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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von modifizierten
Formen des Polyentyp-Antibiotikums Natamycin (=Pimaricin), entsprechende
Zusammensetzungen sowie die Verwendung von solchen Zusammensetzungen
zur Behandlung von Nahrungsmitteln oder landwirtschaftlichen Produkten
oder für
pharmazeutische Zwecke.
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ALLGEMEINER
STAND DER TECHNIK
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Natamycin
wird seit 20 Jahren zur Verhinderung von Schimmelwachstum auf Käse und Würsten verwendet
(Lit. 1–12).
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Käse werden
durch Eintauchen in eine Suspension von Natamycin in Wasser oder
durch Beschichten mit einer natamycinhaltigen wäßrigen Emulsion von einem Polymer, üblicherweise
einer wäßrigen Emulsion von
Polyvinylacetat, behandelt. Würste
werden in erster Linie durch Eintauchen oder durch eine Sprühbeschichtung
mit einer Suspension von Natamycin in Wasser behandelt. Üblicherweise
enthalten wäßrige Natamycinsuspensionen
für Tauchbehandlungen
0,1 bis 0,2% (w/v) Natamycin, während
natamycinhaltige Polymeremulsionen für Beschichtungszwecke einen
Natamycingehalt von 0,01 bis 0,05 (w/v) aufweisen.
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Diese
Behandlungen sind beim Vorbeugen gegen Verderb durch Schimmel meistens
hochwirksam. Aufgrund der schlechten Löslichkeit von Natamycin kann
jedoch trotzdem Verderb durch gewisse Pilze, die gegen Natamycin
wenig empfindlich sind, aufgrund des Fehlens einer vollen Hemmung
stattfinden.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der
Wirksamkeit von Natamycin gegen Schimmel sowie die erhaltenen modifizierten
Formen von Natamycin. Zusammensetzungen, die diese Formen enthalten,
eignen sich für
die Bekämpfung
von Hefen und Pilzen, die normalerweise gegen die Einwirkung von
Natamycin relativ resistent sind.
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In
US-Patent 3,378,441 wird ein Verfahren zur Verbesserung der Isolation
und Gewinnung von Pimaricin (Synonym für Natamycin) beschrieben. Die
letzten Schritte bei diesem Verfahren bestehen darin, daß man das
Pimaricin nach Extraktion des feuchten Filterkuchens mit einem Niederalkanol
löst und
anschließend sprühtrocknet
(Beispiel 2). Da in der Alkanoidlösung noch immer beträchtliche
Wassermengen vorliegen, wurde von uns gefunden, daß dies zur
Bildung der unmodifizierten Form des α-Natamycins führt.
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In
dem GB-Patent 844,289 wird die Herstellung von aufgereinigtem Natamycin
beschrieben, die die Schritte des Ausfällens des Produkts aus einer
Dimethylformamidlösung
durch Versetzen mit Wasser und anschließendes Trocknen im Vakuum umfaßt. Da diese
Art der Trocknung Wasser in dem Niederschlag hinterläßt, wird
wiederum die α-Form
des Natamycins gebildet.
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In
dem US-Patent 4,148,891 werden nützliche
und wirksame Zusammensetzungen für
die antifungale Behandlung von Zitrusfrüchten und anderen Agrarprodukten
beschrieben. Diese Zusammensetzungen werden dadurch erhalten, daß man Natamycin
oder ein anderes Polyen-Antibiotikum mit einem Alkohol, z.B. Methyl-,
Ethyl- und Propylalkohol, oder mit einer organischen Säure, z.B.
Essigsäure
und Propionsäure,
kombiniert. In diesen Zusammensetzungen reicht die Löslichkeit
des Polyen-Antibiotikums aus, um in die Schale des behandelten Produkts
einzudringen und das Schimmelpilzwachstum über einen längeren Zeitraum zu hemmen.
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In
der Literaturstelle 16 wird der Einfluß des Polymorphismus in pharmazeutischen
Anwendungen beschrieben. Angegeben werden der bei der Herstellung
von physikalisch stabilen und wirksamen Darreichungsformen in Betracht
zu ziehende Faktor sowie Verfahren zur Untersuchung des Polymorphismus.
Polymorphismus wird in dieser Schrift als "die Fähigkeit eines beliebigen Elements
oder einer beliebigen Verbindung, in mehr als einer spezifischen
Kristallform zu kristallisieren" beschrieben
(Seite 911, 3. Absatz, Zeile 1–3).
Hieraus ergibt sich als wichtiger Aspekt, daß Polymorphe unterschiedliche
Eigenschaften, z.B. Löslichkeit, Schmelzpunkt,
Dichte usw. aufweisen. Diese Unterschiede sind in Betracht zu ziehen,
wenn Arzneistoffe, die in unterschiedlichen Polymorphen vorliegen
können,
in pharmazeutischen Präparaten
vorliegen.
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Die
Literaturstelle 15 behandelt die Auswirkung von Polymorphismus auf
Polyen-Antibiotika, z.B. Mepartricin und Nystatin, in bezug auf
auf die entsprechende Toxizität
bei der Maus. In 15 wird gezeigt, daß Polymorphe des gleichen Arzneistoffs
aufgrund unterschiedlicher Löslichkeit
und Verfügbarkeit
unterschiedliche Toxizität
aufweisen.
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KURZE DARSTELLUNG
DER ERFINDUNG
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Unerwarteterweise
wurde gefunden, daß die
Wirksamkeit von Natamycin gegen Hefe und Pilze mit einem der folgenden
Verfahren deutlich verbessert werden kann:
- A)
Erstens: Natamycin wird durch Inkontaktbringen der Verbindung mit
Methanol in das Methanolsolvat umgewandelt.
- B) Zweitens: Die solvatisierten Lösungsmittelmoleküle werden
von dem Kristallgitter des Solvats entfernt. Dies kann dadurch geschehen,
daß man
das Natamycinmethanolsolvat einem verringerten Druck über Phosphorpentoxid aussetzt.
Dies führt
zu einer Form, die im folgenden δ-Natamycin
genannt wird.
- C) Drittens: Der "leere" Raum des Kristallgitters
kann mit anderen Lösungsmittelmolekülen gefüllt werden, und
zwar dadurch, daß man
die "leere" Verbindung mit einem
Lösungsmittel
oder dessen Dampf in Kontakt bringt, wodurch man wiederum zu einem
Natamycinsolvat gelangt. Beispiele für Solvate, die nach diesem Verfahren
erhältlich
sind, sind die Solvate mit den folgenden Lösungsmitteln: Ethanol, n-Propanol,
n-Butanol, Methoxyethanol, Dichlormethan, Methylformiat, Ethylformiat,
Acetonitril, Formamid, N,N-Dimethylformamid
und Dimethylsulphoxid.
