffer und chemische Verfahren und dergleichen beschrieben. Es wird jedoch durch Fachleute erkannt werden, dass unterschiedliche chemische Substitutionen gemacht werden können, ohne von dem Wesen und Umfang der Erfindung abzuweichen.

Claims

Extrakt aus Pflanzenmaterial einer Pflanze der Gattung Vaccinium, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem Extrakt monomere und dimere Zucker, Säuren und Anthocyanine aus dem Pflanzenmaterial entfernt sind, wobei der Extrakt angereichert ist an einer Fraktion mit bakterieller Anti-Anhaftungswirkung.
Verfahren zum Herstellen des Extrakts nach Anspruch 1 mit einer angereicherten aktiven Fraktion, die das Anhaften von Mikroben an Zelloberflächen hemmt, umfassend: – mit einer ersten wässrigen Lösung Mischen eines Pflanzenmaterials einer Pflanze der Gattung Vaccinium, das eine ihm eigene aktive Fraktion umfassend polyphenolische Verbindungen mit Anti-Anhaftungswirkung besitzt; – Fraktionieren der Mischung auf einer Säule durch Waschen mit einer zweiten wässrigen Lösung; – Eluieren der Säule mit einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel; und – Abtrennen und Identifizieren eines der Eluate als im Wesentlichen die Fraktion mit Anti-Anhaftungswirkung umfassend.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Säule eine Kationen-Austauschersäule ist, und wobei das Verfahren ferner umfasst: Das Eluieren der Kationen-Austauschersäule mit einer sauren wässrigen Lösung vor dem Eluieren der Kationen-Austauschersäule mit einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Säule eine lipophile Säule ist.
Verfahren nach Anspruch 2, ferner umfassend – Verarbeiten des Pflanzenmaterials, um ein Homogenat des Pflanzenmaterials herzustellen; – Einstellen des pH der ersten wässrigen Lösung durch Hinzugeben einer ausreichenden Menge einer Base zu der ersten wässrigen Lö sung, um das Homogenat auf einen pH größer als 10 zu bringen und um das Ionisiertwerden von Phenolgruppen polyphenolischer Verbindungen zu Phenoxid-Ionen zu verursachen, so dass das Hinzufügen ein alkalinisiertes Homogenat erzeugt; – zu dem alkalisch gemachten Homogenat Hinzugeben einer ausreichenden Menge eines Alkohols, um ein Präzipitat aus den polyphenolischen Verbindungen mit Phenoxid-Ionen herzustellen, und Abtrennen des Präzipitats; – Wiederauflösen des Präzipitats in wasserhaltiger Lösung; – Ansäuern der Lösung; und dann – Fraktionieren der Lösung als der Mischung auf der Säule.
Pflanzenextrakt aus einer Vaccinium-Pflanzenart mit einer angereicherten Fraktion, die das Anhaften von Bakterien an eine Oberfläche hemmt, erhältlich durch ein Verfahren umfassend: – Bereitstellen eines Homogenats eines Pflanzenmaterials einer Pflanze der Gattung Vaccinium, das eine ihm eigene aktive Fraktion umfassend polyphenolische Verbindungen mit Anti-Anhaftungswirkung besitzt; – zu dem Homogenat Hinzugeben einer ausreichenden Menge einer Base, um das Homogenat alkalisch zu machen auf einen pH-Wert größer als etwa pH 10, und um das Ionisiertwerden von Phenolgruppen der polyphenolischen Verbindungen zu Phenoxid-Ionen zu verursachen; – Entfernen monomerer und dimerer Zucker, Säuren und Anthocyanine aus dem Homogenat; und – zu dem alkalisch gemachten Homogenat Hinzugeben einer ausreichenden Menge eines organischen Lösungsmittels, um ein Präzipitat aus den polyphenolischen Verbindungen mit Phenoxid-Ionen herzustellen, und Abtrennen des Präzipitats.
Pflanzenextrakt nach Anspruch 6, wobei das Verfahren ferner umfasst: – Fraktionieren des Präzipitats auf einer lipophilen Säule durch Elution mit einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel, und – Abtrennen und Identifizieren eines der Eluate als im Wesentlichen die Fraktion mit Antianhaftungswirkung umfassend.
Zusammensetzung, umfassend: – einen Extrakt nach einem der Ansprüche 1 oder 6 in einer wirksamen Menge, um in die bakterielle Anhaftung an einer Oberfläche einzugreifen; und – einen geeigneten Träger.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei die Oberfläche eine biologische Oberfläche ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, die ein orales Hygieneprodukt ist und wobei der Träger ein topischer Träger ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zahnpasta und -pulver, Gelbasis-Zusammensetzungen, wässrigen Lösungen, zum oralen Spülen oder Gurgeln geeignete wässrig-alkoholische Lösungen, Zahnseide, künstlicher Speichel und Kaugummi.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei der Träger eine Tablette enthält und wobei die Zusammensetzung in einer Menge von zwischen etwa 0,5 mg und etwa 500 mg vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei der geeignete Träger verträglich ist mit genitalen und cervikalen Schleimhautgeweben und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Duschen (douches), Zäpfchenformulierungen, Cremes und Gelen.
Verwendung eines Extrakts nach einem der Ansprüche 1 oder 6 zum Herstellen eines Medikaments zur topischen Applikation auf ein Körpergewebe in einer ausreichenden Menge, um in die mikrobielle Anhaftung an das Körpergewebe einzugreifen.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Körpergewebe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zahnfleisch, Zahnoberflächen, Mundhöhlen- Schleimhautgeweben, Rachen-Schleimhautgeweben, genitalen Schleimhautgeweben und cervikalen Oberflächengeweben.
Verwendung eines Extrakts nach Anspruch 1 oder 6 zum Herstellen eines Medikaments zur oralen Verabreichung in einer ausreichenden Menge, um in das bakterielle Anhaften an Harntrakt-Geweben einzugreifen.
Extrakt aus einem Pflanzenmaterial einer Pflanze der Gattung Vaccinium, dadurch gekennzeichnet, dass der Extrakt angereichert ist an einer Fraktion mit bakterieller Anti-Anhaftungswirkung, und ferner gekennzeichnet ist dadurch, dass monomere und dimere Zucker, Säuren und Anthocyanine aus dem Extrakt entfernt sind, und wobei der Extrakt angereichert ist im Gehalt an Flavonoiden und Polyphenolen.