DE69511257T2

DE69511257T2 - Oxydativ reinigung von taxol und cephalomannine enthaltende biomasseauszüge mit hilfe von ozon und girard reagens

Info

Publication number: DE69511257T2
Application number: DE69511257T
Authority: DE
Inventors: Dominick Anziano; Jeffrey Beckvermit; Christopher Murray
Original assignee: Hauser Chemical Research Inc
Current assignee: Hauser Chemical Research Inc
Priority date: 1994-04-08
Filing date: 1995-03-30
Publication date: 2000-02-17
Anticipated expiration: 2015-03-31
Also published as: EP0755387A1; EP0755387B1; DE69511257D1; CA2187337A1; WO1995027707A1; AU2234295A; US5364947A

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft die Abtrennung von Cephalomannin und Verwandten, mit Ozon oxidierbare Verbindungen aus Taxol und anderen Taxanen in Extrakten von Biomasse, die eine komplexe Mischung von Verbindungen enthalten. Spezieller betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Vereinfachung der Isolierung und Reinigung von Taxol.

Ausgangssituation

Extrakte von Taxus-Spezies und Zellkulturen von Taxus enthalten Taxol, ein vielversprechendes chemotherapeutisches Mittel, das vor kurzem von der "Food and Drug Administration" für die Behandlung von therapierefraktären Ovarialcarzinom. Gegenwärtig wird Taxol im großen Maßstab lediglich aus der Borke von Taxus brevifolia isoliert. Potentiell läßt sich Taxol jedoch kommerziell im großen Maßstab aus anderen Teilen von Taxus und auch aus Zellkultur von Taxus isolieren. Das Verfahren zur Isolation von Taxol aus einer beliebigen natürlichen Quelle ist kompliziert. Ein besonders schwieriger und aufwendiger Teil der Isolation von Taxol ist die Abtrennung der eng verwandten Diterpenoid-Verbindung "Cephalomannin". Die Strukturen und die chemischen Eigenschaften von Taxol und Cephalomannin sind ähnlich. Der einzige strukturelle Unterschied zwischen den zwei Verbindungen betrifft den Seitenkettenabschnitt des Moleküls (siehe in Fig. 1 "1" und "2"). Die Abtrennung von Taxol aus Cephalomannin ist sehr schwierig, sie kann jedoch auf verschiedenen Wegen der Chromatographie erfolgen. Dieses ist ein aufwendiger Prozeß, wenn er im kommerziellen Maßstab ausgeführt wird.
Ein Verfahren zur Modifikation der Seitenkette von Cephalomannin in Gegenwart von Taxol im gereinigten und/oder teilweise gereinigten Taxan-Mischungen ist von Kingston im "Journal of Natural Products", Bd. 55, Nr. 2, S. 259 ... 261 (Februar 1992) beschrieben worden, worauf hiermit Bezug genommen wird. In der teilweise gereinigten Mischung waren Taxol und Cephalomannin in einer Gesamtmenge von etwa 80 Gewichtsprozent vorhanden. Die selektive Oxidation der Tiglat-Gruppe von Cephalomannin unter Verwendung von Osmiumtetroxid unter stöchiometrischen oder katalytischen Bedingungen (Methode nach Kingston) lieferte ein Diol (Verbindung 3) und beeinflußte die Struktur von Taxol nicht. Das Diol wurde aus dem Reaktionsgemisch durch Silicagel-Chromatographie abgetrennt, wie in Fig. 2 und 3 hierin gezeigt wird.
Wie nachfolgend detaillierter ausgeführt wird, ist der Prozeß nach Kingston nicht zur Verwendung mit nichtgereinigten Taxan-Mischungen geeignet. Wie in unseren Laboratorien demonstriert wurde, ist die durch Osmiumtetroxid katalysierte Oxidation von Cephalomannin nicht zugänglich für nichtreine Extrakte aus Biomasse, die Taxol enthalten, was auf die strengen Reaktionsbedingungen zurückzuführen ist (Reinheit von Substraten, wasserfreie Reagenzien, Lösemittel usw.) ist, die für eine gute Überführung erforderlich sind. Die Verwendung von Osmiumtetroxid bei der Massenherstellung eines Pharmazeutikums ist wegen der starken Toxizität von Osmiumtetroxid und anderer Osmium enthaltender Verbindungen ebenfalls unerwünscht.
Bisher hat es kein Verfahren für eine billige, einfache, sichere und wirksame Abtrennung von Cephalomannin aus Taxol mit einer großen Reihe von Verunreinigungen gegeben.
Die US-P-5 334 732 beschreibt ein Verfahren zum Oxidieren von Cephalomannin und verwandten Verbindungen in Gegenwart von Taxol. Das Verfahren umfaßt die Verwendung von Ozon zum Oxidieren von Cephalomannin und verwandter, leicht oxidierbarer Verbindungen, während das Taxol gleichzeitig weitgehend unverändert bleibt. Taxol kann sodann aus dem oxidierten Cephalomannin und anderen oxidierten Verbindungen unter Anwendung konventioneller Prozeduren, wie beispielsweise der Chromatographie, abgetrennt werden.