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Eine
modifizierte Form von Natamycin kann auch dadurch erhalten werden,
daß man
die Verbindung mit dem "leeren" Kristallgitter einer
feuchten Umgebung aussetzt. Wird δ-Natamycin
einer relativen Feuchtigkeit von 76% ausgesetzt, so gelangt man
zu einer neuen dreifach hydratisierten Kristallmodifikation. Diese neue
Verbindung, die γ-Natamycin
genannt wird, weist eine verbesserte Wirksamkeit gegenüber Arten,
die normalerweise gegen die Wirkung des ursprünglichen α-Natamycins, das ebenfalls eine dreifach
hydratisierte Form des Natamycins ist, eine verbesserte Wirksamkeit
auf (siehe Literaturstelle 14, S. 520).
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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Antipilzzusammensetzung,
die Natamycin enthält,
dadurch gekennzeichnet, daß das
Natamycin in die Zusammensetzung in modifizierter Form, die ein im
Vergleich zum unmodifizierten α-Natamycin
verbessertes Freisetzungsprofil aufweist, eingearbeitet wird. Das
Natamycin wird dadurch in die modifizierte Form übergeführt, daß man das oben beschriebene
Verfahren anwendet.
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Gemäß einem
Aspekt der Erfindung wird eine neue Form von Natamycin beschrieben.
Diese Verbindung stammt aus der Gruppe
- – δ-Natamycin;
- – γ-Natamycin;
- – die
Solvate des Natamycins, die dadurch erhältlich sind, daß man δ-Natamycin
mit: Ethanol, 1-Propanol, 1-Butanol,
2-Methoxyethanol, Methylformiat, Ethylformiat, Aceton, Dichlormethan,
Acetonitril, Dimethylformamid und Formamid in Kontakt bringt.
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Alle
diese Verbindungen weisen eine im Vergleich zum unmodifizierten α-Natamycin
verbesserte Freisetzung der Antipilzverbindung auf.
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Zubereitungen,
die aktiviertes Fungizid enthalten, eignen sich für die Vorbeugung
gegen das Wachstum von Pilzen, die normalerweise gegenüber der
Einwirkung von Polyen-Fungiziden relativ resistent sind. Beispiele
für Pilze,
die gegen Natamycin wenig empfindlich sind, sind Verticillium cinnabarinum,
Botrytis cinerea und Trichophyton-Arten. Unter den Aspergillus-,
Fusarium- und Penicillin-Arten
finden sich auch Arten mit einer relativ hohen Toleranz gegenüber Natamycin.
Ein Beispiel für
solch eine Art ist Penicillium echinulatum var. discolor.
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In
einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung daher Antipilzzusammensetzungen,
die eine modifizierte Form von Natamycin enthalten, bereit, wobei
die letztere dadurch erhältlich
ist, daß man
eines der oben erwähnten
Verfahren anwendet.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Behandeln
eines Nahrungsmittels oder eines landwirtschaftlichen Produkts zum
Inhibieren von Hefe- oder Wachstum bereit, bei dem eine erfindungsgemäße Zusammensetzung
aufgebracht wird.
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Im
Prinzip kann eine Natamycinlösung
bei allen möglichen
Präparaten,
die sich für
die Behandlung von Nahrungsmitteln wie Käse und Würsten und/oder für die Behandlung
von Agrarprodukten wie Früchten,
Gemüsen
und Samen eignen, eingearbeitet werden. Geeignete Zubereitungen
für die
Behandlung von Nahrungsmitteln wie Käse und Würsten sind zum Beispiel Beschichtungsemulsionen,
die durch Bestreichen oder durch Verwendung eines Sprühgeräts aufgebracht
werden können,
sowie flüssige
Präparate,
die für
Tauchbehandlungen verwendet werden können. Der pH-Wert einer erfindungsgemäßen Zubereitung
für die
Behandlung von Nahrungsmitteln oder landwirtschaftlichen Produkten
beträgt
vorzugsweise 1 bis 10, stärker
bevorzugt 2 bis 8 und am stärksten
bevorzugt 3,5 bis 7,5. Die Erfindung betrifft weiterhin auch Nahrungsmittel
und landwirtschaftliche Produkte, wenn sie derart behandelt worden
sind.
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Schließlich kann
die modifizierte Form von Natamycin auch in pharmazeutische Zubereitungen,
zum Beispiel für
die topische Anwendung, eingearbeitet werden. Beispiele für geeignete
pharmazeutische Zubereitungen sind Lotionen, Cremes und Salben.
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BESCHREIBUNG
DER ABBILDUNG
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1 (Aufbringung
von mehreren Natamycinzubereitungen auf Käse) zeigt die Hemmwirkung von Beschichtungsemulsionen,
die γ-Natamycin
(Zusammensetzung J) oder δ-Natamycin
(Zusammensetzung K) enthalten, im Vergleich zu einer Vergleichsbeschichtungsemulsion,
die α-Natamycin
(Zusammensetzung D) enthält
und zu einer wirkstofffreien Beschichtungsemulsion (Zusammensetzung
E).
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung stellt neue Arten von Natamycin-Antipilzzubereitungen und -zusammensetzungen
zur Verhinderung des Verderbs von Nahrungsmitteln und/oder landwirtschaftlichen
Produkten durch Schimmel sowie als Pharmazeutikum bereit. Die Zusammensetzungen
sind durch eine verstärkte
antifungale Wirksamkeit des Natamycins gegenüber Arten, die normalerweise
gegenüber
solchen Verbindungen eine relativ hohe Toleranz aufweisen, gekennzeichnet.
Wie oben erwähnt,
sind Beispiele für
Pilze, die relativ resistent gegen Natamycin sind, Verticillium
cinnabarinum, Botrytis cinerea und Trichophyton-Arten. Unter den
Aspergillus-, Fusarium- und
Penicillium-Arten finden sich ebenfalls Arten mit einer relativ
hohen Toleranz gegenüber
Natamycin. Ein Beispiel für
solch eine Art ist Penicillium echinulatum var. discolor.
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Die
verstärkte
Wirksamkeit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung
beruht vermutlich auf einer verbesserten Verfügbarkeit des Natamycins aufgrund
eines verbesserten Auflösens.