Offenbarung der Erfindung

Nach der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Abtrennung von Cepahlomannin und verwandter Verbindungen von Taxol und anderen nichtreaktionsfähigen Verbindungen offenbart. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einer solchen Weise ausgeführt werden, daß kein wesentlicher Verlust von Taxol resultiert.
Nach der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Abtrennung von Cephalomannin aus einer Mischung gewährt, die Cephalomannin und Taxol in einer Lösung enthält, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
(a) Kontaktieren des Gemisches mit Ozon, wodurch das Cephalomannin unter Erzeugung von oxidiertem Cephalomannin oxidiert wird;
(b) Überführen des oxidierten Cephalomannins in ein wasserlösliches Hydrazon; sowie
(c) Abtrennen des wasserlöslichen Hydrazons von diesem Gemisch, wobei das Gemisch aufbereitet wird durch Auflösen eines getrockneten Biomasse-Extraktes in einem Lösemittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenwasserstoffen, halogenierten Lösemitteln, Alkoholen, Ethern, Aldehyden, Ketonen, Aminen, organischen Säuren, Derivaten von organischen Säuren, Estern, Wasser und Mischungen davon.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist für Mischungen von reinem Taxol, Cephalomannin und anderen Taxanen oder für Rohextrakte von Biomasse wirksam, die sehr geringe Mengen dieser Verbindungen gemeinsam mit anderen extraktionsfähigen Verbindungen enthalten.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Cephalomannin und andere verwandte Verbindungen chemisch in Gegenwart von Taxol und anderen nichtreaktionsfähigen Verbindungen durch Behandlung der Mischung dieser Verbindungen mit Ozon modifiziert. Ozon reagiert mit Cephalomannin und verwandten Verbindungen unter Erzeugung oxidierter Verbindungen, wobei weitgehend das gesamte Taxol unverändert bleibt. In der Natur auftretende und oxidierte Verbindungen, die reaktionsfähige Carbonyl-funktionelle Gruppen enthalten, werden selektiv in wasserlösliche Hydrazone überführt und danach vom Taxol und anderen Taxanen nach verschiedenen Verfahren abgetrennt, die keine aufwendigen und unwirksamen chromatographischen Schritte erfordern.
Wie hierin beschrieben wird, umfaßt das Verfahren die Abtrennung dreier Arten von Verbindungen: (a) Taxol und andere nichtreaktionsfähige Verbindungen, die abgetrennt werden von (b) Cephalomannin und verwandten Verbindungen, und/oder (c) anderen in der Natur auftretenden Verbindungen, die reaktionsfähige Carbonyl-Gruppen enthalten.
Der hierin verwendete Begriff "andere nichtreaktionsfähige Verbindungen" schließt Taxane und Verbindungen ein, die nicht ohne weiteres durch Ozon in dem erfindungsgemäßen Verfahren oxidiert werden und nicht zu Hydraziden oder Hydrazinen in dem erfindungsgemäßen Verfahren reaktionsfähig sind.
Der hierin verwendete Begriff "verwandte Verbindungen" bezieht sich auf das Verfahren der vorliegenden Erfindung und schließt Taxane und andere Verbindungen ein, die durch Ozon leicht oxidierbare Olefin-funktionelle Gruppen enthalten, z. B. eine Olefin-Gruppe, die an dem einen Ende der Doppelbindung nichtsubstituiert ist. Olefine, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren überraschenderweise nicht reaktionsfähig sind, schließen solche mit vier Hauptsubstituenten ein (siehe Fig. 1, Kohlenstoffe 11 und 12, z. B.).
Der hierin verwendete Begriff "reaktionsfähige Carbonyl-Verbindung" schließt Ketone und Aldehyde ein, die zu Hydraziden und Hydrazinen in dem erfindungsgemäßen Verfahren reaktionsfähig sind. Per Definition werden reaktionsfähige Carbonyl-Verbindungen vom Taxol und anderen nichtreaktionsfähigen Taxanen in Mischungen unabhängig davon getrennt, ob Cephalomannin in der Mischung vorhanden ist oder nicht.
Das Verfahren zur Abtrennung von Cephalomannin und verwandten Verbindungen vom Taxol und anderen nichtreaktionsfähigen Verbindungen erfordert drei Schritte. Der erste Schritt ist eine Ozon-Oxidation, die lediglich die Auflösung des Materials erfordert (unabhängig von der Reinheit des Taxols, des Cephalomannins und anderer Taxane) sowie einen Ozon-Erzeuger, der zur Erzeugung von 1 ... 10 Prozent Ozon in einem Sauerstoff- oder Luftstrom in der Lage ist. Das Ozon wird durch die flüssige Mischung für die benötigte Zeit geperlt und die Mischung danach mit einem inerten Gas gespült. Der zweite Schritt ist die Umwandlung der oxidierten Verbindungen, die reaktionsfähige Keton- oder Aldehyd-funktionelle Gruppe enthalten, einschließlich das oxidierte Cephalomannin, zu wasserlöslichen Hydrazonen. Die bevorzugten wasserlöslichen Hydrazone sind die Girard- Hydrazone und sind für andere Abtrennungen verwendet worden, einschließlich die Abtrennung von Ketosteroiden von Nichtketosteroiden entsprechend der Beschreibung von D. A. Forss, Nature, Bd. 173, S. 401 ... 402 (1954), worauf hiermit Bezug genommen wird. Die Verwendung von Girard-Reagenzien für die Isolation und Reinigung von Taxanen ist bisher noch nicht veröffentlicht worden. Der dritte Schritt ist die Abtrennung der wasserlöslichen Hydrazone des oxidierten Cephalomannins und verwandter Verbindungen von Taxol und anderen Taxanen auf der Grundlage der unterschiedlichen Löslichkeiten und Polaritäten dieser Materialien. Hierin werden zur Abtrennung zwei spezielle Methoden berichtet, die keine leistungsschwache Chromatographie benötigen. Die drei Schritte des erfindungsgemäßen Prozesses sind in Fig. 4 zusammengefaßt. Die Strukturen der zwei am häufigsten verwendeten Girard-Reagenzien sind in Fig. 5 gezeigt.
Der Ozonolyse-Prozeß zur selektiven Oxidation von Cephalomannin und verwandten Verbindungen in Gegenwart von Taxol und anderen Taxanen führt zu vielen neuen oxidierten Verbindungen in zum Teil reinen und unreinen Mischungen von Taxanen. Taxusin 4 und Brevifoliol 5 (siehe Fig. 6) sind zwei Verbindungen, die beispielsweise häufig in Biomasse von Taxus brevifolia angetroffen werden, die sehr wahrscheinlich gemeinsam mit Cephalomannin oxidiert werden. Die Oxidation erfolgt vorzugsweise an den Olefin-funktionellen Gruppen, die in Fig. 6 mit gestrichelten Linien gekennzeichnet sind. Das durch den fettgedruckten Pfeil gekennzeichnete tetra-substituierte Olefin in den jeweiligen Strukturen von Fig. 6 ist sehr viel weniger reaktionsfähig als die weniger substituierten Olefine. Unter den hierin dargestellten Bedingungen bleibt das tetra-substituierte Olefin im Verlaufe des erfindungsgemäßen Oxidationsprozesses weitgehend unverändert. Andere, für die Ozon-Oxidation anfällige Taxane verfügen über funktionelle Gruppen, die ähnlich derjenigen sind, wie sie durch die gestrichelten Linien in Fig. 6 dargestellt werden. Die hohe Selektivität des Prozesses der Ozon- Oxidation für spezielle Taxane in nichtreinen und zum Teil reinen Mischungen ist unerwartet und kann den Reinigungsprozeß von Taxol, wie er hierin beschrieben wird, stark vereinfachen.
Der erste Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens, d. h. die Ozonolyse von Cephalomannin und verwandten Verbindungen in Gegenwart von Taxol und anderen Taxanen, ist wirkungsgradgünstig. Bei sehr reinen Mischungen von Cephalomannin und Taxol werden zwischen 1 und 10 val, ohne darauf beschränkt zu sein, Ozon bei Raumtemperatur für die vollständige Oxidation des Cephalomannins benötigt, was zu keinem wesentlichen Verlust von irgendwelchem Taxol führt. Bei nichtreinen Mischungen von Taxol, Cephalomannin und anderen Verbindungen hängt die Dauer der Ozon-Behandlung von der Konzentration der Verunreinigungen ab, die mit Ozon reagieren. Die Umwandlung der funktionellen Gruppe bei Cephalomannin vom Ozonolyse-Oxidationsschritt ist in Fig. 7 gezeigt.
Der zweite Schritt des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, d. h. die Umwandlung von oxidiertem Cephalomannin und verwandten Verbindungen zu Girard-Hydrazonen in Gegenwart von Taxol und anderen Taxanen ist ebenfalls wirkungsgradgünstig. Bei sehr reinen Mischungen von oxidiertem Cephalomannin und Taxol sind zwischen 1 und 10 val, ohne darauf beschränkt zu sein, Girard-Reagenz bei 50ºC zur vollständigen Umwandlung des oxidierten Cephalomannins zu dem Hydrazon-Derivat erforderlich. Die Umwandlung führt zu keinem wesentlichen Verlust von irgendwelchem Taxol. Die Hydrazon-Bildung ist bei bestimmten Ketonen in der Taxan- Reihe von Verbindungen sehr selektiv. Beispielsweise ist das Keton bei C-9 (siehe Fig. 1 und Fig. 8) in dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht reaktionsfähig. Dafür ist es offensichtlich zu stark gehindert. Die erforderliche Menge von Girard-Reagenz, um das oxidierte Cephalomannin vollständig umzuwandeln, hängt von der Konzentration der anderen reaktionsfähigen Verbindungen (Verunreinigungen) ab. Die Umwandlung der funktionellen Gruppe bei oxidiertem Cephalomannin (von Ozon) für die Hydrazon-Bildung ist in Fig. 8 gezeigt.
Der dritte Schritt des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, d. h. die Abtrennung der Hydrazone des oxidierten Cephalomannins und verwandter Verbindungen von Taxol und anderen Taxanen, ist ebenfalls wirkungsgradgünstig. Bei sehr reinen Mischungen von Taxol und dem Girard-Hydrazon von oxidiertem Cephalomannin führt die selektive Ausfällung oder Flüssig/Flüssig-Extraktion zur Isolation von Taxol mit hohem Rückgewinnung. Bei nichtreinen Mischungen von Taxol, Girard-Hydrazonen von oxidiertem Cephalomannin und verwandten Verbindungen erfolgt die Abtrennung gleichermaßen gut, wobei jedoch größere Volumina Lösemittel und Prozesse, wie beispielsweise kontinuierliche Flüssig/Flüssig-Extraktion für einen hohen Rückgewinnung von Taxol erforderlich werden können.
Die drei Schritte des hierin beschriebenen Verfahrens erfolgen schonend. Die Behandlungsdauer zur vollständigen Oxidation von Cephalomannin und verwandten Verbindungen kann ohne wesentlichen Verlust von Taxol zur Oxidation schonend aufrecht erhalten werden. Wiederum hängt die Dauer der Ozon-Behandlung von der Konzentration von Verunreinigungen ab. Die Behandlungsdauer für die vollständige Umwandlung von oxidiertem Cephalomannin und verwandten Verbindungen zu Girard-Hydrazonen kann ohne wesentlichen Verlust von Taxol schonend aufrecht erhalten werden. Die Menge des zugesetzten Girard-Reagenz hängt von der Konzentration reaktionsfähiger Verunreinigungen ab. Die Abtren nung der wasserlöslichen Girard-Hydrazone des Cephalomannins und verwandter Verbindungen von Taxol und anderen Taxanen unter Anwendung von Flüssig/Flüssig-Extraktion oder selektiver Ausfällung bietet eine außerordentlich schonende Alternative zur Chromatographie.
Das Abtrennungsverfahren der vorliegenden Erfindung hängt nicht von dem Verhältnis von Cephalomannin und verwandter Verbindung zu Taxol und Taxanen ab. Beispielsweise beträgt das Verhältnis von Cephalomannin zu Taxol in den Rohextrakten von Taxus brevifolia entsprechend der Bestimmung mit Hilfe der Hochleistungschromatographie (HPLC)(mit dem bei 227 nm eingestellten UV-Detektor) näherungsweise 0,2. Andere Arten von Biomasse haben schwankende Verhältnisse von Taxol und Cephalomannin. Das erfindungsgemäße Verfahren ist bei Mischungen der zwei Verbindungen bei oder unterhalb des Verhältnisses des Rohextraktes von Taxus brevifolia-Borke und bei Verhältnissen bis zu 7,35 (Cephalomannin/Taxol) effektiv gewesen.
Die Oxidation via Ozon bietet viele Vorteile bei Reinigungsaufgaben gegenüber den Oxidationsverfahren unter Einsatz anderer chemischer Oxidationsmittel (z. B. Wasserstoffperoxid, Perchlorsäure, Natriumperiodat, Kaliumpermanganat, Natriumhypochlorit, Osmiumtetroxid und Peressigsäure). Die Oxidation unter Verwendung von Ozon ist schneller, selektiver bei Cephalomannin in Gegenwart von Taxol, vollständiger bei kurzen Reaktionszeiten (Minuten) und weniger toxisch als die anderen aufgeführten Oxidationsmittel. Darüber hinaus ist die Ozon-Oxidation für die Behandlung sehr unreinen Mischungen von Taxol und anderer nichtreaktionsfähiger Verbindung und Cephalomannin und verwandter Verbindungen zugänglich als das bei anderen Oxidationsmitteln der Fall ist. Für die kommerzielle Reinigung von Taxol ist auch die Tatsache sehr wichtig, daß Ozon an einer sehr frühen Stelle im Reinigungsprozeß eingeführt werden kann, während dies bei Verwendung von Osmiumtetraoxid nicht möglich ist.
Das gesamte Abtrennungsverfahren der vorliegenden Erfindung zeigt zahlreiche Vorteile gegenüber alternativen Verfahren, bei denen Chromatographie benötigt wird. Chromatographie (normale oder Umkehrphasenchromatographie) ist bei einem kommerziellen Verfahren sehr aufwendig. Die erforderliche Apparatur ist hochspezialisiert und umfangreich. Das Material in fester Phase ist kostspielig und erfordert nach Gebrauch eine Reinigung und/oder Verbringung. Chromatographische Verfahren erfordern eine Fraktionierung des Eluierungsmittels, die zeitaufwendig ist und eine Fraktionsanalyse einschließt. Lösemittelsysteme und Lösemittelaufbereitung sind oftmals komplizierter als bei homogeneren Lösemitteln und Rückführströmen, wie beispielsweise bei denen eines Flüssig/Flüssig-Extraktionsprozesses. Generell ist ein Verfahren, bei dem keine Chromatographie benötigt wird, wirkungsgradgünstiger und dementsprechend weniger aufwendig als eine Verfahren, das Chromatographie erforderlich macht.
Hinsichtlich der Reinigung schließt das hierin offenbarte Verfahren ein: selektive Ozon-Oxidation; Umwandlung der oxidierten Taxane zu wasserlöslichen Hydrazonen; sowie Abtrennung der Hydrazone von anderen Verbindungen; eine bessere Gesamtselektivität und Brauchbarkeit als die vom Kingston-Prozeß gezeigte bei gleichzeitiger Vermeidung der Kosten und der Probleme der Toxizität.
Weitere Vorteile des Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden anhand der detaillierten Beschreibung offensichtlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Das Verfahren wird unter Bezugnahme der beigefügten Zeichnungen detaillierter beschrieben, worin sind:
Fig. 1 ein Vergleich der Struktur von Taxol und Cephalomannin;
Fig. 2 Reaktionsschema von Cephalomannin mit Osmiumtetroxid in Gegenwart von Taxol;
Fig. 3 ein Fließschema zur Abtrennung von Taxol und Cephalomannin unter Anwendung von Osmiumtetroxid und Silicagel-Chromatographie;
Fig. 4 ein Fließschema zur Abtrennung von Taxol und Cephalomannin unter Anwendung von Ozon, gefolgt von einer Behandlung mit Girard-Hydrazid und einem Trennverfahren;
Fig. 5 die Struktur der Girard T- und Girard P- Reagenzien;
Fig. 6 die funktionelle Gruppen-Selektivität von Ozon mit verschiedenen Taxanen;
Fig. 7 die Reaktion von Cephalomannin und Ozon;
Fig. 8 die Reaktion von oxidiertem Cephalomannin (aus der Ozonolyse) und Girard T-Hydrazid;
Fig. 9 einen Vergleich der chemischen Oxidation durch Ozon und Osmiumtetroxid.

Beste Ausführungsform der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein selektives Hochleistungsverfahren für die Abtrennung von Cephalomannin und verwandten Verbindungen von Taxol und anderen nichtreaktionsfähigen Verbindungen in nicht gereinigten, zum Teil gereinigten und gereinigten Mischungen. Die Trennverfahren der vorliegenden Erfindung erfordern keine Normalphasenchromatographie oder Umkehrphasenchromatographie. Der Kingston-Prozeß macht eine Chromatographie für die Abtrennung von Taxol und Cephalomannin erforderlich. Chromatographie ist sehr viel aufwendiger und weniger wirksam als die Verfahren, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben werden, speziell im großtechnischen Maßstab. Diese und andere Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber dem Kingston-Prozeß werden nachfolgend im Detail beschrieben.
Der vorstehend genannte Kingston-Prozeß wurde mit gereinigten und teilweise gereinigten Taxan-Mischungen ausgeführt, die Cephalomannin und Taxol enthielten (siehe Fig. 2). Die angegebene teilweise gereinigte Mischung wurde zu 80 Gewichtsprozent für Taxol plus Cephalomannin berechnet. Es gibt keine Angaben über die Brauchbarkeit dieses Prozesses bei Mischungen mit Verunreinigungen unterhalb der Konzentration von 80 Gewichtsprozent. Daher wurde der Kingston-Prozeß nicht im Zusammenhang auf seine Wirksamkeit bei einem Ausgangsmaterial bewertet, das sehr unrein ist, beispielsweise Mischungen, die weniger als 1 Gewichtsprozent Taxol und weniger als 1 Gewichtsprozent Cephalomannin enthalten. Der Kingston-Prozeß und das Verfahren der vorliegenden Erfindung sind in Fig. 3 bzw. Fig. 4 zusammengestellt.
In unseren Laboratorien wurde der Kingston-Prozeß unter Verwendung von gereinigtem Cephalomannin wiederholt (90 Gewichtsprozent Cephalomannin, kein Taxol), um die Nützlichkeit dieses Prozesses für Mischungen von Taxanen mit hoher Reinheit zu bestätigen. Der Versuch wurde an 214 mg Cephalomannin (kein Taxol) unter Anwendung der von Kingston veröffentlichten Methode ausgeführt. Das isolierte Produkt von 114 mg Cephalomannindiol (57% Ausbeute) wurde mit Hilfe spektroskopischer Methoden ausgewertet, wobei die Daten mit den von Kingston veröffentlichten Daten gut übereinstimmten. Danach wurde der Kingston-Prozeß an einer getrockneten, nicht gereinigten Probe von 505 mg Taxanen ausgeführt, die 0,21 Gewichtsprozent Taxol und 0,058 Gewichtsprozent Cephalomannin (Bestimmung anhand der HPLC) enthielten. Es wurden mehrere Portionen von überschüssigem Osmiumtetroxid benötigt, um das Cephalomannin in der Rohmischung vollständig zu oxidieren. Insgesamt wurden näherungsweise 2.000 val Osmiumtetroxid in bezug auf Cephalomannin zugesetzt. Die Reaktion benötigte 8 Tage, wobei die resultierende Rohmischung sehr dick und schwer zu handhaben war. Wegen der sehr schwierigen Handhabung der Mischung war keine Abtrennung des oxidierten Cephalomannins und Taxols möglich.
Die zahlreichen negativen Merkmale des stöchiometrischen Kingston-Prozesses zur selektiven Oxidation von Cephalomannin in Gegenwart von Taxol bei Anwendung von sehr unreinen Mischungen von Taxanen schließen ein: die sehr lange Zeitdauer, die zur vollständigen Oxidation von Cephalomannin benötigt wird; das sehr hohe Verhältnis von Osmiumtetroxid zu Cephalomannin, das zur vollständigen Oxidation erforderlich ist (der Prozeß ist nicht wirtschaftlich - das Osmiumtetroxid ist als Reagenz sehr kost spielig mit 76 USD/Gramm von einem allgemein bekannten kommerziellen Zulieferer im Jahr 1993); die für das toxische Osmiumtetroxid-Reagenz erforderliche extrem behutsame Handhabung und der toxische Abfall im Zusammenhang mit dem Prozeß; sowie die Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der Handhabung sehr dicker Reaktionsgemische wegen der hohen Konzentration von toxischem Übergangsmetall und Übergangsmetallsalzen in der Mischung. Die Chromatographie dieser dicker Reaktionsgemische, ein entscheidender Schritt für den Kingston-Prozeß ist sehr schwierig.
In der Veröffentlichung von Kingston wird auch ein katalytische Verfahren zur Oxidation von Cephalomannin in Gegenwart von Taxol beschrieben. Das katalytische Verfahren wurde offensichtlich von Kingston als eine Möglichkeit zur Verringerung der Kosten und der Toxizitätprobleme im Zusammenhang mit Osmiumtetroxid angegeben. Das katalytische Verfahren wurde unter Verwendung von gereinigtem Cephalomannin (90 Gewichtsprozent Cephalomannin, kein Taxol) wiederholt, um die Nützlichkeit dieses Prozesses für gereinigte Mischungen von Taxanen zu bestätigen. Der Versuch wurde an 5,9 mg Cephalomannin (90 Gewichtsprozent) bei 0ºC in Azeton als Lösemittel ausgeführt, um eine Mischung zu erhalten, die das zu erwartende Diol enthielt, was mit Hilfe eines HPLC-Vergleichs mit einem Standard des Diols ermittelt wurde, das auf stöchiometrischem Weg zubereitet wurde. Sodann wurde der Kingston-Prozeß an einer getrockneten Probe von 1,4 g nichtreiner Taxane ausgeführt, die 0,21 Gewichtsprozent Taxol und 0,058 Gewichtsprozent Cephalomannin enthielten (Bestimmung mit Hilfe der HPLC). Die Taxan-Probe war nicht vollständig löslich in dem Azeton- Lösemittelsystem, auch nicht bei Beschallung. Die Zugabe des Katalysatorsystem, gefolgt von einem Rühren, ergab keine Abnahme der Cephalomannin-Menge in der Mischung auch nicht nach mehreren Tagen Reaktionsdauer. Das negative Merkmal des Prozesses zur katalytischen Osmiumtetraoxid- Oxidation von Cephalomannin in Gegenwart von Taxol nach der Beschreibung von Kingston besteht daher darin, daß er bei weniger reinen Mischungen von Taxanen nicht funktioniert.
Die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren in drei Schritten. Der erste Schritt schließt das Kontaktieren einer Mischung von Cephalomannin und Taxol enthaltenden Taxanen mit Ozon in stöchiometrischen Mengen ein (siehe Fig. 4 und 7). Der zweite Schritt umfaßt die selektive Überführung des oxidierten Cephalomannins und anderer oxidierter verwandter Verbindungen zu wasserlöslichen Hydrazonen in Gegenwart von Taxol. Die bevorzugten wasserlöslichen Hydrazone sind Girard T- oder Girard P-Hydrazone. Der dritte Schritt schließt die Abtrennung der wasserlöslichen, oxidierten Taxanhydrazone von Taxol und arideren nicht reaktionsfähigen Verbindungen durch selektives Ausfällen, Flüssig/Flüssig- Extraktion oder andere Verfahren ein.
Die vorliegende Erfindung ist wirksam für die Abtrennung von anfälligen Taxanen als sehr reine einzelne Verbindungen oder in sehr reinen Mischungen. Proben von reinem Cephalomannin oder einer 50 : 50-Mischung von reinem Taxol und reinem Cephalomannin gehen beispielsweise gut. Darüber hinaus ist die vorliegende Erfindung auch wirksam für die Abtrennung von anfälligen Taxanen in sehr unreinen Mischungen von Taxanen. Die Rohextrakte von Biomasse eignen sich beispielsweise ebenfalls sehr gut. Der Kingston-Prozeß hat sich lediglich als nützlich bei gereinigten oder teilweise gereinigten Mischungen von Taxol und Cephalomannin bei mehr oder gleich 80 Gewichtsprozent Reinheit erwiesen. Es ist hierin nachgewiesen worden, daß der Kingston-Prozeß bei sehr unreinen Mischungen von Taxanen nicht anwendbar ist. Die Nüztlichkeit der vorliegenden Erfindung für die selektive Oxidation und Abtrennung von Taxol von Proben aus anfälligen Taxanen mit einem großen Bereich von Verunreinigungen ohne Anwendung der Chromatographie als ein Trennschritt gewährt ein wesentlich verbessertes kommerzielles Verfahren im Vergleich zu dem von Kingston entwickelten Prozeß.
Der erste Schritt des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, d. h. die Oxidation von gereinigtem Cephalomannin durch Behandlung mit Ozon, wurde an Cephalomannin ausge führt, das eine Reinheit von 90 Gewichtsprozent hatte. Die Behandlung einer Lösung von Cephalomannin (2,4 g) in Dichlormethan mit 1,4 val Ozon führte zu einer quantitativen Ausbeute der gewünschten Verbindung, die in Form offener und geschlossener Ringe vorlag und nachfolgend bezeichnet wird als 6a/6b. Die vorherrschende Form in nichtalkoholischen Lösemitteln ist 6a (siehe Fig. 7). Das Verbindungsgemisch 6a/6b wurde mit Hilfe der Spektroskopie und anderer Methoden vollständig charakterisiert. Fig. 9 zeigt nachhaltig den Unterschied der in der vorliegenden Erfindung erhaltenen Produkte im Vergleich zum Kingston- Prozeß. Ozon führt zu einer oxidativen Spaltung der Olefin- Bindung, während Osmiumtetroxid zur Dihydroxylierung der Olefin-Bindung führt. Beim Osmiumtetroxid-Prozeß kommt es zu keiner Spaltung einer Olefin-Bindung. Die Strukturen 3 und 6a/6b zeigen die verschiedenen Produkte, die nach den zwei unterschiedlichen Prozessen erzeugt wurden. Die Strukturen 6a/6b haben zwei Kohlenstoffatome weniger als "2" oder "3", was auf die oxidative Spaltung zurückzuführen ist. Der vorstehend beschriebene Versuch demonstriert die Wirksamkeit und das besondere Wesen des Oxidationsteils des hierin beschriebenen Verfahrens. Das Oxidationsprodukt von Cephalomannin 6a/6b wurde vollständig mit Hilfe des alpha- Ketoamid-Derivats charakterisiert. Entscheidend für die Erzeugung des wasserlöslichen Girard-Hydrazons ist in dem zweiten Schritt des Abtrennungsverfahrens eine zugängliche Carbonyl-Gruppe (Keton oder Aldehyd). Das in dem Kingston- Prozeß erzeugte Diol ist für die Erzeugung eines wasserlöslichen Girard-Hydrazons nicht brauchbar.