Im allgemeinen wird nur ein in Lösung
vorhandenes Fungizid verfügbar
sein, um eine antifungale Wirksamkeit auszuüben. Bei einem Fungizid mit
einer schlechten Löslichkeit
werden also die folgenden drei Faktoren eine Auswirkung auf die
fungizide Endwirkung ausüben:
die Auflösung
des Fungizids, die Diffusion des gelösten Fungizids an die Infektionsstelle
sowie die Elimination des gelösten
Fungizids. Natamycin kann durch einen lichtbedingten Abbau oder
durch Hydrolyse seine Wirkung verlieren (Lit. 2). Natamycin weist
eine MHK (minimale Hemmkonzentration) von weniger als 10 ppm für die meisten
nahrungsmittelbürtigen
Pilze auf, während
seine Wasserlöslichkeit
30 bis 50 ppm beträgt
(Lit. 13). Meistens wird daher die Wirksamkeit des Natamycins in
traditionellen Antipilzpräparaten
gegen solche Pilze nicht wesentlich durch Solubilisierungs- oder
Diffusionsfaktoren begrenzt werden, da die Löslichkeit wesentlich höher als
der MHK-Wert liegt. Eine Elimination von gelöstem Natamycin wird ausreichend
dadurch kompensiert werden, daß ungelöstes Natamycin
in Lösung
geht, sowie dadurch, daß gelöstes Natamycin
an die Infektionsstelle diffundiert.
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Bei
Pilzen mit einer relativ niedrigen Empfindlichkeit gegenüber Polyen-Fungiziden,
zum Beispiel Penicillium echinulatum var. discolor, können Solubilisierung
und Diffusion solch eines Fungizids jedoch eine stärker begrenzende
Wirkung auf seine Hemmwirkung ausüben. Verwendet man ein traditionelles
Fungizidpräparat,
das Natamycin enthält,
so kann im Gleichgewichtszustand die durchschnittlich gelöste Natamycinmenge unter
die Wirkkonzentration absinken, da eine Elimination nicht ausreichend
durch Lösung
und Diffusion der Antipilzverbindung kompensiert wird. Üblicherweise
kann solch ein Problem dadurch gelöst werden, daß man die
Löslichkeit
des Wirkstoffs durch geeignete Auswahl der Lösungsmittel verbessert oder
dadurch, daß man eine
kleine Teilchengröße verwendet,
um die Solubilisierungsgeschwindigkeit zu verbessern und die Diffusionsbegrenzungen
dadurch zu kompensieren, daß man
die Dichte der Teilchenverteilung an der zu behandelnden Oberfläche erhöht. Diese
gutbekannten Maßnahmen
haben jedoch bei einer Anwendung auf Natamycin in wäßriger Suspension
nicht die erwünschte
Auswirkung.
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Wird
Natamycin in einem Lösungsmittel
wie Glyzerin auf die Oberfläche
von z.B. Käse,
der mit Penicillium echinulatum var. Discolor angeimpft ist, aufgebracht,
so unterdrückt
es das Pilzwachstum nicht stark genug. Die Verwendung einer mikronisierten
Probe führt
im Vergleich zu einer nichtmikronisierten Probe ebenfalls nur zu
einer schwachen Verbesserung.
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Im
ersten Fall sinkt vermutlich die aktive Natamycinkonzentration an
der Oberfläche
des Käses
aufgrund einer all zu raschen Diffusion des gelösten Natamycin in dem Käse auf einen
zu niedrigen Wert ab, um das Pilzwachstum wirksam zu unterdrücken. Im
zweiten Fall ist eine Verbesserung der Solubilisierungsgeschwindigkeit
nicht ausreichend, um zu der gewünschten
Verbesserung der antifungalen Wirksamkeit zu führen.
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Erfindungsgemäße Zusammensetzungen
weisen, wenn sie gemäß dem in
Beispiel 1 beschriebenen Verfahren gemessen werden, ein charakteristisches
Fungizidfreisetzungsprofil auf.
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Unter
den Prüfbedingungen
des Verfahrens gemäß Beispiel
1 weist eine Suspension von Natamycin in Wasser oder in einer Polyvinylacetatemulsion
normalerweise eine anfängliche
Natamycinfreisetzungsgeschwindigkeit von ungefähr 1 bis 2 μg/Tag auf. Unter den gleichen
Bedingungen weisen erfindungsgemäße Zusammensetzungen
eine Fungizidfreisetzungsgeschwindigkeit von mindestens 3 μg/Tag über zumindest
den ersten Tag auf. Es kann sogar eine Fungizidfreisetzungsgeschwindigkeit
von ungefähr
20 μg/Tag
oder noch höher
beobachtet werden.
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Unerwarteterweise
wurde gefunden, daß dadurch,
daß man
die polymorphe Form modifiziert, die Wirksamkeit von Natamycin gegen
weniger empfindliche Arten erhöht
werden kann. Wurde die Messung zum Beispiel gemäß dem Verfahren von Beispiel
1 durchgeführt,
so konnte gezeigt werden, daß das
Methanolsolvat des Natamycins im Vergleich zu dem ursprünglichen
gutbekannten Natamycintrihydrat ein verbessertes Auflösungsprofil
aufweist. (Das wie z.B. in Lit. 14 beschriebene, gutbekannte Natamycintrihydrat
wird im folgenden Text als α-Natamycin
bezeichnet.)
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Von
manchen Polyen-Antipilzverbindungen sind polymorphe Formen bekannt.
In Lit. 15 zum Beispiel wird erwähnt,
daß die
Unterschiede bezüglich
der akuten Toxizitätswerte
zwischen verschiedenen Chargen von Polyen-Antipilzverbindungen,
insbesondere Mepartricin und Nystatin, auf den polymorphen Formen
beruhen. Andererseits wurden bezüglich
der mikrobiologischen Wirksamkeit zwischen den unterschiedlichen
polymorphen Formen von Mepartricin oder Nystatin keine Unterschiede
beobachtet.
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In
Lit. 14 (Seite 538) wird erwähnt,
daß die
großen
Unterschiede zwischen den Löslichkeitswerten
für Natamycin,
die in unterschiedlichen Literaturangaben zu finden sind, auf der
Bildung von Solvaten beruhen könnten.
Der Unterschied zwischen der ursprünglichen Löslichkeit von Natamycin in
Methanol und dem Natamycin, das nach spontaner Kristallisation in
Lösung
verblieb, wurde als Beispiel herangezogen. Diese Erscheinung wurde
der Bildung des (in Methanol) schlechter löslichen Methanolsolvats zugeschrieben.
Bei Kontakt mit Wasser jedoch wurden die Kristalle rasch in die
ursprüngliche
Form mit dem gleichen Röntgendiffraktionsmuster
wie die aus wäßrigen Lösungsmitteln
isolierten Kristalle zurückumgewandelt
(Seite 519). Aufgrund der raschen Umwandlung des Methanolsolvats
in das ursprüngliche
Trihydrat bei Kontakt mit Wasser war die Verbesserung der Wirksamkeit
von Natamycinmethanolsolvaten unter wäßrigen Bedingungen gegen Arten,
die wenig empfindlich sind, äußerst unerwartet.