Das Verfahren als ganzes wurde an einer Mischung von reinem Cephalomannin und Taxol ausgeführt. Cephalomannin (> 95%) und Taxol (> 98%) wurden vereinigt zu einer 1 : 1- Mischung (Gewicht/Gewicht) und in einem geeigneten Lösemittel aufgelöst, wie beispielsweise Dichlormethan. Die Mischung wurde mit 3 val Ozon bei -78ºC behandelt. Die oxidierte Gemischlösung wurde eingeengt und zu ihr 1,5 val Girard T-Hydrazon und Essigsäure als Lösemittel zugesetzt. Die Lösung wurde für 2 Stunden bei 50ºC erhitzt und danach bis zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Methanol mit mäßigem Erhitzten aufgelöst und vorsichtig Wasser zugesetzt, um das Taxol selektiv auszufällen und das wasserlösliche Girard T-Hydrazon des oxidierten Cephalomannins in Lösung zu belassen. Das feste Taxol wurde abfiltriert und umkristallisiert und lieferte 67,7 Prozent des ursprünglichen Taxols. Dieses Verfahren ist nicht optimiert worden, wobei jedoch alle Einzelheiten in Beispiel VI angegeben werden. Ein alternatives Verfahren (Flüssig/Flüssig-Extraktion) zur Abtrennung des Hydrazons und Taxols wird in Beispiel VII beschrieben. Es ist darauf hinzuweisen, daß die Ozonolyse der Mischung von Taxol und Cephalomannin mit Hilfe der HPLC überwacht werden kann unabhängig von der Reinheit der Ausgangsmischung.
Das Verfahren ist nicht auf den Typ des Hydrazids oder des Hydrazins beschränkt, die geeignet sind. Das Girard P- Hydrazid ist für dieses Verfahren genauso gut geeignet wie das Girard T-Hydrazid. Darüber hinaus können andere wasserlösliche Hydrazine für die Erzeugung wasserlöslicher Hydrazone des oxidierten Cephalomannins genauso geeignet sein wie Girard-Hydrazide. Die Anforderungen an die wasserlöslichen Hydrazid-Reagenzien für das hierin beschriebene Verfahren schließen ein: hohe Wasserlöslichkeit des Hydrazids; hohes Reaktionsvermögen mit der Pyruvamidketon- Gruppe des oxidierten Cephalomannins; kein Reaktionsvermögen mit dem C-9-Keton von Taxol; hohe Wasserlöslichkeit des/der Hydrazons/Hydrazone des oxidierten Cephalomannins und verwandter Verbindungen; sowie Stabilität des Hydrazons für die Erzeugungs- und Handhabungsschritte des Trennverfahrens. Im weitesten Sinne eignen sich auch Materialien auf Hydrazid-Basis, die Hydrazone erzeugen und eine andere Löslichkeit haben als nichtreaktionsfähige Verbindung in dem Ausgangsmaterial, genauso gut. Ebenso gut geeignet sollten auch beispielsweise reaktionsfähige Hydrazide, die an polymeren Trägern gebunden sind.
Bei sehr unreinen Mischungen von Cephalomannin und Taxol, die Verhältnisse von 0,1 ... 1,0 Cephalomannin/Taxol (Reinheit von Taxol zwischen 0,1 ... 1 Gewichtsprozent) enthalten, ist das Verfahren grundsätzlich das gleiche wie bei gereinigten Mischungen. Allerdings erfordert das Verfahren für eine effektive Umwandlung längere Ozon- Behandlungszeiten und größere val-Mengen an Girard-Reagenz. Beispielsweise folgt der Auflösung einer Mischung von getrocknetem Biomasseextrakt, die Taxol und Cephalomannin in Essigsäure enthält, eine Behandlung mit Ozon (normalerweise mehr als 50 val bezogen auf Cephalomannin). Der Umfang der Cephalomannin-Oxidation läßt sich sorgfältig mit Hilfe der HPLC-Analyse von Aliquoten des Reaktionsgemisches überwachen (siehe den Abschnitt "Beispiele"). Die Lösung wird danach mit einem inerten Gas, wie beispielsweise Argon oder Stickstoff, gespült. Es wird das Girard-Reagenz zugesetzt (normalerweise mehr als 30 val bezogen auf des Cephalomannin) und die Mischung bis näherungsweise 50ºC zwischen einer und zwanzig Stunden erhitzt. Danach wird das Essigsäure-Lösemittel unter Vakuum entfernt. Die Abtrennung der Hydrazone von dem Rest der Mischung (die Taxol enthält) kann unter Anwendung einer selektiven Ausfällung oder durch Flüssig/Flüssig-Extraktion erfolgen. Sofern vorteilhaft, läßt sich die Normalphasenchromatographie oder Umkehrphasenchromatographie anwenden, wobei sie jedoch für dieses Trennverfahren nicht obligatorisch ist. Es können andere Trennverfahren nützlich sein, die von dem Vorteil der differierenden Löslichkeiten und differierenden Polaritäten der wasserlöslichen Hydrazone gegenüber dem Taxol Gebrauch machen. Bei sehr unreinen Mischungen scheint die Flüssig/Flüssig-Extraktion gut geeignet zu sein. Beispielsweise wird der Rückstand in einer ternären Mischung von Ethylacetat, Wasser und Methanol (10 : 2 : 1) aufgelöst. Andere Lösemittelsysteme können ebenfalls gut geeignet sein. Die resultierenden organischen und wäßrigen Phasen werden getrennt und die organische Phase (die das Taxol enthält) mit Wasser gewaschen, um restliche wäßrige Verunreinigungen zu entfernen. Die HPLC-Analyse des getrockneten Rückstandes aus der organischen Phase zeigt eine hervorragende Rückgewinnung von Taxol (> 96% in allen Beispielen) und eine im allgemeinen um mehr als 100 Prozent erhöhte Reinheit des Taxols. Die Mischung kann zu einer weiteren Reinigung überführt werden. Das Cephalomannin ist jedoch vollständig entfernt worden und erleichtert somit einen der schwierigeren und aufwendigeren Schritte der Reinigung von Taxol aus Extrakten von Biomasse, die ebenfalls Cephalomannin enthalten.
Bei teilweise gereinigten Mischungen von Cephalomannin und Taxol, die Verhältnisse von Cephalomannin/Taxol von 0,05 ... 7,35 enthalten (die Reinheit von Taxol oder Cephalomannin liegt zwischen 1 ... 5 Gewichtsprozent), läuft das Verfahren ähnlich ab, wie es unmittelbar vorstehend beschrieben wurde. Die Mischung von Cephalomannin und Taxol (ein Trockenpulver mit Reinheiten im Bereich von 1 Prozent Taxol ... 99 Prozent Taxol) wird in einem organischen Lösemittel (beispielsweise Essigsäure, Methanol oder Dichlormethan) aufgelöst, wonach Ozon durch die Lösung solange durchgeperlt wird, bis das Cephalomannin vollständig oxidiert ist. Die Reaktion kann mit Hilfe der HPLC-Analyse entsprechend der Beschreibung in dem Abschnitt "Beispiele" überwacht werden. Nach Beendigung der Oxidation wird das Reaktionsgemisch mit Argon- oder Stickstoffgas zur Entfernung von überschüssigem Ozon gespült. In allen Fällen wurden das Cephalomannin und verwandte Verbindungen mit hoher Ausbeute an Taxol oxidiert. Die Mischungen wurden sodann mit der entsprechenden Menge des Girard T- oder P- Hydrazids behandelt, um die Gesamtheit des oxidierten Cephalomannins oder anderer anfälliger oxidierter Taxane wirksam umzuwandeln. Die Abtrennung der Hydrazone und des nicht umgesetzten Hydrazids aus dem Rest der Mischung (die Taxol enthält) kann unter Anwendung der vorstehend ausgeführten Verfahren erfolgen.
Die Angabe der val-Menge des zugesetzten Ozons hängt von der Reinheit der Mischung (Gewichtsprozent Taxol und Cephalomannin) und der Konzentration von Cephalomannin und anderer Verbindungen ab, die mit Ozon reagieren. In der Regel erfordern weniger reine Mischungen von Taxanen größere val-Mengen (bezogen auf das Cephalomannin) Ozon zur vollständigen Oxidation des Cephalomannins als reine Mischungen von Taxanen. Die weniger reinen Mischungen von Taxanen enthalten mehrere Verbindungen, die mit dem Cephalomannin um das in die Mischung eingeführte verfügbare Ozon konkurrieren. Siehe hierzu beispielsweise Fig. 6, wo mit Taxusin und Brevifoliol Verbindungen gezeigt werden, die über olefinfunktionelle Gruppen verfügen (dargestellt mit der gestrichelten Linie), die mit Ozon reagieren.
Die zur Umwandlung der oxidierten Taxane in Hydrazone zu verwendende geeignete Menge von Girard T- oder P- Hydrazid beruht auf einer Anfangsanalyse auf Cephalomannin und andere Taxane in der Ausgangsmischung. Ähnlich dem Schritt der Ozonoxidation erfordern weniger reine Mischungen von Taxanen größere val-Mengen (bezogen auf Cephalomannin) von Girard-Hydrazid-Reagenz, um das Hydrazon des oxidierten Cephalomannins vollständig zu erzeugen, als reine Mischungen von Taxanen. Der Schritt der Hydrazon- Erzeugung ist dem Schritt der Ozonoxidation insofern ähnlich, daß der Umwandlung der oxidierten Taxane zu Hydrazonen eine HPLC folgen kann. Allerdings sind die Hydrazone in der angewendeten Methode der analytischen Chromatographie nicht mobil (siehe den Abschnitt "Beispiele"). Dementsprechend ist die Feststellung, daß ein Peak im -Vergleich zu Chromatogrammen der oxidierten Ausgangsmischung und der Hadrazid/Hydrazon-Mischung fehlt, ein guter Hinweis dafür, daß die Umwandlung der oxidierten Verbindung zu dem Hydrazon vollständig ist.
Lösemittel, die für das Verfahren der Ozonoxidation verwendet werden können, schließen ein: gesättigte Kohlenwasserstoffe, halogenierte Lösemittel, Alkohole, Ether, Aldehyde, Ketone, organische Säuren, Ester, Wasser und Mischungen davon. Die bevorzugten Lösemittel für den Oxidationsprozeß sind Dichlormethan, Chloroform, Methanol und Essigsäure oder Mischungen davon.
Bei den reineren Mischungen von Cephalomannin und Taxol (d. h. mehr als 5 Gewichtsprozent entweder Cephalomannin oder Taxol) können Lösemittel dem getrockneten Feststoffen zugesetzt werden, um die Lösungen zuzubereiten. Die Lösungen werden sodann mit Ozon für die geeignete Zeitdauer behandelt, indem der Fortgang der Reaktion mit Hilfe der HPLC auf das Verschwinden der Zielverbindungen überwacht wird.
Die Hydrazon-Erzeugung ist in halogenierten Lösemitteln, Alkoholen, Ethern, organischen Säuren, Estern, Wasser und Mischungen davon wirksam. Das bevorzugte Lösemittel ist Essigsäure.
Für das selektive Ausfällen wirksame Lösemittel schließen Lösemittel ein, die in der Regel mit Wasser mischbar sind. Verwendbare Lösemittel schließen ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: Alkohole, Ether, Aldehyde, Ketone, organische Säuren, Ester und Mischungen davon. Das bevorzugte Lösemittelsystem ist Methanol/Wasser.
Für die Flüssig/Flüssig-Extraktion wirksame Lösemittel schließen Lösemittel ein, die allgemein mit Wasser mischbar sind, wobei Taxol in diesen Lösemitteln ein hohes Lösungsvermögen besitzt. Verwendbare Lösemittel schließen ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: gesättigte und ungesättigte Kohlenwasserstoffe, halogenierte Lösemittel, Alkohole, Ether, Aldehyde, Ketone, Ester und Mischungen davon. Das bevorzugte Lösemittelsystem ist Ethylacetat/Wasser oder Dichlormethan/Wasser.
Der Oxidationsprozeß ist über einen großen Temperaturbereich wirksam. Es wurden Temperaturen von -100ºC ... 50ºC untersucht, ohne auf diese beschränkt zu sein. Die Hydrazon-Erzeugung ist bei Temperaturen bei oder oberhalb von Raumtemperatur, jedoch unterhalb von 100ºC, wirksam.
Ozon ist beispielsweise aus einem Ozon-Erzeuger verfügbar, der in der Lage zur Erzeugung von mindestens 8 g Ozon/Stunde (0,42 Pound/Tag) bei einer Konzentration von nicht weniger als 1 Gewichtsprozent in trockener, sauberer Luft (-60ºF Taupunkt) in der Lage ist, wenn der Betrieb mit 115 Volt, Strom mit 60 Hertz und 8 psig Überdruck ((1 psig = 6.895 kPa)) erfolgt; oder mindestens 16 g Ozon/Stunde (0,85 pound/Tag) bei einer Konzentration von nicht weniger als 2 Gewichtsprozent in reinem, sauberen, trockenen Sauerstoff (-60F Taupunkt) bei einem Betrieb mit 115 Volt, einem Strom von 60 Hertz und einem Überdruck von 8 psig.
Die Ozonkonzentration in dem Sauerstoffstrom kann mit Hilfe einer Vielzahl von Methoden bestimmt werden. Eine bevorzugte Methode ist die titrimetrische Analyse einer sauren Lösung von Kaliumiodid nach bestimmten Behandlungszeiten mit Ozon. Für die folgenden Reaktionen der Ozonolyse wurde die Verwendung von Sudan Red 7B (ein Farbstoff) veröffentlicht. Zusätzlich sind geeichte Ozon-Meßgeräte bei einigen Herstellern verfügbar. Das Ozon kann dem Reaktionsgemisch auch als eine Lösung von Ozon in Lösemittel zugeführt werden.
Die Girard-Reagenzien sind bei mehreren Herstellern verfügbar. Eine Übersicht über die Chemie dieser Klasse von Verbindungen wird von Wheeler, Chemical Reviews, Bd. 62, S. 205 ... 221 (1962), gegeben, worauf hiermit Bezug genommen wird.
Die Verwendung von Ozon in einem Oxidationsprozeß mit einem verhältnismäßig empfindlichen, in der Natur vorkommenden Produkt, wie beispielsweise Taxol, sollte das Taxol erwartungsgemäß nicht unbeeinflußt lassen. Dieses gilt besonders, wenn man bedenkt, daß Taxol, Cephalomannin, Taxusin und Brevifoliol alle über eine Olefin-funktionelle Gruppe im A-Ring (siehe die Pfeile in Fig. 6) verfügen, die erwartungsgemäß mit Ozon reagieren sollten. Darüber hinaus enthalten Taxol und andere Taxane zahlreiche funktionelle Gruppen, die gegenüber Oxidation anfällig sind, wie beispielsweise tertiäre Wasserstoffatome, Aryl-Ringe und Ether. Für den Fachmann auf dem Gebiet ist die hohe Ausbeute und selektive Ozonoxidation des Tiglat-Schwanzabschnittes der Cephalomannin-Seitenkette in ungereinigten, teilweise gereinigten und gereinigten Mischungen von Taxanen unter einer Reihe von Bedingungen nicht selbstverständlich.
Die Erzeugung der Girard T- oder P-Hydrazone der oxidierten Taxane, speziell oxidiertes Cephalomannin, ist selektiv und wirkungsgradgünstig. Die Reaktionen können in bezug auf Beendigung mit Hilfe der HPLC überwacht werden. Die erzeugten Produkte verfügen über eine hohe Wasserlöslichkeit. Die Abtrennung der wasserlöslichen Hadrazone von oxidiertem Cephalomannin und Taxol erfolgt selektiv und ebenfalls wirkungsgradgünstig. Selbst wenn das hierin ausgeführte Verfahren einen zusätzlichen Schritt im Vergleich zu dem Kingston-Prozeß erfordert, machen die Vorteile einer fehlenden Chromatographie und die nützliche technische Anwendung des Verfahrens auf Mischungen, die Taxol in einem großen Bereich von Verunreinigung enthalten, den zusätzlichen Schritt akzeptabel. Beispiele VI, VII und VIII heben die positiven Merkmale der drei Schritte der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu den Beispielen III und IV hervor. Es ist wichtig festzustellen, daß andere wasserlösliche Hydrazone für die Abtrennung von Taxol und anderer nichtreaktionsfähiger Verbindungen von Cephalomannin und verwandten Verbindungen in dem vorliegenden Verfahren genauso gut geeignet sein können wie die Girard- Hydrazone der oxidierten Verbindungen. Allgemeine Strukturen für wasserlösliche Hydrazide und Hydrazine, die in dem vorliegenden Verfahren verwendbar sein können, sind in Fig. 5 gezeigt.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird Taxol durch Ozon nicht wesentlich abgebaut, wobei die selektive Oxidation von Cephalomannin und verwandten Verbindungen in Gegenwart von Taxol und anderen nichtreaktionsfähigen Verbindungen bei Verwendung von Ozon auf die Unterschiede der funktionellen Gruppen zwischen dem Cephalomannin zusammen mit den verwandten Verbindungen und dem Taxol beruht. Es ist jedoch wichtig, festzustellen, daß Taxol durch ungeeignete Exponierung an einem großen Ozonüberschuß oder bei ungeeigneter Exponierung an einem geringfügigen Überschuß über eine längere Zeitdauer zu mehreren nichtidentifizierten Verbindungen zerfällt. Der Abbau von Taxol durch Ozon kann vermieden werden, wenn die Reaktion sorgfältig mit Hilfe der TLC oder HPLC überwacht wird. Die folgenden Beispiele liefern Prozeduren für die Ausführung der selektiven Ozonoxidation von Proben, die Taxol und Cephalomannin enthalten, und zwar ohne Abbau von Taxol.
Die positiven Merkmale der vorliegenden Erfindung im Vergleich zum Kingston-Prozeß schließen ein: sehr kurze Reaktionszeiten (Oxidation); leicht kontrollierbare Zugabe von oxidierenden Reagenzien; ein Prozeß, der ausreichend flexibel ist, um Cephalomannin und verwandte Verbindungen in Mischungen selektiv und wirkungsvoll zu oxidieren, die Taxol in einem weiten Bereich von Verunreinigungen enthalten (getestete Reinheitsgrade schließen Mischungen ein, die Cephalomannin und Taxol mit mindestens 0,3 Gewichtsprozent enthalten, bis zu Mischungen, die Cephalomannin und Taxol mit mehr als 95 Gewichtsprozent in einer 1 : 1-Mischung enthalten); kostengünstige und leichte Handhabung von Reagenzien und Reaktionsgemischen; wirksame und selektive Erzeugung von wasserlöslichen Hydrazon- Derivaten der oxidierten Taxane; kostengünstige und wirksame Verfahren zur Abtrennung der wasserlöslichen Hydrazone von oxidierten Taxanen und Taxol; sowie sehr geringe toxische Abfälle im Zusammenhang mit der Reaktion und der Abtrennung.