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Weiterhin
handelt es sich bei Natamycinmethanolsolvat um eine instabile Substanz
(Lit. 14, Seite 542), die sich daher nicht sehr für die praktische
Verwendung eignet. Mittels Differenzialscanningkalorimetrie (DSC)-Messungen, thermogravimetrischer
Analyse und Differenzialthermoanalyse (TG/DTA) sowie kernresonanzmagnetischer
Analyse (NMR) konnte gezeigt werden, daß Natamycinmethanolsolvat pro
Mol Natamycin ungefähr
2 Mol Methanol und ungefähr
0,5 Mol Wasser enthält.
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Wie
aus der Thermoanalyse hervorgeht, verliert Natamycinmethanolsolvat,
wenn es verringertem Druck über
Phosphorpentoxid ausgesetzt wird, sein Methanol vollständig. Aus
der Röntgenanalyse
ging hervor, daß man
als Ergebnis eine neue Kristallmodifikation des Natamycins, die
im folgenden Text als δ-Natamycin
bezeichnet wird, erhält. δ-Natamycin
kann unter Verschluß länger als
3 Monate ohne Zersetzung aufbewahrt werden, obwohl die Farbe der
weißen
Substanz dazu neigt, gelb zu werden. Unter Kühlung und/oder inerten Bedingungen
kann die Substanz jedoch mehr als 3 Monate ohne Verfärbung aufbewahrt
werden. Dies ist deshalb überraschend,
da Natamycintrihydrat, das dadurch äußerst stark getrocknet wird,
daß man
es einem Vakuum über
Phosporpentoxid aussetzt, innerhalb von 48 Stunden 15% seiner Aktivität verliert,
wenn es unter Verschluß aufbewahrt
wird (Lit. 14, Seite 542).
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Überraschenderweise
weist δ-Natamycin
auch eine verbesserte Auflösung
und weiterhin auch eine verbesserte Wirksamkeit gegen Arten, die
gegen Natamycin wenig empfindlich sind, auf.
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Die
Erfindung umfaßt
daher auch δ-Natamycin,
das dadurch erhalten wird, daß man
die solvatisierten Methanolmoleküle
(teilweise) aus dem Kristallgitter des Natamycinmethanolsolvats
entfernt, z.B. dadurch, daß man
sie verringertem Druck über
einem Wasserbindemittel wie Phosphorpentoxid aussetzt oder dadurch,
daß man
einen verringerten Druck in Kombination mit einem leichten Strom
eines inerten Gases wie Stickstoff anlegt.
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Wird δ-Natamycin
bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 76% aufbewahrt, so wird
es in eine Kristallmodifikation umgewandelt, die 3 Mol Wasser pro
Mol Natamycin enthält.
Wie aus der Röntgenanalyse
jedoch hervorgeht, unterscheidet sich die neue Kristallform von
der ursprünglichen α-Modifikation.
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Ein
Polymorphismus von Natamycintrihydrat war bis jetzt unbekannt (Lit.
14, Seite 518). Bei der vorliegenden Modifikation, die als γ-Natamycin
bezeichnet wird, handelt es sich daher um eine neue Verbindung. γ-Natamycin ist eine
weiße
stabile Substanz, deren Farbe sich bei Aufbewahrung unter Umgebungsbedingungen
langsam nach gelb verändert.
Bei Aufbewahrung unter inerten Gasbedingungen, z.B. unter Stickstoff, bleibt
die Farbe jedoch weiß.
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Weiterhin
geht aus der verbesserten Auflösung
auch hervor, daß γ-Natamycin
im Vergleich zur α-Modifikation
auch eine verbesserte Wirksamkeit gegenüber Arten, die gegen Natamycin
wenig empfindlich sind, aufweist.
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Weiterhin
kann δ-Natamycin,
wenn es den Dämpfen
von verschiedenen Lösungsmitteln
ausgesetzt wird, in verschiedene Solvate umgewandelt werden. Ein
Merkmal der Erfindung sind daher auch Substanzen, die dadurch erhalten
werden, daß man
die "leere" Kristallmodifikation
des δ-Natamycins
Lösungsmitteldämpfen aussetzt.
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Schließlich kann
man zu modifizierten Formen des Natamycins dadurch gelangen, daß man das δ-Natamycin
mit Lösungsmitteln
in Kontakt bringt. Geeignete Lösungsmittel
zur Herstellung der polymorphen Formen sind solche, die zur Gruppe
der niederen (mehrwertigen) Alkohole, aliphatischen Ketone, halogenierten aliphatischen
Kohlenwasserstoffe, aliphatischen Cyanokohlenwasserstoffe, aliphatischen
Ether und aliphatischen Ester oder deren Mischungen zählen. Beispiele
für geeignete
Lösungsmittel
sind Ethanol, Methoxyethanol, Chloroform, Methylenchlorid, Acetonitril,
Dioxan, Aceton und Essigester. Auch Feuchtigkeit kann in dem Lösungsmittelsystem
in einer kleinen Menge von bis zu 1% vorliegen.
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Bei
erfindungsgemäßen Zusammensetzungen,
die für
die Behandlung von Nahrungsmitteln wie Käse oder Würsten verwendet werden können, kann
es sich zum Beispiel um Flüssigkeiten
für die
Tauch- und/oder Sprühbehandlung
oder Beschichtungsemulsionen, die den Polyvinylacetattyp oder den Öl-in-Wasser-(O/W)-Typ
bzw. den Wasser-in-Öl-(W/O)-Typ
aufweisen, handeln.
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Erfindungsgemäße Zusammensetzungen
für die
Behandlung von landwirtschaftlichen Produkten wie Blumenzwiebeln,
(Kernen/Körnern)
und Gemüse
können
zum Beispiel wäßrige System
sein, die nach an sich bekannten Verfahren, z.B. Tauchen oder Sprühen, verwendet
werden können.
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Beispiele
für pharmazeutische
Zusammensetzungen, bei denen eine Lösung einer modifizierten Form von
Natamycin mitverwendet werden kann, sind Lotionen, Cremes und Salben.
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Die
Natamycinmenge in einer flüssigen
Zusammensetzung für
die Tauchbehandlung kann von 0,01% bis 2% (w/v) betragen. Vorzugsweise
beträgt
diese Menge 0,01% bis 1% (w/v). Bei der Tauchflüssigkeit kann es sich im Prinzip
um eine beliebige Art handeln. Wird ein wäßriges System verwendet, so
kann die Zugabe eines Tensids vorteilhaft sein, insbesondere für die Behandlung
von Objekten mit hydrophober Oberfläche.