Beispiele

Die folgenden Beispiele bieten spezielle Verfahren für die selektive Oxidation von Cephalomannin und anderer anfälliger Verbindungen in ungereinigten, teilweise gereinigten oder gereinigten Proben von Taxanen. Diese selektiven Oxidationen eignen sich auch gut bei Proben, die für Ozon anfällige Verbindungen mit oder ohne Taxol oder Cephalomannin enthalten. Die folgenden Beispiele gewähren ebenfalls ein Verfahren zum Abtrennen der oxidierten Verbindungen, speziell oxidiertes Cephalomannin, von Taxol und anderen nichtreakitonsfähigen Taxanen. Alle wissenschaftlichen und technischen Begriffe haben die Bedeutungen, wie sie von einem Fachmann auf dem Gebiet verstanden werden. Der hierin verwendete Begriff "Biomasse" schließt Taxus- Spezies und Zellkultur von Taxus-Spezies ein. Die nichtreinen Mischungen, d. h. rohe Biomasseextrakte, lassen sich beispielsweise nach den in einer neueren Veröffentlichung beschriebenen Verfahren erhalten (Rao, Koppaka V., "Method for the Isolation and Purification of Taxane Derivatives", International Publication Number, WO 92/07842, 14. Mai 1992), worauf hiermit Bezug genommen wird.
Alle eingesetzten Lösemittel und Reagenzien wurden in der Form verwendet, wie sie vom Hersteller erhalten wurden mit der Ausnahme von Pyridin, das vor Gebrauch destilliert wurde. Die Reaktionen wurden mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie ("TLC") unter Verwendung von 0,20 mm Silicagel-Platten der E. M. Industries Silica Gel 60 (Aluminium-Träger) überwacht. Die Reaktionen wurden ebenfalls mit Hilfe der Hochleistungschromatographie ("HPLC") überwacht. Die Aliquoten von verunreinigten Reaktionsgemischen wurden für die HPLC-Analyse aus dem Reaktionsgefäß mit Hilfe einer 3 Mikroliter-Pipette entnommen und auf 200 Mikroliter in einer HPLC-Probeampulle (mit Einsatz) verdünnt. Das HPLC- System bestand aus einer Pumpe des Modells L-6200, Modell AS-4000 oder L-3000 UV/VIS/DAD-Detektor (Hitachi Instruments, Inc.). Das System war ausgestattet mit einem NEC 286er Computer mit einer 40 MByte-Festplatte und einer Software "Lab Manager HPLC" (Hitachi Instruments, Inc.). Die verwendeten HPLC-Säulen umfaßten eine 4,6 mm · 250 mm- Phenyl-Säule, gepackt mit 5 Mikrometer Diphenyl-Material (Supelco, Inc.); eine 4,6 mm · 250 mm, 5 Mikrometer, 60 Å Pentafluorphenyl (PFP)-Säule (Es Industries) sowie eine 4,6 mm · 250 mm Phenyl-Schutzsäule (Jones Chromatography). Der verwendete Ozonerzeuger war ein "Polymetrics Laboratory Ozonator T-819". Die Konzentration der Ozonzuführung betrug 0,0046 mMol/s bei Einstellungen von 100 Volt, 60 Hz Strom, 3,0 psig Überdruck und einer Fließrate von 2 SLMP. Der Ozonfluß wurde unter Anwendung der vom Hersteller beschriebenen Methode kalibriert. Das Silicagel für die Flash-Chromatographie (230 ... 400 Mesh) wurde von Scientific Products erhalten. Für die ¹H- und ¹³C -NMR- Spektren mit den in ppm angegebenen chemischen Verschiebungen relativ zu Tetramethylsilan unter Verwendung des restlichen, nicht-deuterierten NMR-Lösemittel zum Vergleich wurden ein Spektrometer nach Bruker WP-270 und ACE-300, Varian Gemini 400 und ein JEOL FX90Q-Spektrometer eingesetzt. Die Ausbeuten beziehen sich auf chromatographisch reine Verbindungen und sind nicht optimiert. Die Reinheit der Produkte wurde, sofern nicht anders angegeben, auf der Grundlage der spektrophotometischen Homogenität mit > 90 Prozent bewertet. Der hierin verwendete Begriff "chromatographische Reinheit" bezieht sich auf die prozentuale genormte HPLC-Peakfläche bei 227 nm für eine bestimmte Komponente. Die Massenspektren wurden mit einem M-Scan Inc. unter Verwendung eines VG Analytical 2-SE-Hochfeld-Massenspektrometers oder eines VG-Plattform-Massenspektrometers unter Benutzung des Elektrospray-Modes eingesetzt. Die spektroskopischen Analysen wurden unter Verwendung eines Analect Diamond-20 FTIR mit einem XAD-Plus-Mikroskop bestimmt. Das Instrument war ausgestattet mit einem "ACR Advanced Logic Research-486er Computer mit einer 200 MByte- Festplatte und einem Softwarepaket "Analect FX80".

Beispiel I (Demonstration des Standes der Technik) Prozedur für die Oxidation von gereinigtem Cephalomannin mit Osmiumtetroxid (stöchiometrisches Verfahren)

Es wurde OsO&sub4; in Pyridin (0,020 Mol, 24,5 ml, 2,1 val) zu einer Lösung von Cephalomannin (292 mg, 0,23 mMol) in wasserfreiem Pyridin (12,88 ml, 0,02 Mol) gegeben und für 19 Stunden bei Raumtemperatur gemischt. Die Reaktion wurde sodann mit 10prozentiger NaHSO&sub3; (43 ml) abgeschreckt und für 2,5 Stunden gemischt. Die Mischung wurde mit 3 normaler HCl auf pH 1 (Papier) angesäuert und 3 · mit EtOAc extrahiert. Die organische Schicht wurde 2 · mit Salzlösung gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und eingedampft. Der hellgrüne Rückstand wurde auf Silicagel chromatographiert (Gradient EtOAc/Hexan) und ergab 114 mg (57 Prozent Ausbeute) eines weißen Feststoffes (Rf = 0,41, 10 : 90 MeOH/CH&sub2;Cl&sub2;). Die spektrometrischen Analysen des Feststoffes entsprachen den von Kingston veröffentlichten Werten ("Modified Taxols, 7. A Method For The Separation Of Texol And Cephalomannine", Journal of Natural Products, 55, 259 ... 261 (1992).

Beispiel II (Demonstration des Standes der Technik) Prozedur zur Oxidation von gereinigtem Cephalomannin mit Osmiumtetraoxid (katalytische Methode)

Zu 5,9 mg (0,007 mMol) in Aceton aufgelöstem Cephalomannin wurde Tetraethylammoniumacetat (0,7 mg, 0,003 mMol, 0,43 val) gegeben. Die Mischung wurde auf 0ºC gekühlt und tert-Butylhydroperoxid (1,7 Mikroliter, 2,54 val einer 70prozentigen wäßrigen Lösung) und Osmiumtetroxid (2,5 Mikroliter, 0,029 val einer 0,070 Mol Lösung in tert- Butanol) zugesetzt. Die Mischung wurde für eine Stunde bei 0ºC und danach 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es wurde eine Probe mit Hilfe der HPLC analysiert, wonach die Reaktion beendet zu sein schien. Die HPLC- und TLC-Daten zeigten eine sehr ähnliche, nach der katalytischen Methode erzeugte Produktmischung wie nach der stöchiometrischen Methode.

Beispiel III

Oxidation von nichtreinem Cephalomannin/Taxol mit Osmiumtetroxid (stöchiometrische Methode)

Es wurde ein getrocknetes, natürliches Produktextrakt (505,3 mg), das Cephalomannin (0,3 mg, 0,058 Gewichtsprozent) aufgelöst in wasserfreiem Pyridin (1,3 ml) enthielt. Der Lösung wurden in Portionen OsO&sub4; in Pyridin (0,077 Mol) über eine Dauer von sieben Tagen bei Raumtemperatur solange zugesetzt, bis nach den Angaben der HPLC kein Cephalomannin zurückblieb. Es wurden zwischen 1.176 und 1.990 val OsO&sub4; (5,345 ml bzw. 9,045 ml) benötigt, um das verfügbare Cephalomannin vollständig zu oxidieren.

Beispiel IV

Oxidation von nichtreinem Cephalomannin/Taxol mit Osmiumtetroxid (katalytische Methode)

Es wurde eine Suspension von getrocknetem, gemahlenen Biomasseextrakt (1,40 g), das 0,81 mg Cephalomannin (0,058 Gewichtsprozent) enthielt, in Aceton (1,5 ml original) hergestellt und 3 · 0,5 ml-Portionen zur Erleichterung des Mischens hinzugefügt. Das anfangs flüssig/granulare Gemisch änderte sich innerhalb von 10 Minuten zu einer flüssig/gummiartigen Teermasse. Die Flüssigkeit wurde für die HPLC-Analyse gesampled und dadurch die Anwesenheit von Cephalomannin bestätigt. Es wurde Tetraethylammoniumacetat (0,08 mg, 0,32 val) zugesetzt und die Mischung auf 0ºC gekühlt. Zu dieser Mischung wurde tert-Butylhydroperoxid (0,3 Mikroliter, 2,28 val einer 70prozentigen wäßrigen Lösung) zugesetzt, gefolgt von einer Zugabe von Osmiumtetraoxid (0,3 Mikroliter, 0,025 val einer 0,79 molaren Lösung). Die Mischung wurde für 1,25 Stunden bei 0ºC und danach 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. An dieser Stelle wurde keinerlei Oxidation von Cephalomannin festgestellt, wenn ein geringes Aliquot aus der Mischung entnommen und mit Hilfe der HPLC analysiert wurde. Es wurden nach 17,75 und 25,75 Stunden Gesamtreaktionszeit weitere Aliquote entnommen. Die HPLC-Analyse dieser Proben zeigte keine Abnahme der Menge von Cephalomannin oder Erhöhung der Menge von erwartetem Diol.

Beispiel V

Prozedur für die Oxidation von reinem Cephalomannin mit Ozon

Es wurde Cephalomannin 2 (90 Gewichtsprozent, Gesamtgewicht: 2,702 g; Cephalomannin: 2,432 g, 29,24 mMol) in CH&sub2;Cl&sub2; (65 ml, 0,45 Mol) bei -60ºC ... -75ºC mit Ozon (39,744 mMol, 0,0046 mMol/s, 1,4 val) für 184 Minuten behandelt. Die Lösung wurde danach mit Argon bei Raumtemperatur für 5 Minuten gespült, wonach eine Eindampfung folgte. Die HPLC-Analyse zeigte, daß die Reaktion beendet war, während die NMR das Gleichgewichtsgemisch von 6a und 6b zeigte. Die Resonanzen für die Hauptverbindung sind aufgeführt: ¹H-NMR (90 MHz, CDCl&sub3;) 1,11 (s, 3H); 1,21 (s, 3H); 1,29-1,58 (m,2H); 1,64 (s, 3H); 1,78 (s,3H); 1,89-2,16 (m, 3H); 2,20 (s, 3H); 2,31 (s, 3H); 2,24 (s, 3H); 2,40-2,72 (m, 1H); 3,75 (d, J = 6,8 Hz, 2H); 3,98-4,47 (m, 3H); 4,64 (m, 1H); 4,89 (d, J 8,5 Hz, 1H); 5,13-5,68 (m, 2H); 5,98-6,20 (m, 1H); 6,25 (s, 1H) 7,27-7,73 (m, 8H); 7,85 (d, J = 9,4 Hz, 1H); 8,07 (d, J = 7,7 Hz, 2H). ¹³C-NMR (12 MHz, CDCl&sub3;) 9,54; 14,65; 20,76; 21,65; 22,51; 24,37; 26,7.9; 35,62; 35,62; 43,12; 45,72; 55,00; 58,48; 72,04; 72,04; 73,31; 74,96; 75,58; 76,44; 79,00; 81,16; 84,32; 126,97; 126,97; 128,60; 128,60; 128,60; 128,89; 128,89, 129,16; 130,11, 130,11, 133,24; 133,65; 137,14; 141,68; 159,70; 166,88; 170,30; 171,07; 171,93; 195,94; 203,55. Die diagnostischen Signale in den ¹³C-NMR-Spektrum für das keinere Isomer in CDCl&sub3; (Kohlenstoff 6' der zwei Diastereomere von 6b) sind 102,52 bzw 105,35 ppm. Die diagnostischen Signale in CD&sub3;OD von 6ab, einschließlich möglicher Lösemittelzusatz (CD&sub3;OD) sowohl zu 6a als auch zu 6b sind: 97,9 und 197,2 ppm. FTIR (rein, cm&supmin;¹) 981,6 (m); 1025,9 (m); 1070,3 (m); 1108,9 (m); 1178,3 (m); 1241,9 (s); 1373,1 (m); 1724,0 (s); 2900,4 (w); 2940,9 (w); 3064,3 (w); 3413,4 (m); 3490,5 (m). Der Schmelzpunkt einer analytisch reinen Probe (chromatische Reinheit > 97 Prozent) betrug 162ºC ... 167ºC. Massenspektrum (FAB, Glycerol/Thioglycerol-Matrix) m/z 821 (M + 1)&spplus;.