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In
einer erfindungsgemäßen Beschichtungsemulsion
kann die Natamycinmenge 0,005% bis 2% (w/v) vorzugsweise 0,01 bis
1% (w/v) und stärker
bevorzugt 0,01 bis 0,5% (w/v) betragen. Die Beschichtungsemulsion
kann dem O/W- oder
W/O-Typ entsprechen. Besonders bevorzugt sind Emulsionen, die aus üblicherweise
in der Nahrungsmittelindustrie verwendeten Beschichtungsemulsionen
hergestellt werden. So kann zum Beispiel für die Behandlung von Hartkäsen eine
wäßrige Polymeremulsion,
die den Polyvinylacetattyp aufweist, verwendet werden.
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Wie
oben erwähnt
beträgt
der pH-Wert einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung
für die
Behandlung von Nahrungsmitteln oder landwirtschaftlichen Produkten
1 bis 10, stärker
bevorzugt 2 bis 8 und am stärksten
bevorzugt 3,5 bis 7,5. Der pH-Wert solch einer Zusammensetzung kann
nach einem beliebigen fachbekannten Verfahren, zum Beispiel durch
Versetzen mit einer sauren oder basischen Verbindung oder durch Verwendung
eines Puffersystems, eingestellt werden. Säuren, die sich für diesen
Zweck eignen, sind zum Beispiel Citronensäure, Milchsäure, Salzsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure und
Weinsäure.
Basische Verbindungen, die sich eignen und die ebenfalls verwendet
werden können,
sind zum Beispiel Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak und
Calciumhydroxid. Puffersysteme, die sich eignen und in erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
verwendet werden können,
sind zum Beispiel solche, die den Phosphat- bzw. Citrattyp aufweisen.
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Die
Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht:
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DSC- und TG/DTA-Messungen
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Allgemeine Vorgehensweise
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Die
DSC- und TG/DTA-Messungen wurden mit dem System SSC 5200 von Seiko
mit den Öfen
DSC 120 und TG/DTA 220 durchgeführt.
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Die
gewünschten
Meßwerte
wurden mit standardmäßigen Vorgehensweisen
erzielt.
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Als
Probenbehältnis
wurde ein verschlossener (UFO-förmiger)
Tiegel (Al) mit einer Ausnehmung im Deckel verwendet. Die Ausnehmung
im Deckel wurde dadurch, daß man
eine Standard-Nadel verwendete, reproduzierbar hergestellt. DSC
Temperaturprogramm: | –35 bis
270°C |
Aufheizgeschwindigkeit: | 5°C/Minute |
Probenahme: | 0,5
Sekunden |
Ofenatmosphäre: | Stickstoff
(80 ml/Minute) |
Referenz: | 1,154
mg Aluminiumoxid in |
| verschlossenem
Tiegel (Al) |
| mit
Ausnehmung im Deckel |
Probenmenge: | 1,20 ± 0,15
mg |
Probenbehältnis: | 15-μl-Probenbehältnis (Al), |
| verschlossen,
mit |
| Ausnehmung
im Deckel |
TG/DTA
Temperaturprogramm: | 22
bis 230°C |
Aufheizgeschwindigkeit: | 2,5°C/Minute |
Probenahme: | 0,5
Sekunden |
Ofenatmosphäre: | Stickstoff
(100 ml/Minute) |
Referenz: | leere,
offene Pt-Tiegel |
Probenmenge: | ±5 mg |
Probenbehältnis: | Offener
Pt-Tiegel |
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Röntgenanalyse
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Das
Röntgenmuster
der unterschiedlichen Natamycinkristalle wurde mit einer Guinier-Kamera
mit Monochromator, Typ Johansson, unter Verwendung von CuKα-Strahlung
bestimmt.
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BEISPIEL 1
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In
diesem Beispiel wird ein mikrobiologisches Verfahren zur Bestimmung
der Verfügbarkeit
von Natamycin aus einer Antipilzverbindung beschrieben.
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Die
Prüfzubereitung
wurde auf Papierfilterscheibchen (S&S Antibiotics Test Discs Nr. 321260)
mit einem Durchmesser von 0,6 cm so aufgetragen, daß auf jedes
Scheibchen 40 μg
Natamycin kommen, es wurden also zum Beispiel 50 μl einer Probe,
die 800 ppm Natamycin enthielt, auf ein Scheibchen aufgetragen. Anschließend wurden
die Scheibchen auf einen Agar, der mit Saccharomyces cerevisiae
ATCC 9763 inokuliert worden war, gelegt. Die den Agar enthaltenden
Petrischalen wurden anschließend
24 Stunden bei 6°C
aufbewahrt, so daß das
Natamycin in den Agar freigesetzt werden konnte. Unter diesen Bedingungen
wächst
Saccharomyces nicht. Als Referenz wurden verschiedene bekannte Natamycinmengen,
die in wäßrigem Methanol gelöst wurden,
frisch auf Scheibchen aufgetragen.
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Am
nächsten
Tag wurden die Probescheibchen auf neue Petrischalen, die mit Saccharomyces
cerevisiae inokulierten Agar enthielten, umgesetzt. Als Referenz
wurden neue Scheibchen hergestellt, auf die verschiedene bekannte
Mengen an gelöstem
Natamycin frisch aufgetragen worden waren. Die neuen Schalen mit
den Probescheibchen und den neuen Referenzen wurden 24 Stunden bei
6°C aufbewahrt,
und die alten Schalen, die das freigesetzte Natamycin enthielten,
wurden 24 Stunden lang bei 30°C
inkubiert.
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Die
Größe der Hemmzone
ist ein Maß für das aus
den Probescheibchen freigesetzte Natamycin. Die Menge des freigesetzten
Natamycins kann nach Verfahren, die als solche bekannt sind, berechnet
werden. Durch Wiederholen der Vorgehensweise kann das freigesetzte
Natamycin täglich
gemessen werden. Es können
jedoch auch andere Freisetzungsintervalle gewählt werden.
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BEISPIEL 2
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Aufreinigung
von α-Natamycin
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11
g industriell reines Natamycin wurden in einer Mischung aus 640
ml Wasser und 160 ml n-Propanol suspendiert. Der pH-Wert wurde durch
Zugabe von konzentriertem Ammoniak auf 9,9 eingestellt. Die erhaltene
Lösung
wurde anschließend
mit 11 g Farbruß behandelt
und durch ein Seitz-Filter filtriert. Durch Einstellen des pH-Werts
des Filtrats auf 6,5 mit einer 50%igen Essigsäurelösung wurde das Natamycin zur
Kristallisation gebracht.
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Die
Kristalle wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Die Kristallmasse
wurde in 400 ml Wasser suspendiert, abfiltriert und nacheinander
mit 50 ml Wasser und 50 ml Aceton gewaschen. Nach Trocknen über Nacht
bei 40°C
im Abzug erhielt man 7,78 g Natamycin. Die Substanz wurde bei 76%
relativer Feuchtigkeit equilibriert, wodurch man 7,83 g α-Natamycin
erhielt.
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Die
einzelnen DSC-Daten waren: Endothermen bei Ttop 45,2,
65,9 und 104,7°C
(Wasser) und eine Endotherme, auf die sich unmittelbar eine Exotherme
anschließt,
bei Ttop 205,6 bzw. 221,2°C (Zerfall).
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Die
kristallographischen Daten der erhaltenen Substanz, die jetzt als α-Natamycin
definiert worden ist, sind in Tabelle I dargestellt. Die Daten stimmen
mit den zuvor erhaltenen Daten überein
(Lit. 14, Seite 520).
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BEISPIEL 3
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Herstellung
des Methanolsolvats von Natamycin
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25
g aufgereinigtes α-Natamycin
wurde unter Rühren
in 2,5 l Methanol suspendiert und am Rückfluß erhitzt. Nach 15 Minuten
wurde der Heizmantel entfernt und die Suspension wurde über Nacht
gerührt.
Die Kristalle wurden abfiltriert und mit 500 ml Methanol gewaschen.
Die kristalline Substanz wurde anschließend 1 Stunde lang bei Raumtemperatur
im Vakuuum getrocknet, wodurch man 21,9 g Natamycinmethanolsolvat erhielt.
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Das
Vorhandensein von Methanol wurde mittels NMR-Analyse nachgewiesen. Das DSC-Thermogramm
wies zwei Endothermen bei Ttop 53,4 und
71,5°C (Methanol),
eine Endotherme bei Ttop 123,5°C (Wasser)
und eine Endotherme, an die sich unmittelbar eine Exotherme anschließt, bei
Ttop 181,2 bzw. 186,1°C (Zersetzung) auf.
-
Das
Methanolsolvat kann auch bei Raumtemperatur ohne zuvoriges Erhitzen
und bei einer höheren Konzentration,
z.B. 100 g Natamycin in 1 l Methanol, hergestellt werden. In diesem
Fall wird man vor der Bildung des Methanolsolvats zu keiner klaren
Lösung
gelangen. Üblicherweise
ist die Umwandlung des α-Natamycins
in das Methanolsolvat innerhalb von 15 Minuten vollständig.
-
Die
kristallographischen Daten des erhaltenen Natamycinmethanolsolvats
sind in Tabelle I dargestellt.
-
Stabilität des Natamycinmethanolsolvats
-
100-mg-Proben
von Natamycinmethanolsolvat wurden bei 20°C, 4°C bzw. –35°C unter Luft- oder Stickstoffatmosphäre aufbewahrt.
-
Die
Zersetzungsgeschwindigkeit von Natamycinmethanolsolvat war bei Aufbewahrung
unter Stickstoff und/oder bei niedriger Temperatur beträchtlich
geringer.
-
Nach
zweitägiger
Aufbewahrung des Methanolsolvats bei Raumtemperatur unter Luftatmosphäre wurde
keine Verfärbung
beobachtet. Gemäß DSC-Analyse
war die Substanz nach wie vor intakt. Nach fünftägiger Lagerung erhielt man
ein gelblich gefärbtes
Produkt, das ziemlich starkt zersetzt war. Bei 4°C war das Methanolsolvat noch
nach zwölftägiger Lagerung
intakt, nach 19 Tagen wurde jedoch starke Zersetzung nachgewiesen.
-
Wurde
das Methanolsolvat jedoch unter Kühlung bei –35°C aufbewahrt, so war es auch
noch nach drei Monaten ungefärbt
und wies keine Zersetzungserscheinungen auf.
-
Durch
Lagerung unter Stickstoffatmosphäre
war die Stabilität
des Methanolsolvats stark verbessert. Auch nach drei Monaten bei
Raumtemperatur wurde weder Verfärbung
noch Zersetzung beobachtet.
-
BEISPIEL 4
-
Herstellung von δ-Natamycin
-
10
g aufgereinigtes α-Natamycin
wurden in 100 ml Methanol suspendiert und bei Raumtemperatur gerührt. Nach
15 Minuten war die Umwandlung des α-Natamycins in das Methanolsolvat
vollständig,
wie dies unter dem Mikroskop aufgrund der vollständigen Umwandlung der Plättchen in
Nadeln nachgewiesen werden konnte. Nach zweistündigem Rühren wurden die Kristalle abfiltriert
und mit 100 ml Methanol gewaschen. Durch zwanzigstündiges Trocknen
der Kristallmasse im Vakuum über
P2O5 bei Raumtemperatur
wurde das Methanol vollständig
entfernt, und man erhielt 8,83 g δ-Natamycin. Die DSC-Analyse
wies eine Endotherme bei Ttop 126,7°C (entsprechend
0,5 Mol Wasser gemäß TGA-Analyse)
und eine Endotherme sowie unmittelbar anschließend daran eine Exotherme bei
Ttop 182,4 bzw. 186,8°C (Zersetzung) auf.
-
Die
kristallographischen Daten des erhaltenen δ-Natamycins sind in Tabelle I dargestellt.
-
Das
Natamycinmethanolsolvat kann auch dadurch in δ-Natamycin umgewandelt werden, daß man die Substanz
19 Stunden ohne P2O5 auf
52°C im
Vakuum erhitzt oder dadurch, daß man
das Methanolsolvat 72 Stunden bei Raumtemperatur einem verringerten
Druck sowie einem schwachen kontinuierlichen Stickstoffgasstrom
aussetzt.
-
Stabilität des δ-Natamycins
-
Proben
von 180-mg-Proben von δ-Natamycin
wurden bei 20°C,
4°C oder –35°C unter Luft-
oder Stickstoffatmosphäre
aufbewahrt.
-
Es
stellte sich heraus, daß das δ-Natamycin
wesentlich stabiler als das entsprechende Methanolsolvat war. Gemäß DSC wurde
bei δ-Natamycin,
das 3 Monate lang bei Raumtemperatur unter Luftatmosphäre aufbewahrt
wurde, keinerlei Zersetzung, nur eine leichte Verfärbung, beobachtet.