Beispiel VI

Oxidation von reinem Cephalomannin/Taxol mit Ozon und Abtrennung unter Verwendung von Girard T-Reagenz und selektives Ausfällen

Es wurde eine Mischung von reinem Taxol (100,6 mg, 0,119 mMol) und Cephalomannin (100,5 mg, 0,121 mMol) in wasserfreiem Dichlormethan aufgelöst. Die Mischung wurde auf -78ºC in einem Trockeneis/Aceton-Bad gekühlt und 3 val (im Vergleich zu Cephalomannin) Ozon in die Lösung eingeperlt. Nach dem Spülen der Lösung mit Argon wurde das Lösemittel aus der Mischung abgetrieben. Zu dem getrockneten Reaktionsgemisch wurden 1,5 val (Vergleich zur ursprünglichen Molmenge an Cephalomannin) Girard T- Hydrazid-Reagenz (30,8 mg) zugesetzt. Zur Auflösung der Feststoffe wurde ausreichend Essigsäure hinzugefügt (880 Mikroliter), um eine 0,14 molare Lösung zuzubereiten. Das Reaktionsgemisch wurde auf 50ºC unter Rühren für 2 Stunden erhitzt. Die Essigsäure wurde abgedampft und 800 Mikroliter Methanol (8 ml/l g Feststoffe) zur Auflösung der Mischung zugesetzt. Die Lösung wurde sodann auf 50ºC erhitzt und ausreichend Wasser (200 Mikroliter) langsam zugesetzt, um eine 25prozentige H&sub2;O/MeOH-Lösung zuzubereiten. Die Lösung ließ man langsam auf Raumtemperatur abkühlen und gab sie danach über Nacht in einen Gefrierschrank. Am folgenden Morgen wurden die Feststoffe (Taxol) durch Vakuumfiltration isoliert. Nach dem Trocknen betrug die Taxol-Ausbeute 79,6 mg, 79,1 Prozent). Die Feststoffe wurden in MeOH/H&sub2;O auf eine Ausbeute von 68,1 mg (67,7 Prozent Ausbeute) umkristallisiert. Die chromatographische Reinheit des gewonnenen Taxols betrug 97,5 Prozent. Der Fp betrug 198ºC ... 201ºC; der Fp für einen Taxol-Standard: 208ºC ... 212 ºC. Die ¹³C-NMR-Daten für das isolierte Taxol stimmten exakt mit denen einer Standardprobe überein.

Beispiel VII

Oxidation von reinem Cephalomannin/Taxol mit Ozon und Abtrennung unter Verwendung von Girärd T-Reagenz und Anwendung von Flüssig/Flüssig-Extraktion

Es wurde eine gleiche Mischung von reinem Cephalomannin (19,7 mg, 0,024 mMol) und reinem Taxol (19,7 mg, 0,023 mMol) in 1,2 ml Essigsäure aufgelöst und mit 2 val Ozon (bezogen auf Cephalomannin) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Argon gespült und 5 val (im Vergleich zu Cephalomannin) des Girard T-Reagenz (20,1 mg) zugesetzt und die Lösung auf 50ºC erhitzt. Nach dem Erhitzen für 2 Stunden wurde das Lösemittel unter Vakuum abgedampft. Das getrocknete Reaktionsgemisch wurde in einer geringen Menge Ethylacetat und Wasser aufgelöst und die zwei Phasen separiert. Die organische Phase, die das Taxol enthielt, wurde nacheinander mit gesättigtem Natriumhydrogencarbonat und Salzlösungen gewaschen. Der Gesamtrückstand (19,1 mg) nach dem Eindampfen betrug 95 Prozent Taxol nach der chromatographischen Reiheitsanalyse mit einer Gesamtausbeute von 93 Prozent.

Beispiel VIII

Oxidation von nichtreinem Cephalomannin/Taxol mit 03 und Abtrennung unter Verwendung von Girard T-Reagenz und Anwendung von Flüssig/Flüssig-Extraktion

Es wurde ein Methanol-Rohextrakt von Taxus brevifolia- Borke assayiert. Die Cephalomannin-Reinheit wurde auf 0,4 Prozent und die Taxol-Reinheit auf 0,20 Prozent berechnet. Der getrocknete Rohextrakt (52,89 g) wurde in einer geringen Mengen Essigsäure (350 ml) aufgelöst und mit 50 val (bezogen auf Cephalomannin) Ozon behandelt. Nach dem Spülen der Lösung mit Argon, wurden 121,7 mg (30 val bezogen auf Cephalomannin) des Girard T-Reagenz zugesetzt und die Lösung auf 50ºC in einem Ölbad erhitzt. Nach dem Mischen für 2 Stunden wurde die Lösung aus der Hitze genommen und die Essigsäure unter Vakuum entfernt. Danach wurde das getrocknete Reaktionsgemisch in Ethylacetat (500 ml), Wasser (100 ml) und Methanol (45 ml) aufgelöst. Das Methanol wurde der Lösung zugesetzt, um die Auflösung der Feststoffe zu unterstützen. Die Lösung wurde in einen Trenntrichter gespült und die zwei Phasen separiert. Die organisch Taxol-enthaltende Phase wurde mit Wasser zur Entfernung der restlichen Verunreinigungen der wäßrigen Phase gewaschen. Die Analyse der organischen Phase mit Hilfe der HPLC zeigte eine Ausbeute von Taxol mit 97 Prozent bei einer 60prozentigen Abnahme von Verunreinigungen. Die organische Phase wurde eingedampft und wiederum mit Hilfe der HPLC assayiert. Die Taxol-Gesamtreinheit wurde auf 0,5 Prozent (von 0,2 Prozent) erhöht und Cephalomannin und oxidiertes Cephalomannin aus der Mischung vollständig entfernt.
Weitere Varianten sind ohne Abweichung von dem Geltungsbereich der Erfindung möglich.

Claims

1. Verfahren zum Abtrennen von Cephalomannin aus einem Gemisch, enthaltend Cephalomannin und Taxol in einer Lösung, welches Verfahren die Schritte umfaßt:

(a) Kontaktieren des Gemisches mit Ozon, wodurch das Cephalomannin unter Erzeugung von oxidiertem Cephalomannin oxidiert wird;

(b) Überführen des oxidierten Cephalomannins in ein wasserlösliches Hydrazon; sowie

(c) Abtrennen des wasserlöslichen Hydrazons von diesem Gemisch, wobei das Gemisch aufbereitet wird durch Auflösen eines getrockneten Biomasse-Extraktes in einem Lösemittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenwasserstoffen, halogenierten Lösemitteln, Alkoholen, Ethern, Aldehyden, Ketonen, Aminen, organischen Säuren, Derivaten von organischen Säuren, Estern, Wasser und Mischungen davon.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das Ozon durch das Gemisch hindurchgeperlt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das Ozon in einer Flüssigkeit enthalten ist, die dem Gemisch zugesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das wasserlösliche Hydrazon erzeugt wird, indem das Gemisch, das das oxidierte Cephalomannin enthält, mit einem wasserlöslichen Hydrazid oder Hydrazin kontaktiert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei welchem das wasserlösliche Hydrazid ein Girard T-Hydrazid oder Girard-P- Hydrazid ist und die Formel hat:

Girards Reagenz T-Hydrazid

Girards Reagenz P-Hydrazid

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das wasserlösliche Hydrazon aus dem Gemisch durch selektives Ausfällen, Flüssig/Flüssig-Extraktion oder durch Chromatographie abgetrennt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem der getrocknete Biomasse-Extrakt ein Extrakt aus Taxus brevifolia ist.

8. Verfahren zum Herstellen eines wasserlöslichen Hydrazon-Derivats von Cephalomannin in einer Lösung, umfassend die Schritte:

(a) Oxidieren des Cephalomannins durch Kontaktieren der Lösung mit Ozon unter Erzeugung von oxidiertem Cephalomannin:

(b) Kontaktieren des oxidierten Cephalomannins in der Lösung mit einem wasserlöslichem Hydrazid, um ein wasserlösliches Hydrazon zu erzeugen; sowie

(c) Abtrennen des wasserlöslichen Hydrazons von der Lösung.

9. Verbindung der Formel:

worin R einen Acetyl-Rest oder Hydroxyl-Rest bezeichnet.

10. Verbindung der Formel:

worin R einen Acetyl-Rest oder Hydroxyl-Rest bezeichnet.