-
BEISPIEL 5
-
Herstellung
von γ-Natamycin
-
10
g aufgereinigtes α-Natamycin
wurden in 100 ml Methanol suspendiert. Nach 24stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde
die Kristallmasse abfiltriert und mit 100 ml Methanol gewaschen.
Nach einstündigem
Trocknen im Vakuum bei Raumtemperatur erhielt man 9,98 g Natamycinmethanolsolvat.
Die Substanz wurde anschließend
23 Stunden bei Raumtemperatur im Vakuum über P2O5 aufbewahrt, wodurch man 8,84 g δ-Natamycin
erhielt. Schließlich
wurde das δ-Natamycin
drei Tage lang einer Atmosphäre
mit 76%iger relativer Feuchtigkeit ausgesetzt, wodurch man 9,67
g γ-Natamycin
erhielt.
-
Das
DSC-Thermogramm wies Endothermen bei Ttop 42,8°C, 60,3°C und 124,8°C (Wasser)
sowie eine Endotherme und unmittelbar im Anschluß daran eine Exotherme bei
Ttop 182,5 bzw. 186,8°C (Zersetzung) auf.
-
Die
kristallographischen Daten des γ-Natamycins
sind in Tabelle I dargestellt.
-
BEISPIEL 6
-
Herstellung von α-Natamycin
aus dem Methanolsolvat
-
1,0
g Natamycinmethanolsolvat wurde bei Raumtemperatur in 100 ml entsalztem
Wasser suspendiert. Die Suspension wurde 25 Stunden lang gerührt. Die
Kristalle wurden abfiltriert, mit 25 ml Wasser bzw. 50 ml Aceton
gewaschen und anschließend über Nacht
im Abzug bei 35°C
getrocknet. Man erhielt 0,81 g einer Substanz, deren DSC-Thermogramm
mit α-Natamycin
identisch war. Typische Daten waren: drei Endothermen bei Ttop 44,6°C,
68,4°C und
97,9°C (Wasser)
sowie eine kleine Endotherme und unmittelbar in Anschluß daran eine
Exotherme bei Ttop 216,2 bzw. 230,0°C (Zersetzung).
-
BEISPIEL 7
-
Herstellung
von α-Natamycin
aus γ-Natamycin
-
1,0
g γ-Natamycin
wurde in 250 ml entsalztem Wasser suspendiert und die Suspension
wurde 7 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Kristalle wurden abfiltriert
und mit 20 ml Wasser bzw. 20 ml Aceton gewaschen und anschließend im
Abzug bei 30°C
getrocknet, wodurch man 0,92 g α-Natamycin
erhielt. Dies wurde mittels DSC-Analyse bestätigt: Endothermen bei Ttop 45,2°C,
67,8°C und
100,3°C
(Wasser) sowie eine Endotherme und unmittelbar im Anschluß daran
eine Exotherme bei Ttop 214,3°C bzw. 226,9°C (Zersetzung).
-
BEISPIEL 8
-
Herstellung
von α-Natamycin
aus γ-Natamycin
-
1,0
g γ-Natamycin
wurde in 100 ml entsalztem Wasser suspendiert und die Suspension
wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Kristalle wurden abfiltriert
und mit 25 ml Wasser bzw. 50 ml Aceton gewaschen und anschließend im
Abzug bei 35°C
getrocknet, wodurch man 1,02 g α-Natamycin
erhielt. Dies wurde mittels DSC-Analyse bestätigt: Endothermen bei Ttop 43,3°C,
67,8°C und
100,3°C
(Wasser) sowie eine Endotherme und unmittelbar im Anschluß daran
eine Exotherme bei Ttop 215,0°C bzw. 226,8°C (Zersetzung).
-
BEISPIEL 9
-
Herstellung von δ-Natamycin
aus γ-Natamycin
-
1,0
g γ-Natamycin
wurde 24 Stunden lang im Vakuum über
P2O5 getrocknet,
wodurch man 0,9 g δ-Natamycin
erhielt, was mittels DSC-Analyse bestätigt wurde: Endotherme bei
Ttop 125,4°C (Wasser) sowie eine Endotherme
und unmittelbar im Anschluß daran
eine Exotherme bei Ttop 182,4°C bzw. 186,8°C (Zersetzung).
-
BEISPIEL 10
-
Herstellung von Natamycinmethanolsolvat
aus δ-Natamycin
-
1,0
g δ-Natamycin,
das aus dem entsprechenden Methanolsolvat durch 19stündiges Trocknen
im Vakuum bei 52°C
hergestellt worden war, wurde im Exsikkator aufbewahrt und 113 Stunden
lang Methanoldampf ausgesetzt, wodurch man 1,12 g Natamycinmethanolsolvat
(gemäß DSC-Analyse)
erhielt: Endothermen bei Ttop 55,9°C und 74,0°C (Methanol)
sowie 124,8°C
(Wasser), sowie eine Endotherme und unmittelbar im Anschluß daran
eine Exotherme (Zersetzung) bei Ttop 181,1°C bzw. 186,1°C.
-
BEISPIEL 11
-
Herstellung von Natamycinsolvaten
aus δ-Natamycin
durch Einwirkung des Dampfs von mehreren Lösungsmitteln auf δ-Natamycin
-
Eine
100-mg-Probe von δ-Natamycin
wurde in ein 8-ml-Vial
gegeben. Das offene Vial wurde anschließend in einen 125-ml-Kolben,
der eine kleine Schicht eines Lösungsmittels
enthielt, gegeben. Der Kolben wurde anschließend verschlossen und 7 Tage
lang im Dunkeln bei Raumtemperatur aufbewahrt. Auf diese Weise wurden
Proben von δ-Natamycin
der Einwirkung des Dampfs von mehreren Lösungsmitteln ausgesetzt. Man erhielt
die Natamycinsolvate mit den folgenden Lösungsmitteln:
Ethanol
(6 Mol)
1-Propanol (2,5 Mol)
1-Butanol (1,5 Mol)
2-Methoxyethanol
(2,5 Mol)
Ethylformiat (1 Mol)
Aceton (2 Mol)
Dichlormethan
(1,3 Mol)
Acetonitril (3 Mol)
Dimethylformamid (4,5 Mol)
-
Die
Lösungsmittelmengen
(Mol) pro Mol Natamycin gemäß NMR-spektroskopischer
Analyse sind als Klammerausdruck angegeben.
-
BEISPIEL 12
-
Herstellung von Natamycinsolvaten
aus δ-Natamycin
durch Inkontaktbringen des Natamycins mit einem Lösungsmittel
-
In
einem verschlossenen (Schnappverschluß) 6-ml-Vial wurden 200 mg
einer δ-Natamycinprobe
24 Stunden lang bei 32°C
mit 2 ml eines Lösungsmittels
gerührt.
Die kristalline Substanz wurde anschließend abfiltriert, mit dem verwendeten
Lösungsmittel
gewaschen und auf dem Filter mit einem Stickstoffgasstrom trockengeblasen.
Schließlich
wurden die Kristalle auf dem Filter mit einer kleinen Menge Aceton
oder Diethylether gewaschen. Mit diesem Verfahren erhielt man die
Solvate von Natamycin mit den folgenden Lösungsmitteln: Methanol, Ethanol,
1-Propanol, 1-Butanol, 2-Methoxyethanol, Methylformiat, Acetonitril,
Dimethylsulfoxid und Formamid. Die Umwandlung des δ-Natamycins
in die Solvate wurde mittels DSC-Analyse bestätigt.
-
BEISPIEL 13
-
Freisetzungsgeschwindigkeit
von verschiedenen Natamycinproben aus wäßrigen Suspensionen
-
Freisetzungsgeschwindigkeitsprofile
von verschiedenen Natamycinzubereitungen wurden miteinander nach
dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren verglichen.
-
Es
wurden Suspensionen der Natamycinzubereitungen so hergestellt, daß jede Suspension
800 ppm reines Natamycin als solches enthielt. 50 μl von jeder
der entsprechenden Mischungen wurde auf ein Filterpapierscheibchen
aufgetragen und die Freisetzungsgeschwindigkeit wurde mit dem Verfahren
von Beispiel 1 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt.
-
Die
Freisetzungsgeschwindigkeit von mikronisiertem Natamycin ist mit
derjenigen von nichtmikronisiertem Natamycin vergleichbar, während die
modifizierten Natamycinarten eine höhere Freisetzungsgeschwindigkeit über einen
längeren
Zeitraum aufweisen.
-
BEISPIEL 14
-
Freisetzungsgeschwindkeit
von verschiedenen Natamycinproben aus Plasticoat®
-
Nach
dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben wurde auch
die Freisetzungsgeschwindigkeit aus Plasticoat® gemessen.
Die Konzentration des Natamycins als solchem betrug in jedem Fall
800 ppm. 50 μg
jeder der entsprechenden Mischungen wurde auf ein Papierfilterscheibchen
aufgetragen und die Freisetzungsgeschwindkeit wurde nach dem Verfahren
von Beispiel 1 bestimmt.
-
Die
Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.
-
Die
Freisetzungsgeschwindkeit von mikronisiertem Natamycin aus Plasticoat® ist
mit derjenigen von nichtmikronisiertem Natamycin vergleichbar, während die
modifizierten Natamycinarten eine höhere Freisetzungsgeschwindigkeit über einen
längeren
Zeitraum aufweisen.
-
BEISPIEL 15
-
Dieses
Beispiel zeigt die Wirkung von erfindungsgemäß hergestellten Natamycinzusammensetzungen
gegen Penicillium echinulatum var. discolor an Käse.
-
Die
Beschichtungszusammensetzungen wurden auf die Oberfläche von
Goudakäse-Stücken aufgetragen
und zwar folgendermaßen:
ein
frisch lakebehandelter Laib Goudakäse wurde zuerst waagerecht
in zwei Teile geschnitten. Jeder Teil wurde anschließend in
Stücke
mit den Abmessungen 5 × 5 × 5 cm geschnitten.
Nur Stücke
mit einer flachen Rindenoberfläche
wurden für
den Versuch verwendet. Die Käsestücke wurden
so in ein geschmolzenes Paraffinbad bei 80°C getaucht, daß die Rindenoberfläche paraffinfrei
blieb, während
die anderen fünf
Oberflächen durch
einen dünnen
Film verfestigtes Paraffin bedeckt waren.
-
Die
Rindenoberfläche
wurde anschließend
ungefähr
6 × 103 KBE/cm2 einer Sporenmischung
von drei Stämmen
von Penicillium echinulatum var. discolor (CBS-Nummern 611.92, 612.92
und 613.92) inokuliert. Inokuliert wurde dadurch, daß man 0,15
ml einer Sporensuspension, die ungefähr 106 KBE/ml
enthielt, auf die Oberfläche
der Käsestücke auftrug.
Dieses Inokulum wurde mittels eines sterilen Tupfers, der mit der
Sporensuspension gesättigt
war, gleichmäßig über die
Oberfläche
verteilt.
-
Nachdem
die Käsestücke über Nacht
in verschlossenen Plastikschachteln bei ungefähr 6°C stehengelassen wurden, wurden
sie mit einer wirkstofffreien Plasticoat®-Emulsion
sowie mit Plasticoat®-Emulsionen, die 500 ppm α-Natamycin
(Zusammensetzung D), 500 ppm γ-Natamycin (Zusammensetzung
J) sowie 500 ppm δ-Natamycin
(Zusammensetzung K) enthielten, behandelt. Die Natamycinzubereitungen
wurden vor der Zugabe zu dem Plasticoat® in
Wasser (1% w/v) suspendiert. Für
jede Behandlung wurden 5 Käsestücke verwendet.
Auf jedes Stück
wurden 0,8 ml der Plasticoat®-Zusammensetzung aufgetragen
und mittels eines sterilen rechteckigen Stücks Plastik, das ungefähr 2·5 cm groß war, gleichmäßig über die
Oberfläche
des Käses verteilt.
Nachdem die Käsestücke 2 Stunden
unter Raumbedingungen stehengelassen worden waren, wurden sie bei
15°C und
einer relativen Feuchtigkeit von 95% inkubiert. Die Schimmelhemmwirkung
wurde folgendermaßen
bestimmt:
jeden Tag wurde die Anzahl der sichtbaren Kolonien,
die sich auf jedem Käsestück gebildet
hatten, bestimmt und die durchschnittliche Anzahl pro Stück wurde
für jede
Behandlung berechnet. Überschritt
die Kolonienzahl auf einem Käsestück den Wert
30, so wurden die Käsestücke als
vollständig
mit Schimmel bewachsen bezeichnet.
-
Die
Ergebnisse sind in 1 dargestellt. Die Käsestücke, die
mit Zusammensetzung J oder K behandelt worden waren, waren 10 Tage
lang schimmelfrei, während
die mit der Kontrolle behandelten Stücke nur 7 Tage schimmelfrei
waren.
-
-
-
-
Literaturangaben
-
- 1. Jedrychowski, L.; Reps, A.; Jarmul, I.;
Babuchowski, A.
"Use
of natamycin for a protection of semihard cheeses against moulding"
Kurzbeitrag
anläßlich des
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